專利名稱：成纖維細(xì)胞生長因子－14的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及最近鑒定的多核苷酸，該多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸和多肽的用途以及該多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地講，本發(fā)明的多肽經(jīng)推斷鑒定為成纖維細(xì)胞生長因子/肝素結(jié)合生長因子，在下文中稱作“FGF-14”。本發(fā)明也涉及抑制該多肽的作用。
成纖維細(xì)胞生長因子是具有與肝素結(jié)合的特征的一個蛋白質(zhì)家族，并且因此也稱之為肝素結(jié)合生長因子(HBGF)。發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)的不同成員在不同的組織中表達(dá)，并且這種表達(dá)處于特定的時序和空間的控制之下。對于中胚層、外胚層以及內(nèi)胚層起源的各種細(xì)胞而言，這些蛋白質(zhì)是有效的促細(xì)胞分裂劑，上述細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞，角膜及血管內(nèi)皮細(xì)胞，粒細(xì)胞，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成肌細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞，上皮晶狀體細(xì)胞，黑色素細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，星形細(xì)胞，成骨細(xì)胞以及造血細(xì)胞。
每種蛋白質(zhì)成員都具有與其它蛋白質(zhì)成員重疊的功能，并且也具有其獨(dú)特的功能范圍。除具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力以外，F(xiàn)GF-1與2均對內(nèi)皮細(xì)胞具有趨化性，并且已經(jīng)表明FGF-2可以使內(nèi)皮細(xì)胞滲透至基底膜。按照這種性質(zhì)，F(xiàn)GF-1與2均具有刺激血管生成的能力。這些生長因子另一個重要的特征為其促進(jìn)傷口愈合的能力。FGF家族中許多其它的成員都享有與FGF-1與2類似的活性，例如促進(jìn)血管生成與傷口愈合的活性。已經(jīng)表明FGF家族的幾個成員可以誘導(dǎo)中胚層的形成并且可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的分化。
除了這些在正常組織中的生物學(xué)活性以外，已經(jīng)暗示FGF蛋白通過促進(jìn)腫瘤血管生成以促進(jìn)癌癥和肉瘤中的腫瘤發(fā)生，并且當(dāng)其表達(dá)失控時這些蛋白可以充當(dāng)轉(zhuǎn)化蛋白。
FGF家族目前由8個在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽組成堿性FGF，酸性FGF，int 2，hst 1/k-FGF，F(xiàn)GF-5，F(xiàn)GF-6，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子，AIGF(FGF-8)，并且近來已經(jīng)表明一種神經(jīng)膠質(zhì)活化因子是一種新的肝素結(jié)合生長因子，該因子是從一種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液中純化出來的(Miyamoto，M.等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，13(7)4251-4259(1993))。每種多肽的基因已經(jīng)被克隆并且進(jìn)行了測序。該成員中的兩種，即FGF-1與FGF-2已被賦予了許多名稱，但是最常用的分別稱作酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子。正常的基因產(chǎn)物影響了大多數(shù)由中胚層和神經(jīng)外胚層所產(chǎn)生的細(xì)胞一般的增殖能力。它們能夠誘導(dǎo)體內(nèi)的血管生成并且可以在早期發(fā)育中發(fā)揮重要的作用(Burges s，w.H.和Maciag，T.，生化回顧年報，58575-606，(1989))。
許多上面所鑒定的FGF家族的成員也可以結(jié)合到同樣的受體上，并且通過結(jié)合到這些受體上而誘導(dǎo)第二信使。
通過基因轉(zhuǎn)移已經(jīng)把編碼一種分泌型FGF-1的真核表達(dá)載體引入到豬動脈中。這一模型確定了位于體內(nèi)動脈內(nèi)壁的基因功能。在基因轉(zhuǎn)移21天后，F(xiàn)GF-1的表達(dá)誘導(dǎo)豬動脈內(nèi)膜加厚(Nabel，E.G.，等，自然，362844-6(1993))。這進(jìn)一步表明堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長與惡化，其中的生長與惡化不依賴于該因子在腫瘤血管生成中所起的作用，并且表明堿性成纖維細(xì)胞生長因子的釋放或分泌可能是這些作用所需要的(Morrison，R.S.，等，神經(jīng)科學(xué)研究雜志，34502-9(1993))。
已經(jīng)進(jìn)一步暗示出象堿性FGF這樣的成纖維細(xì)胞生長因子在體外卡波西肉瘤細(xì)胞的生長中起作用(Huang，Y.Q.，等，臨床研究雜志，911191-7(1993))。而且，在由噬菌體T7 RNA聚合酶所識別的轉(zhuǎn)錄啟動子的下游已克隆了編碼人的堿性成纖維細(xì)胞生長因子的cDNA序列。已經(jīng)表明由此得到的堿性成纖維細(xì)胞生長因子具有無法區(qū)別于人胎盤成纖維細(xì)胞生長因子在促有絲分裂活性(mitogenicity)、血纖蛋白溶酶原激活劑的合成與血管生成測定方面的生物活性(Squires，C.H.，等.生物化學(xué)雜志，26316297-302(1988))。
美國專利No.5，155,214公開了基本上純的哺乳動物的堿性成纖維細(xì)胞生長因子及其生產(chǎn)。該專利公開了牛與人的堿性成纖維細(xì)胞生長因子的氨基酸序列以及編碼牛物種的這一多肽的DNA序列。
最近發(fā)現(xiàn)FGF-9與FGF家族的其它成員間具有大約30％的序列相似性。該家族成員中的兩個半胱氨酸殘基與其它的共有序列在FGF-9的序列中也是完全保守的。人們發(fā)現(xiàn)FGF-9在其N末端沒有象在酸性與堿性FGF中的典型信號序列。但是，盡管FGF-9缺乏一種典型的信號序列FGF，人們發(fā)現(xiàn)在合成后它卻可以從細(xì)胞中分泌出來(Miyamoto，M.等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，13(7)4251-4259(1993))。而且，人們發(fā)現(xiàn)FGF-9刺激少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型2星形細(xì)胞祖細(xì)胞、BALB/c3T3與PC-12細(xì)胞的細(xì)胞生長，但卻不促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(Naruo，K.，等.生物化學(xué)雜志，2682857-2864(1993))。
堿性FGF與酸性FGF是細(xì)胞增殖，細(xì)胞活動性，分化與存活的有效的調(diào)節(jié)劑，并且影響來自于外胚層，中胚層與內(nèi)胚層的細(xì)胞類型。通過蛋白質(zhì)的純化鑒定了這兩類FGFs以及KGF和AIGF。但是，其它的四個成員作為癌基因而被分離，其中基因的表達(dá)局限于胚胎發(fā)育與某種類型的癌癥。已經(jīng)表明FGF-9是一種抗神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的促細(xì)胞分裂原。曾報道FGF家族的成員具有致癌的潛能。當(dāng)將FGF-9轉(zhuǎn)化到BALB/c3T3細(xì)胞中時，已經(jīng)表明FGF-9具有轉(zhuǎn)化的潛能(Miyamoto，M.，等，分子細(xì)胞生物學(xué)，13(7)4251-4259(1993))。
又被稱作FGF-8的雄激素誘導(dǎo)生長因子(AIGF)是從以睪酮刺激的小鼠乳房癌細(xì)胞(SC-3)的條件培養(yǎng)基中純化出來的。AIGF是特殊的一類FGF生長天子，它具有推定的信號肽并且與FGF家族的已知成員間享有30-40％的同源性。采用AIGF轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞顯示出對缺乏雄激素的SC-3細(xì)胞的生長具有顯著的刺激效應(yīng)。由于AIGF可以通過腫瘤細(xì)胞自身分泌出來，因此AIGF介導(dǎo)了SC-3細(xì)胞并且可能還有其它細(xì)胞的雄激素誘導(dǎo)的生長。
由于本發(fā)明的多肽的氨基酸序列與FGF家族其它成員的同源性，已經(jīng)推斷鑒定該多肽為FGF家族的一個成員。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了新的成熟多肽及其具有生物學(xué)活性并在診斷學(xué)或治療學(xué)上有用的片段，類似物與衍生物。本發(fā)明的多肽是人源的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子，該核酸分子包括mRNAs，DNAs，cDNAs.基因組DNA，以及它的反義類似物和其具有生物學(xué)活性并在診斷學(xué)或治療學(xué)上有用的片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了通過使用諸如在本發(fā)明的多肽的重組生產(chǎn)中用作試劑的克隆和表達(dá)質(zhì)粒的重組載體通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法，以及含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了一種利用該多肽或編碼該多肽的多核苷酸用于篩選其興奮劑(agonist)及其拮抗劑以及用于治療目的的方法，例如促進(jìn)傷口愈合，比如治愈燒傷與潰瘍，防止由于與中風(fēng)有關(guān)的神經(jīng)元的損傷并促進(jìn)神經(jīng)元的生長，防止皮膚老化與頭發(fā)脫落，刺激在早期胚胎中血管生成、中胚層誘導(dǎo)以及刺激四肢再生。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了抗這種多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了抗這種多肽的拮抗劑及其用于抑制這種多肽的作用的方法，例如在治療細(xì)胞轉(zhuǎn)化(如腫瘤)、減少結(jié)疤與治療血管過多的疾病方面。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了含有足夠長的核酸分子的核酸探針，該探針可以特異地雜交到編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸上。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了檢測與在本發(fā)明的核酸序列中的突變有關(guān)的疾病或疾病的易感性，以及檢測由該序列所編碼的多肽的過度表達(dá)的診斷測定方法。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種將這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸用于與科學(xué)研究，DNA的合成以及DNA載體的生產(chǎn)有關(guān)的體外目的的方法。
根據(jù)本文的教導(dǎo)，本發(fā)明的這些以及其它的方面對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言應(yīng)該是顯而易見的。
下面的附圖僅僅意味著是對本發(fā)明的具體實施方案的說明，而并不意味著以任何的方式限制本發(fā)明。


圖1示出了FGF-14的cDNA序列以及相應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸序列。起始的26個氨基酸殘基代表推定的前導(dǎo)序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了分離的核酸分子(多核苷酸)，該分子編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NOS2)的成熟多肽或者編碼由在1995年5月12日保藏于ATCC、保藏號為97148的克隆的cDNA所編碼的成熟多肽。
