專利名稱：：豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的提取純化方法，尤其是一種從豬血中提取純化殺菌性/通透性增加蛋白(簡稱BPI)的方法。已知BPI是一種存在于人及兔等哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞(簡稱PMNL)中的陽性蛋白質(zhì)，是一種強(qiáng)有力的殺菌物質(zhì)，具有特異殺滅革蘭氏陰性菌及中和內(nèi)毒素的活性，因此，人們欲從人及兔的PMNL中提取BPI，以期應(yīng)用于臨床，然而傳統(tǒng)的BPI提純方法為1.將人或兔的純化PMNL采用研磨法破壞細(xì)胞膜，并用0.16N硫酸抽提得粗提液；2.將粗提液經(jīng)過三次柱層析即葡聚糖G-75或G-50、葡聚糖C-50和葡聚糖G-100得到純化的BPI。這種提取純化法存在有不足之處1.原料資源匱乏，不易得；2.采用研磨法破壞細(xì)胞膜，污染度高；3.經(jīng)過三次柱層析，工作量大，設(shè)備條件要求高且不易控制，耗時(shí)長達(dá)1-2周。由于上述原因，使其成本高，不易得，阻礙了它的價(jià)值發(fā)揮。本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快捷、經(jīng)濟(jì)的BPI的提取純化法。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，豬血的PMNL中存在有BPI，它是一帶正電荷的蛋白質(zhì)，它與G-菌外膜的內(nèi)毒素帶負(fù)電荷部分有很高的親和力，這種親和力大大超過與其他物質(zhì)的親和力，而且這種結(jié)合中的BPI可被高濃度Mg2+所取代下來。鑒于上述觀點(diǎn)，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法為首先將豬血中純化的PMNL采用冷凍法制取BPI粗提液；再以大腸桿菌作為結(jié)合菌進(jìn)行孵育、離心得到結(jié)合菌體；然后從結(jié)合菌體中分離出蛋白質(zhì)；最后進(jìn)行透析，離心得純化BPI。其中所述BPI粗提液的制取是指將純化的BPI進(jìn)行冷凍，反復(fù)凍融三次或三次以上，并用0.16N硫酸抽提得PH為4.0的BPI粗提液。其中所速結(jié)合菌體的制法是指將大腸桿菌15菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使其J5菌終濃度為5×108cfu/ml，在37℃條件下孵育10-15min，離心收集結(jié)合菌體。其中所述分離蛋白質(zhì)的條件為將所得結(jié)合菌體置于PH4.0的緩沖液中，使結(jié)合菌體終濃度為5×109cfu/m1，37℃振蕩孵育15min，在4℃，23000×g條件下離心20min，取上清，該上清為分離出的蛋白質(zhì)。其中所述的透析、離心條件為將2000倍于上述上清體積的透析液中透析24小時(shí)，在4℃，23000×g條件下離心20min得純化的BPI。其中所述結(jié)合菌體制法中所指的PH4.0緩沖液為200mMMgCl2/10mMHAc/NaAc。其中所述透析液是指10mMHAC/NaPH4.0緩沖液。該方法采用的設(shè)備簡單，條件易控制，耗時(shí)短，時(shí)間不會(huì)超過48小時(shí)；采用冷凍法破壞細(xì)胞膜，將污染度降為最低，且較研磨法又節(jié)省了人力；豬血價(jià)廉易得，使其從原材料及設(shè)備均降低了成本，綜上所述，這是一種簡單、快捷、經(jīng)濟(jì)的提純BPI的方法，從整體上降低了BPI的成本，而且該法獲得的BPI經(jīng)測試其純化倍數(shù)及純度已能滿足臨床需求，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述一種豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法為首先將豬血中純化的PMNL采用冷凍法制取BPI粗提液；再以大腸桿菌作為結(jié)合菌進(jìn)行孵育、離心得到結(jié)合菌體；然后從結(jié)合菌體中分離出蛋白質(zhì)；最后進(jìn)行透析，離心得純化BPI。其中所述BPI粗提液的制取是指將從豬血中純化的PMNL進(jìn)行冷凍，冷凍溫度為0℃反復(fù)凍融三次，并用0.16N硫酸抽提得PH為4.0的BPI粗提液。