專(zhuān)利名稱(chēng)：角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的類(lèi)似物的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)和蛋白工程。具體地說(shuō)，應(yīng)用重組DNA方法生成角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)的多肽類(lèi)似物，KGF是非成纖維上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的強(qiáng)力促細(xì)胞分裂劑，其中類(lèi)似物具有比母體KGF增強(qiáng)的穩(wěn)定性。

背景技術(shù)：
組織生成和再生地復(fù)雜過(guò)程由大量有時(shí)被稱(chēng)作軟組織生長(zhǎng)因子的蛋白因子介導(dǎo)。這些分子通常由一種細(xì)胞類(lèi)型釋放，影響其它細(xì)胞類(lèi)型的增殖(Rubin等(1989)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，86802-806)。有些軟組織生長(zhǎng)因子由某種細(xì)胞類(lèi)型分泌，影響多細(xì)胞生物體發(fā)育過(guò)程中應(yīng)答細(xì)胞的增殖、分化和/或成熟(Finch等(1989)，科學(xué)，245752-755)。除了在正在發(fā)育的生物體中起作用，有些還對(duì)更成熟的系統(tǒng)的持續(xù)的健康與維持有重要意義。例如，哺乳動(dòng)物中有許多系統(tǒng)的細(xì)胞更新很快。這些系統(tǒng)包括皮膚和胃腸道，二者均含上皮細(xì)胞。軟組織生長(zhǎng)因子包括了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)蛋白家族。
目前已知八種FGF家族成員，它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上有親緣關(guān)系堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，bFGF(Abraham等(1986)，EMBO雜志，52523-2528)；酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，aFGF(Jaye等(1986)，科學(xué)，233541-545)；int-2基因產(chǎn)物，int-2(Dickson和Peters(1987)，自然，326833)；hst/kFGF(Delli-Bovi等(1987)，細(xì)胞，50729-737)和Yoshida等(1987)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，847305-7309)；FGF-5(Zhan等，(1988)，分子細(xì)胞生物學(xué)，83487-3495)；FGF-6(Marics等，(1989)，癌基因，4335-340)；角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Finch等，(1989)，科學(xué)，24752-755)；和富組親動(dòng)蛋白(Habazzettl等(1992)，自然，359855-858)。
FGF家族的蛋白中，角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)是間質(zhì)組織來(lái)源的非成纖維上皮(尤其是角化細(xì)胞)細(xì)胞增殖的專(zhuān)一效應(yīng)物。術(shù)語(yǔ)“天然KGF”指SEQ ID NO2給出的氨基酸序列所描述的天然人類(lèi)(hKGF)或重組(rKGF)多肽(帶或不帶信號(hào)序列)或其等位變異體。(除非有其它說(shuō)明，本文描述的分子的氨基酸編號(hào)應(yīng)當(dāng)對(duì)應(yīng)于SEQID NO2的氨基酸32至194給出的天然分子的成熟形式(即去掉信號(hào)序列)的編號(hào))。
天然KGF可從天然的人類(lèi)來(lái)源(hKGF)或用重組DNA技術(shù)(rKGF)生產(chǎn)得到(Finch等(1989)，引文見(jiàn)上；Rubin等(1989)，引文見(jiàn)上；Ron等(1993)，生物化學(xué)雜志，268(4)2984-2988；Yan等(1991)，體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)，27A437-438)。
已知天然KGF在水溶液狀態(tài)下相對(duì)不穩(wěn)定，可發(fā)生化學(xué)的和物理的降解，導(dǎo)致在生產(chǎn)和貯存時(shí)生物活性損失(Chen等(1994)，醫(yī)藥研究，111582-1589)。升溫時(shí)天然KGF傾向于聚集，酸性條件下傾向于失活(Rubin等(1989)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，86802-806)。天然KGF在水溶液中的聚集也使蛋白失活。這種活性損失是有害的，因?yàn)樗沟瞄L(zhǎng)時(shí)間貯存天然KGF蛋白的水溶液制劑不可行，長(zhǎng)時(shí)間用該蛋白給藥也不可行。而且制備藥物制劑特別成問(wèn)題，因?yàn)榫奂牡鞍子忻庖咴?Cleland等(1993)，醫(yī)用藥物載體系統(tǒng)評(píng)論與綜述，10307-377；Robbins等(1987)，糖尿病，36838-845；Pinckard等(1967)，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)，2331-340)。
天然KGF有5個(gè)半胱氨酸殘基，即氨基酸1、15、40、102和106(Finch等(1989)，科學(xué)，24752-755)。雖然天然KGF的半胱氨酸含量已有報(bào)道，但半胱氨酸殘基對(duì)活性(例如對(duì)生物活性的必需性)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如形成不需要的分子間和分子內(nèi)二硫鍵的傾向性)所起的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此沒(méi)有現(xiàn)有技術(shù)說(shuō)明，半胱氨酸殘基(如果有的話)為不需要的二硫鍵形成所必需或參與二硫鍵形成，從而使蛋白易于聚集和/或不穩(wěn)定。
為了改進(jìn)或改變天然KGF的一個(gè)或多個(gè)特性，可以應(yīng)用蛋白工程。重組DNA技術(shù)已被用于修飾天然KGF序列。
Ron等(1993，生物化學(xué)雜志，268(4)2984-2988)報(bào)道N末端3、8、27、38或49個(gè)氨基酸缺失的修飾KGF多肽。缺失3、8、或27個(gè)N末端殘基的多肽保留肝素結(jié)合活性；其它的不保留該活性。而且缺失3和8個(gè)殘基的多肽據(jù)報(bào)道具有全部活性，而缺失27個(gè)殘基的多肽的促細(xì)胞分裂能力減少10到20倍，缺失38或49個(gè)氨基酸的形式?jīng)]有促細(xì)胞分裂活性。修飾的KGF多肽的穩(wěn)定性未被討論或報(bào)道。
已出版的PCT申請(qǐng)90/08771號(hào)，引文見(jiàn)上，也報(bào)道生產(chǎn)了一種嵌合蛋白，其中天然KGF成熟形式的前40個(gè)N末端氨基酸與aFGF的C末端部分(約140個(gè)氨基酸)組合。據(jù)報(bào)道，該嵌合體象KGF一樣靶向角化細(xì)胞，但對(duì)肝素不敏感，后者是aFGF的特征而非KGF的特征。嵌合體的穩(wěn)定性未見(jiàn)討論或報(bào)道。
因此尚沒(méi)有這樣一種修飾的KGF分子的報(bào)道，該分子的穩(wěn)定性比天然KGF明顯增高。而且文獻(xiàn)中也未報(bào)道有足夠的講述與證據(jù)，使人們能合理地期待能成功地生成具有所需特征的KGF分子。
通常，任何氨基酸變化對(duì)蛋白生物活性的影響依賴許多因素而變化，包括蛋白三維結(jié)構(gòu)，以及修飾是否在蛋白一級(jí)序列的受體結(jié)合區(qū)。由于三維結(jié)構(gòu)或天然KGF的一級(jí)結(jié)構(gòu)受體結(jié)合區(qū)未見(jiàn)于出版物，本領(lǐng)域已有知識(shí)不足以根據(jù)氨基酸修飾對(duì)普通歸類(lèi)的蛋白的效果歸納出氨基酸修飾對(duì)天然KGF的作用。
本發(fā)明的目的是提供編碼比天然KGF穩(wěn)定性升高(例如在典型pH、熱和/或其它貯存條件下)的KGF類(lèi)似物的多肽分子。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供新的有生物活性的KGF多肽類(lèi)似物。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“KGF”包括天然KGF和以肽序列基本與天然KGF肽序列相同為特征的蛋白，它保留對(duì)應(yīng)于天然KGF的Cys1和Cys15(SEQ ID NO2)的Cys32和Cys46)的半胱氨酸殘基，還保留天然KGF的部分或全部活性，特別是非成纖維上皮細(xì)胞增殖活性?！耙噪男蛄谢九c天然KGF肽序列相同為特征”指能優(yōu)選地在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與SEQ ID NO1的核苷酸201到684雜交的DNA序列編碼的肽序列。
要確定兩段氨基酸序列的對(duì)應(yīng)氨基酸位置，可以將兩段序列并列，使殘基匹配最大化，包括移動(dòng)氨基端和/或羧基端，需要時(shí)在候選物中引入裂隙(gap)或去除作為插入序列的殘基?？捎弥页Ｓ玫男蛄型葱?一致性掃描算法程序(例如Pearson和Lipman(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，852444-2448；Altschul等(1990)，分子生物學(xué)雜志，215403-410；Lipman和Pearson(1985)，科學(xué)，2221435或Devereux等(1984)，核酸研究，12387-395)作數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、序列分析與操作。
雜交時(shí)的嚴(yán)謹(jǐn)條件是雜交反應(yīng)中鹽，溫度，有機(jī)溶劑和其它典型受控參數(shù)的嚴(yán)謹(jǐn)組合條件。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子有4×SSC中62-67℃雜交，再用0.1×SSC 62-67℃洗約1小時(shí)。可選地，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子為在45-55％甲酰胺，4×SSC中40-45℃雜交(見(jiàn)T.Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南；冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)，387至389頁(yè))。
因此，蛋白包括天然KGF片段、嵌合體或雜交分子的等位變異體或氨基酸缺失、替換，或插入。一種KGF的例子包括電荷變化多肽，其中天然KGF的氨基酸殘基41-154中一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選的是殘基Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153或Thr154)缺失或被中性殘基或帶負(fù)電荷殘基替換，以使蛋白正電荷減少(見(jiàn)共有的U.S.S.N.08/323,337，提交日期1994年10月13日)，具體包括R(144)Q，一種在天然KGF的氨基酸144位將谷酰胺替換成精氨酸的KGF。另一KGF的例子包括將具有高度環(huán)形成能力的至少一個(gè)氨基酸替換天然KGF的環(huán)形成區(qū)Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119中至少一個(gè)氨基酸得到的蛋白(見(jiàn)共有的U.S.S.N.08/327,473，提交日期1994年10月13日)，具體包括H(116)G，一種將天然KGF氨基酸116位的組氨酸替換成甘氨酸的KGF。另一個(gè)例子包括在天然KGF的123-133區(qū)(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的蛋白，這些蛋白可能具有激動(dòng)或拮抗活性。
人們驚奇地發(fā)現(xiàn)若含有對(duì)應(yīng)于天然KGF的Lys1和Lys15(SEQ IDNO2的半胱氨酸殘基32和46)的半胱氨酸殘基(用上述技術(shù)確定)的KGF分子經(jīng)修飾去掉了對(duì)應(yīng)的半胱氨酸，得到的KGF類(lèi)似物比母體KGF穩(wěn)定性升高。優(yōu)選地，本發(fā)明除了使穩(wěn)定性升高外，還要得到與天然KGF相比表現(xiàn)全部生物活性(即至少有基本相似的受體結(jié)合或親和活性)的類(lèi)似物。
本發(fā)明另一方面描述了純化并分離的編碼各種有生物活性的KGF多肽類(lèi)似物的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中這些核酸包括克隆到有生物功能的質(zhì)?；虿《据d體的DNA分子。在另一實(shí)施方案中，核酸結(jié)構(gòu)可能用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一個(gè)方法，其中用核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的原核(優(yōu)選的是大腸桿菌)或真核宿主細(xì)胞在允許KGF類(lèi)似物表達(dá)的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。表達(dá)后得到的重組多肽可被分離并純化。
本發(fā)明的另一方面涉及含有治療有效量的KGF類(lèi)似物和藥用載體的藥物制劑。這種制劑將用于治療患有上皮疾病和損傷的患者。
