專利名稱：生產(chǎn)納米結(jié)構(gòu)的材料及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米結(jié)構(gòu)，即，在宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的建造中有用的納米大小的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明尤其是指基于T4噬菌體尾絲蛋白及其變異體的納米結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
盡管大多數(shù)的金屬和陶瓷材料的強(qiáng)度源于他們的組分分子和微晶表面之間的理論粘合強(qiáng)度，但這種強(qiáng)度很大程度上限于材料的晶體或玻璃樣結(jié)構(gòu)中的裂縫。這些裂縫通常原材料自身就存在或在制作過程中有所發(fā)展，并且他們由于暴露在外界應(yīng)力下而經(jīng)常擴(kuò)大。
納米技術(shù)領(lǐng)域的出現(xiàn)使得傳統(tǒng)材料的局限性更為突出。設(shè)計(jì)和生產(chǎn)很小的能滿足復(fù)雜功能的結(jié)構(gòu)(即，納米大小)的能力依靠應(yīng)用合適材料的使用，這些材料制作起來可預(yù)料，可重復(fù)，并且具有每個(gè)新用途所要求的特性。
生物系統(tǒng)可作為尖端納米技術(shù)的一個(gè)范例?；罴?xì)胞制造蛋白質(zhì)并把他們裝配成完善的結(jié)構(gòu)，能夠抵抗正常環(huán)境中的破壞。在某些情況下，錯(cuò)綜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)是由一個(gè)自我組裝的過程產(chǎn)生的，它的指令預(yù)先設(shè)定于作為組成成分的多肽中。最后，蛋白質(zhì)須經(jīng)校對(duì)過程以保證高水平的質(zhì)量控制。
因此，在本領(lǐng)域中對(duì)于方法和組合物來說就需要有一定要求，從而利用蛋白質(zhì)的這些獨(dú)特性質(zhì)以形成人工納米結(jié)構(gòu)的元素。需要的是設(shè)計(jì)這樣的材料其特征能經(jīng)改造以適合納米規(guī)模技術(shù)的特定需要。而且既然大多數(shù)宏觀結(jié)構(gòu)材料，陶瓷、金屬、纖維等的亞單位是基于納米結(jié)構(gòu)亞單位的結(jié)合，那么如果用沒有裂縫、位、相精確、均一性好的，如此令人滿意的亞單位來制作，當(dāng)然會(huì)提高宏觀結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度和一致性，這是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)表面更規(guī)則，它能在更為廣泛的范圍內(nèi)更緊密地相互作用，這是相對(duì)其他尺寸較大，異質(zhì)性較強(qiáng)的材料而言的。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明為納米結(jié)構(gòu)提供了分離的蛋白建造塊，包括修飾過的T4噬菌體尾絲蛋白。gp34、36、37蛋白以不同方式修飾以便形成具有不同特點(diǎn)的新的桿狀結(jié)構(gòu)?？蓜h除特定的內(nèi)部多肽序列而不影響形成二聚體及與他們的天然尾絲對(duì)應(yīng)物相組配的能力。可選擇地，可以這樣修飾，以使它們只和其他修飾過的而非天然的尾絲對(duì)應(yīng)物相作用，顯示出與它們配體之間的溫度敏感型的相互作用；或包含能夠使它們與異源結(jié)合部分相互作用的附加功能基團(tuán)。
本發(fā)明也包括融合蛋白，這些蛋白包含來自2個(gè)或更多個(gè)不同的尾絲蛋白的序列。形成一種角連接的gp35蛋白，被修飾后可形成區(qū)別于天然平均角度137°(±7°)或156°(±12°)的平均角度，顯示出與其對(duì)應(yīng)物之間溫度敏感型的相互作用。
另一方面，本發(fā)明提供包括天然的和修飾的T4噬菌體尾絲蛋白的納米結(jié)構(gòu)。納米結(jié)構(gòu)可以是一維桿狀結(jié)構(gòu)，二維多邊形， 開放(open)或封閉(closed)的折疊片，或三維開放的籠狀物或封閉的實(shí)體結(jié)構(gòu)。
附圖簡述

圖1A和圖1B是T4噬菌體顆粒(圖1A)和T4噬菌體尾絲蛋白(圖1B)的圖解。
圖2顯示桿狀結(jié)構(gòu)單位的圖解。
圖3A-3D是如下幾部分的圖解多單位桿狀結(jié)構(gòu)沿X軸的一維連接(圖3A)；閉合型的簡單折疊片(圖3B)；閉合型的磚房型折疊片(圖3C)；以及開放型的磚房型折疊片(圖3D)。
圖4顯示用以構(gòu)建多孔的和致密的折疊片(頂和底)的兩個(gè)基本單位，當(dāng)它們交叉層疊的時(shí)候，就形成如圖所示的一套層疊的籠狀結(jié)構(gòu)。
圖5顯示一個(gè)呈120°角的角形結(jié)構(gòu)。
圖6顯示T4噬菌體基因34、35、36和37的DNA序列(SEQ ID NO1)。
圖7顯示T4噬菌體基因34(SEQ ID NO2，ORFX SEQ IDNO3)，35(SEQ ID NO4)，36(SEQ ID NO5)及37(SEQ ID NO6)基因產(chǎn)物的氨基酸序列(以單字符表示)。氨基酸序列(每一對(duì)的下線)是和核苷酸序列(每對(duì)的上線)呈線性對(duì)應(yīng)的。應(yīng)當(dāng)指出的是從基因35(從NCBI數(shù)據(jù)庫)推導(dǎo)出來的蛋白序列據(jù)信并不準(zhǔn)確。
圖8A-8B顯示從一個(gè)自組裝形成二聚體的分子形成一個(gè)P37二聚體啟動(dòng)因子(圖8A)；從一個(gè)自組裝形成三聚體的分子形成一個(gè)P37三聚體啟動(dòng)因子(圖8B)。
圖9顯示從一個(gè)自組裝二聚體的啟動(dòng)因子形成多聚體(P37-36)n。
發(fā)明詳述所有專利，專利申請(qǐng)和說明書中引用的參考文獻(xiàn)在此全部引入作為參考，在不一致的情況下，以本公開內(nèi)容為準(zhǔn)，包括定義。
雖然本發(fā)明用T4噬菌體尾絲蛋白的術(shù)語來描述，但它必須被理解成本發(fā)明也適用于其他T-偶數(shù)噬菌體的尾絲蛋白，例如，T4家族(例如，T4，TuIa，TuIb)的尾絲蛋白，T2家族(T2，T6，K3，OX2，M1等等)的尾絲蛋白。
定義“納米結(jié)構(gòu)”此處定義為這樣的結(jié)構(gòu)不論其大小、形狀如何，只要由納米大小的蛋白組分組裝而成。
“嵌合體”此處定義為嵌合蛋白，這些蛋白中至少氨基末端和羧基末端區(qū)域來源于不同原始多肽，不論此原始多肽是自然存在或是已由誘變而被修飾。
“同源二聚體”此處定義為兩個(gè)基本上一致的蛋白亞基的組裝物，它們形成一種特定的三維結(jié)構(gòu)。
“gp”是指一種單體多肽，而“P”表示同型寡聚物。P34，P36和P37可能是同源二聚體或同源三聚體。
“基本上由”一個(gè)特定的氨基酸序列組成的一種分離的多肽此處定義為一個(gè)含有特定序列的多肽或序列內(nèi)包含保守替換的多肽。保守替換，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，這種替換是指一種酸性殘基替代另一種酸性殘基，一種堿性殘基替代另一種堿性殘基，或一種疏水殘基代替另一種疏水殘基。當(dāng)特定殘基的缺少不會(huì)在使用本發(fā)明的實(shí)踐中對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生明顯影響時(shí)，這種在氨基末端或羧基末端缺少一個(gè)或多個(gè)但總共不超過5個(gè)氨基酸的多肽也包括在內(nèi)。
本發(fā)明屬于一種新型的蛋白構(gòu)建塊，其大小在納米水平，其對(duì)構(gòu)建微觀和宏觀結(jié)構(gòu)是有用的。若是不被理論限制的話，可以相信此基本單元是一種由兩個(gè)相同的具有交叉-β構(gòu)型的蛋白亞單位組成的同源二聚體，盡管一種三聚體結(jié)構(gòu)也可能包括在內(nèi)。因此，顯而易見，在此所用的“同源二聚體”或“二聚化作用”的有關(guān)說法將在許多例子中可被演繹推論到“同源三聚體”或“三聚作用”。這些又長又硬，而且穩(wěn)固的桿狀單元能通過偶合元件與其他桿狀結(jié)構(gòu)組合，偶合元件可通過遺傳操作或體外方式連進(jìn)去。這種裝置能使一種桿狀結(jié)構(gòu)的末端可能與其它桿狀結(jié)構(gòu)或相似桿狀結(jié)構(gòu)的不同末端相連結(jié)。桿狀結(jié)構(gòu)長度的選擇性，連接物角度的多樣性，以及他們的柔韌性允許形狀各異的結(jié)構(gòu)在原位自組裝。用這種方式這些單元能夠自我組合成預(yù)定的一維，二維或立體的較大的結(jié)構(gòu)。這種自我組合可以控制以形成構(gòu)象精確、強(qiáng)度均一的結(jié)構(gòu)，因?yàn)榇私Y(jié)構(gòu)的成分是無裂隙的生物產(chǎn)品。此桿狀結(jié)構(gòu)也可經(jīng)遺傳和化學(xué)的修飾以形成預(yù)定的針對(duì)其他化學(xué)本體的特異性結(jié)合位點(diǎn)，從而使復(fù)雜結(jié)構(gòu)的形成成為可能。
本發(fā)明的一個(gè)重要方面是此蛋白單元能被設(shè)計(jì)成包含不同長度的桿狀結(jié)構(gòu)，可被進(jìn)一步修飾以包含一些特征，這些特征以預(yù)定方式改變表面屬性和/或影響他們與其它相同或不同單元連結(jié)的能力。并且，此自我組合方式的能力可通過產(chǎn)生嵌合蛋白得以擴(kuò)展，此嵌合蛋白綜合了其不同成員的性質(zhì)。此設(shè)想的特征通過操作編碼這些蛋白的基因結(jié)構(gòu)而得以實(shí)現(xiàn)。
如下所述，本發(fā)明的組成和方法得益于天然蛋白的性質(zhì)，即，由本發(fā)明得出的結(jié)構(gòu)，在水介質(zhì)中，緊密、結(jié)實(shí)、穩(wěn)定、耐熱、抗蛋白酶，并且能做成生物可降解性的?？梢杂梦⑸锶菀椎厣a(chǎn)大量的單元。并且，為了組裝更簡化，大量的組分和部件可以被貯存起來在需要的時(shí)候使用。
此蛋白亞單位的序列是以大腸桿菌的T4噬菌體尾絲蛋白的組分為基礎(chǔ)的?？梢岳斫鉃榇艘?guī)則和技術(shù)也適用于其它T-偶數(shù)噬菌體的尾絲蛋白或其他有關(guān)的有相似的尾和/或纖維結(jié)構(gòu)的噬菌體。
T4噬菌體尾絲的結(jié)構(gòu)(見圖1)以圖解方式描述如下(N＝氨基末端，C＝羧基末端N[P34]C-N[gp35]C-N[P36]C-N[P37]C.P34，P36和P37都是緊密的，桿狀蛋白同源二聚體，此二聚體是由兩個(gè)相同的β折疊片以的相同方向組成的，它們通過鄰近片段之間的疏水作用面對(duì)面融合起來，這些鄰近片段具有通過桿狀結(jié)構(gòu)長軸180°的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱。(如果P34、P36和P37是同源三聚體，此結(jié)構(gòu)將會(huì)改變)。相比較而言，gp35是一種單體多肽，它特異地連接P36的N-末端；而后再連接到P34的C-末端，形成兩個(gè)桿狀結(jié)構(gòu)之間的成角度的連結(jié)。T4感染大腸桿菌期間，兩個(gè)gp37單體二聚化形成P37同源二聚體，據(jù)信此二聚化過程開始于P37C-末端附近并且需要二個(gè)大腸桿菌伴侶蛋白。(本發(fā)明中所用的一種位于C-末端附近具有溫度敏感性突變的gp37變異體，只需要一種伴侶分子即gp57，即可發(fā)生二聚化作用)。一旦發(fā)生二聚化作用，P37的N-末端即可啟動(dòng)兩個(gè)gp36單體聚合成一種P36桿狀結(jié)構(gòu)的聚合作用。在P36C-端和P37N-端之間的連結(jié)是緊密牢固的，卻是非共價(jià)鍵。然后P36的N-端與gp35單體連接；這種相互作用使P36穩(wěn)定，并且形成此尾絲的肘。最后，pg35與P34(就是它利用了gp57進(jìn)行的二聚化作用)的C-端連結(jié)。因此，尾絲自組裝是通過特定亞單位預(yù)定的順序進(jìn)行相互作用來調(diào)節(jié)的，而由當(dāng)初待組裝成分的形成所引發(fā)的結(jié)構(gòu)成熟過程允許與新的亞單位發(fā)生相互作用(先前則不允許)。這將導(dǎo)致從這些組分的隨機(jī)混合物中產(chǎn)生出一種具有精確規(guī)格的結(jié)構(gòu)。
依據(jù)本發(fā)明，編碼這些蛋白的基因可以被修飾以生成具有不同長度、不同末端組合的桿狀結(jié)構(gòu)。從這一點(diǎn)來說天然蛋白的性質(zhì)尤其具有優(yōu)勢。首先，此β-折疊由反平行β-束組成，左(L)右(R)邊緣有β-轉(zhuǎn)角。第二，此氨基酸側(cè)鏈在折疊平面上下交錯(cuò)出現(xiàn)。第一種特性允許彎曲被延伸以形成介于左表面和右表面之間的對(duì)稱及特異性的結(jié)合位點(diǎn)，以及其它結(jié)構(gòu)的結(jié)合位點(diǎn)。另外，β-折疊片的核心部分可通過遺傳學(xué)操作縮短或延長，例如通過在折疊片的同一側(cè)緣拼接編碼β-轉(zhuǎn)角的DNA區(qū)域以形成不包含插入多肽的新的彎曲，或以類似方式在轉(zhuǎn)角處拼接以插入多肽片段。第二個(gè)性質(zhì)允許伸出β-折疊片表面上下方的氨基酸側(cè)鏈通過遺傳置換或化學(xué)偶合方式進(jìn)行修飾。重要的是，完成以上所述的所有修飾并不破壞桿狀結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)完整性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，這些性質(zhì)使得單元的設(shè)計(jì)具有很大的靈活性，可以裝配出一系列的結(jié)構(gòu)。其中的一部分將在下文加以詳述。結(jié)構(gòu)單元本發(fā)明中桿狀結(jié)構(gòu)的功能類似于建筑中木質(zhì)的2×4中間柱或鋼梁。在這種情況下，此表面在分子水平是嚴(yán)格可重復(fù)性的，從而能夠符合與相似或不同的桿狀結(jié)構(gòu)單元的特定位點(diǎn)的特異結(jié)合。這些表面也可經(jīng)修飾以增強(qiáng)或減弱其親水性，包括正電或負(fù)電基團(tuán)，可以設(shè)計(jì)一些突起以特異結(jié)合于其他單元，或結(jié)合到具有兩個(gè)接受位點(diǎn)的中間連接結(jié)構(gòu)上。桿狀結(jié)構(gòu)的表面和桿狀結(jié)構(gòu)單位的圖解如附圖2所示。桿的三維定義為x，指從后(B)向前(F)的方向，y指從下(D)向上(U)方向；z指從左(L)到右(R)方向。
單個(gè)的桿狀結(jié)構(gòu)單元最容易沿著X軸相互連接形成一維的多單位桿狀結(jié)構(gòu)(圖3A)，但是亞基沿其他兩個(gè)方向有規(guī)則地結(jié)合亦可形成一個(gè)長形的結(jié)構(gòu)，與x軸方向相比，其交叉部分不同。
二維構(gòu)建是指桿狀結(jié)構(gòu)沿任意2個(gè)軸相互作用形成的折疊片。1)閉合型單折疊片由桿狀結(jié)構(gòu)的表面沿任意兩個(gè)軸方向(圖3B)精確重疊而形成。2)閉合的磚房樣折疊片是通過單元之間這樣的相互作用而形成在一個(gè)方向上是精確的表面重疊，在另一個(gè)方向上則是某種特殊類型的重疊(圖3C)。在這種情況下必有兩套不同的互補(bǔ)連結(jié)，二者之間相距有嚴(yán)格的1/2個(gè)單元長度。如果它們被放在中間(例如，每套距末端1/4單位長度)，那么，每個(gè)連接點(diǎn)將在單元上面或下面的中心點(diǎn)。如果它們相互抵消了，那么此連接也同樣將互相抵消。在這種構(gòu)造中，互補(bǔ)作用部位可用·和··來簡要表示。如果每個(gè)作用部位自身都是對(duì)稱的，則交錯(cuò)的行能與桿狀結(jié)構(gòu)在兩個(gè)方向上進(jìn)行相互作用。如果它們不對(duì)稱，則只能與方向與這相同或相反的相互作用行發(fā)生作用，如此折疊片將由單一向的桿狀結(jié)構(gòu)或順反層疊的桿狀結(jié)構(gòu)組成。3)開放磚房型折疊片(或網(wǎng))產(chǎn)生于當(dāng)這些單元被分離到相距大半個(gè)單位時(shí)(圖3D)。開口(或微孔)的大小取決于相互作用部位之間距離(dx)和這些位點(diǎn)分散于表面上的距離(dy)。
三維結(jié)構(gòu)需在三個(gè)表面上都存在適配的立體相互作用，方可形成實(shí)體。1)閉合實(shí)體由三個(gè)方向上精確重疊的單位組裝而成(如，閉合型簡單折疊片的精確重疊)。以同樣方式，閉合磚型折疊片可由折疊片的精確重疊，形成封閉實(shí)體，或通過置換作用使磚房形結(jié)構(gòu)具有三維特性。這要求在該單元的所有3對(duì)平行面上都有適當(dāng)?shù)某商椎倪B接。2)多孔實(shí)體由開放性磚型折疊以不同方式連接而成。例如，如果單元在第三維空間精確重疊就會(huì)形成伴有尺度精確的小孔列陣圖的實(shí)體，孔沿縱軸方向與紙面垂直。換句話說，就是需要一種閉合表面，在Z軸方向(即，從上往下方向，U→＞D方向)有一定厚度的層疊。一種簡單的封閉折疊片撂在開孔的磚房折疊片上以封閉那些小孔。如果開放磚房型折疊片的重疊部分是1/4單位，那么長度為3/4個(gè)單位的桿狀結(jié)構(gòu)將用以制造此折疊片。于是在第3維即Z軸方向就需要連接了。用以聚合形成這些交錯(cuò)片層的兩類單位，及片層本身，如圖4所示。
