專(zhuān)利名稱(chēng)：：(1→3)－β－葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)、識(shí)別該蛋白質(zhì)的抗體及其利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從鱟的血球得到的(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)或其變體及其抗體。本發(fā)明還涉及由這些蛋白質(zhì)組成的(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定劑、由這些蛋白質(zhì)和該測(cè)定劑組成的藥盒、由這些蛋白質(zhì)和該抗體組成的藥盒，以及使用這些蛋白質(zhì)的(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定方法。本發(fā)明還涉及這些蛋白質(zhì)或結(jié)合這些蛋白質(zhì)的載體組成的(1→3)-β-D-葡聚糖的除去劑及使用該除去劑的(1→3)-β-D-葡聚糖的除去方法。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及使用這些蛋白質(zhì)的鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中存在的G因子活化的抑制方法。本發(fā)明還更進(jìn)一步涉及使用這些蛋白質(zhì)的內(nèi)毒素測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：1964年，有人發(fā)現(xiàn)鱟血球提取液(變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，以下稱(chēng)作LAL)可被極微量的革蘭氏陰性(G-)菌內(nèi)毒素(以下稱(chēng)作內(nèi)毒素(Et)或脂多糖(LPS))凝固(凝膠化)，迄今已闡明與Et(LPS)敏感因子(C因子)起始的凝膠化有關(guān)的多個(gè)因子(絲氨酸蛋白酶前體)。據(jù)報(bào)告，該反應(yīng)由類(lèi)似于哺乳動(dòng)物凝血系統(tǒng)的連鎖反應(yīng)機(jī)制組成，在其它無(wú)脊椎動(dòng)物也存在同樣的機(jī)制。另一方面，已知LAL除了Et外也與極微量的(1→3)-β-D-葡聚糖(以下也稱(chēng)作β-葡聚糖)反應(yīng)引起凝膠化，也發(fā)現(xiàn)識(shí)別β-葡聚糖的敏感因子(G因子)。而且，也闡明了通過(guò)和C因子介導(dǎo)的途徑(C因子系統(tǒng))完全不同的途徑(G因子系統(tǒng))的凝固機(jī)制，可誘導(dǎo)Et同樣的凝膠化。因?yàn)棣?葡聚糖也是真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)多糖，所以也可進(jìn)一步推測(cè)此途徑具有與C因子系統(tǒng)同樣的對(duì)機(jī)體防御的密切關(guān)系。作為β-葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)，迄今報(bào)告了鱟的血液凝固G因子〔FEBSLett.，129，318-321(1981)〕、蠶的β-葡聚糖識(shí)別蛋白質(zhì)(プロフェノ-ル氧化酶)〔J.Biol.Chem.，263，12056-12062(1988)〕、人單核細(xì)胞的β-葡聚糖受體〔J.Exp.Med.，173，1511-1520(1991)〕、局部調(diào)理素化時(shí)的補(bǔ)體受體〔J.Immunol.，124，3307-3315(1985)〕、對(duì)植物細(xì)胞的β-葡聚糖ェリシタ-〔J.CellBiol.，78，627(1978)〕、來(lái)自Streptococcussobrinus的葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)〔Infect.Immun.，60(12)5291-5293(1992)〕、來(lái)自ツヅリガ的β-葡聚糖特異性植物凝集素〔MathaV.，64，35-42(1990)〕等。發(fā)明的揭示本發(fā)明者對(duì)LAL中凝固化因子進(jìn)行研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)LAL中存在與β-葡聚糖特異性結(jié)合、抑制β-葡聚糖激活G因子的蛋白質(zhì)，并分離了這種蛋白質(zhì)。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)了選擇性識(shí)別這種蛋白質(zhì)的抗體。而且，研究了這些蛋白質(zhì)或抗體的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了其用途。即、本發(fā)明的課題是提供這樣的特異性結(jié)合于β-葡聚糖的新型蛋白質(zhì)及其抗體，將其應(yīng)用于β-葡聚糖和內(nèi)毒素的檢出、β-葡聚糖的去除或用作真菌感染治療藥。即、本發(fā)明為得自鱟血球、精制成在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中顯示單一區(qū)帶的、具有如下理化性質(zhì)的β-葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)。(1)分子量約580kDa(非還原條件下的凝膠過(guò)濾)約170kDa(還原條件下的SDS-PAGE)(2)等電點(diǎn)約9.2(3)紫外吸收光譜280nm處具有最大吸收(4)溶解性易溶于水(5)物質(zhì)的顏色白色且N末端氨基酸序列如下所示。Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro-Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp-Phe-Asn-(式中，Xaa表示存在于自然界的任何氨基酸)。而且，本發(fā)明中也包含上述蛋白質(zhì)的變體。本發(fā)明中的變體為與上述蛋白質(zhì)功能相同的物質(zhì)，通過(guò)取代、缺失或追加該蛋白質(zhì)的氨基酸而對(duì)其功能無(wú)實(shí)質(zhì)性影響的物質(zhì)。更進(jìn)一步，較好的是，本發(fā)明中的變體其氨基酸序列具有高度相同性，意味著所要求的效果與該蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上相同的蛋白質(zhì)(以下稱(chēng)包括這些變體的蛋白質(zhì))。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及如下所述的抗體、使用這些抗體的葡聚糖測(cè)定劑、測(cè)定盒及葡聚糖測(cè)定方法。(1)選擇識(shí)別上述蛋白質(zhì)的抗體。(2)由上述蛋白質(zhì)或標(biāo)記的上述蛋白質(zhì)組成的(1→3)-β-D-葡聚糖測(cè)定劑。(3)由上述蛋白質(zhì)和上述抗體或標(biāo)記的上述抗體組成的(1→3)-β-D-葡聚糖測(cè)定盒。(4)由上述蛋白質(zhì)和上述測(cè)定劑組成的(1→3)-β-D-葡聚糖測(cè)定盒。(5)以上述蛋白質(zhì)和試樣中的(1→3)-β-D-葡聚糖反應(yīng)形成復(fù)合物、檢出該復(fù)合物為特征的(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定方法。(6)上述(5)中所述的測(cè)定方法，即采用所述抗體或標(biāo)記的或可標(biāo)記的抗體進(jìn)行上述復(fù)合物的檢出。(7)(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定方法，其特征在于將試樣中的(1→3)-β-D-葡聚糖固定在固相上，或以可形成固相的上述蛋白質(zhì)和該標(biāo)記蛋白質(zhì)挾持，形成三明治狀復(fù)合物，上述蛋白質(zhì)為可固定于固相的物質(zhì)時(shí)，將該復(fù)合物固定于固相上，將固相與液相分離后，測(cè)定任一相的標(biāo)記物質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及從含有這樣的葡聚糖的樣品中除去葡聚糖的葡聚糖除去劑及除去方法。(8)上述蛋白質(zhì)或固定蛋白質(zhì)的載體組成的(1→3)-β-D-葡聚糖除去劑。