專利名稱：：用作病原體抑制劑的分支寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)病原體具有抑制作用的合成寡核苷酸。更具體地，本發(fā)明涉及較已知寡核苷酸具有更好抑制特性的抗病原體的合成寡核苷酸。使用合成寡核苷酸作為抗感染劑最近已發(fā)展成為一個(gè)頗具希望的領(lǐng)域。Agrawal的“生物技術(shù)的趨勢(shì)”((TrendsinBiotechnology)10152-158,1992)綜述了反義寡核苷酸用作抗病毒劑的發(fā)展。現(xiàn)在，合成寡核苷酸不僅在作為抗病毒劑方面，而且在作為其它病原體的抑制劑方面均顯示出相當(dāng)好的前景。Rapaport等的“美國(guó)全國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)”(Proc.Natl.Acad，Sci.USA898577-8580，1992)報(bào)道了硫代磷酸寡核苷酸抗惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)的抗瘧活性。由于合成寡核苷酸作為抗感染劑的巨大希望，很多研究致力于提高這類化合物的藥理特性。很多這樣的研究包括向寡核苷酸中引入修飾的核苷間鍵，從而提高對(duì)溶核降解作用的抗性和生物穩(wěn)定性。Agrawal等的“美國(guó)全國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA857079-7083，1988)報(bào)道，硫代磷酸寡脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸氨基磷酸酯能抑制人類免疫缺陷病毒(MIV)的增殖。Sarin等的“美國(guó)全國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA857448-7451，1988)披露了寡脫氧核苷酸甲基膦酸酯對(duì)HIV具有抑制作用。Padmapriga的“生物有機(jī)和醫(yī)藥化學(xué)通訊”(Bioorganic&MedicinalChemistryLetters3761-764，1993)報(bào)道了具有新的甲基硫代磷酸酯核苷間鍵的寡核苷酸。Goodchild和Zamecnik(美國(guó)專利第4,806,463號(hào))公開(kāi)了抑制HTLV-III復(fù)制和蛋白質(zhì)表達(dá)的反義寡苷酸。這些寡核苷酸是針對(duì)HTLV-III基因組的高度保守區(qū)域的。它們針對(duì)的位點(diǎn)包括a)rRNAlys引物結(jié)合位點(diǎn)，b)rRNAlys引物結(jié)合位點(diǎn)5′端附近的HTLV-III基因組區(qū)域，c)tRNAlys引物結(jié)合位點(diǎn)和rRNAlys引物結(jié)合點(diǎn)5′端附近的HTLV-III基因組區(qū)域，d)mRNA剪接供體，e)mRNA剪接受體，f)gag基因的起始密碼子，g)env基因的起始密碼子，h)tat基因的起始密碼子，i)sor基因的起始密碼子，j)3′orf基因的起始密碼子，k)HTLV-III基因組加帽核苷酸，l)art基因及其部分序列，m)HTLV-III基因組編碼grameshift的區(qū)域。其它修飾，不一定僅指使用修飾的磷酸二酯核苷酸間鍵，還包括在寡核苷酸3′未端引入化學(xué)封閉結(jié)構(gòu)。Temsamani等的“紐約科學(xué)院年鑒”(AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences，660318-320，1992)報(bào)道具有3′-帽子的硫代磷酸寡核苷酸的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)和生物穩(wěn)定性超過(guò)沒(méi)有帽子的硫代磷酸寡核苷酸。Tang等的“核酸研究”(NucleicAcidRes.212729，1993)報(bào)道具有3′未端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸的生物穩(wěn)定性較好。Koga等的“有機(jī)化學(xué)雜志”(J.Org.Chem.563757-3759，1991)報(bào)道，具有交替(3′→3′)未端(5′→5′)的核苷酸間磷酸二酯鍵的交替α，β-寡聚胸苷酸對(duì)核酸酶的抗性提高了。Seliger等的“核苷和核苷酸”(Nucleosides&Nacleotides10469-477，1991)和Ortigao等的“反義研究和發(fā)展”(AntisenseResearch&Development2129-146，1992)報(bào)道具有單一未端3′→3′和5′→5′鍵倒位的寡脫氧核苷酸對(duì)溶核降解作用的抗性提高了。合成具有至少一個(gè)3′→3′核苷間鍵的寡核苷酸的方法可包括使用允許5′→3′合成的修飾核苷單體，或使用接頭，采用可市購(gòu)的5′氨基膦酸酯核苷單體，由上述接頭進(jìn)行雙向3′→5′合成，獲得具有3′→3′和5′→5′鍵的寡核苷酸。CLONTECHniques(1993年4月)報(bào)道使用可市購(gòu)的分支接頭合成了具有單個(gè)3′→3′核苷間鍵的寡核苷酸。Horne和Dervan的“美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊”(J.Am.Chem.Soc.1122435-2437，1990)、Luebke和Dervan的“核酸研究”(NucleicAcidRes.203005-3009，1992)和vandeSande等的“科學(xué)”(Science，241551-557，1988)報(bào)道以類似方法合成了具有單個(gè)3′→3′鍵的寡核苷酸，以研究交替鏈三螺旋的形成或平行鏈DNA。然而，使用合成寡核苷酸有效地進(jìn)行抗感染治療存在著一些潛在的問(wèn)題，這些問(wèn)題是由作用對(duì)象的性質(zhì)引起的，而不是由寡核苷酸引起的，因而不能通過(guò)提高寡核苷酸的生物穩(wěn)定性得到解決。問(wèn)題之一是感染體可能通過(guò)靶序列的突變，降低寡核苷酸與靶序列的反應(yīng)能力，從而逃脫寡核苷酸介導(dǎo)的治療。例如，Lisziewicz等的“美國(guó)全國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA8911209-11213，1992)報(bào)道一種剪接受體的反義寡核苷酸開(kāi)始能抑制MOLT-3感染細(xì)胞中的HIV，但25天后，觀察到有病毒突破抑制。