編碼本發(fā)明的FGF-14的多核苷酸最初從人小腦組織所得到的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。它在結(jié)構(gòu)上與成纖維細(xì)胞生長因子家族的所有成員均相關(guān)，并且含有一個編碼225個氨基酸的多肽的開放讀框，其中該多肽起始的26個氨基酸代表推定的信號序列，從而成熟多肽包含199個氨基酸。其中最為匹配的情況是1)在一段126個氨基酸序列的區(qū)域內(nèi)，與人FGF-9存在40％的相同性和61％的序列相似性；2)在一段126個氨基酸的區(qū)域內(nèi)，與大鼠FGF-9存在40％的相同性和61％的相似性；3)在一段148個氨基酸序列的范圍內(nèi)，與人KGF存在36％的相同性和57％的相似性。
FGF/HBGF家族的特征，GXLX(S，T，A，G)X6(D，E)CXFXE在本發(fā)明的多肽中是保守的(X代表任意氨基酸殘基；(D，E)代表或者為D或者為E殘基，X6代表任意6個氨基酸殘基)。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因組DNA與合成DNA，DNA可以是雙鏈或者是單鏈的。編碼成熟多肽的編碼序列可以與顯示在圖1中的編碼序列(SEQ ID NOS1)或者所保藏的克隆的編碼序列相同，或者由于遺傳密碼子的重復(fù)或簡并該序列可以是一個不同的編碼序列，但它編碼與圖1的DNA(SEQ ID NOS1)或所保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽(SEQ ID NOS2)或者編碼由所保藏的cDNA(s)編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列與附加的編碼序列，諸如前導(dǎo)或分泌序列或者蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(以及任選的附加的編碼序列)和非編碼序列如內(nèi)含子或者成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包括僅含有該多肽編碼序列的多核苷酸以及含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述的多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NOS2)的多肽的片段、類似物與衍生物，或者編碼由所保藏的克隆的cDNA(s)編碼的多肽的片段、類似物與衍生物。多核苷酸的變異體可以是該多核苷酸的天然發(fā)生的等位基因變異體，或者是多核苷酸的非天然發(fā)生的變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼如圖1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NOS2)或由所保藏的克隆的cDNA(s)編碼的相同成熟多肽的多核苷酸及其變異體，其中變異體編碼圖1的多肽(SEQ ID NOS2)或者由所保藏的克隆的cDNA(s)編碼的多肽的片段、衍生物或者類似物。核苷酸變異體包括缺失變異體，取代變異體以及添加或插入變異體。
如上文所示，多核苷酸可以具有圖1所示的編碼序列(SEQ ID NOS1)或者所保藏的克隆的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列。正如在本領(lǐng)域中已知的，等位基因變異體是多核苷酸序列的可選擇的形式，它可以具有一個或多個核苷酸的取代，缺失或添加，但它基本上不改變被編碼多肽的功能。
本發(fā)明也包括多核苷酸，其中可以在同一讀框內(nèi)將該成熟多肽的編碼序列融合到如下一個多核苷酸序列中，所述的多核苷酸序列協(xié)助多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)與分泌，例如一個前導(dǎo)序列，它作為控制多肽從細(xì)胞運(yùn)輸?shù)姆置谛蛄邪l(fā)揮作用。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種蛋白質(zhì)前體，并且它可以經(jīng)宿主細(xì)胞裂解前導(dǎo)序列以形成該多肽的成熟形式。多核苷酸也可以編碼一種為成熟蛋白加上附加的5’氨基酸殘基的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一種蛋白原并且是該蛋白的一種非活性形式。一旦序列原被裂解，活性成熟蛋白便保留下來。
因此，本發(fā)明的多核苷酸例如可以編碼一種成熟蛋白，或者編碼一種具有個序列原的蛋白，或者編碼一種具有序列原與前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，該標(biāo)記序列便于本發(fā)明的多肽純化。標(biāo)記序列可以是一個由PQE-9載體所提供的六組氨酸標(biāo)記物從而保證在細(xì)菌宿主的情況下與標(biāo)記物融合的成熟多肽的純化，或者例如當(dāng)使用哺乳動物宿主、例如COS-7細(xì)胞時，標(biāo)記序列可以是血凝素(HA)標(biāo)記物。HA標(biāo)記對應(yīng)于從流感血凝素蛋白得到的表位(Wilson，I.，等，細(xì)胞，37767(1984))。
術(shù)語“基因”是指涉及生產(chǎn)一個多肽鏈的DNA區(qū)段；它包括在編碼區(qū)之前與之后的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)與尾區(qū))以及在各個編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
全長的FGF-14基因的片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，以便于分離全長的基因并且分離與該基因具有高的序列相似性或相似的生物活性的其它基因。這種類型的探針優(yōu)選具有至少30個堿基并且可以含有例如50或更多個堿基。該探針也可以用于鑒定對應(yīng)于全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆以及含有完整的FGF-14基天的一個基因組克隆或多個克隆，其中完整的FGF-14基因包括調(diào)節(jié)區(qū)與啟動區(qū)，外顯子和內(nèi)含子。一個篩選的實例包括通過使用已知的DNA序列分離出FGF-14基因的編碼區(qū)以合成寡核苷酸探針。具有互補(bǔ)于本發(fā)明基因的序列的標(biāo)記寡核苷酸可以用于篩選人cDNA、基因組DNA或mRNA的文庫，從而測定與該探針雜交的文庫成員。
如果序列間存在至少70％、優(yōu)選至少90％且更優(yōu)選至少95％的相同性時，本發(fā)明進(jìn)一步涉及與上述序列雜交的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。文中所使用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指只有序列間存在至少95％且優(yōu)選至少97％的相同性時才發(fā)生雜交。在一個優(yōu)選的實施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保留了與由圖1的cDNAs(SEQID NO1)或保藏的cDNAs所編碼的成熟多肽同樣的生物功能或活性的多肽。
另一方面，多核苷酸可以含有至少20個堿基，優(yōu)選30個堿基并且更優(yōu)選至少50個堿基，它們可以和本發(fā)明的多核苷酸雜交并且與之具有相同性，并且如上所述可以保留或不保留活性。例如這樣的多核苷酸可以用作SEQ ID NO1的多核苷酸的探針，比如用于回收多核苷酸或用作診斷探針或PCR引物。
因此，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸具有至少70％的相同性、優(yōu)選至少90％的相同性且更優(yōu)選至少95％的相同性的多核苷酸及其片段，以及該多核苷酸所編碼的多肽，其中的片段具有至少30個堿基并且優(yōu)選至少50個堿基。
本文所涉及的保藏物將按照關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行保存。這些保藏物僅為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便而提供，不是對按35 U.S.C.§112要求保藏物的許可。包含在保藏材料中的多核苷酸的序列及其所編碼的多肽的氨基酸序列在本文中作為參考而附入，并且在與本文序列描述有沖突的任意的一種情況下起決定作用。制造、使用或銷售該保藏材料需要許可證，并且此處不頒發(fā)這樣的許可證。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)或者具有由保藏的cDNA所編碼的氨基酸序列的FGF多肽以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)涉及圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽時，術(shù)語“片段”、“衍生物”與“類似物”是指基本上保留了該多肽的同樣的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，一種類似物包括可以通過該蛋白原部分的裂解而激活從而產(chǎn)生有活性的成熟多肽的蛋白原。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)一種多肽，其中一個或多個氨基酸殘基被一個保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選一個保守的氨基酸殘基)所取代并且被取代的氨基酸殘基可以是或可以不是由該遺傳密碼所編碼，或者(ii)一種多肽，其中一個或多個氨基酸殘基包含一個取代基，或者(iii)一種多肽，其中，成熟多肽與另一種化合物，諸如一種提高該多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)一種多肽，其中成熟多肽與附加的氨基酸融合，諸如融合一個前導(dǎo)或分泌序列或者一個用于該成熟多肽的純化的序列或者一個蛋白原序列。從本文的教導(dǎo)出發(fā)，這樣的片段、衍生物與類似物視為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的范圍內(nèi)的。
本發(fā)明的多肽與多核苷酸優(yōu)選以一種分離的形式而提供，并且優(yōu)選將其純化成均一物質(zhì)。
術(shù)語“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如如果該物質(zhì)是天然存在的，即指天然環(huán)境)中分離出該物質(zhì)。例如，一種存在于活體動物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分離的，但是從天然系統(tǒng)中一些或所有的共存物質(zhì)里分離出的同樣的多核苷酸或DNA或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是一個載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是一種組合物的一部分，并且如果該載體或組合物并非是其天然環(huán)境的一部分，則其仍然是分離的。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽(特別是成熟多肽)以及與SEQ IDNO2的多肽具有至少70％的相似性(優(yōu)選至少70％的相同性)的多肽、更優(yōu)選與SEQ ID NO2的多肽具有至少90％的相似性(更優(yōu)選至少90％的相同性)的多肽、并且特別優(yōu)選與SEQ ID NO2的多肽具有至少95％的相似性(特別優(yōu)選至少95％的相同性)的多肽，本發(fā)明的多肽也包括該多肽的部分，其中該多肽的這些部分通常含有至少30個氨基酸并且更優(yōu)選至少50個氨基酸。
正如在本領(lǐng)域中已知的，兩種多肽之間的“相似性”是通過把一個多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與第二個多肽的序列進(jìn)行比較而測定的。
通過肽合成，本發(fā)明多肽的片段或部分可以用于生產(chǎn)相應(yīng)的全長的多肽；因此，該片段可以用作生產(chǎn)全長多肽的中間體。本發(fā)明的多核苷酸的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長的多核苷酸。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞可以是用本發(fā)明的載體進(jìn)行遺傳工程化的(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，其中載體例如可以是克隆載體或表達(dá)載體，載體例如可以呈質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等的形式。改造的宿主細(xì)胞可以在經(jīng)改良以適于激活啟動子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增FGF基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(諸如溫度、pH及其它)是為了表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞以前所采用的條件，并且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來講是顯而易見的。