(9)(1→3)-β-D-葡聚糖的除去方法，其特征在于將上述蛋白質(zhì)或固定于上述載體上的上述蛋白質(zhì)與樣品中的(1→3)-β-D-葡聚糖反應(yīng)，形成復(fù)合物，從樣品中分離除去該復(fù)合物。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及G因子活化的抑制方法。(10)上述蛋白質(zhì)與鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物混合，或樣品與上述蛋白質(zhì)混合后、該樣品與鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物混合組成的該鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中存在的G因子的活化的抑制方法。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及內(nèi)毒素的測(cè)定方法。(11)內(nèi)毒素的測(cè)定方法，其特征在于用采用鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的鱟反應(yīng)測(cè)定含(1→3)-β-D-葡聚糖的樣品中所含的內(nèi)毒素時(shí)，在鱟反應(yīng)之前，將樣品與上述蛋白質(zhì)混合，或?qū)⒃撊馨a(chǎn)物與上述蛋白質(zhì)混合。本發(fā)明的β-葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)(以下也稱(chēng)GBP)可應(yīng)用通常用于鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物配制的低滲液提取法，從鱟Tachypleustridentatus、Tachypleusgigas、Limuluspolyphemus、Carcinoscorpiusrotundicauda等的血球(變形細(xì)胞)中提取〔例如，參照J(rèn).Biochem.，80，1101-1021(1976)〕。具體地為在鱟的血球中，加入冷卻至0-4℃的0.02MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)，于0-4℃攪拌，提取。將提取液冷卻、離心，得到上清液(溶胞產(chǎn)物)。在此溶胞產(chǎn)物中含有プロクロツテイング酶(ProCE)、凝固蛋白原(coagulogen)、G因子、B因子、C因子、GBP、抗LPS因子等各種凝血系統(tǒng)因子。溶胞產(chǎn)物上以0.02-0.05MTris-鹽酸緩沖液(pH7.0-8.5)(含有0-0.2MNaCl)平衡過(guò)的CL-6B親和柱(以硫酸右旋糖酐、瓊脂糖CL-6B(Pharmacia制)，用已知的方法(Anal.Biochem.60，149-152(1974)制備)，用含有0.2-0.5MNaCl的上述緩沖液洗脫。在洗脫部分中取顯示GBP活性的流份。這樣便得到混有B因子、C因子和GBP的流份。將此流份冷凍干燥，冷凍干燥物用凝膠過(guò)濾色譜法精制。凝膠過(guò)濾色譜法是用以0.02-0.08MTris-鹽酸緩沖液(pH6.5-8.5)(含有0.4-1MNaCl)平衡過(guò)的SephacrylS-300HR(高分辨)柱(Pharmacia制)或セルロファインGCL-2000m柱(生化學(xué)工業(yè)(株)出售)等進(jìn)行的。用于平衡的緩沖液進(jìn)行洗脫，較好的是，同樣的色譜法至少重復(fù)進(jìn)行2次。將凝膠過(guò)濾色譜法的洗脫部分分別收集，對(duì)各流份測(cè)定GBP活性，取顯示此活性的流份。在第一次色譜分離中，B因子、C因子和GBP幾乎完全分離，再通過(guò)用同樣柱的色譜法，得到精制的GBP。收集此流份，冷凍干燥，得到本發(fā)明的GBP。它是白色粉末，易溶于水。此GBP在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中顯示單一區(qū)帶，顯示上述理化性質(zhì)。本發(fā)明的GBP因N末端氨基酸序列已確定，可用公知的遺傳工程方法(例如從該序列制成DNA引物，用此引物從鱟血球得到的cDNA文庫(kù)得到編碼GBP的DNA，將此DNA整合入載體，得到重組體，使其按常規(guī)方法表達(dá)等方法)得到。本發(fā)明中的GBP的活性按如下方法進(jìn)行測(cè)定在β-葡聚糖(用Saito等的方法(Agri.Biol.Chem.，32，1261-1269(1968))，從茯苓制得的茯苓糖(Pachyman)的50pg/ml0.01MNaOH水溶液)0.05ml中加入上述色譜的各流份0.05ml，37℃加溫10分鐘，加入按Obayashi等的方法(Clic.Chim.Acta，149，55-65(1985))從Tachypleustridentatus變形細(xì)胞的胞溶產(chǎn)物制得的G因子(0.04ml)和プロクロツテイング酶(ProCE)(0.02ml)，以及1MMgSO4(0.01ml)、2MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)(0.01ml)和作為プロクロツテイング酶(ProCE)底物的5mM叔丁氧基羰基-L-亮氨酰-甘氨酰-L-精氨酰-對(duì)硝基苯胺(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)(0.02ml)，37℃反應(yīng)20分鐘，將游離的對(duì)硝基苯胺用重氮偶合反應(yīng)發(fā)色后，測(cè)定545nm的吸光度。然后，以用水代替樣品時(shí)測(cè)定的G因子活化能力(對(duì)照)作為100％時(shí)的相對(duì)活性作為抑制活性。G因子活化能力的抑制是由GBP和β-葡聚糖的結(jié)合引起的(參照后面的實(shí)施例)。因此，將此G因子抑制活性作為GBP活性。本發(fā)明的GBP純度的測(cè)定可用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(pH7.0-8.0，5-7.5％凝膠或pH4-5，5-7.5％凝膠)、SDS-PAGE(pH7.0-8.0，6-7.5％凝膠，0.1-0.2％SDS)或等電點(diǎn)電泳(IEF)來(lái)進(jìn)行。GBP的分子量測(cè)定可用SDS-PAGE、SephacrylS-300HR或セルロファインGCL-2000m等凝膠過(guò)濾、干涉光學(xué)系的沉降平衡、超速離心的沉降測(cè)定、粘度、光散射、用火棉膠膜等的滲透壓測(cè)定、氨基酸分析、激光離子化質(zhì)譜法等進(jìn)行。但是，本發(fā)明的GBP是對(duì)具有特定結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖有親和性的物質(zhì)，而且與通常的蛋白質(zhì)相比分子量也非常大，因此在用具有糖苷鍵的不溶性載體進(jìn)行凝膠過(guò)濾和質(zhì)譜等物理測(cè)定的情況下，難以得到真正的值。這就需要選擇無(wú)干擾作用的載體和條件。本發(fā)明的GBP的紫外吸收光譜見(jiàn)圖7。如圖所示280nm處有最大吸收。本發(fā)明的GBP的N末端氨基酸序列如序列表1號(hào)序列所示。本發(fā)明也包括上述變體。本發(fā)明的GBP特異性地結(jié)合于具有(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)構(gòu)的β-聚葡糖苷，中和也具有對(duì)鱟G因子的活化能力的β-葡聚糖的生物化學(xué)性質(zhì)和免疫藥理學(xué)性質(zhì)。而且也同樣中和除直鏈(1→3)-β-D-葡聚糖以外具有(1→6)-β-D-或(1→4)-β-D-等分子內(nèi)側(cè)鏈的支鏈(1→3)-β-D-葡聚糖。(抗體)選擇性識(shí)別本發(fā)明的GBP的抗體(以下稱(chēng)作抗GBP抗體)，為以精制的GBP作為抗原而得到的對(duì)此抗原的抗血清、多克隆抗體和單克隆抗體。本發(fā)明中使用的多克隆抗體的制備方法，可以列舉將該抗原給予家兔、山羊等被免疫動(dòng)物，所得的抗血清再加以精制等方法。在投與被免疫動(dòng)物時(shí)，合用佐劑可望激活抗體產(chǎn)生細(xì)胞。本發(fā)明中使用的單克隆抗體的制備方法，可以列舉如下制備方法，即將該抗原給小鼠或大鼠腹腔注射后摘出脾臟等，將從該脾臟等取出的細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞株骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，建立雜交瘤，使所得的雜交瘤在試管內(nèi)連續(xù)增殖，再?gòu)乃玫碾s交瘤中選出持續(xù)產(chǎn)生抗上述抗原的特異性抗體的細(xì)胞株，將選出的此細(xì)胞株在試管內(nèi)培養(yǎng)或在小鼠腹腔等生物體內(nèi)培養(yǎng)，大量地制備單克隆抗體。