這一報(bào)道提示用互補(bǔ)于不同靶序列的寡核苷酸進(jìn)行聯(lián)合或分批治療，可能有助于避免病毒突破抑制。有必要找到提高抑制病原體的合成寡核苷酸的生物穩(wěn)定性的其它方法。也有必要找到避免病原體的突變引起的突破抑制的新途徑。理想的情況是得到能同時(shí)解決上述兩個(gè)問(wèn)題的寡核苷酸。本發(fā)明涉及到對(duì)病原體具有抑制作用的合成寡核苷酸。本發(fā)明提供的抗病原體的合成寡核苷酸，較已知的寡核苷酸具有更好的抑制特性。本發(fā)明針對(duì)HIV或流感病毒的分支寡核苷酸較通常的寡核苷酸更為有效。本發(fā)明的寡核苷酸具有更好的抑制特性是由這些寡核苷酸的初級(jí)結(jié)構(gòu)特征所決定的，它們是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的寡核苷酸序列相互連接而成，所說(shuō)的寡核苷酸序列與一個(gè)或多個(gè)病原體的一個(gè)或多個(gè)必需基因互補(bǔ)。一方面，本發(fā)明提供了由兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的寡核苷酸序列相互連接而成的寡核苷酸，其中，每一寡核苷酸序列都與病原體的同一靶序列互補(bǔ)。靶序列為病原體增殖所必需的基因或調(diào)控序列的部分序列。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，相同的寡核苷酸序列可以5′→3′構(gòu)型或3′→3′構(gòu)型相互連接。采用后一構(gòu)型的寡核苷酸對(duì)溶核降解作用具有高度的抗性。另一方面，本發(fā)明提供了由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的寡核苷酸序列相互連接而成的寡核苷酸，其中，每一寡核苷酸序列與同一病原體的不同靶序列互補(bǔ)。所述不同的寡核苷酸序列可與同一基因或調(diào)控序列的不同部分互補(bǔ)，或與不同的基因和/或調(diào)控序列互補(bǔ)。此處的寡核苷酸降低了病原體通過(guò)突變逃脫該寡核苷酸抑制作用的機(jī)率。不同的寡核苷酸序列可以5′→3′或3′→3′構(gòu)型相互連接，采用后一構(gòu)型大大提高了對(duì)溶核降解作用的抗性。第三方面，本發(fā)明提供了由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的寡核苷酸序列相互連接而成的寡核苷酸，其中，一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與一種病原體的一段靶序列互補(bǔ)，一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與另一種病原體的一個(gè)基因或調(diào)控序列互補(bǔ)。此處的寡核苷酸可對(duì)包括兩種不同病原體的感染進(jìn)行聯(lián)合治療。不同寡核苷酸序列可以5′→3′或3′→3′構(gòu)型相互連接。采用后一構(gòu)型大大提高了對(duì)溶核降解作用的抗性。第四方面，本發(fā)明提供了由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的寡核苷酸序列相互連接而成的寡核苷酸，其中，一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與病原體的一個(gè)菌株的一個(gè)基因或調(diào)控序列互補(bǔ)，一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與同一病原體的另一菌株的一個(gè)基因或調(diào)控序列互補(bǔ)。此外的寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)在于可有效地抑制病原體的兩個(gè)或兩個(gè)以上菌株，因而該寡核苷酸甚至在病原體的特定菌株被發(fā)現(xiàn)之前就可作為其抑制劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以知道本發(fā)明的幾個(gè)方面可以集中在一種寡核苷酸上，從而提供一種對(duì)治療特定疾病有更好特性的寡核苷酸。他們也會(huì)認(rèn)識(shí)到如果本發(fā)明前三個(gè)方面的相同或不同的寡核苷酸序列具有3′末端核糖核苷酸，那么相同或不同的寡核苷酸也可通過(guò)5′→3′、5′→2′、2′→3′、3′→2′或3′→3″鍵連接。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抗病原體的寡核苷酸，它們能減少或消除突變引起的病原體逃脫這種寡核苷酸的抑制作用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能同時(shí)抑制一種以上病原體的抗病原體寡核苷酸，尤其是在自然條件下，這些病原體通常共同感染宿主機(jī)體的情況下。上文僅僅總結(jié)了本發(fā)明的某些方面，無(wú)意、也絕不應(yīng)理解為是以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。此處引用的所有專利和出版物這里把其全文引為參考。圖1顯示5′-氨基磷酸酯(phosphoramidites)和5′-連接于CPG的核苷的一般合成路線。圖2顯示一種3′→3′連接的寡核苷酸的實(shí)例，其中X例如可為硫或氧。圖3顯示用蛇毒磷酸二酯酶處理過(guò)的寡核苷酸的A260/時(shí)間曲線。圖4顯示用蛇毒磷酸二酯酶消化寡核苷酸3(PO)和4(PO)的結(jié)果。圖5顯示大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶和T4DNA聚合酶的3′-核酸外切活性(前者也具有一定的5′-核酸外切活性)消化5′-32P末端標(biāo)記的寡核苷酸3(PO)和4(PO)的結(jié)果。圖6顯示在37℃溫度下有10％的牛胎血清存在時(shí)，消化寡核苷酸3(PO)和4(PO)的結(jié)果。圖7顯示用牛胎血清處理寡核苷酸1(PS)和4(PS)的結(jié)果。圖8顯示RNaseH切割寡核苷酸雙螺旋的結(jié)果。圖9A和9B顯示用本發(fā)明的寡核苷酸處理HIV感染的細(xì)胞的結(jié)果。本發(fā)明涉及對(duì)病原體具有抑制作用的合成寡核苷酸。