專利名稱：用deae-5pw陰離子-離子交換色譜和疏水作用色譜純化硫代磷酸寡脫氧核苷酸的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及寡脫氧核苷酸純化領(lǐng)域，特別是硫代磷酸寡脫氧核苷酸的純化。
現(xiàn)有技術(shù)描述過去幾年來，在為治療目的的選擇性基因調(diào)節(jié)領(lǐng)域中，使用修飾的磷酸酯骨架寡脫氧核苷酸作為反義寡核苷酸已得到越來越多的關(guān)注?，F(xiàn)已將幾種類型修飾的磷酸酯鍵，例如，膦酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、摻入到反義寡核苷酸中并對此進行了研究。例如Erickson和Izant(Eds.)“基因調(diào)節(jié)(Gene Regulation)反義RNA和DNA生物學”(Raven出版社，紐約，1992)。已發(fā)現(xiàn)硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸能抑制免疫缺陷病毒[Agrawal等“全美科學通報”(Proc.Natl.Aca d.Sci.USA)85，7079(1988)；Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，7790(1989)；Agrawal等，“改進的藥物釋放綜述”(AdvancedDrug Delivery Reviews)6，251(R，Juliano，Ed.，Elsevier，Amsterdam，1991)；Agrawal等，“癌癥和艾滋病反義核酸治療展望”(Prospects for AntisenseNucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS)，143(E.Wickstrom，Ed.，Wiley/Liss，New York，1991)；和Zamecnikl和Agrawal“艾滋病研究年度回顧”(Annual Review of AIDS Research)，301(Koff等，Eds.，Dekker，NewYork，1991)]，并能抑制組織培養(yǎng)中的流感病毒(Leiter等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 87，3420-3434(1990))。另外，各種基礎(chǔ)研究均集中在硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸(例如，Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1401(1990)和Eckstein和Gish，Trends Biochem.Sci.14，97(1989))；酶抑制研究(Mujumdar等，“生物化學”28，1340(1989))；癌基因表達的調(diào)節(jié)(Reed等，“癌癥評述”50，6565(1990))和IL-1表達(Manson等，Lymphokine Res.9，35(1990))上。
自動合成儀已經(jīng)是獲得寡核苷酸的一種非常有價值的工具。寡核苷酸是分步合成的，每隔一定時間向新生成的寡核苷酸鏈上加上一種單體。在每一反應(yīng)周期中盡管加入核苷酸單體，但還有2-3％的反應(yīng)不能進行。因此所得產(chǎn)物一般是不同長度寡核苷酸的不均勻混合物。例如，在典型的鏈長為20個單元的產(chǎn)物合成中，該20個單元產(chǎn)物只代表50～60％回收率的寡核苷酸產(chǎn)物。
而且，在固相載體上制備寡脫氧核苷酸需要將寡脫氧核苷酸從載體上解脫下來。將該寡聚物從載體上解脫下來一般是用濃氫氧化銨處理該固相。常規(guī)下再用例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下去除該氫氧化銨。但是這種去除氫氧化銨的方法不宜用于大規(guī)模分離寡脫氧核苷酸。
對于很多目的(例如治療或診斷)來說，化合物的純度是極其重要的。因此有興趣開發(fā)純化寡核苷酸的色譜技術(shù)。因為就其治療上應(yīng)用的藥效而言，關(guān)鍵多數(shù)在于如何純化硫代磷酸寡核苷酸的問題。
純化寡脫氧核苷酸的常規(guī)方法是使用反相液相色譜。這種方法需要有防爆裝置，因為一般在洗脫緩沖液中使用了乙腈。
硫代磷酸寡脫氧核苷酸純化的方法已有報導。Agrawal等“色譜雜志”(J.Chromatography)509，396(1990)報導了使用反相柱高效液相色譜分離硫代磷酸寡核苷酸。在該項研究中，Agrawal等將硫代磷酸寡核苷酸轉(zhuǎn)化成其磷酸二酯對應(yīng)物，然后進行HPLC分析。使用該方法能在強陰離子交換柱(Partisphere SAX柱)上分析含有10個或更少核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸。但是因為與SAX基質(zhì)發(fā)生強的相互作用，不能分析比10個核苷酸多的硫代磷酸寡核苷酸。
