專利名稱：：奎尼定綴合物及其在免疫測(cè)定中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及奎尼定綴合物及其在對(duì)試驗(yàn)樣品中定量的奎尼定的免疫測(cè)定中的應(yīng)用，以及，更具體地，涉及用于產(chǎn)生抗奎尼定抗體及用于合成與報(bào)道試劑結(jié)合的綴合物的奎尼定衍生物。本發(fā)明也涉及用于合成含親水接頭的奎尼定綴合物的單保護(hù)的親水性雙胺試劑。技術(shù)背最特殊的結(jié)合反應(yīng)，如抗體-抗原相互作用，已被廣泛地用于免疫測(cè)定中，以檢測(cè)和/或定量分析存在于生物體液中的藥物或其它令人感興趣的化合物。這樣的免疫測(cè)定已被發(fā)展用于測(cè)定多價(jià)抗原，如蛋白質(zhì)，以及半抗原。作為分子定義的半抗原太小，以致于將其用于動(dòng)物時(shí)不能刺激抗體的產(chǎn)生，也就是說(shuō)，半抗原本身是非免疫原性的。但是，本領(lǐng)域公知，通過將半抗原與合適的載體分子共價(jià)結(jié)合(綴合)而產(chǎn)生免疫原性。將這樣的免疫原性的綴合物用于動(dòng)物時(shí)，通常會(huì)引起抗體譜的產(chǎn)生，一些抗體抗載體天然的抗原位點(diǎn)(表位)，而一些抗體抗結(jié)合的半抗原分子。合適的載體通常含有聚(氨基酸)片段，包括多肽，蛋白質(zhì)和糖蛋白?？墒褂玫妮d體的特例為鑰孔血藍(lán)素(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)，γ-球蛋白和植物球蛋白(例如，南瓜籽球蛋白)。各種化學(xué)物質(zhì)已被用來(lái)制備產(chǎn)生抗-半抗原抗體所必須的免疫原性的半抗原-載體綴合物。由于天然的載體通常含有一定數(shù)量的賴氨酸殘基，而后者又含有活性氨基，因此，一種特別有用的方法利用了含胺-反應(yīng)性官能團(tuán)的半抗原或半抗原衍生物與載體的反應(yīng)。這種方法的一個(gè)重要的方面是由羧基官能化的半抗原和半抗原衍生物迅速地轉(zhuǎn)化為合適的氨-反應(yīng)中間體。奎尼定，本申請(qǐng)?zhí)貏e關(guān)注的半抗原，為有效的藥用化合物。它作為抗心律不齊藥物的價(jià)值是由于在使用這些藥物治療并發(fā)房纖顫的瘧疾病人時(shí)，偶然“治愈”了他們的心律不齊而偶然發(fā)現(xiàn)的。在肝和/或腎無(wú)疾病的情況下，奎尼定的生物半衰期是約6小時(shí)。部分藥物無(wú)變化地由腎臟排泄，剩余部分由肝臟代謝產(chǎn)生無(wú)抗心律不齊活性的產(chǎn)物?？岫ㄍㄟ^直接作用于心肌及間接作用于傳導(dǎo)系統(tǒng)而影響心臟的速率和節(jié)律?？岫ń档团d奮性，傳導(dǎo)速度和心肌收縮力?？岫ń?jīng)常產(chǎn)生不需要的胃腸道副作用，該副作用多少與劑量相關(guān)。血漿藥物水平的檢測(cè)所提供的信息有助于在最大程度地限制不需要的副作用的同時(shí)保持適當(dāng)?shù)闹委熕?。但是，天然奎尼定不含上述的?反應(yīng)性官能團(tuán)。因此必須將其合成為合適的奎尼定衍生物。奎尼定中的C-10-C-11雙鍵特別地提供了開始反應(yīng)的位置?？际系?Kobayashietal.)(聚合物科學(xué)雜志(JournalofPolymerScience)PolymerLettersEdition，vol.20，85-90，F(xiàn)unctionalPolymers9。新金雞納生物堿衍生物不對(duì)稱催化(AsymmetricCatalysisbyNewCinchonaAlkaloidDerivatives)。不對(duì)稱誘導(dǎo)中C(3)取代基的作用(EffectofC(3)SubstituentOnAsymmetricInduction)，JohnWileyandSons，Inc.，)公開了在奎尼定C-11位具有有機(jī)硫基團(tuán)的金雞納生物堿的合成。但是，并未制備出含有適于本發(fā)明目的的官能團(tuán)的衍生物。公開于1991年10月31日國(guó)際公開號(hào)為WO91/16322的國(guó)際PCT申請(qǐng)和公開于1993年4月15日國(guó)際公開號(hào)為WO93/07142的國(guó)際PCT申請(qǐng)公開了奎尼定和奎尼定衍生物作為不對(duì)稱羥基化催化劑的用途。所公開的化合物包括作為臨界控制劑的C-11位由磺酰基或磺?；愌苌目岫ㄑ苌铩Ｍ瑯?，這些衍生物也不含有適于本發(fā)明目的的官能團(tuán)。特別地，尚沒有參考文獻(xiàn)提及或暗示用于奎尼定免疫測(cè)定的合成的免疫原性的綴合物或報(bào)道試劑(例如粒子試劑)的奎尼定衍生物的制備。目前需要奎尼定綴合物并將其應(yīng)用于試驗(yàn)樣品中奎尼定的定量免疫測(cè)定以及，具體地，應(yīng)用于能夠及時(shí)地，精確地監(jiān)測(cè)奎尼定水平的產(chǎn)生抗-奎尼定抗體的奎尼定衍生物。發(fā)明概要本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括結(jié)構(gòu)式I的化合物，該化合物也可由內(nèi)鹽II表示，或離析為外鹽III其中x為1-2，而A-為一個(gè)陰離子，如氯離子，4-甲苯磺酸根離子，3-巰基丙酸根離子，等。