作為細(xì)胞融合用的細(xì)胞可用脾細(xì)胞以外的淋巴結(jié)細(xì)胞和末梢血液中的淋巴細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞株來(lái)自同種細(xì)胞株的比來(lái)自異種細(xì)胞株的為好，可得到穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體的雜交瘤。所得的多克隆抗體和單克隆抗體的精制方法可列舉用硫酸鈉、硫酸銨等中性鹽的鹽析、低溫醇沉淀和聚乙二醇或按等電點(diǎn)選擇的分步沉淀法、或電泳、用DEAE載體、CM載體等離子交換劑和蛋白質(zhì)A、羥基磷灰石吸附劑的解吸法、凝膠過(guò)濾和超速離心法等。(測(cè)定法)本發(fā)明的GBP特異性地結(jié)合于具有(1→3)-β-D-葡聚糖苷結(jié)構(gòu)的β-聚葡糖苷(以下稱(chēng)作(1→3)-β-D-葡聚糖)，因此，該GBP與試樣中的(1→3)-β-D-葡聚糖反應(yīng)，形成復(fù)合物，檢出該復(fù)合物便可測(cè)定(1→3)-β-D-葡聚糖。本發(fā)明的(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定方法可列舉如下方法。例如將試樣中的(1→3)-β-D-葡聚糖固定在固相上，或以可固定的GBP和標(biāo)記GBP挾持，形成三明治狀復(fù)合物，蛋白質(zhì)或其變體為可固定于固相的物質(zhì)時(shí)，將該復(fù)合物固定于固相上，將固相與液相分離后，用應(yīng)用于該標(biāo)記物質(zhì)的方法測(cè)定任一相的標(biāo)記物質(zhì)，從而測(cè)定(1→3)-β-D-葡聚糖。此(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定方法可為例如在固定于固相上的GBP上添加含(1→3)-β-D-葡聚糖的試樣，使該GBP與(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合，同時(shí)或其后添加預(yù)先以標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的GBP，將該(1→3)-β-D-葡聚糖以該GBP和含標(biāo)記的GBP挾持，形成三明治狀復(fù)合物，或?qū)㈩A(yù)先以標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的GBP和(1→3)-β-D-葡聚糖的試樣混合，該標(biāo)記的GBP與(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合形成結(jié)合物，將此結(jié)合物添加在固定于固相上的GBP上，形成上述三明治狀復(fù)合物后，將該復(fù)合物固定的固相與液相分離，用適用于該標(biāo)記物質(zhì)的方法檢出任一相的標(biāo)記物質(zhì)(例如固定于固相的該復(fù)合物的標(biāo)記物質(zhì))。本發(fā)明中所用的標(biāo)記GBP可以用已知方法以標(biāo)記物質(zhì)(酶(過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等)、放射性同位素(125I、131I、3H等)、熒光物質(zhì)(熒光素異硫氰酸酯、繖形酮等)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(魯米諾等)或其它物質(zhì)(生物素、抗生物素蛋白(較好的為鏈霉抗生物素蛋白)等)直接標(biāo)記GBP而得到。GBP的標(biāo)記方法宜選自適用于標(biāo)記物質(zhì)的方法，如標(biāo)記酶時(shí)的戊二醛法、高碘酸交聯(lián)法、馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)法、碳化二亞胺法等，用放射性同位素標(biāo)記時(shí)的氯胺T法、乳過(guò)氧化物酶等(續(xù)生化學(xué)講座5免疫生化學(xué)研究法、東京化學(xué)同人、1986年發(fā)行、參照歐洲專(zhuān)利第0163041號(hào)說(shuō)明書(shū))。將本發(fā)明的GBP固定于微量培養(yǎng)板、珠、管、膜、乳膠、試管、濾紙及瓊脂糖、聚丙烯酰胺、纖維素和葡聚糖等不溶性載體的固相上的方法，可采用物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法等一般的固定化酶的制備方法(參照固定化醇素、1975年、談講社發(fā)行、第9-75頁(yè))。特別以較為簡(jiǎn)便的物理吸附法為佳。GBP不結(jié)合的部分用血清白蛋白、明膠、乳蛋白等進(jìn)行封閉為宜。下面對(duì)本發(fā)明的測(cè)定方法作更詳細(xì)的說(shuō)明。首先，將GBP固定在固相上。固定的方法可為例如將GBP溶解在pH9-10的磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液中，加在固相上，于4℃下保持6-14小時(shí)的固定方法。如上述固定后，添加封閉劑，該GBP未固定的部分必須預(yù)先被覆蓋。封閉劑可為例如從牛等采取的血清白蛋白。血清或乳蛋白等。接著，在上述GBP固定的固相上添加含(1→3)-β-D-葡聚糖的試樣，使(1→3)-β-D-葡聚糖與上述GBP結(jié)合。含(1→3)-β-D-葡聚糖的試樣除可使用人、牛、大鼠、小鼠等血液和體液等之外，可將下述試樣直接作為樣品。使(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合后，一般推薦將固相用添加Tween類(lèi)表面活性劑等的磷酸鹽緩沖液洗滌。再在上述(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合的固相上，添加標(biāo)記的GBP，使該標(biāo)記的GBP結(jié)合于(1→3)-β-D-葡聚糖。用此操作使(1→3)-β-D-葡聚糖形成以上述GBP和該標(biāo)記的GBP挾持的三明治狀復(fù)合物。然后，測(cè)定該三明治狀復(fù)合物的標(biāo)記物質(zhì)，對(duì)(1→3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行定量。標(biāo)記物質(zhì)的測(cè)定方法因標(biāo)記物質(zhì)而異，例如在對(duì)標(biāo)記物質(zhì)使用生物素的情況下，在上述形成三明治狀復(fù)合物的固相或不溶性載體上添加結(jié)合有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的酶，使酶通過(guò)抗生物素蛋白結(jié)合于復(fù)合物上，測(cè)定該酶的酶促反應(yīng)引起的底物的變化。然后，對(duì)(1→3)-β-D-葡聚糖濃度和標(biāo)記物質(zhì)測(cè)定結(jié)果的關(guān)系作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用未知樣品的測(cè)定結(jié)果和該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)未知檢體中的(1→3)-β-D-葡聚糖定量。作為本發(fā)明的測(cè)定方法，可向固定的(1→3)-β-D-葡聚糖(如細(xì)胞和組織中存在的(1→3)-β-D-葡聚糖、以物理或化學(xué)方法結(jié)合于不溶性的載體等的(1→3)-β-D-葡聚糖等)添加以標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的GBP，形成該(1→3)-β-D-葡聚糖和該GBP的復(fù)合物，從復(fù)合物的標(biāo)記物質(zhì)檢出(1→3)-β-D-葡聚糖或進(jìn)行定量。本發(fā)明的測(cè)定方法還可以是在上述固定的(1→3)-β-D-葡聚糖上添加GBP，使該(1→3)-β-D-葡聚糖與該GBP形成復(fù)合物，然后添加選擇識(shí)別GBP的抗體，再用特異性識(shí)別該抗體的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)該物質(zhì)檢出(1→3)-β-D-葡聚糖或加以定量，或使該復(fù)合物形成后，添加用標(biāo)記物質(zhì)預(yù)先標(biāo)記的該抗體，通過(guò)該標(biāo)記物質(zhì)檢出(1→3)-β-D-葡聚糖或加以定量。