本發(fā)明提供對(duì)病原體具有更好的抑制特性的抗病原體的合成寡核苷酸。本發(fā)明的針對(duì)HIV或流感病毒的分支寡核苷酸較通常的反義寡核苷酸更為有效。本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案中寡核苷酸具有更好的抑制特性，是由于寡核苷酸通過(guò)5′→3′、5-′2′或優(yōu)選的3′→3′、3′→2′或2′→3′寡核苷酸間鍵相互連接產(chǎn)生的。當(dāng)寡核苷酸通過(guò)5′→3′鍵相互連接時(shí)，該寡核苷酸的序列不與任何天然的環(huán)狀核酸連接。一方面，本發(fā)明提供了由兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的寡核苷酸序列相互連接而成的寡核苷酸。本發(fā)明此處所說(shuō)的寡核苷酸中，相同的寡核苷酸序列均與病原體的同一靶核苷酸序列互補(bǔ)。靶序列為病原體致病效應(yīng)必需基因或調(diào)控序列的部分序列。此處所說(shuō)的寡核苷酸對(duì)病原體的致病效應(yīng)的抑制作用較通常的寡核苷酸要強(qiáng)。另一方面，本發(fā)明提供了由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同寡核苷酸序列相互連接而成的寡核苷酸。在此處所說(shuō)的寡核苷酸中，不同的寡核苷酸序列與同一病原體的靶核苷酸序列互補(bǔ)。這些不同的靶序列可以是同一基因或調(diào)控序列中的不同位點(diǎn)，或是不同的基因和/或調(diào)控序列。這些寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)在于能夠消除病原體的突變引起的逃脫該寡核苷酸對(duì)它的抑制作用。當(dāng)使用的抗病原體寡核苷酸只與單一靶核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，病原體有可能通過(guò)該苷核苷酸序列的突變，使所述寡核苷酸不能與該靶核苷酸序列雜交，從而逃脫所述寡核苷酸的抑制作用。當(dāng)使用的寡核苷酸具有與兩個(gè)不同的靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列時(shí)，這種逃脫的可能性就大大降低了，因?yàn)槎辔稽c(diǎn)同時(shí)發(fā)生突變的頻率是單位點(diǎn)突變頻率的乘積。與同時(shí)或分批使用互補(bǔ)于不同靶核苷酸序列的寡核苷酸相比，此處的寡核苷酸具有以下優(yōu)點(diǎn)首先，使用較為簡(jiǎn)單，因?yàn)橹恍枰铣珊褪褂靡环N化合物。這種化合物的優(yōu)點(diǎn)也體現(xiàn)在，當(dāng)這種寡核苷酸作人用或獸用時(shí)，為管理需要易于進(jìn)行質(zhì)量控制且頒發(fā)許可較為簡(jiǎn)單。第三方面，本發(fā)明又提供了由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同寡核苷酸序列相互連接而成的寡核苷酸。然而，此處所說(shuō)的寡核苷酸中，不同的寡核苷酸序列與不同病原體的靶核苷酸序列互補(bǔ)。這些靶核苷酸序列為每一病原體的致病效應(yīng)必需基因或調(diào)控序列的部分序列。此處的寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)在于合成和使用一種化合物，就可抑制兩種可能共同感染宿主的不同病原體的致病效應(yīng)，兩種病原體共同感染宿主常見(jiàn)于人類免疫缺陷病毒(HIV)和巨細(xì)胞病毒、流感病毒、卡氏肺囊蟲(chóng)(Pneumocystiscarnii)或結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的共同感染。在組織培養(yǎng)研究中另外一個(gè)例子是任何待研究的病毒和污染的支原體，常使研究結(jié)果復(fù)雜化。第四方面，本發(fā)明還提供了含有兩個(gè)或兩個(gè)以上不同核苷酸序列的寡核苷酸。然而，此處的寡核苷酸中，不同的寡核苷酸序列與同一病原體的不同菌株或等位基因的靶核苷酸序列互補(bǔ)。這些靶核酸序列可以是該病原體的致病效應(yīng)必需基因或調(diào)控序列的相同或不同部分。此處的寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)在于合成和使用一種化合物，即可抑制一種病原體的致病效應(yīng)，而無(wú)需知道該病原體的哪一種菌株或等位基因影響了該宿主。根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面對(duì)寡核苷酸采用下述名稱?！肮押塑账嵝蛄小卑ㄓ羞x擇地具有額外的核糖核苷酸、2′-取代的核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸單體的寡核苷酸，它們均可通過(guò)5′→3′鍵連接，所述鍵可以是本領(lǐng)域中已知的任何核苷酸間鍵。優(yōu)選這些寡核苷酸有選擇地包括磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基醚、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、橋連氨基磷酸酯、橋連亞甲基磷酸酯、橋連硫代磷酸酯和/或砜核苷酸間鍵。含上述任何核苷酸間鍵的寡核苷酸的合成為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如，可參考Uhlmann和Peyman的文章“化學(xué)綜述”(ChemicalReviews90543-584，1990)和Schneider和Banner的文章“四面體通訊”(TetrahedronLett.31335，1990)。優(yōu)選本發(fā)明的寡核苷酸的寡核苷酸序列以總共含有大約6-100個(gè)單體，最優(yōu)選大約8-50個(gè)單體。這些修飾的寡核苷酸也可選擇性地包括修飾的核酸堿基和/或糖、以及附加的取代基，如二元胺、膽甾烯基或其它親脂基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指能夠與細(xì)胞內(nèi)的靶核苷酸序列形成雜合體的充分互補(bǔ)。在實(shí)際工作中，這種充分互補(bǔ)可通過(guò)測(cè)定使用該寡核苷酸是否能抑制靶核苷酸序列的功能來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證?！