Metelev和Agrawal，“分析生物化學”(Anal.Biochem.)200，342(1992)報導了在弱陰離子交換柱(Partisphere WAX)上進行硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸的離子交換HPLC分析，其中弱陰離子交換劑使用了與Partisphere硅石鍵連的二甲基氨基丙基官能團。離子交換容量為0.18meq/g的這種基質(zhì)與陰離子的相互作用比用強陰離子交換基質(zhì)所觀察到的相互作用更弱。該項研究的作者發(fā)現(xiàn)，對于長度達25個核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸來說，分離作用有長度依賴性。而且n-1峰可與主峰很好分離。他們還發(fā)現(xiàn)，盡管用較小梯度能獲得更好的分離效果，但用相同梯度也可分離30個核苷酸和35個核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸。
Metelev等，Ann.N.Y.Acad.Sci.(紐約科學年刊)660，321-323(1992)，報導了用離子交換HPLC分析寡核糖核苷酸和嵌合的寡核糖-寡脫氧核糖核苷酸。他們發(fā)現(xiàn)所研究的寡核苷酸的保持時間取決于寡核苷酸中核糖核苷酸殘基的數(shù)目。另外發(fā)現(xiàn)寡核糖核苷酸的保持時間與其長度有關(guān)。作者指出可以純化和分析長度高達25個核苷酸的寡核糖核苷酸。
Bigelow等，“色譜法雜志”(J.Chromatography)533，131(1990)報導了用離子對HPLC分析硫代磷酸寡核苷酸。Stec等，“色譜法雜志”326，263(1985)，和Agrawal和Zamecnik，“核酸評述”(Nucleic Acids Res.)19，5419(1990)，報導了用反相柱對含有一個或兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵連的寡脫氧核糖核苷酸的HPLC分析。
這些硫代磷酸寡核苷酸純化方法都是使用HPLC。這項技術(shù)適于少量操作，而不適于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。因此，現(xiàn)在需要有適用于大規(guī)模制備寡核苷酸的純化寡核苷酸的改進方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供純化硫代磷酸寡脫氧核苷酸的改進方法。具體地說，本發(fā)明提供的方法適合于大規(guī)模制備硫代磷酸寡核苷酸的純化技術(shù)。本發(fā)明純化方法不需要使用減壓去除氫氧化銨或使用常規(guī)的C-18硅膠反相液相色譜。本發(fā)明方法用疏水作用色譜或DEAE-5PW陰離子交換色譜代替這些過程。
本發(fā)明的一方面是用疏水作用色譜純化寡脫氧核苷酸。用氫氧化銨將寡核苷酸從它們進行合成的固相載體上脫開。一般情況下，用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分氫氧化銨。然后一般用反相色譜從無DMT的寡核苷酸中分離DMT保護的寡核苷酸。但是這些技術(shù)不適用于大規(guī)模應(yīng)用。本發(fā)明的這一方面是用疏水作用色譜代替單獨的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，或代替旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和反相色譜兩者。HIC比旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)好，因為其能簡單快速地去除氫氧化銨，可在大規(guī)模純化過程中應(yīng)用。如果其后進行RPLC，HIC相對于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來說可提高寡核苷酸的純度，結(jié)果使RPLC柱的污垢減少，也減少了用RPLC柱純化所碰到的困難。
當HIC代替旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和RPLC使用時，HIC提供了一次完成兩項任務(wù)(去除氫氧化銨，從無DMT的寡聚物中分離DMT保護的寡聚物)的優(yōu)點。用HIC代替RPLC也減少了樹脂消耗；不需要有機溶劑(用有機溶劑需要更嚴格的操作，包括特殊的控制、防爆環(huán)境、和蒸發(fā)設(shè)備)；提供了更快的排污過程(污染物例如未反應(yīng)的單體和無用的序列)；并提高了產(chǎn)率。產(chǎn)率的提高可通過使用短柱和高線性速度而實現(xiàn)。
HIC也減少了使用HPLC所帶來的高費用(指柱填料和設(shè)備)和一些可能出現(xiàn)的問題，例如HPLC柱的充料和維持的困難?？捎糜诒景l(fā)明的合適的HIC柱包括但不限于苯基-瓊脂糖凝膠快流(高取代)和TSK-凝膠苯基-5PW柱。
令人感興趣的是盡管HIC和DEAE-5PW色譜從機理上來說完全不同，但它們可為相同目的而互換使用。這兩者皆可用于純化無DMT保護的寡核苷酸。而如下面所證明的，當純化25個核苷酸的寡核苷酸時，DEAE-5PW得到更好的產(chǎn)率。使用這些技術(shù)常規(guī)上可獲得純度大約98％的寡核苷酸混合物。
象HIC柱一樣，使用DEAE-5PW柱純化無DMT保護的寡核苷酸不需要進行HPLC，因此如在比較短的柱子上進行純化一樣具有相同優(yōu)點，即提高產(chǎn)率并易于充料，而且只要簡單的洗脫分級梯度，因而簡化了設(shè)備要求并減少了可能發(fā)生的差錯。