通過重組技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸可以用于生產(chǎn)多肽。因此，例如該多核苷酸序列可以包含在表達(dá)多肽的多種表達(dá)載體中的任意一種中，具體而言如載體或質(zhì)粒中。這樣的載體包括染色體、非染色體及合成DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；質(zhì)粒與噬菌體DNA結(jié)合所得到的載體、病毒DNA(諸如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒與假狂犬病)。但是，只要任意一種其它的載體或質(zhì)粒在宿主中可以復(fù)制并且存活便可以使用它們。
可通過許多種方法把合適的DNA序列插入到載體中。一般而言，通過本領(lǐng)域已知的方法可以把DNA序列插入到一個合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上。該方法及其它方法被視為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的范圍之內(nèi)。
表達(dá)載體中的DNA序列可操作地與一個合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動子)連接以指導(dǎo)mRNA的合成。作為上述啟動子有代表性的實例可以提到的有LTR或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體λPL啟動子以及其它已知調(diào)控原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中基因表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體也含有一個用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)與一個轉(zhuǎn)錄終止子。載體也可以包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適序列。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一種為轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的篩選而提供一種表型性狀的基因，諸如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者諸如在大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
含有如上所述的合適的DNA序列以及一個合適的啟動子或調(diào)控序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化一種合適的宿主從而允許該宿主表達(dá)蛋白。作為合適宿主有代表性的實例可以提到的有細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏桿菌，鏈霉菌屬；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅S2與苜蓿銀紋夜蛾Sf9；動物細(xì)胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等等。根據(jù)本文的教導(dǎo)，選擇合適的宿主被認(rèn)為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的范圍之內(nèi)。
更具體地講，本發(fā)明也包括含有一個或多個如上廣義所述的序列的重組構(gòu)建體。構(gòu)建體包括將本發(fā)明的序列以正向或逆向插入其中的載體，如質(zhì)?；虿《据d體。在這一實施方案一個優(yōu)選方面，構(gòu)建體進(jìn)一步包括可操作地與序列連接的調(diào)節(jié)序列，例如啟動子。許多合適的載體與啟動子是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的且可以通過商業(yè)途徑得到。下面的載體以舉例的方式提供細(xì)菌pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pBSKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)；真核細(xì)胞pWLneo，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。但是，只要任意一種其它的質(zhì)粒或載體在該宿主中可以復(fù)制并存活便可以使用它們。
采用具有選擇標(biāo)記的CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它載體，可以從任意一種所需要的基因中篩選出啟動子區(qū)域。兩個合適的載體為pKK232-8與pCM7。特別指出的細(xì)菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PL和trp。真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期與晚期SV40，來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體與啟動子在本領(lǐng)域普通的技術(shù)水平上是可以完成的。
在更進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞)，或是低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔可以實現(xiàn)該構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的引入(Davies，L.，Dibner.M.，Battey，I.，分子生物學(xué)基本方法，(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以以常規(guī)的方式使用從而生產(chǎn)由該重組序列所編碼的基因產(chǎn)物。另一方面，本發(fā)明的多肽也可以通過常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)。
在合適的啟動子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳動物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或它細(xì)胞中表達(dá)。采用從本發(fā)明的DNA構(gòu)建體得到的RNAs，也可通過無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)該蛋白。用于原核與真核宿主的合適的克隆與表達(dá)載體在Sambrook等人的《分子克隆實驗室手冊第二版)》(紐約冷泉港，1989)中進(jìn)行了描述，此處以參考文獻(xiàn)引用其公開內(nèi)容。
通過向載體中插入一個增強(qiáng)子序列可提高通過高等真核生物對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子為DNA的順式作用元件，一般大約從10至300bp，它作用于啟動子以提高其轉(zhuǎn)錄。它的例子包含有位于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100至270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子，位于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子與腺病毒增強(qiáng)子。
一般而言，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)與允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記(例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母TRP1基因)以及從一個高度表達(dá)的基因中得到的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這些啟動子可以從編碼如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)這樣的糖酵解酶、α因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白等的操縱子中得到。異源結(jié)構(gòu)序列以合適的方式與翻譯起始和終止序列，以及優(yōu)選地一個能夠指導(dǎo)被翻譯的蛋白分泌至周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列進(jìn)行裝配。異源序列可以任選地編碼一種融合蛋白，該蛋白含有一個N-末端鑒定肽，其中的鑒定肽賦予了表達(dá)的重組產(chǎn)物所需要的特征，例如穩(wěn)定性或易于純化的特性。
通過將編碼一種所需蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始與終止信號以可操縱的閱讀方式和一個功能啟動子一起插入，可以構(gòu)建對細(xì)菌的使用而言有用的表達(dá)載體。該載體將包括一個或多個表型選擇標(biāo)記和一個復(fù)制起點(diǎn)，以確保維持該載體并且如果需要的話可以保證在宿主中進(jìn)行擴(kuò)增。用于轉(zhuǎn)化的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及屬于假單胞桿菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬中的許多種，當(dāng)然其它種的生物也可以采用。
作為代表性但卻無限制性的例子，對細(xì)菌的使用而言有用的表達(dá)載體可以包括一個選擇標(biāo)記和來自含有所熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這些商購載體包括如pKK223-3(Phamacia精細(xì)化學(xué)公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“骨架”部分與一種合適的啟動子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相結(jié)合。
進(jìn)行合適的宿主株系的轉(zhuǎn)化并且該宿主株系生長至合適的細(xì)胞密度后，通過合適的方法(例如溫度變動或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動子并且再將細(xì)胞培養(yǎng)一段時間。
細(xì)胞通常經(jīng)離心收獲，通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行破碎，并且保留得到的粗提物以便進(jìn)一步的純化。
在蛋白表達(dá)中所使用的微生物細(xì)胞可以通過任意一種方便的方法進(jìn)行破碎，該方法包括冷凍-融化循環(huán)，超聲處理，機(jī)械破碎，或者使用細(xì)胞裂解劑。
各種哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)重組蛋白。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的實例包括由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))所述的猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系以及可以表達(dá)相容載體的其它細(xì)胞系，例如C127，3T3，CHO，HeLa與BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動子和增強(qiáng)子、以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。從SV40病毒基因組中得到的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)，早期啟動子，增強(qiáng)子，剪接與聚腺苷酸化位點(diǎn)可以用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