以上所有的結(jié)構(gòu)由簡單的線性桿狀結(jié)構(gòu)組成。另一種結(jié)構(gòu)單元，角單元將使可能結(jié)構(gòu)的類型和方向增多。此角單元以180°以外的角度連結(jié)兩個(gè)桿狀結(jié)構(gòu)，類似于一個(gè)角狀鐵的作用，其平均角度和剛性水平內(nèi)化在此連結(jié)結(jié)構(gòu)當(dāng)中。例如，附圖5所示的結(jié)構(gòu)有一個(gè)120°角，a和b處分別有一個(gè)特定結(jié)合位點(diǎn)。以下是幾個(gè)結(jié)構(gòu)實(shí)例，是以角連接形成結(jié)構(gòu)的例子。
1)開放型磚房狀折疊片通過加上與折疊片垂直的角得以在桿狀結(jié)構(gòu)長軸方向垂直的方向上擴(kuò)展和加強(qiáng)。這樣，一種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就形成了。以90°角與桿狀結(jié)構(gòu)末端的連接形成的角幾乎在折疊片的平面內(nèi)，新的桿狀結(jié)構(gòu)又可以加到這些角上(這些角必須與它相連接的原始折疊片平面也成一定角度)，形成新的折疊片。這些折疊片接近平行，與相鄰的上面的或下面的片垂直。
2)六邊形是由桿狀結(jié)構(gòu)和呈120°角的角連接的混合物制成。這樣，就有了兩套專門的連結(jié)。每套由此桿狀結(jié)構(gòu)兩端之一和角上的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)之一組成。從六邊形有一個(gè)方向(順或逆時(shí)針)這個(gè)意義上講，這是一個(gè)線性結(jié)構(gòu)，連結(jié)此六邊形的邊就能把此六邊形制成一種二維的開放網(wǎng)結(jié)構(gòu)(即，一種二維蜂窩狀結(jié)構(gòu))。將下面的六邊形的頂端和上面的六邊形的底面接合就能制成一種六邊形截面的管狀結(jié)構(gòu)。如果把它們的邊也連接起來，就能形成一種開放三維多重六邊形管3)螺旋形六邊形管與六邊形形成類似，只是第六個(gè)結(jié)構(gòu)單位沒有與第一單位連結(jié)起來以封閉此六邊形。取而代之，此末端從六邊形平面上轉(zhuǎn)移出來，第七和更靠后的單位接上去形成一種六棱形管，如果在螺旋線的單位之間有很少或沒有附著力的話，此結(jié)構(gòu)就能形成一種彈簧樣的結(jié)構(gòu)，如果有一種力量保持并列單位靠近的話，此六棱形管狀結(jié)構(gòu)會(huì)是一種很緊密的桿狀結(jié)構(gòu)。
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明的組成和方法也適用于其它多邊形結(jié)構(gòu)，例如八邊形結(jié)構(gòu)，以及開放實(shí)體，象由三角形形成的四面體、二十面體，由正方形和長方形形成的盒狀物。結(jié)構(gòu)的范圍僅受限于角單位類型以及通過工程方法在桿狀結(jié)構(gòu)單位的不同軸上實(shí)現(xiàn)的替換。例如，其它自然存在的角已發(fā)現(xiàn)于T7噬菌體的尾絲上，此尾絲有一個(gè)90°角(Steven等.J.Md.Biol.200352-365，1988)。
桿狀結(jié)構(gòu)蛋白的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)用來構(gòu)建本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)的蛋白亞單位基于四種多肽，這四種多肽包括T4噬菌體尾絲蛋白即gp34，gp35，gp36和gp37。編碼這些蛋白的基團(tuán)已被克隆，它們的DNA和蛋白序列已被測定(基因36和37見Oiver等.分子生物學(xué)雜志，153545-568，1981)。g34，35，36和37的DNA和氨基酸序列在圖6和圖7中說明。
完整的T4噬菌體顆粒感染大腸桿菌細(xì)胞，gp34，gp35，gp36和gp37會(huì)自然發(fā)生。接下來在細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的合成，此gp34，36和37單體形成同源二聚體，此二聚體能夠組裝形成成熟噬菌體顆粒。因此，大腸桿菌可用作有效率和方便的工廠，這個(gè)工廠可進(jìn)行如下所述的蛋白亞單位的合成和二聚化作用。
在本發(fā)明的實(shí)際操作過程中，編碼目的蛋白的基因(天然的，修飾的，或重組的)被整合進(jìn)本領(lǐng)域中所熟知的DNA表達(dá)載體中。這些環(huán)形質(zhì)粒通常包含選擇性標(biāo)記基因(通常使轉(zhuǎn)化菌具備抗生素的耐受性)以及允許質(zhì)粒在大腸桿菌進(jìn)行高拷貝數(shù)復(fù)制的序列，在緊接著可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的下游有一個(gè)多克隆位點(diǎn)。適用于本發(fā)明可作為商品購買得到的載體的例子包括pET系統(tǒng)(Novagen，Inc，Madison.WI)和超級(jí)連接物載體pSE280和pSE384(Invitrogen、SanDiego、CA)策略是1)構(gòu)建目的基因并將它克隆到多克隆位點(diǎn)；2)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；3)誘導(dǎo)克隆基因的表達(dá)；4)檢測蛋白產(chǎn)物的合成；以及最后5)檢測功能同源二聚體的形成。有時(shí)，目的蛋白的二聚化需要其他蛋白的參與，則有關(guān)基因也被克隆到同一質(zhì)粒中。例如，在表達(dá)野生型或經(jīng)修飾的gp37時(shí)，也同時(shí)表達(dá)細(xì)菌伴侶分子基因57；當(dāng)表達(dá)野生型或修飾型gp36時(shí)，也包括gp37基因的野生型或修飾型版本的表達(dá)。修飾后的gp37應(yīng)有二聚化的能力，含有一個(gè)充當(dāng)gp36二聚化伴侶作用的N-末端。本方法促進(jìn)單體基因產(chǎn)物的形成，在缺失通常存在于T4感染細(xì)胞中的其他的噬菌體誘導(dǎo)蛋白的情況下，本方法也能使單體成熟為同源二聚的桿狀結(jié)構(gòu)以上所說策略的第1-4步通過DNA重組技術(shù)和細(xì)菌蛋白表達(dá)領(lǐng)域中常用的方法來完成。例如，在步驟1中，在多克隆位點(diǎn)用限制酶剪切，緊接著進(jìn)行片段連接，這些方法被用于gp34，36及37桿狀結(jié)構(gòu)片段內(nèi)部缺失突變的構(gòu)建(見如下實(shí)施例1)?；蛘?，用單一或多個(gè)限制性酶切，接著用核酸外切酶消化(EXO-SIZE，New England Biolabs，Beverly，MA)被用來從最初切點(diǎn)處的一端或兩端造成DNA序列的缺失；當(dāng)再接上連接步驟時(shí)，此過程產(chǎn)生一套巢式的缺失突變，缺失的范圍逐漸增大。同樣，也用這些基本技術(shù)重組兩個(gè)不同的尾絲基因的DNA片段，以生產(chǎn)編碼融合蛋白(在本說明書中稱“嵌合體”)的嵌合基因?？偟膩碚f，將用這項(xiàng)最新技術(shù)提供待用的N-或C-末端，產(chǎn)生新的末端組合，以形成不同桿狀結(jié)構(gòu)片段新類型的連接。這種類型嵌合體的一個(gè)代表，gp37-36的融合，將在實(shí)施例2中進(jìn)行敘述。生產(chǎn)這類蛋白(步驟2)優(yōu)選的宿主是大腸桿菌菌株BL21(DE3)和BL21(DE3/pLgsS)(可自Novagen，Madison，WI購得)，當(dāng)然其他兼容性recA菌株，如HMS174(DE3)和HMS174(DE3/pLgsS)也可以用。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化(步驟2)也是用常規(guī)方法完成的(Sombrook，J，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY；這也是本發(fā)明中常規(guī)DNA重組技術(shù)的依據(jù))。轉(zhuǎn)化子的篩選是根據(jù)它們對(duì)抗生素的抗性，例如，氨芐青霉素或卡那霉素。誘導(dǎo)克隆的尾絲基因表達(dá)(步驟3)的方法取決于所用的特定啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子是plac(載體上有一個(gè)1aciq，以減少本底表達(dá))，可以加異丙基硫代半乳糖苷IPTG對(duì)它進(jìn)行調(diào)控，第二個(gè)優(yōu)選啟動(dòng)子是pT7φ10，它是T7RNA聚合酶特異性的，不被大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別。對(duì)利福霉素有抗性的T7 RNA聚合酶，是整合在大腸桿菌BL21染色體上的溶源性缺陷型λDE。BL21(DE3)上的T7聚合酶被質(zhì)粒上的1aciq基因超限抑制，可用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)和調(diào)控。
通常情況下，細(xì)菌轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物在有誘導(dǎo)劑存在的情況下孵育數(shù)小時(shí)，在此期間，目的蛋白的合成受到監(jiān)測。在本例中，提取細(xì)菌細(xì)胞的抽提物，以檢測T4尾絲蛋白，如，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。
一旦被修飾的蛋白在細(xì)菌提取液中被檢測到，就有必要查明此蛋白是否形成適宜的同源二聚體(步驟4)。這最初是經(jīng)過檢測此蛋白是否能被特異性的抗此蛋白的成熟二聚化物的抗血清識(shí)別來完成的。
尾絲特異性抗血清按下述方法制備(Edgar.R.S.andLielansis，I.，遺傳521187，1965；Ward et al，分子生物學(xué)雜志5415，1970)。簡而言之，整個(gè)T4噬菌體被用作一種免疫原；可選擇地制備的抗血清用無尾噬菌體顆粒選擇性的吸收，從而除去針對(duì)尾絲蛋白以外的所有抗體。接下來的步驟中抗血清的不同等分試樣分別用缺少一種特定尾絲蛋白的提取液吸收。例如，一種提取液只包含尾絲成分P34，gp35和gp36(來自用缺少一種功能性gp37基因的突變體T4感染的細(xì)胞)，如果這種提取液被用作吸收，則制得的抗血清將只能識(shí)別成熟P37和二聚化P36-P37。一種替代的方法，可被用來制備單獨(dú)的抗血清，這種用分別含有遠(yuǎn)端的半截尾絲或P34，gp35和P37的提取物進(jìn)行吸收的辦法制備的抗血清僅能識(shí)別成熟的(例如同型二聚化的)P34和P36。另一種辦法是用純化的尾絲組分制備抗體，例如P34和gp35-P36-P37?？筭p35-P36-P37的抗體隨即能被P36-P37吸收以產(chǎn)生抗gp-35，用P37和gp35進(jìn)行吸收以產(chǎn)生抗-P36?？?P37，抗gp-35和抗-P34用提純的P37，gp35和P34用作免疫原也能被直接生產(chǎn)出來。另一方面是生產(chǎn)抗不同尾絲成分或其片斷的特異性單克隆抗體。
在下述所有檢測尾絲蛋白是否正確二聚化的方法中都要用到亞單位或尾部分的特異性抗體。1)篩選那些能表達(dá)成熟尾絲蛋白的菌落所用的方法是通過直接將此菌落，或被溶解或未被溶解培養(yǎng)物樣品二者之一轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜，如果有必要就在濾膜上裂解這些細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)而用特異性抗體孵育。接著使用在本領(lǐng)域廣泛使用的方法(例如，第二抗體結(jié)合一種生色酶或放射標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A)檢測這些免疫復(fù)合物的形成。這種方法特別適用于篩選大量菌落，例如，如上所述的由EXO-SIZE缺失產(chǎn)生的菌落。2)表達(dá)相關(guān)蛋白的細(xì)菌細(xì)胞首先利用35S-蛋氨酸進(jìn)行代謝性標(biāo)記，隨即制備提取物，然后用抗血清孵育。通過與固相化的蛋白A孵育，離心收集免疫復(fù)合物，而后它們可能通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得以區(qū)分。
尾絲蛋白的內(nèi)部缺失使噬菌體失去感染能力，為了解它是否仍保留著二聚化及和其他完整的對(duì)應(yīng)物組合的能力，用了一個(gè)替代的競爭抑制試驗(yàn)進(jìn)行檢測，試驗(yàn)應(yīng)用了體外的互補(bǔ)系統(tǒng)。1)如上所述的一種細(xì)菌提取液包含被修飾的目的蛋白，此提取液與另一種由目的基因突變了的T4噬菌體感染的細(xì)胞制備的提取液混合。2)孵育幾小時(shí)后，加入第三種提取液，此提取液包含被檢測蛋白的野生型版本，然后繼續(xù)孵育幾小時(shí)。3)最后，經(jīng)過感染大腸桿菌和確定得出的噬菌斑數(shù)來確定提取物中感染性噬菌體顆粒的效價(jià)。一種經(jīng)修飾的尾絲蛋白被正確地二聚化，它能夠與它的對(duì)應(yīng)物連接，這種尾絲蛋白在步驟1中以無功能方式整合在尾絲中，從而在步驟2中阻止了此蛋白的野生型版本的整合；結(jié)果是得到的噬菌體樣品效價(jià)下降。相反，如果此經(jīng)修飾蛋白不能二聚化，那么就形成正確的N-末端或C-末端，在步聚1中此蛋白就不會(huì)整合進(jìn)噬菌體顆粒，從而不會(huì)與步驟2中的完整噬菌體顆粒競爭組裝；噬菌體效價(jià)就會(huì)與步驟1中沒有加入經(jīng)修飾的蛋白(陰性對(duì)照)時(shí)觀察到的效價(jià)相等。
另一種檢測方法是檢測嵌合體的內(nèi)部缺失尾絲蛋白是否保留了二聚化能力和與它們合適對(duì)應(yīng)物相結(jié)合的能力，此方法是用體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行的。此試驗(yàn)檢測到這些嵌合體和缺失蛋白具有與正常噬菌體部分競爭組裝的能力，因而用野生型噬菌體感染在其中嵌合體或缺失蛋白已得到重組表達(dá)的同一宿主細(xì)胞，結(jié)果釋放野生型噬菌體的數(shù)目會(huì)減少。這樣，一種表達(dá)在細(xì)胞中被誘導(dǎo)，這種表達(dá)來自編碼此嵌合體或缺失蛋白的表達(dá)載體，在這種情況下，細(xì)胞用野生型噬菌體感染的。野生型噬菌體的產(chǎn)生受到抑制證實(shí)了重組嵌合體或蛋白與噬菌體的正確的尾絲蛋白組裝的能力上面所述方法在設(shè)計(jì)和制造不同類型被修飾尾絲蛋白時(shí)被單獨(dú)或聯(lián)合起來使用。例如，對(duì)大量菌落進(jìn)行的初篩，能確定表達(dá)了正確二聚化蛋白的陽性菌落，此菌落隨即經(jīng)過體外互補(bǔ)試驗(yàn)被逐一檢測出來。
本發(fā)明包含的新蛋白的非限定性實(shí)例包括1)內(nèi)部缺失的gp34，36和37多肽(見下文中的實(shí)施例1)；2)C-末端截短的gp37融合到N-末端截短的gp37的N-末端；3)gp36和gp37的融合蛋白，其中g(shù)p37以N-末端連到gp36(即與天然順序相反)；此處稱為“gp37-36嵌合體”(見下文實(shí)施例2)，4)gp34和gp36的融合蛋白，其中g(shù)p36以N-末端連到gp34(即與天然順序相反)，此處命名為“gp36-34嵌合體”；
5)一種gp36的變異體，它的C端發(fā)生突變以致于使它缺失了與野生型P37的N端相互作用(以及與之發(fā)生二聚化作用)的能力，此處命名為“gp36*”；6)一種gp37的變異體，它的N端發(fā)生突變以致使它形成了一種缺少與野生型gp36的C-端相互作用的能力的P37，此處稱“*P37”；7)gp36*和*P37的變異體能相互作用，但不能與gp36或P37相互作用。
8)一種“P37-36嵌合體”的變異體，其gp36部分是從5)中的突變體得到的，即，“P37-36*”。(5-8，見如下實(shí)例3)9)一種“P37-36嵌合體”的變異體，其gp37部分是從上面6)中的突變體得到的，即“*P37-36”。
10)一種P37-36嵌合體的變異體，*P37-36*，其gp36和gp37部分是從7)中變異體得來的。
11)gp36和gp34的融合蛋白，其中g(shù)p36序列是將N-端連到gp34，其二聚體在此稱為“P36-34嵌合體”。
12)gp35的變異體形成不同于137°或158°(天然的角度)的平均角，例如，當(dāng)野生型gp35蛋白與P34及P36-P37二聚體結(jié)合形成137°角，和/或顯示出比天然多肽更大或更小的柔韌性的情況下，gp35變異體形成的平均角就會(huì)小于約125°或大于約145°。
13)gp34，35，36和37的變異體表現(xiàn)出與它們的同源對(duì)應(yīng)物相互作用時(shí)的溫度敏感性或其它的變異體特異性相互作用。