當(dāng)x＝2時(shí)，結(jié)構(gòu)式I或II化合物被稱為“QAD-1”，QuinidineAcidDerivative，No.1的首字母縮寫詞。該化合物合適的化學(xué)名稱為11-(2-羧乙硫基)二氫奎尼定。另一個(gè)實(shí)施方案為要求保護(hù)化合物和載體的免疫原性綴合物，其中載體優(yōu)選聚(氨基酸)蛋白質(zhì)和糖蛋白。另一個(gè)實(shí)施方案為要求保護(hù)的化合物和報(bào)道試劑的綴合物。報(bào)道試劑為具有可使該試劑在樣品中的量被迅速地定量測(cè)定的化學(xué)或物理性質(zhì)的試劑。常見的報(bào)道試劑有乳膠顆粒，螢光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，發(fā)色團(tuán)，放射性物質(zhì)和酶。在適當(dāng)定型的測(cè)定中，藥物或其他令人感興趣的化合物與報(bào)道試劑的綴合物可被用來(lái)顯示樣品中的藥物的量和樣品中報(bào)道試劑的量(快速測(cè)量)。另一個(gè)實(shí)施方案為要求保護(hù)的化合物與一種報(bào)道試劑的綴合物，更特別地，其中要求保護(hù)的化合物經(jīng)親水連接與報(bào)道試劑綴合。另一個(gè)實(shí)施方案為一類用于在藥物和報(bào)道試劑的綴合物中導(dǎo)入親水接頭部分(Seqment)的單保護(hù)的親水性二胺。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為測(cè)定試驗(yàn)樣品中奎尼定的存在和/或含量的免疫測(cè)定法，其中的步驟為(a)將含要求保護(hù)的化合物與報(bào)道試劑形成的綴合物的報(bào)道試劑，試驗(yàn)樣品，和一種凝集試劑混合在一起，接著(b)按已知方法進(jìn)行凝集免疫測(cè)定。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明根據(jù)相應(yīng)的附圖，本發(fā)明將在下列詳細(xì)描述中變得更加清楚，該附圖也是本申請(qǐng)的一個(gè)組成部分，其中圖1表示用各種QAD-1蛋白免疫原性的綴合物免疫小鼠，使之產(chǎn)生抗奎尼定-抗體。該圖將在實(shí)施例3中更詳細(xì)地討論。圖2為濁度-抑制試驗(yàn)(turbity-inhibitiontest)數(shù)據(jù)的標(biāo)示圖，它表示溶液中游離的奎尼定與結(jié)合顆粒的奎尼定競(jìng)爭(zhēng)以限制抗體的量。該圖也將在實(shí)施例3中更詳細(xì)地討論。圖3表示奎尼定濁度抑制免疫測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。它將在實(shí)施例6，部分B中更詳細(xì)地討論。發(fā)明的描述本發(fā)明涉及奎尼定衍生物，由其制備的免疫原性的綴合物，由免疫原性的綴合物引發(fā)的抗體，針對(duì)報(bào)道試劑的奎尼定綴合物，以及它們?cè)诿庖邷y(cè)定中的應(yīng)用。本發(fā)明最終涉及兩種最終試劑，抗-奎尼定抗體和奎尼定-乳膠顆粒的制備。兩種最終試劑為測(cè)定體液中奎尼定的存在與量的測(cè)量系統(tǒng)的組成部分。在本發(fā)明中，通過C-10-C-11之間具有雙鍵的硫羥基-官能化的羧酸的反應(yīng)合成羧基-官能化的奎尼定衍生物。已知使用游離基化學(xué)可將硫羥基加到雙鍵上。例如，使用2，2’-偶氮雙(異丁腈)(AIBN)作為起始游離基源通過3-巰基丙酸(3-MPA)對(duì)奎尼定雙鍵的加成得到稱為QAD-1的衍生物?？梢栽O(shè)想，該反應(yīng)是在幾個(gè)步驟中發(fā)生的。下式中，圓點(diǎn)表示未成對(duì)的電子而QCH＝CH2表示奎尼定。1.游離基產(chǎn)生(起始階段)。2.游離基由碳轉(zhuǎn)移至硫，形成硫羥游離基。3.硫羥游離基加入奎尼定雙鍵。4.游離基由碳轉(zhuǎn)移至硫。5.步驟3和4的反應(yīng)循環(huán)多次，以令人滿意的產(chǎn)率將反應(yīng)物轉(zhuǎn)化成QAD-1。本發(fā)明的羧基-官能化的奎尼定衍生物可用載體綴合而形成免疫原。首先必需將羥基轉(zhuǎn)化為胺-反應(yīng)性基團(tuán)。羧基-官能化反應(yīng)劑向胺-反應(yīng)反應(yīng)劑的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。形式上，羧基中的羥基由負(fù)電性的或吸電子的原子或基團(tuán)取代，以使部分正電荷被誘導(dǎo)在羰基碳原子附近。某些可滿足上述需要的X的結(jié)構(gòu)如下表所示-Cl，-Br，-F酰菌酸酐或混合酐異脲酯異脲鎓酯Formadiniumester二甲基咪唑鎓酯琥珀酰亞胺基酯磺基琥珀酰亞胺基酯苯并三唑基酯6-氯苯并三唑基酯6-硝基苯并三唑基酯7-氯雜苯并三唑基酯氧代苯并三嗪基酯酰基鏻混合酐?；l混合酐混合磷酸酐?；⑺狒旌硝；沽姿狒；鹚峄旌萧?N3酰基疊氮化物咪唑化物咪唑鎓衍生物?