專利名稱：人半胱氨酸蛋白酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及最新鑒別的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途以及這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法。更具體地說，本發(fā)明的多肽已被推定性地鑒定為人半胱氨酸蛋白酶抑制劑E，下文有時(shí)稱為“CysE”。本發(fā)明也涉及抑制這些多肽的作用的方法。
半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族包括一組半胱氨酸蛋白酶抑制因子，它們在人類組織和體液中廣泛地分布，并且與半胱氨酸蛋白酶(如組織蛋白酶B，H，L和S)形成緊密的和可逆的復(fù)合物。半胱氨酸蛋白酶抑制劑很可能涉及這些蛋白酶所參與的正?；蛘呤遣±磉^程的調(diào)節(jié)。這樣，半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以影響蛋白質(zhì)和肽類的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外分解代謝(Barret，A.J.和Kirchke，H，酶學(xué)方法，80535-561(1981))，調(diào)節(jié)原激素的蛋白水解加工(Orlowski，M.，分子細(xì)胞生物化學(xué)，5249-74(1983))和原酶(Taugner，R.等，組織化學(xué)，83103-108(1985))，保護(hù)正常組織免受惡性細(xì)胞(Sloane，B.F.，Semin.CancerBiol，，1137-152(1990))或微生物(Bjorck，L.等，自然，337385-386(1989)和Bjorck，L.等，J.Virol.，64941-943(1990))的侵入和在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Mort，J.S.等，Arthritis Rheum.，27509-515(1984))和化膿性支氣管擴(kuò)張(Buttle，D.J.等，Scand.J.Clin.Lab.Invest.，50509-516(1990))中調(diào)節(jié)局部炎癥的方法。
半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族細(xì)分成I，II和III家族(分別也稱為stefin、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和激肽原家族)，各自具有在結(jié)構(gòu)構(gòu)成和生物學(xué)分布上不同于其它家族的成員(Barret，A.J.等，生物化學(xué)雜志，236312(1986))。I族半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B是由沒有二硫橋的大約100個(gè)氨基酸殘基的單一多肽鏈組成的小蛋白質(zhì)。II族半胱氨酸蛋白酶抑制劑由具有兩個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的大約120個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈組成。最后，III族半胱氨酸蛋白酶抑制劑(激肽原)顯示出以存在三個(gè)類II族半胱氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鞯母叨鹊慕Y(jié)構(gòu)復(fù)雜性，各自具有兩個(gè)在同源于II族半胱氨酸蛋白酶抑制劑的那些位點(diǎn)上的二硫橋(Muller-gsterl，W.等，Transbiochem.Sci.，11336-339(1986)).I和II族半胱氨酸蛋白酶抑制劑主要存在于胞內(nèi)和分泌液中(Abrahamson，M.等，生物化學(xué)雜志，26111282-11289(1986))，而激肽原在血漿中具有高濃度(Adam，A.等，Clin.Chem.，31423-426(1985))。
至少一種類型的II族半胱氨酸蛋白酶抑制劑(命名為半胱氨酸蛋白酶抑制劑C)似乎在所有組織中表達(dá)(Abrahamson，M.等，生物化學(xué)雜志，268287-294(1990))。相反，S-型半胱氨酸蛋白酶抑制劑主要在唾液中發(fā)現(xiàn)(Abrahamson，M.，等，生物化學(xué)雜志，26111282-11289(1986))。半胱氨酸蛋白酶抑制劑和衍生物肽類具有抗細(xì)菌和抗病毒活性(Bjorck等(1989，1990))，與它們存在于直接暴露于環(huán)境中的分泌浴上皮表面中相一致。半胱氨酸蛋白酶抑制劑也可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，這可以通過抑制從巨噬細(xì)胞釋放的半胱氨酸蛋白酶直接發(fā)生(Bieth，J.，半胱氨酸蛋白酶和它們的抑制因子，V.Turk，ed.(Waiter De Gruyter &Company，紐約)pp.693-703(1986))，或者是通過抑制細(xì)胞的趨藥性反應(yīng)和吞噬作用相關(guān)的呼吸脈沖間接發(fā)生(Leung-Tack等，生物化學(xué)，371255-258(1990))。這些信息說明II型半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以在上皮發(fā)揮各種保護(hù)功能。人II型半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因家族由至少七個(gè)成員組成。
疾病遺傳性半胱氨酸蛋白酶抑制劑C淀粉樣蛋白血管病(HCCAA)與編碼半胱氨酸蛋白酶抑制劑C之基因中的谷氨酸→亮氨酸的突變有關(guān)。它導(dǎo)致由這種突變體半胱氨酸蛋白酶抑制劑C組成的淀粉樣蛋白纖絲在腦部動脈上沉積，后者似乎導(dǎo)致致命的出血(Ghiso，J.等，PNAS.USA，832974-2978(1986))。
作為與半胱氨酸蛋白酶抑制劑C氨基酸序列同源性的結(jié)果，本發(fā)明的多肽已經(jīng)被推定性地鑒定為CysE。作為氨基酸序列同源性的結(jié)果，進(jìn)行了這種鑒定。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新的成熟多肽以及其生物學(xué)活性的并且在診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人類來源的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其類似物和其生物學(xué)活性的并且在診斷上或治療上有用的片段和衍生物。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法，該方法包括在促進(jìn)所說蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽的人核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞，并且隨后回收所說的蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸用于治療目的的方法，所述治療目的例如，抑制組織蛋白酶和預(yù)防骨質(zhì)疏松、腫瘤轉(zhuǎn)移、病毒復(fù)制、炎癥、化膿性支氣管擴(kuò)張、保護(hù)視網(wǎng)膜、預(yù)防腦白質(zhì)病、降低骨潰瘍、治療變態(tài)反應(yīng)、治療惡病質(zhì)和肌肉消瘦以及預(yù)防淀粉樣變性和作為抗微生物劑。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明也提供了核酸探針，這種核酸探針包含長度足以特異性地與編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列雜交的核酸分子。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗這些多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測與編碼本發(fā)明的多肽之核酸序列中的突變有關(guān)的疾病和疾病的易感性的診斷測定方法。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸體外用于與科學(xué)研究、DNA合成及DNA載體的制備有關(guān)目的的方法。
從本文的教導(dǎo)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會清楚本發(fā)明的這些和其它方面。
下列附圖用來說明本發(fā)明的實(shí)施方案，而無意于用它們來限制本發(fā)明權(quán)利要求所包括的范圍。


圖1描述了本發(fā)明的多肽的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列。使用了氨基酸標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫。用373自動DNA測序儀(AppliedBiosystem公司)進(jìn)行測序。
圖2說明本發(fā)明的多肽(上排)與人類半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(下排)之間的氨基酸同源性。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，這種核酸編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽或由1995年3月20日以保藏號ATCC 97103保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