14)gp37的變異體，其多肽的C-末端結(jié)構(gòu)域經(jīng)修飾后含有確定整個(gè)分子特異性識(shí)別性質(zhì)的序列。例如，來自識(shí)別生物素的親和素蛋白的序列，來自免疫球蛋白的重鏈能識(shí)別葡萄球菌蛋白A的序列，來自單克隆抗體的Fab段的重鏈部分的序列，若和它們各自的Fab對(duì)應(yīng)輕鏈部分結(jié)合則可形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，能識(shí)別特異抗體的免疫反應(yīng)性序列，或結(jié)合特異金屬離子的序列。這些配體可以固相化以便于提純和/或裝配。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合體包括兩部分，一部分由第一種尾絲蛋白的至少前10(N-端)個(gè)氨基酸組成，第二部分由第二種尾絲蛋白的至少后10(C-末端)個(gè)氨基酸組成，這兩部分通過肽鏈連接起來。第一和第二種尾絲蛋白可能是同一種或不同種蛋白。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合體包括一個(gè)尾絲蛋白的前10～16個(gè)氨基酸部分融合到第二個(gè)尾絲蛋白的最后10～16個(gè)氨基酸部分。從另外一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)氨基酸部分至少有此尾絲蛋白的20個(gè)氨基酸。此嵌合體包括互相融合的幾部分，即非全長的尾絲蛋白相互融合。從優(yōu)選的角度，此嵌合體的第一個(gè)尾絲蛋白部分來源于gp37，第二個(gè)尾絲蛋白部分來源于gp36。這樣的嵌合體(gp37-36嵌合體)在寡聚化形成P37-36后，可與其它相同的寡聚物聚合。gp36-34嵌合體經(jīng)寡聚作用形成P36-34后可與gp35結(jié)合，形成的這個(gè)單位能多聚化。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，第一部分來自gp37，第二部分來自gp34。從優(yōu)選的角度，本發(fā)明中的嵌合體是由插入或缺失尾絲蛋白β-結(jié)構(gòu)的一個(gè)β轉(zhuǎn)角來完成的。最優(yōu)選地，插入一個(gè)尾絲序列，或融合到另一個(gè)尾絲蛋白序列上(優(yōu)選通過重組DNA水平的操作以產(chǎn)生所想要的編碼蛋白)，以便在β-折疊同一邊的β-轉(zhuǎn)角中的序列相互交聯(lián)。
除了上述嵌合體外，本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)還包含尾絲蛋白的缺失型，它們的一端被截短，如缺失分子的氨基端或羧基端(至少5到10個(gè)氨基酸)。這種氨基端截短的分子如截短的gp37，gp34或gp36，可用于納米結(jié)構(gòu)的“封頂”(“cap”)，因?yàn)?，一旦摻入，它們將終止聚合。這些分子更好的形式是包含尾絲蛋白的一個(gè)片段，而這種尾絲蛋白缺少氨基末端10，20或60個(gè)氨基酸。
為了按需要改變桿狀組份蛋白的長度，相同或不同尾絲蛋白的部分序列可插入尾絲嵌合體中以延長桿狀分子，或從嵌合體中刪除以縮短桿狀分子。將單獨(dú)的桿狀結(jié)構(gòu)組份裝配成納米結(jié)構(gòu)本發(fā)明的蛋白在大腸桿菌中如上述方式表達(dá)導(dǎo)致了大量蛋白的合成，并允許同一細(xì)胞中不同成分的同時(shí)表達(dá)和裝配。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)方法較簡單，技術(shù)廣為人知，有許多標(biāo)準(zhǔn)操作程序可用來從細(xì)菌培養(yǎng)液中回收天然及修飾尾絲蛋白。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基因36上有一個(gè)琥珀型突變的T4噬菌體在(不含琥珀型抑制)SU°細(xì)菌品系中生長，天然(非重組)gp35可用標(biāo)準(zhǔn)方法從培養(yǎng)基中純化。
g34，P36-P37，p37及它們的嵌合體從大腸桿菌培養(yǎng)基中純化出來后是成熟的二聚體。GP35及其變異體純化出來后是單體。純化由以下步驟或其組合而完成，使用標(biāo)準(zhǔn)方法1)分子篩層折，離子交換，和/或疏水基質(zhì)層折；2)制備超離心以及3)親和層折，使用特異性抗體或其它特異性結(jié)合部分作固定配體。如P37的C-末端區(qū)與大腸桿菌B的脂多糖結(jié)合。其它T4類噬菌體有P37類似物，可結(jié)合其它細(xì)胞表面成分如OmpF或TSX蛋白?；蛘撸鞍踪|(zhì)通過工程改造使其帶有異源區(qū)域，此異源區(qū)可作配體或結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)對(duì)應(yīng)物固定于固相基質(zhì)用于親和純化。如生物素可作為異源區(qū)，它可結(jié)合到鏈霉親和素包被的固相載體上。
或者，幾種成分在同樣的細(xì)菌細(xì)胞中共表達(dá)，在僅限于體內(nèi)的裝配以后，使用上面列舉的方法，純化了更大納米結(jié)構(gòu)的裝配部件。
然后，純化的各組分在體外條件下組合。裝配成所需納米結(jié)構(gòu)，溫度在約4～37℃之間，pH在約5～9之間。對(duì)一個(gè)特定的納米結(jié)構(gòu)，裝配的最佳條件(如鹽和金屬離子的種類及濃度)可容易地由常規(guī)試驗(yàn)確定，如單獨(dú)變動(dòng)各可變因素，并監(jiān)測正確產(chǎn)物的形成狀況。
可替換地制備一或多種細(xì)菌粗提液，混合之，裝配反應(yīng)在純化之前進(jìn)行。
在某些情況下，一種或多種純化的組分可自動(dòng)裝配成所需結(jié)構(gòu)；這一過程不需啟動(dòng)因子。其它情況中，啟動(dòng)因子是必需的，它可在桿狀或折疊片分子的聚合中起成核作用。這為裝配過程的定位(如啟動(dòng)因子是固定或定位的)及調(diào)控最終結(jié)構(gòu)的大小提供了便利。如含有一個(gè)功能性P36羥基末端的桿狀結(jié)構(gòu)組分需一個(gè)功能性P37氨基末端，以化學(xué)計(jì)量方式啟動(dòng)桿狀結(jié)構(gòu)的形成；這樣，改變啟動(dòng)因子和桿狀結(jié)構(gòu)組份的相對(duì)數(shù)量，即可調(diào)節(jié)桿狀聚合物的平均長度。如果比例是n，桿狀結(jié)構(gòu)的平均長度約為(P37-36)n--N-末端P37-P37C-末端。
在另外一些情況中，最終的納米結(jié)構(gòu)由兩種或多種成份組成，它們不能單獨(dú)自我裝配，而只能相互結(jié)合。這種情況下，可以籌劃變更裝配循環(huán)以得到有精確結(jié)構(gòu)的終產(chǎn)物(見下面的實(shí)施例6B)。
使用了固定化啟動(dòng)因子，則階段性裝配以后易于從基質(zhì)上除去聚合結(jié)構(gòu)。為此目的，設(shè)計(jì)了特殊的啟動(dòng)因子，使其與第一個(gè)桿狀結(jié)構(gòu)組份的作用受熱影響而可逆(見以下例5)。這樣，聚合物可容易地與結(jié)合在基質(zhì)上的啟動(dòng)因子分離，于是允許1)可容易地制備均一成份或裝配部件的貯存液。2)在聚合的啟動(dòng)、生長、釋放的多輪循環(huán)中，基質(zhì)結(jié)合的啟動(dòng)因子可重復(fù)使用。
在一個(gè)通過gp34(或P34)連于固相基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)的裝配實(shí)例中，將納米結(jié)構(gòu)脫離進(jìn)入溶液的一種方法是使用突變gp34(溫度敏感型)，它可用于在較高溫度下使納米結(jié)構(gòu)脫離(如40℃)。這一種突變gp34，命名為T4tsB45，在其羧基端有突變，這樣P34在30℃時(shí)可連接在尾絲末端，但在體外40℃存在1％SDS情況下，可從中脫離出來(不象野生型T4那樣在這些條件下都能穩(wěn)定結(jié)合)。這一技術(shù)目前已獲報(bào)道并具實(shí)用性(Seed，1980，T4噬菌體近側(cè)一半尾絲的研究哲學(xué)博士論文，加利福利亞技術(shù)研究所)。
能催化蛋白質(zhì)正確穩(wěn)定二級(jí)(20)結(jié)構(gòu)(最低能量狀態(tài))的形成的蛋白質(zhì)叫分子伴侶，(經(jīng)常地，特別在球蛋白中，三級(jí)結(jié)構(gòu)可促進(jìn)這種穩(wěn)定性，如β-折疊可能通過在β-套筒(barrel)中相互作用或與α-螺旋作用而穩(wěn)定)。一般來說，分子伴侶可阻止不正確的鏈內(nèi)或鏈間相互作用，這些相互作用可導(dǎo)致不利的、相對(duì)不穩(wěn)定的折疊的中間體的產(chǎn)生，阻止或延緩正確折疊。在T4噬菌體尾絲的形態(tài)發(fā)生中有兩種廣為人知的輔助蛋白，gp57和gp58，有時(shí)叫分子伴侶，它們對(duì)蛋白多聚體的正確裝配是必需的，但并不出現(xiàn)在終結(jié)構(gòu)中。
通常的分子伴侶系統(tǒng)(如groEL/ES)和基因產(chǎn)物的特定寡肽相互作用，以阻止它們與同一或不同多肽鏈的其它寡肽部分的不正確作用，否則會(huì)形成次穩(wěn)定的折疊中間體而延緩或阻止多肽鏈正確折疊成天然狀態(tài)(能量較低狀態(tài))。
Gp57，主要結(jié)合一些膜蛋白，具有并列(及排列)和/或起動(dòng)2或3個(gè)相同gp37分子折疊的功能。排列的肽鏈鎖合成粱(可相互穩(wěn)定其初生β-結(jié)構(gòu))，并不需要與gp57進(jìn)一步作用。Gp57在T4的裝配中，不僅在gp37的寡聚化中起作用，在gp34和gp12的寡聚化中也有功能。體外自裝配成粱結(jié)構(gòu)的組份除了使用體內(nèi)生成的啟動(dòng)因子如預(yù)先形成的嵌合或天然寡聚單位來起動(dòng)嵌合體的聚合外，能自我裝配的分子(尤其是肽類)，可做成融合蛋白，融合到本發(fā)明的尾絲變體的氨基端或羧基端(嵌合體，缺失/插入構(gòu)建體)，這樣就并列其末端，也可在體外利于它們的無輔助折疊，生成寡聚的，穩(wěn)定的β-折疊桿狀(粱)單位，縱然沒有正常折疊所需的分子伴侶(例如，gp57)及宿主細(xì)胞膜蛋白。
拿P37作為gp36-37寡聚和多聚的啟動(dòng)因子來說明，一般來說，gp37正確折疊成P37啟動(dòng)因子需噬菌體感染的細(xì)胞膜及兩種伴侶蛋白分子gp38和gp57。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過突變可以不必使用gp38，ts3813(gp37轉(zhuǎn)變區(qū)下游緊鄰的7殘基重復(fù)突變體)可抑制基因38(WOOD.W，B，F(xiàn).A.Eiserling和R.A Crowther，1994，長尾絲基因、蛋白、結(jié)構(gòu)和裝配在T4噬菌體分子生物學(xué)(編者JimD.Karam)美國微生物學(xué)協(xié)會(huì)華盛頓區(qū)，第282～290頁)。如果一個(gè)能自我裝配成二聚體，三聚體或其他寡聚體單體的部分(“自裝配組分”)融合到C-末端缺失的gp37的轉(zhuǎn)變區(qū)域的上游或下游[轉(zhuǎn)變區(qū)是T4類尾絲蛋白中一個(gè)保守的17個(gè)氨基酸殘基區(qū)，蛋白結(jié)構(gòu)在此區(qū)窄成一根纖細(xì)的尾絲，參見henning等1994年的T-偶數(shù)型大腸桿菌噬菌體的受體識(shí)別在T4噬菌體的分子生物學(xué)雜志中，karam(編者)，美國微生物學(xué)協(xié)會(huì)，華盛頓區(qū)，第291-298頁；wood等1994年的長尾絲基因、蛋白、結(jié)構(gòu)和裝配在T4噬菌體的分子生物學(xué)中，編者karam，美國微生物學(xué)協(xié)會(huì)，華盛頓區(qū)，282～290頁]，自裝配分子表達(dá)后，它們將平行聚集，使融合gp37肽鏈并列，使它們?cè)跓o其他伴侶分子的情況下在體外折疊。
如果P37是二聚體(圖8A)，自裝配部分可以是自體二聚肽段，象亮氨酸拉鏈，由酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4的250～281殘基組成(E.K.O.shea，R。RutkowsKi和p.s.kim，《科學(xué)》243538，1989)也可是自體二聚的突變亮氨酸拉鏈肽pIL，其中a位用異亮氨酸代替，d位用亮氨酸替代(Harbury P.B.，T.zhang，P.S.Kim和T.Alper.1993.《GCN4亮氨酸拉鏈突變體中二、三、四鏈卷曲螺旋的相互轉(zhuǎn)變》《科學(xué)》262期，1401～1407頁)。如果P37是三聚體(圖8B)，自裝配部分可以是自體三聚的突變亮氨酸拉鏈PII，其中a和d位都由異亮氨酸替代(Harbury P.B.等ibid)?？商娲?，膠原蛋白也可用作自裝配部分，如Bella等所述CJ.Bella，M.Eaton，B.Brodsky和H.M.Berman1994膠原蛋白類肽1.9A分辨率的晶體及分子結(jié)構(gòu)?？茖W(xué)226期，75～81頁)。它們可以通過靠近中心部位插入的特異性非重復(fù)丙氨酸殘基而并列聚合。
在沒有常規(guī)的啟動(dòng)因子情況下，自裝配部分可用作多聚反應(yīng)的啟動(dòng)因子。例如為嵌合單體的寡聚和多聚反應(yīng)生成啟動(dòng)因子，gp37-36，gp37-36-C2如圖9所可用作啟動(dòng)因子。(C2指二聚體形成肽鏈融合到gp36部分的羧基端。如果粱結(jié)構(gòu)是二聚結(jié)構(gòu)用C2，否則用C3-三聚體形成肽鏈融合到gp36羧基端)。更進(jìn)一步可利用大腸桿菌Cac的阻遏蛋白氨基端，靠著每個(gè)方向相互靠近的兩個(gè)螺旋，使二聚體(或其多聚體)的末端相連形成四聚體，是氨基端還是羧基端相連取決于自裝配肽段放置在哪一端。它們也可連接氨基端和羧基端。任何情況下，它們單獨(dú)只能形成二聚體，二聚體的每端都可通過加入合適的嵌合體單體而延長(如圖9中較簡單情況所示)。
在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，自裝配部分可融合到嵌合體的氨基端。在一個(gè)特的實(shí)施方案中，自裝配部分融合到T-偶數(shù)樣尾絲蛋白至少10氨基酸部分上。
也可使用能自裝成異源寡聚體的自裝配部分。例如粱的多聚反應(yīng)由二聚β-交叉表面所指導(dǎo)，加入異源二聚體，它的表面不會(huì)促進(jìn)進(jìn)一步的聚集，這樣可以很方便地封閉倒數(shù)第二個(gè)亞基而終止聚合。如果自裝配部分兩類螺旋區(qū)之間的作用力大于它們本身之間的作用力，那么所有的二聚體都將是異源二聚體。Jun和Fos氨基末端的亮氨酸拉鏈就是如此。
這種異源二聚體更有利的一面是它能使聚合反應(yīng)階段化，這樣一次只組成一個(gè)單位(或二維排列的一個(gè)表面)。如假定A表面和B表面親和但本身之間無作用(〔A←→B〕用來代表這種作用)?；旌螦/A和B/B0(B0連在基質(zhì)上，以便于純化)。這樣就會(huì)形成B0/B-A/A。洗掉A/A，加入B/B，將組成B0/B-A/A-B/B0。加入A/A0。將組建成B0/B-A/A-B/B-A/A0，這樣任何桿束也加不進(jìn)來了。當(dāng)然還有許多其他可能性。應(yīng)用本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)的用途多樣，包括需高度規(guī)則、精確定位的纖絲、籠或?qū)嶓w的應(yīng)用，這些東西有特異作用位點(diǎn)，使它們能與其他物質(zhì)相互作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，三維六邊形排列的管可用作分子篩或分子濾器，提供了精確直徑的規(guī)則垂直孔，用來按顆粒大小選擇分離。這種濾器能用于溶液消毒(如除菌或病毒)或作為一組按分子大小截留的濾器。在這種情況下，孔道的蛋白組分可作修飾以提供特殊表面性質(zhì)(即親水性和疏水性，結(jié)合特殊配體的能力等)。這種過濾裝置的優(yōu)越性在于孔徑的均一性和直線性及孔道對(duì)基質(zhì)的高比例。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一維長纖絲可摻入如紙或水泥或塑料中以增加濕態(tài)或干態(tài)的彈力。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，不同排列的納米結(jié)構(gòu)可浸入紙或織物中，作為防偽標(biāo)志。在這種情況中，一種簡單的顯色抗體反應(yīng)(如商業(yè)化的試劑盒)即可驗(yàn)證特質(zhì)來源。或者，這種納米結(jié)構(gòu)排列可結(jié)合染料或其他物質(zhì)，在整合前后，使紙張或織物著色或改變其外表或其它方面的性質(zhì)。試劑盒本發(fā)明也提供制造納米結(jié)構(gòu)的試劑盒，試劑盒在一或多個(gè)容器中包含本發(fā)明的嵌合體及缺失體。如一種這樣的試劑盒里包含一或多種盛有純品gp35和純品gp36-34嵌合體的容器。另一種這樣的試劑盒里包含純品gp37-36嵌合體。
以下的例子不限范圍地說明本發(fā)明。
在以下的實(shí)施例中，所有的限制酶、核酸酶、連接酶等都可從各種商業(yè)渠道購得，如新英格蘭Biolab公司(NEB).Beverly.M.A；生命技術(shù)公司(GIBCO-BRL)，Gaithorsburg MD；及Boehringer Mannheim公司.(BMC)，Indiannapolis，IN.實(shí)施例1內(nèi)部缺失P37的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和表達(dá)gp37的編碼基因有兩個(gè)BglII限制酶切位點(diǎn)，第一個(gè)切點(diǎn)位于293核苷酸后，第二個(gè)位于1486核苷酸后(核苷酸從起始甲硫氨酸密碼子ATG開始計(jì)數(shù))。這樣，用BglII消化gp37編碼DNA片段，切除掉中間片段(從核苷酸294到1485)，再連接5′和3′片段，這樣形成了內(nèi)部缺失的gp37，用ΔP37表示，其中精氨酸98和絲氨酸497相連。
限制酶消化混合液含有g(shù)p37質(zhì)粒DNA(1μg/μl)2μlNEB緩沖液2(10x) 1μlH2O 0μlBglII(10U/μl) 1μlgp37質(zhì)粒指基因37插入在PT7-5質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，在合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及基因57下游，基因57產(chǎn)物對(duì)gp37二聚化起分子伴侶作用。37℃保溫反應(yīng)1小時(shí)。然后，加入89μl的T4 DNA連接酶緩沖液及1μl T4 DNA連接酶，反應(yīng)在16℃延續(xù)4小時(shí)。再加入2μl StuI限制酶37℃繼續(xù)保溫1小時(shí)(StuI限制酶切，可消化在第一步中未被BglII切動(dòng)的殘余質(zhì)粒，使其轉(zhuǎn)染效率下降100倍)。