；溥蜴f衍生物三唑化物1-甲基吡啶鎓-2-基酯，4-硝基苯酯三氯苯基酯五氯苯基酯四氟苯基酯五氟苯基酯硝基磺基苯酯三硝基磺基苯酯三嗪基酯苯并噁唑鎓酯噻吩并酯在本發(fā)明的特例中，使用二琥珀酰亞胺碳酸酯將QAD-1轉(zhuǎn)化成胺-反應(yīng)活性的琥珀酰亞胺基酯，然后使其與載體中的賴氨酸(胺)基團(tuán)反應(yīng)，得到免疫原性的綴合物(免疫原)。該免疫原可被用來(lái)使用的已知抗體生產(chǎn)和篩選方法誘導(dǎo)抗體。例如，可將免疫原注射到合適的動(dòng)物宿主體內(nèi)以刺激抗體的產(chǎn)生。既可將如此制得的抗體直接用于與半抗原或密切相關(guān)的類似物的特定的結(jié)合反應(yīng)，也可首先通過任何已知的方式，如親和層析，從動(dòng)物血清中純化。選擇性地，可使用本發(fā)明的綴合物篩選從被注射的宿主中得到的免疫淋巴細(xì)胞以選擇對(duì)免疫原性的綴合物有反應(yīng)的細(xì)胞。然后可將其與合適的骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生可產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。細(xì)胞融合，選擇及增殖的方法為已知方法，通常由考氏等的方法[Kohleretal.，Nature，Vol.256，495-497(1975)]修改而來(lái)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體為使用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體。使用本發(fā)明免疫原性的綴合物制備的抗-奎尼定抗體可被用于任何已知的免疫測(cè)定形式，以利用抗體和其半抗原之間的特定的結(jié)合反應(yīng)，測(cè)定試驗(yàn)樣品中游離的半抗原的存在和/或量。這樣的已知免疫測(cè)定形式的例子包括同源的，異源的，競(jìng)爭(zhēng)性的和直接的(非競(jìng)爭(zhēng)性的)形式。本發(fā)明的方法限于所要求的化合物與報(bào)道試劑，特別是乳膠顆粒的偶合。優(yōu)選的顆粒包括具有聚苯乙烯芯和已與乙二醇二異丁烯酸酯交聯(lián)的聚(縮水甘油基異丁烯酸酯)殼的顆粒。這種顆粒的制備和用途已在克氏等(Craigetal.)的美國(guó)專利No.4,480,042中公開，該文獻(xiàn)在此作為參考。這些顆粒表面的環(huán)氧基與胺，硫醇等迅速反應(yīng)，這一性質(zhì)可用來(lái)使各種令人感興趣的化合物附著在乳膠顆粒上。特別地，本發(fā)明使用環(huán)氧基與存在于親水性二胺接頭中的氨基的反應(yīng)。在這種連接中，應(yīng)當(dāng)提到的是由其他的胺-反應(yīng)活性劑-如醛，琥珀酰亞胺基酯，和烯丙基或芐基鹵化物官能化的乳膠顆粒也適用作本發(fā)明的報(bào)道反應(yīng)劑。通過高親水性接頭(有時(shí)也稱為間隔基或橋)將綴合物對(duì)的兩個(gè)組分偶合，隨后綴合物預(yù)定的功能為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)。下面是這種技術(shù)的-些例子(a)付氏等。作為顆粒反應(yīng)劑連接劑用于免疫測(cè)定的聚醚聚胺(W.A.FreyandD.M.Simons.Polyetherpolyaminesaslinkingagentsforparticlereagntsusefulinimmunoassays)。US4,581,337，April8，1986；(b)希氏等。使用于可釋放配體的特定結(jié)合的測(cè)定方法(D.M.Simons，S.Y.TsengandD.M.Obzansky.MethodforSpecificbindingassaysusingareleasableligand)。U.S.5,332,679，DuPont，July26，1994；(c)阿氏等。使用一種新的親水性交聯(lián)劑的單克隆抗體和葡萄球菌屬內(nèi)毒素A的綴合物的制備和性質(zhì)。生物綴合物化學(xué)4455-466(1993)(E.Akerblom，M.Dohlsten，C.Bryno，M.Mastej，I.Steringer，G.Hedlund，P.LandoandT.Kalland.PreparationandcharacterizationofconjugatesofmonoclonalantibodiesandstaphylococcalenterotoxinAusinganewhydrphiliccross-liker.BioconjugateChem.4455-466(1993)；(d)胡氏等(E，Huber，D.Zdunek，C.KleinandR.Schenk)。Hapten-Biotin-KonjugateundIhreVerwendung.EP0451810Al，April10，1991(Boehringermannheim)。假定好的效果由兩種因素的結(jié)合得到減少空間位阻和降低存在于綴合物這種或那種組分或者其它可隨后加入的反應(yīng)劑中的疏水區(qū)與親水性接頭的非特異性，非共價(jià)相互作用。在本例子中，使用這樣的親水性間隔基提高奎尼定測(cè)定的精度和準(zhǔn)確度。含有氧亞乙基單元的二胺或多胺試劑特別適用于親水性接頭。