本發(fā)明的另一方面是用DEAE-5PW柱進行離子交換。當寡核苷酸要用于治療用途時，所有的銨陽離子必需被取代例如用鈉陽離子取代。這可用Dowex陽離子交換柱接著用交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾脫鹽而實現(xiàn)。本發(fā)明的這方面技術(shù)是用DEAE-5PW柱代替標準的離子交換方法。與最近介紹的陰離子離子交換苯乙烯二乙烯苯聚合物載體(例如，Per Septive Biosytems，Polymer labs)相比，這種樹脂比較便宜，也很堅固，足以經(jīng)受在生產(chǎn)上應(yīng)用(指顆粒大小和能經(jīng)受通常使用的清洗過程)。
當使用DEAE-5PW樹脂純化寡脫氧核苷酸時，洗脫液一般具有很高的鹽濃度，使得典型的交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾脫鹽變得不實際和不可能。應(yīng)該使用其它去除鹽的技術(shù)，例如，RPLC和切向流過濾(TFF)來代替交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾。在一優(yōu)選實施例中是用切向流過濾使DEAE-5PW寡核苷酸混合物脫鹽。
以上只是概括了本發(fā)明的一些方面，不是也不應(yīng)該認為是在任何方面限制本發(fā)明。
本說明書提到的所有專利和出版物都是通過參考文獻作為整體而引入本發(fā)明的。
發(fā)明的詳細說明本發(fā)明提供了純化硫代磷酸寡脫氧核苷酸的改進方法。具體地說，本發(fā)明提供的方法適合于大規(guī)模分離硫代磷酸寡核苷酸的純化技術(shù)。本發(fā)明純化方法不需要使用減壓去除氫氧化銨或使用常規(guī)的C-18硅膠反相液相色譜。本發(fā)明方法用疏水作用色譜或DEAE-5PW陰離子離子交換色譜代替了上述這些方法。
寡核苷酸是在固相合成后，通過在氫氧化銨中將固相載體保溫而從該載體上解脫下來。從該載體上解脫下來的不僅是所要的寡核苷酸，而且也有序列斷裂的寡核苷酸，即長度少于所需核苷酸序列數(shù)目的寡核苷酸也解脫了下來。這些斷裂的序列是由于核苷酸單體沒有完全與增長的寡核苷酸鏈偶聯(lián)以及未反應(yīng)官能位點沒有完全飽和而產(chǎn)生的。如果將其有效地用于治療或其它目的，必須將需要的寡核苷酸從斷裂的序列中分離出來。
習慣上用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大量氫氧化銨，接著用反相液相色譜將所需的DMT保護的寡聚物(即有5′二甲氧三苯甲基保護基的寡核苷酸)與不需要的無DMT保護的寡聚物(即沒有5′保護基團的寡核苷酸)分離。更具疏水性的DMT保護的寡聚物比無DMT保護的寡聚物能更緊密地與反相柱結(jié)合。
如果所需的寡核苷酸要用于治療目的，與寡核苷酸配位的所有銨陽離子必須用陽離子交換(例如用鈉離子)。這通常是通過離子交換色譜后再用交聯(lián)葡聚糖凝膠脫鹽來實現(xiàn)的。
本發(fā)明包括一些改進的方法用來分離或純化硫代磷酸寡核苷酸。這里使用的“分離”和“純化”兩詞能互換使用，并且是指這樣的過程，即具有某種特定分子結(jié)構(gòu)的寡核苷酸用物理方法從具有不同分子結(jié)構(gòu)的寡核苷酸中分離出來，且將氫氧化銨和/或其它鹽從寡核苷酸混合物中去除。具體說，本發(fā)明包括使用疏水作用色譜(HIC)和DEAE-5PW離子交換色譜分離純化硫代磷酸寡核苷酸。
在本發(fā)明第一種實施方案中，所需的寡核苷酸是從過量氫氧化銨中分離出來，并將含有寡核苷酸的氫氧化銨溶液經(jīng)過疏水作用色譜接著用反相液相色譜處理而制得。優(yōu)選的是，HIC包括使含寡核苷酸的氫氧化銨通過苯基-瓊脂糖凝膠快流色譜樹脂或苯基-5PW色譜樹脂。
在本發(fā)明的第二個實施方案中，將含寡核苷酸的氫氧化銨溶液通過疏水作用色譜而將所需寡核苷酸從過量氫氧化銨和無DMT保護的寡聚物中分離出來。優(yōu)選的是用HIC處理時包括使含寡核苷酸的氫氧化銨通過苯基-瓊脂糖凝膠快流色譜樹脂或苯基-5PW色譜樹脂。
在本發(fā)明的第三個實施方案中，用DEAE-5PW柱完成離子交換(其中銨離子被交換成鈉離子)和純化。在該實施方案中發(fā)現(xiàn)，該洗脫液的鹽濃度通常對交聯(lián)葡聚糖凝膠脫鹽來說是太高，由如傳統(tǒng)上是在進行標準的寡核苷酸離子交換之后脫鹽。在該實施方案中，脫鹽是通過某種能有效控制高鹽濃度的合適技術(shù)來進行的。優(yōu)選通過切向流過濾(TFF)來進行脫鹽。TFF的優(yōu)點是能調(diào)節(jié)，使具有高鹽濃度(例如2M NaCl)的溶液能進行大容量脫鹽。
本發(fā)明也包括制備寡核苷酸的純化混合物的方法。本發(fā)明的該方法包括(a)用HIC去除氫氧化銨并去除沒有DMT保護基的寡聚物；(b)去三苯甲基化，以去除DMT保護基；(c)DEAD-5PW陰離子交換；(d)切向流過濾；和(e)凍干。
本發(fā)明方法可用來純化含有硫代磷酸寡核苷酸的粗混合物。這些粗混合物是用氫氧化銨從固相合成載體上剛解脫下來的或者是事先經(jīng)過純化程序但沒達到要求純度的混合物。
我們發(fā)現(xiàn)硫代磷酸寡核苷酸可以在DEAE-5PW離子交換柱、苯基-5PW和苯基瓊脂糖凝膠柱上用5PW水溶液進行純化，從而使硫代磷酸寡核苷酸從磷酸二酯中按高產(chǎn)率進行有效分離。本發(fā)明提出的方案可大規(guī)模純化硫代磷酸寡核苷酸以取代常規(guī)純化方法中所用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和C18硅石凝膠方案。結(jié)果減少了生產(chǎn)工藝的步驟，使產(chǎn)物達到更好的純度和收率。
