專利名稱：肽衍生的放射性核素螯合劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于診斷造影領(lǐng)域，涉及用來對以所要診斷的組織為靶的試劑進(jìn)行放射性標(biāo)記的化學(xué)螯合劑。
背景技術(shù)：
診斷造影技術(shù)中采用造影劑，其選擇性地結(jié)合或定位于體內(nèi)位點(diǎn)，幫助分辨所要診斷部位的影象。例如67鎵鹽具有對腫瘤和被感染組織的親和性，并且借助于X射線斷層掃描照相術(shù)能夠使醫(yī)生發(fā)現(xiàn)受傷的體內(nèi)組織。其它造影劑包括金屬放射性核素，如99m锝和186/188錸，其已被用來標(biāo)記靶向分子，諸如位于人體特定部位的蛋白質(zhì)、肽和抗體。
作為靶向試劑，蛋白質(zhì)和其它大分子能提供滿足診斷準(zhǔn)確性要求的組織特異性；但從其物質(zhì)結(jié)構(gòu)而言，用金屬放射性核素標(biāo)記這些試劑很困難。具體而言，蛋白質(zhì)和肽靶向試劑存在可與放射性核素結(jié)合的多個(gè)位點(diǎn)，從而得到不均勻標(biāo)記的產(chǎn)物。而且，盡管這些蛋白質(zhì)分子可能很大，但其很少能呈現(xiàn)出一種最適于與高親和性放射性核素結(jié)合的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，即結(jié)合有4個(gè)或多個(gè)供體原子形成5元環(huán)的區(qū)域，因此，放射性核素通常被結(jié)合于較為豐富的低親和性位點(diǎn)，形成不穩(wěn)定配合物。
為解決這種低親和力結(jié)合問題，Paik等人(Nucl Med Biol 1985，123)提出了一種方法，其中在過量DPTA(二氨亞丙基五乙酸)存在下對抗體進(jìn)行標(biāo)記，使低親和力結(jié)合位點(diǎn)隱蔽起來。雖然通過這種方法能避免低親和力結(jié)合問題，但這種情況中實(shí)際上放射性核素锝的結(jié)合量最終仍是很低的。已有文獻(xiàn)報(bào)道了具有高半胱氨酸殘基比例的蛋白質(zhì)的直接標(biāo)記(Dean等；WO 92/13572)。該方法利用了半胱氨酸殘基中的巰基作為放射性核素結(jié)合的高親和性位點(diǎn)，并且該方法必須限于應(yīng)用在那些具有所需巰基結(jié)構(gòu)的靶向性試劑中。
代替靶向性試劑直接標(biāo)記的一種可行方法是采用間接標(biāo)記途徑，其中使用一螯合劑使靶向性試劑和放射性核素偶聯(lián)。用作螯合劑的候選物是那些與所選金屬放射性核素緊密結(jié)合的并且還具有與靶向性分子結(jié)合的反應(yīng)官能團(tuán)的化合物。為用于標(biāo)記肽和以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的靶向性試劑，理想的螯合劑也是以肽為基礎(chǔ)的，如此可使用肽合成技術(shù)全部合成這些螯合劑-靶向性分子共軛物，為用于診斷造影，理想的螯合劑應(yīng)具有適于體內(nèi)應(yīng)用的性質(zhì)，諸如血和腎清除性及血管外擴(kuò)散性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了與診斷用金屬放射性核素鍵連的螯合劑，其能與可在體內(nèi)定位欲診斷位點(diǎn)和欲治療位點(diǎn)的靶向性試劑偶聯(lián)。本發(fā)明螯合劑為肽類似物，設(shè)計(jì)其結(jié)構(gòu)存在N3S構(gòu)型，能鍵連氧代、二氧代和99m锝及186/188錸的次氮基離子。
更具體而言，本發(fā)明 一方面提供了下式所示的金屬放射性核素螯合劑
其中X是一直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的C1-4烷基鏈，該烷基鏈可任選地插入一個(gè)或兩個(gè)選自N、O和S的雜原子；并且可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；Y是H或由X定義的取代基；X和Y一起形成一個(gè)5-至8-元飽和或不飽和雜環(huán)，該雜環(huán)可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、氧代、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；R1至R4各自獨(dú)立地選自H；羧基；C1-4烷基；被選自羥基、氨基、巰基、鹵素、羧基、C1-4烷氧羰基和氨基羰基的一個(gè)基團(tuán)取代的C1-4烷基；除脯氨酸外的D-或L-氨基酸的α-碳側(cè)鏈；和C(O)Z；R5和R6各自獨(dú)立地選自H；羧基；氨基；C1-4烷基；被羥基、羧基或氨基取代的C1-4烷基；和C(O)Z；R7選自H和硫保護(hù)基；及Z選自羥基、C1-4烷氧基和靶向性分子。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明螯合劑其具有通式II的配合金屬放射性核素的形式
