專利名稱：純化凝血調(diào)節(jié)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過濃縮純化含在人尿中的凝血調(diào)節(jié)蛋白的方法。凝血調(diào)節(jié)蛋白是一種抗凝劑，且希望被用作與血液凝聚能力異常相關(guān)的疾病的預(yù)防和治療劑。
凝血調(diào)節(jié)蛋白(以下簡稱為“ TM”)，是一種表現(xiàn)在血管內(nèi)皮細胞上的高親和性凝血酶受體，被N.L.Esmon等發(fā)現(xiàn)(J.Biol.Chem.，257859-864，1982)。作為一種能提高蛋白C活性的蛋白，TM以1∶1的摩爾比與凝血酶結(jié)合，并因此在Ca2+存在下激活蛋白C，同時，在另一方面，TM結(jié)合的凝血酶幾乎失去了自身的全部凝聚活性，如血纖蛋白原凝集活性和血小板活化活性。TM，由于其內(nèi)源性肝素活性，已知可通過抗凝血酶III提高對凝血酶的抑制，而且希望其作為新型藥物應(yīng)用于臨床。
人的TM最初是由H.H.Salem等(J.Biol. Chem.，25912246-12251，1984)從人的胎盤中純化出來的，但人的胎盤不適于用作大規(guī)模生產(chǎn)TM的起始原料(EMBO J.61891-1897，1987)。盡管Suzuki等已鑒定出人TM的遺傳結(jié)構(gòu)(EMBO J.61891-1897，1987)，但合成與天然TM具有相同糖鏈的TM是非常難的，因為TM含有大量的糖鏈。
以后，Yamamoto等分離并純化了人尿TM(J.Biochem.113433-440，1993)且D.E.Jackson等證明人尿適于用作分離天然型TM的起始原料(Eur.J.Biochem.2211079-1087，1994)。
至于從尿中純化TM的方法，Yamamoto等純化TM的過程使用了QAE交聯(lián)葡聚糖，抗TM單克隆抗體柱，凝血酶作配體的親和柱，和交聯(lián)葡聚糖G-200，但由于此方法需要制備單克隆抗體，此過程因此復(fù)雜且麻煩。D.E.Jackson等純化TM時結(jié)合使用了DEAE瓊脂糖凝膠，凝血酶作配體的親和柱，和反向HPLC，在此方法中遇到的麻煩是由反向HPLC獲得的產(chǎn)量特別低，且HPLC不適于大規(guī)模純化。另外，Aoki等(日本專利申請公開No.Sho-63-30423)和Kunihiro等(日本專利申請公開No.Sho-63-218399)報道了從新鮮尿液中純化TM的方法，使用了離子交換色譜，凝血酶結(jié)合的親和柱和凝膠滲透。從發(fā)明者的經(jīng)驗看，已知尿液中TM的含量是不穩(wěn)定的，特別是當TM含量很低時，此方法不能令人滿意。因此，特別需要開發(fā)一種即使在尿液TM含量很低時也實用有效的純化方法。
從上述原因看，發(fā)明人努力研究一種不考慮尿液中TM的含量，而能獲高純度的TM的純化方法。
為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明者重復(fù)了大量試驗，并研究出使用羥基磷灰石作為吸附劑的吸附色譜可高效地純化凝血調(diào)節(jié)蛋白，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及純化人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于所述方法包括使用羥基磷灰石作為吸附劑的吸附色譜。
至于本發(fā)明方法的含人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白的起始材料，可使用的例子如，人的原尿或經(jīng)硫酸銨分離濃縮的人尿，盡管沒有特別的限制，但優(yōu)選使用經(jīng)離子交換色譜，凝血酶結(jié)合的親和色譜等預(yù)純化的人尿。
至于羥基磷灰石，可使用任何商業(yè)上可得的產(chǎn)品(例如，由日本Seikagaku Kogyo K.K.和日本W(wǎng)ako Pure Chemicals Co.制造的產(chǎn)品)。
在可獲得微小量的起始物時，可使用HPLC柱分離或分析使用，如TSKgel HA-1000(日本Tosoh公司制造)和KBC柱(日本Kohken公司制造)。
一由羥基磷灰石填充的柱子，用1-30mM，優(yōu)選5-10mM的磷酸緩沖液平衡至pH5-8，優(yōu)選pH6-7，并因此適于加鹽，如氯化鈣，氯化鈉，氯化鉀和氯化鎂，用以平衡溶液。優(yōu)選使用濃度小于1mM的氯化鈣。