根據(jù)本發(fā)明方法，長度大約10至大約35個核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸可以在DEAE-5PW離子交換柱、苯基瓊脂糖凝膠柱或苯基-5PW柱上分離。在優(yōu)選實施方案中，用本發(fā)明方法能分離大約20至大約35，優(yōu)選25-30長度的硫代磷酸寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，用本發(fā)明方法分離的寡核苷酸可以少則一個，多則所有的核苷酸之間有硫代磷酸酯鍵連接。這里所用“硫代磷酸寡核苷酸”這一詞就是這種寡核苷酸。與所描述的該硫代磷酸寡核苷酸一樣大小的硫代磷酸寡核苷酸也都可通過本發(fā)明方法分離。
將寡核苷酸置于柱上在室溫或接近室溫溫度下用梯度或非梯度緩沖液洗脫。對于用HIC進行氨溶液的純化/制備，所用乙酸銨平衡緩沖液的濃度大約0.5至大約2.0M，優(yōu)選0.75M。盡管加入乙酸銨可以使pH值稍有降低，但一般應(yīng)保持高的pH值以減少三苯甲基基團的損失。已成功地使用了7.5-11.0的pH值。一般優(yōu)選的pH值為10.0，因為該較大堿性的pH值能減少三苯甲基從寡核苷酸上失去。用水進行洗脫是最有效的，但在具體應(yīng)用中證明了可以使用緩沖液的其它方案。分離不需要有機溶劑，但當用HIC制備寡核苷酸時，接著進行的RPLC分離可能需要包括有機溶劑的溶液?？梢允褂幂^高的柱子(其高度直徑之比參見以下實施例)，而較短柱子能很好操作因而為大規(guī)模生產(chǎn)所選用。裝柱高度可以在650 OD單位/ml，取決于洗脫條件和柱子幾何條件。優(yōu)選的柱負荷是裝柱大約200 OD單位/ml。線性速度可以高到300cm/hr，但優(yōu)選大約150cm/hr。
當用HIC純化無DMT保護的寡核苷酸時，可以使用pH范圍在大約7.2至大約8.5的各種緩沖液。在優(yōu)選實施方案中，使用pH大約7.5的Tris-HCl。在裝載柱和平衡液中必須加入鹽，如氯化鈉，沖洗緩沖液濃度范圍是大約1M至大約3M，優(yōu)選大約3M。通過鹽遞減的線性或分級梯度進行洗脫。苯基瓊脂糖凝膠柱優(yōu)選以高流速的規(guī)格裝柱。發(fā)現(xiàn)速度超過大約250cm/hr裝載效果最好。以大約150-200cm/hr的速度洗脫是比較合適的。
當用DEAE-5PW純化無DMT保護的寡核苷酸時，要使用緩沖液，如Tris-HCl(優(yōu)選濃度大約10至大約50mM)。鹽(如氯化鈉)用于平衡和洗脫。優(yōu)選使用0至2M的氯化鈉梯度。對于較短柱子，氯化鈉濃度范圍優(yōu)選是在0.85和2M之間。裝柱的寡核苷酸溶液的pH可以在大約7.0和大約10.5之間，優(yōu)選大約7.2。平衡、沖洗和洗脫緩沖液的pH可以是自大約7.2至大約8.5的范圍，優(yōu)選大約7.2，在一些應(yīng)用中，可以向緩沖液中加入螯合劑如1mM的EDTA和有機溶劑如乙腈或乙醇?？梢赃M行線性梯度，但用簡單的分級梯度能得到極好的收率和純度。在很多情況下，用分級梯度能得到更好的收率(線性梯度似乎會引起固定著的產(chǎn)物從柱上緩慢流失，經(jīng)常不利于有效分離和高收率)。雖然可以使用較高的柱子，便較短的柱子有極好的效果故優(yōu)選用于大規(guī)模生產(chǎn)。寡核苷酸柱容量稍微低于HIC樹脂柱容量，最好裝柱范圍可高到大約200 OD單位/ml樹脂，優(yōu)選大約150OD單位/ml填料。最佳線性速度范圍在大約50和大約150cm/hr之間，優(yōu)選大約70cm/hr。
柱幾何條件對平衡緩沖液鹽條件的要求有十分顯著的影響-與較短柱子(高度直徑比較小)相比，較高柱子(較大的高度直徑比)需要較高鹽濃度。柱高直徑比和氯化鈉濃度之間的關(guān)系與產(chǎn)物得率有關(guān)。隨著DEAE-5PW柱的高度直徑之比的增加，最好提高平衡緩沖液中氯化鈉鹽的溶度，以獲得純化產(chǎn)物的較大收率。
本發(fā)明的分離方法基本上與裝柱顆粒大小無關(guān)。粒度在25至90μm范圍的使用效果較好。在優(yōu)選實施方案中，顆粒大小是25μm-40μm或45μm-165μm。具體優(yōu)選的疏水作用色譜樹脂的粒度大約為90μm。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認識到，對本發(fā)明可作某些改變并不偏離本發(fā)明的構(gòu)思或范圍。下面的實施例進一步詳細說明本發(fā)明，不能認為是限制本發(fā)明或本發(fā)明所說明的具體方法的范圍。
實施例在下述每一實施例中，設(shè)備和材料是從以下所指出的幾家公司購得Toso Haas(Montgomeryville，PA)；Amicon(Beverly，MA)；Waters(Milford，MA)；Hewlett-Packard(HP)(Palo Alto，CA)；Perkin-Elmer(Norwalk，CT)；ISCO(Lincoln NB)；Rainin(Woburn，MA)；Filtron(North-borough，MA)；Pharmacia(Piscataway，NJ)；和Biorad(Hercules，CA)。
實施例1用DEAE-5PW純化用0.51、30μm的TSK DEAE-5PW柱(自Toso Haas購得)純化具有CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT(GEM 91)序列的25單元寡核苷酸。樹脂裝入Pharmacia的5.0cm直徑的玻璃柱中。用帶有254nm濾器和Rainin跑兔泵的ISCO UA-5檢測器控制該純化過程。
