專利名稱：：用于脂化親水分子的方法和組合物的制作方法本申請是1995年1月25日提交的08/349,717號申請的部分繼續(xù)申請。本發(fā)明總體上涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及用于提高親水分子特別是肽和蛋白質(zhì)在哺乳動物中吸收和保留的方法和組合物。生物技術(shù)的發(fā)展使得可能大量生產(chǎn)有治療活性的純蛋白和肽。現(xiàn)今，大部分這些藥劑只有在經(jīng)侵入途經(jīng)如注射給藥時才能取得治療效果。由于大部分蛋白的半衰期非常短，只有頻繁注射才能保持它們的有效濃度。雖然注射給藥是體內(nèi)輸送蛋白的最有效方式，但多次注射使病人難以忍受。另外，注射給藥是一項技術(shù)工作，需要培訓(xùn)；而病人也并不總能享受到這種技巧和培訓(xùn)。當(dāng)?shù)鞍姿幬锞哂型炀壬淖饔脮r，病人可以接受注射給藥。但當(dāng)?shù)鞍姿幬镏皇菐追N可能療法中的一種時，病人就可能不接受蛋白和肽的注射。因此，需要開發(fā)輸送蛋白和肽的其他途徑。輸送蛋白和肽的其他途徑可以包括頰內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、肺內(nèi)、直腸內(nèi)和眼內(nèi)途徑。這些途徑的效率無一例外小于胃腸外給藥途徑。但這些蛋白和肽的輸送途徑仍遠(yuǎn)比胃腸外途徑更有吸引力，因為它們對病人提供了方便和控制權(quán)?？诜緩骄哂刑貏e吸引力，因為它最方便最隨從病人。隔開體內(nèi)和體外的粘膜屏障(如胃腸、眼、肺、直腸和鼻的粘膜)包括一層緊密相連的細(xì)胞單層，它嚴(yán)格調(diào)節(jié)分子的轉(zhuǎn)運。屏障中的單個分子由緊密的接界相連，調(diào)節(jié)進(jìn)入細(xì)胞間空間。因此，粘膜是第一道生理屏障，跨膜轉(zhuǎn)運要么采取跨細(xì)胞途徑，要么采取細(xì)胞旁途徑[Lee，V.H.L.(1988)CRC.治療藥物輸送系統(tǒng)評述5，69-97]。通過充滿水的緊密接界進(jìn)行細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運限于小分子(MW＜1KDa)，基本上是一種由跨粘膜的濃度梯度驅(qū)動的擴散過程[Lee(1988)，同上；Artursson，P.，和Magnusson，C.(1990)，藥物科學(xué)雜志，79，595-600]。緊密接界只占粘膜總表面積的0.5％以下[Gonzalez-Mariscal，L.M.等(1985)，膜生物學(xué)雜志，86，113-125；Vetvicka，V.，和Lubor，F(xiàn).(1988)CRC治療藥物輸送系統(tǒng)評述5，141-170]；因而它們在蛋白藥物的跨粘膜轉(zhuǎn)運中只起很小的作用。只要藥物的理化性質(zhì)適于跨越疏水細(xì)胞屏障而轉(zhuǎn)運，小分子藥物能進(jìn)行有效的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運。但蛋白和肽的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運只限于胞吞轉(zhuǎn)運作用[Shen，W.C.等(1992)，藥物輸送進(jìn)展綜述(Adv.DrugDe-liveryRev.)8，93-113]。胞吞轉(zhuǎn)運作用是一個復(fù)雜的過程蛋白質(zhì)和肽從細(xì)胞一側(cè)被攝入泡囊，然后穿過細(xì)胞到達(dá)細(xì)胞另一側(cè)，并從內(nèi)吞小泡中釋放出來[Mostov，K.E.和Semister，N.E.(1985)細(xì)胞43,389-390]。粘膜屏障的細(xì)胞膜是疏水的脂雙層，對蛋白和肽類親水帶電大分子沒有親合力。另外，粘膜細(xì)胞可以分泌粘蛋白，后者可作為許多大分子轉(zhuǎn)運的屏障(Edwards，P.