然后，將起始物用于此緩沖液洗過的柱子，然后再使用相同的緩沖液徹底洗滌。當流出物在波長280nm的吸收顯示明顯下降后，使用線性梯度濃度的磷酸進行洗脫，濃度梯度在5-300mM的范圍內(nèi)適于純化TM。在洗脫的步驟中，TM首先被洗脫出(磷酸的濃度在50-100mM范圍內(nèi))，然后雜質(zhì)被洗脫出，當使用開放的柱子時，同時，此開放的柱子可制成長而細的形狀以提高分離效果。當進行完此時，仍可檢測到雜質(zhì)時，最后可使用凝膠滲透等方法進行純化。本發(fā)明的使用羥基磷灰石的吸收色譜的方法具有的特征在于當所使用的起始物的比活度較低時，也總能制出與使用高比活度起始物時同樣純度的產(chǎn)物。
為了純化人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白，本發(fā)明的方法可與其他色譜方法，如離子交換色譜，凝血酶結(jié)合的親和色譜和凝膠過濾色譜結(jié)合使用。
在每個純化步驟中，TM的比活度可通過下列方法測定將30μl緩沖液A(20mMTris-Hcl緩沖液(pH7.5)含0.1M氯化鈉和3.5mM氯化鈣)，10μl人蛋白C溶液[用緩沖液B(0.1％BAS在緩沖液A中的溶液)制成濃度為100μl/ml]，每10μl樣品和標準樣品混合，向混合溶液加入50μl人凝血酶溶液(使用緩沖液B制成濃度為4U/ml)，然后在37℃保溫30分鐘。然后將150μl人抗凝血酶III溶液[用緩沖液C(用50mMtris-Hcl溶液(pH7.5)制成含有0.1M氯化鈉和1mM氯化鈣)制成濃度為50μl/ml]和50μl肝素溶液(用緩沖液C制成濃度為2U/ml)加入反應(yīng)液，再在37℃保溫15分鐘。向溶液中加入600ml底物溶液{25mgTestZyme S-2366(日本Daiichi Kagaku公司制造)在23.19ml緩沖液C中的溶液}，再在37℃保溫20分鐘，然后加入50％乙酸100μl終止反應(yīng)。將反應(yīng)液在波長405nm測定吸收值在標準樣品(從兔肺得到的TM用緩沖液B分別稀釋成2，5，10，20和40mU/ml的溶液，用作標準樣品)吸收值的基礎(chǔ)上計算TM含量。
由上明顯可知，本發(fā)明通過使用簡單的吸收色譜，不僅可以較高的純化率濃縮和純化人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白，而且在使用較低比活度的凝血調(diào)節(jié)蛋白進行純化時可得到比高比活度的更大的純化率。下面是本發(fā)明方法的實施例的描述，但本發(fā)明并不限于下述實施例，其中相關(guān)附圖

圖1是實施例1中，含人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白的起始物(批號1)在羥基磷灰石柱子中吸收，用線性濃度梯度的硫酸鈉溶液洗脫得到的凝血調(diào)節(jié)蛋白的洗脫圖形。
圖2是實施例2中，起始物(批號2)使用同樣的過程得到的凝血調(diào)節(jié)蛋白的洗脫圖形。
圖3是照片，顯示在還原和非還原的條件下，SDS聚丙烯酰胺與實施例1得到的純化的人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白的凝膠電泳結(jié)果。
實施例1下述描述是從兩批不同的2000L人尿純化得到的結(jié)果。將2000L體積的人尿調(diào)到pH 5.5并摻合0.5％(w/v)脫乙酰殼多糖溶液作為吸收劑，然后攪拌。將溶液混合物在pH 5.5保持30分鐘，然后過濾，用水洗滌，然后懸浮在5％硫酸銨溶液(pH 10.5)中，在室溫攪拌1小時。將懸浮液過濾，然后洗滌以洗脫吸收組分，用60％硫酸銨進行分離，且過濾除去沉淀。將分離出的沉淀溶于20mM Tris-Hcl緩沖液(pH 8.0)，并使用同樣的緩沖液對溶液進行滲析，然后將它用于一柱子，此柱子為DEAE-Toyopearl 650M(樹脂量1.2L；115×11cm)(由日本Tosoh公司制造)預(yù)先用同樣的緩沖液飽和過。柱子用同樣的緩沖液洗滌，洗脫使用含0.3M氯化鈉的相同的緩沖液進行。洗脫出的部分用20mM Tris-Hcl緩沖液(pH 8.0)稀釋到3倍量，然后溶液再與氯化鈣混合達到最后的濃度為5mM。將混合物用于DIP-凝血酶結(jié)合的瓊脂糖凝膠柱(樹脂量為40ml；2.5×8cm)，此柱子預(yù)先用含有0.1M氯化鈉和5mM氯化鈣的Tris-Hcl緩沖液(pH 8.0)飽和，用同樣的緩沖液洗滌柱子后，用含有2M氯化鈉和10MEDTA的20mM Tris-Hcl緩沖液(pH 8.0)進行洗脫。洗脫出的部分用含有0.4mM氯化鈣和0.9％氯化鈉的5mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)滲析，然后用于羥基磷灰石柱子(吸收劑的量為20ml；1.0×25cm)(由日本Seikagaku Kogyo K.K.