安≡w”包括能夠感染人、其它動(dòng)物或細(xì)胞的病毒、細(xì)菌和真核生物，也包括由于其正?；虍惓１磉_(dá)，使得人、植物或動(dòng)物疾病惡化或加重的天然或突變基因。優(yōu)選病原體包括、但不限于人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病冒、乙肝病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、口蹄疫病毒、黃熱病病毒、巨細(xì)胞病毒、結(jié)核分枝桿菌、卡氏肺囊蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、ras和B2癌基因、人淀粉樣蛋白前體(APP)基因、人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因、人多重藥物抗性(mdr)基因?！翱共≡w寡核苷酸”是指與該病原體致病效應(yīng)必需基因或調(diào)控序列的部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸?！斑B接”或“相互連接”指直接或通過(guò)中間化學(xué)組分共價(jià)連結(jié)，所述共價(jià)連接結(jié)包括一個(gè)寡核苷酸序列的5′末端和另一寡核苷酸序列的3′或2′末端的連結(jié)，或一個(gè)寡核苷酸序列的3′或2′末端和另一寡核苷酸序列的3′或2′末端的連結(jié)。“兩個(gè)或兩上以上”指2到大約6個(gè)。此處，“PO”指具有磷酸二酯核苷酸間鍵的寡核苷酸，“PS”指具有硫代磷酸酯核苷酸間鍵的寡核苷酸。對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面來(lái)說(shuō)，兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸序列可通過(guò)5′→3′、5′→2′、3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′鍵相互連接。許多核苷酸能夠摻入本發(fā)明的分支寡核苷酸，這在本領(lǐng)域中是已知的。例如，這類寡核苷酸包括、但不限于上文提到的Goodchild和Zamecnik的美國(guó)專利第4,806,463號(hào)公開(kāi)的寡核苷酸。當(dāng)寡核苷酸通過(guò)3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′鍵相互連接時(shí)，它們就對(duì)外切核酸的降解作用具有高度的抗性。它們可以通過(guò)任何已知的核苷酸間鍵相互連接。或者也可以通過(guò)一些其它的化學(xué)取代基相互連接，這些取代基包括、但不限于環(huán)糊精、醚和醚鍵、冠醚和甘油。優(yōu)選這種鍵為共價(jià)鍵，但具有非常高的解離常數(shù)的非共價(jià)鍵，如抗生物素蛋白-生物素鍵和環(huán)糊精金剛烷，也是可以接受的。本發(fā)明的寡核苷酸可用于體內(nèi)和體外的多種目的。這種寡核苷酸可用于體內(nèi)治療由病原體的作用引起的人、植物或動(dòng)物疾病。此處，病原體指本發(fā)明所定義的病原體。這些寡核苷酸得到FDA的上市許可，也可用作藥物。本發(fā)明的寡核苷酸也具有多種體外用途。它們可用于抑制組織培養(yǎng)細(xì)胞系中病原體的作用。根據(jù)本發(fā)明的第二方面的寡核苷酸可用于研究某一病原體中不同基因的相對(duì)突變率。根據(jù)本發(fā)明的第三方面的寡核苷酸可用于研究不同病原體的基因的相對(duì)突變率。根據(jù)本發(fā)明的第四方面的寡核苷酸可用于研究同一病原體不同菌株的基因的相對(duì)突變率。最后，根據(jù)本發(fā)明的所有方面，對(duì)核酸酶具有最強(qiáng)抗性的寡核苷酸可作為研究在某些條件下病原體基因表達(dá)的探針，在這些條件下普通寡核苷酸會(huì)被降解。以下實(shí)施例是為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，而絕不是要對(duì)發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例實(shí)施例15_氨基磷酸酯和5′-連接于CPG的核苷的合成如圖1所示，5′→3′合成寡核苷酸所需的5′-氨基磷酸酯F和5′-連接于CPG支持物上的核苷G，由3′-DMT核苷E制得。而3′-DMT核苷是由4′-O-乙酰丙基堿保護(hù)的核苷A合成，后者根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備(例如，參見(jiàn)Kumar和Poonian，“有機(jī)化學(xué)雜志”(J.Org，Chem494905-4912，1984)。合成步驟如下(i)采用t-丁基二甲基甲硅烷基氯進(jìn)行5′-羥基的甲基硅烷化(見(jiàn)上文Kumar和Poonian)；(ii)用肼除去乙酰丙基(見(jiàn)上文Kamar和Poonian)；(iii)用二對(duì)甲氧三苯甲基(DMT)氯保護(hù)(酸不穩(wěn)定的)3′-羥基(Smitb等“美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊”(J.Am.Chem.Soc.84430，1962))；(iv)用1M氟化回丁銨進(jìn)行5′位去甲基硅烷化(見(jiàn)上文，Kumar和Poonian)；(v)用氯(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基亞磷酸酯進(jìn)行5′位亞磷酸化(Sinha等，“核酸研究”(Nucl.AcidsRes.124539-4557，1984)；或(vi))通過(guò)與琥珀-?；腖CAA-CPG縮合，將5′位連接于CPG支持物上(Damha等“核酸研究”(Nucl.AcidRes.)183813-3821，1990)。5′-氨基磷酸酯和5′-連接于CPG的核苷最近已可向GlenResearch(Sterling.VA)商購(gòu)。實(shí)施例2寡核苷酸的合成寡核苷酸的合成是采用β氰乙基氨基磷酸酯在標(biāo)準(zhǔn)條件下于自動(dòng)合成儀(Millipore8700，Bedford，MA)上進(jìn)行，合成規(guī)模為1μmol。對(duì)含有硫代磷酸酯核苷酸間鍵的寡核苷酸來(lái)說(shuō)，碘氧化步驟被3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物的氧化步驟所代替。