其中X是一直鏈或支鏈、飽和或不飽和C1-4烷基鏈，該烷基鏈可任選地插入一個(gè)或兩個(gè)選自N、O和S的雜原子；并且可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；Y是H或X定義的取代基；X和Y一起形成5-至8-元飽和或不飽和雜環(huán)，該雜環(huán)可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、氧代、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；R1至R4各自獨(dú)立地選自H；羧基；C1-4烷基；被一個(gè)選自羥基、氨基、巰基、鹵素、羧基、C1-4烷氧羰基和氨基羰基的基團(tuán)取代的C1-4烷基；除脯氨酸外的D-或L-氨基酸的α碳側(cè)鏈；和C(O)Z；R5和R6各自獨(dú)立地選自H；羧基；氨基；C1-4烷基；被羥基、羧基或氨基取代的C1-4烷基；和C(O)Z；Z選自羥基、C1-4烷氧基和一個(gè)靶向性分子；M是一金屬放射性核素或其氧化物或氮化物。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于造影的共軛物，其中螯合劑所呈形式是與診斷用靶向性分子偶聯(lián)，并可任選地與配合的金屬放射性核素結(jié)合。
本發(fā)明另一方面提供了一種在所要診斷位點(diǎn)進(jìn)行造影的方法，其中首先對病人施用作為放射性核素配合物的本發(fā)明共軛物，然后用造影方法探測放射性核素所處部位。
附圖簡述

圖1為以99mTc標(biāo)記的N，N-二甲基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH共軛物的HPLC分析結(jié)果。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了金屬放射性核素螯合劑，當(dāng)其與靶向性分子偶聯(lián)時(shí)，能用來將放射性核素遞送至所要治療或診斷的身體部位。正如上式中所示，該螯合劑為肽化合物，其呈現(xiàn)N3S構(gòu)型，其中放射性核素被螯合。
這里所用的定義R1-R7、X、Y和Z各種變化的術(shù)語含義如下“烷基”指直鏈或支鏈C1-4鏈；“芳基”指芳香環(huán)或雜芳香環(huán)；“鹵素”指F、Cl和Br；“硫保護(hù)基”指抑制巰基氧化的化學(xué)基團(tuán)，包括那些在金屬螯合作用時(shí)可被裂解的基團(tuán)。適合的硫保護(hù)基包括已知的烷基、芳基、?；?、鏈烷酰基、芳酰基、巰?；陀袡C(jī)硫代基。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，螯合劑符合上式，其中R1至R4各自獨(dú)立地選自H；羥基取代的C1-4烷基，如羥甲基和1-羥乙基；R5和R6各自獨(dú)立地選自H和C1-4烷基，優(yōu)選均為H；R7是氫原子或硫保護(hù)基，且最優(yōu)選乙酰氨基甲基；X是C1-4烷基鏈，優(yōu)選甲基或乙基；或被芳基取代的C1-4烷基鏈，優(yōu)選形成芐基；Y是H或X定義的取代基；優(yōu)選甲基、乙基或芐基，最優(yōu)選為與X相同；Z是OH，C1-4烷氧基或一靶向性分子，優(yōu)選肽靶向性分子。
本發(fā)明具體螯合劑包括N，N-二甲基Gly-Ser-Cys(Acm)-OH；N，N-二甲基Gly-Thr-Cys(Acm)-OH；N，N-二乙基Gly-Ser-Cys(Acm)-OH；N，N-二芐基Gly-Ser-Cys(Acm)-OH；和肌氨酸-Ser-Cys(Acm)-OH。
當(dāng)X和Y代表的取代基與鄰接的N原子形成一個(gè)雜環(huán)時(shí)，該環(huán)可以是5-至8-元飽和環(huán)，例如吡咯烷、哌啶、 1-氮雜環(huán)庚烷和1-氮雜環(huán)辛烷。由X和Y形成的不飽和環(huán)包括吡咯和4H-吡啶，顯然環(huán)中結(jié)合的氮原子必須是三價(jià)的且不能與鄰位原子形成雙鍵。由X和Y形成的雜環(huán)也可包含另外一個(gè)或兩個(gè)選自N、O和S的雜原子。具有另外雜原子的環(huán)包括1-咪唑、吡唑、哌嗪、嗎啉和硫代嗎啉，但不限于這些。由X和Y形成的環(huán)也可被一個(gè)或多個(gè)并優(yōu)選少于三個(gè)基團(tuán)取代，取代基選自鹵素、羥基、羧基、氧代、C1-4烷基和芳基，例如形成4-氧代-1-哌啶、4-氧代-1-吡咯烷和4-羥基-1-哌啶。
