專利名稱：具有ii型磷脂酶a2抑制作用的新型單克隆抗體及含其一部分的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)II型磷脂酶A2具有強(qiáng)抑制活性的新型單克隆抗體及含其一部分的蛋白質(zhì)。
更具體地，本發(fā)明涉及對(duì)II型磷脂酶A2特異性、親和性好，同時(shí)抑制II型磷脂酶A2作用強(qiáng)，作為涉及II型磷脂酶A2的疾病的治療藥可利用的新型單克隆抗體及含其一部分的蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及產(chǎn)生該單克隆抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞，編碼該單克隆抗體或蛋白質(zhì)的DNA及含有該DNA的重組載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有該單克隆抗體或蛋白質(zhì)的醫(yī)藥組合物或II型磷脂酶A2抑制劑。
背景技術(shù)：
已知磷脂酶A2是生物膜構(gòu)成成分1，2-二?；姿岣视王2位上的酯鍵的水解酶。此酶見于哺乳動(dòng)物的各種臟器和細(xì)胞，不僅調(diào)節(jié)生物膜磷脂的生成和代謝，而且起花生四烯酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)的限速酶的作用，已知其代謝產(chǎn)物前列腺素、白三烯、血栓烷、PAF等具有很多生理活性。
磷脂酶A2已知有I型、II型、細(xì)胞內(nèi)等種類(厚味嚴(yán)一等，日本臨床，1994年特刊，202-206)。其中，II型磷脂酶A2會(huì)伴隨炎癥反應(yīng)進(jìn)入炎癥部位的滲出液，大量釋放到血液中。有各種報(bào)告表明，這種酶在各種炎癥性疾病中使病情惡化或成為一部分病因。例如，Kikuchi-Yanoshita等報(bào)告了在心肌梗塞模型大鼠的缺血性心臟疾病中，此酶活性的上升與臟器損害的進(jìn)展相對(duì)應(yīng)(Kikuchi-Yanoshita，R.et al.，J.Biochemistry，11433-38，1993)。Leong等報(bào)告了心肌梗塞患者血中存在比正常人多的此種酶(Leong，L.L et al.，Clinical ExperimentalPharmacology and Physiology，19113-118，1992)。
Lauritzen等報(bào)告了在腦梗塞的缺血再灌流障礙中，本酶對(duì)疾病的惡化起了重要的作用(Lauritzen I.et al.，Brain Research，651353-356，1994)。Baur等報(bào)告了在急性腎功能衰竭中，本酶在病情的惡化上起了重要作用(Baur M.，KlinWochenschr，67196-202，1989)。Murakami等提出，該酶在哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病中起著中心作用，會(huì)促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放組胺顆粒，抑制此酶可能開發(fā)出哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療藥(Murakami，M.et al.，Journal of Immunology，1515675-5684，1993)。
Smith等和Pruzanski等報(bào)告了慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Smith G.M.et al.，British Journal ofRheumatology，31175-178，1992；Pruzanski W.et al.，J.Rheumatol.，151351-1355，1988)。Pruzanski等報(bào)告了變形性關(guān)節(jié)炎患者滲出液中同樣存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Pruzanski W.et al.，Life Sciences，482457-2462，1991)。Vadas等報(bào)告了敗血性休克患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Vadas P.et al.，Life Sciences，50807-811，1992，Green J.，Inflammation，15355-367，1991)、Nevalainen等報(bào)告了胰腺炎患者、特別是重癥患者的血中存在大量本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Nevalainen T.J.et al.，Gut，341133-1136，1993)。Anderson等報(bào)告了牛皮癬患者皮膚中存在大量本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Anderson S.et al.，Inflammation，181-12，1994)。
Koike等報(bào)告了在多器官衰竭(MOF)中，該酶作為病因起了主要作用(Koike K.et al.，Surgery，112173-180，1992)。Koeniger等、Edelson等及Romaschin等報(bào)告了在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Koeniger R.et al.，Klin Wochenschr，67212-216，1989；Edelson J.D.et al.，AM REV RESPIRDIS，1431102-1109，1991；Romaschin A.et al.，Clin.Biochem.，255-60，1992)。
Minami等報(bào)告了在克羅恩病及潰瘍性大腸炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Minami T.et al.，Gut，33914-921，1992)。
另外，據(jù)推測(cè)，眼色素層炎、新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)、支氣管肺發(fā)育異常(BPD)等疾病也與本酶有關(guān)。
作為抗人II型磷脂酶A2抗體，報(bào)道了以下情況。
Stoner等從人胎盤和滑液精制了人II型磷脂酶A2，將其作為抗原，用小鼠獲得單克隆抗體(Stoner C.R.et al.，Journal of Immunological Methods，145127-136，1991)。此文中所用的免疫方法是將BALB/cByJ系小鼠先用與福氏完全佐劑混合的磷脂酶A25μg免疫，再在25日后用3μg免疫。進(jìn)行脾細(xì)胞融合三天前(免疫36天后)以5μg最終免疫。因此，免疫的抗原全量13μg分三次、經(jīng)36天進(jìn)行免疫。脾細(xì)胞的融合采用小鼠骨髓瘤PAI-0細(xì)胞，選擇HAT培養(yǎng)基。培養(yǎng)基上清液用磷脂酶A2經(jīng)ELISA系統(tǒng)檢測(cè)，獲得單克隆抗體(PLA184、PLA185、PLA186、PLA187)。這些抗體具有對(duì)人磷脂酶A2的抑制活性。但是，對(duì)其它動(dòng)物磷脂酶A2抑制活性的檢測(cè)試驗(yàn)僅對(duì)大鼠II型磷脂酶A2進(jìn)行了試驗(yàn)，這些抗體對(duì)大鼠II型磷脂酶A2幾乎沒有或完全沒有交叉反應(yīng)，因此不能用于大鼠動(dòng)物試驗(yàn)。
Takayama等從風(fēng)濕癥患者的關(guān)節(jié)液中提純了人II型磷脂酶A2，作為免疫原，用小鼠獲得了單克隆抗體(Takayama K.et al.，BIOCHEMICAL ANDBIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 1671309-1315，1990)。該文所用的免疫方法為在硝酸纖維素膜上吸附人II型磷脂酶A2 10μg后，制成勻漿，將其接種于BALB/c小鼠脾內(nèi)。2周后，進(jìn)行同樣的免疫。從而，免疫的抗原全量20μg分兩次、于28日內(nèi)免疫。然后，在3天后，進(jìn)行脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(X63-Ag8.6.5.3)的融合。通過使用磷脂酶A2的ELISA系統(tǒng)檢測(cè)培養(yǎng)基的上清液，得到有反應(yīng)性的單克隆抗體(HP-1、HP-2、HP-3、HP-4)。這些抗體中，對(duì)人磷脂酶A2抑制活性最強(qiáng)的為HP-1。然而，即使HP-1，其抑制活性也是弱的，即使加入200倍摩爾比的抗體，也只顯示約80％的抑制活性。
McCord等精制了重組人II型磷脂酶A2，將其作為免疫原，用小鼠得到單克隆抗體(McCord M.et al.，THE JOURNAL OF INVESTIGATIVEDERMATOLOGY 102980-986，1994)。該文所用的免疫方法是對(duì)CAF1系小鼠用混合了福氏完全佐劑的磷脂酶A2各以100、50、25μg的量每4周免疫一次。在進(jìn)行脾細(xì)胞融合前3天，進(jìn)行最終免疫。因而免疫的抗原全量約200μg，分4次，于56日內(nèi)進(jìn)行免疫。脾細(xì)胞的融合采用小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-AG14，選擇HAT培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基上清液。用磷脂酶A2檢測(cè)抑制活性，獲得單克隆抗體(3F10)。用此抗體1μg檢測(cè)人磷脂酶A2抑制活性。然而，該論文中沒有記載用多少量的人磷脂酶A2，抑制活性是否強(qiáng)并不明確。
Johnson等還在專利申請(qǐng)公開公報(bào)(特表平4-506447號(hào)公報(bào))中公開了精制重組人磷脂酶A2，將其作為免疫原，用家兔獲得多克隆抗體的方法。這不是單克隆抗體，而且，他們用兩種肽(人磷脂酶A2序列的片斷GTKFLSYKFSNSGSRITC(N末端67-85位)和NKTTYNKKYQYYSNKHSRGSTPRC(N末端109-132位))作為免疫原進(jìn)行免疫。用此抗體檢測(cè)磷脂酶A2抑制活性。然而，從該說明書的記載中，用多少量的抗體和人磷脂酶A2是不清楚的，抑制活性是否強(qiáng)也不明確。
在特開平7-109300號(hào)中揭示了能促進(jìn)人II型磷脂酶A2與硫酸化多糖結(jié)合的抗體，但該抗體對(duì)人II型磷脂酶A2活性的抑制作用未加以確認(rèn)。
在上述公知的抗體中，關(guān)于對(duì)猴、小鼠、家兔、貓、狗和大鼠的II型磷脂酶A2的抑制作用，以及是否能釋放結(jié)合于細(xì)胞的人磷脂酶A2，尚不明了。
一旦以人的酶免疫小鼠，就容易對(duì)人酶的氨基酸序列與小鼠不同的部分產(chǎn)生抗體。因而，將人II型磷脂酶A2給小鼠免疫后，從理論上推斷，結(jié)合于人II型磷脂酶A2的抗體與小鼠II型磷脂酶A2幾乎完全不結(jié)合。