特異性識(shí)別該抗體的物質(zhì)，可為例如按已知方法用標(biāo)記物質(zhì)(如生物素、抗生物素蛋白、酶、同位素、熒光色素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等)標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體所形成的化合物等。本發(fā)明的試劑盒由GBP和標(biāo)記的GBP構(gòu)成。使用本發(fā)明的試劑盒時(shí)，必須有將該GBP固定于固相上的步驟，但是，通過(guò)將該GBP預(yù)先固定在固相上可省略該步驟。本發(fā)明的試劑盒也可由GBP和選擇性識(shí)別GBP的抗體構(gòu)成，也可再加上標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體。本發(fā)明的試劑盒還可由GBP和標(biāo)記的抗GBP抗體構(gòu)成。本發(fā)明的試劑盒中也可再加上上述固相、檢測(cè)標(biāo)記物質(zhì)的試劑、緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等，制成試劑盒。(除去)本發(fā)明的GBP和樣品中的(1→3)-β-D-葡聚糖反應(yīng)形成復(fù)合物，從樣品中分離除去該復(fù)合物即可除去(1→3)-β-D-葡聚糖。該復(fù)合物的分離除去方法可使用公知的蛋白質(zhì)分離方法。然而，較好的是使試樣中的(1→3)-β-D-葡聚糖與固定了GBP的載體(更好的是不溶性載體)接觸，使該GBP與(1→3)-β-D-葡聚糖形成復(fù)合物，分離除去該復(fù)合物的方法。這時(shí)所用的載體的形狀可列舉具有膜狀(濾膜形、中空纖維狀、管形、平膜形等)、粒狀、乳膠狀、片狀、粉末狀、微量培養(yǎng)板狀等形狀的物體。載體以無(wú)(1→3)-β-D-葡聚糖的為佳。將GBP與載體結(jié)合，可以是使GBP與聚苯乙烯類(lèi)或聚丙烯類(lèi)等載體物理性的結(jié)合，或GBP與聚酰胺類(lèi)、纖維素類(lèi)、瓊脂糖類(lèi)、聚丙烯酰胺類(lèi)、葡聚糖類(lèi)、乙烯基聚合物類(lèi)(甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的多孔性共聚體)等載體的化學(xué)性結(jié)合。作為化學(xué)性結(jié)合法，可根據(jù)載體的種類(lèi)，從以下公知的結(jié)合方法中選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，用于GBP的結(jié)合，這些方法是利用載體的芳香族氨基進(jìn)行重氮偶合反應(yīng)的重氮法、用CNBr使載體的羥基活化形成肽鍵的CNBr法、用載體的肼衍生物等形成肽鍵的酰迭氮法、利用鹵素等反應(yīng)性強(qiáng)的載體官能團(tuán)將蛋白質(zhì)烷基化的烷化法、用戊二醛之類(lèi)與游離氨基反應(yīng)的交聯(lián)試劑使載體和蛋白質(zhì)的游離氨基之間交聯(lián)的方法、碳化二亞胺法、環(huán)氧活化法、以及用這些方法通過(guò)間隔物結(jié)合的方法等。結(jié)合了GBP的載體與含(1→3)-β-D-葡聚糖的樣品接觸的方法可以是公知的固液接觸方法，例如將樣品液通過(guò)膜狀載體的方法；將樣品液通過(guò)充填了粒狀載體的柱的方法；將樣品加入微量培養(yǎng)板載體的孔中，放置一定時(shí)間后將樣品分離的方法；將樣品加在任意形狀的載體上，振搖一定時(shí)間后，靜置，用通常的固液分離方法(過(guò)濾、離心分離、抽濾、傾析等)得到除去(1→3)-β-D-葡聚糖的樣品的方法等。在用采用鱟變形細(xì)胞胞溶產(chǎn)物的鱟反應(yīng)測(cè)定Et時(shí)，通過(guò)在LAL或樣品中加入該GBP，該GBP結(jié)合于(1→3)-β-D-葡聚糖上，形成復(fù)合物，這樣，利用抑制(1→3)-β-D-葡聚糖敏感因子(G因子)的活化，通過(guò)LAL中的C因子系統(tǒng)反應(yīng)，可特異性地測(cè)定含(1→3)-β-D-葡聚糖的樣品中的Et而不受(1→3)-β-D-葡聚糖的影響。這樣，本發(fā)明的GBP可用作(1→3)-β-葡聚糖和Et的檢出及測(cè)定試劑，而且(1→3)-β-D-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)多糖，GBP與此多糖結(jié)合，對(duì)真菌等的增殖可給予影響，因此可望開(kāi)發(fā)成醫(yī)藥品，特別是抗真菌劑。本發(fā)明的(1→3)-β-D-葡聚糖測(cè)定或除去方法可以是用于檢出或除去血清、血漿、尿、腦脊液等體液、非經(jīng)口醫(yī)藥品、輸液、注射用水、生物學(xué)制劑等試樣中可能含有的(1→3)-β-D-葡聚糖的方法。關(guān)于本發(fā)明的內(nèi)毒素的測(cè)定，可以是用于檢出與上述同樣的樣品中含有的內(nèi)毒素的方法。附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1表示實(shí)施例1中鱟血球提取物的硫酸右旋糖酐瓊脂糖CL-6B柱層析的洗脫曲線(xiàn)。圖2表示圖1的GBP活性部分的SephacrylS-300HR色譜曲線(xiàn)。圖3表示圖2的GBP活性部分的第二次SephacrylS-300HR色譜圖。圖4表示用采用SephacrylS-300HR的凝膠過(guò)濾法得到的本發(fā)明的GBP的估計(jì)分子量。圖5表示用SDS-PAGE得到的本發(fā)明的GBP的估計(jì)分子量。A欄和B欄分別表示分子量標(biāo)記和還原條件下的GBP的分子量。圖6表示用等電點(diǎn)電泳分析法得到的本發(fā)明的GBP的等電點(diǎn)。A欄和B欄分別表示GBP的等電點(diǎn)和標(biāo)記物的等電點(diǎn)。圖7表示本發(fā)明的GBP的紫外吸收光譜。圖8表示本發(fā)明的GBP對(duì)G因子活化抑制能力和GBP用量。圖9為表示用本發(fā)明的測(cè)定方法得到的(1→3)-β-D-葡聚糖的濃度與吸光度的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)施本發(fā)明的最佳狀態(tài)下面舉出實(shí)施例來(lái)表示實(shí)施本發(fā)明的最佳狀態(tài)。本實(shí)施例中所用的全部玻璃器具都經(jīng)干熱滅菌(250℃、2小時(shí))成為無(wú)β-葡聚糖的狀態(tài)加以使用。部分試劑在活性炭處理后用121℃高壓釜處理20-90分鐘，也成為無(wú)β-葡聚糖的狀態(tài)。以下操作全部在無(wú)β-葡聚糖的狀態(tài)下進(jìn)行。實(shí)施例1GBP的精制及理化性質(zhì)(1)GBP的精制將日本產(chǎn)的鱟(Tachypleustridentatus)血淋巴液2.5L于4℃、1,500rpm下離心10分鐘，在其沉淀部分(血球變形細(xì)胞)約50g中加入0.02MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)500ml，用勻漿器(PolitronRRT10(商品名)，Kinematica公司制)破碎均勻并取出，于4℃、10,000×G下冷卻離心30分鐘，得到上清液(溶胞產(chǎn)物)450ml。將其全量添加在用0.02MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)平衡過(guò)的硫酸右旋糖酐-瓊脂糖CL-6B柱(5×23cm)上，用同樣的緩沖液1.0L洗滌后，用含有0.2MNaCl的0.02MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)1.5L洗脫，再用含0.45MNaCl的0.02MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)1.5L洗脫。這些洗脫液以每10ml一份加以收集。按照Obayashi等的方法(Clin.Chim.Acta，149，55-65(1985))測(cè)定這樣洗脫的流份的活性。即プロクロツテイング酶(ProCE)、B因子、C因子和G因子的活性測(cè)定采用405nm的吸光度，凝固蛋白原(coagulogen)的活性測(cè)定采用360nm的吸光度。