(1978)英國醫(yī)學(xué)雜志34，55-56]。因此，除非存在專門的蛋白和肽的轉(zhuǎn)運機制，否則它們跨粘膜屏障的持續(xù)轉(zhuǎn)運幾乎是可以忽略的。除對蛋白和肽的轉(zhuǎn)運構(gòu)成一種緊密的物理屏障外，粘膜屏障中還具有能在通過粘膜前、后或過程中降解蛋白和肽的酶。這一屏障被稱為酶屏障，它由在蛋白和肽末端或其結(jié)構(gòu)當(dāng)中酶切的外肽酶和內(nèi)肽酶構(gòu)成。已對數(shù)種粘膜的酶活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在白化兔的頰、鼻、直腸和陰道粘膜勻漿中存在顯著的蛋白酶活性，這些活性與髂骨中存在的酶活性相當(dāng)[Lee等(1988)，同上]。因而即使不考慮粘膜，這種酶屏障也將強烈地降解蛋白和肽分子。肽的N和C末端帶電，加之帶電側(cè)鏈的存在也賦予這些大分子高度的親水特征。另外，帶電側(cè)鏈的存在意味著肽和蛋白具有很強的氫結(jié)合能力，已證明這種氫結(jié)合能力在抑制甚至是小肽的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運中起主要作用[Conradi，R.A.等(1991)，藥物研究，8，1453-1460]。因而，蛋白和肽的大小和親水性質(zhì)一起嚴(yán)重限制了其跨粘膜屏障的轉(zhuǎn)運。已用于改變粘膜屏障物理性質(zhì)的一條途徑是使用穿透增效劑，它是通過使用能液化細(xì)胞膜[Kaji，H等(1985)生命科學(xué)，37，523-530]、打開緊密接界[Inagaki等(1985)鼻科學(xué)23，213-221]和在細(xì)胞膜上成孔[Gordon，S等(1985)Proc.Natl.Acad.SciUSA82,7419-7423；Lee，V.H.L等(1991)治療藥物載體系統(tǒng)的評述，CRC出版社，8，91-192]的小分子量試劑在細(xì)胞屏障中打開缺口。這些試劑的使用造成屏障完整性的非特異性損失，并能導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)有毒性的多種大分子的吸收。蛋白酶抑制劑與蛋白和肽同時給藥已證明對提高這些大分子的體內(nèi)吸收具有有限的作用[Kidron，M等(1982)生命科學(xué)31，2837-2841；Takaroi.k.等(1986)生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，137，682-687]。這一途徑的安全性和長期效應(yīng)還有待徹底地研究。前藥途徑是改造肽使其不被酶降解和識別。這是通過在肽結(jié)構(gòu)中代之以D-構(gòu)型氨基酸，通過酰胺化和?；忾]肽的易損基因、反轉(zhuǎn)肽的手性以及在肽結(jié)構(gòu)中引入構(gòu)象強制來實現(xiàn)的。前藥的合成僅適用于活性域易于識別的小肽。減小體積是提高蛋白轉(zhuǎn)運潛力的另一可行途徑，但在此之前必須先確定蛋白的活性位置。一般而言，這一途徑難于應(yīng)用于大多數(shù)蛋白上。利用載體配體的性質(zhì)可以改變細(xì)胞攝入和轉(zhuǎn)運蛋白和肽的特征。這一途徑的關(guān)鍵是將不能穿越細(xì)胞的蛋白或肽和一種能被高度轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中的載體共價結(jié)合。載體配體被細(xì)胞攝粒并胞轉(zhuǎn)的機制對決定能增強蛋白和肽轉(zhuǎn)運之載體的適用性上是很重要的。大分子載體是親水性的，不會分配至膜中，因而大的多聚載體向細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運是由載體對細(xì)胞膜的親和力介導(dǎo)的。一般講，大分子偶聯(lián)物的攝入始于與細(xì)胞膜的結(jié)合。