本發(fā)明的多肽可以通過迄今為止所使用的方法從重組的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化，該方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析與凝集素層析。如果需要的話，在完成該成熟蛋白的構(gòu)型中可以采用蛋白重折疊步驟。最后，可以采用高效液相層析(HPLC)用于最終的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是一種天然純化的產(chǎn)物，或者是一種化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或者是從原核或真核宿主(例如通過細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng))經(jīng)重組技術(shù)制備的。根據(jù)在重組生產(chǎn)方法中所使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化或者可以是非糖基化的。該多肽也可以包含一個起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的多肽由于具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的能力，所以可以用于刺激由不同的疾病狀況(如血栓、動脈硬化)以及其它的心血管狀況所造成的局部缺血組織再形成血管的治療中。這些多肽也可以用于促進(jìn)血管生成與四肢再生。
由于該多肽對于不同來源的不同細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞)是促分裂的并且因此有利于所損傷或患病組織的修復(fù)或替換，所以該多肽也可以用于治療由于損傷、燒傷、手術(shù)后組織修復(fù)和潰瘍所造成的傷口。
本發(fā)明的多肽也可以用于刺激神經(jīng)元的生長并且用于治療和預(yù)防與中風(fēng)有關(guān)的以及在某種神經(jīng)紊亂或神經(jīng)變性狀況下(如阿爾茨海默病，帕金森氏病)發(fā)生的神經(jīng)元的損傷和與AIDS有關(guān)的綜合癥。FGF-14具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長的能力，因此它們可以用于刺激骨骼和牙周的再生并且協(xié)助組織移植或骨骼移植。
本發(fā)明的多肽通過促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的生長也可以用于防止由太陽燒傷所造成的皮膚老化。
由于FGF家族的成員可以激活毛發(fā)生成細(xì)胞并且促進(jìn)黑素細(xì)胞的生長，所以FGF-14多肽也可以用于防止頭發(fā)脫落。與該方法一致，當(dāng)把本發(fā)明的多肽與其它的細(xì)胞因子結(jié)合使用時，該多肽也可以用于促進(jìn)造血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的生長與分化。
FGF-14多肽也可以用于在移植前維持器官或者用于支持初級組織的細(xì)胞培養(yǎng)。
本發(fā)明的多肽也可以用于誘導(dǎo)中胚層來源的組織在早期胚胎中進(jìn)行分化。
根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種利用該多肽或者編碼該多肽的多核苷酸的方法，它們可作為與科學(xué)研究、DNA的合成、DNA載體的生產(chǎn)有關(guān)的體外目的中的研究試劑，以用于開發(fā)治療人類疾病的治療學(xué)和診斷學(xué)方法。
本發(fā)明提供了一種鑒定本發(fā)明多肽的受體的方法。編碼受體的基因可以通過許多為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行鑒定，例如配體淘選與FACS分選(Coligan，等，免疫學(xué)通用方案，1(2)，第五章，(1991))。優(yōu)選采用表達(dá)克隆法，從對該多肽有反應(yīng)的細(xì)胞、例如已知對FGF家族的蛋白含有多個受體的NIH3T3細(xì)胞和SC-3細(xì)胞中制備聚腺苷酸化的RNA，并且把從該RNA產(chǎn)生的cDNA文庫分割成多個集合體并且將其用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或其它對該多肽無反應(yīng)的細(xì)胞。將生長于玻璃載玻片上的轉(zhuǎn)染細(xì)胞與標(biāo)記后的本發(fā)明的多肽接觸，可通過許多方法，包括碘化作用或引入一個位點(diǎn)特異性蛋白激酶的識別位點(diǎn)來標(biāo)記本發(fā)明的多肽。
固定與溫育后，對玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒定陽性集合體并且采用一種重復(fù)亞合并與再篩選方法來制備和再轉(zhuǎn)染亞集合體，最終得到一種編碼推定的受體的單一克隆。
作為一種用于受體鑒定的替代方法，標(biāo)記的多肽可以和細(xì)胞膜或表達(dá)該受體分子的提取物的制劑光親和連接。交聯(lián)物質(zhì)通過PAGE分析進(jìn)行分辨并且在X-光膠片上曝光?？梢郧邢潞性摱嚯氖荏w的標(biāo)記復(fù)合物，分解成肽片段并且使之進(jìn)行蛋白微量測序。從微量測序得到的氨基酸序列可以用來設(shè)計一套簡并的用于篩選cDNA文庫的寡核苷酸探針，從而鑒定編碼該推定受體的基因。
本發(fā)明還涉及一種篩選化合物的方法，以便于鑒定那些調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽的作用的物質(zhì)。這種測定的一個實例包括在成纖維細(xì)胞可以正常增殖的細(xì)胞培養(yǎng)條件下將一種哺乳動物成纖維細(xì)胞、本發(fā)明的多肽、待篩選的化合物和3[H]胸苷結(jié)合。對照測定可以在缺少待篩選化合物的條件下進(jìn)行，并且將其與在該化合物存在下成纖維細(xì)胞增殖的數(shù)量進(jìn)行比較，從而通過測定每種情況下3[H]胸苷的吸收以確定該化合物是否促進(jìn)增殖。成纖維細(xì)胞的增殖通過可以測量3[H]胸苷摻入的液閃計數(shù)進(jìn)行測定。
按照另一種方法，在該化合物存在下采用被標(biāo)記的本發(fā)明的多肽來溫育表達(dá)本發(fā)明多肽的受體的哺乳動物細(xì)胞或膜制劑，于是可以測定該化合物促進(jìn)或阻遏這一反應(yīng)的能力。另一方面，在測定了待篩選的化合物與FGF-14受體之間的反應(yīng)之后再測定一種已知的第二信使系統(tǒng)的反應(yīng)，并且測定該化合物結(jié)合到該受體上以及刺激第二信使反應(yīng)的能力，從而確定該化合物是否是一種潛在的興奮劑或拮抗劑。上述第二信使系統(tǒng)包括cAMP鳥苷酸環(huán)化酶，離子通道，酪氨酸磷酸化作用或磷酸肌醇水解作用，但是該系統(tǒng)并不局限于此。
拮抗劑化合物的實例包括抗體或在某些情況下包括寡核苷酸，它們結(jié)合到本發(fā)明的多肽的受體上但卻不刺激第二信使的反應(yīng)，或者會結(jié)合到FGF-14多肽自身上。另一方面，一種潛在的拮抗劑可以是該多肽的一種突變異體形式，它結(jié)合到受體上但卻不刺激第二信使的反應(yīng)并且因此有效地阻止了該多肽的作用。
針對FGF-14基因及其基因產(chǎn)物的另一種拮抗劑化合物為一種采用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。通過三股螺旋形成反義DNA或RNA，反義技術(shù)可以用于控制基因的表達(dá)，上述兩種方法均是建立在一種多核苷酸結(jié)合到DNA或RNA的基礎(chǔ)上的。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用于設(shè)計一種反義RNA寡核苷酸，其長度從大約10至40個堿基對。將一種DNA寡核苷酸設(shè)計成互補(bǔ)于涉及轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域(三股螺旋一參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456(1988)；與Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，從而阻止轉(zhuǎn)錄以及本發(fā)明多肽的生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)雜交到mRNA上并且阻止mRNA分子翻譯成多肽(反義-Okano，神經(jīng)化學(xué)雜志，56560(1991)；作為基因表達(dá)的反義抑制劑的寡脫氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。還可以把上述寡核苷酸傳遞至細(xì)胞，從而該反義RNA或DNA可以在體內(nèi)表達(dá)以抑制多肽的生產(chǎn)。
潛在的拮抗劑包括一些小分子，這些小分子可以結(jié)合多肽的活性位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)或多肽的其它生長因子結(jié)合位點(diǎn)從而阻止多肽的正常生物學(xué)活性。小分子的實例包括但不限于小肽或類肽分子。
拮抗劑化合物可以用于抑制本發(fā)明多肽的細(xì)胞生長與增殖作用對贅生性細(xì)包與組織的影響，即刺激腫瘤的血管生成，并且因此而阻滯或防止了異常細(xì)胞的生長與增殖，比如腫瘤的形成或生長。
拮抗劑也可以用于預(yù)防血管過多的疾病，并且阻止了囊外白內(nèi)障外科手術(shù)后上皮晶狀體細(xì)胞的增殖。在如氣囊(balloon)血管成形術(shù)之后再狹窄的病例中可能也需要阻止本發(fā)明多肽的促細(xì)胞分裂活性。
拮抗劑也可以用于防止在傷口愈合期間傷疤組織的生長。
拮抗劑可以與一種如下所述的藥物學(xué)可接受的載體一起用于一種組合物中。
本發(fā)明的多肽、興奮劑和拮抗劑可以結(jié)合一種合適的藥物載體而使用，從而形成一種腸胃外給藥的藥物組合物。這種組合物包括一種治療上有效量的多肽、興奮劑或拮抗劑以及一種藥用可接受的載體或賦形劑。這樣的一種載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其混合物。該配方應(yīng)當(dāng)適合于給藥的方式。
本發(fā)明也提供了一種藥物包裝或試劑盒，它們包括一個或多個容器，該容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分。與該容器相伴的可以是一則以管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式存在的通知，該通知反映出生產(chǎn)、使用或銷售機(jī)構(gòu)對人體給藥的批準(zhǔn)。此外，該藥物組合物可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
該藥物組合物可以按照常規(guī)的方式給藥，如通過口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或者真皮內(nèi)的途徑。該藥物組合物以對治療和/或預(yù)防具體癥狀有效的量進(jìn)行給藥。一般而言，該組合物以至少約10μg/kg體重的量進(jìn)行給藥，并且在大多數(shù)情況下該組合物的給藥量將不超過約8mg/kg體重/天。在大多數(shù)情況下考慮到給藥的途徑、癥狀等，該劑量從每天約10μg/kg體重至約1mg/kg體重。在局部給藥的特殊情況下，給藥劑量優(yōu)選從約0.1μg至9mg/cm2。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多肽以及同為多肽的興奮劑(agonist)和拮抗劑化合物也可以通過在體內(nèi)表達(dá)所述多肽而使用，這通常稱作“基因治療”。
因此，例如可以采用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在體外工程化來自患者細(xì)胞，隨后將工程化的細(xì)胞提供給待采用該多肽治療的患者。上述方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，可以通過本領(lǐng)域已知的方法、采用一種含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒來工程化細(xì)胞。
類似地，為了在體內(nèi)表達(dá)多肽，例如可以通過本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)工程化細(xì)胞。正如在本領(lǐng)域已知的，為了在體內(nèi)工程化細(xì)胞并且在體內(nèi)表達(dá)多肽，可以給予患者一種生產(chǎn)含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞。從本發(fā)明的教導(dǎo)出發(fā)，通過上述方法給予本發(fā)明的一種多肽的這些或者其它的方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的。例如，除了逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒以外，用于工程化的細(xì)胞的表達(dá)載體還可以是如一種腺病毒，它可以在與一種合適的輸送載體結(jié)合后用于在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