反應(yīng)混合物使用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)入從Novagen獲得的大腸桿菌BL21品系。轉(zhuǎn)化混合物涂于含100μg/μl氨芐的瓊脂培養(yǎng)基上，平板37℃培養(yǎng)過夜。
挑出過夜培養(yǎng)出的克隆，提取質(zhì)粒DNA，用BglII如上所述消化。消化物用1％瓊脂糖凝膠電泳分離。瓊脂電泳后出現(xiàn)一條新的4.2kb的DNA片段，證實(shí)了缺失是成功的，這條新片段是基因37未缺失的部分，這部分依然留在質(zhì)粒上，并經(jīng)由連接而重新形成BglII切點(diǎn)。原基因中兩個(gè)BglII位點(diǎn)之間的1.2kb DNA片段已不再連在質(zhì)粒中，而在膠里也不出現(xiàn)了。
如上述已作了缺失的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)品系。轉(zhuǎn)化菌在30℃培養(yǎng)直到菌體密度(A600)達(dá)到0.6，加入IPTG到終濃度0.4mM，30℃繼續(xù)保溫2小時(shí)，然后培養(yǎng)液用冰浴冷卻。取20μl培養(yǎng)液，加入20μl2ד破碎”緩沖液，其中含1％十二烷基磺酸鈉，甘油及示蹤染料。15μl的這種溶液上10％聚丙烯酰胺凝膠；另15μl等分試樣先沸水浴3分鐘，再上同一凝膠。電泳后，固定，染色。水煮樣品泳道上有一條分子量65000～70000道爾頓的蛋白條帶，證實(shí)了缺失型gp37的表達(dá)。未煮樣品泳道上高分了量條帶的強(qiáng)度，或65000～70000道爾頓條帶的消失程度可表示二聚化程度。
缺失型肽鏈二聚化的能力可直接由其被P37抗血清所識(shí)別的能力來判斷，P37抗血清只和成熟的P37二聚體反應(yīng)。此反應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)蛋白免疫印跡操作規(guī)程。
另一種評(píng)價(jià)缺失P37肽鏈(也稱ΔP37)功能性二聚體化的方法是檢測其對(duì)T4 37-噬菌體的體內(nèi)互補(bǔ)能力。首先誘導(dǎo)ΔP37表達(dá)，然后用突變T4感染，檢測后代噬菌體。
如上所述制備ΔP37，發(fā)現(xiàn)它能在體內(nèi)與T4 37-噬菌體互補(bǔ)。實(shí)施例2gp36-37嵌合體的設(shè)計(jì)，構(gòu)建和表達(dá)一開始構(gòu)建的質(zhì)粒中，編碼gp37的基因克隆在gp36基因上游緊鄰部位(即5′端)。質(zhì)粒用HaeIII消化，刪掉了從724核苷酸到3′末端的整個(gè)gp37 DNA 3′端下游區(qū)，同時(shí)也刪掉了從5′末端到349核苷酸的gp36DNA 5′端。反應(yīng)混合液同于實(shí)施例1；除了質(zhì)粒不同，酶是haeIII之外。使用T4DNA連接酶連接，細(xì)菌轉(zhuǎn)化，酶切分析同于實(shí)施例1。在這處例子中，插入的基因37-36的中間部分的切除揭示插入了新的346個(gè)在閱讀框內(nèi)的密碼子，它只被HaeIII切了一次(725核苷酸后)。產(chǎn)生的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中如實(shí)施例1那樣表達(dá)。
出現(xiàn)了一種約35000道爾頓的蛋白產(chǎn)物，證實(shí)了gp37-36嵌合體的成功表達(dá)。gp37的氨基端頭242個(gè)氨基酸融合到了gp36的羧基端的末尾104個(gè)氨基酸(從118～221)。這種嵌合體的用途取決于二聚化及末端相連的能力，即，這種肽鏈的羧基端可和T4噬菌體的P37二聚體的氨基端作用形成附加二聚體，這種肽鏈二聚體的氨基端可和其他嵌合體的二聚體作用?？赏ㄟ^評(píng)估加入ΔP37是否啟動(dòng)二聚化和多聚化來驗(yàn)證這種性質(zhì)。另外，以ΔP37啟動(dòng)二聚化之后可用針對(duì)P36二聚體的多克隆抗體來檢測P36。
Gp37-36嵌合體用如上所述類似步驟制備，其中的限制性內(nèi)切酶HaeIV換成TaqI。簡言之，就是將基因37和基因36均以TaqI消化，前者消化下來的5′端產(chǎn)物片段和后者消化下來的3′端片段連接起來。這樣形成的產(chǎn)物即編碼gp37-36嵌合體，其中g(shù)p37的1～48氨基酸融合到了gp36的100～221氨基酸上，。構(gòu)建體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，測得嵌合蛋白大小為18KD。發(fā)現(xiàn)此嵌合體如果在野生型T4噬菌體感染前即誘導(dǎo)表達(dá)則可抑制野生型T4的生長(通過體外噬菌體抑制試驗(yàn)分析得到)。實(shí)施例3GP37-36雜合體的突變以產(chǎn)生互體的抑制因子此項(xiàng)構(gòu)建的目的是生產(chǎn)一種可以二聚化的P37-36嵌合體的兩種變異體一種是在多肽的N-端進(jìn)行了突變(A，記為*P37-36)，另一種在多肽的C-端進(jìn)行了突變(B，記為P37-36*)。要求是突變了的*P36 N-端不能和野生型P36 C-末端，而只能和突變了的*P36 N-端形成聚合物?；驹硎茿和B自身均不能獨(dú)立地多聚化(而親本P37-36蛋白卻能夠)，它們只能按一定順序相結(jié)合(即，P37-36*+*P37-P36-→P37-36*--*P37-36)。
第二種構(gòu)建，*P37-P36*是通過*P37-36和P37-36*的體外重組形成的。在有P37起始因子存在的情況下，將*gp37-36*和gp37-36單體混合，gp37-36會(huì)二聚化進(jìn)而多聚化形成(P37-36)n；同樣地，*P37僅催化*gp37-36*多聚化形成(*P37-36*)n。假使是這樣的話，這兩種嵌合體的大小會(huì)不相同，一級(jí)結(jié)構(gòu)也不相同，可能導(dǎo)致不同的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用，能夠引發(fā)基于P37結(jié)合特異性而產(chǎn)生在不同表面上的結(jié)合。
用來進(jìn)行試驗(yàn)的菌株是一個(gè)大腸桿菌的SU°菌株(是指缺乏抑制琥珀突變能力的菌株)。當(dāng)用基因35，36及37攜帶琥珀突變的T4噬菌體的突變體感染此菌株時(shí)，噬菌體的復(fù)制是不完全的，因?yàn)槲步z蛋白不能合成。當(dāng)在此菌株中首先轉(zhuǎn)化進(jìn)一個(gè)能引導(dǎo)野生型gp35、gp36和gp37基因表達(dá)的質(zhì)粒，并用IPTG誘導(dǎo)，隨即用突變噬菌體感染，這樣就能產(chǎn)生感染的噬菌體顆粒；這一點(diǎn)可由“缺刻”的來證明。缺刻的菌落并不圓，周邊也不光滑，有部分缺口。這是由于單個(gè)噬菌體對(duì)微菌落的攻擊造成的，它進(jìn)行復(fù)制并且抑制缺口部分細(xì)菌的生長。
此構(gòu)建的目的是將基因36的3′-端部分(相當(dāng)于gp36的C-末端區(qū)域)以隨機(jī)摻雜的寡核苷酸進(jìn)行誘變。隨機(jī)摻雜的寡核苷酸的合成是在寡核苷酸的化學(xué)合成過程中，在給定的位點(diǎn)加進(jìn)極少量(到百分之幾)其他三種核苷酸，如此在最后的寡核苷酸混合物中就混有占很小比例的一部分，在特定部位出現(xiàn)錯(cuò)誤核苷酸。將此種寡核苷酸整合進(jìn)質(zhì)粒將導(dǎo)致它們隨機(jī)突變(Hutchison等，酶學(xué)方法.202～356頁，1991)。
經(jīng)過誘變的質(zhì)粒群體(當(dāng)然亦包括未經(jīng)修飾的基因36和37)，又經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)SU°細(xì)菌中，隨即如上所述用突變的T4噬菌體感染。如此這樣，非“缺刻”菌落的出現(xiàn)表明突變了的gp36C-末端不再和野生型P37相互作用以形成功能性尾絲。在這些“非缺刻”菌落中發(fā)現(xiàn)候選的gp36*表型，經(jīng)如上所述的靈敏的免疫特異性檢驗(yàn)，檢查是否缺乏二聚化的N-末端，而陽性菌落將作為下一步質(zhì)粒的來源。
數(shù)個(gè)經(jīng)過以上突變的質(zhì)粒經(jīng)過回收，再進(jìn)行另一輪誘變，這一次是用寡聚核苷酸庫將隨機(jī)突變引入同一個(gè)質(zhì)粒上gp37的N-端區(qū)域。同樣，誘變質(zhì)粒(此時(shí)已不是兩次誘變的)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌的supo菌株，轉(zhuǎn)化子用T4噬菌體的突變體感染。此階段，篩選細(xì)菌平板，以尋找再次出現(xiàn)的缺刻的菌落。此期缺刻的菌落的出現(xiàn)表明，由于*P37突變抑制了無功能的gp36*突變，噬菌體得以復(fù)制。也就是說，這些菌落必須含有新的*P37多肽，此多肽獲得了與同一質(zhì)粒編碼的P36*蛋白相互作用的能力。
如此就用如實(shí)施例2所述的同樣方法構(gòu)建了*P37-36和P37-36*(如上的A和B)配對(duì)的嵌合抑制因子。這樣的話，則*P37起了野生型P37的作用，而P36*代替了野生型P36。*P37-36*嵌合體的制備可通過剪切*P37-36及P37-36*并把它們按重組順序連接即可。*P37-36*可以和P37-36混和，在有對(duì)方存在的情況下各自獨(dú)立地完成聚合，互不干擾。在這些嵌合體的桿狀結(jié)構(gòu)樣核心部分經(jīng)過了不同的修飾時(shí)，這一性質(zhì)是十分有用的。實(shí)施例4gp36-34嵌合體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和表達(dá)此構(gòu)建所用的起始質(zhì)粒中含有基因57，而基因gp36則直接克隆在基因gp34的上游(即5′端)。質(zhì)粒經(jīng)NdeI消化，它在基因36的219堿基和基因34的2594堿基處切斷質(zhì)粒，如此切除了gp36部分的C-末端的最后148個(gè)密碼子和gp34部分N-末端的初始865個(gè)密碼子。反應(yīng)混合物同實(shí)施例1所述，僅僅質(zhì)粒DNA不同，所用的酶是NdeI(NEB)。用T4DNA連接酶連接，細(xì)菌轉(zhuǎn)化，限制性酶切分析也與實(shí)施例1同樣操作。這樣就產(chǎn)生了一個(gè)新的雜合基因，編碼497個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(gp36的73個(gè)N-末端氨基酸，gp34的424個(gè)C-末端氨基酸，序號(hào)是866～1289)。
另一種做法，用SphI于基因34的648堿基對(duì)處剪切起始質(zhì)粒，用Exo-size Deletion Kit(NEB)按上述辦法產(chǎn)生缺失突變體。
所構(gòu)建的產(chǎn)物按實(shí)施例1所述的辦法在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。蛋白產(chǎn)物中出現(xiàn)55000道爾頓大小的新蛋白，證明gp36-34嵌合體獲得了成功的表達(dá)。優(yōu)選地，此同源二聚體多肽的氨基末端具備和gp35蛋白相互作用的能力，同時(shí)其羧基末端也會(huì)和其他與之接觸的gp35分子相互作用。二聚體的正確形成可以通過抗-p36抗體的反應(yīng)來檢測，或通過gp35的結(jié)合，抑或用實(shí)施例2中敘述的體外噬菌體抑制試驗(yàn)來檢測。實(shí)施例5分離自組裝用的溫度敏感型蛋白溫度敏感型結(jié)構(gòu)可以在納米結(jié)構(gòu)中應(yīng)用于a)在低溫時(shí)啟動(dòng)嵌合體多聚化(例如，gp36-37)，隨后在高溫下滅活啟動(dòng)因子并與之分離；b)啟動(dòng)p36和gp35之間角度的形成(例如，gp35的變異體具有溫度敏感型的與p36N-末端或P34C-末端的結(jié)合位點(diǎn)，一種P36變異體與gp35形成溫度敏感型的結(jié)合，而一種P34變異體具有一個(gè)溫度依賴型的C-末端結(jié)合位點(diǎn)。)溫度敏感性可以是可逆的，當(dāng)恢復(fù)較低的溫度以后允許合適的末端重新結(jié)合，它也可以是不可逆的。
為了生產(chǎn)一種gp37的變異體，它允許p36-37結(jié)合物的熱誘導(dǎo)解離，按如上所述的辦法摻雜的用寡核苷酸對(duì)gp37 DNA的5′端進(jìn)行了隨機(jī)誘變。然后將誘變的DNA片段重組進(jìn)T4噬菌體，所用的辦法是用一個(gè)攜帶處于誘變區(qū)域兩端的兩個(gè)琥珀突變的T4噬菌體感染含有誘變DNA的細(xì)胞。在一輪低倍性感染之后，在較低的溫度30℃下于大腸桿菌su°中篩選非琥珀型噬菌體。這些噬菌斑的后代在緩沖液中重懸，加熱到60℃攻擊。在此溫度下，野生型尾絲保持結(jié)構(gòu)和功能的完整性，而溫度敏感型的則釋放出末端的P37單元，使得那些噬菌體成為非感染性的。
在此期，野生型噬菌體通過以下方式除去1)用敏感性細(xì)菌吸附野生型噬菌體，而后，沉淀(或過濾)吸附了野生型噬菌體的細(xì)菌；或2)將裂解物與抗-P37抗體反應(yīng)，而后通過固相化的蛋白A除去吸附的野生型噬菌體。兩種方法均讓無感染性的突變噬菌體顆粒留在上清液中或?yàn)V過液中，它們都可以被回收。缺失P37末端部分(或許還包括余下的尾絲部分)的無感染性噬菌體隨后用6M尿素處理，將其和細(xì)菌的原生質(zhì)體混合，以容許低倍性的感染，于是它們得以在低溫下復(fù)制并釋放出子代。另外一種辦法，感染性噬菌體可以通過在體外將突變噬菌體和野生型P37于30℃孵育的方法得以重組；孵育后即按照常規(guī)方案感染完整的細(xì)菌細(xì)胞。此后一種感染方式需要特異性地選擇突變噬菌體，其中P36-P37的溫度依賴型結(jié)合為可逆性的。
不管用哪種方法，噬菌體種群均須經(jīng)過如上的多輪篩選，而后通過噬菌斑純化的方法在30℃條件下分離單個(gè)的噬菌體顆粒。最后，這些候選的突變體要按以下特征逐項(xiàng)評(píng)價(jià)1)在較高溫度下(40-60℃)孵育后失去感染能力，可以測得滴度的下降；2)在高溫下孵育后丟失P37，由檢測到P37特異性抗體與噬菌體顆粒結(jié)合力的下降而得知；3)由電鏡觀測到，高溫孵育后尾絲發(fā)生形態(tài)改變。
突變體分離后，表型也經(jīng)過進(jìn)一步確定之后，P37基因經(jīng)過了測序，如果突變位于特定區(qū)域或殘基，將針對(duì)那些序列進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變以優(yōu)化目標(biāo)特征。
最后，突變基因37被克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒，如實(shí)施例1一樣，在大腸桿菌中分別表達(dá)。突變的P37二聚體從細(xì)菌提取物中純化出來，用于體外的組裝反應(yīng)中。
用類似的模式，也可以分離gp35的突變體多肽，此多肽顯示出與P36的N-末端或P34的C-末端的溫度敏感型相互作用。在與P34的溫度敏感型相互作用中，噬菌體經(jīng)高溫孵育，導(dǎo)致其尾絲遠(yuǎn)端的那一半的完整脫落(即gp35-P36-P37)。實(shí)驗(yàn)方案中全部的差別在于1)在整個(gè)gp35基因上進(jìn)行了隨機(jī)突變；2)野生型噬菌體(及遠(yuǎn)端的一半尾絲來自溫度敏感型突變體者)與高溫下已經(jīng)失活的溫度敏感型突變噬菌體(但仍然連接著尾絲近端的那一半)進(jìn)行了分離，分離的方法是用任何一種抗尾絲蛋白遠(yuǎn)端部分抗體，接著以葡萄球菌A-蛋白珠子沉淀遠(yuǎn)端的那一半尾絲以及含完整尾絲的噬菌體顆粒；3)留在上清中的突變噬菌體通過與含有野生型的完整半根遠(yuǎn)端尾絲的細(xì)菌抽提物在低溫下共同孵育，得以恢復(fù)了活動(dòng)；4)全部的溫度敏感型基因，在30℃條件下生長的35個(gè)突變體，通過在60℃條件下滅活而后在30℃重孵育可以檢測出可逆性的溫度敏感性。滅活是針對(duì)濃縮的噬菌體懸浮物進(jìn)行的，而在30℃的重孵育則分別針對(duì)稀釋前及稀釋后。如果未經(jīng)稀釋的噬菌體能夠成功地復(fù)活，但稀釋后卻不能，這表明它們的gp35是可逆的溫度敏感型。
為了產(chǎn)生一個(gè)攜帶有溫度敏感型的gp35-P36連接物的基因36的突變，基因36的C-末端經(jīng)過了如上所述的誘變，突變體也進(jìn)行了可逆性篩選。另一個(gè)選擇是誘變gp35以產(chǎn)生這樣一個(gè)基因35的突變體，其中的gp35-P36連接在60℃將解離。若是這樣的話，可以用抗-gp35抗體共孵育的方法沉淀沒有P36-P37的噬菌體，以達(dá)到使之與野生型噬菌體以及遠(yuǎn)端的半截尾絲(P36-P37)分離，由于gp35的變異體仍將保持與P34的結(jié)合。實(shí)施例6一維桿狀結(jié)構(gòu)的裝配A.簡單裝配實(shí)施例2中描述的P37-36嵌合體可以自組裝，但需要一個(gè)P37啟動(dòng)因子結(jié)合第一個(gè)桿狀結(jié)構(gòu)單位。所以，一個(gè)P37或ΔP37二聚體可以結(jié)合到固體基質(zhì)中或在溶液中呈游離形式作為啟動(dòng)因子。如果啟動(dòng)因子是連接到固相基質(zhì)則優(yōu)選用溫度敏感型的P37二聚體。加入含有g(shù)p37-36或純化的gp37-36嵌合體的提取物，會(huì)延長線性多聚體的自組裝的長度。在基質(zhì)結(jié)合的情況下，最后的幾個(gè)桿狀結(jié)構(gòu)會(huì)在高溫下(40-60℃，取決于特定的溫度敏感型P37突變體的性質(zhì))簡短孵育之后得以釋放。