該實施例中使用了兩種來源的GEM 91(1)從交聯(lián)葡聚糖凝膠G-15柱出來的GEM 91級份，接著在Filtron切向流過濾(TFF)膜上脫鹽和濃縮，然后進行色譜分離；(2)兩批凍干的GEM 91粉末一批是經(jīng)離子交換-HPLC低純度的，另一批是經(jīng)CGE(毛細凝膠電泳)低純度的。
GEM 91寡核苷酸按150 A260O.D(光密度)單位/ml裝柱。
用含有0.85至1.0M NaCl室溫pH 7.2的25mM Tris-HCl作緩沖液，在一些實驗中該緩沖液還含有1mM EDTA。用含有2M NaCl、pH 7.2(室溫)的25mM Tris-HCl進行洗脫，在一些實驗中，洗脫液中還含有1mMEDTA。裝上樣品后用6柱體積(4號用4柱體積)的合適的平衡緩沖液沖洗柱子。收集級份，測定O.D.收率，用離子交換HPLC(IEX)，在一些情況下用CGE分析法分析各等份的純度。
另外，在0.51柱子上進行純化，為了評價柱構(gòu)型的性能效果，以9ml柱規(guī)格進行三次實驗。
結(jié)果見表1。用離子交換(IEX)HPLC分析百分純度(％純度＝硫代磷酸的百分數(shù)，包括N和N-1序列)；#5試驗也有CGE數(shù)據(jù)(％純度＝N寡核苷酸的百分數(shù)，包括硫代磷酸和磷酸二酯寡聚物)。
在9ml(2.2cm直徑×2.4cm柱高)柱上進行三次實驗。結(jié)果見表2。
結(jié)果表明，粗產(chǎn)品寡核苷酸可以用DEAE-5PW純化，能得到高純度和極好的收率。
表1純化的收集液試驗序號 條件O.D回收百分率1％純度 產(chǎn)物回收百分率21平衡0.85M NaCl＋EDTA54.1 99.6 59.7裝載90％IEX純度32平衡1.0M NaCl/+EDTA 85.8 98.6 94.0裝載89％IEX純度3平衡1.0M NaCl 86.0 99.2 96.2裝載89％IEX純度4平衡1.0M NaCl 58.7 98.0 64.7裝載89％IEX純度5平衡1.0M NaCl 87.0 97.8 89.94裝載89％IEX純度， 84.777％CE純度重復試驗6 平衡1.0M NaCl78.398.290.1裝載87％ IEX重復試驗純度7 平衡1.0M NaCl78.798.689.3裝載87％IEX重復試驗純度8 平衡1.0M NaCl83.598.493.4裝載88％IEX重復試驗純度1以最初裝柱的總O.D(光密度)單位為基礎(chǔ)的百分收率。2以最初裝柱的“純度單位”表示的產(chǎn)物百分收率。3IEX純度單位＝(總的O.D.單位)×(IEX－HPLC分析的百分純度)；CE純度單位＝(總O.D.單位)×(CE分析的百分純度)。CE純度單位表明柱回收效率。4以CE數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。
表2純化收集液平衡緩沖液 O.D.百分 O.D.百分 ％純度(IEX 產(chǎn)物百分中的[NaCl] 回收率(總)回收率-HPLC)回收率90.85M 109.087.097.0 94.0100.85M 101.080.097.0 86.0111.0M 113.067.099.0 73.0實施例2用疏水作用色譜進行純化將GEM 91樣品進行疏水作用色譜純化。該樣品的成份如表3所示。
表3有DMT保護 百分比CGE分析的寡核苷酸的百分比PO nn-1 n-2 n-3
62 0.4 55.2 11.4 2.8 3.5這是用Ami con 2.2cm玻璃柱、Waters 650溶劑輸送系統(tǒng)、HP積分儀、Rainin Dynamax UV-C吸收檢測器和Perkin-Elmer分光光度計，在苯基瓊脂糖凝膠快流(fast flow)(高取代作用)柱上純化的寡核苷酸。
將樹脂裝填到兩種構(gòu)型柱中的一種柱中，它們的高度∶直徑比是2.2∶1或2.5∶1。
應(yīng)用下面的洗脫方案(A)將裝柱樣品調(diào)成1.7M乙酸銨溶液，pH 10.7；用2.5M乙酸銨平衡并沖洗柱子；用0.1M乙酸銨(pH 8.5)洗脫，接著用水洗脫；(B)將裝柱樣品調(diào)成1.0M乙酸銨溶液，pH10.7；用1.0M乙酸銨(pH8.5)平衡并沖洗柱子；樣品用水洗脫；(C)將裝柱樣品調(diào)成1.0M乙酸銨溶液，pH10.7；用1.0M乙酸銨(pH8.5)平衡并沖洗柱子；樣品用0.01 M NaOH(pH11.5)洗脫，接著用水洗脫；(D)裝柱樣品調(diào)成0.75M乙酸銨溶液，pH11.0；用0.75M乙酸銨(pH8.5)平衡并沖洗柱子；樣品用0.01M NaOH(pH11.5)洗脫，接著用水洗脫；用離子交換和反相(RP)HPLC方法分析沖洗和洗脫級份的等份樣品。結(jié)果見表4。
表4樣品 高度 裝載量1速度 洗脫OD百分回收率3產(chǎn)物百分回收率4洗脫純度5直徑比(cm/hr)2方案 洗脫 總計洗脫總計12.2∶1 252 316 A53.2 99.264.0 86.497.822.2∶1 252 316 B66.1 101.7 96.0 102.0 80.532.2∶1 252316/158C50.9 98.880.8 93.888.042.5∶1 200316/158C55.8 100.8 80.5 85.789.852.5∶1 200316/158C62.7 99.284.8 91.183.862.5∶1 200316/158C63.9 100.0 79.7 88.277.372.5∶1 200316/158D59.1 98.382.3 86.386.382.5∶1 178316/158D66.1 95.383.9 85.987.792.5∶1 178316/158D57.9 89.876.6 80.191.1