II型磷脂酶A2的酶活性中心及其鄰近部位一般在動(dòng)物種間具保守性，即便在小鼠與人之間同源性也相當(dāng)高。當(dāng)用人II型磷脂酶A2對(duì)小鼠免疫時(shí)，由于免疫學(xué)的耐受性，難以得到識(shí)別酶活性中心及其鄰近部位的抗體。因此，對(duì)人II型磷脂酶A2抑制作用強(qiáng)的抗體也難以得到，這是目前的狀況。
強(qiáng)力抑制人II型磷脂酶A2、同時(shí)抑制小鼠II型磷脂酶A2和/或猴II型磷脂酶A2的抗體尚未被發(fā)現(xiàn)。新藥在進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)前，必須先通過動(dòng)物試驗(yàn)闡明其藥效作用。因此，必須有對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特別對(duì)小鼠等小動(dòng)物和猴發(fā)揮藥效作用的單克隆抗體，即抑制人II型磷脂酶A2的同時(shí)，強(qiáng)力抑制這些動(dòng)物的II型磷脂酶A2的單克隆抗體。
已知在磷脂酶A2水解膜磷脂時(shí)，必須與細(xì)胞結(jié)合(Suga H.et al.，Eur.J.Biochem.，218807-813，1993；Murakami M.et al.，J.Biol.Chem.，268839-844，1993)。因此，如果抗體不但能抑制血中或滲出液中游離狀態(tài)的酶，而且能釋放結(jié)合于其膜磷脂將被水解的細(xì)胞上的磷脂酶A2，由于新的作用機(jī)制，可望這樣的抗體具有更強(qiáng)力的磷脂酶A2抑制作用。然而，抗體一旦與結(jié)合于細(xì)胞表面的磷脂酶A2結(jié)合，可預(yù)想到補(bǔ)體和/或效應(yīng)細(xì)胞可攻擊所述細(xì)胞，因而具有副作用。然而，可釋放結(jié)合于細(xì)胞的磷脂酶A2的抗體尚未得到。
因此，在考慮作為醫(yī)藥品的抗II型磷脂酶A2抗體時(shí)，期望獲得強(qiáng)力抑制人II型磷脂酶A2、同時(shí)可抑制來自其它動(dòng)物種類的II型磷脂酶A2的抗體、及具有可釋放與細(xì)胞結(jié)合的II型磷脂酶A2的性質(zhì)的抗體。
發(fā)明的揭示本發(fā)明者們?yōu)榭朔@些問題而進(jìn)行了刻意研究，完成了以下發(fā)明。
即將重組人II型磷脂酶A2按每只小鼠20μg與福氏完全佐劑混合，以2-3周間隔共免疫8次。這樣，與其他研究者不同，免疫的頻率高，同時(shí)免疫的時(shí)間長(zhǎng)，旨在避免免疫學(xué)的耐受性。而且，在篩選抗體時(shí)，努力改善了用于磷脂酶A2抑制活性的檢測(cè)系統(tǒng)。
即用敏感性高的大腸桿菌磷脂作為磷脂酶A2活性檢測(cè)用底物(Jacobson P.B.et al.，Biochem.Pharm.，391557，1990)，并改進(jìn)了作為底物的大腸桿菌磷脂的制備。大腸桿菌磷脂的制備系采用磷脂酶A2缺失的大腸桿菌SN17(pldA，pla-2，thr-1，leuB6，thi)(Doi，O.et al.，J.Biochem.，801247-1258，1976)，攙入氚標(biāo)記的油酸，進(jìn)行制備。使用這種菌，高效地制成了不被大腸桿菌磷脂酶A2分解的、氚標(biāo)記的比活性高的大腸桿菌磷脂。而且，使用比現(xiàn)有技術(shù)(J.Biol.Chem.，2614239-4246，1986)酶反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、敏感性高的檢測(cè)系統(tǒng)，高效、精確地篩選了產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤。從而，檢測(cè)了對(duì)得自各種動(dòng)物的II型磷脂酶A2的活性的抑制效果。
而且，采用檢測(cè)所得抗體是否釋放結(jié)合于細(xì)胞的磷脂酶A2的系統(tǒng)，檢測(cè)了抗體的新作用。
結(jié)果，成功地獲得以具有如下性質(zhì)為特征的單克隆抗體。
即，本發(fā)明者們獲得的單克隆抗體對(duì)人II型磷脂酶A2有反應(yīng)性，具有強(qiáng)的抑制活性。而且，與得自猴和小鼠血小板的II型磷脂酶A2顯示交叉反應(yīng)性，具有強(qiáng)的抑制活性。因此，如果使用本發(fā)明的抗體，在進(jìn)行人體試驗(yàn)時(shí)，可先進(jìn)行猴、小鼠的動(dòng)物試驗(yàn)。此外，本發(fā)明的抗體不僅能抑制血中或滲出液中的酶，特別是血中或滲出液中的游離酶，而且能釋放結(jié)合于細(xì)胞的II型磷脂酶A2。已知II型磷脂酶A2通過細(xì)胞表面的硫酸肝素與細(xì)胞結(jié)合，從而與細(xì)胞表面具有硫酸肝素等的肝細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞等結(jié)合。本發(fā)明的單克隆抗體不僅抑制血中或滲出液中呈游離狀態(tài)的酶，而且具有如上所述的從細(xì)胞膜釋放結(jié)合于細(xì)胞的II型磷脂酶A2的性質(zhì)。
此外，本發(fā)明中包括包含具有上述性質(zhì)的單克隆抗體的一部分，而與該單克隆抗體有同等的抗原結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。而且，本發(fā)明還包括還原烷基化衍生物，以及對(duì)于免疫動(dòng)物所得的單克隆抗體的氨基酸序列進(jìn)行了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸添加、缺失、取代或變異而得到的蛋白質(zhì)，只要它們具有與該單克隆抗體同等的抗原結(jié)合能力。
本發(fā)明者還從產(chǎn)生本發(fā)明所包括的抗體的“雜交瘤1.4”和“雜交瘤10.1”分離出編碼抗體的H鏈和L鏈可變區(qū)的cDNA，確定其全堿基序列。據(jù)此，不但可利用遺傳工程技術(shù)大量生產(chǎn)抗體，而且可利用遺傳工程技術(shù)將本發(fā)明所包括的抗體自由地進(jìn)行改變。(將“雜交瘤1.4”確定的堿基序列表示為序列1(L鏈)、序列3(H鏈)。從該堿基序列推測(cè)的氨基酸序列表示為序列2(L鏈)、序列4(H鏈)。將“雜交瘤10.1”確定的堿基序列表示為序列5(L鏈)、序列7(H鏈)。從該堿基序列推測(cè)的氨基酸序列表示為序列6(L鏈)、序列8(H鏈)。)即，本發(fā)明包含以下內(nèi)容(1)可抑制人II型磷脂酶A2的活性、同時(shí)抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性的單克隆抗體，或含有該抗體的一部分、具有該抑制活性的蛋白質(zhì)。
(2)具有釋放結(jié)合于細(xì)胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含有該抗體的一部分、具有該作用的蛋白質(zhì)。
(3)如(2)中所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)，其中磷脂酶A2來自人。
(4)可抑制人II型磷脂酶A2的活性、同時(shí)抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性、而且具有釋放結(jié)合于細(xì)胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含有該抗體的一部分、具有該作用的蛋白質(zhì)。
(5)從雜交瘤12H5(FERM BP-5300)、雜交瘤1.4(FERM BP-5297)或雜交瘤10.1(FERM BP-5298)產(chǎn)生的單克隆抗體或含有該抗體一部分的蛋白質(zhì)，或具有與它們同等的對(duì)II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體或含有該抗體一部分的蛋白質(zhì)。
(6)如(1)或(2)中所述的單克隆抗體或含有其一部分的蛋白質(zhì)，所述單克隆抗體或蛋白質(zhì)包含具有序列2、4、6或8之一所示的氨基酸序列或具有對(duì)該氨基酸序列中所含的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸進(jìn)行了氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(7)如(1)或(2)中所述的單克隆抗體、含有該抗體一部分的蛋白質(zhì)，其中所述單克隆抗體或蛋白質(zhì)包含具有序列9-20之一所示的氨基酸序列或具有對(duì)該氨基酸序列中所含的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸進(jìn)行了有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(8)產(chǎn)生(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
(9)如(8)所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞為雜交瘤。
(10)如(8)所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞是用重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
(11)如(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的制備方法，所述方法包含培養(yǎng)(8)中所述的細(xì)胞，從培養(yǎng)上清液回收單克隆抗體或蛋白質(zhì)的工序。
(12)編碼(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的DNA。
(13)如(12)所述的DNA，所述DNA包含序列1、3、5或7之一所示的堿基序列或?qū)υ搲A基序列中所含的一個(gè)或幾個(gè)堿基進(jìn)行了堿基取代、缺失或插入的堿基序列。
(14)含有(12)或(13)的DNA的重組載體。
(15)由(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)與藥劑學(xué)上允許的載體組成的醫(yī)藥組合物。
(16)含有(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的II型磷脂酶A2抑制劑。
本發(fā)明所述的“蛋白質(zhì)”并不特別限定氨基酸的數(shù)目，也包含氨基酸較少的肽。本發(fā)明所述的“產(chǎn)生單克隆抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞”，也只要是產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞即可，包含細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等所有細(xì)胞。