本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)對(duì)患者施用治療有效量的KGF類(lèi)似物來(lái)刺激上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，非成纖維上皮細(xì)胞是被刺激增殖的細(xì)胞。這樣的上皮細(xì)胞包括各種附件(adnexal)細(xì)胞、胰細(xì)胞、肝細(xì)胞和呼吸道與胃腸道的粘液上皮。
附圖簡(jiǎn)述


圖1給出天然KGF的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQID NO2)(編碼天然KGF成熟形式的核苷酸由SEQ ID NO1的堿基201至684給出，KGF的成熟形式由SEQ ID NO2的氨基酸殘基32至194給出)。
圖2A、2B和2C分別給出pCFM1156，pCFM1656和pCFM3102的質(zhì)粒圖譜。
圖3給出RSH-KGF構(gòu)建體核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQID NO4)序列。
圖4給出包含于KGF質(zhì)粒的構(gòu)建體的核苷酸(SEQ ID NO5)和氨基酸(SEQ ID NO6)序列。
圖5給出用于替換包含于KGF質(zhì)粒的構(gòu)建體的KpnI位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)間DNA序列(SEQ ID NO6的氨基酸46至85位)以生產(chǎn)KGF(dsd)質(zhì)粒中的構(gòu)建體的化學(xué)合成OLIGO(OLIGO#6至OLIGO#11分別為SEQ ID NO12-17)。
圖6給出用于構(gòu)建KGF(密碼子最優(yōu)化)的化學(xué)合成OLIGO(OLIGO#12至OLIGO#24，分別為SEQ ID NO18-30)。
圖7給出在天然KGF氨基酸位置1和15用絲氨酸替換半胱氨酸的KGF類(lèi)似物C(1，15)S的核苷酸(SEQ ID NO31)和氨基酸(SEQ IDNO32)序列。
圖8給出天然KGF的N末端前3個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸被替換成絲氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN3/C(15)S的核苷酸(SEQ IDNO33)和氨基酸(SEQ ID NO34)序列。
圖9給出天然KGF的N末端前3個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN3/C(15)-的氨基酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列。
圖10給出天然KGF的N末端前8個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸被替換成絲氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN8/C(15)S的核苷酸(SEQID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列。
圖11給出天然KGF的N末端前8個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置15的半胱氨酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN8/C(15)-的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。
圖12給出天然KGF的N末端前15個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN15的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。
圖13給出天然KGF的N末端前16個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN16的核苷酸(SEQ ID NO43)和氨基酸(SEQ ID NO44)序列。
圖14給出天然KGF的N末端前17個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN17的核苷酸(SEQ ID NO45)和氨基酸(SEQ ID NO46)序列。
圖15給出天然KGF的N末端前18個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN18的核苷酸(SEQ ID NO47)和氨基酸(SEQ ID NO48)序列。
圖16給出天然KGF的N末端前19個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN19的核苷酸(SEQ ID NO49)和氨基酸(SEQ ID NO50)序列。
圖17給出天然KGF的N末端前20個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN20的核苷酸(SEQ ID NO51)和氨基酸(SEQ ID NO52)序列。
圖18給出天然KGF的N末端前21個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN21的核苷酸(SEQ ID NO53)和氨基酸(SEQ IDNO54)序列。
圖19給出天然KGF的N末端前22個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN22的核苷酸(SEQ ID NO55)和氨基酸(SEQ ID NO56)序列。
圖20給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN23的核苷酸(SEQ ID NO57)和氨基酸(SEQ ID NO58)序列。
圖21給出天然KGF的N末端前24個(gè)氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物ΔN24的核苷酸(SEQ ID NO59)和氨基酸(SEQ ID NO60)序列。
圖22給出天然KGF的氨基酸位置1和15的半胱氨酸被替換成絲氨酸且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷氨酸的KGF類(lèi)似物C(1，15)S/R(144)E的核苷酸(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ ID NO62)序列。
圖23給出天然KGF的氨基酸位置1和15的半胱氨酸被替換成絲氨酸且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷酰胺的KGF類(lèi)似物C(1，15)S/R(144)Q的核苷酸(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ ID NO64)序列。
圖24給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷酰胺的KGF類(lèi)似物ΔN23/R(144)Q的核苷酸(SEQID NO65)和氨基酸(SEQ ID NO66)序列。
圖25給出天然KGF和C(1，15)S在20mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pH7.0中37℃貯存27小時(shí)后剩余的可溶蛋白量。
圖26給出天然KGF和C(1，15)S在20mMNaPO4，0.15M NaCl，pH7.0中37℃貯存27小時(shí)后剩余的可溶蛋白量。
圖27給出天然KGF，ΔN15和C(1，15)S在50mM NaPO4，0.15M NaCl，pH7.0中37℃貯存27小時(shí)后剩余的可溶蛋白量。
圖28給出體積排阻HPLC確定的可溶蛋白量作為37℃溫育時(shí)間的函數(shù)。
圖29給出天然KGF，C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E估計(jì)的熔解溫度(Tm)作為pH的函數(shù)。
圖30給出通過(guò)測(cè)量DNA合成時(shí)[3H]-胸苷摻入確定的與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得到的C(1，15)S促細(xì)胞分裂活性的典型圖譜。
圖31給出通過(guò)測(cè)量DNA合成時(shí)[3H]-胸苷摻入確定的與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得到的ΔN15促細(xì)胞分裂活性的典型圖譜。
圖32給出通過(guò)測(cè)量DNA合成時(shí)[3H]-胸苷摻入確定的與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得到的ΔN23促細(xì)胞分裂活性的典型圖譜。
圖33給出通過(guò)測(cè)量DNA合成時(shí)[3H]-胸苷摻入確定的與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得到的ΔN23/R(144)Q的促細(xì)胞分裂活性的典型圖譜。
圖34給出通過(guò)測(cè)量DNA合成時(shí)[3H]-胸苷摻入確定的與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得到的C(1，15)S/R(144)Q促細(xì)胞分裂活性的典型圖譜。
圖35給出通過(guò)測(cè)量DNA合成時(shí)[3H]-胸苷摻入確定的與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得到的C(1，15)S/R(144)E促細(xì)胞分裂活性的典型圖譜。
圖36給出C(1，15)S和ΔN23對(duì)血清化學(xué)的作用。
圖37給出天然KGF氨基酸位置1，15和40的半胱氨酸被替換成絲氨酸的KGF類(lèi)似物C(1，15，40)S的核苷酸(SEQ ID NO77)和氨基酸(SEQ ID NO78)序列。
圖38給出天然KGF氨基酸位置1，15和102的半胱氨酸被替換成絲氨酸的KGF類(lèi)似物C(1，15，102)S的核苷酸(SEQ ID NO79)和氨基酸(SEQ ID NO80)序列。
圖39給出天然KGF氨基酸位置1，15，102和106位的半胱氨酸被替換成絲氨酸的KGF類(lèi)似物C(1，15，102，106)S的核苷酸(SEQ ID NO81)和氨基酸(SEQ D NO82)序列。
圖40給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸137位的天冬酰胺被替換成谷氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/N(137)E的核苷酸(SEQ D NO83)和氨基酸(SEQ ID NO84)序列。
圖41給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置139的賴氨酸被替換成谷氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/K(139)E的核苷酸(SEQID NO85)和氨基酸(SEQ ID NO86)序列。
圖42給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置139的賴氨酸被替換成谷酰胺的KGF類(lèi)似物ΔN23/K(139)Q的核苷酸(SEQID NO87)和氨基酸(SEQ ID NO88)序列。
圖43給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷丙氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/R(144)A的核苷酸(SEQ ID NO89)和氨基酸(SEQ ID NO90)序列。
圖44給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替換成谷氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/R(144)E的核苷酸(SEQID NO91)和氨基酸(SEQ ID NO92)序列。
圖45給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置144的精氨酸被替換成亮氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/R(144)L的核苷酸(SEQID NO93)和氨基酸(SEQ ID NO94)序列。
圖46給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置147的賴氨酸被替換成谷氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/K(147)E的核苷酸(SEQID NO95)和氨基酸(SEQ ID NO96)序列。
圖47給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置147的賴氨酸被替換成谷酰胺的KGF類(lèi)似物ΔN23/K(147)Q的核苷酸(SEQID NO97)和氨基酸(SEQ ID NO98)序列。
圖48給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置153的賴氨酸被替換成谷氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/K(153)E的核苷酸(SEQID NO99)和氨基酸(SEQ ID NO100)序列。
圖49給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置153的賴氨酸被替換成谷酰胺的KGF類(lèi)似物ΔN23/K(153)Q的核苷酸(SEQID NO101)和氨基酸(SEQ ID NO102)序列。
圖50給出天然KGF的N末端前23個(gè)氨基酸缺失且氨基酸位置152的谷酰胺被替換成谷氨酸，153位的賴氨酸被替換成谷氨酸的KGF類(lèi)似物ΔN23/Q(153)E/K(153)E的核苷酸(SEQ ID NO103)和氨基酸(SEQID NO104)序列。