GBP的活性用后面敘述的方法(參照實(shí)施例2-(4)實(shí)驗(yàn)3，用水代替GBP作對(duì)照)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1。GBP存在于0.45MNaCl洗脫部分，對(duì)β-葡聚糖引起的G因子的活化有很強(qiáng)的抑制作用。將此洗脫部分收集在茄形燒瓶中，冷凍干燥。將此冷凍干燥物溶于25ml水，全量添加在以0.05MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0，含有0.5MNaCl、4mMCaCl2)平衡過(guò)的SephacrylS-300HR柱(2.2×95cm)上，以18ml/小時(shí)的流速洗脫，每流份2.5ml。GBP活性用上述方法測(cè)定，將抑制G因子活化能力50％的量作為100單位。以下GBP活性的單位有時(shí)用U表示。按照Obayashi等的方法(Clin.Chim.Acta，149，55-65(1985))，測(cè)定545nm處的吸光度，求出B因子和C因子的活性。結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2所示，可見(jiàn)GBP的活性在第70-88流份(47.5ml)。將此洗脫部分冷凍干燥，用8ml水溶解，再次添加在用與上面同樣的緩沖液平衡過(guò)的SephacrylS-300HR柱(1.4×95cm)上，以4.5ml/小時(shí)的流速洗脫，每0.93ml為一流份，測(cè)定GBP活性。其結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖3所示，可見(jiàn)GBP的活性在第81-84流份。這樣所得的GBP在用硫酸右旋糖酐-瓊脂糖進(jìn)行親和層析(圖1)后，用SephacrylS-300HR凝膠過(guò)濾，可幾乎完全分離B因子和C因子(圖2)。再通過(guò)用同樣的載體的層析可得到高純度的精制品。表1表示此精制步驟的比活性。溶胞產(chǎn)物(粗提取液)中存在大量G因子，因此不可能測(cè)定GBP的活性，進(jìn)行這樣的層析，與G因子相互分離，才能知道GBP活性和GBP的存在。該GBP也可從其它種的鱟(如Limuluspolyphemus、Tachypleusgigas、Carcinoscorpiusrotundicauda)的溶胞產(chǎn)物同樣地進(jìn)行制備。表12)GBP的理化性質(zhì)(1)分子量的測(cè)定使用上述SephacrylS-300HR色譜柱(1.4×95cm，柱床體積(Vt)＝146.2ml)進(jìn)行色譜分析，算出具有GBP活性的流分的洗出位置(Ve)，通過(guò)以高分子量凝膠過(guò)濾試劑盒(Pharmacia公司產(chǎn)品)的各蛋白質(zhì)的表觀分配系數(shù)((Ve-V0/Vt-V0)，以Kav表示)相對(duì)于分子量的對(duì)數(shù)而繪出的校正曲線(xiàn)，推定GBP的分子量。其結(jié)果，如圖4所示，該GBP活性流分中的GBP的分子量約為580千道爾頓。此外，將由上述方法純化得到的GBP(1.9×103units/ml，蛋白質(zhì)濃度245.2μg/ml)0.3ml加至截留分子量5,000的離心過(guò)濾管(0.3ml容量，ゥルトラフリ-(Ultrafree)C3LCC，Millipore公司產(chǎn)品)中，在4℃離心(4500×g，50分鐘)后，往濃縮液(0.03ml)中加水，使其達(dá)到0.3ml，然后再在同樣條件下離心過(guò)濾濃縮至變成0.03ml。對(duì)該試樣按Laemmli的方法〔Nature，227，680-685(1970)〕，在用2-巰基乙醇還原的條件下進(jìn)行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，測(cè)定分子量，其結(jié)果，如圖5所示，測(cè)得分子量為約170千道爾頓。使用的標(biāo)記是下述6種蛋白質(zhì)(BoehringerMannheimGmbH公司產(chǎn)品)α2-巨球蛋白(170k)、β-半乳糖苷酶(116.4k)、果糖-6-磷酸激酶(85.2k)、谷氨酸脫氫酶(55.6k)、醛縮酶(39.2k)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(26.6k)。(2)等電點(diǎn)的測(cè)定再使用PhastGelIEFgradient3-9和PhastSystemTM(均為Pharmacia公司產(chǎn)品)，按常法(InGelElectrophoresisandIsoelectricFocusingofProteins236-240(1984))進(jìn)行等電點(diǎn)電泳。將電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。其結(jié)果見(jiàn)圖6。如圖6所示，為單一的條帶，等電點(diǎn)(pI)約為9.2。使用的標(biāo)記為下述10種蛋白質(zhì)(Pharmacia公司產(chǎn)品)胰蛋白酶原(pI9.30)、兵豆凝集素堿性側(cè)條帶(pI8.65)、兵豆凝集素中間條帶(pI8.45)、兵豆凝集素酸性側(cè)條帶(pI8.15)、肌紅蛋白堿性側(cè)條帶(pI7.35)、肌紅蛋白酸性側(cè)條帶(pI6.85)、牛碳酸酐酶B(pI5.85)、β-乳球蛋白(pI5.20)、大豆胰蛋白酶抑制劑(pI4.55)和淀粉葡萄糖苷酶(pI3.50)。(3)GBP的N末端氨基酸部分序列的測(cè)定用Matsudaira的方法(J.Biol.Chem.，262，10035-10038(1987)〕測(cè)定GBP的N末端氨基酸序列。以每泳道(lane)0.0lml的量將GBP(1.7×104units/ml)加載在7.5％的平板凝膠上，用30mA的恒電流進(jìn)行泳動(dòng)。切出泳動(dòng)后的凝膠，用水洗滌5分鐘后，在轉(zhuǎn)移緩沖液〔0.01M3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)/10％甲醇〕中浸漬15分鐘。然后，用トランスブロツテインゲサンドイヂtransplotingsandwich裝置于4℃經(jīng)18小時(shí)(20V，恒電壓)將蛋白質(zhì)從凝膠復(fù)制至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-RadLaboratories產(chǎn)品)上。取出PVDF膜，水洗5分鐘，用0.1％考馬斯亮藍(lán)R-250/50％甲醇染色5分鐘后，反復(fù)水洗3次，在潔凈室干燥1小時(shí)后在-35℃保存。用消毒切刀切割目的的條帶，按常法用氣相氨基酸序列分析儀(島津制作所產(chǎn)品，PPSQ-10)進(jìn)行分析。其結(jié)果，得到下列N末端的氨基酸序列。Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro-Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp-Phe-Asn-(式中，Xaa表示自然界中存在的任何氨基酸)(4)GBP的紫外吸收光譜和物性測(cè)定該流分的紫外吸收光譜，如圖7所示，得到在280nm具有最大吸收的特征光譜。將該流分冷凍干燥，得到白色粉末。該白色粉末易溶于水。實(shí)施例2GBP作用的研究(1)對(duì)G因子的抑制活性使用由實(shí)施例1制得的純GBP(10、20、40、60、80μg/ml)各0.05ml，按上述方法求出對(duì)G因子的抑制活性(GBP活性)。結(jié)果見(jiàn)圖8。圖8表明，GBP活性存在對(duì)用量的依從關(guān)系。(2)加熱處理對(duì)GBP活性的影響將由實(shí)施例1制得的純GBP在100℃處理3分鐘后離心(1000×g，15分鐘)，用水將所得上清液稀釋10倍，取出0.05ml，按上述方法比較處理前后對(duì)G因子的抑制活性的變化。結(jié)果見(jiàn)表2。表2方法總活性(U)殘存活性(％)對(duì)照(未處理)42.8100加熱(100℃，3分鐘)4.19.6表2表明，GBP是不耐熱(對(duì)熱不穩(wěn)定性)的蛋白質(zhì)。(3)GBP的結(jié)合特異性往GBP(1.6×104units/ml)0.05ml中加入直鏈(1→3)-β-D-葡聚糖和支鏈(1→3)-β-D-葡聚糖，按上述方法測(cè)定GBP活性和殘存活性，算出抑制率。結(jié)果見(jiàn)表3。這里使用的直鏈(1→3)-β-D-葡聚糖和支鏈(1→3)-β-D-葡聚糖的供應(yīng)商如下所示。直鏈(1→3)-β-D-葡聚糖茯苓糖(Pachyman)(按Agric.Biol.Chem.