為診斷造影目的，本質(zhì)上螯合劑可呈與金屬放射性核素成配合物形式。適宜的放射性核素包括99mTc、64Cu、67Cu、97Ru、105Rh、109Pd、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、212Pb和212Bi的各種氧化物或氮化物。優(yōu)選的金屬放射性核素為氧化物形式的锝(99mTc)和錸(186，188Re)，如ReO3+、ReO2+、99mTcO2+，最優(yōu)選99mTcO3+。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選方面，螯合劑與由上式中Z代表的靶向性分子偶聯(lián)，形成一種結(jié)合物，用來向哺乳動物體中目標(biāo)位點(diǎn)遞送螯合的放射性核素。適于與螯合劑偶聯(lián)的靶向性分子的例子包括但不限于甾族化合物、蛋白質(zhì)、肽、抗體、核苷酸和糖類。優(yōu)選靶向性分子包括蛋白質(zhì)和肽，特別是那些能與具體病理特點(diǎn)的細(xì)胞表面受體進(jìn)行特異結(jié)合的肽和蛋白。例如，通過標(biāo)記與本發(fā)明螯合劑偶聯(lián)的蛋白或其受體結(jié)合片段，可對特殊蛋白受體的超表達(dá)相關(guān)疾病進(jìn)行造影。最優(yōu)選的靶向性分子是肽，其能特異地結(jié)合于靶位點(diǎn)，且具有三個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。用于某些疾病狀況和組織造影的靶向性肽如下所示針對動脈粥樣硬化斑YRALVDTLKRALVDTLKRALVDTLKFVTQAEGAKYAKFRETLEDTRDRMYAKFRETLEDTRDRMY AALDLNAVANKIADFELYAALDLNAVANKIADFEL YRALVDTLKFVTEQAKGARALVDTLKFVTEQAKGAYRALVDTEFKVKQEAGAKRALVDTEFKVKQEAGAKYRALVDTLKFVTQAEGAK針對感染和動脈粥樣硬化斑VGVAPGVGVAPGVGVAPG 甲酰Nleu.LF.Nleu.YKVPGVGVPGVGVPGVGVPGVG 甲酰MIFL甲酰MLFK 甲酰MLFI甲酰MFIL 甲酰MFLI
甲酰MLIF 甲酰MILF甲酰TKPR VGVAPG甲酰MLF YIGSRCH2CO.YIGSRC針對血栓NDGDFEEIPEEYLQ NDGDFEEIPEEY(SO3Na)LQGPRG針對血小板D-Phe.PRPGGGGNGDFEEIPEEYL RRRRRRRRRGDVPLYKKIIKKLLES RGDRGDS針對淀粉樣蛋白斑(早老性癡呆)EKPLQNFTLSFR為與螯合劑連接，靶向性分子可以包含一個(gè)“間隔臂”，以在螯合劑和靶向性分子間形成一個(gè)物理間隔。間隔臂可以是一烷基鏈，其被衍化用于與螯合劑偶聯(lián)。當(dāng)靶向性分子是肽時(shí)，間隔臂可以是適合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選肽靶向性分子含有1至5個(gè)氨基酸的間隔臂，這些氨基酸具有化學(xué)惰性的α-碳側(cè)鏈，諸如甘氨酸或β丙氨酸殘基。
靶向性分子可以在各種位點(diǎn)包括R1至R6、X、Y和Z及由X和Y形成的環(huán)與本發(fā)明螯合劑偶聯(lián)。通過將靶向性分子上反應(yīng)活性基團(tuán)與螯合劑上的取代基反應(yīng)，形成一連接鍵，完成偶聯(lián)。例如，具有自由氨基象N-末端或有ε-氨基的Lys基團(tuán)的肽靶向性分子可以與螯合劑的羧基反應(yīng)，形成酰胺連接鍵?；蛘?，肽靶向性分子的C-末端可以與螯合劑的氨基取代基反應(yīng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向性分子通過一酰胺鍵如肽鍵在取代基Z處與式(I)螯合劑偶聯(lián)。例如，肽靶向性分子的N-末端氨基與Z處的羧基反應(yīng)。除肽外的靶向性分子，只要其具有適于與螯合劑偶聯(lián)的基團(tuán)，均可以以相似的方式與本發(fā)明螯合劑偶聯(lián)。當(dāng)適宜的基團(tuán)不存在時(shí)，可以將靶向性分子化學(xué)衍生出這種基團(tuán)。當(dāng)螯合劑或靶向性分子上存在多于1個(gè)的反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，應(yīng)該用合適的封閉劑將除特定的偶聯(lián)基團(tuán)外的所有基團(tuán)封閉，以獲得單一共軛物。例如通過形成酯可將自由羧基保護(hù)起來，象叔丁酯，其可用TFA去除。用如FMOC封閉基可將自由氨基保護(hù)起來，用哌啶可隨后將其去除。