本發(fā)明的多核苷酸在來源于原代培養(yǎng)羊膜細(xì)胞的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。其在結(jié)構(gòu)上和半胱氨酸蛋白酶抑制劑II超家族相關(guān)。其包含一個(gè)編碼148個(gè)氨基酸殘基之蛋白質(zhì)的開放讀框，其中大約前28個(gè)氨基酸殘基是推定的前導(dǎo)序列(這樣所說成熟蛋白質(zhì)包含120個(gè)氨基酸)。所述蛋白質(zhì)和人類半胱氨酸蛋白酶抑制劑C顯示出最高程度的同源性，在一段147個(gè)氨基酸的序列上具有33.566％的相同性和53.846％的相似性。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，其可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1(SEQ ID NO1)所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列相同；由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其可以和圖1的DNA(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如前導(dǎo)或分泌序列或蛋白原序列；編碼成熟多肽的編碼序列(和可有可無的附加的編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列。
這樣，“編碼多肽的多核苷酸”這一術(shù)語包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖1(SFQ ID NO2)的推定的氨基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產(chǎn)生的多核苷酸等位變體或是非天然產(chǎn)生的多核苷酸變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的相同成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、衍生物和類似物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一種編碼序列，該序列是圖1(SEQ ID NO1)中所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體。本領(lǐng)域已知等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，而實(shí)質(zhì)上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明也包括這樣的多核苷酸，其中所說的成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框架中與幫助從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌多肽的多核苷酸序列融合，所述的多核苷酸序列如作為分泌序列在控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用的前導(dǎo)序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且可以具有由宿主細(xì)胞切割形成成熟形式的多肽的前導(dǎo)序列。這種多核苷酸也編碼蛋白原(proprotein)，這種蛋白原是添加有附加的5’氨基酸殘基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一種無活性的蛋白形式。一旦切除原序列，留下的就是有活性的成熟蛋白。
這樣，本發(fā)明的多核苷酸例如可以編碼一種成熟蛋白或編碼具有原序列的蛋白質(zhì)或編碼既有原序列又有前序列(presequence)(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得可以純化本發(fā)明的多核苷酸。在細(xì)菌宿主的情況下，所述的標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，其提供來純化融合進(jìn)標(biāo)記的成熟多肽，或例如當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。所說的HA標(biāo)記相應(yīng)于來源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的一種表位(Wilson，I.等，細(xì)胞，37767(1984))。
術(shù)語“基因”是指和產(chǎn)生多肽鏈有關(guān)的DNA區(qū)段；其包括在編碼區(qū)前面的和后面的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)和尾隨序列)以及在各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
全長CysE基因的片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，用來分離全長CysE基因和與CysE基因有高度的序列類似性或類似生物活性的其它基因。這種類型的探針優(yōu)選地是具有至少30個(gè)堿基，并且可以含有，例如50個(gè)或更多的堿基。所說的探針也可以用于鑒別相應(yīng)于全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆和含有包括調(diào)節(jié)和啟動子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完整CysE基因的基因組克隆。篩選的實(shí)例包括通過利用已知DNA序列合成寡核苷酸探針來分離CysE基因的編碼區(qū)。具有互補(bǔ)于本發(fā)明的基因序列之序列的標(biāo)記寡核苷酸可以用來篩選人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，以確定探針和哪些文庫成員雜交。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(條件是兩個(gè)序列之間具有至少70％，優(yōu)選地具有至少90％，更優(yōu)選地具有至少95％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選地具有至少97％的同源性時(shí)雜交才可以發(fā)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實(shí)質(zhì)上保持與由圖1(SEQ ID NO1)的cDNA或保藏的cDNA(s)編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
此外，所述多核苷酸可以具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選地是至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選地是至少50個(gè)堿基，其與本發(fā)明的多核苷酸雜交，并且具有如上文所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，這種多核苷酸可以用作SEQ ID NO1多核苷酸的探針，例如用于回收多核苷酸或作為診斷探針或作為PCR引物。
這樣，本發(fā)明涉及與編碼圖1(SEQ ID NO2)多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，優(yōu)選地至少90％相同性并且更優(yōu)選地至少95％相同性的多核苷酸及其片段(這種片段具有至少30個(gè)堿基，優(yōu)選地至少50個(gè)堿基)和這些多核苷酸編碼的多肽。
本文所提及的保藏物將按照用于專利程序的國際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保持。這些保持物僅僅是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，并不是35 U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾。對保藏材料的任何制造、使用或銷售需要經(jīng)過許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1(SEQ ID NO2)的推導(dǎo)的氨基酸序列的CysE多肽或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段、類似物和衍生物。
術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”，當(dāng)有關(guān)圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。這樣，類似物包括蛋白原，這種類似物可以由蛋白原部分切除進(jìn)而產(chǎn)生活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
所說的圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代(優(yōu)選地是保守氨基酸殘基取代)并且取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的氨基酸殘基；或(ii)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基；或(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)這樣一種，其中附加氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)或分泌序列或用來純化成熟多肽的序列或原序列。通過本文的闡述，可以認(rèn)為這樣的片段、衍生物以及類似物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選地是提供分離形式的多肽和多核苷酸，并且優(yōu)選地是將所述多肽和多核苷酸純化成同質(zhì)性的。