啟動(dòng)因子針對(duì)gp37-36的比例也可以變化，桿狀結(jié)構(gòu)的大小分布也可以用以下任一辦法測得1)大小排阻層析法；2)溶液粘稠度的增大；及3)電鏡下的直接測量。
B.逐步的組裝例3中描述的P37-36的變異體*P37-36和P37-36*不能自發(fā)多聚化，這就使得可以按照如下方案依照一定的長度對(duì)桿狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行逐步的組裝。
1.將啟動(dòng)因子P37(優(yōu)選溫度敏感型)結(jié)合到基質(zhì)上。
2.加過量*gp37-36使之結(jié)合到P37的N-末端，并象P37-36同源寡聚體一樣寡聚化。
3.洗掉未反應(yīng)的*gp36-37，并用gp37-36*沖洗。
4.洗掉未反應(yīng)的gp37-36*，并用過量*gp37-36沖洗。
5.重復(fù)步驟2-4，n-1次。
6.從基質(zhì)上釋放組裝產(chǎn)物，方法如上所述，在高溫下簡短孵育。
每次反應(yīng)中蛋白桿狀結(jié)構(gòu)線性長度的范圍取決于異源嵌合物單元的長度以及加入反應(yīng)物的輪次(n)。此方法的優(yōu)點(diǎn)是桿結(jié)構(gòu)長度的絕對(duì)可重復(fù)性能夠保證，以及每次試驗(yàn)中其大小分布趨勢的同一性、穩(wěn)定性。實(shí)施例7多邊形的逐步裝配下邊的組裝方案中用gp35作為角連接物以形成多邊形。在此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，設(shè)定以gp35形成的角為137°。桿狀結(jié)構(gòu)單元包括實(shí)施例4中能夠自身多聚化的P36-34嵌合體。P36-34同源二聚體由一個(gè)同時(shí)表達(dá)gp36-34和gp57細(xì)菌克隆生產(chǎn)。gp57能夠在gp36-34的同源二聚化作用以形成P36-34的過程中起伴侶作用。
1.啟動(dòng)因子不完整的半截遠(yuǎn)端尾絲P36-37通過P37C-末端連接到固體基質(zhì)。實(shí)施例5中所述的溫度敏感型gp35隨后加進(jìn)去以形成完整的啟動(dòng)因子。
2.加入過量的P36-34嵌合體以結(jié)合單個(gè)的P36-34。通過gp35結(jié)合到基質(zhì)上，未結(jié)合的嵌合體則洗去。
3.旋即加入過量野生型(即非溫度敏感型)gp35。孵育之后，洗去未結(jié)合者。
4.將步驟2和3重復(fù)7-8次。
5.于高溫下簡短孵育以從基質(zhì)上釋放組裝產(chǎn)物。
釋放出的多聚桿狀結(jié)構(gòu)，8個(gè)單位長，將形成一個(gè)規(guī)則的八邊形，它的邊包括P36-34二聚體，它的邊包括野生型gp35單體。然則，這樣的8單位形成的多聚體也可能呈螺旋形連接。當(dāng)一個(gè)單位未閉合時(shí)，卻在它的末端連上另一個(gè)，它就更不能閉合了，而螺旋則可以在兩端延伸。第一個(gè)接頭的方向也已經(jīng)決定了螺旋的手性。十個(gè)(或七個(gè))單位的桿狀結(jié)構(gòu)更易于形成螺旋形結(jié)構(gòu)而不是多邊形，由于它們的自然角是144°(或128.6°)。閉合形成規(guī)則多邊形的可能性不光取決于gp35的平均角度，還取決于它的柔性，它可能通過遺傳或環(huán)境修飾的辦法進(jìn)一步操作。
以此方案形成的多邊形的類型取決于桿狀結(jié)構(gòu)單位的長度和角連接物形成的角。例如，可以在第2步中改用不同大小的桿狀結(jié)構(gòu)單位。另外，可以用形成的角度不同于自然角度170°的gp35的變異體多肽，以形成不同的規(guī)則多邊形。而且，對(duì)一個(gè)給定的各角相等，邊數(shù)為偶數(shù)的多邊形，只要兩半部分對(duì)稱，每一半的邊長大小則是任意的。
序列表(1)總的信息(I)申請(qǐng)人 Goldberg，Edward B.(II)發(fā)明的題目生產(chǎn)納米結(jié)構(gòu)的材料及其用途(III)序列數(shù)6(IV)通訊地址(A)收信人Pennie和Edmonds(B)街 道美國1155街道(C)城 市紐約(D)州紐約(E)國 家美國(F)郵 區(qū)10036(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0版本#1.25(VI)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)柎?B)提交日期1995年10月13日(C)分類(VIII)委托/代理人信息
(A)姓名Misrock，S.Lesli(B)登記號(hào)18，872(C)參考/存檔號(hào)8471-0005-999(IX)電訊信息(A)電話(212)790-9090(B)傳真212-869-8864(C)電報(bào)66441 PENNIE(2)序列ID NO1的信息(I)序列特征(A)長度8855堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(II)分子類型DNA(基因組)(III)假設(shè)無(IV)反義序列無(VI)最初來源(A)生物體噬菌體T4(VII)直接來源(B)克隆尾絲基因(XI)序列描述序列ID NO1TAGGAGCCCG GGAGAATGGC CGAGATTAAA AGAGAATTCA GAGCAGAAGA TGGTCTGGAC60GCAGGTGGTG ATAAAATAAT CAACGTAGCT TTAGCTGATC GTACCGTAGG AACTGACGGT 120GTTAACGTTG ATTACTTAAT TCAAGAAAAC ACAGTTCAAC AGTATGATCC AACTCGTGGA 180TATTTAAAAG ATTTTGTAAT CATTTATGAT AACCGCTTTT GGGCTGCTAT AAATGATATT 240CCAAAACCAG CAGGAGCTTT TAATAGCGGA CGCTGGAGAG CATTACGTAC CGATGCTAAC 300TGGATTACGG TTTCATCTGG TTCATATCAA TTAAAATCTG GTGAAGCAAT TTCGGTTAAC 360ACCGCAGCTG GAAATGACAT CACGTTTACT TTACCATCTT CTCCAATTGA TGGTGATACT 420ATCGTTCTCC AAGATATTGG AGGAAAACCT GGAGTTAACC AAGTTTTAAT TGTAGCTCCA 480GTACAAAGTA TTGTAAACTT TAGAGGTGAA CAGGTACGTT CAGTACTAAT GACTCATCCA 540AAGTCACAGC TAGTTTTAAT TTTTAGTAAT CGTCTGTGGC AAATGTATGT TGCTGATTAT 600AGTAGAGAAG CTATAGTTGT AACACCAGCG AATACTTATC AAGCGCAATC CAACGATTTT 660ATCGTACGTA GATTTACTTC TGCTGCACCA ATTAATGTCA AACTTCCAAG ATTTGCTAAT 720CATGGCGATA TTATTAATTT CGTCGATTTA GATAAACTAA ATCCGCTTTA TCATACAATT 780GTTACTACAT ACGATGAAAC GACTTCAGTA CAAGAAGTTG GAACTCATTC CATTGAAGGC 840CGTACATCGA TTGACGGTTT CTTGATGTTT GATGATAATG AGAAATTATG GAGACTGTTT 900GACGGGGATA GTAAAGCGCG TTTACGTATC ATAACGACTA ATTCAAACAT TCGTCCAAAT 960GAAGAAGTTA TGGTATTTGG TGCGAATAAC GGAACAACTC AAACAATTGA GCTTAAGCTT 1020CCAACTAATA TTTCTGTTGG TGATACTGTT AAAATTTCCA TGAATTACAT GAGAAAAGGA 1080CAAACAGTTA AAATCAAAGC TGCTGATGAA GATAAAATTG CTTCTTCAGT TCAATTGCTG 1140CAATTCCCAA AACGCTCAGA ATATCCACCT GAAGCTGAAT GGGTTACAGT TCAAGAATTA 1200GTTTTTAACG ATGAAACTAA TTATGTTCCA GTTTTGGAGC TTGCTTACAT AGAAGATTCT 1260GATGGAAAAT ATTGGGTTGT ACAGCAAAAC GTTCCAACTG TAGAAAGAGT AGATTCTTTA 1320AATGATTCTA CTAGAGCAAG ATTAGGCGTA ATTGCTTTAG CTACACAAGC TCAAGCTAAT 1380GTCGATTTAG AAAATTCTCC ACAAAAAGAA TTAGCAATTA CTCCAGAAAC GTTAGCTAAT 1440CGTACTGCTA CAGAAACTCG CAGAGGTATT GCAAGAATAG CAACTACTGC TCAAGTGAAT 1500CAGAACACCA CATTCTCTTT TGCTGATGAT ATTATCATCA CTCCTAAAAA GCTGAATGAA 1560AGAACTGCTA CAGAAACTCG TAGAGGTGTC GCAGAAATTG CTACGCAGCA AGAAACTAAT 1620GCAGGAACCG ATGATACTAC AATCATCACT CCTAAAAAGC TTCAAGCTCG TCAAGGTTCT 1680GAATCATTAT CTGGTATTGT AACCTTTGTA TCTACTGCAG GTGCTACTCC AGCTTCTAGC 1740CGTGAATTAA ATGGTACGAA TGTTTATAAT AAAAACACTG ATAATTTAGT TGTTTCACCT 1800AAAGCTTTGG ATCAGTATAA AGCTACTCCA ACACAGCAAG GTGCAGTAAT TTTAGCAGTT 1860GAAAGTGAAG TAATTGCTGG ACAAAGTCAG CAAGGATGGG CAAATGCTGT TGTAACGCCA 1920GAAACGTTAC ATAAAAAGAC ATCAACTGAT GGAAGAATTG GTTTAATTGA AATTGCTACG 1980CAAAGTGAAG TTAATACAGG AACTGATTAT ACTCGTGCAG TCACTCCTAA AACTTTAAAT 2040GACCGTAGAG CAACTGAAAG TTTAAGTGGT ATAGCTGAAA TTGCTACACA AGTTGAATTC 2100GACGCAGGCG TCGACGATAC TCGTATCTCT ACACCATTAA AAATTAAAAC CAGATTTAAT 2160AGTACTGATC GTACTTCTGT TGTTGCTCTA TCTGGATTAG TTGAATCAGG AACTCTCTGG 2220GACCATTATA CACTTAATAT TCTTGAAGCA AATGAGACAC AACGTGGTAC ACTTCGTGTA 2280GCTACGCAGG TCGAAGCTGC TGCGGGAACA TTAGATAATG TTTTAATAAC TCCTAAAAAG 2340CTTTTAGGTA CTAAATCTAC TGAAGCGCAA GAGGGTGTTA TTAAAGTTGC AACTCAGTCT 2400GAAACTGTGA CTGGAACGTC AGCAAATACT GCTGTATCTC CAAAAAATTT AAAATGGATT 2460GCGCAGAGTG AACCTACTTG GGCAGCTACT ACTGCAATAA GAGGTTTTGT TAAAACTTCA 2520TCTGGTTCAA TTACATTCGT TGGTAATGAT ACAGTCGGTT CTACCCAAGA TTTAGAACTG 2580TATGAGAAAA ATAGCTATGC GGTATCACCA TATGAATTAA ACCGTGTATT AGCAAATTAT 2640TTGCCACTAA AAGCAAAAGC TGCTGATACA AATTTATTGG ATGGTCTAGA TTCATCTCAG 2700TTCATTCGTA GGGATATTGC ACAGACGGTT AATGGTTCAC TAACCTTAAC CCAACAAACG 2760AATCTGAGTG CCCCTCTTGT ATCATCTAGT ACTGGTGAAT TTGGTGGTTC ATTGGCCGCT 2820AATAGAACAT TTACCATCCG TAATACAGGA GCCCCGACTA GTATCGTTTT CGAAAAAGGT 2880CCTGCATCCG GGGCAAATCC TGCACAGTCA ATGAGTATTC GTGTATGGGG TAACCAATTT 2940GGCGGCGGTA GTGATACGAC CCGTTCGACA GTGTTTGAAG TTGGCGATGA CACATCTCAT 3000CACTTTTATT CTCAACGTAA TAAAGACGGT AATATAGCGT TTAACATTAA TGGTACTGTA 3060ATGCCAATAA ACATTAATGC TTCCGGTTTG ATGAATGTGA ATGGCACTGC AACATTCGGT 3120CGTTCAGTTA CAGCCAATGG TGAATTCATC AGCAAGTCTG CAAATGCTTT TAGAGCAATA 3180AACGGTGATT ACGGATTCTT TATTCGTAAT GATGCCTCTA ATACCTATTT TTTGCTCACT 3240GCAGCCGGTG ATCAGACTGG TGGTTTTAAT GGATTACGCC CATTATTAAT TAATAATCAA 3300TCCGGTCAGA TTACAATTGG TGAAGGCTTA ATCATTGCCA AAGGTGTTAC TATAAATTCA 3360GGCGGTTTAA CTGTTAACTC GAGAATTCGT TCTCAGGGTA CTAAAACATC TGATTTATAT 3420ACCCGTGCGC CAACATCTGA TACTGTAGGA TTCTGGTCAA TCGATATTAA TGATTCAGCC 3480ACTTATAACC AGTTCCCGGG TTATTTTAAA ATGGTTGAAA AAACTAATGA AGTGACTGGG 3540CTTCCATACT TAGAACGTGG CGAAGAAGTT AAATCTCCTG GTACACTGAC TCAGTTTGGT 3600AACACACTTG ATTCGCTTTA CCAAGATTGG ATTACTTATC CAACGACGCC AGAAGCGCGT 3660ACCACTCGCT GGACACGTAC ATGGCAGAAA ACCAAAAACT CTTGGTCAAG TTTTGTTCAG 3720GTATTTGACG GAGGTAACCC TCCTCAACCA TCTGATATCG GTGCTTTACC ATCTGATAAT 3780GCTACAATGG GGAATCTTAC TATTCGTGAT TTCTTGCGAA TTGGTAATGT TCGCATTGTT 3840CCTGACCCAG TGAATAAAAC GGTTAAATTT GAATGGGTTG AATAAGAGGT ATTATGGAAA 3900AATTTATGGC CGAGATTTGG ACAAGGATAT GTCCAAACGC CATTTTATCG GAAAGTAATT 3960CAGTAAGATA TAAAATAAGT ATAGCGGGTT CTTGCCCGCT TTCTACAGCA GGACCATCAT 4020ATGTTAAATT TCAGGATAAT CCTGTAGGAA GTCAAACATT TAGGCGCAGG CCTTCATTTA 4080AGAGTTTTTG ACCCTTCCAC CGGAGCATTA GTTGATAGTA AGTCATATGC TTTTTCGACT 4140TCAAATGATA CTACATCAGC TGCTTTTGTT AGTTTTCATG AATTCTTTGA CGAATAATCG4200AATTGTTGCT ATATTAACTA GTGGAAAGGT TAATTTTCCT CCTGAAGTAG TATCTTGGTT4260AAGAACCGCC GGAACGTCTG CCTTTCCATC TGATTCTATA TTGTCAAGAT TTGACGTATC4320ATATGCTGCT TTTTATACTT CTTCTAAAAG AGCTATCGCA TTAGAGCATG TTAAACTGAG4380TAATAGAAAA AGCACAGATG ATTATCAAAC TATTTTAGAT GTTGTATTTG ACAGTTTAGA4440AGATGTAGGA GCTACCGGGT TTCCAAGAAG AACGTATGAA AGTGTTGAGC AATTCATGTC4500GGCAGTTGGT GGAACTAATA ACGAAATTGC GAGATTGCCA ACTTCAGCTG CTATAAGTAA4560ATTATCTGAT TATAATTTAA TTCCTGGAGA TGTTCTTTAT CTTAAAGCTC AGTTATATGC4620TGATGCTGAT TTACTTGCTC TTGGAACTAC AAATATATCT ATCCGTTTTT ATAATGCATC4680TAACGGATAT ATTTCTTCAA CACAAGCTGA ATTTACTGGG CAAGCTGGGT CATGGGAATT4740AAAGGAAGAT TATGTAGTTG TTCCAGAAAA CGCAGTAGGA TTTACGATAT ACGCACAGAG4800AACTGCACAA GCTGGCCAAG GTGGCATGAG AAATTTAAGC TTTTCTGAAG TATCAAGAAA4860TGGCGGCATT TCGAAACCTG CTGAATTTGG CGTCAATGGT ATTCGTGTTA ATTATATCTG4920CGAATCCGCT