載體與細(xì)胞膜的結(jié)合可以是特異性的(如抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合)、非特異性的(陽離子配體或凝集素與細(xì)胞表面糖的結(jié)合)或由受體介導(dǎo)的(轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素與其受體的結(jié)合)。一旦載體被結(jié)合在細(xì)胞表面，就被吞噬到泡囊中，然后這些泡囊經(jīng)逐步加工，并可以有幾種途徑。一種途徑是泡囊返回其被吞入的膜；另一途徑是被溶酶體溶解，這對偶聯(lián)物有破壞作用；還有一條途徑是導(dǎo)致偶聯(lián)物胞吞轉(zhuǎn)運的途徑，其中泡囊與被攝入膜相反一側(cè)的膜融合。細(xì)胞攝粒作用和胞吞轉(zhuǎn)運作用間的適當(dāng)平衡決定著蛋白偶聯(lián)物向其靶標(biāo)的輸送。例如，細(xì)胞攝粒作用可決定偶聯(lián)物被靶細(xì)胞攝入的程度，但胞吞轉(zhuǎn)運作用決定偶聯(lián)物是否到達(dá)其靶標(biāo)[Shen等(1992)，同上]。為了從胃腸道被成功地吸收，偶聯(lián)物必需與胃腸粘膜的頂端膜結(jié)合，內(nèi)在化入粘膜細(xì)胞中，跨細(xì)胞輸送，最后從底側(cè)膜釋放出去?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中有許多報道證明非特異性載體如聚賴氨酸[Shen，W.C.和Ryser，H.J.P.(1981)Proc.Natl，Acad.Sci.USA787589-7593]和凝集素[Broadwell，R.D等(1988)Proc.Natl.A-cad.Sci.USA85，632-646]，和特異性載體如轉(zhuǎn)鐵蛋白[Wan，J等(1992)生物學(xué)化學(xué)雜志267，13446-13450]，脫唾液酸糖蛋白[Seth，R等(1993)傳染病雜志168，994-999]和抗體[Vitetta，E.S(1990)臨床免疫學(xué)雜志10，15S-18S]可以提高蛋白的細(xì)胞攝粒作用。關(guān)于蛋白胞轉(zhuǎn)載體的報道較少，而很少有關(guān)于蛋白偶聯(lián)物跨細(xì)胞屏障轉(zhuǎn)運的研究。已證明小麥胚凝集素[Broadwell等(1988)，同上]和抗轉(zhuǎn)鐵蛋白/氨甲喋呤偶聯(lián)物[Friden，P.M.和Walus，L.R.(1993)Adv.Exp.Med.Biol，331，129-136]在體內(nèi)可被胞轉(zhuǎn)通過血腦屏障。還證明辣根過氧化物酶(HRP)的聚賴氨酸偶聯(lián)物和HRP的轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)物在體外可被胞轉(zhuǎn)通過細(xì)胞單層[Wan，J和Shen，W.C.(1991)藥學(xué)研究8，S-5；Taub，M.E.和Shen，W.C.(1992)細(xì)胞生理雜志，150，283-290；Wan，J等(1992)生物學(xué)化學(xué)雜志，267，13446-13450，同上]。作為磷脂的成分，脂肪酸構(gòu)成了細(xì)胞膜的主體。它們可以在市場上購得且較廉價。由于其脂質(zhì)性，脂肪酸易于分配到細(xì)胞膜中并與其相作用而無毒性。因此，脂肪酸是潛在的最有用的蛋白和肽的輸送載體配體。使用脂肪酸輸送蛋白和肽的策略包括蛋白和肽的共價修飾和脂肪酸乳液的使用。一些研究已報道了脂肪酸乳液在體內(nèi)輸送蛋白和肽中的成功應(yīng)用(Yoshikawa，H等(1985)藥物研究2，249-251；Fix，J.A.等美國生理學(xué)雜志251，G332-G340]?，F(xiàn)在還不清楚脂肪酸乳液促進(jìn)蛋白和肽吸收的機制。脂肪酸乳液可能打開緊密接界、溶化膜、將蛋白和肽隔離胃腸環(huán)境，以及通過其吸收攜帶蛋白和肽跨過胃腸粘膜[Smith，P.等(1992)藥物輸送進(jìn)展綜述8，253-290]。