本發(fā)明的單克隆抗體例如可通過在培養(yǎng)基或小鼠腹水中培養(yǎng)小鼠雜交瘤而產(chǎn)生。其片斷F(ab′)2、Fab、Fab′等，例如可將產(chǎn)生的抗體用選自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等的蛋白分解酶進(jìn)行消化，再作適當(dāng)?shù)木贫玫健?br> 本發(fā)明的雜交瘤，例如雜交瘤12H5、1.4、10.1，可這樣得到將以高的免疫頻率、長(zhǎng)的免疫時(shí)間用健康人II型磷脂酶A2致敏的BALB/c系小鼠的脾細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞P3×63Ag8/U1(P3U1)按常規(guī)方法，如Kohler和Milstein的細(xì)胞融合法進(jìn)行融合(參照后面的實(shí)施例)。
本發(fā)明者們?nèi)〉玫?、本發(fā)明中所包含的小鼠雜交瘤12H5、1.4、10.1分別保藏如下關(guān)于雜交瘤12H5的保藏(1)保藏機(jī)構(gòu)名稱、地址名稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所地址日本國(guó)茨城縣つくば市東1丁目1番3號(hào)(郵政編碼305)(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日(3)保藏編號(hào)生命研條寄第5300號(hào)(FERM BP-5300)關(guān)于雜交瘤1.4的保藏(1)保藏機(jī)構(gòu)名稱、地址名稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所地址日本國(guó)茨城縣つくば市東1丁目1番3號(hào)(郵政編碼305)(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日(3)保藏編號(hào)生命研條寄第5297號(hào)(FERM BP-5297)
關(guān)于雜交瘤10.1的保藏(1)保藏機(jī)構(gòu)名稱、地址名稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所地址日本國(guó)茨城縣つくば市東1丁目1番3號(hào)(郵政編碼305)(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日(3)保藏編號(hào)生命研條寄第5298號(hào)(FERM BP-5298)作為上述雜交瘤的培養(yǎng)基，可使用在例如Dalbecco改良的Eagle極限必需培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱“DMEM”)中含有胎牛血清、L-谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇及抗生素(如青霉素G、鏈霉素、慶大霉素等)的培養(yǎng)基等。
雜交瘤的培養(yǎng)通常在如下條件下進(jìn)行在培養(yǎng)基中于37℃、5％CO2、95％空氣的氣相中培養(yǎng)2-4天，或在以2，6，10，14-四甲基正十五烷(例如姥鮫烷，Aldrich公司制)預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)10-20天左右，產(chǎn)生可精制量的抗體。
將編碼本發(fā)明抗體的基因的全部或部分插入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞中，使其產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質(zhì)，也可得到它們。
這樣制得的單克隆抗體可用從培養(yǎng)上清液或腹水中分離精制蛋白質(zhì)的常規(guī)方法加以分離精制。這樣的方法可列舉如離心分離、透析、硫酸銨鹽析、用DEAE-纖維素、羥基磷灰石、A蛋白瓊脂糖等柱層析等。
這樣分離精制所得的抗體，可按常規(guī)方法，用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白酶進(jìn)行消化，再按蛋白質(zhì)分離精制的常規(guī)方法進(jìn)行分離精制，得到具有活性的部分，如F(ab′)2、Fab、Fab′、Fv。進(jìn)一步通過用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺等按常規(guī)方法將橋接抗體的H鏈與H鏈和/或H鏈與L鏈的二硫鍵還原烷基化，可得到H鏈與L鏈僅以非共價(jià)鍵結(jié)合的抗體的還原烷基化衍生物(有用的免疫試驗(yàn)法，第39頁，講談社科學(xué)書籍)。
關(guān)于本發(fā)明的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質(zhì)，為了抑制效應(yīng)細(xì)胞的活性，也可改變Fc部分的氨基酸序列(Duncan，A.R.et al.，Nature，332738，1988；Tao，M.et al.，J.Exp.Med.，178661-667，1993；Lund，J.，J.Immunology，1472657，1991)。也可以用其他蛋白質(zhì)置換Fc部分。還可將其他蛋白質(zhì)融合于Fc部分，使其產(chǎn)生新的作用。
在人的治療中使用本發(fā)明的單克隆抗體或含該抗體一部分的蛋白質(zhì)時(shí)，較佳的是使用來自人的部分比例高的單克隆抗體或含該抗體一部分的蛋白質(zhì)。這樣的單克隆抗體的例子可列舉(1)僅作為可變區(qū)由來自小鼠等動(dòng)物的氨基酸序列、作為恒定區(qū)由來自人的氨基酸序列組成的抗體，即所謂“嵌合抗體”；(2)僅在互補(bǔ)決定區(qū)(或高變區(qū)，以下簡(jiǎn)稱“CDR”)由來自小鼠等動(dòng)物的氨基酸序列、其他區(qū)域由來自人的氨基酸序列組成的抗體即所謂“人源化抗體”。這些類型的抗體也包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域技術(shù)人員例如可通過從本發(fā)明的雜交瘤分離對(duì)應(yīng)于可變區(qū)或CDR的基因，將其與人抗體基因重組，引入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，來制備這些“嵌合抗體”或“人源化抗體”(參照Int.J.Cancer，44，424-433(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87,8095-8099(1990))。當(dāng)基因的堿基序列確定后，即可使用合成的相應(yīng)序列的基因，也可使用從雜交瘤和人抗體形成細(xì)胞所得的基因與合成基因結(jié)合而成的基因。作為對(duì)應(yīng)于可變區(qū)或CDR的基因，最好為本發(fā)明者們分離所得的、序列1、3、5或7之一所記載的堿基序列或含其CDR部分的堿基序列的DNA，或包含編碼序列2、4、6或8之一所記載的氨基酸序列或其CDR部分的堿基序列的DNA，或具有對(duì)該DNA的堿基序列的一個(gè)或幾個(gè)堿基進(jìn)行了堿基的取代、缺失或插入的堿基序列的DNA基因或其一部分的DNA。堿基的取代、缺失或插入等變異的引入可用公知的方法進(jìn)行(Gillamn et al.，Gene，8，81-97(1979)；Roberts et al.，Nature，328，731-734(1987))。在所得的變異堿基序列中，選擇編碼具有較佳性質(zhì)的氨基酸序列的序列，可用噬菌體展示法(Annu.Rev.Immunol.，12，433-455(1994))等。特別是，具體的關(guān)于“人源化抗體”，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照公知的方法容易地進(jìn)行制備(Nature，321，522-525(1986)；Science，239，1534-1536(1988)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，86,10029-10033(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，88,2869-2873(1991))。根據(jù)這些文獻(xiàn)，制備“人源化抗體”時(shí)，較佳的是使用與衍生該被移植的CDR的人以外的生物的抗體高度同源的人抗體，作為僅在CDR部位以人以外的生物衍生的CDR取代的人抗體(即構(gòu)成“人源化抗體”的基本骨架的抗體，稱為“人受體抗體”)。如實(shí)施例7所示，與本發(fā)明者們所得到的本發(fā)明中所包括的小鼠抗體高度同源的人抗體有例如Pag-1抗體(Hughes-Jones，N.C.et al.，Biochem.J.，268，135-140(1990))、WEA抗體(Goni，F(xiàn).et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80,4837-4841(1983))、ITH5-2抗體(Chin，L.T.，et al.，Immunol.Letter，44，25-30(1995))、ITC48抗體(Ohlin，M.，et al.，Mol.Immunol.，31，983-991(1994))，這些抗體據(jù)認(rèn)為適于作為制備“人源化抗體”時(shí)的“人受體抗體”。
至于“嵌合抗體”，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照公知的方法容易地進(jìn)行制備(Nature，314，268-270(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,3439-3443(1987)；ibid.，84，214-218(1987)；ibid.，81，6851-6855(1984))。
本發(fā)明中所包含的較好的單克隆抗體或蛋白質(zhì)可列舉用人II型磷脂酶A2致敏，如上所述制成的單克隆抗體12H5或1.4及其片斷F(ab′)2、Fab、Fab′等?？闪信e具有這些單克隆抗體或其一部分的可變區(qū)或高變區(qū)、其他部分來自人的單克隆抗體。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物非經(jīng)口投與，即皮下、肌肉或靜脈注射特別有效。非經(jīng)口投與用的組合物通常由溶解于可投與的載體(較佳為水性載體)的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質(zhì)的溶液組成。各種水性載體，如水、緩沖液、0.4％食鹽水、0.3％甘氨酸溶液、5％葡萄糖溶液、人白蛋白溶液等均可使用。這些溶液為無菌的，并且一般不含有會(huì)形成顆粒的物質(zhì)。這些組合物可用常規(guī)所用的公知的滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。這些組合物可含有緩沖劑、等滲劑之類為接近生理?xiàng)l件所必需的藥劑學(xué)上允許的輔助劑，如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、枸櫞酸鈉等?？煞墙?jīng)口投與的組合物的實(shí)際制備可采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的或眾所周知的技術(shù)，如記載于“Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1980)＂的技術(shù)。