1裝柱的總OD單位/ml填料。
2樣品3～9以316cm/hr裝載，并以158cm/hr速度洗脫。
3OD的百分回收率＝裝柱的寡核苷酸的百分回收率洗脫＝洗脫收集液中的百分回收率總計＝全部級份的百分回收率4產(chǎn)物百分回收率＝裝柱的“DMT保護”產(chǎn)物的百分回收率洗脫＝洗脫收集液中“DMT保護”產(chǎn)物的百分回收率總計＝全部級份中“DMT保護”產(chǎn)物的百分回收率5以含DMT物質(zhì)的百分比表示(DMT保護百分率)；以下式計算(離子交換HPLC測定的DMT保護百分率＋反相HPLC測定的DMT保護百分率)/2。
用Waters 650溶劑輸送系統(tǒng)、HP積分儀、Rainin Dynamax UV-C吸收檢測器、1cm(Biorad)和2.2cm(Amicon)直徑玻璃柱、和Perkin-Elmer分光光度計，在苯基瓊脂糖凝膠快流(高取代作用)柱上純化平均DMT保護率為62％的GEM 91氨溶液。
在苯基瓊脂糖凝膠裝柱之前，將脫保護的溶液調(diào)成1.7M乙酸銨溶液，pH 10.3。苯基瓊脂糖凝膠事先用乙酸按平衡，用pH 7.85乙酸銨反梯度洗脫接著用水進行寡核苷酸洗脫。使用下面試驗條件(A)用2.5M乙酸銨(pH 8.5)平衡并沖洗柱子；用分級梯度為8％ACN的0.1M乙酸銨(pH 7.85)、接著用水洗脫寡核苷酸；(B)用1.7M乙酸銨(pH 8.5)平衡并沖洗柱子；用1.5M-1.0M和1.0M-0M乙酸銨的連串線性梯度、接著用水洗脫寡核苷酸；(C)用7M乙酸銨(pH 8.5)平衡并沖洗柱子；用分級梯度0.5M乙酸銨、接著用線性梯度0.5-0M乙酸銨、接著用水洗脫寡核苷酸；(D)用2.6M乙酸銨(pH 8.5)平衡并沖洗柱子；用分級梯度0.5M乙酸銨、接著用線性梯度0.5-0M乙酸銨、接著用水洗脫寡核苷酸。
用離子交換和反相HPLC分析方法沖洗和洗脫等分級份。結(jié)果見表5。
表5高度直徑比 裝載量1線性速度 洗脫 OD回收率 產(chǎn)物回收率 洗脫純度2(cm/hr) 方案(％) (％)洗脫 總計 洗脫 總計
5.4∶1192462A 46.9 106.4 75.4 78.199.72.2∶1385315B 42.4 97.766.7 83.697.82.2∶1385315C 18.9 101.5 30.2 93.199.02.2∶1252315D 32.3 96.652.5 85.397.51裝柱OD單位/ml填料。
2DMT保護百分率(用離子交換HPLC的離子交換方法測定的DMT保護百分率＋用反相HPLC測定的DMT保護百分率)/2這些結(jié)果表明DMT保護的寡核苷酸可以從氨溶液和無DMT保護的寡核苷酸中純化出來。
實施例3HIC代替旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和RPLC將兩份GEM 91樣品做疏水作用色譜分離。這些樣品成份如表6所示。樣品3-1已經(jīng)在4℃下以氨溶液形式保存，樣品3-2新近制備表6樣品DMT保護百分率 ％POCGEnn-1 n-2n-3163 0.456.5 10.32.82.9269 0.457.6 6.5 2.03.7用Amicon 22cm玻璃柱、Water 650溶劑輸送系統(tǒng)、HP積分儀、Rainin Dynamax UV-C吸收檢測器、和Perkin-E(mer分光光度計，在苯基瓊脂糖凝膠快流(高取代作用)柱上純化這些寡核苷酸。
將GEM 91氨溶液調(diào)成0.75M乙酸銨溶液，并以75cm/hr的速度裝載到事先用0.75M乙酸銨(pH 10.2)平衡過的柱子上。裝料后，用(0.75M)乙酸銨以317cm/hr速度沖洗柱子，再用水以159cm/hr沖洗柱子由此來洗脫DMT保護產(chǎn)物。
用離子交換和反相HPLC對沖洗和洗脫的等分進行分析。結(jié)果見表7。被洗脫下來的產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率相當于用反相液相色譜所達到的純度和產(chǎn)率。這證明適當調(diào)節(jié)裝柱和洗脫條件，用HIC在較短(低高度∶直徑比)色譜柱上能獲得極好產(chǎn)率的高純度DMT保護產(chǎn)物。
表7粗產(chǎn)品GEM 91 OD分回收率 產(chǎn)物百分回收率 洗脫純度寡聚物樣品裝載量1洗脫 總計洗脫總計 DMT保護百分率21200 55.8 102.1 85.085.397.51300 48.5 104.1 73.588.898.51200 56.6 96.183.588.996.02200 64.0 104.4 89.094.396.01裝柱總的OD單位/ml。
2計算純度(IEX－HPLC測定的DMT保護百分率＋RP－HPLC測定的DMT保護百分率)/2。
實施例4用HIC純化寡核苷酸用Biorad玻璃柱(1.5cm直徑)帶有254nm濾器的ISCOUA-5檢測器、Rainin跑兔泵、和Perkin-Elmer分光光度計，在TSK-凝膠苯基-5PW(Toso Haas)柱上和以瓊脂糖為基礎(chǔ)的苯基瓊脂糖凝膠快流(高取代作用)柱(Pharmacia)上純化GEM 91。
在2000 MWCO改進的聚醚砜濾器(Filtron，Inc.)上通過切向流過濾(TFF)，從各批產(chǎn)物的脫鹽柱(凝膠過濾)副級分中回收GEM 91(鈉鹽形式)。在施加到柱子上之前將寡脫氧核苷酸溶液調(diào)節(jié)成3M NaCl的25mMTris-HCl和pH 7.4-7.5的溶液。實驗條件A.苯基5PW；將3M NaCl/25mM Tris-HCl、pH 7.5中的寡核苷酸裝載上柱，用線性梯度3M-0M NaCl洗脫寡聚物。