術(shù)語“分離的”意指所述的物質(zhì)脫離了其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然產(chǎn)生的)。例如，一種存在于活的動物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因?yàn)檫@種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明的多肽包括圖1(SEQ ID NO2)的多肽(特別是成熟多肽)以及和圖1(SEQ ID NO2)的多肽具有至少70％的相似性(最好是70％的相同性)，更優(yōu)選地是90％的相似性(最好是90％的相同性)，最優(yōu)選地是95％的相似性(最好是95％相同性)的多肽，也包括這些多肽的部分，這種多肽的部分通常包含至少30個(gè)氨基酸，并且優(yōu)選地是至少50個(gè)氨基酸。
如本領(lǐng)域所熟知的，兩個(gè)多肽之間的“相似性”是通過比較一個(gè)多肽和另一個(gè)多肽序列的氨基酸序列和其保守氨基酸取代來確定的。
本發(fā)明多肽的片段或部分通過肽合成可以用于生產(chǎn)相應(yīng)的全長多肽；因此，此片段可以用作生產(chǎn)全長多肽的中間體。本發(fā)明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長多核苷酸。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)產(chǎn)生的，所說的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。該載體可以是例如，質(zhì)粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程宿主細(xì)胞可以在改良的適于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增CysE基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，例如溫度和pH值等，是以前用于表達(dá)選擇的宿主細(xì)胞的那些，對普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來經(jīng)重組技術(shù)生產(chǎn)多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用于表達(dá)多肽的表達(dá)載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒和噬菌體DNA組合衍生的載體、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬病病毒)。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)。這樣的方法和其它方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
在表達(dá)載體中的所說的DNA序列是可操作地連接到適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)mRNA合成表達(dá)控制序列(啟動子)上的。這樣的啟動子的代表性例子可以提到的是LTR或SV 40啟動子，大腸桿菌的lac或trp、噬菌體λPL啟動子，和已知在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達(dá)的其它啟動子。所說的表達(dá)載體也包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該載體也可以包含供擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特征，例如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
包含以上所述的適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)?shù)膯幼踊蚩刂菩蛄械妮d體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動物細(xì)胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。通過本文的闡述，對適當(dāng)?shù)乃拗鞯倪x擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
更具體地說，本發(fā)明也包括重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構(gòu)建體包含載體，如質(zhì)?；虿《镜妮d體，該載體已正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的更為理想的情況下，構(gòu)建體還包含可操作連接到所述序列上的調(diào)節(jié)序列，包括，例如，啟動子。大量適合的載體和啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是通過商業(yè)途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質(zhì)?；蜉d體都可以使用，只要它們在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定。
可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體從任何所需的基因選擇啟動子區(qū)。兩種合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對適當(dāng)?shù)妮d體與啟動子的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以上所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所說的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)。可以由磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DHAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔有效地將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以用來以常規(guī)方式生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的多肽可以由常規(guī)肽合成器合成產(chǎn)生。
成熟蛋白質(zhì)可以在哺乳動物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)膯幼涌刂葡卤磉_(dá)。采用來源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA，無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達(dá)載體。
高等真核生物編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄被插入到載體中的增強(qiáng)子序列增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動子上增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)100至270bp上的SV40增強(qiáng)子、細(xì)胞肥大病毒早期啟動子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)上的多形瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。
一般來說，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(例如，大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表達(dá)基因的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。這樣的啟動子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質(zhì)等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列以合適的方式(phase)與翻譯起始和終止序列裝配，優(yōu)選地，與能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，這種蛋白質(zhì)包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達(dá)的重組產(chǎn)物穩(wěn)定或簡化純化步驟。
通過將帶有合適的翻譯起始和終止信號的編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列插入具有功能性啟動子的可操作讀框來構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體。所說載體包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以在宿主來保證保持載體和需要時(shí)提供擴(kuò)增。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種(當(dāng)然其它的也可以選擇來使用)。