TCACCTCCGG ATATAATGGT ACTTCCTACG CAAGCATCGT CTAAAACTGG4980TAAAGTGTTT GGGCAAGAAT TTAGAGAAGT TTAAATTGAG GGACCCTTCG GGTTCCCTTT5040TTCTTTATAA ATACTATTCA AATAAAGGGG CATACAATGG CTGATTTAAA AGTAGGTTCA5100ACAACTGGAG GCTCTGTCAT TTGGCATCAA GGAAATTTTC CATTGAATCC AGCCGGTGAC5160GATGTACTCT ATAAATCATT TAAAATATAT TCAGAATATA ACAAACCACA AGCTGCTGAT5220AACGATTTCG TTTCTAAAGC TAATGGTGGT ACTTATGCAT CAAAGGTAAC ATTTAACGCT5280GGCATTCAAG TCCCATATGC TCCAAACATC ATGAGCCCAT GCGGGATTTA TGGGGGTAAC5340GGTGATGGTG CTACTTTTGA TAAAGCAAAT ATCGATATTG TTTCATGGTA TGGCGTAGGA5400TTTAAATCGT CATTTGGTTC AACAGGCCGA ACTGTTGTAA TTAATACACG CAATGGTGAT5460ATTAACACAA AAGGTGTTGT GTCGGCAGCT GGTCAAGTAA GAAGTGGTGC GGCTGCTCCT5520ATAGCAGCGA ATGACCTTAC TAGAAAGGAC TATGTTGATG GAGCAATAAA TACTGTTACT5580GCAAATGCAA ACTCTAGGGT GCTACGGTCT GGTGACACCA TGACAGGTAA TTTAACAGCG5640CCAAACTTTT TCTCGCAGAA TCCTGCATCT CAACCCTCAC ACGTTCCACG ATTTGACCAA5700ATCGTAATTA AGGATTCTGT TCAAGATTTC GGCTATTATT AAGAGGACTT ATGGCTACTT5760TAAAACAAAT ACAATTTAAA AGAAGCAAAA TCGCAGGAAC ACGTCCTGCT GCTTCAGTAT5820TAGCCGAAGG TGAATTGGCT ATAAACTTAA AAGATAGAAC AATTTTTACT AAAGATGATT5880CAGGAAATAT CATCGATCTA GGTTTTGCTA AAGGCGGGCA AGTTGATGGC AACGTTACTA5940TTAACGGACT TTTGAGATTA AATGGCGATT ATGTACAAAC AGGTGGAATG ACTGTAAACG6000GACCCATTGG TTCTACTGAT GGCGTCACTG GAAAAATTTT CAGATCTACA CAGGGTTCAT6060TTTATGCAAG AGCAACAAAC GATACTTCAA ATGCCCATTT ATGGTTTGAA AATGCCGATG6120GCACTGAACG TGGCGTTATA TATGCTCGCC CTCAAACTAC AACTGACGGT GAAATACGCC6180TTAGGGTTAG ACAAGGAACA GGAAGCACTG CCAACAGTGA ATTCTATTTC CGCTCTATAA 6240ATGGAGGCGA ATTTCAGGCT AACCGTATTT TAGCATCAGA TTCGTTAGTA ACAAAACGCA 6300TTGCGGTTGA TACCGTTATT CATGATGCCA AAGCATTTGG ACAATATGAT TCTCACTCTT 6360TGGTTAATTA TGTTTATCCT GGAACCGGTG AAACAAATGG TGTAAACTAT CTTCGTAAAG 6420TTCGCGCTAA GTCCGGTGGT ACAATTTATC ATGAAATTGT TACTGCACAA ACAGGCCTGG 6480CTGATGAAGT TTCTTGGTGG TCTGGTGATA CACCAGTATT TAAACTATAC GGTATTCGTG 6540ACGATGGCAG AATGATTATC CGTAATAGCC TTGCATTAGG TACATTCACT ACAAATTTCC 6600CGTCTAGTGA TTATGGCAAC GTCGGTGTAA TGGGCGATAA GTATCTTGTT CTCGGCGACA 6660CTGTAACTGG CTTGTCATAC AAAAAAACTG GTGTATTTGA TCTAGTTGGC GGTGGATATT 6720CTGTTGCTTC TATTACTCCT GACAGTTTCC GTAGTACTCG TAAAGGTATA TTTGGTCGTT 6780CTGAGGACCA AGGCGCAACT TGGATAATGC CTGGTACAAA TGCTGCTCTC TTGTCTGTTC 6840AAACACAAGC TGATAATAAC AATGCTGGAG ACGGACAAAC CCATATCGGG TACAATGCTG 6900GCGGTAAAAT GAACCACTAT TTCCGTGGTA CAGGTCAGAT GAATATCAAT ACCCAACAAG 6960GTATGGAAAT TAACCCGGGT ATTTTGAAAT TGGTAACTGG CTCTAATAAT GTACAATTTT 7020ACGCTGACGG AACTATTTCT TCCATTCAAC CTATTAAATT AGATAACGAG ATATTTTTAA 7080CTAAATCTAA TAATACTGCG GGTCTTAAAT TTGGAGCTCC TAGCCAAGTT GATGGCACAA 7140GGACTATCCA ATGGAACGGT GGTACTCGCG AAGGACAGAA TAAAAACTAT GTGATTATTA 7200AAGCATGGGG TAACTCATTT AATGCCACTG GTGATAGATC TCGCGAAACG GTTTTCCAAG 7260TATCAGATAG TCAAGGATAT TATTTTTATG CTCATCGTAA AGCTCCAACC GGCGACGAAA 7320CTATTGGACG TATTGAAGCT CAATTTGCTG GGGATGTTTA TGCTAAAGGT ATTATTGCCA 7380ACGGAAATTT TAGAGTTGTT GGGTCAAGCG CTTTAGCCGG CAATGTTACT ATGTCTAACG 7440GTTTGTTTGT CCAAGGTGGT TCTTCTATTA CTGGACAAGT TAAAATTGGC GGAACAGCAA 7500ACGCACTGAG AATTTGGAAC GCTGAATATG GTGCTATTTT CCGTCGTTCG GAAAGTAACT 7560TTTATATTAT TCCAACCAAT CAAAATGAAG GAGAAAGTGG AGACATTCAC AGCTCTTTGA 7620GACCTGTGAG AATAGGATTA AACGATGGCA TGGTTGGGTT AGGAAGAGAT TCTTTTATAG 7680TAGATCAAAA TAATGCTTTA ACTACGATAA ACAGTAACTC TCGCATTAAT GCCAACTTTA 7740GAATGCAATT GGGGCAGTCG GCATACATTG ATGCAGAATG TACTGATGCT GTTCGCCCGG 7800CGGGTGCAGG TTCATTTGCT TCCCAGAATA ATGAAGACGT CCGTGCGCCG TTCTATATGA 7860ATATTGATAG AACTGATGCT AGTGCATATG TTCCTATTTT GAAACAACGT TATGTTCAAG 7920GCAATGGCTG CTATTCATTA GGGACTTTAA TTAATAATGG TAATTTCCGA GTTCATTACC 7980ATGGCGGCGG AGATAACGGT TCTACAGGTC CACAGACTGC TGATTTTGGA TGGGAATTTA 8040TTAAAAACGG TGATTTTATT TCACCTCGCG ATTTAATAGC AGGCAAAGTC AGATTTGATA 8100GAACTGGTAA TATCACTGGT GGTTCTGGTA ATTTTGCTAA CTTAAACAGT ACAATTGAAT 8160CACTTAAAAC TGATATCATG TCGAGTTACC CAATTGGTGC TCCGATTCCT TGGCCGAGTG 8220ATTCAGTTCC TGCTGGATTT GCTTTGATGG AAGGTCAGAC CTTTGATAAG TCCGCATATC8280CAAAGTTAGC TGTTGCATAT CCTAGCGGTG TTATTCCAGA TATGCGCGGG CAAACTATCA8340AGGGTAAACC AAGTGGTCGT GCTGTTTTGA GCGCTGAGGC AGATGGTGTT AAGGCTCATA8400GCCATAGTGC ATCGGCTTCA AGTACTGACT TAGGTACTAA AACCACATCA AGCTTTGACT8460ATGGTACGAA GGGAACTAAC AGTACGGGTG GACACACTCA CTCTGGTAGT GGTTCTACTA8520GCACAAATGG TGAGCACAGC CACTACATCG AGGCATGGAA TGGTACTGGT GTAGGTGGTA8580ATAAGATGTC ATCATATGCC ATATCATACA GGGCGGGTGG GAGTAACACT AATGCAGCAG8640GGAACCACAG TCACACTTTC TCTTTTGGGA CTAGCAGTGC TGGCGACCAT TCCCACTCTG8700TAGGTATTGG TGCTCATACC CACACGGTAG CAATTGGATC ACATGGTCAT ACTATCACTG8760TAAATAGTAC AGGTAATACA GAAAACACGG TTAAAAACAT TGCTTTTAAC TATATCGTTC8820GTTTAGCATA AGGAGAGGGG CTTCGGCCCT TCTAA 8855(2)SEQ ID NO2的信息(I)序列特征(A)長度1289氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)最初來源(A)生物體噬菌體T4(vii)直接來源(B)克隆p34氨基酸(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO2Met Ala Glu Ile Lys Arg Glu Phe Arg Ala Glu Asp Gly Leu Asp Ala1 5 10 15Gly Gly Asp Lys Ile Ile Asn Val Ala Leu Ala Asp Arg Thr Val Gly20 25 30Thr Asp Gly Val Asn Val Asp Tyr Leu Ile Gln Glu Asn Thr Val Gln35 40 45Gln Tyr Asp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu Lys Asp Phe Val Ile Ile Tyr50 55 60Asp Asn Arg Phe Trp Ala Ala Ile Asn Asp Ile Pro Lys Pro Ala Gly65 70 75 80Ala Phe Asn Ser Gly Arg Trp Arg Ala Leu Arg Thr Asp Ala Asn Trp85 90 95Ile Thr Val Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Leu Lys Ser Gly Glu Ala Ile100 105 110Ser Val Asn Thr Ala Ala Gly Asn Asp Ile Thr Phe Thr Leu Pro Ser115 120 125Ser Pro Ile Asp Gly Asp Thr Ile Val Leu Gln Asp Ile Gly Gly Lys130 135 140Pro Gly Val Asn Gln Val Leu Ile Val Ala Pro Val Gln Ser Ile Val145 150 155 160Asn Phe Arg Gly Glu Gln Val Arg Ser Val Leu Met Thr His Pro Lys165 170 175Ser Gln Leu Val Leu Ile Phe Ser Asn Arg Leu Trp Gln Met Tyr Val180 185 190Ala Asp Tyr Ser Arg Glu Ala Ile Val Val Thr Pro Ala Asn Thr Tyr195 200 205Gln Ala Gln Ser Asn Asp Phe Ile Val Arg Arg Phe Thr Ser Ala Ala210 215 220Pro Ile Asn Val Lys Leu Pro Arg Phe Ala Asn His Gly Asp Ile Ile225 230 235 240Asn Phe Val Asp Leu Asp Lys Leu Asn Pro Leu Tyr His Thr Ile Val245 250 255Thr Thr Tyr Asp Glu Thr Thr Ser Val Gln Glu Val Gly Thr His Ser260 265 270Ile Glu Gly Arg Thr Ser Ile Asp Gly Phe Leu Met Phe Asp Asp Asn275 280 285Glu Lys Leu Trp Arg Leu Phe Asp Gly Asp Ser Lys Ala Arg Leu Arg290 295 300Ile Ile Thr Thr Asn Ser Asn Ile Arg Pro Asn Glu Glu Val Met Val305 310 315 320Phe Gly Ala Asn Asn Gly Thr Thr Gln Thr Ile Glu Leu Lys Leu Pro325 330 335Thr Asn Ile Ser Val Gly Asp Thr Val Lys Ile Ser Met Asn Tyr Met340 345 350Arg Lys Gly Gln Thr Val Lys Ile Lys Ala Ala Asp Glu Asp Lys Ile355 360 365Ala Ser Ser Val Gln Leu Leu Gln Phe Pro Lys Arg Ser Glu Tyr Pro370 375 380Pro Glu Ala Glu Trp Val Thr Val Gln Glu Leu Val Phe Asn Asp Glu385 390 395 400Thr Asn Tyr Val Pro Val Leu Glu Leu Ala Tyr Ile Glu Asp Ser Asp405 410 415Gly Lys Tyr Trp Val Val Gln Gln Asn Val Pro Thr Val Glu Arg Val420 425 430Asp Ser Leu Asn Asp Ser Thr Arg Ala Arg Leu Gly Val Ile Ala Leu435 440 445Ala Thr Gln Ala Gln Ala Asn Val Asp Leu Glu Asn Ser Pro Gln Lys450 455 460Glu Leu Ala Ile Thr Pro Glu Thr Leu Ala Asn Arg Thr Ala Thr Glu465 470 475 480Thr Arg Arg Gly Ile Ala Arg Ile Ala Thr Thr Ala Gln Val Asn Gln485 490 495Asn Thr Thr Phe Ser Phe Ala Asp Asp Ile Ile Ile Thr Pro Lys Lys