圖51給出ΔN23對(duì)Sprague-Dawley大鼠鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病的作用。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供新的KGF類(lèi)似物。已確定天然KGF的4個(gè)半胱氨酸殘基(Cys1和Cys15，Cys102和Cys106)參與形成兩個(gè)二硫橋。Cys40不參與形成分子內(nèi)二硫鍵。因而KGF含有相隔幾乎90個(gè)氨基酸的兩個(gè)小二硫環(huán)。根據(jù)第一要點(diǎn)，對(duì)哪些半胱氨酸殘基參與了二硫橋的確定表明這些半胱氨酸能自由地形成不需要的分子間交聯(lián)或分子內(nèi)鍵，從而使蛋白形成不需要的三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如一種減少蛋白活性的構(gòu)象)。
人們驚奇地發(fā)現(xiàn)通過(guò)去除對(duì)應(yīng)于KGF位置1和15的半胱氨酸殘基(SEQ ID NO2的32和46位)或?qū)⑵溆闷渌被釟埢鎿Q來(lái)修飾KGF得到穩(wěn)定性提高相當(dāng)多的KGF類(lèi)似物(即不正常折疊，形成分子間二硫鍵和/或蛋白聚集造成的問(wèn)題減少)。例如KGF類(lèi)似物一般以產(chǎn)率提高的可溶和正確折疊的蛋白形式被純化。而且該物質(zhì)一旦被純化，與母體分子相比，對(duì)pH，溫度等的穩(wěn)定性增大。不受理論所束縛，據(jù)信KGF的Cys1和Cys15除去形成分子內(nèi)二硫橋的N末端二硫環(huán)外，在一定條件下以游離的半胱氨酸形式存在，能形成分子間二硫橋，使蛋白不穩(wěn)定并聚集。而且發(fā)現(xiàn)N末端二硫環(huán)對(duì)受體結(jié)合或細(xì)胞分裂活性并不重要。
本發(fā)明中“KGF類(lèi)似物”或“KGF多肽類(lèi)似物”均指任何所述的天然或非天然存在的多肽，其與KGF的結(jié)構(gòu)差別在于對(duì)應(yīng)于KGF的N末端24個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2的氨基酸32至55)的肽序列含有修飾，其中KGF的Cys1和Cys15(SEQ ID NO2的氨基酸32至46)被替換或缺失。半胱氨酸被替換或缺失的方式并不重要，包括例如多肽類(lèi)似物含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或替換。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一個(gè)新的角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白家族。該家族包括幾組蛋白。
一組KGF類(lèi)似物的分子中KGFl和15位半胱氨酸被氨基酸，包括不是天然存在于蛋白的氨基酸所替換。生成替換類(lèi)似物的策略包括定點(diǎn)突變(Ho等(1989)，基因，7751-59；Innis等“PRC操作規(guī)程(PRC Protocols)”學(xué)術(shù)出版公司，圣迭戈，加州)。(含有氨基酸替換的KGF類(lèi)似物表示法SEQ ID NO2給出的成熟蛋白(無(wú)信號(hào)序列)該位置的氨基酸，后面括號(hào)內(nèi)是該氨基酸位置，再后面是新氨基酸。例如在KGF氨基酸15位(SEQ ID NO2的46位)半胱氨酸被替換成絲氨酸的類(lèi)似物記作“C(15)S”。)優(yōu)選地，半胱氨酸變成中性氨基酸如甘氨酸，纈氨酸，丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，色氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和蛋氨酸，其中絲氨酸，蘇氨酸和丙氨酸由于與半胱氨酸化學(xué)性質(zhì)相似而最為優(yōu)選。實(shí)施例1詳述了用部分基因合成(與其它重組技術(shù)共用)，然后在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主中重組表達(dá)而生成C(15)S。
另一組KGF類(lèi)似物分子去除了KGF第1位和15位的半胱氨酸。可用不同策略來(lái)研制這種KGF類(lèi)似物，如N末端截短和定點(diǎn)缺失或二者組合。
“N末端截短”指這樣一種KGF修飾，其中KGF的1至24N末端氨基酸殘基(SEQ ID NO2的氨基酸32至55)，包括Cys1和Cys15缺失。(含氨基酸截短的KGF類(lèi)似物可以這樣表示由SEQ ID NO2給出的成熟蛋白(無(wú)信號(hào)序列)中該位置的缺失殘基，缺失位點(diǎn)的起始和缺失的殘基數(shù)。例如，KGFN末端24個(gè)殘基(SEQ ID NO2的1-55殘基)截短的KGF類(lèi)似物被稱(chēng)為“ΔN24”類(lèi)似物。)具體地說(shuō)，該組包括天然KGF的ΔN23類(lèi)似物，其中氨基酸殘基41-154(SEQ ID NO2的氨基酸72-185)的一個(gè)或多個(gè)，特別地包括氨基酸殘基123-133(SEQ ID NO2的氨基酸154-164，缺失或被中性殘基或帶負(fù)電荷的殘基替換，這些殘基可以降低蛋白的正電荷。優(yōu)選的待修飾殘基是Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153或Thr154，其中Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152或Lys153更優(yōu)選，Arg144最優(yōu)選。該組還包括天然KGF的ΔN23類(lèi)似物，在Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119(SEQ IDNO2的氨基酸146-150)的環(huán)形成區(qū)具有環(huán)形成修飾，優(yōu)選地包括氨基酸殘基116的電荷變化修飾，更優(yōu)選的是116位被替換成甘氨酸。該組進(jìn)一步包括天然KGF的ΔN23類(lèi)似物，在天然KGF的123-133區(qū)(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換，缺失或添加。
實(shí)施例1詳述用部分基因合成連同其它重組技術(shù)，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主中重組表達(dá)而生成有系統(tǒng)的N末端截短，例舉的這種N末端截短包括ΔN15至ΔN24。而且實(shí)施例3詳述了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)編碼天然KGF和異質(zhì)N末端糖基化同型物(isoform)的DNA，以及優(yōu)選的具有天然KGF成熟形式氨基酸1-23N末端截短的糖基化同型物的純化。
與之對(duì)照，定點(diǎn)缺失指這樣一種KGF修飾，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如Cys1或Cys15)被去除。若特異性地去除KGF的Cys1或Cys15，則類(lèi)似物比KGF少一個(gè)氨基酸。(含有氨基酸缺失的KGF類(lèi)似物如下表示SEQ ID NO2給出的成熟蛋白(無(wú)信號(hào)序列)該位置的殘基，后面是括號(hào)中的氨基酸位置，再后面是一個(gè)負(fù)號(hào)。例如該組類(lèi)似物在KGF第15位有半胱氨酸缺失(SEQ ID NO2的第36位)，記作“C(15)-”。)可如上述用定點(diǎn)突變生成定點(diǎn)缺失。
該組還包括通過(guò)截短和缺失去除Cys1和Cys15的KGF類(lèi)似物。例如代表性的KGF類(lèi)似物在KGF前3個(gè)末端殘基被截短(Cys-Asn-Asp)或KGF前8個(gè)末端殘基(Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln)被截短且KGF氨基酸第15位半胱氨酸缺失(這些類(lèi)似物分別記作ΔN3/C(15)-和ΔN8/C(15)-)。由于天然KGF氨基酸第4和9位天然存在蛋氨酸殘基，不需要另外的Met密碼子以保證適當(dāng)?shù)姆g起始。
另一組分子的KGF第1和15位半胱氨酸通過(guò)截短和替換而被取代。例如代表性的KGF類(lèi)似物是ΔN3/C(15)S和ΔN8/C(15)S。這樣的類(lèi)似物含有KGF前3個(gè)或前8個(gè)氨基酸殘基截短且氨基酸位置15的半胱氨酸被另一種氨基酸例如絲氨酸替換。
若KGF類(lèi)似物是生物生成的，即是細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物而非固態(tài)合成的，或是天然產(chǎn)物的蛋白水解或酶解衍生物等，則編碼這些多肽的核酸與天然KGF核苷酸序列相比將有一個(gè)或多個(gè)核苷酸不同。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可用許多重組技術(shù)的任一種表達(dá)這些核苷酸并純化得到的多肽。
編碼KGF類(lèi)似物全部或部分的DNA序列可包括加入優(yōu)選地在選定宿主細(xì)胞中表達(dá)的密碼子(例如“大腸桿菌表達(dá)密碼子”)；提供限制酶切割位點(diǎn)；提供另外的起始、終止或中間核苷酸序列(例如用于大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的起始蛋氨酸殘基)以協(xié)助構(gòu)建易于表達(dá)的載體。
本發(fā)明還提供重組分子或載體，用于多肽表達(dá)。這種載體可由DNA或RNA組成，可為環(huán)型、線型、單鏈或雙鏈，可以是天然存在的或是多種組分(無(wú)論它是天然存在的還是合成的)的組合體。
已知許多這種表達(dá)載體的例子。載體的組分，例如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子，啟動(dòng)子等可得自天然來(lái)源或由已知操作方法合成。各種情況下用于本發(fā)明的表達(dá)載體含有至少一個(gè)表達(dá)控制元件，與編碼KGF多肽類(lèi)似物的插入核酸分子功能相連。有用的控制元件包括例如lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、λ噬菌體的操縱基因和啟動(dòng)子，糖酵解酵母啟動(dòng)子、酵母酸性磷酸酶基因啟動(dòng)子、酵母α交配因子、腺病毒，Epstein Barr病毒，多瘤病毒，猿猴病毒以及多種逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的啟動(dòng)子。不過(guò)本領(lǐng)域已知的大量適于原核或真核表達(dá)的其它載體和控制元件也可用于本發(fā)明的實(shí)踐。
適當(dāng)?shù)脑丝寺≥d體的例子包括大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pBR322，colE1，pUC和F因子)，優(yōu)選的質(zhì)粒是pCFM1156(ATCC 69702)，pCFM1656(ATCC 69576)和pCFM3102(描述見(jiàn)下面實(shí)施例部分)。其它大量類(lèi)型的本領(lǐng)域已知的用于哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母、真菌和細(xì)菌表達(dá)的合適載體也可用于此用途。這些載體轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞可得到KGF類(lèi)似物多肽的表達(dá)。
用于本發(fā)明的宿主微生物可為原核或真核微生物。適當(dāng)?shù)脑怂拗靼ǜ鞣N大腸桿菌(例如FM5、HB101、DH5α、DH10和MC1061)、假單胞菌、芽孢桿菌和鏈霉菌菌株，優(yōu)選大腸桿菌。合適的真核宿主包括酵母和其它真菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞，例如COS(如COS-1和COS-7)和CV-1猴細(xì)胞系、Swiss來(lái)源的3T3細(xì)胞系、Balb-c或NIH細(xì)胞，Hela和L-929小鼠細(xì)胞，以及CHO，BHK或HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞。依據(jù)所用的宿主，生產(chǎn)的重組多肽可被哺乳動(dòng)物或其它真核碳水化合物糖基化或非糖基化。
優(yōu)選的生產(chǎn)方法依許多因素和考慮而變；本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員用最少的實(shí)驗(yàn)即可獲知某一給定條件下的最優(yōu)生產(chǎn)方法。然后可用本領(lǐng)域已知的方法將得到的表達(dá)產(chǎn)物純化至近于同質(zhì)。原核細(xì)胞生產(chǎn)的典型純化方法涉及高壓或其它手段裂解細(xì)胞壁，離心或過(guò)濾去除細(xì)胞碎片，然后對(duì)上清或?yàn)V過(guò)物作離子交換層析，最后作斥水作用層析。如果類(lèi)似物以不溶形式表達(dá)，則另一純化技術(shù)涉及將含有類(lèi)似物的包涵體溶解，再離子交換層析，然后將蛋白再折疊，最后是斥水作用層析。純化技術(shù)的例子見(jiàn)共有的U.S.S.N.08/323,339，提交日期1994年10月13日。一般說(shuō)來(lái)，U.S.S.N.08/323,339講授一種純化角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的方法，包括(a)得到含有KGF的溶液；(b)將步驟(a)的溶液的KGF結(jié)合陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；(c)用洗脫液將KGF從陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上洗脫；(d)將步驟(c)的洗脫液通過(guò)合適的分子量排阻基質(zhì)或?qū)Σ襟E(c)的洗脫液作斥水作用層析；(e)從分子量排阻基質(zhì)或斥水作用層析中回收KGF。