所提出的后一機制與關(guān)于脂肪吸收機制的現(xiàn)有知識不相符?？缭轿改c上皮輸送蛋白和肽的一種更符合邏輯的策略是利用脂肪酸作為非特異性膜吸附劑。有數(shù)例研究報道表明與蛋白相連的非特異性膜結(jié)合劑可以促進(jìn)蛋白偶聯(lián)物體外胞轉(zhuǎn)至細(xì)胞[Wan，J.等(1990)細(xì)胞生理學(xué)雜志145，9-15；Taub和Shen(1992)，同上]。還證明與脂肪酸偶聯(lián)可提高大分子進(jìn)入細(xì)胞膜和跨越細(xì)胞膜的吸收[Lestinger，R等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，6553-6556；Kabanov，A等(1989)蛋白工程3，39-42]。但脂肪酸與肽和蛋白的偶聯(lián)有困難，包括(1)脂肪酸在偶聯(lián)反應(yīng)的水溶液中不溶解；(2)脂肪酸?；箅暮偷鞍椎纳锘钚該p失；及(3)脂肪酸-偶聯(lián)肽在水溶液中不溶[見，如Hashimoto，M等，，藥物研究，6，171-176(1989)；Martins，M.B.F.等，生物化學(xué)72，671-675(1990)；Mu-ranishi，S等，藥物研究，8，649-652(1991)；Robert，S.等，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊196，447-454(1993)]。本發(fā)明的目的是提供用于偶聯(lián)脂肪酸和親水分子并提高肽和蛋白生物利用度的方法和組合物。按照本發(fā)明，含巰基化合物(例如含有或經(jīng)改造后含有巰基的肽蛋白或寡核苷酸)的脂肪酸衍生物，即含二巰鍵的脂肪酸-偶聯(lián)產(chǎn)物用于向哺乳動物細(xì)胞輸送這些含巰基化合物。與未偶聯(lián)化合物的吸收率相比，這種修飾顯著提高了哺乳動物細(xì)胞對這些化合物的吸收，并延長了這些化合物在血液和組織中的保留時間。而且，偶聯(lián)物中的二巰鍵在細(xì)胞中很不穩(wěn)定，在細(xì)胞中易于從脂肪酸部分釋放完整的化合物。還提供了制備該脂肪酸衍合物的試劑和方法。參照附圖可以更好地理解本發(fā)明圖1說明BBI、BBIssPal和BBIssOleic在Caco-2細(xì)胞中的吸收；圖2說明靜脈給藥后BBI和BBIssPal在CF-1小鼠血、腎、肺和肝中的生物分布；圖3說明靜脈給藥后BBI和BBIssOleic在CF-1小鼠血、腎、肺和肝中的生物分布；圖4說明腹膜內(nèi)給藥后BBI和BBIssPal在CF-1小鼠中的生物分布；圖5說明BBI、BBIssPal(2)和BBIssPal(4)跨越和進(jìn)入Caco-2細(xì)胞的胞吞轉(zhuǎn)運作用和累積；及圖6說明來自含胞轉(zhuǎn)BBI、BBIssPal(2)和BBIssPal(4)的Caco-2細(xì)胞的基質(zhì)，經(jīng)G-50凝膠過濾分析的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，含巰基化合物(如以下所定義的生物多聚物)通過可逆的可生物降解的二巰鍵與脂肪酸衍生物連結(jié)。這種偶聯(lián)物預(yù)期與細(xì)胞膜的頂側(cè)結(jié)合，經(jīng)膜轉(zhuǎn)運和反轉(zhuǎn)到達(dá)胃腸上皮的底側(cè)膜，并經(jīng)二硫鍵的還原釋放到間隙液中。一方面，本發(fā)明提供通式VI的偶聯(lián)物其中P是含巰基化合物衍生的殘基；R1是氫、低級烷基或芳基；R2是含脂殘基(如下文所定義)；及R3是-OH、含脂殘基或含一或兩個氨基酸并且末端為-CO2H或-COR2的氨基酸鏈。這些偶聯(lián)物對提高含巰基化合物PSH的吸收及延長其血液和組織保留時間特別有用。另一方面，本發(fā)明提供一種提高含巰基化合物PSH在哺乳動物中的吸收或延長其血液和組織保留時間的方法，其中從含巰基化合物形成通式VI的偶聯(lián)物，然后將此偶聯(lián)物給予哺乳動物(例如，以水溶液或口服劑量單位形式)。