500 505 510Leu Asn Glu Arg Thr Ala Thr Glu Thr Arg Arg Gly Val Ala Glu Ile515 520 525Ala Thr Gln Gln Glu Thr Asn Ala Gly Thr Asp Asp Thr Thr Ile Ile530 535 540Thr Pro Lys Lys Leu Gln Ala Arg Gln Gly Ser Glu Ser Leu Ser Gly545 550 555 560Ile Val Thr Phe Val Ser Thr Ala Gly Ala Thr Pro Ala Ser Ser Arg565 570 575Glu Leu Asn Gly Thr Asn Val Tyr Asn Lys Asn Thr Asp Asn Leu Val580 585 590Val Ser Pro Lys Ala Leu Asp Gln Tyr Lys Ala Thr Pro Thr Gln Gln595 600 605Gly Ala Val Ile Leu Ala Val Glu Ser Glu Val Ile Ala Gly Gln Ser610 615 620Gln Gln Gly Trp Ala Asn Ala Val Val Thr Pro Glu Thr Leu His Lys625 630 635 640Lys Thr Ser Thr Asp Gly Arg Ile Gly Leu Ile Glu Ile Ala Thr Gln645 650 655Ser Glu Val Asn Thr Gly Thr Asp Tyr Thr Arg Ala Val Thr Pro Lys660 665 670Thr Leu Asn Asp Arg Arg Ala Thr Glu Ser Leu Ser Gly Ile Ala Glu675 680 685Ile Ala Thr Gln Val Glu Phe Asp Ala Gly Val Asp Asp Thr Arg Ile690 695 700Ser Thr Pro Leu Lys Ile Lys Thr Arg Phe Asn Ser Thr Asp Arg Thr705 710 715 720Ser Val Val Ala Leu Ser Gly Leu Val Glu Ser Gly Thr Leu Trp Asp725 730 735His Tyr Thr Leu Asn Ile Leu Glu Ala Asn Glu Thr Gln Arg Gly Thr740 745 750Leu Arg Val Ala Thr Gln Val Glu Ala Ala Ala Gly Thr Leu Asp Asn755 760 765Val Leu Ile Thr Pro Lys Lys Leu Leu Gly Thr Lys Ser Thr Glu Ala770 775 780Gln Glu Gly Val Ile Lys Val Ala Thr Gln Ser Glu Thr Val Thr Gly785 790 795 800Thr Ser Ala Asn Thr Ala Val Ser Pro Lys Asn Leu Lys Trp Ile Ala805 810 815Gln Ser Glu Pro Thr Trp Ala Ala Thr Thr Ala Ile Arg Gly Phe Val820 825 830Lys Thr Ser Ser Gly Ser Ile Thr Phe Val Gly Asn Asp Thr Val Gly835 840 845Ser Thr Gln Asp Leu Glu Leu Tyr Glu Lys Asn Ser Tyr Ala Val Ser850 855 860Pro Tyr Glu Leu Asn Arg Val Leu Ala Asn Tyr Leu Pro Leu Lys Ala865 870 875 880Lys Ala Ala Asp Thr Asn Leu Leu Asp Gly Leu Asp Ser Ser Gln Phe885 890 895Ile Arg Arg Asp Ile Ala Gln Thr Val Asn Gly Ser Leu Thr Leu Thr900 905 910Gln Gln Thr Asn Leu Ser Ala Pro Leu Val Ser Ser Ser Thr Gly Glu915 920 925Phe Gly Gly Ser Leu Ala Ala Asn Arg Thr Phe Thr Ile Arg Asn Thr930 935 940Gly Ala Pro Thr Ser Ile Val Phe Glu Lys Gly Pro Ala Ser Gly Ala945 950 955 960Asn Pro Ala Gln Ser Mer Ser Ile Arg Val Trp Gly Asn Gln Phe Gly965 970 975Gly Gly Ser Asp Thr Thr Arg Ser Thr Val Phe Glu Val Gly Asp Asp980 985 990Thr Ser His His Phe Tyr Ser Gln Arg Asn Lys Asp Gly Asn Ile Ala995 l0001005Phe Asn Ile Asn Gly Thr Val Met Pro Ire Asn Ile Asn Ala Ser Gly101010151020Leu Met Asn Val Asn Gly Thr Ala Thr Phe Gly Arg Ser Val Thr Ala1025103010351040Asn Gly Glu Phe Ile Ser Lys Ser Ala Asn Ala Phe Arg Ala Ile Asn104510501055Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Ile Arg Asn Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Phe106010651070Leu Leu Thr Ala Ala Gly Asp Gln Thr Gly Gly Phe Asn Gly Leu Arg107510801085Pro Leu Leu Ile Asn Asn Gln Ser Gly Gln Ile Thr Ile Gly Glu Gly109010951100Leu Ile Ile Ala Lys Gly Val Thr Ile Asn Ser Gly Gly Leu Thr Val1105111011151120Asn Ser Arg Ile Arg Ser Gln Gly Thr Lys Thr Ser Asp Leu Tyr Thr112511301135Arg Ala Pro Thr Ser Asp Thr Val Gly Phe Trp Ser Ile Asp Ile Asn114011451150Asp Ser Ala Thr Tyr Asn Gln Phe Pro Gly Tyr Phe Lys Met Val Glu115511601165Lys Thr Asn Glu Val Thr Gly Leu Pro Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Glu117011751180Val Lys Ser Pro Gly Thr Leu Thr Gln Phe Gly Asn Thr Leu Asp Ser1185119011951200Leu Tyr Gln Asp Trp Ile Thr Tyr Pro Thr Thr Pro Glu Ala Arg Thr120512101215Thr Arg Trp Thr Arg Thr Trp Gln Lys Thr Lys Asn Ser Trp Ser Ser
122012251230Phe Val Gln Val Phe Asp Gly Gly Asn Pro Pro Gln Pro Ser Asp Ile123512401245Gly Ala Leu Pro Ser Asp Asn Ala Thr Met Gly Asn Leu Thr Ile Arg125012551260Asp Phe Leu Arg Ile Gly Asn Val Arg Ile Val Pro Asp Pro Val Asn1265127012751280Lys Thr Val Lys Phe Glu Trp Val Glu1285(2)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)長度65氨基酸(B)類型65氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)最初來源(A)生物體噬菌體T4(vii)直接來源(B)克隆ORF X氨基酸(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO3Met Glu Lys Phe Met Ala Glu Ile Trp Thr Arg Ile Cys Pro Asn Ala1 5 10 15Ile Leu Ser Glu Ser Asn Ser Val Arg Tyr Lys Ile Ser Ile Ala Gly20 25 30Ser Cys Pro Leu Ser Thr Ala Gly Pro Ser Tyr Val Lys Phe Gln Asp35 40 45Asn Pro Val Gly Ser Gln Thr Phe Arg Arg Arg Pro Ser Phe Lys Ser50 55 60Phe65(2)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(A)長度29 5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)最初來源(A)生物體噬菌體T4(vii)直接來源(B)克隆p35氨基酸(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO4Met Leu Phe Arg Leu Gln Met Ile Leu His Gln Leu Leu Leu Leu Val1 5 10 15Phe Met Asn Ser Leu Thr Asn Asn Arg Ile Val Ala Ile Leu Thr Ser20 25 30Gly Lys Val Asn Phe Pro Pro Glu Val Val Ser Trp Leu Arg Thr Ala35 40 45Gly Thr Ser Ala Phe Pro Ser Asp Ser Ile Leu Ser Arg Phe Asp Val50 55 60Ser Tyr Ala Ala Phe Tyr Thr Ser Ser Lys Arg Ala Ile Ala Leu Glu65 70 75 80His Val Lys Leu Ser Asn Arg Lys Ser Thr Asp Asp Tyr Gln Thr Ile85 90 95Leu Asp Val Val Phe Asp Ser Leu Glu Asp Val Gly Ala Thr Gly Phe100 105 110Pro Arg Arg Thr Tyr Glu Ser Val Glu Gln Phe Met Ser Ala Val Gly115 120 125Gly Thr Asn Asn Glu Ile Ala Arg Leu Pro Thr Ser Ala Ala Ile Ser130 135 140Lys Leu Ser Asp Tyr Asn Leu Ile Pro Gly Asp Val Leu Tyr Leu Lys145 150 155 160Ala Gln Leu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Gly Thr Thr Asn165 170 175Ile Ser Ile Arg Phe Tyr Asn Ala Ser Asn Gly Tyr Ile Ser Ser Thr180 185 190Gln Ala Glu Phe Thr Gly Gln Ala Gly Ser Trp Glu Leu Lys Glu Asp195 200 205Tyr Val Val Val Pro Glu Asn Ala Val Gly Phe Thr Ile Tyr Ala Gln210 215 220Arg Thr Ala Gln Ala Gly Gln Gly Gly Met Arg Asn Leu Ser Phe Ser225 230 235 240Glu Val Ser Arg Asn Gly Gly Ile Ser Lys Pro Ala Glu Phe Gly Val245 250 255Asn Gly Ile Arg Val Asn Tyr Ile Cys Glu Ser Ala Ser Pro Pro Asp260 265 270Ile Met Val Leu Pro Thr Gln Ala Ser Ser Lys Thr Gly Lys Val Phe275 280 285Gly Gln Glu Phe Arg Glu Val290 295(2)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(A)長度221氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)最初來源(A)生物體噬菌體T4(vii)直接來源
(B)CLONEp36 amino acid(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO5Met Ala Asp Leu Lys Val Gly Ser Thr Thr Gly Gly Ser Val Ile Trp1 5 10 15His Gln Gly Asn Phe Pro Leu Asn Pro Ala Gly Asp Asp Val Leu Tyr20 25 30Lys Ser Phe Lys Ile Tyr Ser Glu Tyr Asn Lys Pro Gln Ala Ala Asp35 40 45Asn Asp Phe Val Ser Lys Ala Asn Gly Gly Thr Tyr Ala Ser Lys Val50 55 60Thr Phe Asn Ala Gly Ile Gln Val Pro Tyr Ala Pro Asn Ile Met Ser65 70 75 80Pro Cys Gly Ile Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Gly Ala Thr Phe Asp Lys85 90 95Ala Asn Ile Asp Ile Val Ser Trp Tyr Gly Val Gly Phe Lys Ser Ser100 105 110Phe Gly Ser Thr Gly Arg Thr Val Val Ile Asn Thr Arg Asn Gly Asp115 120 125Ile Asn Thr Lys Gly Val Val Ser Ala Ala Gly Gln Val Arg Ser Gly130 135 140Ala Ala Ala Pro Ile Ala Ala Asn Asp Leu Thr Arg Lys Asp Tyr Val145 150 155 160Asp Gly Ala Ile Asn Thr Val Thr Ala Asn Ala Asn Ser Arg Val Leu165 170 175Arg Ser Gly Asp Thr Met Thr Gly Asn Leu Thr Ala Pro Asn Phe Phe180 185 190Ser Gln Asn Pro Ala Ser Gln Pro Ser His Val Pro Arg Phe Asp Gln195 200 205Ile Val Ile Lys Asp Ser Val Gln Asp Phe Gly Tyr Tyr210 215 220(2)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(A)長度1026氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)最初來源(A)生物體噬菌體T4(vii)直接來源(B)克隆p37氨基酸(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO6Met Ala Thr Leu Lys Gln Ile Gln Phe Lys Arg Ser Lys Ile Ala Gly1 5 10 15Thr Arg Pro Ala Ala Ser Val Leu Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ile Asn20 25 30Leu Lys Asp Arg Thr Ile Phe Thr Lys Asp Asp Ser Gly Asn Ile Ile35 40 45Asp Leu Gly Phe Ala Lys Gly Gly Gln Val Asp Gly Asn Val Thr Ile50 55 60Asn Gly Leu Leu Arg Leu Asn Gly Asp Tyr Val Gln Thr Gly Gly Met65 70 75 80Thr Val Asn Gly Pro Ile Gly Ser Thr Asp Gly Val Thr Gly Lys Ile85 90 95Phe Arg Ser Thr Gln Gly Ser Phe Tyr Ala Arg Ala Thr Asn Asp Thr100 105 110Ser Asn Ala His Leu Trp Phe Glu Asn Ala Asp Gly Thr Glu Arg Gly115 120 125Val Ile Tyr Ala Arg Pro Gln Thr Thr Thr Asp Gly Glu Ile Arg Leu130 135 140Arg Val Arg Gln Gly Thr Gly Ser Thr Ala Asn Ser Glu Phe Tyr Phe145 150 155 160Arg Ser Ile Asn Gly Gly Glu Phe Gln Ala Asn Arg Ile Leu Ala Ser165 170 175Asp Ser Leu Val Thr Lys Arg Ile Ala Val Asp Thr Val Ile His Asp180 185 190Ala Lys Ala Phe Gly Gln Tyr Asp Ser His Ser Leu Val Asn Tyr Val195 200 205Tyr Pro Gly Thr Gly Glu Thr Asn Gly Val Asn Tyr Leu Arg Lys Val210 215 220Arg Ala Lys Ser Gly Gly Thr Ile Tyr His Glu Ile Val Thr Ala Gln225 230 235 240Thr Gly Leu Ala Asp Glu Val Ser Trp Trp Ser Gly Asp Thr Pro Val245 250 255Phe Lys Leu Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Gly Arg Met Ile Ile Arg Asn260 265 270Ser Leu Ala Leu Gly Thr Phe Thr Thr Asn Phe Pro Ser Ser Asp Tyr275 280 285Gly Asn Val Gly Val Met Gly Asp Lys Tyr Leu Val Leu Gly Asp Thr290 295 300Val Thr Gly Leu Ser Tyr Lys Lys Thr Gly Val Phe Asp Leu Val Gly305 310 315 320Gly Gly Tyr Ser Val Ala Ser Ile Thr Pro Asp Ser Phe Arg Ser Thr325 330 335Arg Lys Gly Ile Phe Gly Arg Ser Glu Asp Gln Gly Ala Thr Trp Ile340 345 350Met Pro Gly Thr Asn Ala Ala Leu Leu Ser Val Gln Thr Gln Ala Asp355 360 365Asn Asn Asn Ala Gly Asp Gly Gln Thr His Ile Gly Tyr Asn Ala Gly