在本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，使用一共軛物對體內(nèi)炎癥病灶位點(diǎn)進(jìn)行造影，其中靶向性分子是包含氨基酸序列Thr-Lys-Pro-Pro-Lys(TKPPR)的趨化性肽。已發(fā)現(xiàn)該肽能與白細(xì)胞受體很好地結(jié)合。通過附加的氨基酸殘基(優(yōu)選甘氨酸)可將靶向性肽與螯合劑間隔開，條件是肽仍保持其定位活性。在一具體實(shí)施方案中，通過一Gly殘基將肽TKPPR與式(I)螯合劑的取代基Z偶聯(lián)。
使用各種現(xiàn)有技術(shù)可制備以肽為基礎(chǔ)的靶向性分子本身或?qū)⑵渑c螯合劑一起制備成共軛物。由于其適于固相肽合成，所以采用交替的FMOC保護(hù)和去保護(hù)是制備短肽的優(yōu)選方法。生產(chǎn)蛋白質(zhì)或其長片段時(shí)優(yōu)選用重組DNA技術(shù)。在一具體實(shí)施方案中，通過固相肽合成方法制備肽-螯合劑共軛物，包括向連接在不溶性(固體)支持物或基質(zhì)如聚苯乙烯的增長的肽鏈上逐步增加氨基酸殘基。首先將靶向性肽的C-末端殘基鍵連到市售的支持物上，其氨基由N-保護(hù)劑如芴甲氧羰基(FMOC)保護(hù)。通常，支持物被預(yù)先連接上呈被保護(hù)形式的C-末端殘基。用適宜的去保護(hù)試劑如哌啶除去氨基保護(hù)基，并用偶聯(lián)劑如雙環(huán)碳二亞胺(DCC)連接下一個(gè)氨基酸殘基(呈N-被保護(hù)形式)。肽鍵形成時(shí)，從支持物上洗去反應(yīng)試劑。一旦合成靶向性肽鏈，則要向N末端加上螯合劑的第一個(gè)殘基即S-乙酰氨基甲基保護(hù)的半胱氨酸。螯合劑的最后殘基是衍生的氨基酸殘基，其形成了式(X)(Y)N-C(R1)(R2)-CO-，其中X、Y、R1和R2的定義如前所述。最后一個(gè)殘基，例如二甲基甘氨酸、二乙基甘氨酸、二芐基甘氨酸或肌氨酸，均可市購或合成。用適宜的試劑如三氟乙酸(TFA)從載體上解離下該完整的共軛物。
顯然，根據(jù)本發(fā)明，所有取代基R1至R4均為天然存在或衍生的氨基酸，包括D-氨基酸的側(cè)鏈，其可市購且適于固相合成技術(shù)。對于購買不到的衍生氨基酸殘基，根據(jù)現(xiàn)有有機(jī)化學(xué)技術(shù)合成這些氨基酸并在上述固相肽合成的適宜期間插入這些氨基酸，從而可使其摻人本發(fā)明螯合劑中。與此類似，當(dāng)取代基R5和R6不是H時(shí)，在肽合成中使用衍生半胱氨酸殘基。例如，當(dāng)R5和R6均為甲基時(shí)，摻入市售的青霉胺殘基。
通過將X和Y的各種取代基作為固相合成中的最后殘基，如式(X)(Y)N-C(R1)(R2)-C(O)-OH所示的衍生的氨基酸，可將其摻入本發(fā)明螯合劑中，其中X、Y、R1和R2的含義同前。根據(jù)現(xiàn)有有機(jī)化學(xué)方法和技術(shù)可以合成具有N-末端氨基取代基X和Y的氨基酸。例如，當(dāng)X和Y均為二芐基取代基時(shí)，可通過在適當(dāng)?shù)娜軇┤缍燃淄橹袑⑹惺墼噭╀逡宜岷投S胺反應(yīng)，然后加熱，合成出相應(yīng)的二芐基甘氨酸殘基。在反應(yīng)中可采用其它胺代替二芐胺，如二異丙胺，得到相應(yīng)的二異丙基甘氨酸。與此類似，用哌啶和嗎啉這種環(huán)胺代替二芐胺，可得到相應(yīng)的哌啶基甘氨酸和嗎啉基甘氨酸殘基。
在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在固相載體上制備肽-螯合劑共軛物，其具有式(I)結(jié)構(gòu)，其中靶向性分子是序列為Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH的肽；R1、R2、R3、R5和R6是H；R4是羥甲基或1-羥乙基，R7是乙酰氨基甲基。