作為一個(gè)代表性的但不是限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體可以包含源于市售質(zhì)粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件)的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“骨架”片段與適當(dāng)?shù)膯幼雍痛磉_(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。
在合適的宿主菌株轉(zhuǎn)化和合適的宿主菌株生長至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用合適的方法(例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時(shí)間。
典型地經(jīng)離心收獲細(xì)胞，經(jīng)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保持所形成的粗產(chǎn)物用于進(jìn)一步的純化。
可以經(jīng)任何常規(guī)的方法破碎用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，所述方法包括凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和其它能夠表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)、適合的啟動子和增強(qiáng)子，也可以包含任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列可以用來提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
本發(fā)明的多肽可以用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時(shí)在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可以使用高效液相色譜(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或經(jīng)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌、酵母、高等植物、培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)產(chǎn)生的。依據(jù)重組生產(chǎn)方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
本發(fā)明的CysE多肽可以用于抑制人類組織蛋白酶和所形成的與這些組織蛋白酶的作用有關(guān)的病理狀態(tài)。例如，CysE可以用于治療骨質(zhì)疏松、貝切特氏病、血鈣過多、骨軟化(osteomalicia)、變態(tài)性皮膚病，變態(tài)性鼻炎和變態(tài)性紫癜。
人們也認(rèn)為組織蛋白酶在腫瘤的轉(zhuǎn)移中具有至關(guān)重要的作用；因此，CysE可以用于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。
CysE多肽可以用作抗微生物劑，用于阻止某些微生物病原體(例如，鏈球菌)的生長，并通過減少與齲齒有關(guān)的酸的產(chǎn)生減少牙齲。
CysE多肽也可以用作抗病毒劑，用于治療由病毒引起的感染，例如，用于阻止單純皰疹病毒(HSV)的復(fù)制。CysE多肽也用于保護(hù)視網(wǎng)膜使其不受半胱氨酸蛋白酶的攻擊。
本發(fā)明的CysE多肽也可以用于通過阻止半胱氨酸蛋白酶的作用治療惡病質(zhì)和肌肉消瘦。
CysE多肽也可以用于改善炎癥(例如與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥)和用于治療膿毒性休克。CysE多肽也用于治療化膿性支氣管擴(kuò)張。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作人類疾病診斷的治療研究試劑和診斷材料。
本發(fā)明提供了鑒別半胱氨酸蛋白酶抑制劑E多肽受體的方法?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法鑒別編碼所說受體的基因，所述方法如配體淘選和FACS分選(Coligan等，免疫學(xué)當(dāng)代方案，1(2)，第5章，(1991))。優(yōu)選地，使用表達(dá)克隆，其中從對半胱氨酸蛋白酶抑制劑E多肽反應(yīng)性的細(xì)胞制備聚腺苷酸化RNA，將從這一RNA產(chǎn)生的cDNA文庫分成集合體，用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或?qū)Π腚装彼岬鞍酌敢种苿〦多肽非反應(yīng)性的其它細(xì)胞。使生長在載玻片上的標(biāo)記后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露在半胱氨酸蛋白酶抑制劑E多肽下，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E多肽可以由多種方法(包括碘化或引入位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)激酶的識別位點(diǎn))標(biāo)記。在固定和溫育后，將載玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒別陽性集合體，制備亞集合體，用交互式亞集合和再篩選方法再轉(zhuǎn)染，最終產(chǎn)生編碼推定的受體的單克隆。受體鑒別的另一種方法是可以將標(biāo)記的多肽與表達(dá)受體分子的細(xì)胞膜和抽提制劑光親和連接，經(jīng)PAGE分離交聯(lián)材料，并對X-光膠片曝光?？梢郧邢掳潴w-受體的標(biāo)記復(fù)合物，分離成肽片段進(jìn)行蛋白質(zhì)微測序。從微測序獲得的氨基酸序列用于設(shè)計(jì)一套篩選cDNA文庫的簡并寡核苷酸探針，以鑒別編碼推定的受體的基因。
本發(fā)明提供了篩選化合物以鑒別結(jié)合到半胱氨酸蛋白酶抑制劑E受體上并由此誘導(dǎo)第二信使系統(tǒng)反應(yīng)的化合物的方法。例如將哺乳動物細(xì)胞或者表達(dá)半胱氨酸蛋白酶抑制劑E受體的膜制劑在所述化合物存在下與本發(fā)明的標(biāo)記的多肽一起培養(yǎng)。測定在所說化合物和所說受體相互作用后的已知第二信使系統(tǒng)的反應(yīng)，并與由半胱氨酸蛋白酶抑制劑E引發(fā)的第二信使反應(yīng)比較。這種第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道或者是磷酸肌醇水解。
本發(fā)明的多肽和激動劑化合物可以就抑制半胱氨酸蛋白酶活性的能力進(jìn)行試驗(yàn)，該試驗(yàn)包括通過用10μM Z-Phe-Arg-NHMec為底物，在100M磷酸鈉緩沖液中的連續(xù)的速率測定(Nicklin，M.J.H.，和Barrett，A.J.，生物化學(xué)雜志，223245-258(1984)，測定半胱氨酸蛋白酶抑制劑E復(fù)合物與木瓜蛋白酶和人類組織蛋白酶B解離的平衡常數(shù)(Ki)。緩沖液包含1mM二硫蘇糖醇和2mM乙二胺四乙酸，用木瓜蛋白酶進(jìn)行測定時(shí)pH調(diào)節(jié)至6.5，用組織蛋白酶B進(jìn)行測定時(shí)pH調(diào)節(jié)至6.0。組織蛋白酶B在使用之前于室溫下在測定緩沖液中事先溫育20分鐘。在測定中的酶濃度是0.05-0.25nM。在組織蛋白酶B測定中所試的最高半胱氨酸蛋白酶抑制劑E濃度是100nM。在木瓜蛋白酶測定中，給出可見抑制(即在添加抑制劑之后1小時(shí)內(nèi)形成新的穩(wěn)定狀態(tài)的速率)的抑制劑濃度是20-50nM。于37℃分別在360和460毫微米的激發(fā)和發(fā)射波長下在Perkin-Elmer Cetus LS50熒光計(jì)中監(jiān)測底物的水解。經(jīng)以下關(guān)系式將所測定的Z-Phe-Arg-NHMec水解的Km值用于補(bǔ)償所獲得的抑制劑的底物誘導(dǎo)的解離的表觀Ki值表觀Ki＝Ki(1+[S]/Km)。
本發(fā)明的多肽和激動劑化合物可以與合適的藥物載體組合使用。這樣的組合物包含治療有效量的所說多肽或激動劑和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它們的組合物。其配方應(yīng)該適宜于施用的方式。
本發(fā)明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個(gè)或多個(gè)填裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。這種容器中還可以包括管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人類使用品得到政府機(jī)構(gòu)的同意。此外，本發(fā)明的多肽或組合物可以與其它治療化合物結(jié)合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預(yù)防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數(shù)情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數(shù)情況之下，考慮用藥途徑和病癥等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