當(dāng)然，可快速篩選類(lèi)似物來(lái)評(píng)價(jià)其物理特性。實(shí)施例部分給出多種熟知的穩(wěn)定性試驗(yàn)，但用哪種具體實(shí)驗(yàn)來(lái)檢查該類(lèi)似物并不重要。而且也可用多種試驗(yàn)檢查生物活性水平(例如，結(jié)合受體和/或親和性，促細(xì)胞分裂性，細(xì)胞增殖和/或體內(nèi)活性)，其中一些由實(shí)施例部分給出。常見(jiàn)的多種試驗(yàn)可用于快速篩選KGF類(lèi)似物以確定其是否具有可接受的生物活性。一種這樣的試驗(yàn)特異性通過(guò)與125I-KGF結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)來(lái)檢查KGF類(lèi)似物結(jié)合KGF受體(KGFR)的能力(Bottaro等(1990)，生物化學(xué)雜志，26512767-12770；Ron等(1993)，生物化學(xué)雜志，2682984-2988)。一種檢驗(yàn)KGFR/KGF類(lèi)似物相互作用的可選方法涉及使用實(shí)時(shí)生物特異性相互作用分析(BIA)技術(shù)(Felder等(1993)，分子細(xì)胞生物學(xué)，131449-1455)。另外可用促細(xì)胞分裂劑試驗(yàn)檢驗(yàn)KGF類(lèi)似物激發(fā)DNA合成的能力(Rubin等(1989)引文見(jiàn)上)。最后，可用細(xì)胞增殖試驗(yàn)來(lái)檢查KGF類(lèi)似物激發(fā)細(xì)胞增殖的能力(Falco等(1988)，癌基因，2573-578)。用任一上述試驗(yàn)系統(tǒng)均可快速對(duì)KGF類(lèi)似物篩選其生物活性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)保留天然KGF全部(即至少基本相似)體外或體內(nèi)活性的KGF類(lèi)似物。用一種或多種上述試驗(yàn)確定的具有這些特性的KGF類(lèi)似物的示例有C(1，15)S、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)-、ΔN8/C(15)S、ΔN8/C(15)-、ΔN15、ΔN16、ΔN17、ΔN18、ΔN19、ΔN20、ΔN21、ΔN22、ΔN23、ΔN24或ΔN23/R(144)Q。
可進(jìn)一步修飾KGF類(lèi)似物，使其含有通常不是肽的一部分的其它化學(xué)基元。這類(lèi)衍生基元可以提高KGF類(lèi)似物的可溶性、吸附性、生物半衰期等。這些基元可去除或減弱蛋白的任何不利副作用等。能介導(dǎo)這類(lèi)效應(yīng)的基元見(jiàn)例如《雷氏醫(yī)藥科學(xué)》第18版，Mack出版公司，Easton，賓州(1990)。將肽的靶氨基酸殘基與能與指定側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生劑反應(yīng)，在分子中引入共價(jià)修飾(T.E.Creighton(1983)《蛋白結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)》，W.H.Freeman公司，舊金山，79-86頁(yè))，聚乙二醇(PEG)是這樣一種化學(xué)基元，可用于制備醫(yī)療用蛋白產(chǎn)品。某些蛋白連接聚乙二醇能防止蛋白水解，Sada等(1991)，發(fā)酵生物工程雜志，71137-139，并且已有連上某些聚乙二醇基元的方法。見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,179,337號(hào)，Davis等，“非免疫原性多肽”1979年12月18日公布；美國(guó)專(zhuān)利4,002,531號(hào)，Royer，“用聚乙二醇修飾酶及其產(chǎn)品”，1977年1月11日公布。綜述見(jiàn)Abuchowski等，作為藥物的酶，(Holcerberg和Roberts編，367-383頁(yè)(1981))?？捎迷S多方法將聚乙二醇分子連接蛋白。一般聚乙二醇分子通過(guò)蛋白上的反應(yīng)性基團(tuán)連接蛋白。如賴氨酸殘基或N末端的氨基可方便地用于連接。例如Royer(美國(guó)專(zhuān)利4,002,531，見(jiàn)上)宣稱(chēng)用還原性烷基化將聚乙二醇分子連到酶上。EP 0,539,167，1993年4月28日出版，Wright“Peg亞氨酸酯及其蛋白衍生物”宣稱(chēng)用PEG的亞氨酸衍生物或相關(guān)的水溶性有機(jī)多聚體修飾肽和具有游離氨基的有機(jī)化合物。美國(guó)專(zhuān)利4,904,584，Shaw，1990年2月27日發(fā)布，涉及修飾蛋白上許多賴氨酸殘基以通過(guò)活性氨基聯(lián)上聚乙二醇分子。
在另一實(shí)施方案中本發(fā)明涉及一種可安全地腸胃外給藥或口服來(lái)治療溫血?jiǎng)游?如人)的疾病的藥物制劑的單劑量給藥單位。這種制劑可以是冰凍干燥或其它方式脫水的醫(yī)療品或診斷用品形式，加入生理可接受溶劑后恢復(fù)原狀。溶劑可以是任何能溶解干燥的組合物，與選定給藥途徑相容并且不會(huì)干擾所用的主要活性成分或重建穩(wěn)定劑的任何介質(zhì)，如無(wú)菌水、生理鹽水、葡萄糖溶液或其它糖的水溶液(例如多醇如甘露醇，木糖醇或甘油)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)單劑量給藥單位的試劑盒。該試劑盒含有容納干蛋白的一個(gè)容器和含有重建穩(wěn)定劑的水相制劑的另一容器。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員均明了溶液中蛋白濃度，每個(gè)容器中溶液體積及容器容量(可適當(dāng)修飾的相關(guān)參數(shù)，依賴于最終劑量單位中主要活性成分的所需濃度)，可以在很大范圍內(nèi)變化。
本發(fā)明的KGF類(lèi)似物可用作治療和診斷藥劑以及研究試劑。因而KGF類(lèi)似物可用于體外和/或體內(nèi)診斷試驗(yàn)，對(duì)組織或器官樣品的KGF定量或確定和/或分離表達(dá)KGFR的細(xì)胞(Bottano等，(1990)生物化學(xué)雜志，26512767-12770；Ron等(1993)，生物化學(xué)雜志，2682984-2988)。在組織或器官試驗(yàn)中，由于未標(biāo)記的天然KGF結(jié)合KGFR，與125I-KGF類(lèi)似物標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線相比，結(jié)合KGFR的125I-KGF的放射性要小。相似地，125I-KGF類(lèi)似物可用于檢測(cè)不同細(xì)胞類(lèi)型中KGFR的存在。
本發(fā)明還考慮用KGF類(lèi)似物生成抗肽的抗體，該抗體也結(jié)合天然KGF。本實(shí)施方案中抗體來(lái)源于為單克隆或多克隆，是用KGF生成的。得到的抗體優(yōu)選地結(jié)合天然KGF，優(yōu)選地該蛋白為天然(有生物活性)構(gòu)型。這些抗體可用于檢測(cè)或純化天然KGF。
而且本發(fā)明考慮用KGF類(lèi)似物來(lái)發(fā)現(xiàn)有醫(yī)療用途的高親和性或低親和性KGF結(jié)合分子，其應(yīng)用如作為有效的KGF傳輸途徑或作為KGF活性的抑制物。KGF類(lèi)似物的熱穩(wěn)定性對(duì)于在生理?xiàng)l件下(即37℃)鑒定這種結(jié)合分子十分重要，因?yàn)槠銴GF親和性可能導(dǎo)致強(qiáng)的溫度依賴性，不能從在4℃觀察到的親和性預(yù)測(cè)出來(lái)。
KGF類(lèi)似物可與添加劑配制用于體內(nèi)。添加劑包括緩沖液、載體、穩(wěn)定劑、賦形劑、防腐劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等(例如粘性調(diào)節(jié)劑或伸展劑(extender))。選擇某種添加劑要依賴KGF類(lèi)似物的貯存形式(即液體或冰凍干燥的)及給藥方式。本領(lǐng)域已知的合適配制法可見(jiàn)《雷氏醫(yī)藥科學(xué)》(最新版)，Mack出版公司，Easton，賓州。
KGF類(lèi)似物可以以治療有效量施給有損傷或臨床非成纖維上皮細(xì)胞不足的組織。KGF類(lèi)似物可以成功給藥的范圍包括但不限于燒傷或其它部分或全厚度損傷患者的附屬結(jié)構(gòu)如毛囊，汗腺和脂腺的激發(fā)，增殖與分化；大皰性表皮松解造成的損傷的快速再上皮化，該病是上皮與下面真皮粘附的疾病，導(dǎo)致頻繁的裂口，可能導(dǎo)致嚴(yán)重病患；預(yù)防化療引起的脫發(fā)和治療男性的禿頂，或男性和女性的進(jìn)行性脫發(fā)；治療胃和十二指腸潰瘍；治療發(fā)炎性腸道疾病，如Crohn氏癥(主要影響小腸)和潰瘍性大腸炎(主要影響大腸)；防止或減少放射和化療過(guò)程中消化道毒性(例如治療前和/或治療后)以誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)或再生或同時(shí)誘導(dǎo)二者；激發(fā)整個(gè)胃腸道的粘液產(chǎn)生；誘導(dǎo)II型肺細(xì)胞的增殖與分化，幫助治療或預(yù)防早產(chǎn)兒的疾病如玻璃膜癥(即嬰兒呼吸緊迫綜合癥和肺氣管發(fā)育異常)；對(duì)于由呼吸損傷(包括高氧水平)、肺氣腫、施用損傷肺的化療藥品、呼吸器官外傷及其它肺損傷條件造成的肺損傷或功能不全、刺激支氣管和/或肺泡上皮的增殖和分化；增強(qiáng)肝功能以治療肝硬化，急性肝衰竭，急性病毒性肝炎導(dǎo)致的損傷和/或肝中毒；誘導(dǎo)角膜細(xì)胞再生，例如治療角膜擦傷；誘導(dǎo)上皮細(xì)胞再生以治療進(jìn)行性牙齦病；誘導(dǎo)鼓膜上皮細(xì)胞再生以治療鼓膜損傷以及治療或預(yù)防糖尿病發(fā)作或作為胰島細(xì)胞移植定位的輔助物。
用有效量的KGF類(lèi)似物對(duì)需要非成纖維上皮細(xì)胞增殖的患者給藥?！坝行Я俊敝改茉谑苤委熁颊咧幸l(fā)所需反應(yīng)的KGF類(lèi)似物的量，通常由醫(yī)師決定。影響KGF類(lèi)似物給藥量的因素包括患者年齡和一般狀況，受治療的病癥等。典型的劑量范圍為0.001-500mg/kg體重。
KGF類(lèi)似物可以對(duì)溫血?jiǎng)游?如人)安全地腸道外給藥(例如通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)途徑)，口服或局部給藥。KGF類(lèi)似物可用一次或重復(fù)施用，依疾病和患者情況而定。某些情況下，KGF類(lèi)似物可作為其它療法的輔助物與其它藥物制劑一起給藥。
下列實(shí)施例用來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解在不偏離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)的條件下，可以對(duì)給出的方法進(jìn)行修改。
實(shí)施例
下列實(shí)施例描述的許多操作規(guī)程的標(biāo)準(zhǔn)方法或合適的可選操作規(guī)程，由常見(jiàn)的分子生物學(xué)手冊(cè)提供，如《分子克隆》第二版，Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1987)和《分子生物學(xué)當(dāng)代操作方法》Ausabel等，Green出版附屬機(jī)構(gòu)/Wiley交叉科學(xué)，紐約(1990)。實(shí)施例1制備編碼KGF和KGF類(lèi)似物的DNA
通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞RNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和化學(xué)合成的(大腸桿菌最優(yōu)化密碼子)寡聚核苷酸(“OLIGO”)的PCR克隆全長(zhǎng)人類(lèi)KGF基因(編碼具有天然KGF序列的多肽)。兩種方法的描述如下
用從已知生產(chǎn)該多肽的細(xì)胞中分離的RNA作PCR擴(kuò)增。首先用硫氰胍破碎人類(lèi)成纖維細(xì)胞系A(chǔ)G1523A(得自醫(yī)學(xué)研究用人類(lèi)遺傳變異細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，Camden，新澤西)細(xì)胞，然后提取(根據(jù)Chomyzinski等(1987)，生化年刊，172156的方法)。用總RNA的標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄酶操作方法生成KGF cDNA。用KGF cDNA作模板，引物OLIGO#1和OLIGO#2編碼KGF基因5′和3′的DNA序列，進(jìn)行KGF基因的PCR(PCR#1)擴(kuò)增(9600型熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，康涅迪格)；28個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)為94℃變性1分鐘，60℃退火2分鐘，72℃延長(zhǎng)3分鐘)。PCR#1產(chǎn)物的等分試樣用作第二輪KGF PCR(PCR#2)擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增條件同上，僅是退火溫度為50℃。對(duì)KGF基因的表達(dá)克隆用嵌套PCR引物制造KGF基因兩端的方便的限制位點(diǎn)。用OLIGO#3和OLIGO#4修飾PCR#2的DNA產(chǎn)物，在基因的5′和3′端分別引入MluI和Bam HI限制位點(diǎn)(PCR#3，30個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)包括94℃變性1分鐘，60℃退火2分鐘，72℃延長(zhǎng)3分鐘)。然后將DNA用Mlu I和Bam HI切割，酚抽提，乙醇沉淀。再重懸并(用T4連接酶)連接到含“RSH”信號(hào)序列的序列的pCFM1156質(zhì)粒中(圖2A)得到RSH-KGF構(gòu)建體(圖3)。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(根據(jù)Hanahan(1983)，分子生物學(xué)雜志，166557的方法)大腸桿菌FM5菌株(ATCC53911)，在LB+卡那霉素上28℃鋪平板。選幾個(gè)轉(zhuǎn)化體，在含20μg/ml卡那霉素的小量液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。從每種培養(yǎng)物的細(xì)胞中分離RSH-KGF質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測(cè)序。由于KGF基因內(nèi)在的Nde I位點(diǎn)不可能將天然基因序列直接克隆到含有括號(hào)內(nèi)的NdelI和Bam HI限制位點(diǎn)的所需表達(dá)載體中。用三步(three-way)連接可以做到。在專(zhuān)一的BsmI和SstI限制位點(diǎn)切割RSH-KGF質(zhì)粒，用1％瓊脂糖凝膠電泳后分離到～3kbp的DNA片段(含有KGF基因的3′端)。進(jìn)行PCR(PCR#4)，如進(jìn)行PCR#3時(shí)所述但將OLIGO#3換成OLIGO#5。然后用NdeI和BsmI切割PCR DNA產(chǎn)物，4％瓊脂糖凝膠電泳后分離到311bp的DNA片段。連接用的第三段是pCFM1156用NdeI和SstI切割后1％瓊脂糖凝膠電泳分離的1.8kbpDNA片段。如上述連接(T4連接酶)、轉(zhuǎn)化、卡那霉素篩選和DNA測(cè)序，挑選含有圖4的構(gòu)建體和名為KGF的質(zhì)粒的克隆。由于有產(chǎn)生截短產(chǎn)物的內(nèi)在核糖體結(jié)合位點(diǎn)，用化學(xué)合成的OLIGO(OLIGO#6至OLIGO#11)取代專(zhuān)一性KpnI和EcoRI位點(diǎn)間的KGF DNA序列以最少使用內(nèi)在起始位點(diǎn)(圖5)。