通過各種已知方法可在螯合劑中摻入所選擇的放射性核素。例如可使用下述常規(guī)方法。首先將螯合劑溶解于乙醇水溶液如乙醇-水1∶1中形成螯合劑溶液。用例如N2排氣，除去O2，然后加入氫氧化鈉除去巰基保護(hù)基，將溶液再次除凈氧氣，并水浴加熱使巰基保護(hù)基水解，然后用有機(jī)酸如乙酸將溶液中和(pH6.0-6.5)。在標(biāo)記步驟中，向螯合劑溶液中加入高锝酸鈉和足以還原锝的氯化亞錫。將溶液混合，置于室溫下反應(yīng)然后水浴加熱。在另一種方法中，可用調(diào)至pH8的螯合劑溶液進(jìn)行標(biāo)記。在這種較高pH值時(shí)，可用含锝的溶液代替高锝酸鹽，锝配合有不穩(wěn)定配基，適于與所需螯合劑進(jìn)行配基交換反應(yīng)。適宜的配基包括酒石酸鹽、檸檬酸鹽和七葡糖酸鹽。若螯合溶液另被調(diào)節(jié)至更高pH如pH12-13，用于標(biāo)記步驟，則可用連二亞硫酸鈉作為還原劑代替氯化亞錫。本發(fā)明螯合劑在用放射性核素標(biāo)記之前可與靶向性分子偶聯(lián)，此方法即指“雙功能螯合”法。另一種途徑是“預(yù)先標(biāo)記配基”法，其中先以放射性核素標(biāo)記螯合劑，再將螯合劑與靶向性分子偶聯(lián)。
可通過色譜法，例如使用先以乙醇活化然后再用稀HCl活化的C-18Sep Pak柱，可將被標(biāo)記的螯合劑從污染物99mTcO4和膠態(tài)99mTcO2中分離出來。用稀鹽酸洗脫分離出99mTcO4，用乙醇-鹽水1∶1洗脫帶出螯合劑，而膠態(tài)99mTcO2存留在柱中。
當(dāng)本發(fā)明螯合劑與靶向性分子偶聯(lián)并用診斷用金屬標(biāo)記時(shí)，可通過診斷造影領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)將其用于檢測病理狀況?？蓪Σ溉閯游锸┯靡苑派湫院怂亟饘偃顼綐?biāo)記的螯合劑-靶向性分子結(jié)合物，淋巴內(nèi)、腹膜內(nèi)且優(yōu)選靜脈內(nèi)給予藥用溶液中如生理鹽水或血漿介質(zhì)中的藥。被標(biāo)記結(jié)合物的給藥量取決于所選靶向性分子的毒性曲線和金屬的毒性曲線，通常每70kg病人給藥范圍在0.01至100且優(yōu)選10至50mCi。通過標(biāo)準(zhǔn)閃爍照相技術(shù)在給藥后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間體內(nèi)追蹤金屬的位置?？色@得影象的時(shí)間取決于靶向性分子的分布曲線，例如大多數(shù)肽會很快定位，使得在3小時(shí)之內(nèi)便可獲得影象，通常在1小時(shí)之內(nèi)即可。在一具體實(shí)施方案中，通過靜脈注射.施用本發(fā)明偶聯(lián)于肽靶向性分子GTKPPR的螯合劑的鹽水溶液，對病灶炎癥部位進(jìn)行造影。
下述實(shí)施例用于說明本發(fā)明的一些實(shí)施方案。實(shí)施例1-制備肽-螯合劑共軛物N，N-二甲基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-ArgN，N-二甲基Gly-Thr-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg和肌氨酸-Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg使用FMOC化學(xué)法通過固相肽合成技術(shù)制備標(biāo)題共軛物單鏈肽，使用應(yīng)用生物系統(tǒng)433A肽合成儀(Foster City，CA)在預(yù)先接有FMOC-精氨酸的2-甲氧基-4-烷氧基苯甲醇樹脂(Sasrin Resin，Bachem生命科學(xué)公司，費(fèi)城)上進(jìn)行合成。在鏈延伸的適當(dāng)步驟中摻入衍生的氨基酸殘基S-乙酰氨基甲基半胱氨酸(Bachem)、N，N-二甲基甘氨酸(Sigma化學(xué)公司，St.Louis.MO)和肌氨酸。
在加入最后一個(gè)殘基N，N-二甲基甘氨酸或肌氨酸后，將肽樹脂在真空條件下過夜干燥，并在室溫下將9.5mL三氟乙酸(TFA)，0.5ml水、0.5ml茴香硫醚和0.25ml 2-乙二硫醇的冷卻溶液(每100mg肽樹脂1ml)與肽樹脂混合1.5至2小時(shí)，使肽從樹脂上解離。過濾除去樹脂，并用1-3mL TFA洗滌，得到6-8mL澄清的黃色液體。將此液體緩慢地滴入50ml錐形聚丙烯離心管中的30-35ml冷叔丁醚中，生成白色沉淀。0℃以7000rpm將該沉淀離心5分鐘(Sorvall RT6000，Dupont)，傾倒出上清液，用叔丁醚再洗滌兩次。真空下干燥后，將該沉淀溶解于水中。在丙酮-干冰中冷凍溶液并將其冷凍干燥過夜。將所得白色粉末溶解于水，通過0.45μm注射過濾器(Gelman Acrodisc3CR PTFE)過濾，用C18柱(Waters RCM 25×10)反相HPLC(Beckman System Gold)進(jìn)行純化，以1％TFA水溶液為緩沖液A，1％TFA乙腈溶液為緩沖液B。