本發(fā)明的單克隆抗體或蛋白質(zhì)或醫(yī)藥組合物可冷凍儲(chǔ)存，或冷凍干燥儲(chǔ)存而于使用前用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙庠偕笫褂?。冷凍干燥和再生可用采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)。
附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1表示用重組人II型磷脂酶A2對(duì)12H5、10.1和1.4的ELISA結(jié)果。
圖2表示12H5、10.1和1.4對(duì)來自大鼠血小板的磷脂酶A2活性的ELISA結(jié)果。
圖3表示12H5、10.1和1.4對(duì)重組人II型磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖4表示12H5、10.1和1.4對(duì)大鼠II型磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖5表示12H5對(duì)來自各種動(dòng)物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖6表示10.1對(duì)來自各種動(dòng)物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖7表示1.4對(duì)來自各種動(dòng)物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖8表示12H5、10.1和1.4釋放結(jié)合于BRL-3A細(xì)胞的磷脂酶A2的作用。
圖9表示1.4的H鏈和L鏈可變區(qū)cDNA錨式PCR克隆方法。
圖10表示抗體1.4的L鏈可變區(qū)的cDNA序列及翻譯所得的氨基酸序列。對(duì)應(yīng)于CDR序列的推測(cè)的序列加下劃線。
圖11表示抗體1.4的H鏈可變區(qū)的cDNA序列及翻譯所得的氨基酸序列。對(duì)應(yīng)于CDR序列的推測(cè)的序列加下劃線。
圖12表示10.1的H鏈和L鏈可變區(qū)cDNA的PCR克隆方法。
圖13表示抗體10.1的L鏈可變區(qū)的cDNA序列及翻譯所得的氨基酸序列。對(duì)應(yīng)于CDR序列的推測(cè)的序列加下劃線。
圖14表示抗體10.1的H鏈可變區(qū)的cDNA序列及翻譯所得的氨基酸序列。對(duì)應(yīng)于CDR序列的推測(cè)的序列加下劃線。
實(shí)施發(fā)明的最佳方案以下描述本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1 雜交瘤12.5、1.4、10.1的制備(a)重組人II型磷脂酶A2的制備本發(fā)明的單克隆抗體可通過將重組人II型磷脂酶A2免疫動(dòng)物而得到，關(guān)于重組人II型磷脂酶A2的制備，按照特開平5-192167號(hào)公報(bào)中記載的方法進(jìn)行。
(b)經(jīng)免疫的脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例1(a)中精制所得的重組人II型磷脂酶A2按每只動(dòng)物20μg溶解于0.1ml生理鹽水中，與等體積福氏完全佐劑混合，乳化，給BALB/c雄性小鼠(開始免疫時(shí)是6周齡)腹腔注射(初次免疫)。以后按2-3周間隔，用同量的磷脂酶A2和同體積福氏完全佐劑混合乳化而成的乳劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫7次。第7次免疫的24天后，將磷脂酶A2(20μg/只)溶于0.2ml生理鹽水，腹腔注射(最終免疫)。最終免疫3天后，從1只小鼠取脾細(xì)胞，懸浮于DMEM培養(yǎng)基中。
(c)雜交瘤12H5、1.4、10.1的制備將如上制備的脾細(xì)胞(1×108個(gè))與小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3×63Ag8·U1(P3U1)(2×107個(gè))按Kohler&Milstein的方法(見Nature，256，495(1975))進(jìn)行融合。即將脾細(xì)胞與P3U1細(xì)胞用DMEM洗滌幾次后，一起放入50ml塑料離心管，充分混合。再離心分離除去培養(yǎng)基，在攪拌下，用1分鐘向其中緩緩加入保溫于37℃的含50％(w/v)聚乙二醇(Sigma，平均分子量3350)的DMEM1ml。
然后，滴加保溫于37℃的DMEM 10ml，使細(xì)胞融合反應(yīng)終止。離心分離反應(yīng)液，除去上清液后，向殘?jiān)屑尤際AT培養(yǎng)基(含有添加了次黃嘌呤(1×10-4M)、氨基喋呤(4×10-7M)、胸苷(1.6×10-5M)的10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，使脾細(xì)胞濃度達(dá)到6×105個(gè)/ml。將此細(xì)胞懸浮液按每孔200μl(脾細(xì)胞1.2×105個(gè))分別注入96孔塑料板。11天后，吸去半量培養(yǎng)基，加入上述HAT培養(yǎng)基。細(xì)胞融合7-10天后，約半數(shù)孔中見到雜交瘤的增殖。用下述(d)的方法測(cè)定培養(yǎng)上清液中的抗體活性。將陽性的克隆移至48孔塑料板，再移至24孔塑料板，除了不含氨基喋呤外，用與上述同樣的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用24孔塑料板培養(yǎng)上清液按(d)的方法確認(rèn)抗體活性的重現(xiàn)性，同時(shí)用(e)的方法測(cè)定酶抑制活性。
為了證實(shí)顯示酶抑制活性的3個(gè)克隆為單克隆，用有限稀釋法進(jìn)行連續(xù)克隆化。將這樣所得的克隆產(chǎn)生的單克隆抗體分別命名為12H5、1.4和10.1。
(d)用ELISA法測(cè)定抗體的活性將精制的重組人II型磷脂酶A2用20mM Tris緩沖的食鹽水(TBS，pH7.4)溶解成0.05μg/ml，在96孔平底微量滴定板的各孔中每孔加入100μl，在濕潤(rùn)室中于4℃保存一夜。然后，棄去溶液，每孔添加含有1％BSA的TBS 200μl，37℃靜置1小時(shí)，以封閉各孔的未吸附部分。然后，用含0.05％吐溫20(商品名)的TBS(TBS-吐溫)溶液洗滌幾次。將雜交瘤培養(yǎng)上清液或腹水或精制的抗體制品用含0.2％BSA的TBS-吐溫(BSA-TBS-吐溫)溶液稀釋，在每孔中各加入100μl，室溫反應(yīng)2小時(shí)。
與前面同樣的用TBS-吐溫溶液洗滌后，在每個(gè)孔中各加入以BSA-TBS-吐溫溶液200倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠抗體(Zymed公司制)100μl，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后，與前面同樣的用TBS-吐溫溶液洗滌后，各加入含0.006％過氧化氫和3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(0.1mg/ml)的0.1M乙酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH5.8)100μl作為酶底物，室溫下靜置30分鐘。靜置后，各加入3M硫酸25μl使反應(yīng)停止，測(cè)定450nm的吸光度。
(e)磷脂酶A2抑制活性的測(cè)定用如下對(duì)生物化學(xué)雜志的方法(Pepinsky，R.B.et al.，J.Biol.Chem.，261(9)，4239-4246(1986))作了若干改良的方法測(cè)定抗體對(duì)磷脂酶A2的抑制活性。
將重組人II型磷脂酶A2精制制品0.5ng和培養(yǎng)上清液或精制抗體制品在含150mM氯化鈉、12.5mM氯化鈣和250μg/ml牛血清白蛋白的125mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)100μl中，室溫下預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)。然后，將摻入氚標(biāo)記的油酸的大腸桿菌SN17的高壓消毒的制品25μl(5萬-10萬cpm)加入反應(yīng)液中，37℃反應(yīng)30分鐘。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入冰中，加入4N鹽酸25μl終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，加入40mg/ml牛血清白蛋白25μl，混合后在冰中放置30分鐘。
然后，于15000rpm離心2分鐘，測(cè)定上清液的放射活性。從所得的放射活性中減去陰性對(duì)照(不含磷脂酶A2和抗體的樣品的放射活性)，所得的值作為磷脂酶A2的活性。抗體對(duì)磷脂酶A2活性的抑制率以陽性對(duì)照的磷脂酶A2活性(含所述磷脂酶A2但不含抗體的樣品的磷脂酶A2活性)為基準(zhǔn)，按如下計(jì)算表示為百分率。
磷脂酶A2活性抑制率＝{1-(磷脂酶A2與培養(yǎng)上清液或精制抗體制品一起保溫后的磷脂酶A2活性)/(陽性對(duì)照的磷脂酶A2活性)}×100在磷脂酶A2活性測(cè)定中作為底物用的摻入氚標(biāo)記油酸的大腸桿菌的高壓消毒制品按特開平5-192167號(hào)公報(bào)第8頁記載的方法進(jìn)行制備。
實(shí)施例2 單克隆抗體的產(chǎn)生和精制(a)單克隆抗體的產(chǎn)生BALB/c小鼠出生后5-6周腹腔注射2，6，10，14-四甲基正十五烷(姥鮫烷，Sigma)0.5ml，14-21天后，腹腔內(nèi)接種以0.5ml生理鹽水懸浮的5×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。10-20天后，處死小鼠，剖腹，取其產(chǎn)生的腹水。從每只小鼠得到5-10ml含有單克隆抗體的腹水。
(b)單克隆抗體的精制將此腹水離心分離除去不溶物后，加入等體積的飽和硫酸銨溶液，于冰上攪拌1小時(shí)。離心分離產(chǎn)生的沉淀，溶于少量含0.9％氯化鈉的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，對(duì)100倍體積的同一緩沖液于4℃透析一夜，得到粗Y-球蛋白部分。使用MAPS-II小鼠單克隆抗體精制試劑盒(商標(biāo)，BioRad Laboratories制)，從此部分提純IgG。