一些特例為H2NCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH21，8-二氨基-3，6-二氧雜辛烷杜邦編碼名稱DA-10商品名JeffamineEDR-148制造商或來(lái)源TexacoChemicalCo.pKa(兩個(gè)氨基相同)9.4H2NCH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NH21，10-二氨基-4，7-二氧雜癸烷杜邦編碼名稱DA-12制造商或來(lái)源TokyoKasel，Inc.，911N.HarborgateSt.，Portland，ORpKa(兩個(gè)氨基相同)9.98H2NCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH21，11-二氨基-3，6，9-三氧雜十一碳烷杜邦編碼名稱DA-13商品名JeffamineEDR-192制造商或來(lái)源TexacoChemicalCo.pKa(兩個(gè)氨基相同)9.4H2NCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH21，13-二氨基-4，7，10-三氧雜十三碳烷杜邦編碼名稱DA-15制造商或來(lái)源FlukapKa(兩個(gè)氨基相同)10.02在上述材料的杜邦編碼名稱中，“DA”表示二胺，數(shù)字表示除末端氫原子外的鏈中原子的數(shù)目。含氧亞乙基鏈的分子中固有的較低的非特異性，非共價(jià)的分子內(nèi)部相互作用與它們類似物有關(guān)，表明了物理性質(zhì)。例如，DA-10在室溫下為液體，但它的全烴類似物，1，8-二氨基辛烷為熔點(diǎn)為52℃的固體。本發(fā)明的奎尼定-親水性間隔基-報(bào)道試劑綴合物可以幾種方式制備。例如，可使用下列3步法(a)將羧基官能化的藥物衍生物(如QAD-1)轉(zhuǎn)化成胺-反應(yīng)活性的衍生物；(b)使胺-反應(yīng)活性的藥物衍生物與親水性二胺的一個(gè)氨基偶合；以及(c)將制得的綴合物與胺-反應(yīng)活性的報(bào)道試劑接觸，形成所需的藥物-親水性間隔基-報(bào)道試劑綴合物?；蛘?，選擇性地，(a)使胺-反應(yīng)活性報(bào)道試劑和親水性二胺的一個(gè)氨基偶合；(b)將羧基官能化的藥物衍生物轉(zhuǎn)化成胺-反應(yīng)活性的衍生物；以及(c)將兩種試劑結(jié)合形成需要的藥物-親水性間隔基-報(bào)道試劑綴合物。本發(fā)明的方法中，羧基-官能化的QAD-1通過與二琥珀亞胺基碳酸酯反應(yīng)的方式被轉(zhuǎn)化成胺-反應(yīng)活性的琥珀酰亞胺基酯。上述各個(gè)親水性二胺的兩個(gè)氨基具有相同的堿性，如pKa值反映出的，以及對(duì)各種胺-反應(yīng)活性試劑具有相同的反應(yīng)性。這些二胺與限量的胺-反應(yīng)活性試劑的反應(yīng)總是得到含兩種反應(yīng)物加未反應(yīng)的二胺的混合物。最終反應(yīng)混合物中的各組分的摩爾分?jǐn)?shù)為最初的化學(xué)計(jì)量的函數(shù)。產(chǎn)物的理論公布如表1所示。表1作為化學(xué)計(jì)量函數(shù)的理論產(chǎn)物分布*二胺與胺-反應(yīng)活性試劑的摩爾比轉(zhuǎn)化成二取代的二胺的胺-反應(yīng)活性藥物衍生物的量通常都丟失了。當(dāng)該衍生物很昂貴或難于定量合成時(shí)，這可能是個(gè)主要問題。作為化學(xué)計(jì)量函數(shù)的藥物衍生物的理論損失如表2所示表2作為化學(xué)計(jì)量函數(shù)的藥物衍生物理論損失*二胺與胺-反應(yīng)活性試劑的摩爾比通過胺-反應(yīng)活性藥物衍生物與半保護(hù)的親水性二胺，即，其中一個(gè)氨基預(yù)先已由適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基封閉的親水性二胺的反應(yīng)可避免產(chǎn)生混合產(chǎn)物以及由此帶來(lái)的有價(jià)值的藥物衍生物的損失。上述保護(hù)基必須在與胺-反應(yīng)活性藥物衍生物的反應(yīng)中使用的所有條件下保持完整，而且隨后必須容易除去。在本例中，已發(fā)現(xiàn)叔丁氧羰基(Boc)為令人滿意的保護(hù)基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種既可提供所需要的半保護(hù)的中間體，又可避免二保護(hù)的二胺和未反應(yīng)的二胺的方法。該方法包括下列連續(xù)的步驟(a)在氫氧化鈉存在下在水/有機(jī)介質(zhì)中使二叔丁基二碳酸酯(‘Boc’酐)與過量親水性二胺反應(yīng)。(b)除去有機(jī)溶劑，使系統(tǒng)基本上轉(zhuǎn)入水相。(c)降低水相的pH值，以確保所有剩余的氨基基本上都處于被質(zhì)子化的形式。(d)使用與水不混溶的有機(jī)溶劑萃取水相，除去非堿性物質(zhì)。(e)升高水相的pH值，以確保一半或一半以上的剩余的氨基處于未質(zhì)子化的形式。(f)將鹽加入水相。(g)用水不混溶的有機(jī)溶劑萃取水相。(h)分離有機(jī)相。(i)從有機(jī)相中除去溶劑，得到所需的產(chǎn)物。