又一方面，本發(fā)明提供通式V化合物A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(＝O)R3V其中A是芳香活化殘基(如下文所定義)，R1、R2和R3如前文所定義。通式V化合物在從式PSH的含巰基化合物到通式VI偶聯(lián)物的制備中特別有用。又一方面，本發(fā)明提供從式PSH的含巰基化合物制備通式VI偶聯(lián)物的方法，該方法包括通式PSH化合物與通式V化合物反應(yīng)。典型反應(yīng)是用過量通式V化合物(例如過量2-10倍)在適當(dāng)?shù)乃跃彌_液(如磷酸鹽、碳酸氫鹽和硼酸鹽緩沖液)中，在約4-37℃下進(jìn)行約1-24小時。該反應(yīng)優(yōu)選在pH8的碳酸氫鹽緩沖液中進(jìn)行。又一方面，本發(fā)明提供通式III化合物A-S-S-CH2-CR1(NH2)C(＝O)R3′III其中R3′為-OH或含一或兩個氨基酸且末端為-CO2H的氨基酸鏈，A和R1如前文所定義。通式III化合物在通式V化合物的制備中特別有用。通式III化合物可通過通式II化合物H-S-CH2-CR1(NH2)C(＝O)R3II與通式A-S-S-A或A-SS-A′化合物反應(yīng)制得，其中A′與A不同，為一種芳香活化殘基。這些反應(yīng)物要么在市場上可購得[如2，2′-二硫二吡啶和5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)]要么可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)合成方法制備。又一方面，本發(fā)明提供其中R2為脂基的式V化合物的制備方法，其中通式III化合物與通式X-O2C-B或X-OC-B的活化脂基反應(yīng)，其中X為脂活化基團(tuán)(如下文所定義)，B為脂基(如下文所定義)。按本身已知的方法易于制備通式X-O2C-B或X-OC-B化合物。制備通式III化合物的步驟例如為大致等摩爾量的通式II化合物和式A-S-S-A或A-S-S-A′化合物在極性有機溶劑(如乙醇)中適當(dāng)?shù)鼗旌?。通過在非極性有機溶劑(如苯)中結(jié)晶可以適當(dāng)?shù)胤蛛x通式III產(chǎn)物。當(dāng)然，其他適當(dāng)?shù)牟襟E對本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見的。為制備X-O2C-B或X-OC-B，脂肪酸例如可與下列物質(zhì)反應(yīng)(a)N-羥基琥珀酰亞胺和碳化二亞胺試劑以形成N-羥基琥珀酰亞胺基活性酯；(b)三氟乙酸酐以形成脂肪酸酐；或(c)亞硫酰氯以形成脂肪酸酰氯。其他替代方法也可能適用于引入這些或其他的脂活化基團(tuán)。對于本發(fā)明的目的，“含脂殘基”指脂基團(tuán)本身或含脂基團(tuán)的碳?xì)浠鶊F(tuán)(特別是一個或多個氨基酸)?！爸敝负s4-26個碳原子(優(yōu)選約5-19個碳原子)的疏水取代基。適當(dāng)?shù)闹ǖ幌抻谧貦盎?C15H31)；油基(C15H29)；硬脂基(C17H35)；膽酸酯；和脫氧膽酸酯?！胺枷慊罨瘹埢敝赣糜谑雇ㄊ絍化合物的二硫鍵更易于與通式PSH的含巰基化合物進(jìn)行取代反應(yīng)的殘基(因而作為良好的離去基團(tuán))。本發(fā)明優(yōu)選的芳香活化基團(tuán)是2-吡啶基；其他適當(dāng)?shù)姆枷慊罨鶊F(tuán)包括4-硝基苯基?！爸罨鶊F(tuán)”對本發(fā)明而言指使得與其相連的羧脂基團(tuán)與通式III化合物有反應(yīng)活性的殘基。本發(fā)明優(yōu)選的脂活化基團(tuán)是N-羥基琥珀酰亞胺酯；其他適當(dāng)?shù)闹罨鶊F(tuán)包括酰氯和酸酐。雖然本發(fā)明設(shè)計的通式VI化合物的制備和偶聯(lián)物的應(yīng)用包括廣泛的含巰基化合物，但應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物制備含生物多聚物的偶聯(lián)物特別有利。