即在Y-球蛋白部分加入等體積的結(jié)合緩沖液，混合后，加到以同樣的結(jié)合緩沖液充分平衡過的A蛋白-瓊脂糖CL4B(Pharmacia制)填充的柱上(凝膠床體積20ml)，用3倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌。然后用試劑盒中所裝的洗脫緩沖液約3倍柱體積洗脫IgG。洗脫的IgG對(duì)20mM Tris-緩沖食鹽水(pH7.4)等進(jìn)行透析，將此作為抗體制品。通常每ml腹水中得到5-10mg IgG。
實(shí)施例3抗體亞類的確定用雜交瘤培養(yǎng)上清液，采用Amersham制的小鼠單克隆抗體分型用試劑盒測(cè)定其IgG亞類。本方法基于ELISA法，分別確定了12H5(IgG2a)、1.4(IgG2a)和10.1(IgGl)。
實(shí)施例4抗體的交叉反應(yīng)性(a)大鼠II型磷脂酶A2的精制在大鼠PRP(富血小板血漿)中加入1/5體積的ACD液(含65mM檸檬酸和85mM檸檬酸鈉的2％(w/v)的葡萄糖液)，以2500×g離心10分鐘。將沉淀的血小板加ACD/F10培養(yǎng)基(1∶5)(F10，Gibco制)混合液懸浮成2×109個(gè)細(xì)胞/毫升后，以2500×g離心10分鐘。再將沉淀的血小板用F10培養(yǎng)基再懸浮成2×109個(gè)細(xì)胞/毫升，然后依次加入1M氯化鈣和2500單位/毫升凝血酶使終濃度為2mM和2.5單位。
添加后，37℃培養(yǎng)5分鐘，再于4℃、3000×g離心15分鐘，回收上清液(凝血酶刺激的大鼠血小板上清液)，將此上清液供給以后的精制操作。磷脂酶A2的精制系將特開平5-192167號(hào)公報(bào)第12頁記載的方法作若干改良。即將凝血酶刺激的大鼠血小板上清液通過預(yù)先用0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡過的硫酸化cellulofine(生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)柱(Econocolumn，柱體積20ml，BIO-RAD公司制)。將洗滌液(含0.5M氯化鈉的0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0))200ml通過該柱進(jìn)行充分洗滌后，用30ml洗脫液(含1.5M氯化鈉的0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0))洗脫，所得的流份為硫酸化cellulofine結(jié)合部分。然后，再用HPLC分離出硫酸化cellulofine結(jié)合部分。
用LC-4AHPLC系統(tǒng)(島津制作所制)，采用CAPCELL PAK C 18柱(4.6mmID×25cm；資生堂制)，全部以1ml/分的流速進(jìn)行HPLC。硫酸化cellulofine結(jié)合部分通過柱后，讓0.1％三氟乙酸通過柱60分鐘。然后，在0.1％三氟乙酸存在下，以0-50％的線性梯度的乙腈洗脫磷脂酶A2。磷脂酶A2的峰出現(xiàn)在約30％乙腈附近，故在此加以回收。
回收的部分用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色法鑒定，檢出磷脂酶A2單一區(qū)帶，證實(shí)此帶為大鼠II型磷脂酶A2。
(b)來自人、猴、狗、家兔、貓和小鼠血小板的II型磷脂酶A2的制備按照生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.，264(10)，5768-5775(1989))記載的人血小板破碎液的制備方法制備來自各種動(dòng)物血小板的II型磷脂酶A2。
即，從人、恒河猴、狗、家兔、小鼠和貓制備PRP(富血小板血漿)，添加EDTA使終濃度成為2mM后，2500×g離心10分鐘，回收細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含有120mM氯化鈉和2mM EDTA的30mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)中，再以2500×g離心10分鐘。本操作進(jìn)行2次后，將所得的細(xì)胞再懸浮于含有120mM氯化鈉和2mM EDTA的30mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)中，使每毫升含2×109個(gè)細(xì)胞，冷凍于液氮中。
使冷凍的細(xì)胞懸浮液融解，加入等體積0.36N的硫酸，進(jìn)行超聲粉碎(BIOMC 7040 ULTRA SONIC PROCESSORSeiko制，輸出80，15秒×6次)。所得的細(xì)胞超聲波破碎液在冰中放置60分鐘后，于4℃、10000×g離心30分鐘，回收上清液。在沉淀中再加入離心上清液1/3體積的0.18N硫酸，再懸浮后，在冰中放置60分鐘。然后于4℃、10000×g離心30分鐘，回收上清液。合并兩次離心上清液，對(duì)含有200mM氯化鈉的50mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)透析一夜。透析后，將細(xì)胞破碎液于4℃、15000×g離心40分鐘，回收上清液，作為來自血小板的磷脂酶A2。
(c)ELISA反應(yīng)性用實(shí)施例2(b)中所得的各種單克隆抗體純品進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。將IgG制品用BSA-TBS-吐溫配成10μg/ml，進(jìn)行系列3倍稀釋。按照實(shí)施例1(d)，進(jìn)行ELISA，研究對(duì)重組人II型磷脂酶A2和大鼠II型磷脂酶A2的交叉反應(yīng)性。將實(shí)施例1(d)的重組人II型磷脂酶A2換成大鼠II型磷脂酶A2，進(jìn)行對(duì)大鼠II型磷脂酶A2的ELISA。
結(jié)果見圖1-圖2，圖中橫軸為抗體濃度，縱軸為450nm處的吸光度。對(duì)于12H5和1.4觀察到對(duì)大鼠磷脂酶A2的交叉反應(yīng)性，對(duì)于10.1未見交叉反應(yīng)性。
(d)對(duì)來自各種動(dòng)物的磷脂酶A2的抑制活性用實(shí)施例2(b)中所得的各種單克隆抗體純品進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。
(1)對(duì)重組人II型磷脂酶A2的抑制活性用實(shí)施例1(a)的重組人II型磷脂酶A2，按照實(shí)施例1(e)測(cè)定對(duì)磷脂酶A2的抑制活性。各抗體對(duì)重組人II型磷脂酶A2活性的抑制率見圖3，將磷脂酶A2和抗體樣品預(yù)培養(yǎng)后的抗體濃度作為橫軸。12H5和1.4在10μg/ml的濃度時(shí)幾乎完全抑制磷脂酶A2的活性。而10.1在3μg/ml的濃度達(dá)到80％的抑制率。
(2)對(duì)大鼠II型磷脂酶A2的抑制活性將實(shí)施例1(e)的重組人II型磷脂酶A2換成實(shí)施例4(a)的大鼠II型磷脂酶A2精制品(0.5ng)，測(cè)定對(duì)磷脂酶A2的抑制活性。各抗體對(duì)大鼠II型磷脂酶A2活性的抑制率見圖4，將磷脂酶A2和抗體樣品預(yù)培養(yǎng)后的抗體濃度作為橫軸。12H5和1.4也抑制大鼠II型磷脂酶A2的活性，抑制磷脂酶A2活性50％所需的抗體濃度在12H5為5μg/ml。
(3)對(duì)來自人、猴、狗、家兔、貓和小鼠血小板的II型磷脂酶A2的抑制活性將實(shí)施例1(e)的重組人II型磷脂酶A2換成一定量的各血小板破碎液(20-40μl)，測(cè)定對(duì)磷脂酶A2的抑制活性。各抗體對(duì)來自血小板的磷脂酶A2活性的抑制率見圖5-圖7，橫軸為血小板破碎液和抗體樣品預(yù)培養(yǎng)后的抗體濃度。12H5、1.4和10.1對(duì)來自人血小板的磷脂酶A2活性與重組人II型磷脂酶A2活性同樣地具有抑制作用。從而表明，本發(fā)明的抗重組人II型磷脂酶A2的抗體具有抑制天然人II型磷脂酶A2活性的能力。另一方面，本發(fā)明的抗體抑制來自恒河猴、小鼠的血小板的磷脂酶A2的活性。對(duì)來自狗血小板的磷脂酶A2活性也能部分抑制。而對(duì)來自家兔、貓的血小板的磷脂酶A2活性則無抑制作用。
實(shí)施例5 抗體釋放結(jié)合于細(xì)胞的II型磷脂酶A2的活性在96孔平板培養(yǎng)皿(Falcon公司制)上，用F12K/10％FCS(F12K大日本制藥社制)培養(yǎng)肝細(xì)胞(BRL-3A購自大日本制藥)。將長(zhǎng)成鋪滿細(xì)胞后的培養(yǎng)基棄去，加入含有以4ng125I標(biāo)記的重組人II型磷脂酶A2的F12K/10％FCS 50μl，于37℃培養(yǎng)，使磷脂酶A2與細(xì)胞結(jié)合。1小時(shí)后，加入含有精制抗體制品的F12K/10％FCS或者F12K/10％FCS 50μl，再培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)后，回收培養(yǎng)液，測(cè)定其放射活性。同時(shí)，將添加到反應(yīng)系統(tǒng)中的4ng125I標(biāo)記的磷脂酶A2的放射活性另外加以測(cè)定。
以所添加的磷脂酶A2的放射活性減去磷脂酶A2與細(xì)胞結(jié)合后添加F12K/10％FCS培養(yǎng)后的培養(yǎng)液的放射活性所得的值作為100％，抗體從細(xì)胞釋放磷脂酶A2的活性表示為添加各種濃度抗體進(jìn)行培養(yǎng)后的培養(yǎng)液的放射活性的百分率。
重組人II型磷脂酶A2的125I標(biāo)記用以下方法進(jìn)行。在涂有IODOGEN(Pierce公司制)10μg的玻璃試管中加入含有30μg重組人II型磷脂酶A2的100mMTris-鹽酸緩沖液(pH7.4)100μl，加入100mCi/ml Na125I(ICN公司制)6μl后，在室溫下放置20分鐘。從玻璃試管中取出反應(yīng)液使反應(yīng)終止。用凝膠過濾法除去未反應(yīng)的Na125I。
在結(jié)合了磷脂酶A2的細(xì)胞中加入各種濃度的精制抗體制品進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)液的放射活性。各抗體釋放結(jié)合于細(xì)胞的磷脂酶A2的活性見圖8，橫軸為加入抗體后培養(yǎng)液中的抗體濃度。作為對(duì)照的小鼠抗體完全不從細(xì)胞釋放磷脂酶A2，而12H5、10.1和1.4濃度依賴性地從細(xì)胞釋放磷脂酶A2。
實(shí)施例6 抗體的H鏈和L鏈可變區(qū)cDNA的克隆使用QuickPrep Micro mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)，從約107個(gè)雜交瘤細(xì)胞制成用于cDNA克隆的信使RNA。即將細(xì)胞懸浮于提取緩沖液，用寡(dT)-纖維素分離mRNA。