利用半-Boc親水性二胺中間體，由單保護(hù)的二胺合成藥物-親水性間隔基-報(bào)道試劑綴合物的方法圖解如下(a)將羧基-官能化的藥物衍生物轉(zhuǎn)化成胺-反應(yīng)活性衍生物。(b)使胺-反應(yīng)藥物衍生物與單保護(hù)的親水性二胺的氨基偶合。(c)除去保護(hù)基。(d)從胺鹽釋放游離胺。(e)使如此制得的藥物-親水性接頭綴合物與胺-反應(yīng)活性報(bào)道試劑(這里是環(huán)氧基-官能化的乳膠顆粒)反應(yīng)。步驟(d)和(e)通常在相同的反應(yīng)罐中一起進(jìn)行。這里描述的藥物-親水性接頭-報(bào)道試劑綴合物可用于任何已知的使用報(bào)道試劑測(cè)定試驗(yàn)樣品中的藥物，如奎尼定的存在和/或量的免疫測(cè)定形式。優(yōu)選的使用本發(fā)明的藥物-親水性接頭-顆粒報(bào)道試劑(顆粒試劑)的免疫測(cè)定形式為顆粒增強(qiáng)的濁度抑制免疫測(cè)定(PETINIA)。這種免疫測(cè)定形式利用了已將藥物或其他令人感興趣的化合物附著在上面的微小乳膠顆粒(例如70nm)。例如，當(dāng)用波長(zhǎng)大于懸浮顆粒的直徑(例如，340nm)的單色光觀察時(shí)，該懸浮液基本上是透明的。在適宜條件下，加入對(duì)顆粒上的藥物具有特異性的抗體將導(dǎo)致顆粒凝集。這些凝集物很大，足以散射光線，這導(dǎo)致懸浮液變得混濁。加入含有游離藥物的樣品時(shí)，游離藥物與結(jié)合在顆粒上的藥物競(jìng)爭(zhēng)抗體，因而抑制凝集的速度和程度。這提供了定量樣品中藥物的量的基礎(chǔ)。特別地，本發(fā)明的奎尼定-親水性間隔基-顆粒試劑和抗-奎尼定抗體可提供一種快速，精確，準(zhǔn)確的測(cè)定存在于生物體液中的奎尼定的量的PETINIA法。其它可使用本發(fā)明的報(bào)道試劑的已知免疫測(cè)定形式包括直接的凝集顆粒為基礎(chǔ)的免疫測(cè)定，酶聯(lián)免疫吸附免疫測(cè)定，和螢光法免疫測(cè)定，下列實(shí)施例是說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例1奎尼定衍生物(QAD-1)的合成將裝有磁攪拌棒，加熱罩，回流冷凝器，和干燥氮?dú)馊肟诠芎统隹诠艿?50mL二頸燒瓶用干燥氮?dú)鈴氐浊逑床⒀b入13.00g(0.040mol)奎尼定(AldrichChemicalCo.，Inc.WI)，80mL氯仿(VWRScientific，Inc.，NJ)，和14mL(0.16mol)3-巰基丙酸(AldrichChemicalCo.，Inc.WI)。加入偶氮雙(異丁腈)(660mg；Polysciences，Inc.，PA)，并將該混合物回流12-15小時(shí)。之后加入另一部分偶氮雙(異丁腈)(550mg)并繼續(xù)回流12-15小時(shí)。將該溶液冷卻至室溫，在攪拌下滴到700mL無(wú)水乙醚中。分出粘合的沉淀。將燒瓶在冰浴中冷卻30分鐘，然后潷析醚層。將殘留物用沸騰的醚(每次500mL)萃取三次，這將使其轉(zhuǎn)化成細(xì)粉狀物(重量，18g)。對(duì)硫羥基含量的分析顯示這時(shí)的產(chǎn)物含QAD-1的3-巰基丙酸(3-MPA)鹽的實(shí)際的量每mg樣品0.594μmole硫羥基(＝0.0594mole/100g)，這相當(dāng)于73mole％QAD-1內(nèi)鹽和23mole％QAD-1∶3-MPA外鹽。將未純化的產(chǎn)物溶于80mL氯仿，并將該溶液倒入250mL水中。將一個(gè)pH電極插入水相，溫和地?cái)嚢杌旌衔?，小心地加入固體碳酸氫鈉直到pH穩(wěn)定在7.0-7.2。分出氯仿層，用硫酸鎂干燥，并在攪拌下滴入650mL無(wú)水乙醚中。過濾收集分離出的精細(xì)的白色固體狀產(chǎn)物，重，15.3g。硫羥基分析顯示每mg該物質(zhì)的樣品中含0.042μmole硫羥基。將該物質(zhì)在100mL乙醇中回流30分鐘。(注它不完全溶解)。然后將該混合物在冰浴中冷卻2-3小時(shí)，過濾收集產(chǎn)物。重量，11.7g(75％理論值)。硫羥基含量為每mg樣品0.030μmole硫羥基(＝0.003mole/100g)，對(duì)應(yīng)98.7mole％QAD-1內(nèi)鹽和1.3mole％QAD-1∶3-MPA外鹽的組合物。通過將其溶于氯仿并加入含理論量的4-甲苯磺酸，可將QAD-1轉(zhuǎn)化成4-甲苯磺酸外鹽。實(shí)施例2奎尼定-蛋白質(zhì)綴合物的制備所使用的蛋白質(zhì)為鑰孔血藍(lán)素(KLH)，兔γ-球蛋白(RaIgG)，南瓜籽球蛋白(PSG)，和卵白蛋白(都來(lái)自SigmaChemicalCo.，Inc.，MO)。通過在25mL150mM碳酸氫鈉溶液中將蛋白質(zhì)(150mg)攪拌數(shù)小時(shí)并離心除去任何不溶物(如果需要的話)而制得KLH，RaIgG和卵白蛋白溶液。通過加PSG(105mg)溶于含4M氯化鈉的25mL150mM碳酸氫鈉而制得PSG溶液。QAD-1琥珀酰亞胺基酯貯存液的制備。將QAD-1(120.45mg)，二琥珀酰亞胺基碳酸酯(78.83mg)，3344μL無(wú)水二甲亞砜和45μL三乙胺在一個(gè)配衡管形瓶中合并。溶液的總重量為3.963g。將該溶液在室溫放置1.5小時(shí)。