CysE多肽和多肽形式的激動劑，可以依據(jù)本發(fā)明通過體內(nèi)表達(dá)這樣的多肽來利用，這常被稱作“基因治療”。
這樣，例如，可以體外對患者細(xì)胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進(jìn)行基因工程操作，用工程細(xì)胞向被治療的患者提供所說的多肽。這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且由本文的描述也顯而易見。例如，可以用包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作，以便體內(nèi)表達(dá)多肽。例如，將包裝(packaging)細(xì)胞用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，以便包裝細(xì)胞能產(chǎn)生含有興趣基因的傳染性病毒顆粒?？梢詫⑦@種生產(chǎn)細(xì)胞施用給患者以便體內(nèi)將細(xì)胞基因工程化并體內(nèi)表達(dá)所說的多肽。經(jīng)本發(fā)明的描述，通過這種方式施用本發(fā)明多肽的這些或其它方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的。
可以獲得上文描述的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒、和乳房腫瘤病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個(gè)或多個(gè)啟動子?？梢允褂玫暮线m的啟動子包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動子；和人類巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(Miller，等，生物技術(shù)，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或其它任何啟動子(例如真核細(xì)胞啟動子，如包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。使用的其它病毒啟動子包括但不限于腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細(xì)小病毒啟動子。通過本文的描述，合適的啟動子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在合適的啟動子控制下?？梢允褂玫暮线m的啟動子包括但不限于腺病毒啟動子(如腺病毒主要晚期啟動子)；或異源啟動子(如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子；可誘導(dǎo)的啟動子(如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子)；熱休克啟動子；清蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子(如單純皰疹胸苷激酶啟動子)；反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人類生長激素啟動子。所說的啟動子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動子。
使用反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以便形成生產(chǎn)細(xì)胞系。可以被轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN細(xì)胞系(Miller，人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部內(nèi)容本文一并參考)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任何已知的方法用所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。另外，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包囊在脂質(zhì)體中，或和脂類偶合，然后施用到宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生傳染性的反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然后可以使用這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所述多肽的核酸序列?？杀晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
疾病遺傳性半胱氨酸蛋白酶抑制劑C淀粉樣蛋白血管病導(dǎo)致致命的出血，并且可能與阿耳茨海默氏病、Down’綜合癥、帕金森氏病、dimentia相關(guān)聯(lián)并在40歲前導(dǎo)致死亡。
因此，本發(fā)明也涉及用CysE基因作為診斷劑。CysE基因的突變形式的檢測使得可以診斷由CysE基因中突變引起的類似于HCCAA的疾病。
可以用各種技術(shù)在DNA水平上檢測具有本發(fā)明的人基因突變的個(gè)體。可以從患者的細(xì)胞(包括但不限于血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸?；蚪MDNA可以直接用于檢測，或在分析前用PCR酶促擴(kuò)增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同的目的。作為一個(gè)例子，可以用與編碼CysE的核酸互補(bǔ)的PCR引物鑒別和分析CysE突變。例如，可以通過與正常基因型比較擴(kuò)增產(chǎn)物大小上的改變來檢測缺失或插入。點(diǎn)突變可以經(jīng)擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的CysE RNA或放射性標(biāo)記的CysE反義DNA序列雜交鑒別。經(jīng)核糖核酸酶A消化，或從熔點(diǎn)溫度的不同辨別完美配對的序列和錯(cuò)配雙鏈體。
可通過直接的DNA測序方法揭示參照基因和具有突變的基因間的序列差異。此外，克隆的DNA區(qū)段可以用作探針以檢測特異性DNA區(qū)段。當(dāng)和PCR結(jié)合時(shí)，這種方法的敏感性大大提高。例如，將測序引物和雙鏈的PCR產(chǎn)物或由改良的PCR方法產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。通過常規(guī)的放射標(biāo)記核苷酸方法或具有熒光標(biāo)記的自動測序方法確定序列。
基于DNA序列差異的遺傳試驗(yàn)可以通過檢測在有或沒有變性劑時(shí)凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上的區(qū)別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的熔點(diǎn)或部分解鏈溫度而停滯在凝膠的不同位置(參見，例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
也可以由核酸酶保護(hù)測定法揭示特定位置上的序列變化，所述測定法如核糖核酸酶保護(hù)和S1保護(hù)以及化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測特定DNA序列，所述方法例如雜交、核糖核酸酶保護(hù)、化學(xué)裂解、直接DNA測序、或使用限制酶(例如，限制片段長度多形性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法。
除很多常規(guī)凝膠電泳和DNA測序法之外，也可用原位分析檢測突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列特異地靶向位于單個(gè)的人染色體上的特定位置并能與之雜交。此外，現(xiàn)在需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前，僅有少數(shù)幾種以實(shí)際的序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)為基礎(chǔ)的染色體標(biāo)記試劑可以用于標(biāo)記染色體的位置。本發(fā)明的DNA染色體作圖是將這些序列和疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)的重要的第一步。
簡而言之，通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選10-25bp)便可以把序列定位到染色體上。采用3’未翻譯區(qū)域的計(jì)算機(jī)分析可以快速地選擇引物，其中引物不應(yīng)跨越超過基因組DNA上的一個(gè)外顯子，否則使得擴(kuò)增方法復(fù)雜化。然后采用這些引物用于PCR篩選含有單個(gè)的人染色體的體細(xì)胞雜交體。只有那些含有與該引物對應(yīng)的人基因的雜交體才會生產(chǎn)擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜交體的PCR作圖是將一個(gè)特定的DNA定位于特定的染色體上的快速程序。根據(jù)本發(fā)明采用同樣的寡核苷酸引物，用來自于特定染色體或者大基因組克隆集合體的一組片段、按照類似方式可以實(shí)現(xiàn)亞定位(sublocalization)。可以類似地用于對染色體作圖的其它的作圖策略包括原位雜交，用標(biāo)記的經(jīng)流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及通過雜交進(jìn)行預(yù)選，從而構(gòu)建出染色體特異性的cDNA文庫。