含3′→3′核苷酸間鍵的寡核苷酸的合成分兩部分進(jìn)行。第一種序列的合成，采用5′-氨基磷酸酯和5′-連接于CPG支持物上的3′-DMTr-核苷、沿5′→3′方向進(jìn)行。第一種序列合成后，將單體轉(zhuǎn)換成3′-氨基磷酸酯，第二種序列的合成以通常的3′→5′方向進(jìn)行。圖2顯示了一個(gè)由3′→3′鍵連結(jié)兩個(gè)序列形成的較大的寡核苷酸的一個(gè)四體部分。隨機(jī)序列是采用隨機(jī)方式在合成儀上合成，合成時(shí)由每一單體瓶中取一份氨基磷酸酯，產(chǎn)生各個(gè)位置的混合物。合成結(jié)束后，所得寡核苷酸用濃縮氨在55℃下作用16小時(shí)去保護(hù)。寡核苷酸粗品以反向色譜(C18)進(jìn)行純化、20體的色譜梯度為由100mM乙酸銨配制的0-50％乙腈，時(shí)間為45分鐘以上，40體的色譜梯度為0-40％乙腈。除去三苯甲游基之后，寡核苷酸對(duì)水透析并凍干。寡核苷酸的純度通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)確定。本發(fā)明中合成和使用的寡核苷酸于表I中列出。序列I與HIV核酸gag區(qū)的一段序列互補(bǔ)，序列3與HIV核酸t(yī)at區(qū)的一段序列互補(bǔ)。表1</tables>+PO＝磷酸二酯連接的寡核苷酸PS＝硫代磷酸酯連接的寡核苷酸*N＝每一序列中的核苷酸數(shù)目20＝具有隨機(jī)序列的20體寡核苷酸Y＝5′T-T-3’；Z＝5′T-T-5’實(shí)施例3寡核苷酸的核酸酶抗性分析為了利用增色現(xiàn)象研究寡核苷酸磷酸二酯的消化速度，將0.2個(gè)A260單位的寡核苷酸溶于0.5ml緩沖液(10mMTrisHCl，pH8.310mMMgCl2)中，在一熱控紫外分光光度計(jì)的測(cè)量室內(nèi)使其溫度達(dá)到37℃。加入蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)(5μl，1μg，1.5U/mg)，不同時(shí)間測(cè)其A260結(jié)果示于圖3中。消化寡核苷酸序列5的t1/2為～200秒，而消化寡核苷酸序列7達(dá)1800秒尚未達(dá)到其t1/2。因而不含自由3′末端的寡核苷酸序列7，對(duì)SVPD的3′-外切核酸消化活性，比寡核苷酸序列5穩(wěn)定得多。圖4中再現(xiàn)了這一結(jié)果，討論見(jiàn)下文，結(jié)果顯示15分鐘后，寡核苷酸序列5的90％為SVPD所消化，而寡核苷酸序列7保持原樣。SVPD對(duì)寡核苷酸的消化也通過(guò)以下方法監(jiān)測(cè)將5′-32P標(biāo)記的寡核苷酸(100ng)于37℃下保溫，終體積為20μl，含50mM乙酸鈉(pH4.5)、1mM乙酸鋅、250mMNaCl、0.05mg/mlBSA和2μlSVPD(100ng)。在0、2、5和15分鐘取樣(5μl)，并加入20μl含有染料的80％甲酰胺加樣緩沖液中，樣品在15％聚丙烯酰胺凝膠(8.3M尿素)上進(jìn)行分析，隨后在-80℃下放射自顯影，結(jié)果見(jiàn)圖4。這些結(jié)果證實(shí)，3′→3′連接的寡核苷酸對(duì)核酸酶降解的抗性較普通寡核苷酸強(qiáng)得多。為試驗(yàn)這些結(jié)果能否推廣于更嚴(yán)酷的條件，采用更高的核酸酶活性消化所述寡核苷酸。為研究3′→3′連接的寡核苷酸對(duì)DNA聚合酶I和T4DNA聚合酶的3′-外切核酸活性的抗性，將5′-32P標(biāo)記的寡核苷酸(150ng)在37℃下保溫，終體積為20μl，含有50mMTrisHCl、pH8.0、5mMMgCl2、5mMDTT、0.05mg/mlBSA和大腸桿菌DAN聚合酶I(2.5μl；0.22U，1.5U/μg)或T4DNA聚合酶(3.3μl，0.22U，1.5U/mg)。在0、30、60和120分鐘分別取樣(4μl)，并加入8μl含有染料的80％甲酰胺加樣緩沖液中，在15％聚丙烯酰胺凝胺(8.3M尿素)上進(jìn)行分析，隨后在-80℃下放射自顯影，結(jié)果示于圖5。寡核苷酸序列5在30分鐘內(nèi)被消化成單核苷酸，而寡核苷酸序列7在120分鐘后完好無(wú)損。這些結(jié)果證實(shí)，3′→3′連接的寡核苷酸即使對(duì)高核酸酶活性也具有很高的抗性。為試驗(yàn)這些結(jié)果能否能推廣于哺乳動(dòng)物中存在的核酸，酶活性條件，將所述寡核苷酸與牛胎血清一起保溫。寡核苷酸對(duì)牛胎血清的穩(wěn)定性可通過(guò)如下方法確定將5′-32p標(biāo)記的寡核苷酸(100ng)與含10％牛胎血清的100μl基質(zhì)一起在37℃下保溫。在0、1、3和6小時(shí)分別取樣(10μl)。通過(guò)加入5μl蛋白酶k、10μl緩沖液(20mMTrisHCl，pH7.8，10mMNaCl，10mMEDTA，0.5％SDS)、37℃下保溫30分鐘，終止反應(yīng)。樣品隨后用苯酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，并在15％聚丙烯酰胺凝膠(8.3M尿素)上進(jìn)行分析，隨后在-80℃下放射自顯影，結(jié)果示于圖6。寡核苷酸序列5在6小時(shí)內(nèi)被充分消化，而3′→3′連接的寡核苷酸序列7則穩(wěn)定得多，在6小時(shí)后，大部分完好無(wú)損。對(duì)3′→3′連接的硫代磷酸酯寡核苷酸序列8對(duì)牛胎血清的穩(wěn)定性也進(jìn)行了研究，并將其與含寡核苷酸序列8的半數(shù)序列的寡核苷酸序列2的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較(圖7)。具有自由3′末端的寡核苷酸序列2，在1小時(shí)后開(kāi)始降解，24小時(shí)后被充分降解，不含自由3′末端的寡核苷酸序列8則穩(wěn)定得多，24小時(shí)后完好如初。這些結(jié)果與聚合酶I和T4DNA聚合酶試驗(yàn)所得結(jié)果類似，它們證實(shí)3′→3′連接的寡核苷酸對(duì)哺乳動(dòng)物血清中的外切核酸活性具有高度抗性。實(shí)施例4雙螺旋的穩(wěn)定性對(duì)3′→3′連接的寡核鉗酸與互補(bǔ)于其一個(gè)序列的DNA或RNA形成的雙螺旋的解鏈溫度進(jìn)行了測(cè)定。首先，0.2個(gè)A280單位的寡核苷酸和0.1個(gè)A280單位的其互補(bǔ)核酸在500ml緩沖液(10mMNa2HP04，pH7.4，100mMNaCl)中退火，退火時(shí)先加熱至85℃，然后慢慢冷卻至25℃。