溶液的密度通過對(duì)1000μL樣品稱重測(cè)定，為1.0893mg/μL。如果假定該反應(yīng)是定量進(jìn)行的，那么QAD-1琥珀酰亞胺基酯的濃度為(120.45×1.0893)/(430.56×3963)＝7.69×10-5mmol/μL。綴合物合成。按下面給出的量KLH(878μL)；PSG(878μL)；卵白蛋白(878μL)；和PaIgG(750μL)，將QAD-1琥珀酰亞胺基酯貯備液加入各蛋白溶液中。將該溶液放置過夜，然后對(duì)150mM碳酸氫鈉的3次變化和碳酸鹽-緩沖的鹽水的3次變化透析。透析結(jié)束時(shí)，各溶液的表現(xiàn)如下KLH綴合物，略有混濁；γ-球蛋白綴合物，含一些沉淀；RaIgG綴合物，含很多沉淀(由于鹽濃度低)；卵白蛋白，透明。實(shí)施例3免疫和抗體試驗(yàn)流程簡(jiǎn)述分別用三種劑量的奎尼定-KLH綴合物和奎尼定-兔γ-球蛋白綴合物和奎尼定-PSG綴合物對(duì)三批各五只的雌性BALB/c鼠注射。將各存在于合適的綴合物中的藥劑在零天用完全的弗氏佐劑，在28天和56天用不完全的弗氏佐劑乳化，在開始免疫作用后42和70天采血。通過ELISA法測(cè)定對(duì)奎尼定的小鼠IgG效價(jià)。室溫下將塑料微量滴定板(ImmulonII，Dynatech，Inc.，VA)用奎尼定-卵白蛋白綴合物(6mg/mL在0.1M碳酸鹽中，pH9.6)，50μL/well，包被3小時(shí)并用10mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次。將抗血清用含1％BSA和0.05％Tween20(PBT)(SigmaChemicalCo.，MO)的PBS稀釋并在37℃用抗原包被的板溫育1小時(shí)。將該板用PBS洗滌三次，在37℃用50μL/孔用辣根過氧化物酶(ZymedCo.，Catalogno.61-6020，1∶1000含0.05％Tween20的PBS中)標(biāo)記的抗-小鼠IgG家兔免疫球蛋白(gamma鏈專一)溫育1小時(shí)。將各孔用PBS洗滌三次，并通過加100μL/孔過氧化物酶底物ABTS(2，2’-連氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸二銨鹽)(Kierkegaard&amp;PerryCo.，MD，Catalogno.50-66-1)，在室溫下放置20分鐘，然后在405nm觀察光吸收而測(cè)定小鼠IgG的存在。血清取出42天的結(jié)果(見圖1)顯示在兩種劑量的免疫原后，所有三種綴合物都能誘導(dǎo)奎尼定-特異的IgG抗體的產(chǎn)生。(在圖1中，縮寫詞‘NMS’表示未免疫血清，用作對(duì)照)通過顆粒-增加的濁度抑制免疫測(cè)定法(PETINIA)測(cè)定小鼠血清對(duì)游離奎尼定的反應(yīng)性。使用與下面實(shí)施例6所述基本相同的方法制備在其表面共價(jià)偶合著奎尼定的乳膠顆粒(奎尼定顆粒試劑；QPR)。將此奎尼定顆粒試劑(QPR)以1∶100的比例稀釋在由10mM磷酸鹽，pH6.9，0.4％GAFACRE-610，4％聚乙二醇8000組成的緩沖溶液(PGP緩沖液中。將由奎尼定-KLH綴合物(70天)和奎尼定(SigmaChemicalCo.，MO；0mg/mLDMSO中)免疫接種的小鼠混合抗血清稀釋在PGP緩沖液中。通過在96-孔，平底微量滴定板的孔中將50μL稀釋的小鼠血清(1∶200)與200μL稀釋的奎尼定顆粒試劑(QPR)(1∶1000)混合而開始測(cè)定。通過將游離的奎尼定摻入稀釋的預(yù)先混入抗血清的奎尼定顆粒試劑抑制奎尼定顆粒試劑的凝集。圖2顯示與樣品中奎尼定摩爾濃度相對(duì)的透光度。該數(shù)據(jù)說(shuō)明用本發(fā)明所述的奎尼定-蛋白質(zhì)免疫原性的綴合物免疫化的小鼠產(chǎn)生了在溶液中結(jié)合游離奎尼定的抗體。實(shí)施例4單叔丁氧羰基化的親水性二胺Boc-DA-10的制備在一個(gè)裝有機(jī)械攪拌器，溫度計(jì)和滴液漏斗并在冰浴中冷卻的2-升燒瓶中裝入68g(0.458mole)DA-10，230mL水，460mL二噁烷和229mL1NNaOH。攪拌混合物，直至溫度低于10℃。劇烈攪拌該溶液并滴加Boc酐(50g；0.227mole)，同時(shí)燒瓶?jī)?nèi)溫度保持在10℃以下。加完后，使該混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒎胖眠^夜。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去反應(yīng)混合物中的大部分二噁烷，這導(dǎo)致了油層的分離。將該混合物用1M硫酸氫鈉調(diào)至pH7(約需730mL)并用每份100mL的乙醚萃取三次。棄去乙醚萃取液。用50％氫氧化鈉溶液將水相的pH值調(diào)至9.4，加入175g氯化鈉(大約半飽和)，并將該鹽水溶液用每份100mL的氯仿萃取三次。如果需要，各次萃取后將pH再調(diào)至9.4。將氯仿萃取液合并并用硫酸鎂干燥。為了這個(gè)步驟接近完全，將水浴溫度升至45℃，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀盡可能完全地除去氯仿。殘留物重25.74g(理論值＝42.6g)；產(chǎn)率(粗)為60.4％。