cDNA克隆與一個(gè)中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來實(shí)現(xiàn)一步法準(zhǔn)確染色體定位。該技術(shù)可以采用50或60個(gè)堿基長短的cDNA。關(guān)于該技術(shù)的綜述參閱Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦一個(gè)序列已定位到一個(gè)準(zhǔn)確的染色體位置，則染色體上該序列的物理位置可與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)例如可在V.McKusick，人類的孟德爾遺傳中找到(可以通過Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)文庫聯(lián)機(jī)得到)。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)來鑒定基因與已定位到相同染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接下來需要測定在受影響的和未受影響的個(gè)體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果突變是在一些或所有的受影響個(gè)體中觀察到的、但是又沒有在任何一個(gè)正常個(gè)體中被觀察到的話，那么該突變可能是疾病的病原體。
根據(jù)物理作圖和遺傳作圖技術(shù)目前的分辨率，一個(gè)被準(zhǔn)確定位到與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的病原(causative)基因中的一種(其中假定有1兆堿基的作圖分辨率且每20kb為一個(gè)基因)。
多肽、其片段或該多肽的其它衍生物或類似物、或者表達(dá)上述物質(zhì)的細(xì)胞可以用作生產(chǎn)其抗體的免疫原。這些抗體可以是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合，單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用于生產(chǎn)這些抗體和片段。
針對相應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽而產(chǎn)生的抗體可以通過將該多肽直接注射入動物體內(nèi)或者通過將該多肽向動物給藥來得到，其中的動物優(yōu)選非人類。然后，如此得到的抗體會結(jié)合到該多肽上。通過這種方式，即使是僅僅編碼該多肽的一個(gè)片段的序列也可用于產(chǎn)生能結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。然后，該抗體可以用于從表達(dá)該多肽的組織中分離這種多肽。
為了制備單克隆抗體，可以采用任何一種通過連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler與Milstein，1975，自然，256495-497)，三體雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)，472)以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，等，1985，單克隆抗體與癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以將用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)進(jìn)行修改從而生產(chǎn)出針對本發(fā)明免疫原性多肽制品的單鏈抗體。也可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠來表達(dá)針對本發(fā)明免疫原性多肽制品的人源化抗體。
本發(fā)明將參照下面的實(shí)施例進(jìn)一步加以說明；但是，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。除非另作聲明的以外，所有的份或量均為重量。
為了利于理解以下的實(shí)施例，現(xiàn)敘述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！蓖ㄟ^一個(gè)在前的小寫p和/或跟隨幾個(gè)大寫字母和/或數(shù)字加以命名。本文中的起始質(zhì)?；蛘呖梢酝ㄟ^商業(yè)途徑得到或在不受限制的基礎(chǔ)上公眾可得到，或者可以根據(jù)已公開的方法從可得到的質(zhì)粒中構(gòu)建出來。此外，對于與那些所述等價(jià)的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的并且對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用一種僅對DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多種限制性酶可以通過商業(yè)途徑得到，并且其反應(yīng)條件、輔因子和其它使用要求對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。為了分析目的，通常把1μg的質(zhì)粒或DNA片段與溶于約20μl緩沖溶液的約2單位的酶一起使用。為了分離用于質(zhì)粒構(gòu)建的DNA片段，通常在一個(gè)更大的體積內(nèi)用20至250單位的酶消化5至50μg的DNA。針對具體的限制性酶而言，合適的緩沖溶液和底物的量是由生產(chǎn)者規(guī)定的。通常采用在37℃下約1小時(shí)的溫育時(shí)間，但是該時(shí)間可以根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)者的指示而變化。在消化后，反應(yīng)混合物直接在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳以分離出所需的片段。
采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行裂解片段的大小分離。
“寡核苷酸”或指一種單鏈多脫氧核苷酸，或指可以通過化學(xué)合成的兩條互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一種激酶存在下以ATP添加一個(gè)磷酸時(shí)，該寡核苷酸將不會連接到另一個(gè)寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到未被去磷酸化的片段上。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，出處同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的緩沖液和條件、每0.5μg約等摩爾量的待連接DNA片段10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)來實(shí)現(xiàn)連接。
除非另有說明，按Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1細(xì)菌表達(dá)和純化可溶性的CysE利用PCR寡核苷酸引物起始擴(kuò)增編碼CysE的DNA序列(ATCC#97103)，所說的引物相當(dāng)于加工過的CysE蛋白質(zhì)的5’序列(減去信號肽序列)和CysE基因3’的載體序列。將相應(yīng)于CysE的附加核苷酸分別加入到5’和3’序列中。所說的5’寡核苷酸引物具有序列5’CGCCCATGGCGGCCGCAGGAG3’(SEQ ID NO3)，此引物含有NcoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，接著由加工過的蛋白質(zhì)的假定的末端氨基酸開始的CysE編碼序列。所說的3’序列5’CGCAAGCTTTCACATCTGCAAAAAGTTGGC3’(SEQ ID NO4)包含和HindIII位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，并接著CysE編碼序列。所說的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG可調(diào)節(jié)的啟動子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后用NcoI和HindIII消化pQE-9。將擴(kuò)增的序列連接到pQE-9中并將其插入到帶有編碼組氨酸標(biāo)記之序列和RBS的框架中。然后通過Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))描述的方法，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含質(zhì)粒pREP4的多拷貝，這種質(zhì)粒表達(dá)lacI阻遏物同時(shí)賦予卡那霉素抗性(Kanr)。通過轉(zhuǎn)化體在LB平板上的生長能力鑒定轉(zhuǎn)化體，并篩選出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。通過限制分析分離并確認(rèn)質(zhì)粒DNA。將含有所需構(gòu)建體的菌落在補(bǔ)充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜(O/N)生長。將O/N培養(yǎng)物以1∶100至1∶250的比率用于接種大體積培養(yǎng)物。細(xì)胞生長至0.4和0.6之間的光密度600(O.D.600)時(shí)，加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最終濃度為1mM。IPTG通過失活lacI阻遏物，清除P/O，導(dǎo)致增加基因表達(dá)。將細(xì)胞再培養(yǎng)3至4小時(shí)。通過離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解在6M鹽酸胍離液劑中。澄清后，在允許含有6-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在鎳-螯合物柱中通過層析從溶液中純化溶解的CysE(Hochuli，E.等，層析法雜志411177-184(1984))。將CysE(85％純度)以6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫下來，為了復(fù)性，調(diào)至3M鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10mm谷胱甘肽(還原型)、2mM谷胱甘肽(氧化型)。在溶液中溫育12小時(shí)后，將蛋白質(zhì)對10mM磷酸鈉透析。