混合物隨后以1℃/分鐘的速度再次加熱至85℃，并連續(xù)記錄A260。解鏈溫度于表2中列出。表2互序核酸序列號(hào)DNATm(℃)RNATm(℃)1gag64.3gag70.32gag54.2gag62.43tat57.2tat51.04tat48.9tat42.67gag62.9gag70.3tat55.7tat49.48gag53.1gag61.6tat47.8tat40.0對(duì)含磷酸二酯(序列7)或硫代磷酸酯(序列8)鍵的3′→3′連接的寡核苷酸與互補(bǔ)鏈的解鏈溫度進(jìn)行了測(cè)定，這些互補(bǔ)鏈包括gagDNA(25體)、gagRNA(39體)、tatDNA(24體)或tatRNA(28體)，并將上述解鏈溫度與3′→5′連接的寡核苷酸序列5和序列6的相應(yīng)解鏈溫度進(jìn)行了比較。連接的寡核苷酸序列5-8的解鏈溫度也與寡核苷酸序列1-4中的每一序列與其互補(bǔ)鏈的解鏈溫度進(jìn)行了比較。寡核苷酸序列1-4、7和8與互補(bǔ)DNA和RNA的解鏈溫度于表2中列出。寡核苷酸序列1和2與互補(bǔ)DNA和RNA的解鏈溫度均高于寡核苷酸序列3和4的相應(yīng)解鏈溫度，因?yàn)楣押塑账嵝蛄?和2中的G+C含量較高。通常，PS寡核苷酸的解鏈溫度較PO寡核苷酸的解鏈溫度低8-10℃。3′→3′連接的寡核苷酸序列7和8與互補(bǔ)DNA和RNA形成的雙螺旋的解鏈溫度，較寡核苷酸序列1-4分別與互補(bǔ)核酸形成的雙螺旋的解鏈溫度平均要低約2℃。寡核苷酸序列6和7與互補(bǔ)DNA和RNA的解鏈溫度與寡核苷酸序列7和12的相應(yīng)解鏈溫度相同(數(shù)據(jù)未列出)。實(shí)施例5RNaseH裂解3′→3′連接的寡核苷酸與其互補(bǔ)靶序列(RNA)的結(jié)合也由RNaseH裂解試驗(yàn)得以證實(shí)。為進(jìn)行研究，合成了寡核苷酸52體(序列17)，它含有g(shù)ag和tat寡核苷酸的互補(bǔ)序列。5′-32P標(biāo)記的gag-tatRNA(序列17)(1pmol)分別與寡核苷酸序列1和序列3以及序列5和7的混合物(5pmol)混合，混合液體積為10ml，含20mMTrisHCl(pH7.4)、10mMMgCl2、10mMKCl、0.1mMDTT和5％的甘油。加入RNaseH(Promega，404)，總體積調(diào)整為30ml。移出7ml，加入RNaseH(Promega，0.4U)，37℃保溫。在0.5、2和5分鐘取樣(7ml)，加入10ml含染料的甲酰胺加樣緩沖液，并在15％聚丙烯酰胺凝膠(含8.3M尿素)上進(jìn)行分析，隨后在-80℃下放射自顯影(圖8)。與此類似，32p標(biāo)記的52體RNA(序列17)也與寡核苷酸序列5混合物(5pmol)一起保溫，該混合物含有互補(bǔ)于gag位點(diǎn)(序列18)或tat位點(diǎn)(序列19)的寡脫氧核苷酸(20pmol)。通過(guò)RNaseH裂解證實(shí)了3′→3′連接的寡核苷酸與互補(bǔ)RNA的結(jié)合(圖8)。52體gag-tagRNA含有與3′→3鏈接的寡核苷酸序列8的兩個(gè)序列都互補(bǔ)的區(qū)域，該RNA被用來(lái)確定3′→3′連接的寡核苷酸的兩個(gè)序列是否同時(shí)與該互補(bǔ)RNA結(jié)合。首先，確定了在寡核苷酸序列2(A道)和寡核苷酸序列4(B道)存在時(shí)，RNaseH在52體gag-tatRNA上的特異裂解位點(diǎn)。裂解位點(diǎn)在圖8中用箭頭標(biāo)出。在寡核苷酸序列2存在時(shí)，裂解產(chǎn)物為10-15體，而在寡核苷酸序列4存在時(shí)，裂解產(chǎn)物為44-46體，在不存在互補(bǔ)寡核苷酸時(shí)，未見(jiàn)RNaseH裂解52體gag-tatRNA(序列17)(數(shù)據(jù)未列出)。在3′→3′連接的寡核苷酸序列8存在時(shí)，RNaseH在gag位點(diǎn)和tat位點(diǎn)，同時(shí)裂解gag-tagRNA(序列17)(C道)，這表明3′→3′連接的寡核苷酸(序列8)的兩個(gè)序列同時(shí)與互補(bǔ)RNA結(jié)合。3′→3′連接的寡核苷酸序列8的兩個(gè)序列均能結(jié)合互補(bǔ)RNA，并同時(shí)引導(dǎo)RNaseH裂解的事實(shí)由以下結(jié)果可得到進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)3′→3′連接的寡核苷酸序列8的一個(gè)序列與互補(bǔ)DNA預(yù)先退火進(jìn)行封閉后，RNaseH主要在另一位點(diǎn)裂解52體gag-tatRNA(序列17)(D道和E道)。實(shí)施例6寡核苷酸對(duì)HIV的抑制寡核苷酸的抗HIV活性采用CD4+T細(xì)胞系MOLT-3進(jìn)行了研究，該細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基/13％牛胎血清/2％谷氨酰胺/抗生素中。細(xì)胞(5×105個(gè)分離細(xì)胞)被培養(yǎng)2小時(shí)，用不同濃度的寡核苷酸清洗和處理。4天后收集培養(yǎng)物上清液。活細(xì)胞通過(guò)染料排除計(jì)數(shù)，稀釋成每ml含5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)物用寡核苷酸再次處理。病毒復(fù)制通過(guò)p24膜表達(dá)(免疫熒光分析)進(jìn)行監(jiān)視，培養(yǎng)物上清液中以p24ELISA(DuPont)監(jiān)視。上述步驟每周重復(fù)兩次。其結(jié)果示于圖9A(0.05μM寡核苷酸)和9B(0.1μM寡核苷酸)中。tat、gag和隨機(jī)序列在第7天的活性免強(qiáng)能夠檢測(cè)或不具活性。相反，連接的寡核苷酸在第7天的活性仍相當(dāng)明顯。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Meschwitz，SusanM.Agrawal，Suhdir(ii)發(fā)明名稱用作病原體抑制劑的分支寡核苷酸(iii)序列數(shù)16(iv)通信地址(A)收件人MichaelS.Greenfield(B)街道10S.WackerDriveSuite3000(C)城市芝加哥(D)州依利諾斯(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編60606(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介物類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件DOS5.1WordPerfect(vi)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(viii)律師/代理人信息(A)姓名Greenfield，MichaelS.