通過酸滴定測(cè)得的胺含量如表4所示。表4Boc-DA-in的酸滴定(重復(fù)</table></tables>*理論值為對(duì)純Boc-DA-10的計(jì)算值，F(xiàn)W＝248.3**雜質(zhì)由殘留的氯仿，叔丁醇，等組成。實(shí)施例5奎尼定-親水性接頭綴合物的制備方法A.QAD-1與DA-10的直接偶合化學(xué)計(jì)量DSC/QAD-1摩爾比＝1.10；DA-10/QAD-1摩爾比＝3.00。溶液1。將QAD-1(107.65mg，0.2500mmole)和二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC；70.46mg，0.2750mmole)放入4-mL管形瓶中，加入3.0mL無(wú)水DMSO，將混合物攪拌至全部溶解，然后加入三乙胺(38μL)并將該溶液在室溫下放置一小時(shí)。(周期性地松開管形瓶的蓋稀釋壓力)。溶液2將12-mL管形瓶+蓋貼標(biāo)簽并配衡至最接近的毫克。將DA-10(111.2mg，0.7503mmole)，1.25mLDMSO和一個(gè)磁攪拌棒加入管形瓶中。溶液3劇烈攪拌溶液2，仔細(xì)滴加溶液1，在加入下一滴以前均勻混合每一滴。用四批250-μL無(wú)水DMSO的等分試樣漂洗管形瓶以保證完全轉(zhuǎn)移，并將最終的溶液攪拌1小時(shí)。將磁攪拌棒移至管形瓶的液體水平面之上(使用磁力)，用新鮮的無(wú)水DMSO(1.00mL總量)漂洗，從管形瓶中取出攪拌棒。將管形瓶和它的蓋放在天平上，通過加入無(wú)水DMSO使內(nèi)含物的總重量達(dá)到7.646克。假定所有的反應(yīng)都是定量進(jìn)行的并且單和雙取代的胺的理論分布是合適的，選擇反應(yīng)劑的量使最終綴合物的濃度約為3×10-5mmol/μL。方法B.QAD-1與Boc-DA-10的偶合和脫保護(hù)將QAD-1(107.65mg，0.2500mmole)和三乙胺(38μL)溶于2mL氯仿中。將二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC；70.46mg，0.2750mmole)溶于2mL乙腈。[注DSC不溶于氯仿。]將QAD-1溶液滴入劇烈攪拌的DSC溶液中。加完后繼續(xù)攪拌3小時(shí)，然后一次加入Boc-DA-10(62.08mg；0.2500mmol)和三乙胺(38μL)在2mL乙腈中的溶液。將合并的混合物攪拌3小時(shí)，然后減壓蒸發(fā)至干。在殘留物中加入10mL1∶1的二氯甲烷/三氟乙酸，將該混合物攪拌30分鐘，然后減壓蒸發(fā)至干。將殘留物溶于8250μL二甲亞砜。假定所有的反應(yīng)都是定量進(jìn)行的，選擇反應(yīng)劑的量使綴合物的最終濃度為3×10-5mmol/μL。實(shí)施例6A.奎尼定-親水性接頭-報(bào)道試劑綴合物(奎尼定顆粒試劑；QPR)；QAD-1-DA-10綴合物與環(huán)氧化物-官能化的乳膠顆粒的偶合定義PRM(原材料顆粒)為由用交聯(lián)的聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)包被的聚苯乙烯核心組成的聚合物乳膠顆粒，它可按Graig等提出的U.S.專利No.4,480,042中所述的制備，該文獻(xiàn)作為參考收編在此。GAFAC為GAFACRE-610，從前由GAFCorporation出售，但現(xiàn)在從RhonePoulenc，Collegeville，PA得到，其名稱為RhodafacRE-610。偶合緩沖液為100mM碳酸鈉/碳酸氫鈉，pH9.5。洗滌緩沖液為含1％GAFAC的15mM磷酸鈉，pH7.4。貯存緩沖液為含0.5％GAFAC的15mM磷酸鹽，pH7.4。將下列試劑順序加入50mL試管反應(yīng)器中8.04mL去離子水，10mL偶合緩沖液，3.6mLPRM(固體含量，20.3％；顆粒大小，70nm)，1.25mL10％GAFAC，1.8mL(典型地)奎尼定-親水接頭綴合物(得自實(shí)施例5，A或B)，和0.32mL10％DA-10水溶液。將溶液的pH調(diào)至pH9.5，并將反應(yīng)試管在70℃保溫18小時(shí)。通過在5℃離心2小時(shí)分出所得到的奎尼定-親水接頭顆粒試劑(SorvallRC285，27500rpmonF28/13rotor)。潷析上層清液，并將顆粒試劑塊懸浮在25mL洗滌緩沖液中。將離心/洗滌步驟再重復(fù)兩次，并將最終得到的顆粒試劑塊再懸浮在25mL貯存緩沖液中。被稱為QPR的該試劑含有3％的固體。B.使用奎尼定顆粒試劑(QPR)測(cè)定定義測(cè)定緩沖液為mM磷酸鹽緩沖液，0.4％GAFAC，pH7.0，0.002％thimerosal(乙基汞硫代水楊酸鈉鹽)(AldrichChemicalCo.，Inc.WI)。顆粒測(cè)定溶液通過以1∶80比例用測(cè)定緩沖液稀釋奎尼定顆粒試劑(QPR；3％固體)而制備?？贵w原料溶液為使用與KohlerandMilstein，Nature，256495-497(1975)公開的方法基本相同的已知標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)純化的家庭生產(chǎn)的抗-奎尼定單克隆抗體?？