，32，1261-1269(1968)的方法制備)凝膠多糖(Curdlan)(來(lái)源于AlcaligenesFaecalisvar.myxogenes，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社銷(xiāo)售)羧甲基凝膠多糖(CarboxymethylatedCurdlan；CMPS)(按Phytochemistry，1，175-188(1962)的方法制備，取代度0.63)。眼蟲(chóng)糖(Paramylon)(來(lái)源于Euglenagracillis，按Biochim.Biophys.Acta.，44，161-163(1960)的方法制備)支鏈(1→3)-β-D-葡聚糖(1→6)，(1→3)-β-D-葡聚糖裂裥菌素(Schizophyllan)(Sonifilan；日本科研制藥株式會(huì)社銷(xiāo)售)、香菇多糖(Lentinan)(日本味之素株式會(huì)社銷(xiāo)售)、昆布多糖(Laminaran)(來(lái)源于Laminariadigitata，Sigma公司銷(xiāo)售)、昆布多糖(Laminaran)(來(lái)源于Eiseniaaraborea，NakaraiTask株式會(huì)社銷(xiāo)售)(1→4)，(1→3)-β-D-葡聚糖地衣多糖(Lichenan)(來(lái)源于Cetrariaislandica，Sigma公司銷(xiāo)售)、大麥β-D-葡聚糖(Barleyβ-D-glucan)(Sigma公司產(chǎn)品)將昆布多糖、羧甲基凝膠多糖、裂裥菌素(2×10-6g/ml溶液)、香菇多糖(2×10-8g/ml溶液)、地衣多糖、大麥β-D-葡聚糖分別溶解在蒸餾水中，將茯苓糖、凝膠多糖分別溶解在0.1M氫氧化鈉水溶液中，將眼蟲(chóng)糖、裂裥菌素(1×10-9g/ml溶液)、香菇多糖(2×10-10g/ml溶液)分別溶解在0.3M氫氧化鈉水溶液中，用蒸餾水或0.01M氫氧化鈉水溶液適當(dāng)稀釋后加以使用。表3DW、NaOH表示樣品的溶解液。DW表示蒸餾水，NaOH表示氫氧化鈉水溶液。此外，往GBP(1.6×102units/ml)0.025ml中加入β-葡聚糖以外的各種多糖的樣品0.025ml，在37℃加溫10分鐘后，加入100pg/ml的茯苓糖0.025ml，再在37℃放置10分鐘。然后，加入G因子(0.04ml)、酶(ProCE)(0.02ml)、1MMgSO4(0.01ml)、2MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)(0.01ml)、5mMBoc-Leu-Gly-Arg-pNA(0.02ml)，在37℃反應(yīng)20分鐘，測(cè)定殘存活性，算出抑制率。結(jié)果見(jiàn)表4。使用的多糖的供應(yīng)商如下所示。(1→4)-β-D-葡聚糖羧甲基纖維素(Carboxymethylcellulose)(鈉鹽，ナカライテスク株式會(huì)社銷(xiāo)售)(1→6)-β-D-葡聚糖石耳多糖(Gyrophoran)(來(lái)源于Gyrophoraesculenta，按J.Ferment.Technol.，50，388-396(1971)的方法制備)(1→6)-α-D-葡聚糖右旋糖酐(Dextran)(來(lái)源于Leuconostocsp，分子量-40,000，生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷(xiāo)售)(1→4)，(1→6)-α-D-葡聚糖聚麥芽三糖(Pullulan)(來(lái)源于Pullulariapullulans，日本林原生物化學(xué)研究所銷(xiāo)售)(1→2)，(1→3)，(1→6)-α-D-甘露聚糖酵母α-D-甘露聚糖(Sigma公司銷(xiāo)售)(1→3)-β-D-木聚糖(Xylan)(木糖的聚糖甙。來(lái)源于Caulerpabrachypus，按Nature，187，82-83(1960)的方法制備)將羧甲基纖維素、右旋糖酐和聚麥芽三糖溶解在蒸餾水中，將石耳多糖溶解在0.1M氫氧化鈉水溶液中，將α-D-甘露聚糖和β-D-木聚糖溶解在0.3M氫氧化鈉水溶液中，分別用蒸餾水適當(dāng)稀釋后加以使用。表4DW、NaOH表示樣品的溶解液。DW表示蒸餾水，NaOH表示氫氧化鈉水溶液。如表3所示，除直鏈(1→3)-β-D-葡聚糖以外，發(fā)現(xiàn)對(duì)(1→6)，(1→3)-β-D-和(1→4)，(1→3)-β-D-葡聚糖之類(lèi)的支鏈(1→3)-β-D-葡聚糖以及羧甲基化(1→3)-β-D-葡聚糖也有抑制活性。此外，對(duì)具有(1→3)-β-D-葡聚糖以外結(jié)構(gòu)的多糖，如上所述，預(yù)先與GBP混合加溫后，再加入(1→3)-β-D-葡聚糖，根據(jù)(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合能力即對(duì)G因子的抑制活性受到何種程度的抑制而加以判斷。表4表明，完全未發(fā)現(xiàn)對(duì)羧甲基纖維素((1→4)-β-D-)、石耳多糖((1→6)-β-D-)、右旋糖酐((1→6)-α-D-)、聚麥芽三糖((1→4)，(1→6)-α-D-)、酵母α-甘露聚糖((1→2)，(1→3)，(1→6)-α-D-)、木聚糖(木糖的聚糖甙，(1→3)-β-D-)的抑制活性。(4)關(guān)于GBP對(duì)G因子的抑制作用的詳細(xì)研究實(shí)驗(yàn)1將G因子0.04ml、酶(ProCE)0.02ml、1MMgSO40.01ml、2MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)0.01ml和50pg/ml的茯苓糖(以下有時(shí)稱(chēng)BG)0.05ml混合，在37℃反應(yīng)20分鐘后，分別加入GBP(1.6×104units/ml)0.05ml和5mM底物(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA；以下有時(shí)稱(chēng)Sub)0.02ml，在37℃反應(yīng)3分鐘，按已知方法(Tamura，H等，Thromb.Res.，27，51-57(1982))用重氮偶合劑使游離的p-硝基苯胺發(fā)色，測(cè)定545nm的吸光度。實(shí)驗(yàn)2往G因子0.04ml中加入GBP0.05ml，在37℃加溫10分鐘后，分別加入50pg/mlBG0.05ml、ProCE0.02ml、1MMgSO40.01ml、2MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)0.01ml和5mMSub0.02ml，在37℃反應(yīng)20分鐘，與(1)同樣，用重氮偶合劑發(fā)色后，測(cè)定545nm的吸光度。實(shí)驗(yàn)3往BG0.05ml中加入GBP0.05ml，在37℃加溫10分鐘后，分別加入G因子0.04ml、ProCE0.02ml、1MMgSO40.01ml、2MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)0.01ml和5mMSub0.02ml，在37℃反應(yīng)20分鐘，與(1)同樣，用重氮偶合劑發(fā)色后，測(cè)定545nm的吸光度。實(shí)驗(yàn)4往G因子0.04ml、ProCE0.02ml、50pg/mlBG0.05ml、1MMgSO40.01ml、2MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)0.01ml和5mMSub0.02ml的混合液中加入GBP0.05ml，在37℃反應(yīng)20分鐘，與(1)同樣，用重氮偶合劑使游離的p-硝基苯胺發(fā)色后，測(cè)定545nm的吸光度。同時(shí)，在(1)-(4)中，分別用水代替GBP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以作為對(duì)照，算出G因子活化的抑制率(％)。結(jié)果見(jiàn)表5。表5</tables>FG表示G因子，BG表示茯苓糖((1→3)-β-D-葡聚糖)，ProCE表示酶，GBP表示硫酸右旋糖酐-SepharoseCL-6B的0.45MNaCl洗脫流分(含本發(fā)明的蛋白質(zhì))，Sub表示底物(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)。表5顯示，預(yù)先將本發(fā)明的蛋白質(zhì)(GBP)與(1→3)-β-D-葡聚糖混合、加溫(37℃)，可顯著提高對(duì)G因子活化的抑制能力。