用100∶0的緩沖液A緩沖液B平衡柱子，以1mL/min在25分鐘內(nèi)線性梯度洗脫柱子至50％緩沖液B。級分在HPLC上進(jìn)行再分析，并按匹配曲線收集級分。在丙酮-干冰中冷凍純級分，并冷凍干燥12小時(shí)，得到白色粉末。實(shí)施例2-制備肽-螯合劑共軛物N，N-二芐基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-ArgN，N-二乙基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg使用FMOC化學(xué)法通過固相肽合成技術(shù)制備標(biāo)題共軛物單鏈肽，使用應(yīng)用生物系統(tǒng)433A肽合成儀(Foster City，CA)在預(yù)先載有FMOC-精氨酸的2-甲氧基-4-烷氧基苯甲醇樹脂(Sasrin Resin，Bachem生命科學(xué)公司，費(fèi)城)上進(jìn)行合成。在鏈延伸的適當(dāng)步驟中摻人衍生的氨基酸殘基S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸(Bachem)、N，N-二乙基甘氨酸和N，N-二芐基甘氨酸。
用下述方法合成衍生的氨基酸殘基N，N-二芐基甘氨酸在裝有磁力攪拌子的燒瓶中，將溴乙酸(5.00g，35.99mmol)溶解于CH2Cl2，冷卻至0℃，并加入二芐胺(8.31ml，43.79mmol)。反應(yīng)混合物在O℃攪拌1小時(shí)，并溫?zé)嶂潦覝?，然后?0-40℃之間加熱12小時(shí)。將混合物溶液冷卻至室溫，減壓條件下蒸發(fā)掉CH2Cl2，然后用熱乙醇洗滌，并真空干燥得到白色固體殘余物(71.2％產(chǎn)率)。
用下面的方法合成衍生的氨基酸殘基N，N-二乙基甘氨酸在燒瓶中，向二乙胺(35mL)中加入氯乙酸(5.00g，52.91mmol)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，然后加熱回流72小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并以HCl中和，濃縮使體積減小。然后力入乙酸乙酯和乙醇，過濾所得的白色沉淀并真空干燥，得到1.74g(25％產(chǎn)率)產(chǎn)物。
實(shí)施例3-標(biāo)記肽-螯合劑共軛物N，N-二甲基Gly-Ser-Cys(Acm)-GTKPPRN，N-二甲基Gly-Thr-Cys(Acm)-GTKPPRN，N-二乙基Gly-Ser-Cys(Acm)-GTKPPRN，N-二芐基Gly-Ser-Cys(Acm)-GTKPPR和肌氨酸Ser-Cys(Acm)-GTKPPR重新制備實(shí)施例1和2的共軛物(200μl，1mg/ml鹽水)，然后將其與100μl高锝酸鹽(10mCi)和100μl葡糖酸亞錫(50μg氧化亞錫和1mg葡糖酸鈉)一起注射入3ml的真空容器。將此試管置于沸水浴中12分鐘，然后通過Whatman PVDF注射過濾器過濾，收集被標(biāo)記的共軛物溶液，進(jìn)一步用鹽水將其稀釋，制得可注射用溶液(2Mbq/ml)，通過HPLC(Beckman)從(20μl)樣品中(在稀釋前)分離該共軛物，通過測量放射活性確定標(biāo)記率(labeling yield)。
共軛物標(biāo)記率N，N-二甲基Gly-Ser-Cys(Acm)-GTKPPR＞94％N，N-二甲基Gly-Thr-Cys(Acm)-GTKPPR＞94％N，N-二乙基Gly-Ser-Cys(Acm)-GTKPPR85.4％N，N-二芐基Gly-Ser-Cys(Acm)-GTKPPR98.9％肌氨酸Ser-Cys(Acm)-GTKPPR 90.3％除肌氨酸-Ser-Cys(Acm)-GTKPPR外每種結(jié)合物均出現(xiàn)單一峰，且標(biāo)記率高于85％。標(biāo)記24小時(shí)后，再在HPLC上重新分析N，N-二甲基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg，沒有發(fā)現(xiàn)降解或輻解產(chǎn)物。實(shí)施例4-共軛物的體內(nèi)造影和生物分布按下述方法進(jìn)行大鼠炎癥研究。在造影前24小時(shí)，用酵母聚糖(25mg)，一種酵母細(xì)胞壁懸液，對2只雄性Wistar大鼠(CharlesRiver，200-250g)肌內(nèi)注射入其左后腿。1天后可肉眼觀察到腿部的炎癥病灶。將1mg.(約0.7μmol)螯合劑-肽共軛物溶解于50μl二甲亞砜中，并加入到乙醇-水混合物(1∶1，200μl)中。加入Tc-99m酒石酸鹽(約400MBq)等份溶液，100℃時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)螯合作用(transchelation)20分鐘。通過Sep Pak柱洗脫純化Tc-99m標(biāo)記的共軛物，然后用鹽水稀釋制得含約100μCi(3.7MBq)活性的可注射用制劑(200μl)。