(B)登記號(hào)37,142(C)文件/檔案號(hào)93,743(ix)電信信息(A)電話(312)715-1000(B)電傳(312)715-1234(2)序列1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是CTCGCACCCATCTCTCTCCT20(2)序列2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..20(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列2CTCGCACCCATCTCTCTCCT20(2)序列3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(xi)序列表述序列3ACACCCAATTCTGAAAATGG20(2)序列4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..20(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列4ACACCCAATTCTGAAAATGG20(2)序列5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(xi)序列表述序列5CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTACACCCAATTCTGAAAATGG42(2)序列6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)是(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..42(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列6CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTACACCCAATTCTGAAAATGG42(2)序列7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(xi)序列表述序列7CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTGGTAAAAGTCTTAACCCACA42(2)序列8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..42(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列8CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTGGTAAAAGTCTTAACCCACA42(2)序列9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置23..42(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(xi)序列表述序列9CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置23..42(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..42(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列10CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置23..42(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(xi)序列表述序列11ACACCCAATTCTGAAAATGGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置23..42(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..42(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列12ACACCCAATTCTGAAAATGGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..20(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(xi)序列表述序列13NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置21..22(D)其它信息/注釋＝“3′→3′核苷酸間鍵”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“所有堿基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..20(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置22..42(D)其它信息/注釋＝“此區(qū)通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..42(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列14NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列15信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..20(D)其它信息/注釋＝“該序列通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(xi)序列表述序列15NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN20(2)序列16