可以得到上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney小鼠白血病病毒，脾壞死病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，長臂猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生性肉瘤病毒與乳房腫瘤病毒。在一個具體的實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體是從Moloney小鼠白血病病毒得到的。
載體包含一個或者多個啟動子?？梢圆捎玫暮线m的啟動子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動子；以及在Miller，等，生物技術(shù)，第7卷，第9期，第980-990頁(1989)中所描述的人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子，或者任何一種其它的啟動子(例如細(xì)胞啟動子，如真核細(xì)胞啟動子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。其它可以采用的病毒啟動子包括但不限于腺病毒啟動子，胸苷激酶(TK)啟動子及B19細(xì)小病毒啟動子。根據(jù)本文中的教導(dǎo)，選擇合適的啟動子對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列受到一個合適的啟動子的控制?？梢圆捎玫暮线m的啟動子包括但不限于腺病毒啟動子，如腺病毒主要晚期啟動子；或者異源啟動子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；誘導(dǎo)型啟動子，如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒的胸苷激酶啟動子，如單純皰疹胸苷激酶啟動子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上述修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；以及人生長激素啟動子。啟動子也可以是控制編碼該多肽的基因的天然啟動子。
采用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系從而形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞的實例包括但不限于PE501，PA317，φ-2，φ-AM，PA12，T19-14X,VT-19-17-H2，φCRE，φCRIP，GP+E-86，GP+envAm12以及在Miller，人類基因治療，第1卷，第5-14頁(1990)中所描述的DAN細(xì)胞系，其中該文獻(xiàn)以其全文引入本文以供參考。載體可以通過本領(lǐng)域已知的任何一種方法來轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，這些方法包括但不限于電穿孔，采用脂質(zhì)體以及CaPO4沉淀。在另一種方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包埋在脂質(zhì)體中，或者被偶聯(lián)到脂類上，然后再將該載體引入宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生含有編碼該多肽的核酸序列的侵染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，然后可以使用這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?；蛟隗w外或在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼該多肽的核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚干細(xì)胞，胚胎癌性細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的基因作為一種診斷分析的一部分的用途，從而檢測疾病或疾病易感性，其中的疾病與在編碼本發(fā)明多肽的核酸序列中存在的突變有關(guān)。
在本發(fā)明的基因中個體攜帶的突變可以通過許多技術(shù)在DNA水平上進(jìn)行檢測。用于診斷的核酸可以從病人的細(xì)胞中得到，如來自血液、尿液、唾液、活組織檢查與尸體剖檢材料的細(xì)胞?；蚪MDNA可以直接用于檢測或者在分析之前可以通過采用PCR(Saiki等，自然，324163-166(1986))進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以用于同樣的目的。作為一個實例，互補(bǔ)于編碼本發(fā)明的多肽的核酸的PCR引物可以用于測定和分析突變。例如，與正常的基因型比較，通過擴(kuò)增產(chǎn)物大小的變化可以檢測缺失和插入。通過把擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的RNA或者放射性標(biāo)記的反義DNA序列雜交便可以測定點(diǎn)突變。通過RNase A消化或通過解鏈溫度的差異，完全配對序列可以同錯配的雙螺旋區(qū)別開來。
基于DNA序列差異的基因檢驗可以通過檢測DNA片段在含有或者不含變性劑的凝膠中的電泳遷移率的變化來實現(xiàn)。小的序列缺失與插入可以通過高分辨率的凝膠電泳用肉眼觀測。不同序列的DNA片段可以在變性的甲酰胺梯度凝膠上進(jìn)行區(qū)分，其中根據(jù)DNA片段的特殊解鏈溫度或部分解鏈溫度、不同DNA片段的遷移率被阻滯在凝膠不同的位置上(參見例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
通過如RNase和S1保護(hù)的核酸酶保護(hù)分析或化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，PANS，美國，854397-4401(1985))也可以揭示在特定位置上的序列變化。
因此可以通過如雜交，RNase保護(hù)，化學(xué)裂解，直接的DNA測序或者使用限制性酶(例如，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法這些方法來實現(xiàn)特定DNA序列的檢測。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測序外，突變也可以通過原位分析進(jìn)行檢測。
本發(fā)明也涉及一種用于檢測在不同組織中FGF-14蛋白的變化水平的診斷分析，這是由于與正常對照組織樣品相比該蛋白的過量表達(dá)可以檢測出存在異常細(xì)胞增殖，例如腫瘤。用于檢測從宿主得到的樣品中的蛋白含量的分析方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并且包括放射免疫測定、競爭結(jié)合測定、Western印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定和“夾心”測定。酶聯(lián)免疫吸附測定(Coligan，等，免疫學(xué)通用方案，1(2)，第六章，(1991))最初包括制備一種對本發(fā)明多肽的抗原特異的抗體，其優(yōu)選為一種單克隆抗體。此外制備一種抗該單克隆抗體的報道抗體。將該報道抗體結(jié)合到一個可檢測的試劑上，如放射性、熒光性或在本實施例中為辣根過氧化物酶上。將從宿主中取樣并在一種結(jié)合樣品中的蛋白的固相載體如聚苯乙烯平皿上進(jìn)行溫育。然后通過用一種非特異的蛋白牛血清白蛋白的溫育來覆蓋平皿上任何游離的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。接下來，在該單克隆抗體結(jié)合到已附著在聚苯乙烯平皿上的任何本發(fā)明多肽的期間內(nèi)，在平皿上溫育該單克隆抗體。用緩沖液洗去所有來結(jié)合的單克隆抗體。馬上將連接到辣根過氧化物酶上的報道抗體放置在平皿上，于是使該報道抗體結(jié)合到已和感興趣的蛋白結(jié)合的任何單克隆抗體上。
然后洗去未附著的報道抗體。隨后把過氧化物酶的底物加入平皿中，并且與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，在給定的時間段內(nèi)的顯色量是對存在于給定體積的病人樣品中的本發(fā)明多肽的量的測量值。
可以采用一種競爭測定，其中把對本發(fā)明的多肽特異的抗體結(jié)合到固相載體上，并把標(biāo)記的FGF-13和從宿主得到的樣品引入該固相載體，然后所檢測的標(biāo)記的總量例如可以通過液閃計數(shù)與該樣品中本發(fā)明多肽的量相互關(guān)聯(lián)。
“夾心”測定類似于酶聯(lián)免疫吸附測定。在“夾心”測定中，將本發(fā)明的多肽引入固相載體并結(jié)合到已附著在該固相載體的抗體上，然后將第二抗體結(jié)合到感興趣的多肽上。隨后把已被標(biāo)記并且特異于第二抗體的第三抗體引入固相載體并結(jié)合到該第二抗體上，之后可以定量測定其總量。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列特異地靶向位于單個的人染色體上的特定位置并能與之雜交。此外，現(xiàn)在需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前，僅有少數(shù)幾種以實際的序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)為基礎(chǔ)的染色體標(biāo)記試劑可以用于標(biāo)記染色體的位置。本發(fā)明的DNA染色體作圖是將這些序列和疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)的重要的第一步。
簡而言之，通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選10-25bp)便可以把序列定位到染色體上。采用3’未翻譯區(qū)域的計算機(jī)分析可以快速地選擇引物，其中引物不應(yīng)跨越超過基因組DNA上的一個外顯子，否則使得擴(kuò)增方法復(fù)雜化。然后采用這些引物用于PCR篩選含有單個的人染色體的體細(xì)胞雜交體。只有那些含有與該引物對應(yīng)的人基因的雜交體才會生產(chǎn)擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜交體的PCR作圖是將一個特定的DNA定位于特定的染色體上的快速程序。根據(jù)本發(fā)明采用同樣的寡核苷酸引物，用來自于特定染色體或者大基因組克隆集合體的一組片段、按照類似方式可以實現(xiàn)亞定位(sublocalization)?？梢灶愃频赜糜趯θ旧w作圖的其它的作圖策略包括原位雜交，用標(biāo)記的經(jīng)流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及通過雜交進(jìn)行預(yù)選，從而構(gòu)建出染色體特異性的cDNA文庫。
cDNA克隆與一個中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來實現(xiàn)一步法準(zhǔn)確染色體定位。該技術(shù)可以采用50或60個堿基長短的cDNA。關(guān)于該技術(shù)的綜述參閱Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦一個序列已定位到一個準(zhǔn)確的染色體位置，則染色體上該序列的物理位置可與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)例如可在V.McKusick，人類的孟德爾遺傳中找到(可以通過Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)文庫聯(lián)機(jī)得到)。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)來鑒定基因與已定位到相同染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接下來需要測定在受影響的和未受影響的個體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果突變是在一些或所有的受影響個體中觀察到的、但是又沒有在任何一個正常個體中被觀察到的話，那么該突變可能是疾病的病原體。
根據(jù)物理作圖和遺傳作圖技術(shù)目前的分辨率，一個被準(zhǔn)確定位到與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA可以是50-500個潛在的病原(causative)基因中的一種(其中假定有1兆堿基的作圖分辨率且每20kb為一個基因)。