因此，這與在迄今已知的小分子的水溶性聚糖甙(G因子活化抑制劑；參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)公報(bào)WO90/02951)如昆布多糖低聚糖、凝膠多糖甲酸水解物中發(fā)現(xiàn)的G因子活化抑制劑和G因子的直接結(jié)合而產(chǎn)生的與(1→3)-β-D-葡聚糖(BG)的拮抗抑制不同，被認(rèn)為是(1→3)-β-D-葡聚糖與GBP的直接結(jié)合即由外源凝集素樣相互作用而產(chǎn)生的G因子活化抑制，本發(fā)明的蛋白質(zhì)(GBP)直接結(jié)合在(1→3)-β-D-葡聚糖上的觀點(diǎn)得到支持。通過(guò)上述研究，可以認(rèn)為，GBP在以(1→3)-β-D-葡聚糖為觸發(fā)劑的G因子系統(tǒng)的控制、調(diào)節(jié)以及體內(nèi)的(1→3)-β-D-葡聚糖的輸送以及真菌增殖的抑制等方面具有重要作用。實(shí)施例3對(duì)GBP的抗血清的制備及純化將400μg/ml的純GBP水溶液500μl和等容量的弗氏完全佐劑(ヤトロン株式會(huì)社產(chǎn)品)混合。然后皮下注射于2只兔子(JW，雄性，體重1.8kg)。每2周重復(fù)同樣的致敏操作，重復(fù)4次后，作為追加免疫，靜脈注射100μg/ml的GBP水溶液0.2ml。在末次注射1周后，取出兔子全部的血。接著，在室溫放置1小時(shí)，并在4℃放置一晚，然后以2000rpm離心分離5分鐘，將所得血清60ml在56℃加熱處理30分鐘，進(jìn)行滅活后，添加防腐劑疊氮化鈉0.06g(0.1％(W/V))，得到抗血清。用オクタロニ-雙重?cái)U(kuò)散法測(cè)定抗血清的抗體效價(jià)。再按常法，用硫酸銨對(duì)該血清進(jìn)行鹽析和用蛋白質(zhì)A進(jìn)行親和色譜精制，得到純免疫球蛋白。實(shí)施例4使用GBP進(jìn)行(1→3)-β-D-葡聚糖的定量將純GBP水溶液(400μg/ml)用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)稀釋103倍，并將稀釋液50μl分別滴加在無(wú)β-葡聚糖的96孔微量培養(yǎng)板(トキシペツトプレ-ト，日本生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷(xiāo)售)上，然后在4℃放置12小時(shí)，使該GBP吸附在培養(yǎng)板的固相上(固定)。吸出該溶液，用PBS緩沖液(以下稱(chēng)PBS)洗滌3次后，將所有孔用含5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉，在37℃加溫2小時(shí)。接著，用含0.1％Tween-20的PBS(以下稱(chēng)PBS-TW)洗滌3次，加入(1→3)-β-D-葡聚糖溶液(0.1、1、10、100、1000ng/ml)100μl，在37℃反應(yīng)2小時(shí)。然后用PBS-TW洗滌3次，加入用生物素標(biāo)記的GBP水溶液(0.2μg/ml)100μl，在37℃反應(yīng)2小時(shí)后，加入過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉生物素結(jié)合蛋白(1μg/ml)100μL，在37℃放置2小時(shí)。再加入發(fā)色底物溶液〔含四甲基聯(lián)苯胺10mg和30％H2O22μl的50mM乙酸緩沖液，pH5.0(10ml)〕100μl，在室溫下加溫10分鐘后，加入2M硫酸50μl，停止反應(yīng)，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(WellReaderSK601，日本生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷(xiāo)售)測(cè)定450nm的吸光度(對(duì)照630nm)。(1→3)-β-D-葡聚糖的用量依從性(與GBP的反應(yīng)性，校正曲線(xiàn))見(jiàn)圖9。實(shí)施例5使用GBP進(jìn)行的(1→3)-β-D-葡聚糖的檢出將含作為抗原的(1→3)-β-D-葡聚糖和牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合物(按Agric.Biol.Chem.，54，1953-1959(1990)的方法制備)1.5μg的抗原溶液100μl加至無(wú)β-葡聚糖的96孔微量培養(yǎng)板(トキシペツトプレ-ト96F，日本生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷(xiāo)售)的孔中，在4℃放置12小時(shí)，使抗原涂布在培養(yǎng)板上。吸出抗原溶液，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次后，將所有孔用含5％BSA的PBS(以下稱(chēng)封閉溶液)充滿(mǎn)，在37℃加溫2小時(shí)。接著，除去孔中的封閉溶液，用含0.1％Tween-20的PBS(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PBS-Tween-20)洗滌3次，然后往孔中加入1μg/ml的GBP水溶液100μl，在37℃保溫2小時(shí)。用PBS-Tween-20洗滌孔后，將用PBS以1∶5000、1∶10000和1∶50000的比例稀釋過(guò)的抗GBP血清或正常兔血清加入孔中，在37℃加溫2小時(shí)。用PBS-Tween-20洗滌后，加入用PBS以1∶1000的比例稀釋過(guò)的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊的抗兔IgG血清，在37℃保溫2小時(shí)。用PBS-Tween-20洗滌孔，然后加入發(fā)色底物溶液〔含四甲基聯(lián)苯胺10mg和30％H2O22μl的50mmol/L乙酸緩沖液，pH5.0(10ml)〕100μl，在室溫下保溫10分鐘。然后加入2M硫酸50μl，停止反應(yīng)，以660nm為對(duì)照，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(WellReaderSK601，日本生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷(xiāo)售)測(cè)定450nm的吸光度。使用抗GBP血清，如上所述，以實(shí)驗(yàn)證明GBP和(1→3)-β-D-葡聚糖系直接結(jié)合。兔抗GBP血清對(duì)GBP和(1→3)-β-D-葡聚糖的復(fù)合體的反應(yīng)性的結(jié)果見(jiàn)表6。表6</tables>實(shí)施例6使用GBP除去(1→3)-β-D-葡聚糖將無(wú)(1→3)-β-D-葡聚糖的Sepharose4B(Pharmacia公司產(chǎn)品)100ml移至玻璃濾器(#2)上，用2升注射用蒸餾水(以下稱(chēng)DW)抽吸洗滌后，放入1升容量的燒杯中，加入蒸餾水200ml。邊用磁力攪拌器攪拌，邊用10N氫氧化鈉調(diào)至pH11-12，然后，緩慢加入溶解在蒸餾水500ml中的溴化氰(CNBr)25g，當(dāng)pH不變化時(shí)即中止反應(yīng)。用玻璃濾器過(guò)濾該經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B，并用冷水2升、0.1M碳酸氫鈉1升洗滌。往該活化的Sepharose4B10ml中加入GBP凍干粉末2mg，使其濃度為0.2mg/ml，在用旋轉(zhuǎn)器(rotator)攪拌的同時(shí)，在4℃處理24小時(shí)。反應(yīng)后，為使殘存的雜質(zhì)(亞氨碳酸酯類(lèi))失活，在0.2MTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中放置5小時(shí)。往固定了GBP的Sepharose4B0.5g中加入(1→3)-β-D-葡聚糖溶液(0.1、1、10、100μg/ml)，用復(fù)式攪拌器(multishaker)連續(xù)攪拌8小時(shí)。然后，以3000rpm離心10分鐘后，往上清液50μl中加入(1→3)-β-D-葡聚糖特異性的合成底物試劑(グルスペシ-，日本生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷(xiāo)售)50μl，測(cè)定溶液中殘存的(1→3)-β-D-葡聚糖量。以在無(wú)載體的條件下進(jìn)行同樣操作時(shí)為100％，算出使用本載體的(1→3)-β-D-葡聚糖除去率。