B.苯基瓊脂糖凝膠；按照A中寡核苷酸相同的裝柱和洗脫條件。
C.苯基瓊脂糖凝膠；將3M NaCl/25mM Tris-HCl、pH 7.4中的寡核苷酸裝載上柱；用分級梯度2M和1M NaCl、接著用線性梯度1M-0MNaCl洗脫寡核苷酸。
D.苯基瓊脂糖凝膠；將3M NaCl/25mM Tris-HCl pH 7.4中的寡核苷酸裝載上柱；用分級梯度1M NaCl、接著用線性梯度1M-0.7M NaCl、再接著用分級梯度0.7M和0M NaCl洗脫寡核苷酸；每個柱子的結(jié)果見表8。這些結(jié)果證明，用苯基瓊脂糖凝膠快流樹脂或者苯基5PW樹脂可以純化鈉鹽形式的寡核苷酸。
表8OD單位 產(chǎn)物回收率IEX(％)1產(chǎn)物回收率CGE(％)2洗脫回收率回收率 洗脫回洗脫 回收率 洗脫回 洗脫 回收率合并的收率純度 合并的 收率純度 合并的(％) 級分(％) (％)(％) 級分(％)(％)(％) 級分(％)A53.6 94.5 59.295.991.7nd ndndB74.8 100.877.095.695.877.391.8 96.3C62.5 93.0 65.294.990.163.991.7 96.7D66.0 113.968.396.1112.2 67.192.0 110.11[(級份中CGE單位數(shù))/(裝柱量中CEG單位數(shù))]×100。
2[(級份中IEX單位數(shù))/(裝柱量中IEX單位數(shù))]×100。
實施例5用Waters 650溶劑輸送系統(tǒng)、HP積分儀、1cm(Biorad)和2.2cm(Amicon)直徑玻璃柱和Perkin-Elmer分光光度計，在苯基瓊脂糖凝膠快流(高取代作用)柱上純化平均DMT保護率為62％的GEM 91氨溶液。
將苯基瓊脂糖凝膠裝填到高度直徑比為5.4∶1、2.2∶1、和1∶1的三種構(gòu)型柱子中的一種柱子中。
在pH 8.5的乙酸銨中平衡苯基瓊脂糖凝膠柱，試驗條件如下(A)不調(diào)節(jié)GEM 91氨溶液；用2.5M乙酸銨(pH 8.5)平衡柱子；用分級梯度8％乙腈(ACN)的水溶液(pH 7.85)、接著用水洗脫寡核苷酸；或者(B)在上料前將GEM 91氨溶液調(diào)成1.7M乙酸銨溶液，pH 7.85；用1.5M乙酸銨(pH 7.85)平衡柱子；用分級梯度8％ACN的水溶液、接著用水洗脫寡核苷酸。
用離子交換和反相HPLC分析沖洗和洗脫的等分級份。結(jié)果見表9。這些結(jié)果證明，苯基瓊脂糖凝膠快流樹脂可以用來制備用于下步RPLC中DMT保護寡核苷酸粗產(chǎn)物的氨溶液。
表9高度∶直徑 裝載量1線性速度 洗脫 OD回收率產(chǎn)物回收率 洗脫純度2比 (cm/hr) 方案 (％) (％)洗脫 總計 洗脫 總計5.4∶1192 462A92.1 103.5 94.4 94.4685.4∶1450 462A80.8 104.4 97.8 97.8755.4∶1642 462A54.8 100.1 88.5 91.9805.4∶11285462A24.5 105.5 nd3nd nd1∶1 400 396A62.7 101.1 81.4 91.0811∶1 305 396A53.5 98.3 86.3 89.2721∶1 305 157A72.4 100.0 87.6 92.4751∶1 250 157A80.4 102.0 90.8 91.0702.2∶1355 396A42.1 103.5 55.1 97.2812.2∶1400 317B85.9 105.3 93.5 93.5681裝載量OD單位/ml2洗脫純度用IEX-HPLC測定實施例6使用CPG載體和自動合成儀合成GEM 91。用濃氫氧化銨將寡核苷酸從載體上解脫下來。然后基本上根據(jù)上述實施例1-6提出的方法，用苯基瓊脂糖凝膠或苯基-5PW樹脂，用疏水作用色譜，對寡核苷酸/氫氧化銨混合物進行色譜分析。收集含有GEM 91的所得溶液，并視情況可用制備反相液相色譜進行色譜分析。酸化合并的GEM 91級份，去除二甲氧基三苯甲基(DMT)保護基。將去三苯甲基化的GEM91懸浮于水中，并且基本上按照以上實施例1的說明，在DEAE-5PW離子交換柱上進行色譜分析，將其純化，并轉(zhuǎn)化成GEM 91的鈉鹽形式。然后通過切向流過濾(TFF)去除鹽和任何殘留的小分子雜質(zhì)使寡核苷酸脫鹽，然后在認定為純化的BDS膜上去熱原化。這些步驟后產(chǎn)物總回收率是大約70％，純度是大約98％。因此，使用這項技術(shù)，能有效地結(jié)合HIC和DEAE 5PW色譜，從氨溶液中獲得好收率的高純度寡核苷酸。
從以上的說明中應(yīng)該理解，盡管為了詳細說明本發(fā)明而描述了一些具體的實施方案，但不超出本發(fā)明的構(gòu)思和范圍，可以進行多種改變。
序列表(1)一般情報(i)申請人puma ph.D.，patricia(ii)發(fā)明題目purification of Oligodeoxynucleotide PhosphorothioatesUsing DEAE 5 PW Anion Exchange Chromatographyand Hydrophobic Interaction Chromatography(iii)序列數(shù)1(iv)通訊地址(A)住址Allegretti & Witcoff，Ltd.