多肽、其片段或該多肽的其它衍生物或類似物、或者表達(dá)上述物質(zhì)的細(xì)胞可以用作生產(chǎn)其抗體的免疫原。這些抗體可以是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合，單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用于生產(chǎn)這些抗體和片段。
針對相應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽而產(chǎn)生的抗體可以通過將該多肽直接注射人動物體內(nèi)或者通過將該多肽向動物給藥來得到，其中的動物優(yōu)選非人類。然后，如此得到的抗體會結(jié)合到該多肽上。通過這種方式，即使是僅僅編碼該多肽的一個片段的序列也可用于產(chǎn)生能結(jié)合整個天然多肽的抗體。然后，該抗體可以用于從表達(dá)該多肽的組織中分離這種多肽。
為了制備單克隆抗體，可以采用任何一種通過連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler與Milstein，1975，自然，256495-497)，三體雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)，472)以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，等，1985，單克隆抗體與癌癥治療，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以將用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)進(jìn)行修改從而生產(chǎn)出針對本發(fā)明免疫原性多肽制品的單鏈抗體。也可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠來表達(dá)針對本發(fā)明免疫原性多肽制品的人源化抗體。
本發(fā)明將參照下面的實施例進(jìn)一步加以說明；但是，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明并不局限于這些實施例。除非另作聲明的以外，所有的份或量均為重量。
為了利于理解以下的實施例，現(xiàn)敘述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！蓖ㄟ^一個在前的小寫p和/或跟隨幾個大寫字母和/或數(shù)字加以命名。本文中的起始質(zhì)?；蛘呖梢酝ㄟ^商業(yè)途徑得到或在不受限制的基礎(chǔ)上公眾可得到，或者可以根據(jù)已公開的方法從可得到的質(zhì)粒中構(gòu)建出來。此外，對于與那些所述等價的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的并且對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用一種僅對DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多種限制性酶可以通過商業(yè)途徑得到，并且其反應(yīng)條件、輔因子和其它使用要求對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。為了分析目的，通常把1μg的質(zhì)粒或DNA片段與溶于約20μl緩沖溶液的約2單位的酶一起使用。為了分離用于質(zhì)粒構(gòu)建的DNA片段，通常在一個更大的體積內(nèi)用20至250單位的酶消化5至50μg的DNA。針對具體的限制性酶而言，合適的緩沖溶液和底物的量是由生產(chǎn)者規(guī)定的。通常采用在37℃下約1小時的溫育時間，但是該時間可以根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)者的指示而變化。在消化后，反應(yīng)混合物直接在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳以分離出所需的片段。
采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行裂解片段的大小分離。
“寡核苷酸”或指一種單鏈多脫氧核苷酸，或指可以通過化學(xué)合成的兩條互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一種激酶存在下以ATP添加一個磷酸時，該寡核苷酸將不會連接到另一個寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到未被去磷酸化的片段上。
“連接”是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，出處同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的緩沖液和條件、每0.5μg約等摩爾量的待連接DNA片段10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)來實現(xiàn)連接。
除非另有說明，按Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實施例1FGF-14蛋白質(zhì)的細(xì)菌表達(dá)與純化編碼FGF-14 ATCC # 97148的DNA序列是采用與加工后的蛋白(減去信號肽序列)的5’序列和對應(yīng)于該基因3’的載體序列相對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行起始擴(kuò)增的。與該基因相對應(yīng)的添加的核苷酸可以加入到5’和3’序列中。5’寡核苷酸引物具有序列5’ GCCAGAGCATGCAGCGGCGCGTGTGTCCCCGC 3’(SEQ ID NO3)，并且含有一個SphI限制性酶的位點(diǎn)。3’序列為5’GCCAGAAGATCTGGGGGCAGGGGGACTGGAAGG 3’(SEQ ID NO4)，它含有互補(bǔ)于BgIII位點(diǎn)的序列并且后跟FGF-14編碼序列的21個核苷酸。
限制性酶的位點(diǎn)與在細(xì)菌表達(dá)載體pQE70(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA91311)上的限制性酶的位點(diǎn)對應(yīng)。pQE-70編碼抗生素抗性(Ampr)，一個細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(ori)，一個IPTG-可調(diào)節(jié)的啟動子操縱基因(P/O)，一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，一個6-組氨酸標(biāo)記物和限制性酶位點(diǎn)。然后用NcoI和BgIII消化pQE-70。將擴(kuò)增的序列連接到pQE-70上，并且將其插入含有編碼組氨酸標(biāo)記物和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列的框架中。然后，通過在Sambrook.J.等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989)中所描述的方法，把該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep 4(Qiagen，Inc.)。M15/rep 4含有質(zhì)粒pREP4的多個拷貝，其中該質(zhì)粒表達(dá)lacI阻抑物并且也具有卡那霉素抗性(Kanr)。轉(zhuǎn)化體通過其在LB平板上生長的能力而加以鑒定，并且篩選出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。分離質(zhì)粒DNA并且通過限制酶切分析加以證實。將含有所需構(gòu)建體的克隆以液體培養(yǎng)、在補(bǔ)充有Amp(1 00 μg/m1)和Kan(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基上培育過夜(O/N)。按照1100至1250的比例將O/N培養(yǎng)物用于接種大的培養(yǎng)物。將細(xì)胞培育至光密度600(O.D.600)介于0.4與0.6之間。然后加入IPTG(“異丙基-B-D-巰基半乳糖吡喃糖苷”)至終濃度為1mM。IPTG通過滅活lacI阻抑物、啟動P/O進(jìn)行誘導(dǎo)從而提高基因表達(dá)。將細(xì)胞再培育3至4小時，然后通過離心收集該細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解在6摩爾鹽酸胍的離液劑中。澄清后，通過鎳-螯合柱層析、在允許含有6-組氨酸標(biāo)記物的蛋白緊密結(jié)合的條件下，從該溶液中提純?nèi)芙獾腇GF-14(Hochuli，E.等，層析雜志，411177-184(1984))。該蛋白以6摩爾鹽酸胍、pH5.0從柱中洗脫，并且為了使之復(fù)性將洗脫液調(diào)節(jié)到3摩爾鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10毫摩爾谷胱甘肽(還原型)與2毫摩爾谷胱甘肽(氧化型)。在該溶液中溫育12小時之后將該蛋白對10毫摩爾的磷酸鈉透析。
實施例2采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)FGF-14采用與基因的5’和3’序列對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物來擴(kuò)增編碼全長FGF-14蛋白的DNA序列，ATCC#97148。
FGF-145’引物具有針對pA2載體的序列5’CTAGTGGATCCCATCATGGCGGCGCTGGCCAGT3’(SEQ ID NO5)，并且它含有一個其后跟隨了4個核苷酸的BamHI限制性酶位點(diǎn)(以黑體書寫)，這4個核苷酸類似于在真核細(xì)胞中用于起始翻譯的有效信號(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950(1987))，而它僅位于該基因前18個核苷酸之后(用于翻譯的起始密碼子“ATG”下已被劃線)。對于pA2gp載體而言，5’引物具有序列5’CGACTGGATCCCCAGCGGCGCGTGTGTCCC3’(SEQ ID NO6)。
3’引物具有序列5’CGACTTCTAGAATCAGGGGGCAGGGGGACTGGA3’(SEQ ID NO7)，并且含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaI(以黑體書寫)的切割位點(diǎn)以及互補(bǔ)于該基因的3’未翻譯序列的22個核苷酸。
采用一種可以通過商業(yè)途徑得到的試劑盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，LaJolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠中分離擴(kuò)增序列。然后，該片段用相應(yīng)的內(nèi)切核酸酶進(jìn)行消化并且在1％的瓊脂糖凝膠上再次純化。該片段命名為F2。
通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，利用載體pA2gp(和pA2)(pVL941載體的改進(jìn)，將在下面進(jìn)行討論)來表達(dá)該蛋白(為了回顧，參閱Summers，M.D.與Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體與昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)步驟的方法手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)實驗站會刊No.1555)。該表達(dá)載體含有苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)的多角體蛋白啟動子，其后跟隨了限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和XbaI的識別位點(diǎn)。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化作用。為了容易地選擇出重組病毒，將來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動子同樣的取向插入，其后面是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。為了實現(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染野生型病毒DNA的同源重組，多角體蛋白序列兩側(cè)為病毒序列。許多其它的桿狀病毒載體，如pRG1，pAc373，pVL941和pAcIml可以用于代替pA2(Luckow，VA.與Summers，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