用固定了GBP的載體進(jìn)行的(1→3)-β-D-葡聚糖除去試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表7。表7</tables>工業(yè)上應(yīng)用的可能性如上所述，由于本發(fā)明的(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)及識(shí)別其的抗體可特異性地檢測(cè)出試樣中的內(nèi)毒素、(1→3)-β-D-葡聚糖等或高效率地除去樣品中的(1→3)-β-D-葡聚糖，因此，可用作這些物質(zhì)的檢測(cè)試劑或除去劑。所以，可用于檢測(cè)試樣或樣品中的這些物質(zhì)以及使它們無(wú)毒化。此外，本發(fā)明的(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)具有與真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)多糖(1→3)-β-D-葡聚糖結(jié)合，抑制真菌增殖的可能性，可望開(kāi)發(fā)成醫(yī)藥，尤其是抗真菌藥。序列表序列號(hào)1序列的長(zhǎng)度44序列的類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類(lèi)蛋白質(zhì)來(lái)源鱟血球序列LysSerGlyPheIleLeuThrAlaProLys1510SerLeuThrLeuGlyArgAsnAsnArgLeu1520AsnLeuHisLeuPheAspIleAsnThrAsn2530GlyPheXaaArgIleGlyValLysAspGln3540AsnAspPheAsh權(quán)利要求1.在聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示單一區(qū)帶的、具有如下理化性質(zhì)的與(1→3)β-D-葡聚糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)或其變體(1)分子量約580kD(非還原條件下的凝膠過(guò)濾)約170kD(還原條件下的SDS-PAGE)(2)等電點(diǎn)約9.2(3)紫外吸收光譜280nm處具有最大吸收(4)溶解性易溶于水(5)物質(zhì)的顏色白色。2.按權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或其變體，其N(xiāo)末端氨基酸序列如下所示Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro-Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp-Phe-Asn-式中，Xaa表示存在于自然界的任何氨基酸。3.按權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)或其變體，它得自鱟血球。4.選擇性識(shí)別權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體的抗體。5.由權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體組成的(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定劑。6.按權(quán)利要求5所述的測(cè)定劑，它是用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)或其變體的。7.由權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體和權(quán)利要求4所述的抗體組成的(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定盒。8.按權(quán)利要求7所述的測(cè)定盒，它是用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記抗體的。9.由權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體和權(quán)利要求6所述的測(cè)定劑組成的(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定盒。10.(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定方法，其特征在于使權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體與試樣中的(1→3)-β-D-葡聚糖反應(yīng)形成復(fù)合物，然后檢出該復(fù)合物。11.按權(quán)利要求10所述的測(cè)定方法，即采用權(quán)利要求4所述的抗體進(jìn)行復(fù)合物檢出的方法。12.按權(quán)利要求11所述的測(cè)定方法，其中抗體為標(biāo)記的或可標(biāo)記的。13.(1→3)-β-D-葡聚糖的測(cè)定方法，其特征在于將試樣中的(1→3)-β-D-葡聚糖固定在固相上，或者以可被固定的權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體與以標(biāo)記物標(biāo)記的權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體挾持，形成三明治狀復(fù)合物，蛋白質(zhì)或其變體為可固定于固相的物質(zhì)時(shí)，將該復(fù)合物固定于固相上，將固相與液相分離后，測(cè)定任一相的標(biāo)記物質(zhì)。14.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體組成的(1→3)-β-D-葡聚糖除去劑。15.按權(quán)利要求14所述的除去劑，它是蛋白質(zhì)或其變體固定在載體上的物質(zhì)。16.(1→3)-β-D-葡聚糖的除去方法，其特征在于將權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體與樣品中的(1→3)-β-D-葡聚糖反應(yīng)，形成復(fù)合物，從試樣中分離除去該復(fù)合物。17.按權(quán)利要求16所述的除去方法，它是將蛋白質(zhì)或其變體固定在載體上的方法。18.鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中存在的G因子的活化的抑制方法，其特征在于將權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體與鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物混合，或樣品與該蛋白質(zhì)或其變體混合，或該樣品與該鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物混合。19.內(nèi)毒素的測(cè)定方法，其特征在于用采用鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的鱟反應(yīng)測(cè)定含(1→3)-β-D-葡聚糖的樣品中所含的內(nèi)毒素時(shí)，在鱟反應(yīng)之前，將樣品與權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其變體混合，或?qū)⒃撊馨a(chǎn)物與該蛋白質(zhì)或其變體混合。全文摘要通過(guò)將鱟血球提取液進(jìn)行親和層析處理和凝膠過(guò)濾可得到的、分子量約為580kDa(非還原條件下的凝膠過(guò)濾)和約為170kDa(還原條件下的SDS－PAGE)的(1→3)－β－D－葡聚糖結(jié)合性蛋白質(zhì)或其變體,選擇性識(shí)別它們的抗體,用這些蛋白質(zhì)和抗體檢出試樣中的(1→3)－β－D－葡聚糖的方法,用結(jié)合了這些蛋白質(zhì)的載體從樣品中除去(1→3)－β－D－葡聚糖的方法,可用于試樣或樣品中所含的內(nèi)毒素、(1→3)－β－D－葡聚糖的檢出或(1→3)－β－D－葡聚糖的除去。文檔編號(hào)C07K16/18GK1185161SQ95194888公開(kāi)日1998年6月17日申請(qǐng)日期1995年8月31日優(yōu)先權(quán)日1994年9月1日發(fā)明者田村弘志,田中重則申請(qǐng)人:生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社