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..20(D)其它信息/注釋＝“該序列通過(guò)隨機(jī)摻入A、T、C和G堿基合成”(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)各種特征(B)位置1..20(D)其它信息/注釋＝“均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵”(xi)序列表述序列16NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN20(2)序列17信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度52堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(xi)序列表述序列17CUUACAGGAGAGAGAUGGGUGCGAGCGCCAUUUUCAGAAUUGGGUGUUGCAU52(2)序列18信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(xi)序列表述序列18AGGAGAGAGATGGGTGCGAG20(2)序列19信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)種類核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線狀(iii)是否假設(shè)否(iv)是否反義是(xi)序列表述序列19CCATTTTCAGAATTGGGTGT20權(quán)利要求1.一種抗病原體寡核苷酸，由兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的寡核苷酸序列相互連接而成，其中每一寡核苷酸序列均與病原體的一段靶序列互補(bǔ)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)5′→3′構(gòu)型相互連接，而且不與任何天然核酸相連接。3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′構(gòu)型相互連接。4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′構(gòu)型相互連接。5.一種抗病原體寡核苷酸，由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的寡核苷酸序列相互連接而成，其中該寡核苷酸序列分別與同一病原體的不同靶序列互補(bǔ)。6.根據(jù)權(quán)利要求5的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)5′→3′構(gòu)型相互連接，而且不與任何天然核酸相連接。7.根據(jù)權(quán)利要求5的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′構(gòu)型相互連接。8.根據(jù)權(quán)利要求5的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′構(gòu)型相互連接。9.一種抗病原體寡核苷酸，由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的寡核苷酸序列相互連接而成，其中一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與一種病原體的一段靶序列互補(bǔ)，一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與另一種病原體的一段靶序列互補(bǔ)。10.根據(jù)權(quán)利要求9的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)5′→3′構(gòu)型相互連接，而且不與任何天然核酸相連接。11.根據(jù)權(quán)利要求9的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′構(gòu)型相互連接。12.根據(jù)權(quán)利要求9的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′構(gòu)型相互連接。13.一種抗病原體寡核苷酸，由兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的寡核苷酸序列相互連接而成，其中一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與病原體的一個(gè)菌株的一段靶序列互補(bǔ)，一個(gè)或幾個(gè)寡核苷酸序列與同一病原體的另一個(gè)菌株的一段靶序列互補(bǔ)。14.根據(jù)權(quán)利要求13的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)5′→3′構(gòu)型相互連接，而且不與任何天然核酸相連接。15.根據(jù)權(quán)利要求13的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′構(gòu)型相互連接。16.根據(jù)權(quán)利要求13的抗病原體寡核苷酸，其中該寡核苷酸序列通過(guò)3′→3′構(gòu)型相互連接。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了新的反義寡核苷酸。該寡核苷酸對(duì)核酸酶降解的抗性提高了，對(duì)抗病原體感染的效果也提高了。該寡核苷酸包括兩個(gè)或兩個(gè)以上相同或不同的序列，這些序列均與病原體中的一段核酸序列互補(bǔ)，該病原體中的核酸序列為病原體的代謝和/或增殖所必需。這些序列可與一種病原體中的相同或不同靶核酸序列互補(bǔ)，或與同一病原體的不同菌株的靶序列互補(bǔ)，或與不同病原體中的靶序列互補(bǔ)。在優(yōu)選實(shí)施例方案中，這些序列通過(guò)3′→3′鍵相互連接，這種連接方式大大提高了對(duì)溶核降解作用的抗性。文檔編號(hào)C07H21/00GK1154703SQ95194395公開(kāi)日1997年7月16日申請(qǐng)日期1995年5月30日優(yōu)先權(quán)日1995年5月30日發(fā)明者薩德海爾·阿格雷沃,蘇珊·梅希弗茲申請(qǐng)人:海布里頓公司