OLIGO#1(SEQ ID NO7)5′-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3′
OLIGO#2(SEQ ID NO8)5′-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3′
OLIGO#3(SEQ ID NO9)5′-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3′
OLIGO#4(SEQ ID NO10)
5′-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3′
OLIGO#5(SEQ ID NO11)
5′-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3′
OLIGO#6(SEQ ID NO12)
5′-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3′
OLIGO#7(SEQ ID NO13)
5′-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3′
OLIGO#8(SEQ ID NO14)
5′-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3′
OLIGO#9 (SEQ ID NO15)
5′-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3′
OLIGO#10(SEQ ID NO16)
5′-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3′
OLIGO#11(SEQ ID NO17)
5′-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3′
OLIGO用T4多聚核苷酸激酶磷酸化，再熱變性。溫度緩慢降至室溫使單鏈(ss)OLIGO形成雙鏈DNA片段。用T4連接酶將內(nèi)在OLIGO粘末端和整個(gè)雙鏈OLIGO片段共價(jià)連接到KpnI和EcoRI切割的KGF質(zhì)粒上。將新質(zhì)粒命名為KGF(dsd)。
用PCR擴(kuò)增化學(xué)合成的OLIGO#12至24，構(gòu)建完整的大腸桿菌密碼子最優(yōu)化的KGF基因。
OLIGO#12(SEQ ID NO18)5′-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3′
OLIGO#13(SEQ ID NO19)5′-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3′
OLIGO#14(SEQ ID NO20)
5′-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATG-
ACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3′
OLIGO#15(SEQ ID NO21)
5′-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGT-
GTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3′
OLIGO#16(SEQ ID NO22)
5′-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATC-
ATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3′
OLIGO#17(SEQ ID NO23)
5′-GGTGTTGAAT TGAATTCTACCTGGCATGAACAAAGAAGGTAAACT-
GTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3′
OLIGO#18(SEQ ID NO24)
5′-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGAC-
CCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3′
OLIGO#19(SEQ ID NO25)
5′-ATCCCGGTTCGTGGT-CCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTC-
ACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3′
OLIGO#20(SEQ ID NO26)5′-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3′
OLIGO#21(SEQ ID NO27)5′-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3′
OLIGO#22(SEQ ID NO28)5′-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3′
OLIGO#23(SEQ ID NO29)5′-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3′
OLIGO#24(SEQ ID NO30)5′-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3′
OLIGO#12至24被設(shè)計(jì)成無(wú)論是“Watson”還是“Crick”鏈編碼天然KGF的整個(gè)DNA序列均由OLIGO表示，經(jīng)PCR擴(kuò)增能生產(chǎn)出需要的雙鏈DNA序列(圖6)(PCR#5，9600型熱循環(huán)儀，Perkin-ElmerCetus；21個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)包括94℃變性31秒，50℃退火31秒，73℃延伸31秒；21個(gè)循環(huán)完成后最后延伸7分鐘終止PCR)。PCR擴(kuò)增后用Xba I和Bam HI切割DNA片段，將521bp片段連接到用相同酶切割的表達(dá)質(zhì)粒pCFM1156中。PCR#5用外在引物(100pmol/100μlrxn)OLIGO#12和OLIGO#13，1μl/100μl rxn的由連接(T4連接酶)OLIGO#14至OLIGO#19(OLIGO#15至OLIGO#18用T4多聚核苷酸激酶磷酸化)并且OLIGO#20至OLIGO#24作連接的band-aid寡聚核苷酸(Jayaraman等(1992)，生物技術(shù)12392)得到的KGF模板。最終的構(gòu)建體稱(chēng)為KGF(密碼子最優(yōu)化)。
所有本文描述的KGF類(lèi)似物部分地由見(jiàn)于KGF(dsd)或KGF(密碼子最優(yōu)化)或二者組合的DNA序列組成。在編碼用一種或多種上述DNA片段合成技術(shù)制得的特定KGF氨基酸的DNA序列中方便的限制位點(diǎn)插入序列以進(jìn)一步修飾這些序列。用上述技術(shù)可合成任一全部上述類(lèi)似物。不過(guò)，作為一般OLIGO設(shè)計(jì)的一部分，適當(dāng)時(shí)用最優(yōu)化的大腸桿菌密碼子，盡管在受檢查的任一基因中部分或全部為大腸桿菌優(yōu)化密碼子并不會(huì)顯著增大從培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中得到的蛋白的產(chǎn)率。圖7到24和37到50用合適的例子給出特定KGF類(lèi)似物的核苷酸和氨基酸序列構(gòu)建體C(1，15)S(圖7)；ΔN3/C(15)S(圖8)；ΔN3/C(15)-(圖9)；ΔN8/C(15)S(圖10)；ΔN8/C(15)-(圖11)；ΔN15(圖12)；ΔN16(圖13)；ΔN17(圖14)；ΔN18(圖15)；ΔN19(圖16)；ΔN20(圖17)；ΔN21(圖18)；ΔN22(圖19)；ΔN23(圖20)；ΔN24(圖21)；C(1，15)S/R(144)E(圖22)；C(1，15)S/R(144)Q(圖23)；ΔN23/R(144)Q(圖24)；C(1，15，40)S(圖37)；C(1，15，102)S(圖38)；C(1，15，102，106)S(圖39)；ΔN23/N(137)E(圖40)；ΔN23/K(139)E(圖41)；ΔN23/K(139)Q(圖42)；ΔN23/R(144)A(圖43)；ΔN23/R(144)E(圖44)；ΔN23/R(144)L(圖45)；ΔN23/K(147)E(圖46)；ΔN23/K(147)Q(圖47)；ΔN23/K(153)E(圖48)；ΔN23/K(153)Q 圖49)和ΔN23/Q(152)E/K(153)E(圖50)。本文描述的所有KGF類(lèi)似物構(gòu)建體均由DNA序列證實(shí)。實(shí)施例2在大腸桿菌中生產(chǎn)
用三種不同的表達(dá)質(zhì)粒克隆KGF類(lèi)似物基因，即pCFM1156(ATCC#69702)，pCFM1656(ATCC#69576)和pCFM3102(分別為圖2A，2B和2C)。通過(guò)用PCR重疊寡聚物誘變作一系列定點(diǎn)堿基變化可從pCFM1156質(zhì)粒得到p3102質(zhì)粒。從質(zhì)粒復(fù)制啟動(dòng)子PcopB緊鄰5′的BglIII位點(diǎn)(pCFM1656質(zhì)粒bp#180)開(kāi)始前進(jìn)至質(zhì)粒復(fù)制基因，堿基對(duì)變化如下pCFM1656bp# pCFM1656中的堿基對(duì)在pCFM3102中堿基對(duì)變成
#204 T/AC/G
#428 A/TG/C
#509 G/CA/T
#617-- 插入2個(gè)G/C堿基對(duì)
#677 G/CT/A
#978 T/AC/G
#992 G/CA/T
#1002 A/TC/G
#1005 C/GT/A
#1026 A/TT/A
#1045 C/GT/A
#1176 G/CT/A
#1464 G/CT/A
#2026 G/C堿基對(duì)缺失
#2186C/G T/A
#2479A/T T/A
#2498-2501 AGTG GTCA
TCAC CAGT
#2641-2647 TCCGAGC堿基對(duì)缺失
AGGCTCG
#3441G/C A/T
#3452G/C A/T
#3649A/T T/A
#4556-- 插入的堿基對(duì)
(SEQ ID NO67)5′-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3′
(SEQ ID NO68)3′-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5′
從上可見(jiàn)pCFM1156，pCFM1656和pCFM3 102十分相似且含有許多相同的限制位點(diǎn)。為方便起見(jiàn)選取了這些質(zhì)粒，以便新構(gòu)建體可簡(jiǎn)單地交換載體DNA組分。所有克隆操作均用宿主大腸桿菌菌株FM5(ATCC53911)，用Gene PulserTM轉(zhuǎn)染儀(BioRad Labor atories INC.Hercules加州)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明用電洗脫或根據(jù)Hanahan(1983，引文見(jiàn)上)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
首先，將0.1ml適當(dāng)菌株的冷凍甘油貯存物轉(zhuǎn)移到含500ml Luria肉湯的2L燒瓶中，得到在3個(gè)pCFM載體之一含有所需構(gòu)建體的所需重組大腸桿菌克隆的小量新鮮培養(yǎng)接種物。30℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含8L無(wú)菌分批培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中(Tsai等(1987)，工業(yè)微生物學(xué)雜志2181-187)。