公司制造)此柱預(yù)先用同樣的緩沖液飽和過。將柱子用同樣的緩沖液洗滌，用5-300mM線性濃度梯度的磷酸鈉溶液進行洗脫，TM活性組分首先被洗脫出來，如附圖1(第一批)附圖2(第二批)中的尖峰，然后雜質(zhì)被洗脫出來。將活性組分濃縮，濃縮產(chǎn)物用于Sephacryl S-300柱，(樹脂量80ml；1.5cm×90cm)(由瑞典藥物公司制造)，此柱預(yù)先用含有0.9％氯化鈉的25mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)飽和過，然后用同樣的緩沖液洗脫。表1是經(jīng)過兩次純化的結(jié)果，它顯示出即使使用低比活度的起始物進行純化，羥基磷灰石色譜也能提供令人滿意的高比活度的純化產(chǎn)物。附圖3顯示的是最后純化的產(chǎn)物在還原和非還原的條件下，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示的結(jié)果，圖形顯示兩個相鄰的帶(在分子量7000左右的是在還原條件下進行的)，特征在于在兩批起始物中均檢測到TM。表1總活性U 產(chǎn)率％ 比活度U/mg純化率I羥基磷灰石色譜5,556100 446.3 1.0前(第一批)羥基磷灰石色譜4,48381 1,306.9 2.9后(第一批)羥基磷灰石色譜3,071100 28.7 1.0前(第一批)羥基磷灰石色譜2,56584 674.6 23.5后(第一批)實施例2為了確定純化產(chǎn)物均由TM組成，進一步測定氨基酸組成和N-末端氨基酸序列。用6N鹽酸水解，使用氨基酸分析儀(美國Beckmann公司制造)分析氨基酸的組成，而N-末端氨基酸序列使用蛋白序列儀473A(美國Applied Bio-System公司制造)。氨基酸分析結(jié)果列于表2，所測定的N-末端氨基酸序列如下N-末端氨基酸序列Ala-Pro-Ala-Glu-Pro-＝Gln-Pro-Gly-Gly-SEr-Gln-表2純化的TM Ref..Asx47.047Thr18.219Ser23.224Glx55.150Pro49.643Gly50.846Ala52.752CysN.D.46Val24.625Met4.9 4Ile11.313Leu34.032Tyr9.5 10Phe16.516Lys3.0 3His11.012Arg17.220TrpN.D.6注N.D.表示“未檢測到”。
Ref.值是從TM蛋白的氨基酸序列Ala 1到Asp 468計算出來的。
Asx代表(Asp+Asn)，而Glx代表(Glu+Gln)。
權(quán)利要求
1.一種純化凝血調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于所述方法包括使用羥基磷灰石作為吸收劑的吸收色譜純化人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白。
2.一種純化凝血調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于所述方法包括將含有人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白的原料倒入由羥基磷灰石填充的柱子用以吸收凝血調(diào)節(jié)蛋白，然后從羥基磷灰石上解吸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中含有凝血調(diào)節(jié)蛋白的原料是人的原尿，其通過硫酸銨分離獲得的濃縮產(chǎn)物或其通過離子交換色譜或凝血酶結(jié)合的親和色譜預(yù)純化的產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求2的方法，其中吸收在pH5-8的條件下進行，解吸使用濃度梯度的磷酸進行。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中純化可單獨進行或與離子交換色譜，凝血酶結(jié)合的親和色譜和凝膠滲透色譜結(jié)合使用。
全文摘要
本發(fā)明使得人尿凝血調(diào)節(jié)蛋白可以簡單實用的方法純化，而且它可使具有較低含量的凝血調(diào)節(jié)蛋白起始物比高含量的凝血調(diào)節(jié)蛋白起始物更大的純化率純化。
文檔編號C07K14/435GK1151406SQ9611246
公開日1997年6月11日 申請日期1996年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月24日
發(fā)明者梶原淳一, 淺田亞希, 柴田梢, 加藤和夫 申請人:日本化學(xué)研究股份有限公司