使用5′RACE系統(tǒng)試劑盒(Gibco制)，按圖9所示順序制成抗體1.4的H鏈和L鏈可變區(qū)cDNA。即使用與恒定區(qū)基因(C)雜交形成的引物和逆轉(zhuǎn)錄酶(SUPER SCRIPTII逆轉(zhuǎn)錄酶)，以1μg mRNA為模板，合成單鏈cDNA。此處所用的引物對(duì)于L鏈為“GSP 1L(5′-GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3′)/序列21”，對(duì)于H鏈為“GSP 1H(5′-GGAA(AG)TA(AGC)CCCTTGACCAGGC-3′)/序列22”。GSP 1H序列中，括號(hào)內(nèi)的序列表示對(duì)應(yīng)于簡(jiǎn)并的堿基。然后，在用RNA酶H消化作為模板的mRNA后，用“GLASSMAX Spin Cartridge”提純單鏈DNA。用dCTP和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在單鏈cDNA的3′末端連接聚(dC)尾。使用與聚(dC)尾雜交的錨定引物(5′-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′/序列23)和與恒定區(qū)基因(C)雜交的引物“GSP 2L(5′-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3′)/序列24”(在L鏈的情況下)或“GSP 2H(5′-TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC(CAT)GATGGGG(GC)TGT(TC)GTTTTGGC-3′)/序列25”(在H鏈的情況下)，使用LATaq(寶酒造社制)，使H鏈和L鏈可變區(qū)基因(V)擴(kuò)增。GSP 2H序列中括號(hào)內(nèi)的序列表示對(duì)應(yīng)于簡(jiǎn)并的堿基。將這些PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，可檢出對(duì)應(yīng)于約550-570堿基對(duì)的H鏈和L鏈單一區(qū)帶。
使用“Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontec制)”，按圖12的方法制成抗體10.1的H鏈和L鏈可變區(qū)cDNA。即使用“Marathon cDNA合成引物”和逆轉(zhuǎn)錄酶，以1μg mRNA為模板，合成單鏈cDNA。再使此反應(yīng)液與RNA酶H、DNA聚合酶I、DNA連接酶反應(yīng)，合成雙鏈cDNA。然后，將此反應(yīng)液用T4 DNA聚合酶催化反應(yīng)，使雙鏈DNA末端平整。使用T4 DNA連接酶，使MarathoncDNA銜接頭結(jié)合于雙鏈cDNA。用與銜接頭雜交的銜接引物1和引物GSP2L(在L鏈的情況下)或GSP2H(在H鏈的情況下)，使用LATaq(寶酒造社制)使H鏈和L鏈可變區(qū)基因(V)擴(kuò)增。將此PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，可檢出對(duì)應(yīng)于約550-570堿基對(duì)的H鏈和L鏈單一區(qū)帶。
為了測(cè)定序列，使用“TA克隆試劑盒(Invitrogen制)”，將PCR擴(kuò)增的片斷整合到pCRTMII載體中。將插入此片斷的pCRTMII質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(寶酒造社制)中。用板上形成的集落和與pCRTMII雜交的“5′引物UD(5′-ACCGAGCTCGGATCCACTAG-3′)/序列26”和“3′引物-DU(5′-ATGCATGCTCGAGCGGCCGCC-3′)/序列27”，使用Taq聚合酶(寶酒造社制)進(jìn)行克隆-PCR。用1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增的DNA片斷，從約600-620個(gè)堿基對(duì)的片斷擴(kuò)增的克隆中選出抗體1.4L鏈3個(gè)克隆，H鏈4個(gè)克隆，及抗體10.1L鏈2個(gè)克隆，H鏈4個(gè)克隆。培養(yǎng)各克隆的大腸桿菌，用“QIAwell-8質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen制)”制備質(zhì)粒DNA。
用所制得的各克隆的質(zhì)粒DNA和引物UD、引物DU，或L鏈用的GSP2L，H鏈用GSP2H，使用“DNA序列測(cè)定試劑盒(Parkin-Elmer制)，進(jìn)行序列測(cè)定反應(yīng)，用373DNA序列分析儀(ABI制)進(jìn)行分析?？贵w1.4的3個(gè)L鏈特異性和4個(gè)H鏈特異性克隆，及抗體10.1的2個(gè)L鏈特異性和4個(gè)H鏈特異性克隆分別具有相同的序列。圖10(序列1和2)關(guān)于抗體1.4的L鏈、圖11(序列3和4)關(guān)于抗體1.4的H鏈，分別表示可變區(qū)的cDNA序列及推斷的氨基酸序列。圖13(序列5和6)關(guān)于抗體10.1的L鏈、圖14(序列7和8)關(guān)于抗體10.1的H鏈，分別表示可變區(qū)的cDNA序列及推斷的氨基酸序列。在各圖中，對(duì)應(yīng)于CDR序列推測(cè)的序列加下劃線。(抗體1.4L鏈的推測(cè)的CDR序列以序列9-11表示，抗體1.4H鏈的推測(cè)的CDR序列以序列12-14表示，抗體10.1L鏈的推測(cè)的CDR序列以序列15-17表示，抗體10.1H鏈的推測(cè)的CDR序列以序列18-20表示。)實(shí)施例7 抗體1.4和抗體10.1的H鏈和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人抗體氨基酸序列的同源性檢索從GenBank、EMBL、SWISS-PROT、PIR、PRF數(shù)據(jù)庫檢索與實(shí)施例6中所得的抗體1.4和抗體10.1的H鏈和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有高度同源性的人抗體。同源性檢索采用BLASTP 1.4.8MP(Altschul，S.F.et al.，J.Mo1.Biol.，215，403-410(1990))方案進(jìn)行。其結(jié)果表明，抗體1.4與諸如Pag-1抗體(Hughes-Jones，N.C.et al.，Biochem.J.，268，135-140(1990))和WEA抗體(Goni，F(xiàn).et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80,4837-4841(1983))等具有高度同源性。抗體10.1與諸如ITH 5-2抗體(Chin，L.T.et al.，Immunol.Letter，44，25-30(1995))、ITC 48抗體(Ohlin，M.，et al.，Mol.Immunol.，31，983-991(1994))等具有高度同源性。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的單克隆抗體及含其一部分的蛋白質(zhì)與人II型磷脂酶A2有反應(yīng)性，具有強(qiáng)的抑制活性。而且，所述抗體和蛋白質(zhì)與來自猴和/或小鼠血小板的II型磷脂酶A2顯示交叉反應(yīng)性，因此在作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的這些動(dòng)物上也可適用，在對(duì)人試驗(yàn)藥理效應(yīng)前可先在猴、小鼠身上進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，這是其有利之處。此外，本發(fā)明的單克隆抗體及含其一部分的蛋白質(zhì)可釋放結(jié)合于細(xì)胞的II型磷脂酶A2，因此對(duì)II型磷脂酶A2具有特別強(qiáng)的抑制活性，被認(rèn)為不會(huì)產(chǎn)生因補(bǔ)體和/或效應(yīng)細(xì)胞的攻擊而引起的副作用。
本發(fā)明的單克隆抗體及含其一部分的蛋白質(zhì)可用作人II型磷脂酶A2被認(rèn)為是病情惡化或引起疾病的原因之一的各種疾病的治療劑，如心肌梗塞、腦梗塞、急性腎衰竭、哮喘等變應(yīng)性疾病、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、敗血性休克、胰腺炎、牛皮癬、多臟器衰竭(MOF)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、克羅恩病和潰瘍性大腸炎、葡萄膜炎、新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)、支氣管肺發(fā)育異常(BPD)等。
序列表序列編號(hào)1序列長(zhǎng)度393序列類型核酸鏈的數(shù)目雙鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細(xì)胞系1.4序列的特征表示特征的代號(hào)CDS存在的位置1..393鑒定特征的方法E序列ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA48Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCC TTG GCT96Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala20 25 30GTG TCT TTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 144Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser35 40 45GTT GAT AGT TAT GGC ATT AGT TTT ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 192Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60GGA CAG CCC CCC AAA CTC CTC ATT TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser65 70 75 80GGG ATC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAA TTC ACC 288Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr85 90 95CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT CAC TGT 336Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys100 105 110CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG 384Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu115 120 125GAA ATA AAA 393Glu Ile Lys130序列編號(hào)2序列長(zhǎng)度131序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 