從用投料#1培養(yǎng)基送料開(kāi)始批量送料發(fā)酵(Tsai等(1987)，引文見(jiàn)上)。OD600達(dá)到35時(shí)，迅速將培養(yǎng)物溫度升至37℃誘導(dǎo)所需KGF類(lèi)似物表達(dá)2小時(shí)，然后升溫至42℃將CI阻遏物變性。停加投料1，改加投料2，開(kāi)始送料的速率為300ml/小時(shí)。投料2含有175g/L胰蛋白胨，87.5g/L酵母提取物，260g/L葡萄糖。42℃1小時(shí)后，將培養(yǎng)物溫度降至36℃，保溫6小時(shí)。
然后終止發(fā)酵，通過(guò)離心至1L離心管中的塑料袋里收集細(xì)胞。400rpm離心60分鐘得細(xì)胞沉淀，除去上清，-90℃冰凍細(xì)胞糊狀物。
各種KGF類(lèi)似物在大腸桿菌中表達(dá)后，用下述方法純化天然KGF、C(1，15)S、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q、ΔN15、ΔN23和ΔN23/R(144)Q。高細(xì)胞密度發(fā)酵得到的細(xì)胞糊懸浮于4℃0.2M NaCl，20mM NaPO4、pH7.5中得10-20％溶液(重量/體積)，用合適的高剪切混合器完成。然后將溶液通過(guò)勻漿器(APV Gaulin，Inc.Everett，麻省)三次裂解懸浮細(xì)胞。用合適的熱交換裝置將流出的勻漿冷卻至4-8℃。用J-6BTM離心機(jī)(Beckman儀器公司，Brea，加州)，JS4.2轉(zhuǎn)頭，4200rpm 4℃離心30-60分鐘除去裂解物中的殘片。然后將上清小心地脫水，上樣到預(yù)先制好的4℃0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡的450ml(5cm×23cm)S-瓊脂糖Fast FlowTM樹(shù)脂柱上(Pharmacia，Piscataway，新澤西)。接下來(lái)用5倍柱體積的0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH7.54℃洗柱。用5L 0.5M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗脫下所需蛋白。收集50mL級(jí)分，持續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫液的A280。A280鑒定的含有洗脫物質(zhì)的級(jí)分用14％凝膠作SDS-PAGE來(lái)驗(yàn)證所需多肽的存在。
然后收集含所需蛋白的級(jí)分，再加入等體積蒸餾水。將稀釋的樣品上樣到先前制好的用0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH6.84℃平衡的450ml(5cm×23cm)S-瓊脂糖Fast Flow柱。用2250mL 0.4M NaCl，20mMNaPO4，pH6.8洗柱，再用20柱體積的從0.4M NaCl，20mM NaPO4，pH6.8到0.6M NaCl，20mM NaPO4，pH6.8的線性梯度洗脫蛋白。再收集50mL級(jí)分，持續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫液的A280。收集含有蛋白的級(jí)分(用14％SDS-PAGE確定)，再通過(guò)一個(gè)350cc攪拌室(Amicon Inc.Mayberry，麻省)中的YM-10膜(10,000截?cái)喾肿恿?濃縮至30-40mL體積。
預(yù)先制好1,300mL(44cm×85cm)Superdex-75TM樹(shù)脂(Pharmacia)用含有1×PBS(Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水，“D-PBS”，無(wú)鈣無(wú)鎂)或0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0的柱緩沖液平衡，將濃縮物加樣。樣品進(jìn)入柱后，用柱緩沖液從凝膠過(guò)濾基質(zhì)中洗脫蛋白。此后回收10mL級(jí)分，匯集含類(lèi)似物(14％SDS-PAGE確定)的級(jí)分。典型的最終匯集物中蛋白濃度為約5-10mg/mL。除非另有說(shuō)明，上述操作均在4-8℃下進(jìn)行。
用可選的純化方法純化天然KGF、C(1，15)S和ΔN23。該方法包括下述步驟，除非特別說(shuō)明，所有方法、溶液和物質(zhì)均在23±5℃。
細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)階段完成后，將細(xì)胞培養(yǎng)物冷卻至4-8℃，離心或用相似方法收集細(xì)胞。根據(jù)每單位重量細(xì)胞糊中預(yù)計(jì)的蛋白產(chǎn)量和需要純化的蛋白量，將適當(dāng)重量的細(xì)胞糊懸浮于5倍細(xì)胞糊重量的20mMNaPO4，0.2M NaCl，pH7.5溫和緩沖液。用高剪切混合器將細(xì)胞分散成均質(zhì)溶液。勻漿過(guò)程中保持細(xì)胞糊分散液的溫度為4-8℃。
然后加壓裂解細(xì)胞，例如將細(xì)胞漿分散液通過(guò)適當(dāng)大小的細(xì)胞勻漿器兩次。將勻漿低溫保持于5±3℃。用預(yù)先制好的裝備了具有適當(dāng)量的濾器表面積的濾器，用適當(dāng)體積的0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡的深度濾器套(housing)(Cuno公司，Meriden，CT)使細(xì)胞裂解物澄清。平衡和澄清在5±3℃下進(jìn)行。澄清前用適當(dāng)量的合適的過(guò)濾助劑將濾器預(yù)包被并且與細(xì)胞裂解物徹底混合，之后將溶液通過(guò)濾器以澄清裂解物。用0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗濾器。將濾過(guò)液和任何后續(xù)清洗液收集于適當(dāng)容積的冷凍容器中，所有操作均低于10℃。
澄清后的裂解物通過(guò)預(yù)先制好的SP-瓊脂糖Fast Flow柱，每2g細(xì)胞裂解物至少1mL樹(shù)脂。SP-瓊脂糖Fast Flow柱用冷的(5±3℃)0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5平衡。保持柱的溫度低于10℃。澄清后的裂解物(5±3℃)加樣到離子交換樹(shù)脂上，持續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫物的A280。樣品上樣后先用冷的0.2M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗柱再用23±5℃的0.3M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5洗柱。
用范圍為0.2-1M NaCl，20mM NaPO4，pH7.5的線性梯度洗脫所需蛋白。根據(jù)洗脫物的A280收集幾個(gè)級(jí)分的大量產(chǎn)品。洗脫后合并這些級(jí)分并記下體積。
進(jìn)行氧化步驟以氧化游離的巰基。對(duì)于與天然KGF相比半胱氨酸模式改變的蛋白，加氧化劑(例如，胱胺二鹽酸化物或其它合適的氧化劑如胱氨酸，氧化型谷胱甘肽或二價(jià)銅)至終濃度1-20mM，pH調(diào)至7-9.5，用胱胺二鹽酸化物時(shí)優(yōu)選pH9.0±0.3 10-30℃氧化適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。氧化天然KGF蛋白時(shí)加入適量的(NH4)2SO4，如1-2M(NH4)2SO4，調(diào)pH7.5±0.5，在一段時(shí)間內(nèi)保持溫度為23±5℃。
氧化后，將溶液pH調(diào)到6.5和9.5之間。必要的話在溶液中加入固體(NH4)2SO4，終濃度2M。將溶液通過(guò)適當(dāng)?shù)某吻鍨V器除去顆粒。
過(guò)濾的氧化產(chǎn)物作斥水作用層析(HIC)。HIC基質(zhì)是丁基-650MToyopearlTM樹(shù)脂(Tosohaas Inc.，Montgomeryville，賓州)。將含蛋白溶液上樣到預(yù)先用2M(NH4)2SO4，0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0平衡的柱上。上樣后用2M(NH4)2SO4，0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0洗柱。用0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0中遞降線性2-0M的(NH4)2SO4梯度洗脫所需蛋白。洗脫液A280增加顯示所需蛋白開(kāi)始洗脫，收集這些級(jí)分。每級(jí)分的等分試樣用SDS-PAGE分析。然后收集含所需蛋白的各級(jí)分，徹底混合，確定合并物體積及其中蛋白濃度。
合并的含蛋白HIC洗脫液被濃縮并更換洗脫緩沖液。典型地將蛋白濃縮至5.0-10.0mg/ml。用配備了PTGC PelliconTM盒式系統(tǒng)(Millipore公司，Bedford，麻省)和合適截止大小的膜的超濾系統(tǒng)作超濾。
濃縮后，將樣品對(duì)合適的緩沖液透濾。濃縮步驟的留存物對(duì)0.15MNaCl，20mM NaPO4，pH7.0透濾直到留存物的電導(dǎo)在0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0溶液的電導(dǎo)的5％以內(nèi)。
另外將濃縮透濾的含蛋白樣品通過(guò)0.1μm PosidyneTM濾膜(PallInc.，Cortland，NY)去除可能存在的沉淀物和細(xì)菌毒素。確定了溶液的蛋白濃度并根據(jù)最終大量產(chǎn)品所需濃度，用0.15M NaCl，20mM磷酸鈉，pH7.0將溶液稀釋至所需終濃度。然后用0.22μm濾膜作最后的無(wú)菌過(guò)濾，將最終的大量產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至不含致熱源的容器中貯存(約5℃)和進(jìn)一步配制。B.分析
用來(lái)自大腸桿菌的天然KGF；C(1，15)S；C(1，15)S/R(144)Q；ΔN15；ΔN23和ΔN23/R(144)Q進(jìn)行分析。
構(gòu)象穩(wěn)定性
比較多肽的貯存穩(wěn)定性，熱致去折疊溫度(Tm)，及廣泛范圍pH條件下的穩(wěn)定性。
貯存穩(wěn)定性
天然KGF和C(1，15)S在37℃下溫育約24小時(shí)，確定余下的可溶蛋白。結(jié)果由圖24到26總結(jié)。
圖25比較了貯存于20mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pH7.0，37℃27小時(shí)的天然KGF和C(1，15)S。C(1，15)S比天然KGF的可溶蛋白量明顯增多。
圖26比較了貯存于37℃0.15M NaCl，20mM NaPO4，pH7.0中天然KGF和C(1，15)S。這里，C(1，15)S又比天然KGF穩(wěn)定性高。
圖27比較了貯存于PBS和50mM NaPO4，0.15M NaCl，pH7.0，37℃18小時(shí)的天然KGF，ΔN15和C(1，15)S的穩(wěn)定性。在高磷酸鹽中回收到的可溶蛋白比在PBS中的要多得多(100比60％)。與天然KGF相比，ΔN15和C(1，15)S穩(wěn)定性顯著升高。在高磷酸鹽中ΔN15和C(1，15)S回收率約為100％，與從天然KGF結(jié)果作出的預(yù)計(jì)一致。
不過(guò)，在C(1，15，40)S和C(40)S(被SEQ ID NO1的殘基201到684編碼，但Ser40被AGA編碼)以及在C(1，15，102)和C(102)S(被SEQ ID NO1的殘基201到684編碼，但Ser102被AGA編碼)作了貯存穩(wěn)定性的單一初步比較。結(jié)果(未給出)表明穩(wěn)定性降低(即37℃貯存后可溶性蛋白較少)。但是從培養(yǎng)基中純化到的可溶的正確折疊的C(1，15，40)S蛋白量比C(40)S的量大，表明C(1，15，40)S實(shí)際上更穩(wěn)定并且實(shí)施例的比較結(jié)果不是決定性的。本發(fā)明優(yōu)選地包括在Cys40、Cys102、Cys106之外存在替換的KGF類(lèi)似物，更優(yōu)選地不包括C(1，15，40)S，C(1，15，102)S和C(1，15，40，102，106)。
也檢查了C(1，15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q防止高溫聚集的能力。制備D-PBS中含0.5mg/mL蛋白的樣品。每種樣品的0.5mL分成等分試樣裝入3cc I型玻璃小管中。小管用橡膠瓶塞封口并卷上13mm的flip-off鋁封。然后將小管放入37℃溫育箱中。在預(yù)定的時(shí)間間隔取出小管分析可溶蛋白的損失。將250μl每種樣品通過(guò)0.22μm Spin-XTM濾器單元(Costar，Cambridge，麻省)離心去除可見(jiàn)沉淀。濾過(guò)溶液的可溶蛋白再用排阻HPLC分析。將HPLC峰面積積分確定可溶蛋白量并將結(jié)果作為37℃溫育時(shí)間的函數(shù)。結(jié)果由圖27給出。
可溶單體蛋白損失的半衰期從這些動(dòng)力學(xué)曲線上估計(jì)。表1給出這些蛋白在37℃下貯存的剩余可溶KGF的半衰期。
表1
可溶單體蛋白損失的半衰期
從上面表1和圖28可以看出天然KGF很快聚集溶解度半衰期為0.6天。C(1，15)S/R(144)Q，ΔN23/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E溶解度半衰期有顯著增長(zhǎng)，分別為13.3，22.3和38天。
熱致去折疊
用裝備了PTC343 Peltier型溫控系統(tǒng)的J-720TM偏振光度計(jì)(Jasco公司Easton，馬里蘭州)在230nm用圓二色(CD)監(jiān)測(cè)熱致去折疊。在D-PBS(Life Technologies Inc.Grand Island，紐約州)制備圓二色分析用的含0.1mg/mL多肽的各獨(dú)立樣品。將約2.5mL每個(gè)樣品加樣到10mm光徑的長(zhǎng)矩形SuprasilTM石英(Heraeus Quarzschmelze，GmbH，Hanau，德國(guó))熒光池(Hellma Cells公司，Jamaica，紐約州)中。將池放入偏振光度計(jì)的Peltier型溫控系統(tǒng)中。熱致去折疊速率為50℃/hr。監(jiān)測(cè)230nm橢圓率變化以指示去折疊過(guò)程。鑒定溶液中50％蛋白分子去折疊的溫度來(lái)估計(jì)每個(gè)樣品的Tm(生物物理化學(xué)，Cantor和Schimmel編，W.H.Freeman公司，舊金山(1980))。三種蛋白各自的估計(jì)Tm值列于表2。