(B)街道10 South Wacker Drive，Suite 3000(C)城市Chicago(D)州IL(E)國家USA(F)郵區(qū)60606(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)代理人(事務(wù)所)情報
(A)姓名Greenfield ph.D.，Michael S.
(B)登記號97，142(C)參考/摘要號94，444(ix)電訊情報(A)電話(312)715-1000(B)電傳(312)715-1234(2)序列鑒定號1的情報(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(iii)假擬NO(ix)特性(A)名稱/要點misc_特性(B)地址1..25(C)其它情報/注＝“所有核苷酸間連接的是硫代磷酸酯鍵”(xi)序列描述序列鑒定號1CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 2權(quán)利要求
1.一種純化無DMT保護的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括將該寡核苷酸混合物裝到含有DEAE-5 PW陰離子交換色譜樹脂的柱子上，并用含鹽的洗脫緩沖液洗脫。
2.權(quán)利要求1的方法，其中寡核苷酸長度是10至大約35個核苷酸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的鹽是氯化鈉，其含量范圍為大約0至大約2M，pH在大約7.0和大約10.5之間。
4.權(quán)利要求3的方法，其中氯化鈉濃度是大約0.85M至大約2M。
5.權(quán)利要求3的方法，其中硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的長度為大約20-35個寡核苷酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中洗脫液pH是大約7.2。
7.權(quán)利要求3的方法，進一步包括通過切向流過濾將DEAE-5 PW洗脫液脫鹽。
8.權(quán)利要求1的方法，其中寡核苷酸的裝柱規(guī)格為大約150 O.D.單位/ml的裝載濃度。
9.一種純化無DMT保護的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括將寡核苷酸混合物裝到含疏水作用色譜樹脂的柱子上并用鹽洗脫。
10.權(quán)利要求9的方法，其中疏水作用色譜樹脂是苯基-瓊脂糖凝膠快流色譜樹脂或苯基-5 PW色譜樹脂。
11.權(quán)利要求10的方法，其中寡核苷酸長度是10至大約35個核苷酸。
12.權(quán)利要求1酸的方法，其中鹽是的氯化鈉，其濃度范圍為大約1.0至大約3M，pH在大約7.2和8.5之間。
13.權(quán)利要求12的方法，其中氯化鈉濃度是大約3M。
14.權(quán)利要求12的方法，其中硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的長度為大約20-35個寡核苷酸。
15.權(quán)利要求12的方法，其中洗脫緩沖液pH是大約7.5。
16.權(quán)利要求9的方法，進一步包括通過切向流過濾將洗脫液脫鹽。
17.一種純化DMT保護硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括疏水作用色譜。
18.權(quán)利要求17的方法，其中疏水作用色譜包括使用苯基瓊脂糖凝膠或TSK苯基-5PW樹脂的柱色譜
19.權(quán)利要求17的方法、其中寡核苷酸長度
20.權(quán)利要求18的方法，其中鹽是乙酸銨，其濃度為大約0.75M
21.一種純化DMT保護的硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括用權(quán)利要求19的方法從寡核苷酸溶液中去除過量的氫氧化銨。
22.一種純化DMT保護的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括用權(quán)利要求19的方法從無DMT保護的寡核苷酸中分離DMT保護的寡核苷酸。
23.一種純化DMT保護的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括用權(quán)利要求19的方法從寡核苷酸溶液中去除過量的氫氧化銨，以及從無DMT保護的寡核苷酸中分離DMT保護的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供分離和純化硫代磷酸寡核苷酸用的一些改進的方法。本發(fā)明的某些方面是純化硫代磷酸寡核苷酸的一種方法，該方法包括將寡核苷酸的混合物裝到含DEAE(二乙基氨基乙基)-5PW陰離子離子交換色譜樹脂的柱子上，并用濃度為大約0-2M的氯化鈉洗脫緩沖液洗脫。本發(fā)明的其它方面是純化硫代磷酸寡核苷酸的另一種方法，該方法包括將寡核苷酸混合物裝到含苯基-瓊脂糖凝膠快流色譜樹脂或苯基-5PW色譜樹脂的柱子上，并用基本上無鹽的洗脫緩沖液洗脫。本發(fā)明提供的這些方法能廉價、快速、以及大規(guī)模地純化寡核苷酸的氨溶液。
文檔編號C07H1/00GK1155887SQ95194675
公開日1997年7月30日 申請日期1995年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月30日
發(fā)明者帕特里夏·龐馬, 丹·達菲, 保羅·達維德齊克 申請人:海布里頓公司