贵w稀釋劑為50mM磷酸鹽緩沖液，75mM氯化鈉，0.1％疊氮化鈉，和0.05％thimerosal，pH7.0。抗體測(cè)定溶液通過以1∶80的比例用抗體稀釋劑稀釋抗體原料溶液而制備。完成測(cè)定并使用CobasB10分光光度計(jì)臨床儀(RocheDiagnostics，Inc.，NJ)對(duì)奎尼定濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將5μL量的試驗(yàn)/校準(zhǔn)溶液(來(lái)自E.I.duPontdeNemoursandCompany，Wilmington，DE的奎尼定標(biāo)準(zhǔn)溶液，所使用的aca個(gè)別臨床分析系統(tǒng)，也來(lái)自DuPont)加入Cobas分光光度計(jì)櫚樣品孔(wheel)中。將240μL顆粒測(cè)定溶液試液加入Cobas分光光度計(jì)試劑管中。將20μL抗體測(cè)定溶液試液加入Cobas分光光度計(jì)起始試劑管中。Cobas在37℃進(jìn)行測(cè)定。樣品首先與顆粒測(cè)定溶液混合并培養(yǎng)30秒鐘。測(cè)量340nm處的吸收度并用作空白。然后通過加入抗體測(cè)定溶液(起始試劑)開始凝集反應(yīng)。在220秒時(shí)測(cè)量終點(diǎn)吸收。持續(xù)讀出樣品產(chǎn)生的信號(hào)的兩種吸收的差值。圖3顯示與校準(zhǔn)器中游離奎尼定濃度(μg/mL)相對(duì)的終點(diǎn)(EP)吸收(以千分之一吸收為單位，在220秒后)。權(quán)利要求1.在C-11位連接有載體的下式化合物的奎尼定-載體免疫原性的綴合物。2.具有下式的奎尼定衍生物及其鹽其中x＝1或2。3.權(quán)利要求1的奎尼定-衍生物載體免疫原性的綴合物，其中奎尼定衍生物如下式所示其中x＝1或2。4.權(quán)利要求1的奎尼定-載體免疫原性的綴合物，其中載體選自聚(氨基酸)，蛋白質(zhì)，碳水化合物，乳膠顆粒，和糖蛋白。5.權(quán)利要求1的奎尼定-載體免疫原性的綴合物，其中載體選自鑰孔血藍(lán)素(KLH)，λ-球蛋白，和南瓜籽球蛋白(PSG)。6.制備的抗權(quán)利要求1的免疫原性的綴合物抗-奎尼定抗體。7.奎尼定-接頭-報(bào)道試劑免疫原性的綴合物，其中奎尼定衍生物在奎尼定分子的C-11位與接頭偶合。8.權(quán)利要求7的綴合物，其中奎尼定是通過包含-NH(CH2)mO(CH2CH2O)n(CH2)mNH-的接頭與報(bào)道試劑偶合的，其中m＝2或3，而n＝1-10。9.權(quán)利要求8的綴合物，其中n＝1或2。10.權(quán)利要求7的綴合物，其中奎尼定衍生物如下式所示其中x＝1或2。11.權(quán)利要求7的綴合物，其中報(bào)道試劑選自乳膠顆粒，螢光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，發(fā)色團(tuán)，放射性物質(zhì)，和酶。12.權(quán)利要求7的綴合物，其中報(bào)道試劑為乳膠顆粒。13.具有下式結(jié)構(gòu)的單保護(hù)的親水性二胺試劑Pr-NH(CH2)mO(CH2CH2O)n(CH2)mNH2其中Pr是胺-保護(hù)基，m＝2或3，而n＝1-10。14.權(quán)利要求13的單保護(hù)的親水性二胺試劑，其中n＝1或2。15.權(quán)利要求13的單保護(hù)的親水性二胺試劑，其中胺-保護(hù)基是叔丁氧羰基(t-Boc)。16.合成權(quán)利要求13的單-t-Boc-保護(hù)的親水性二胺試劑的方法，包括下列步驟(a)在氫氧化鈉存在下在水/有機(jī)介質(zhì)中使二叔丁基二碳酸酯與過量親水性二胺反應(yīng)；(b)從介質(zhì)的水相分離出介質(zhì)的有機(jī)相；(c)通過降低水相的pH值，使所有剩余的氨基基本上都被質(zhì)子化；(d)在水相中加入水-不混溶的有機(jī)溶劑，以除去非堿性物質(zhì)；(e)加入堿升高水相pH值，以使至少一半的剩余氨基處于未質(zhì)子化的形式；(f)在步驟(e)的水相中加入鹽；(g)用水-不混溶的有機(jī)溶劑萃取水相；(h)從水相中分出有機(jī)相；和(i)從有機(jī)相中除去溶劑，得到所需的產(chǎn)物。17.測(cè)定試驗(yàn)樣品中奎尼定的存在和/或量的免疫測(cè)定法，其中包括(a)將結(jié)構(gòu)如下Pr-NH(CH2)mO(CH2CH2O)n(CH2)mNH2其中Pr為叔丁氧羰基的單保護(hù)的親水性二胺報(bào)道試劑，試驗(yàn)樣品，和凝集試劑混合在一起，隨后(b)進(jìn)行任何形式的已知的凝集免疫測(cè)定。全文摘要本發(fā)明涉及奎尼定衍生物和免疫原性的綴合物以及由它們制備的報(bào)道綴合物。免疫原性的綴合物和報(bào)道綴合物用于誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生并用于進(jìn)行奎尼定的免疫測(cè)定。同時(shí)也提供了奎尼定顆粒凝集免疫測(cè)定法。文檔編號(hào)C07K16/00GK1166172SQ96191113公開日1997年11月26日申請(qǐng)日期1996年8月2日優(yōu)先權(quán)日1995年8月3日發(fā)明者D·M·西蒙茲申請(qǐng)人:達(dá)德化學(xué)系統(tǒng)公司