表2
估計(jì)的熔解溫度
結(jié)果顯示C(1，15)S和ΔN15比天然KGFTm增加1℃。ΔN23Tm還高一度。但C(1，15)S/R(144)Q或ΔN23的R144Q替換比天然KGFTm增加大于6℃和7℃。而且C(1，15)S/R(144)E比天然KGF穩(wěn)定9℃多。
pH
加入高濃度HCl或NaOH調(diào)D-PBS至不同pH值以比較C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E相對(duì)天然KGF的酸穩(wěn)定性。在石英杯中將約2.35mL不同pH值的D-PBS與100μL的2.45mg/mL KGF蛋白混合。這些樣品熱致去折疊，速率為50℃/hr，230nm CD監(jiān)測(cè)。圖29給出天然KGF，C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E的Tm作為pH的函數(shù)。在檢測(cè)的pH范圍內(nèi)C(1，15)S/R(144)Q和C(1.15)S/R(144)E的Tm總比天然KGF的高。
體外生物活性
通過(guò)測(cè)量Balb/MK細(xì)胞[3H]-胸苷攝入也可將C(1，15)S、ΔN15、ΔN23、ΔN23/R(144)Q、C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E的體外促細(xì)胞分裂活性確定為蛋白濃度和半最大濃度的函數(shù)(根據(jù)Rubin等(1989)的方法，引文見(jiàn)上)。通常用體外生物活性試驗(yàn)確定每種KGF類(lèi)似物相對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)天然KGF的濃度。然后稀釋每種KGF類(lèi)似物并用Balb/MK促細(xì)胞分裂劑試驗(yàn)檢驗(yàn)其生物活性。首先將樣品稀釋到含50％定制Eagle氏MEM50％定制F12，5μ/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ng/ml硒酸鈉，0.0005％HSA和0.005％Tween 20的生物試驗(yàn)培養(yǎng)基。KGF樣品加入接種了Balb/MK細(xì)胞的Falcon primeria 96孔板。測(cè)量DNA合成時(shí)[3H]胸苷的摻入并通過(guò)與天然KGF標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，轉(zhuǎn)換成輸入的天然KGF濃度。結(jié)果由圖30至35給出。從圖中可見(jiàn)，圖29至34描述的已檢測(cè)KGF類(lèi)似物與天然KGF活性相似。實(shí)施例3在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)
本實(shí)施例描述在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的兩種生物活性重組KGF(rKGF)形式的表達(dá)，分離和表征。
用PCR擴(kuò)增得自正常人類(lèi)真皮成纖維細(xì)胞(Clonetec公司，圣迭戈，加州)的cDNA，分離到人類(lèi)KGF基因。用逆轉(zhuǎn)錄酶制得cDNA后用PCR擴(kuò)增KGF基因。用OLIGO#25和OLIGO#26從cDNA中擴(kuò)增出基因，第二次PCR擴(kuò)增后用OLIGO#27和OLIGO#28在片段末端加上Hind III和BglII限制位點(diǎn)，如圖1所述。
OLIGO#25(SEQ ID NO69) 5′-CAATCTACAATTCACAGA-3′
OLIGO#26(SEQ ID NO70) 5′-TTAAGTTATTGCCATAGG-3′
OLIGO#27(SEQ ID NO71) 5′-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3′
OLIGO#28(SEQ ID NO72) 5′-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3′
克隆和確證DNA序列后使用KGF基因DNA。用OLIGO#29和OLIGO#30進(jìn)行擴(kuò)增。
OLIGO#29(SEQ ID NO73)
5′-CGGTCTAGACCACCATGCAAATGGATACTGACATGG-3′
OLIGO#30(SEQ ID NO74)
5′-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3′
有義引物OLIGO#29在起始密碼子ATG上游有XbaI位點(diǎn)和一致Kozak翻譯序列(5′-CCACC-3′)。反義引物OLIGO#30含有SalI克隆位點(diǎn)和另一個(gè)終止密碼子。PCR擴(kuò)增(94℃變性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒)18個(gè)循環(huán)后，用Xba I和SalI消化產(chǎn)物并與類(lèi)似消化的pDSRα2的DNA連接(根據(jù)Bourdrel等(1993)，蛋白實(shí)驗(yàn)與純化，4130-140和Lu等(1992)，Arch.Biochem.Biophys.，298150-158的方法)。這樣得到KGF/pDSRα2質(zhì)粒，其中人類(lèi)KGF基因在SV40早期啟動(dòng)子和α-FSH多聚腺苷化序列之間。選出兩個(gè)克隆，DNA序列分析證實(shí)構(gòu)建到所需載體。
用PvuI線性化2微克KGF/pDSRα2DNA。然后用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣沉淀法(Bourdrel等，引文見(jiàn)上)用處理過(guò)的DNA轉(zhuǎn)染前一天接種到0.8×106細(xì)胞/60mm的培養(yǎng)血中的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞里。兩周后選出單個(gè)的克隆轉(zhuǎn)移到24孔板上。細(xì)胞匯合后條件培養(yǎng)基被認(rèn)為不含血清，用抗大腸桿菌表達(dá)的人類(lèi)KGF的多克隆兔抗血清Western印跡法分析其等分試樣。
Western印跡樣品在12.5％(W/V)SDS聚丙烯酰胺上走膠，用半干轉(zhuǎn)移儀(Hoefer Scientific Instruments，舊金山，加州)400mA1小時(shí)電印跡到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移緩沖液是20mM Tris，150mM甘氨酸，25％甲醇。用PBS中10％正常山羊血清溫育，封閉硝酸纖維素膜。用抗大腸桿菌來(lái)源的KGF的兔抗血清作一抗。使用時(shí)用PBS中1％正常山羊血清稀釋10,000倍，與封閉的硝酸纖維素膜室溫溫育12小時(shí)，然后用PBS洗3次，每次30分鐘，除去多余的抗體。硝酸纖維素膜在100ml含VectastainTM生物素化山羊抗兔IgG (二抗，Vector Labs，Burlingame，加州)的PBS中1％正常山羊血清里室溫溫育30分鐘。用PBS洗3次，每次10分鐘。之后在100ml依制造商說(shuō)明(Vector Labs)制備的含鏈親合素(streptavidin)和生物素化過(guò)氧化物酶的1％正常山羊血清溶液中室溫溫育30分鐘。用PBS洗3次后用100ml PBS中的60μL30％(W/V)H2O2和20mL甲醇中的50mg 4-氯萘酚混合物溫育，將KGF交叉反應(yīng)物質(zhì)顯色。10分鐘后水洗終止反應(yīng)。
分析印跡顯示KGF特異性抗體與三個(gè)不同蛋白帶相聯(lián)系，其中兩個(gè)緊密相關(guān)，分子量為約25-29KDa，另一個(gè)估計(jì)分子量為約17KDa，而163個(gè)氨基酸的成熟蛋白的估計(jì)分子量約為18.8KDa。另外，用Western分析確定分泌量大于2.0mg rKGF每升的幾個(gè)高度表達(dá)克隆被選出并被移入搖瓶(根據(jù)Lu等人的方法，引文見(jiàn)上)以得到大體積的無(wú)血清的條件化培養(yǎng)基，用于陽(yáng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾純化KGF，如下述。
純化3升無(wú)血的條件化培養(yǎng)基中的KGF。將填充了450ml磺乙基陽(yáng)離子交換柱，一種用20mM磷酸鈉pH7.5預(yù)平衡過(guò)的S瓊脂糖Fast Flow(Pharmacia)柱用培養(yǎng)基直接上柱。用5倍柱體積的20mM磷酸鈉，0.2M NaCl pH7.5洗柱。然后用20倍柱體積的20mM磷酸鈉，pH7.5中0.2至1.0M NaCl線性梯度洗脫rKGF。收集50mL級(jí)分并持續(xù)A280監(jiān)測(cè)。用SDS-PAGE分析每一級(jí)分的等分試樣以檢測(cè)KGF蛋白。用預(yù)制的14％Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠(根據(jù)Laemmli(1970)自然，227680-685的方法)在電泳系統(tǒng)(Novex，圣迭戈，加州)上作SDS-PAGE。上樣前將樣品與非還原性SDS樣品緩沖液混合，不需加熱。用考馬斯藍(lán)或銀染檢測(cè)蛋白。看到兩個(gè)晚期洗脫峰含有蛋白帶，對(duì)應(yīng)Western印跡檢測(cè)到的25-29KDa和17KDa帶。含有這些峰的級(jí)分分別濃縮到小于1.0mL的體積中作凝膠過(guò)濾。
凝膠過(guò)濾用的Superdex-75TM樹(shù)脂柱(HR10/30，Pharmacia)用PBS，pH7.2預(yù)平衡，用下述分子量標(biāo)準(zhǔn)(BioRad，舊金山，加州)甲狀腺球蛋白(670KDa)，g球蛋白(158KDa)，卵清蛋白(44KDa)，肌球蛋白(17KDa)和維生素B-12(1.4KDa)標(biāo)定。經(jīng)過(guò)這些純化步驟得到的rKGF約被純化2000倍，特別包括由銀染確定的17KDa和30KDa的物質(zhì)。
由于是較高分子量的物質(zhì)，rKGF被作為主要對(duì)稱(chēng)峰(用A280檢測(cè))洗出，該峰被稱(chēng)作KGF-a。用SDS-PAGE分析少量該物質(zhì)(3μg/泳道對(duì)6μg/泳道)分辨出有1-2KDa分子量差異的兩條帶。將低分子量物質(zhì)KGF-b凝膠過(guò)濾得到具有預(yù)計(jì)移動(dòng)率的蛋白制備物。KGF-a和KGF-b的純化后總回收率均為約30-40％。
還分析了KGF-a和KGF-b的氨基酸序列。儀器是自動(dòng)測(cè)序儀(477A或470A型，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster城，加州)，裝備有120A型在線PTH氨基酸分析儀和900A型數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)(用Lu等(1991)，生物化學(xué)雜志，2668102-8107的方法)。KGF-a的Edman序列分析顯示主要N末端序列為X1-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X3-S-[SEQID NO75]。從N末端第三個(gè)氨基酸天冬氨酸起始的次級(jí)序列占整個(gè)可測(cè)序蛋白的1.6％。由于序列分析時(shí)沒(méi)有苯基乙內(nèi)酰硫脲基(phenylthiohydantoinyl)(PHT)氨基酸信號(hào)，因此不能確定X1，X2和X3。由cDNA預(yù)測(cè)的KGF的N末端氨基酸序列顯示X1和X3是Cys殘基，X2是天冬酰胺。X1和X3不存在顯示這些半胱氨酸可能形成二硫橋。根據(jù)一致N連糖基化序列Asn-X-Ser，對(duì)應(yīng)于X2的預(yù)測(cè)的Asn殘基不存在顯示這是潛在的N連糖基化位點(diǎn)。
有趣的是，KGF-b N末端序列分析顯示N末端氨基酸序列為S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V-(SEQ DNO76)表明它是KGF的N末端截短形式，在Arg23-Ser24肽鍵處被蛋白水解切割。
用已知方法(Sasaki等(1987)，生物化學(xué)雜志，26212059-12076；Takeuchi等(1988)，生物化學(xué)雜志，2633657-3663；Zsebo等(1990)，細(xì)胞，63195-201)用糖苷酶(唾液酸苷酶，O-聚糖酶和/或N-聚糖酶)處理蛋白來(lái)進(jìn)一步將純化的KGF-a和KGF-b定性。這些數(shù)據(jù)顯示KGF-a含N連和O連糖而低分子量形式的KGF-b可能只含N連糖。糖苷酶處理并不能使KGF-b分子量減少，表明該分子未被糖基化。
用上述內(nèi)蛋白酶Glu-C-產(chǎn)生的肽的質(zhì)譜進(jìn)一步確定KGF-a的糖基化模式。用質(zhì)譜分析逐步開(kāi)口(orifice)法闡明糖蛋白的糖結(jié)構(gòu)已被成功地用于其它蛋白(Huddleston等(1993)，化學(xué)年刊，65877-884；Carr等(1993)，蛋白科學(xué)，2183-196)。分離到非糖基化肽證實(shí)Thr22看來(lái)被部分糖基化。對(duì)Asn14作相似的質(zhì)譜分析表明糖基化有微異質(zhì)性，有二，三和四天線結(jié)構(gòu)及不同程度的唾液酸化。