質(zhì)粒以限制性酶消化并且通過本領(lǐng)域已知的方法采用牛腸磷酸酶使其去磷酸化，然后采用可以通過商業(yè)途徑得到的試劑盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠中分離出DNA。該載體DNA命名為V2。
片段F2和去磷酸化的質(zhì)粒V2通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α細(xì)胞并且采用相應(yīng)的限制性酶來鑒定含有質(zhì)粒(pBacFGF-14)的細(xì)菌。克隆片段的序列通過DNA測序加以證實。
采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國，847413-7417(1987))將5μg的質(zhì)粒pBacFGF-14和1.0μg的一種商購線性化的桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。
將1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的質(zhì)粒在一個含有50μl無血清的Grace培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司，Gaithersburg，MD)的無菌微量滴定板的孔中進(jìn)行混合。之后加入10μl的Lipofectin和90μl的Grace培養(yǎng)基，混合并在室溫下溫育15分鐘。然后將該轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入在35mm組織培養(yǎng)平板上接種的Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 1711)，其中平板上含有1毫升無血清Grace培養(yǎng)基。來回?fù)u動該平板以混合新添加的溶液。然后該平板于27℃下溫育5小時。5小時后，從平板中除去轉(zhuǎn)染溶液并且加入1ml補(bǔ)充有10％的胎牛血清的Grace昆蟲培養(yǎng)基。將該平板放回溫育箱中并且于27℃下持續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后收集上清液，并且與Summers和Smith所述(出處同上)類似地進(jìn)行噬斑測定。作為一種改進(jìn)，采用一種含有“Blue Gal”(生命技術(shù)公司，Gaithersburg，MD)的瓊脂糖凝膠，它可以使染上藍(lán)色的噬斑易于分離。(“噬斑測定”的詳細(xì)描述也可以在用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)的使用者指南的第9-10頁中找到，該指南由生命技術(shù)公司，Gaithersburg分發(fā))。
在連續(xù)稀釋4天后將病毒加入細(xì)胞中，并且用一個Eppendorf移液管的尖端挑取染上藍(lán)色的噬斑。然后將含有該重組病毒的瓊脂重新懸浮在一個含有200μlGrace培養(yǎng)基的Eppendorf管中。通過短時間的離心除去瓊脂并且采用含有該重組桿狀病毒的上清液去感染在35mm平皿上接種的Sf9細(xì)胞。4天后收集這些培養(yǎng)平皿中的上清液，然后于4℃下進(jìn)行儲藏。
將Sf9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％熱滅活的FBS的Grace培養(yǎng)基上進(jìn)行培育。在感染復(fù)數(shù)(MOI)為2的條件下，采用重組桿狀病毒V-FGF-14感染細(xì)胞。6小時后除去該培養(yǎng)基并且代之以不含甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司，Gaithersburg)。42小時后加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S半胱氨酸(Amersham)。在離心收獲細(xì)胞前將細(xì)胞進(jìn)一步溫育16小時，通過SDS-PAGE和放射性自顯影觀察被標(biāo)記的蛋白。
實施例3在COS細(xì)胞中表達(dá)重組FGF-14表達(dá)質(zhì)粒FGF-14-HA從載體pcDNA3/Amp(Invitrogen)衍生得到，pcDNA3/Amp包括1)SV40復(fù)制起點(diǎn)；2)氨芐青霉素抗性基因；3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；4)后跟多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)的CMV啟動子。把框內(nèi)融合到3’末端的編碼整個FGF-14前體的DNA片段和HA標(biāo)記克隆到該載體的多接頭區(qū)，從而在CMV啟動子的控制下指導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。HA標(biāo)記對應(yīng)于如以前所述的從流感血凝素蛋白得到的一個表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly和R.Lerner，1984，細(xì)胞，37767(1984))。HA標(biāo)記與靶蛋白的融合使得用識別HA表位的抗體易于檢測重組蛋白。
質(zhì)粒構(gòu)建的策略如下所述通過PCR采用兩個引物來構(gòu)建編碼FGF-14，ATCC#97148的DNA序列，其中5’引物為5’CTAGTGGATCCCATCATGGCGGCGCTGGCCAGT 3’(SEQID NO8)，它含有一個BamHI位點(diǎn)，后面緊跟從起始密碼子開始的編碼序列的18個核苷酸；3’序列為5’GATTTACTCGAGGGGGGCAGGGGGACTGGA 3’(SEQ ID NO9)，它含有互補(bǔ)于XhoI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記和FGF-14編碼序列(不包括終止密碼子)的最后18個核苷酸的序列。因此，PCR產(chǎn)物含有一個BamHI位點(diǎn)、后跟框內(nèi)融合的HA標(biāo)記物的編碼序列、HA標(biāo)記物之后的翻譯終止密碼子和一個XhoI位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增的DNA片段與載體pcDNA3/Amp用相應(yīng)的限制性酶消化并加以連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE(可以從Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA92037中得到)中，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物鋪在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上并且選擇抗性克隆。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA并通過限制酶切分析檢驗正確片段的存在。為了表達(dá)重組FGF-14，通過DEAE-DEXTRAN方法(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社(1989))用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。FGF-14-HA蛋白的表達(dá)通過放射性標(biāo)記和免疫沉淀方法(E.Harlow，D.Lane，抗體實驗室手冊，冷泉港Harbor實驗室出版社(1988))進(jìn)行測定。轉(zhuǎn)染后2天，用35S-半胱氨酸標(biāo)記細(xì)胞8小時。然后收集培養(yǎng)基并用去污劑(RIPA緩沖液(150 mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5))(Wilson，I.，等，出處同上，37767(1984))裂解細(xì)胞。所有的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基均采用一種HA特異的單克隆抗體加以沉淀。在15％SDS-PAGE凝膠上分析被沉淀的蛋白。
實施例5通過基因治療的表達(dá)成纖維細(xì)胞是通過皮膚活組織檢查從一個研究對象中得到的。將得到的組織放置在組織培養(yǎng)基上并且分割成小塊。將小的組織塊放置在組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，其中每個瓶中放置約10塊組織。將瓶顛倒放置，蓋緊并于室溫下保留過夜。在室溫下過24小時后反轉(zhuǎn)瓶，組織塊固定在瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如含有10％FBS，青霉素和鏈霉素的Ham's F12培養(yǎng)基)，然后于37℃下溫育大約1周。這時加入新鮮培養(yǎng)基，隨后每隔幾天更換一次培養(yǎng)基。再培養(yǎng)2周后，出現(xiàn)了一單層成纖維細(xì)胞。該單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。
用EcoRI和Hind III消化旁側(cè)有Moloney鼠肉瘤病毒長末端重復(fù)的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下來用牛腸磷酸酶進(jìn)行處理。線性載體在瓊脂糖凝膠上分級分離并使用玻璃珠加以純化。
采用分別與5’和3’末端序列對應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。5’引物包含一個EcoRI位點(diǎn)，3’引物含有一個Hind III位點(diǎn)。在T4 DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性化骨架與擴(kuò)增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在適于兩個片段連接的條件下保持所得到的混合物。將該連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HBl01，然后為了證實該載體具有插入正確的感興趣的基因而將細(xì)菌涂布在含有卡那霉素的瓊脂上。
將兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包裝細(xì)胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco's改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)的組織培養(yǎng)板上進(jìn)行培育，直至達(dá)到匯合密度。然后將含有基因的MSV載體加入培養(yǎng)基中并用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞隨即生產(chǎn)含有該基因的具有感染性的病毒顆粒(現(xiàn)在包裝細(xì)胞被稱作生產(chǎn)細(xì)胞)。
向轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，接下來從一個鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基經(jīng)微孔過濾器過濾以除去脫附(detached)的生產(chǎn)細(xì)胞，然后利用該培養(yǎng)基去感染成纖維細(xì)胞。從成纖維細(xì)胞的亞鋪滿平板中除去培養(yǎng)基并迅速地代之以來自于生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基。除去該培養(yǎng)基并代之以新鮮的培養(yǎng)基。如果該病毒的滴度高的話，那么實質(zhì)上所有的成纖維細(xì)胞均被感染并且無需選擇。如果滴度非常低，那么就需要采用一個具有如neo或his這樣的可選擇性標(biāo)記物的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