510 15Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser35 40 45Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser65 70 75 80Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr85 90 95Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys100 105 110Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys130序列編號(hào)3序列長(zhǎng)度408序列類型核酸鏈的數(shù)目雙鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細(xì)胞系1.4序列的特征表示特征的代號(hào)CDS存在的位置1..408鑒定特征的方法E序列ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT TTC48Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe1 5 10 15CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAA TCG GGA CCT GGC CTG GTG AAA CCT96Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro20 25 30TCT CAA TCT CTG TCC CTC ACC TGC ATG GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC 144Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr35 40 45AGT GAT TAT GCC TGG AAC TGG ATC CGG CAG TTT CCG GGA AAC AAA CTG 192Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu50 55 60GAG CGG ATG GGA TAC ATA AGG TAC AGT GGT TAC ACT AGC TAC AAC CCA 240Glu Arg Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro65 70 75 80TCT CTC AAA AGT CGA ATC TTT ATC ACG CGA GAC ACA TCC CAG AAC CAG 288Ser Leu Lys Ser Arg Ile Phe Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln85 90 95TTC TTC CTA CAT TTG ACT TCT GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT 336Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr100 105 110TAC TGT ACA AGA GAC TTG GAC GCC TGG TAC TTC GAT GTT TGG GGC GCA 384Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala115 120 125GGG ACA ACG GTC ACC GTC TCC TCA 408Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號(hào)4序列長(zhǎng)度136序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe1 510 15Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro20 25 30Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr35 40 45Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu50 55 60Glu Arg Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro65 70 75 80Ser Leu Lys Ser Arg Ile Phe Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln85 90 95Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr100 105 110Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala115 120 125Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號(hào)5序列長(zhǎng)度381序列類型核酸鏈的數(shù)目雙鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細(xì)胞系10.1序列的特征表示特征的代號(hào)CDS存在的位置1..381鑒定特征的方法E序列ATG GAA TCA CAG ACT CTG GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT48Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr1 5 10 15GGA GCT GAT GGG AAC ATT GTA ATG ACC CAA TCT CCC AAA TCC ATG TCC96Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser20 25 30ATG TCA GTA GGA GAG AGG GTC ACC TTG ACC TGC AAG GCC AGT GAG AAT 144Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn35 40 45GTG GTT ACT TAT GTT TCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAG CAG TCT CCT 192Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro50 55 60AAA CTG CTG ATA TAC GGG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGG GTC CCC GAT 240Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp65 70 75 80CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GCA ACA GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC 288Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTT GCA GAT TAT CAC TGT GGA CAG GGT TAC 336Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr100 105 110AGC TAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA 381Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125序列編號(hào)6序列長(zhǎng)度127序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr1 510 15Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser20 25 30Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn35 40 45Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro50 55 60Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp65 70 75 80Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr100 105 110Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125序列編號(hào)7序列長(zhǎng)度414序列類型核酸鏈的數(shù)目雙鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細(xì)胞系10.1序列的特征表示特征的代號(hào)CDS存在的位置1..414鑒定特征的方法E序列ATG GCT GTC CTG GCA TTA CTT TTT TGC CTG GTA ACA TTC CCA AGC TGT48Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys1 510 15ATC CTT TCC CAG GTG CAG CTG AAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCG96Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala20 25 30CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACA TGT ACC GTC TCA GGG TTC TCA TTA 144Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu35 40 45ACC GAC TTT GGT GTA AAC TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG 192Thr Asp Phe Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60GAG TGG CTG GGA ATG ATA TGG ACT GAT GGA ATC ACA GAC TAT AAT TCA 240Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Thr Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser65 70 75 80GTT CTC AAA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC ACC TCC AAG AGC CAA 288Val Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln85 90 95GTT TTC TTG AAA ATG AAC AAT CTG CAA ACT GAT GAC ACA GCC AGG TAC 336Val Phe Leu Lys Met Asn Asn Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr100 105 110TAC TGT GCC AGA GAT GCA TAC TAC GGC TTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG 384Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp115 120 125GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 414Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號(hào)8序列長(zhǎng)度138序列類型氨基酸鏈的數(shù)目雙鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys1 510 15Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala20 25 30Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu35 40 45Thr Asp Phe Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Thr Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser65 70 75 80Val Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln85 90 95Val Phe Leu Lys Met Asn Asn Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號(hào)9序列長(zhǎng)度15序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His1 510 15序列編號(hào)10序列長(zhǎng)度7序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5序列編號(hào)11序列長(zhǎng)度9序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr1 5
序列編號(hào)12序列長(zhǎng)度6序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Ser Asp Tyr Ala Trp Asn1 5序列編號(hào)13序列長(zhǎng)度16序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15序列編號(hào)14序列長(zhǎng)度9序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系1.4序列Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val1 5序列編號(hào)15序列長(zhǎng)度11序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser1 5 10序列編號(hào)16序列長(zhǎng)度7序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr15序列編號(hào)17序列長(zhǎng)度9序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr15序列編號(hào)18序列長(zhǎng)度5序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Asp Phe Gly Val Asn1 5序列編號(hào)19序列長(zhǎng)度16序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Met Ile Trp Thr Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser1 5 10 15序列編號(hào)20序列長(zhǎng)度11序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類蛋白質(zhì)起源細(xì)胞系10.1序列Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr15 10序列編號(hào)21序列長(zhǎng)度2序列類型核酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列GGCACCTCCA GATGTTAACT GC22
序列編號(hào)22序列長(zhǎng)度20序列類型核酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列GAARTAVCCC TTGACCAG GC 20序列編號(hào)23序列長(zhǎng)度48序列類型核酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列的特征存在的位置36，37，41，42，46，47其它特征N表示肌苷(I)。
序列CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG 48序列編號(hào)24序列長(zhǎng)度46序列類型核酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類其它核酸 合成DNA序列TATAGAGCTC AAGCTTGGAT GGTGGGAAGA TGGATACAGT TGGTGC46
序列編號(hào)25序列長(zhǎng)度50序列類型核酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列TATAGAGCTC AAGCTTCCAG TGGATAGACH GATGGGGSTG TYGTTTTGGC50序列編號(hào)26序列長(zhǎng)度20序列類型核酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列ACCGAGCTCG GATCCACTAG20序列編號(hào)27序列長(zhǎng)度21序列類型核酸拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列的種類其它核酸 合成DNA序列ATGCATGCTC GAGCGGCCGCC2權(quán)利要求
1.抑制人II型磷脂酶A2活性，同時(shí)也可抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性的單克隆抗體，或含其一部分、具有該抑制活性的蛋白質(zhì)。
2.具有釋放結(jié)合于細(xì)胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含其一部分、具有該作用的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)，其中磷脂酶A2來自人。
4.抑制人II型磷脂酶A2活性，同時(shí)也可抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2的活性，并具有釋放結(jié)合于細(xì)胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含其一部分、具有該作用的蛋白質(zhì)。
5.從雜交瘤12H5(FERM BP-5300)、雜交瘤1.4(FERM BP-5297)或雜交瘤10.1(FERM BP-5298)之一產(chǎn)生的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質(zhì)，或有與它們同等的對(duì)II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質(zhì)，其特征在于包含具有序列2、4、6或8之一所述的氨基酸序列或?qū)τ谠摪被嵝蛄兄兴?個(gè)或幾個(gè)氨基酸進(jìn)行了氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質(zhì)，其特征在于包含具有序列9-20之一所述的氨基酸序列或?qū)τ谠摪被嵝蛄兄兴?個(gè)或幾個(gè)氨基酸進(jìn)行了氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
8.產(chǎn)生如權(quán)利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為雜交瘤。
10.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為用重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
11.制備如權(quán)利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，從培養(yǎng)上清液中回收單克隆抗體或蛋白質(zhì)的工序。
12.編碼權(quán)利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的DNA。
13.如權(quán)利要求12所述的DNA，其中包含序列1、3、5或7之一所示的堿基序列或該堿基序列中所含的1個(gè)或幾個(gè)堿基進(jìn)行了堿基取代、缺失或插入的堿基序列。
14.包含權(quán)利要求12或13的DNA的重組載體。
15.權(quán)利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)與藥劑學(xué)上允許的載體組成的醫(yī)藥組合物。
16.包含權(quán)利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質(zhì)的II型磷脂酶A2抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明獲得了抑制Ⅱ型磷脂酶A
文檔編號(hào)C07K16/40GK1171792SQ95197145
公開日1998年1月28日 申請(qǐng)日期1995年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月29日
發(fā)明者河內(nèi)康司, 高崎淳, 安永知榮, 曾保安彥 申請(qǐng)人:山之內(nèi)制藥株式會(huì)社