表3A總結(jié)了以半最大速率激活角化細(xì)胞[3H]胸苷摻入的KGF濃度(根據(jù)Rubin等(1989)的方法，引文見(jiàn)上)。從制備自Balb/MK小鼠表皮角化細(xì)胞的分離KGF受體膜制備物檢查與KGF受體的相互作用(用Massague(19932)，生物化學(xué)雜志，25813614-13620描述的方法)。具體地說(shuō)，將各種形式的KGF用50mM Tirs-HCl，pH7.5含0.2％牛血清清蛋白稀釋至濃度在每50μl0.8ng至100ng范圍內(nèi)。它們單獨(dú)與膜制備物(75ng/mL)和125I標(biāo)記的大腸桿菌來(lái)源的KGF(1.5ng)溫育。在4℃下進(jìn)行受體結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)16小時(shí)，然后取樣品，離心，用上述稀釋緩沖液洗兩遍除去未結(jié)合和非特異性結(jié)合的帶標(biāo)記的KGF。然后對(duì)樣品的殘余放射性進(jìn)行計(jì)量。將非競(jìng)爭(zhēng)百分比對(duì)每個(gè)KGF樣品濃度作圖得到KGF樣品和標(biāo)記KGF的受體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)曲線。表3B歸納了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的大腸桿菌來(lái)源的KGF(ng/mL表示)的60％非競(jìng)爭(zhēng)所需的KGF濃度。
表3A
以半最大速率激活角化細(xì)胞的[3H]-胸苷
摻入的KGF濃度
表3B
以60％非競(jìng)爭(zhēng)速率與I125標(biāo)記的KGF競(jìng)爭(zhēng)
受體結(jié)合的KGF濃度
如表3A所示，KGF-a和KGF-b激活相似的[3H]胸苷摻入，兩種類(lèi)似物的激活半最大速率約為30ng/mL。因此截短并不減小分子的生物活性。但兩種類(lèi)似物比大腸桿菌來(lái)源的全長(zhǎng)KGF活性低約3倍。如表3B所示，放射性受體試驗(yàn)非競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示大腸桿菌來(lái)源的KGF，KGF-a，KGF-b有相似的受體結(jié)合活性。實(shí)施例4大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物
生產(chǎn)的KGF多肽的體內(nèi)生物試驗(yàn)
單個(gè)皮下KGF劑量顯示能使小鼠血清膽固醇在24小時(shí)內(nèi)以劑量依賴方式增大。對(duì)天然KGF、KGF-a、C(1，15)S、ΔN15和ΔN23也評(píng)價(jià)其以劑量依賴方式增大血清膽固醇水平的能力。
每個(gè)處理組包括5個(gè)從CRL得到的雌性Balb/c小鼠(18-20克)。蛋白用0.9％鹽水稀釋?zhuān)罱K注射體積為每只小鼠100μl。對(duì)每只小鼠以下列劑量單次皮下注射給藥
注射24小時(shí)處死小鼠并通過(guò)心臟穿刺取血。處理血液樣品以確定血清膽固醇。
如圖35所示，發(fā)現(xiàn)每種受試KGF類(lèi)似物均能以劑量依賴方式提高血清膽固醇。而且各受試KGF類(lèi)似物之間的生物活性無(wú)明顯差別。
糖尿病體內(nèi)模型
不同動(dòng)物中的化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病模型通常被用于研究該疾病及其治療方法。鏈脲佐菌素在小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、狗和猴中誘導(dǎo)糖尿病，但最常在大鼠和小鼠中做研究。Junod等，Proc.Soc.Exp.Pio.Med.126210-205(1967)；Rerup，醫(yī)藥學(xué)綜述，22485-518(1970)；Rossini等，P.N.A.S.，742485-2489(1977)；Ar’Rajab and Ahren，Pancreas，850-57(1993)。大鼠中鏈脲佐菌素單靜脈內(nèi)劑量45-70mg/kg誘導(dǎo)穩(wěn)定的疾病。45mg/kg劑量誘導(dǎo)暫時(shí)病癥狀態(tài)但該狀態(tài)是可逆的。鏈脲佐菌素注射一天之內(nèi)誘導(dǎo)高血糖狀態(tài)。與正常大鼠相比，血液胰島素水平基本保持不變；但胰內(nèi)胰島素和C肽總含量減少嚴(yán)重。大鼠表現(xiàn)人類(lèi)糖尿病的典型癥狀血糖水平升高(高血糖)、尿糖(糖尿)、口渴(煩渴)、尿頻(多尿)、食欲增大(嗜食)。
本發(fā)明公開(kāi)描述的研究用Sprague-Dawley大鼠中鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型進(jìn)行。用研究開(kāi)始時(shí)體重200-260g的大鼠。每千克體重50mg溶于檸檬酸鈉緩沖液的鏈脲佐菌素單次靜脈注射誘導(dǎo)糖尿病。用非糖尿病對(duì)照大鼠接受單次檸檬酸鈉緩沖液靜脈注射作為對(duì)照。KGF每日皮下注射給藥。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，KGF的劑量為3或5mg/kg/天。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，KGF療法在誘導(dǎo)出糖尿病前兩天開(kāi)始，并持續(xù)其8次注射。在第二個(gè)和第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)出糖尿病一天后開(kāi)始皮下給藥的KGF療法。在第四個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在鏈脲佐菌素處理后第7天開(kāi)始7天的KGF療程，跟蹤觀察動(dòng)物12周。所有實(shí)驗(yàn)，除第4個(gè)實(shí)驗(yàn)，用血糖水平、尿糖水平和尿量作分析用最終數(shù)值點(diǎn)。另外在一些實(shí)驗(yàn)中測(cè)量水的攝入量，尿C肽水平，或整個(gè)胰臟的胰島素和C肽含量。第4個(gè)實(shí)驗(yàn)中只檢測(cè)血糖作最終數(shù)據(jù)點(diǎn)。由于胰島素大部分被肝從循環(huán)中除去，測(cè)外周胰島素濃度反映肝代謝后事件而非胰臟的胰島素分泌。因此通常測(cè)量C肽并用作胰島素分泌的外周標(biāo)記物。C肽在前胰島素到胰島素的加工過(guò)程中產(chǎn)生。胰島素和C肽以等摩爾的量由β細(xì)胞分泌，僅有小部分C肽被肝提取(extract)。
本研究探討了Sprague-Dawley大鼠中rKGF對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病的作用。第0天各組大鼠接受45或50mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。在這些處理后每日監(jiān)測(cè)不節(jié)食時(shí)的血糖水平以評(píng)價(jià)胰島損傷的嚴(yán)重性。在第5天根據(jù)高血糖程度將STZ處理的動(dòng)物分到兩組中(每組20只)。分隔點(diǎn)定在血糖水平為300mg/dl。以一組未受STZ處理的動(dòng)物作對(duì)照。在第7天對(duì)每個(gè)高血糖組中的10只動(dòng)物通過(guò)皮下注射施用ΔN23(3mg/kg/天)或PBS，共7天。然后每天、每隔一天或每周監(jiān)測(cè)血糖水平，如圖51所示。注意到兩組的接受ΔN23的STZ處理的動(dòng)物在ΔN23給藥期間血糖水平明顯下降。重要的是，起始血糖＜300mg/dl的STZ處理的動(dòng)物的平均血糖下降穩(wěn)定在約150mg/dl，而起始血糖＞300mg/dl的組中血糖水平下降只是暫時(shí)的。注意天數(shù)標(biāo)度是非線性的。
盡管本發(fā)明已被一般地以及用優(yōu)選實(shí)施方案作了如上描述，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解，基于上述描述，可有其它的變異形式或修飾存在。
權(quán)利要求
1.一種最多前24個(gè)N末端氨基酸被修飾的KGF多肽類(lèi)似物，其中對(duì)應(yīng)于KGF氨基酸位置1和15[SEQ ID NO2的氨基酸位置32和46(分別為Cys1和Cys15)]的半胱氨酸殘基缺失或被其它氨基酸替換。
2.權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物，其中Cys1和Cys15缺失。
3.權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物，其中前15至24個(gè)N末端氨基酸被截去。
4.權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物，其中Cys1缺失，Cys15被其它氨基酸替換。
5.權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物，其中最多前14個(gè)N末端氨基酸被截去且Cys15被其它氨基酸替換。
6.權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物，其中Cys1和Cys15被其它氨基酸替換。
7.權(quán)利要求4、5或6中任一權(quán)項(xiàng)的多肽類(lèi)似物，其中半胱氨酸被選自丙氨酸、亮氨酸和絲氨酸的氨基酸替換。
8.權(quán)利要求7的多肽類(lèi)似物，其中半胱氨酸被絲氨酸替換。
9.權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物，其選自C(1，15)S、NΔ15、NΔ16、NΔ17、NΔ18、NΔ19、NΔ20、NΔ21、NΔ22、NΔ23和NΔ24、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)-、ΔN8/C(15)S-、ΔN8/C(15)-、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q。
10.一種藥物制劑，其含有治療有效量的權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物和藥用載體。
11.一種藥物制劑，其含有治療有效量的冰凍干燥的權(quán)利要求1的多肽類(lèi)似物。
12.權(quán)利要求11的藥物制劑，其進(jìn)一步包含一種藥用載體。
13.一種選自DNA和RNA的核酸分子，其中該核酸分子編碼最多前24個(gè)N末端氨基酸被修飾的KGF多肽類(lèi)似物，該類(lèi)似物中對(duì)應(yīng)于KGF氨基酸位置1和15[SEQ ID NO2的氨基酸位置32和46(分別為Cys1和Cys15)]的半胱氨酸殘基缺失或被其它氨基酸替換。
14.權(quán)利要求13的核酸分子，其編碼Cys1和Cys15缺失的KGF多肽類(lèi)似物。
15.權(quán)利要求13的核酸分子，其編碼前15到24個(gè)N末端氨基酸被截去的KGF多肽類(lèi)似物。
16.權(quán)利要求13的核酸分子，其編碼Cys1缺失且Cys15被其它氨基酸替換的KGF多肽類(lèi)似物。
17.權(quán)利要求13的核酸分子，其編碼最多前14個(gè)N末端氨基酸被截去且Cys15被其它氨基酸替換的KGF多肽類(lèi)似物。
18.權(quán)利要求13的核酸分子，其編碼Cys1和Cys15被其它氨基酸替換的KGF多肽類(lèi)似物。
19.權(quán)利要求16、17或18中任一權(quán)項(xiàng)的核酸分子，其中半胱氨酸被選自丙氨酸、亮氨酸和絲氨酸的氨基酸替換。
20.權(quán)利要求19的核酸分子，其中編碼絲氨酸的密碼子替換了編碼半胱氨酸的密碼子。
21.權(quán)利要求13的核酸分子，其中多肽類(lèi)似物選自C(1，15)S、NΔ15、NΔ16、NΔ17、NΔ18、NΔ19、NΔ20、NΔ21、NΔ22、NΔ23和NΔ24、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)S-、ΔN8/C(15)S、ΔN8/C(15)-和ΔN23/R(144)Q。
22.一種含有權(quán)利要求13的核酸分子的有生物學(xué)功能的質(zhì)?；虿《据d體。
23.一種用權(quán)利要求22的有生物學(xué)功能的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的原核宿主細(xì)胞，它是大腸桿菌。
25.權(quán)利要求23的真核宿主細(xì)胞，它是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的真核宿主細(xì)胞，它是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
27.一種產(chǎn)生KGF多肽類(lèi)似物的方法，該方法包括在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)用權(quán)利要求13的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主細(xì)胞，所用的方式允許編碼的多肽類(lèi)似物表達(dá)，分離如此產(chǎn)生的多肽類(lèi)似物。
28.一種刺激非成纖維上皮細(xì)胞產(chǎn)生的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1的KGF多肽類(lèi)似物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非成纖維上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的強(qiáng)力促細(xì)胞分裂劑——角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)的多肽類(lèi)似物,KGF最多前24個(gè)N末端氨基酸被修飾,其中對(duì)應(yīng)KGF氨基酸位置1和15[SEQ ID NO:2]的氨基酸位置32和46(分別為Cys1和Cys15)的半胱氨酸缺失或被其它氨基酸替換。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這些類(lèi)似物的核酸分子,以及用這些類(lèi)似物激發(fā)非發(fā)纖維上皮細(xì)胞增殖的方法。
文檔編號(hào)C07K14/50GK1169733SQ95196749
公開(kāi)日1998年1月7日 申請(qǐng)日期1995年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月12日
發(fā)明者C·莫列斯, W·C·肯尼, B·L·陳, E·W·徐 申請(qǐng)人:安姆根有限公司