然后將工程化的成纖維細(xì)胞注射入宿主，它或單獨(dú)注射或在一個cytodex 3微載體珠上已培育至鋪滿之后再注射。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化都是可能的，因此在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以另外的方式實施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請人HU等人(ii)發(fā)明名稱成纖維生長因子-14(iii)序列數(shù)8(iv)聯(lián)系地址(A)地址CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6BECKERFARMROAD(C)城市ROSELAND(D)州 新澤西(E)國家美國(F)郵政編碼07068(v)計算機(jī)可讀形式(A)存儲媒體類型3.5英寸軟磁盤(B)計算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)目前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日同時(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/207,412(B)申請日1994年3月8日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36，134(C)案號/文檔號325800-402(ix)電訊信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度680個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGCGGCGC TGGCCAGTAG CCTGATCCGG CAGAAGCGGG AGGTCCGCGA GCCCGGGGGC60AGCCGGCCGG TGTCGGCGCA GCGGCGCGTG TGTCCCCGCG GCACCAAGTC CCTTTGCCAG 120AAGCAGCTCC TCATCCTGCT GTCCAAGGTG CGACTGTGCG GGGGGGGGCC CGCGCGGCCG 180GACCGCGGCC CGGAGCCTCA GCTCAAAGGC ATCGTCACCA AACTGTTCTG CCGCCAGGGT 240TTCTACCTCC AGGCGAATCC CGACGGAAGC ATCCAGGGCA CCCCAGAGGA TACCAGCTCC 300TTCACCCACT TCAACCTGAT CCCTGTGGGC CTCCGTGTGG TCACCATCCA GAGCGCCAAG 360CTGGGTCACT ACATGGCCAT GAATGCTGAG GGACTGCTCT ACAGTTCGCC GCATTTCACA 420GCTGAGTGTC GCTTTAAGGA GTGTGTCTTT GAGAATTACT ACGTCCTGTA CGCCTCTGCT 480CTCTACCGCC AGCGTCGTTC TGGCCGGGCC TGGTACCTCG GCCTGGACAA GGAGGGCCAG 540GTCATGAAGG GAAACCGAGT TAAGAAGACC AAGGCAGCTG CCCACTTTCT GCCCAAGCTC 600CTGGAGGTGG CCATGTACCA GGAGCCTTCT CTCCACAGTG TCCCCGAGGC CTCCCCTTCC 660AGTCCCCCTG CCCCCCTGAA 680(2)SEQIDNO2信息(i)序列特征(A)長度225個氨基酸(B)類型 氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO2Met Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ile Arg Gln Lys Arg Glu Val-25 -20 -15Arg Glu Pro Gly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val-10 -5 1Cys Pro Arg Gly Thr Lys Ser Leu Cys Gln Lys Gln Leu Leu Ile5 10 15Leu Leu Ser Lys Val Arg Leu Cys G1y Gly Arg Pro Ala Arg Pro20 25 30Asp Arg Gly Pro Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Lys Leu35 40 45Phe Cys Arg Gln Gly Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Asp Gly Ser50 55 60Ile Gln Gly Thr Pro Glu Asp Thr Ser Ser Phe Thr His Phe Asn65 70 75Leu Ile Pro Val Gly Leu Arg Val Val Thr Ile Gln Ser Ala Lys80 85 90Leu Gly His Tyr Met Ala Met Asn Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser95 100 105Ser Pro His Phe Thr Ala Glu Cys Arg Phe Lys Glu Cys Val Phe110 115 120Glu ASn Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Gln Arg125 130 135Arg Ser Gly Arg Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Asp Lys Glu Gly Gln140 145 150Val Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala Ala Ala His155 160 165Phe Leu Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Met Tyr Gln Glu Pro Ser170 175 180Leu His Ser Val Pro Glu Ala Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala Pro185 190 195(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO3GCCAGAGCAT GCAGCGGCGC GTGTGTCCCC GC 32(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4GCCAGAAGAT CTGGGGGCAG GGGGACTGGA AGG 33(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CTAGTGGATC CCATCATGGC GGCGCTGGCC AGT33(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CGACTGGATC CCCAGCGGCG CGTGTGTCCC 30(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CGACTTCTAG AATCAGGGGG CAGGGGGACT GGA 33(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CTAGTGGATC CCATCATGGC GGCGCTGGCC AGT 33(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述EQ ID NO9GATTTACTCG AGGGGGGCAG GGGGACTGGA 30
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，它包括選自如下一組中的一個成員(a)一種編碼包括如SEQ ID NO2所示的第-26位氨基酸至第199位氨基酸的多肽的多核苷酸；(b)一種編碼包括如SEQ ID NO2所示的第1位氨基酸至第199位氨基酸的多肽的多核苷酸；(c)一種能夠與(a)或(b)的多核苷酸雜交并且與(a)或(b)的多核苷酸之間至少有70％相同性的多核苷酸；以及(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的一個多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，它包括如SEQ ID NO1所示的第1位核苷酸至第680位核苷酸。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，它包括如SEQ ID NO1所示的第79位核苷酸至第680位核苷酸。
5.一種分離的多核苷酸，它包括選自如下一組中的一個成員(a)一種編碼由ATCC保藏號97148中所含的DNA編碼的成熟多肽的多核苷酸；(b)一種編碼由ATCC保藏號97148中所含的DNA表達(dá)的多肽的多核苷酸；(c)一種能夠與(a)或(b)的多核苷酸雜交并且與(a)或(b)的多核苷酸之間至少有70％相同性的多核苷酸；以及(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的一個多核苷酸片段。
6.一種含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
7.一種用權(quán)利要求6的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
8.一種生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞中表達(dá)由所說的DNA編碼的多肽。
9.一種生產(chǎn)能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求6的載體遺傳工程化細(xì)胞。
10.一種包括選自如下一組中的一個成員的多肽(i)一種具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽及其片段，類似物與衍生物；以及(ii)一種由ATCC保藏號97148的cDNA編碼的多肽，以及所說多肽的片段，類似物和衍生物。
11.一種抗權(quán)利要求10的多肽的抗體。
12.一種抑制權(quán)利要求10的多肽的生物學(xué)作用的化合物。
13.一種激活權(quán)利要求10的多肽的受體的化合物。
14.一種治療需要FGF-14多肽的病人的方法，該方法包括將治療學(xué)有效量的權(quán)利要求10的多肽給予病人。
15.一種治療需要抑制FGF-14多肽的病人的方法，該方法包括將治療學(xué)有效量的權(quán)利要求12的化合物給予病人。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所說的治療學(xué)有效量的所說多肽是通過向病人提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)該多肽的方式來給藥。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所說的化合物是一種多肽并且治療學(xué)有效量的該化合物是通過向病人提供編碼所說拮抗劑的DNA并在體內(nèi)表達(dá)該拮抗劑的方式來給藥。
18.一種鑒定作為權(quán)利要求10的多肽的興奮劑有活性的化合物的方法，該方法包括(a)在以所說的多肽正常刺激細(xì)胞的條件下，將待篩選的化合物與含有細(xì)胞的反應(yīng)混合物合并，所說的反應(yīng)混合物含有當(dāng)細(xì)胞增殖時摻人細(xì)胞的標(biāo)記；以及(b)測定細(xì)胞的增殖程度以鑒定該化合物是否是一種有效的興奮劑。
19.一種鑒定作為權(quán)利要求10的多肽的拮抗劑有活性的化合物的方法，該方法包括(a)在以所說的多肽正常刺激細(xì)胞的條件下，將待篩選的化合物，多肽和含有細(xì)胞的反應(yīng)昆合物合并，所說的反應(yīng)混合物含有當(dāng)細(xì)胞增殖時摻人細(xì)胞的標(biāo)記；以及(b)測定該細(xì)胞的增殖程度以鑒定該化合物是否是一種有效的拮抗劑。
20.一種診斷與權(quán)利要求10的多肽表達(dá)不足有關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，該方法包括測定在編碼所說的多肽的核酸序列中的突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人成纖維細(xì)胞生長因子－14多肽以及編碼該多肽的DNA(RNA)。本發(fā)明還提供了一種通過重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽的方法。本發(fā)明還公開了利用這種多肽以促進(jìn)傷口愈合的方法,例如治愈燒傷與潰瘍,防止由于中風(fēng)所致/與中風(fēng)有關(guān)的神經(jīng)元的損傷及促進(jìn)神經(jīng)元生長的方法,防止皮膚老化與頭發(fā)脫落的方法,在早期胚胎中刺激血管生成、中胚層誘導(dǎo)的方法以及促進(jìn)四肢再生的方法。本發(fā)明也公開了抗這種多肽的拮抗劑及其用作一種防止異常細(xì)胞增殖,血管過多的疾病以及上皮晶狀體細(xì)胞增殖的治療劑的用途。本發(fā)明還公開了一種用于檢測在編碼序列中的突變以及在從宿主得到的樣品中該多肽濃度改變的診斷方法。
文檔編號C07K14/435GK1183803SQ95197800
公開日1998年6月3日 申請日期1995年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月5日
發(fā)明者約翰·M·格林, 帕特里克·J·迪龍 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司