其中所述結(jié)合菌體的制法是指將大腸桿菌J5菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使J5菌終濃度為5×108cfu/ml，在37℃條件下孵育10-15min，用離心機(jī)在1000rpm×10min條件下離心收集結(jié)合菌體。其中所述分離蛋白質(zhì)的條件為將所得結(jié)合菌體置于PH4.0的200mMMg(Gl2/10mMHAc/NaHAc緩沖液中，使結(jié)合菌體終濃度為5×109cfu/ml，37℃振蕩孵育15min，在4℃，23000×g條件下離心20min，取上清，該上清為分離出的蛋白質(zhì)。其中所述的透析、離心條件為將2000倍于上述上清的體積10mMHAc/NaACPH4.0緩沖液中透析24小時(shí)，在4℃，23000×g條件下離心20min得純化的BPI。對所得的BPI與從豬血中PMNL按傳統(tǒng)的柱層析法提純的BPI測試進(jìn)行對比，得表1表1.兩種方法對比表<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="804">蛋白獲取量(％)殺菌活性*中和內(nèi)毒素能力純化倍數(shù)本發(fā)明0.10.7530.9103傳統(tǒng)法0.10.0851.0170</table></tables>*殺菌活性為殺死90％3×107大腸桿菌所需蛋白的毫克數(shù)。權(quán)利要求1.一種豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法，其特征在于首先將豬血中純化的PMNL采用冷凍法制取BPI粗提液；再以大腸桿菌作為結(jié)合菌進(jìn)行孵育、離心得到結(jié)合菌體；然后從結(jié)合菌體中分離出蛋白質(zhì)；最后進(jìn)行透析，離心得純化BPI。2.如權(quán)利要求1所述的豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法，其特征在于所述BPI粗提液的制取是指將豬血中純化的PMNL進(jìn)行冷凍，反復(fù)凍融三次或三次以上，并用0.16N硫酸抽提得PH為4.0的BPI粗提液。3.如權(quán)利要求1所述的豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法，其特征在于所述結(jié)合菌體的制法是指將大腸桿菌15菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使J5菌終濃度為5×108cfu/ml，在37℃條件下孵育10-15min，離心收集結(jié)合菌體。4.如權(quán)利要求1所述的豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法，其特征在于所述分離蛋白質(zhì)的條件為將所得結(jié)合菌體置于PH4.0的緩沖液中，使結(jié)合菌體終濃度為5×109cfu/ml，37℃振蕩孵育15min，在4℃，23000×g條件下離心20min，取上清，該上清為分離出的蛋白質(zhì)。5.如權(quán)利要求1所述的豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法，其特征在于所述的透析、離心條件為將2000倍于上述上清體積的透析液中透析24小時(shí)，在4℃，23000×g條件下離心20min得純化的BPI。6.如權(quán)利要求4所述的豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法，其特征在于所述PH4.0緩沖液為200mMMgCl2/10mMHAc/NaAc。7.如權(quán)利要求5所述的豬血中提純殺菌性/通透性增加蛋白的方法，其特征在于所述的透析液為10mMHAc/NaAcPH4.0緩沖液。全文摘要本發(fā)明涉及一種從豬血中提取純化殺菌性/通透性增加蛋白(簡秒BPI)的方法。該法為首先將豬血中純化的PMNL采用冷凍法制取BPI粗提液；再以大腸桿菌作為結(jié)合菌進(jìn)行孵育、離心得到結(jié)合菌體；然后從結(jié)合菌體中分離出蛋白質(zhì)；最后進(jìn)行透析，離心得純化BPI。該法采用的設(shè)備簡單，條件易控制，耗時(shí)短，污染度低，成本低，而且該法獲得的BPI經(jīng)測試其純化倍數(shù)及純度已能滿足臨床需求，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C07K1/00GK1156726SQ96117850公開日1997年8月13日申請日期1996年12月20日優(yōu)先權(quán)日1996年12月20日發(fā)明者周紅申請人:周紅