用茄醇(40至50mg/kg)麻醉大鼠，然后通過尾靜脈注射被標(biāo)記的共軛物溶液(200μl)。需要連續(xù)全身閃爍掃描30分鐘。然后超劑量麻醉殺死大鼠，稱量器官、尿、血、已發(fā)炎的肌肉(左腿)和未發(fā)炎的肌肉(右腿)和炎癥滲出物(液體)樣品，根據(jù)器官不同在孔型γ計(jì)數(shù)器或在γ劑量校準(zhǔn)器中計(jì)數(shù)。假設(shè)血量占體重的8％，以此為依據(jù)來計(jì)算劑量。下表1所示的共軛物的結(jié)果為兩只大鼠的平均值，并以尾中殘余劑量進(jìn)行了修正。
權(quán)利要求
1.一種通式(I)的化合物
其中X是一直鏈或支鏈的、飽和或不飽和C1-4烷基鏈，該烷基鏈可任選地插入一個(gè)或兩個(gè)選自N、O和S的雜原子；可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；Y是H或X定義的取代基；X和Y一起形成一個(gè)5-至8-元的飽和或不飽和雜環(huán)，該雜環(huán)可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、氧代、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；R1至R4各自獨(dú)立地選自H；羧基；C1-4烷基；被一個(gè)選自羥基、氨基、巰基、鹵素、羧基、C1-4烷氧羰基和氨基羰基的基團(tuán)取代的C1-4烷基；除脯氨酸外的D-或L-氨基酸的α碳側(cè)鏈；和C(O)Z；R5和R6各自獨(dú)立地選自H；羧基；氨基；C1-4烷基；被羥基、羧基或氨基取代的C1-4烷基；和C(O)Z；R7選自H和硫保護(hù)基；及Z選自羥基、C1-4烷氧基和一個(gè)靶向性分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1、R2、R4、R5和R6為氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X和Y各自獨(dú)立地選自C1-4烷基和芳基取代的C1-4烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R3選自羥甲基和1-羥乙基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Y獨(dú)立地為X定義的取代基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中X和Y為選自甲基、乙基和芐基的相同基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中R3選自羥甲基和1-羥乙基。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中R1、R2、R4、R5和R6為氫。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Z為靶向性分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，其中靶向性分子是肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中肽包含3個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中肽包含序列TKPPR。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的化合物，其中肽包含序列Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的化合物，呈與金屬放射性核素或其氧化物或氮化物配合的形式。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的化合物，其中所述金屬放射性核素選自99mTc、64Cu、67Cu、97Ru、105Rh、109Pd、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、212Pb和212Bi。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的化合物，其中所述金屬放射性核素選自99mTc、186Re和188Re。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的化合物，其中所述金屬放射性核素為99mTc。