實(shí)施例2利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)CysE利用PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼全長CysE蛋白質(zhì)的DNA序列(ATCC#97103)，所說引物相應(yīng)于該基因的5’和3’序列5’引物具有序列5′CGCGGATCCGCCATCATGGCGCGTTCGAACCTC3′(SEQ ID NO5)，包含BamHI限制位點(diǎn)(粗體)，后接真核細(xì)胞翻譯起始的有效信號(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950(1987))和CysE基因的18個(gè)核苷酸(翻譯起始密碼子“ATG”有下劃線)。
3’引物具有序列5′CGCGGATCCTCACATCTGCAAAAAGTTGGCTT3’(SEQ ID NO6)，包含限制性內(nèi)切酶BamHI的切割位點(diǎn)(粗體)和互補(bǔ)于CysE基因3’-非翻譯序列的核苷酸。用市售試劑盒(“Geneclean”’BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴(kuò)增的序列。然后將所說的片段用核酸內(nèi)切酶BamHI消化，并在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段命名為F2。
載體pA2(由pVL941載體修飾而成，見下文討論)用于表達(dá)CysE蛋白質(zhì)，這種表達(dá)使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)方法手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)的試驗(yàn)站公報(bào)1555)。這種表達(dá)載體包含苜蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)強(qiáng)多角體蛋白啟動子，其后面是限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的識別位點(diǎn)。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動子同樣的方向插入，其后是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列的兩側(cè)是用于細(xì)胞介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列?？梢杂煤芏嗥渌臈U狀病毒載體代替PA2，所說的載體如GPR1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
用限制酶BamHI消化所說的質(zhì)粒，然后用本領(lǐng)域已知的方法利用牛腸磷酸酶使質(zhì)粒去磷酸化。然后用市售試劑盒(“Geneclean”，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA命名為V2。
用T4 DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質(zhì)粒V2。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞并用酶BamHI鑒別含有所說質(zhì)粒(pBacCysE)的細(xì)菌。通過DNA測序確認(rèn)所克隆的片段的序列。
用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，847413-7417(1987))將5μg質(zhì)粒pBacCysE和1.0μg市售的線性桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉(zhuǎn)染。
將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質(zhì)粒pBacCysE在含有50微升無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。在添加10微升脂轉(zhuǎn)染試劑和90微升Grace’s培養(yǎng)基后，混合并于室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL1711)中，所說細(xì)胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板上。來回?fù)u動平板以混合新添加的溶液。然后將平板在27℃下培養(yǎng)5小時(shí)。5小時(shí)后，從平板除去轉(zhuǎn)染溶液，添加1微升補(bǔ)充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進(jìn)行噬斑測定。一點(diǎn)改變是使用具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies公司， Gaithersburg)，其使得易于分離染藍(lán)的噬斑(“噬斑測定”的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發(fā)布的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南9-10頁中找到)。
四天后，將系列稀釋的病毒添加到細(xì)胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍(lán)的噬斑。然后將包含重組病毒的瓊脂懸浮于含200微升Grace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中。經(jīng)簡短離心除去瓊脂，將含重組桿狀病毒的上清液用于感染接種到35毫米培養(yǎng)皿中的Sf9細(xì)胞。4天后，收獲這些培養(yǎng)皿中的上清液，于4℃貯存。
使Sf9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％熱滅活FBS的Grace’培養(yǎng)基中生長。在感染復(fù)數(shù)(MOI)2下用重組桿狀病毒V-CysE感染細(xì)胞。6小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用SF900II培養(yǎng)基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時(shí)后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經(jīng)離心收獲之前，將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)16小時(shí)，標(biāo)記蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
實(shí)施例3在COS細(xì)胞中表達(dá)重組CysE質(zhì)粒CysE HA的表達(dá)來源于載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含1)SV 40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動子，其后為多接頭區(qū)、SV 40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼完整的CysE前體的DNA片段和在讀框中融合進(jìn)3’末端的HA標(biāo)記克隆到所說的載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在CMV啟動子控制之下。HA標(biāo)記相應(yīng)于來自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位，這一點(diǎn)以前已經(jīng)描述過(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，細(xì)胞37767，(1984))。