370 375 380Gly Lys Met Asn His Tyr Phe Arg Gly Thr Gly Gln Met Asn Ile Asn385 390 395 400Thr Gln Gln Gly Met Glu Ile Asn Pro Gly Ile Leu Lys Leu Val Thr405 410 415Gly Ser Asn Asn Val Gln Phe Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Ser Ser Ile420 425 430Gln Pro Ile Lys Leu Asp Asn Glu Ile Phe Leu Thr Lys Ser Asn Asn435 440 445Thr Ala Gly Leu Lys Phe Gly Ala Pro Ser Gln Val Asp Gly Thr Arg450 455 460Thr Ile Gln Trp Asn Gly Gly Thr Arg Glu Gly Gln Asn Lys Asn Tyr465 470 475 480Val Ile Ile Lys Ala Trp Gly Asn Ser Phe Asn Ala Thr Gly Asp Arg485 490 495Ser Arg Glu Thr Val Phe Gln Val Ser Asp Ser Gln Gly Tyr Tyr Phe500 505 510Tyr Ala His Arg Lys Ala Pro Thr Gly Asp Glu Thr Ile Gly Arg Ile515 520 525Glu Ala Gln Phe Ala Gly Asp Val Tyr Ala Lys Gly Ile Ile Ala Asn530 535 540Gly Asn Phe Arg Val Val Gly Ser Ser Ala Leu Ala Gly Asn Val Thr545 550 555 560Met Ser Asn Gly Leu Phe Val Gln Gly Gly Ser Ser Ile Thr Gly Gln565 570 575Val Lys Ile Gly Gly Thr Ala Asn Ala Leu Arg Ile Trp Asn Ala Glu580 585 590Tyr Gly Ala Ile Phe Arg Arg Ser Glu Ser Asn Phe Tyr Ile Ile Pro595 600 605Thr Asn Gln Asn Glu Gly Glu Ser Gly Asp Ile His Ser Ser Leu Arg610 615 620Pro Val Arg Ile Gly Leu Asn Asp Gly Met Val Gly Leu Gly Arg Asp625 630 635 640Ser Phe Ile Val Asp Gln Asn Asn Ala Leu Thr Thr Ile Asn Ser Asn645 650 655Ser Arg Ile Asn Ala Asn Phe Arg Met Gln Leu Gly Gln Ser Ala Tyr660 665 670Ile Asp Ala Glu Cys Thr Asp Ala Val Arg Pro Ala Gly Ala Gly Ser675 680 685Phe Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Val Arg Ala Pro Phe Tyr Met Asn690 695 700Ile Asp Arg Thr Asp Ala Ser Ala Tyr Val Pro Ile Leu Lys Gln Arg705 710 715 720Tyr Val Gln Gly Asn Gly Cys Tyr Ser Leu Gly Thr Leu Ile Asn Asn725 730 735Gly Asn Phe Arg Val His Tyr His Gly Gly Gly Asp Asn Gly Ser Thr740 745 750Gly Pro Gln Thr Ala Asp Phe Gly Trp Glu Phe Ile Lys Asn Gly Asp755 760 765Phe Ile Ser Pro Arg Asp Leu Ile Ala Gly Lys Val Arg Phe Asp Arg770 775 780Thr Gly Asn Ile Thr Gly Gly Ser Gly Asn Phe Ala Asn Leu Asn Ser785 790 795 800Thr Ile Glu Ser Leu Lys Thr Asp Ile Met Ser Ser Tyr Pro Ile Gly805 810 815Ala Pro Ile Pro Trp Pro Ser Asp Ser Val Pro Ala Gly Phe Ala Leu820 825 830Met Glu Gly Gln Thr Phe Asp Lys Ser Ala Tyr Pro Lys Leu Ala Val835 840 845Ala Tyr Pro Ser Gly Val Ile Pro Asp Met Arg Gly Gln Thr Ile Lys850 855 860Gly Lys Pro Ser Gly Arg Ala Val Leu Ser Ala Glu Ala Asp Gly Val865 870 875 880Lys Ala His Ser His Ser Ala Ser Ala Ser Ser Thr Asp Leu Gly Thr885 890 895Lys Thr Thr Ser Ser Phe Asp Tyr Gly Thr Lys Gly Thr Asn Ser Thr900 905 910Gly Gly His Thr His Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Thr Asn Gly Glu915 920 925His Ser His Tyr Ile Glu Ala Trp Asn Gly Thr Gly Val Gly Gly Asn930 935 940Lys Met Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Tyr Arg Ala Gly Gly Ser Asn Thr945 950 955 960Asn Ala Ala Gly Asn His Ser His Thr Phe Ser Phe Gly Thr Ser Ser965 970 975Ala Gly Asp His Ser His Ser Val Gly Ile Gly Ala His Thr His Thr980 985 990Val Ala Ile Gly Ser His Gly His Thr Ile Thr Val Asn Ser Thr Gly995 10001005Asn Thr Glu Asn Thr Val Lys Asn Ile Ala Phe Asn Tyr Ile Val Arg101010151020Leu Ala102權(quán)利要求
1.一種分離的基本上由從氨基末端數(shù)缺乏氨基酸99-496(SEQ IDNO6)的T4噬菌體的gp37尾絲蛋白組成的多肽，其中所說多肽具有形成二聚體和與T4噬菌體的P36蛋白寡聚物相互作用的能力。
2.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp36蛋白與gp37蛋白形成的融合蛋白組成的多肽，其中g(shù)p37(SEQ ID NO6)的氨基酸殘基1-242以正確的閱讀框架與gp36(SEQ ID NO5)的氨基酸殘基18-221融合。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中該種多肽的多數(shù)羧基末端具有如下能力能與T4噬菌體的P37蛋白寡聚物的氨基末端相互作用，進(jìn)而形成一種連接的寡聚物，該多肽寡聚物的氨基末端能夠與T4噬菌體的gp36多肽的羧基末端相互作用。
4.一種分離的基本上由兩個(gè)來自T4噬菌體的gp37多肽組成的多肽寡聚物，其中該寡聚物的氨基末端不能與T4噬菌體的gp36多肽的羧基末端相互作用。
5.一種分離的基本上由T4噬菌體的P37蛋白組成的多肽寡聚物，其中該寡聚物的氨基末端不能與T4噬菌體的gp36多肽的羧基末端相互作用。
6.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp36蛋白的變異體組成的多肽，其中該多肽不能與T4噬菌體的P37蛋白寡聚物的氨基末端相互作用。
7.一種分離的基本上由一種T4噬菌體的gp36蛋白和gp34蛋白形成的融合蛋白組成的多肽，其中g(shù)p36(SEQ ID NO5)氨基酸殘基1-73在適當(dāng)?shù)拈喿x杠架下以其氨基末端與gp34(SEQ ID NO5)的氨基酸殘基866-1289融合在一起。
8.權(quán)利要求7多肽的寡聚物，其中所說二聚體的氨基末端能夠與T4噬菌體的gp35蛋白相互作用。
9.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp35蛋白的變異體組成的多肽，其中該多肽在使T4噬菌體的P34與P36-P37蛋白寡聚物連結(jié)起來時(shí)形成了一個(gè)小于大約125°的角，在這種條件下，野生gp35蛋白在與該寡聚物連接時(shí)形成了一個(gè)137°的角。
10.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp35蛋白的一種變異體組成的多肽，其中該多肽在與T4噬菌體的P34與P36-P37蛋白寡聚物連接起來時(shí)形成了一個(gè)大于約145°的角，在這種條件下其中野生型gp35蛋白在與該寡聚物連接時(shí)形成了一個(gè)137°的角。
11.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp35蛋白的一種變異體組成的多肽，其中該多肽與T4噬菌體的P34蛋白寡聚物的相互作用在40-60℃條件下是不穩(wěn)定的。
12.一種分離的基本上由T4噬菌體的P37蛋白的一種變異體組成的多肽寡聚物，其中該寡聚物與T4噬菌體的P36蛋白寡聚物的相互作用在40-60℃條件下是不穩(wěn)定的。
13.一種分離的基本上由T4噬菌體的P37蛋白的一種變異體組成的多肽寡聚物，其中該寡聚物的羧基末端區(qū)域被修飾以便賦予整個(gè)多肽與一種固定化配體特異結(jié)合能力。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中所說的配體選自生物素，免疫球蛋白，或二價(jià)金屬離子。
15.一種包含多個(gè)融合蛋白的納米結(jié)構(gòu)，所說的融合蛋白由兩部分組成，第一部分至少由尾絲蛋白的前10個(gè)N-端氨基酸組成，第二部分至少由中另一種尾絲蛋白的后10個(gè)C-端氨基酸組成，這兩部分通過一種肽鍵融合在一起，其中此尾絲蛋白選自T-偶數(shù)類噬菌體的gp34，gp35，gp36和gp37蛋白，其中第一種尾絲蛋白可以與第二種尾絲蛋白相同，也可以不同。
16.權(quán)利要求15的納米結(jié)構(gòu)，其中第一種和第二種尾纖維蛋白不同。
17.權(quán)利要求15的納米結(jié)構(gòu)，還包含一種能自我組裝成二聚體或三聚體的分子，該分子至少與一種T偶數(shù)類尾絲蛋白的10氨基酸部分融合。
18.權(quán)利要求17的納米結(jié)構(gòu)，其中該分子具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。
19.樹利要求15的納米結(jié)構(gòu)，其中該納米結(jié)構(gòu)包含一種線性一維的桿狀結(jié)構(gòu)。
20.權(quán)利要求15的納米結(jié)構(gòu)，其中該納米結(jié)構(gòu)包含一種多邊形結(jié)構(gòu)。
21.權(quán)利要求15的納米結(jié)構(gòu)，其中該納米結(jié)構(gòu)包含一種三維籠狀或?qū)嶓w結(jié)構(gòu)。
22.權(quán)利要求15的納米結(jié)構(gòu)，其中該納米結(jié)構(gòu)包含一種平面的開放或封閉的片狀結(jié)構(gòu)。
23.一種分離的融合蛋白，基本上由兩部組成，一部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp37蛋白，它至少由此gp37蛋白的前10到60個(gè)N-末端氨基酸組成，這部分和第二部分相融合，第二部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp36蛋白，它至少由此gp36蛋白的最后10到60個(gè)C-末端氨基酸組成。
24.一種分離的融合蛋白，基本上由兩部分組成，一部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp37蛋白，它至少由此gp37蛋白的前10個(gè)N-末端氨基酸組成，這一部分與第二部分相融合，第二部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp36蛋白，它至少由此gp36蛋白最后10個(gè)C-末端氨基酸組成。
25.一種分離的融合蛋白，基本由兩部分組成，一部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp37蛋白，它至少由此gp37蛋白的前20個(gè)N-末端氨基酸組成，這一部分與第二部分相融合，第二部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp36蛋白，它至少由此gp36蛋白的最后20個(gè)C-末端氨基酸組成。
26.一種分離的融合蛋白，基本由兩部分組成，一部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp36蛋白，它至少由此gp36蛋白的前10-60個(gè)N-末端氨基酸組成，這一部分與第二部分融合，第二部分來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp34蛋白，它至少由此gp34蛋白的最后10-60個(gè)C-末端氨基酸組成。
27.一種分離的蛋白，至少包括20個(gè)相鄰的氨基酸，這些氨基酸來自一種T-偶數(shù)類噬菌體的gp37，gp36，或gp34蛋白，此分離的蛋白至少缺少5個(gè)此蛋白氨基末端或羧基末端氨基酸。
28.一種分離的編碼權(quán)利要求1的多肽的DNA。
29.一種分離的編碼權(quán)利要求2的多肽的DNA。
30.一種分離的編碼權(quán)利要求4的多肽的DNA。
31.一種分離的編碼權(quán)利要求5的多肽的DNA。
32.一種分離的編碼權(quán)利要求6的多肽的DNA。
33.一種分離的編碼權(quán)利要求7的多肽的DNA。
34.一種分離的編碼權(quán)利要求9的多肽的DNA。
35.一種分離的編碼權(quán)利要求10的多肽的DNA。
36.一種分離的編碼權(quán)利要求11的多肽的DNA。
37.一種分離的編碼權(quán)利要求12的多肽的DNA。
38.一種分離的編碼權(quán)利要求13的多肽的DNA。
39.一種分離的編碼權(quán)利要求23的多肽的DNA。
40.一種分離的編碼權(quán)利要求25的多肽的DNA。
41.一種分離的編碼權(quán)利要求26的多肽的DNA。
42.一種分離的編碼權(quán)利要求27的多肽的DNA。
43.一種制備多邊形納米結(jié)構(gòu)的方法，包括使權(quán)利要求26的蛋白與提純的T-偶數(shù)類噬菌體的gp35蛋白接觸。
44.一種制備納米結(jié)構(gòu)的方法，包括使多個(gè)權(quán)利要求23的蛋白質(zhì)相互接觸。
45.一種在一個(gè)或多個(gè)容器中包含有權(quán)利要求23的融合蛋白的試劑盒。
46.一種在一個(gè)或多個(gè)容器中包含有權(quán)利要求25的融合蛋白的試劑盒。
47.一種在一個(gè)或多個(gè)容器中包含有權(quán)利要求26的融合蛋白的試劑盒。
48.一種試劑盒，在一個(gè)或多個(gè)容器中包含有權(quán)利要求26的融合蛋白和一種分離的T-偶數(shù)類噬菌體的gp35蛋白。
49.權(quán)利要求23的蛋白，其中T偶數(shù)類噬菌體是T4。
50.權(quán)利要求26蛋白，其中T偶數(shù)類噬菌體是T4。
51.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp36蛋白的一種變異體組成的多肽，其中該多肽與T4噬菌體的P37蛋白寡聚物之間的相互作用在40-60℃條件下不穩(wěn)定。
52.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp36蛋白的一種變異體組成的多肽，其中該多肽與T4噬菌體的gp35蛋白之間的相互作用在40-60℃條件下不穩(wěn)定。
53.一種分離的基本上由T4噬菌體的gp34蛋白的一種變異體組成的多肽，其中該多肽與T4噬菌體的gp35蛋白之間的相互作用在40-60℃條件下不穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米結(jié)構(gòu)，即在微觀和宏觀結(jié)構(gòu)的建造中有用的納米大小的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明尤其是指基于T4噬菌體尾絲蛋白及其變異體的納米結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1168676SQ95196597
公開日1997年12月24日 申請(qǐng)日期1995年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月13日
發(fā)明者愛德華B·戈德伯格 申請(qǐng)人:愛德華B·戈德伯格