18.一種通式(II)的化合物
其中X是一直鏈或支鏈、飽和或不飽和C1-4烷基鏈，該烷基鏈可任選地插入一個(gè)或兩個(gè)選自N、O和S的雜原子；且可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；Y是H或X定義的取代基；X和Y可一起形成一個(gè)5-至8-元的飽和或不飽和雜環(huán)，該雜環(huán)可任選地被至少一個(gè)選自鹵素、羥基、氨基、羧基、氧代、C1-4烷基、芳基和C(O)Z的基團(tuán)取代；R1至R4各自獨(dú)立地選自H；羧基；C1-4烷基；被一個(gè)選自羥基、氨基、巰基、鹵素、羧基、C1-4烷氧羰基和氨基羰基的基團(tuán)取代的C1-4烷基；除脯氨酸外的D-或L-氨基酸的α碳側(cè)鏈；和C(O)Z；R5和R6各自獨(dú)立地選自H；羧基；氨基；C1-4烷基；被羥基、羧基或氨基取代的C1-4烷基；和C(O)Z；Z選自羥基、C1-4烷氧基和一個(gè)靶向性分子；和M是一金屬放射性核素或其氧化物或氮化物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的化合物，其中M選自99mTc、64Cu、67Cu、97Ru、105Rh、109Pd、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、212Pb和212Bi及其氧化物或氮化物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的化合物，其中M選自99mTc、186Re和188Re及其氧化物或氮化物。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的化合物，其中M是99mTc或其氧化物或氮化物。
22.一種探測靶向性分子在哺乳動物體內(nèi)位置的方法，包括施用診斷有效量的權(quán)利要求14的化合物，其中Z是靶向性分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所說的金屬放射性核素為99mTc。
24.一種在哺乳動物體內(nèi)對病灶炎癥部位進(jìn)行造影的方法，包括施用診斷有效量的權(quán)利要求10的化合物，該化合物呈與金屬放射性核素或其氧化物或氮化物配合的形式。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述金屬放射性核素是99mTc。
26.一種在哺乳動物體內(nèi)對病灶炎癥部位進(jìn)行造影的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求12的化合物，該化合物呈與金屬放射性核素或其氧化物或氮化物配合的形式。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說金屬放射性核素為99mTc。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，它選自N，N-二甲基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH；N，N-二甲基Gly-Thr-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH；N，N-二乙基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH；和N，N-二芐基Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的化合物，呈與金屬放射性核素或其氧化物或氮化物配合的形式。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的化合物，其中所述金屬放射性核素為99mTc。
全文摘要
本發(fā)明提供了式(I)放射性核素螯合劑，以用在體內(nèi)要診斷的顯影位點(diǎn)。式(I)中X是直鏈或支鏈的、飽和或不飽和C
文檔編號C07K5/08GK1158133SQ95195127
公開日1997年8月27日 申請日期1995年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月22日
發(fā)明者A·波拉克, A·古德博迪 申請人:分解藥品有限公司