HA和靶細(xì)胞蛋白的融合，使得用識別HA表位的抗體很容易檢測重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下用兩種引物在克隆的原始的EST上通過PCR方法構(gòu)建編碼CysE的DNA序列(ATCC#97103)，所說的引物是5’引物5’GCGCGGATCCACCATGGCGCGTTCG 3’(SEQ ID NO7)，包含BamHI位點(diǎn)，之后是由起始密碼子開始的CysE編碼序列的12個(gè)核苷酸；3’引物5’GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACATCTGCACAAA 3’(SEQ ID NO8)，包含互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記和CysE編碼序列的核苷酸(不包括終止密碼子)的序列。因此，PCR產(chǎn)物包含BamHI位點(diǎn)，CysE編碼序列和接著它的融合進(jìn)讀框的HA標(biāo)記、與HA標(biāo)記相鄰的翻譯終止密碼子和XbaI位點(diǎn)。用BamHI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp并連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(可從Stratagene克隆系統(tǒng)，11099 North Torrey Pines Road，LaJolla，CA92037得到)。將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制分析檢測是否存在正確的片段。為了表達(dá)重組CysE，通過DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1989))。通過放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測CysE HA蛋白質(zhì)的表達(dá)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1988))。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的兩天用15S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)物培養(yǎng)基并用去垢劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))裂解細(xì)胞。用HA特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)物培養(yǎng)基。在15％SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質(zhì)沉淀。
實(shí)施例4經(jīng)由基因治療的表達(dá)成纖維細(xì)胞是通過皮膚活組織檢查從一個(gè)研究對象中得到的。將得到的組織放置在組織培養(yǎng)基上并且分割成小塊。將小的組織塊放置在組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，其中每個(gè)瓶中放置約10塊組織。將瓶顛倒放置，蓋緊并于室溫下保留過夜。在室溫下過24小時(shí)后反轉(zhuǎn)瓶，組織塊固定在瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如含有10％FBS，青霉素和鏈霉素的Ham’s F12培養(yǎng)基)，然后于37℃下溫育大約1周。這時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基，隨后每隔幾天更換一次培養(yǎng)基。再培養(yǎng)2周后，出現(xiàn)了一單層成纖維細(xì)胞。該單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。
用EcoRI和HindIII消化旁側(cè)有Moloney鼠肉瘤病毒長末端重復(fù)的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下來用牛腸磷酸酶進(jìn)行處理。線性載體在瓊脂糖凝膠上分級分離并使用玻璃珠加以純化。
采用分別與5’和3’末端序列對應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。5’引物包含一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，3’引物含有一個(gè)HindIII位點(diǎn)。在T4DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性化骨架與擴(kuò)增的EcoRI和HindIII片段加在一起，在適于兩個(gè)片段連接的條件下保持所得到的混合物。將該連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后為了證實(shí)該載體具有插入正確的感興趣的基因而將細(xì)菌涂布在含有卡那霉素的瓊脂上。
將兼嗜性(amphotropic)pA3 17或GP+am12包裝細(xì)胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)的組織培養(yǎng)板上進(jìn)行培育，直至達(dá)到匯合密度。然后將含有基因的MSV載體加入培養(yǎng)基中并用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞隨即生產(chǎn)含有該基因的具有感染性的病毒顆粒(現(xiàn)在包裝細(xì)胞被稱作生產(chǎn)細(xì)胞)。
向轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，接下來從一個(gè)鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基經(jīng)微孔過濾器過濾以除去脫附(detached)的生產(chǎn)細(xì)胞，然后利用該培養(yǎng)基去感染成纖維細(xì)胞。從成纖維細(xì)胞的亞鋪滿平板中除去培養(yǎng)基并迅速地代之以來自于生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，該多核苷酸包括圖1所示的1至576位核苷酸的序列。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，該多核苷酸包括圖1所示的14至459位核苷酸的序列。
8.一種包含權(quán)利要求2的DNA的載體。
9.一種用權(quán)利要求10的載體經(jīng)基因工程操作產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。
10.一種生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞表達(dá)由所說的DNA編碼的多肽。
11.一種生產(chǎn)能夠表達(dá)多肽之細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求10的載體對細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作。
12.一種多肽，該多肽包括選自如下一組的成員(i)一種具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；和(ii)一種由ATCC保藏物97103號的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
13.一種激活權(quán)利要求12的多肽的受體的化合物。
14.一種抑制權(quán)利要求12的多肽的受體的化合物。
15.一種治療需要CysE之患者的方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權(quán)利要求12的多肽。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的治療有效量的多肽是通過對患者提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所說的多肽來施用的。
17.一種治療需要抑制CysE多肽之患者的方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權(quán)利要求14的化合物。
18.一種診斷與權(quán)利要求12的多肽的表達(dá)不足相關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，該方法包括測定編碼所說多肽之核酸序列中的突變。
19.一種診斷方法，該方法包括分析來源于宿主細(xì)胞的樣品中是否存在權(quán)利要求12的多肽。
20.一種鑒別結(jié)合并激活權(quán)利要求12之多肽的受體的化合物的方法，該方法包括在允許結(jié)合所說受體的條件下，使在其表面表達(dá)所說多肽受體的細(xì)胞與待篩選的化合物接觸，所說受體與能夠提供響應(yīng)化合物結(jié)合所說受體的可檢測信號的第二組分相聯(lián)；和通過檢測所說化合物與所說受體的相互作用所產(chǎn)生的信號的存在與否確定所說化合物是否結(jié)合并激活所說受體。
全文摘要
本文公開了一種人類CysE多肽和編碼這種多肽的DNA(RNA),以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法。本文也公開了利用這種多肽治療骨質(zhì)疏松、腫瘤轉(zhuǎn)移、微生物感染、病毒感染、膿毒性休克、炎癥、視網(wǎng)膜刺激、骨潰瘍、惡病質(zhì)和肌肉消瘦的方法。本文還公開了用于檢測編碼序列中的突變和得自宿主的樣品中的多肽濃度的改變的診斷方法。
文檔編號C07H21/04GK1186497SQ95197884
公開日1998年7月1日 申請日期1995年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月5日
發(fā)明者倪健, 余國良, 賴納·根茨, 克雷格·A·羅森 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司