有關(guān)生物多聚物包括肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸(如下文所定義)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于看出的那樣，含巰基的生物多聚物或硫醇化生物多聚物可以含有多個結(jié)構(gòu)上相應(yīng)于通式VI偶聯(lián)物的部分(即，具有通式VI化合物減去P殘基這樣結(jié)構(gòu)的基團(tuán))。對于本發(fā)明，“肽”指含2-50個氨基酸的氨基酸鏈，“蛋白”指含多于50個氨基酸的氨基酸鏈。這些蛋白和肽可以從天然來源分離到或用本領(lǐng)域熟知的方法制得，如用重組DNA技術(shù)或固相合成技術(shù)。本發(fā)明中使用的肽和蛋白可以只含天然的L-氨基酸，L-氨基酸和其他氨基酸(包括R-氨基酸和修飾氨基酸)結(jié)合，或只含有L-氨基酸以外的氨基酸。為了形成通式VI的偶聯(lián)物，該肽或蛋白必須帶有至少一個反應(yīng)活性巰基。許多肽或蛋白含有半胱氨酸殘基(一種含有巰基的氨基酸)。不含巰基的肽或蛋白可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的方法改造；特別是熟知的硫醇化試劑[如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸(SPDP)和2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(2-imimothiolane，Traut’s試劑)]可以按常規(guī)用于該目的?！肮押塑账帷敝负瑑蓚€或多個天然或修飾核苷酸的鏈，例如天然或重組脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)序列。為了形成本發(fā)明的偶聯(lián)物，該寡核苷酸必須經(jīng)硫醇化反應(yīng)修飾，以便含有與含脂殘基相連的巰基。這種修飾可按本身已知的方式常規(guī)地進(jìn)行。例如，可用碳化二亞胺偶聯(lián)寡核苷酸和半胱胺，然后用二硫蘇糖醇還原產(chǎn)生游離巰基。一類優(yōu)選的通式VI化合物中，R1為氫，R2為脂殘基，R3為-OH。此類偶聯(lián)物適于從半胱氨酸制得。另一類本發(fā)明優(yōu)選的偶聯(lián)物中，R1為氫，R2為-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3為-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一個含脂殘基。該類偶聯(lián)物適于從谷胱甘肽制備。通式VI示例化合物(其中P為蛋白)的合成示于路線I中。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，易于找出許多替代合成路線。本發(fā)明的脂肪酸偶聯(lián)物可溶于蛋白和肽可溶的大部分緩沖液中。尤其是，在中性pH下游離羧酸基團(tuán)帶電，從而提高偶聯(lián)物的溶解度。這極大地方便了偶聯(lián)物與適當(dāng)藥物可接受載體或佐劑的配制，以便口服或經(jīng)其他途徑將蛋白或肽給予病人。脂肪酸部分與肽或蛋白間的二硫鍵易于還原，本發(fā)明的這一點是特別有利的。這樣，活性肽或蛋白就以完整的形式被釋放在靶組織或細(xì)胞內(nèi)。而且，該偶聯(lián)物的脂肪酸部分只含氨基酸和脂分子，對哺乳動物特別是人無毒性。參考以下實施例可能更好地理解本發(fā)明，這些實施例旨在說明，而不應(yīng)視為對權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明范圍的任何限制。實施例1N-棕櫚基-2-吡啶基二硫基半胱氨酸(Pal-PDC)的合成將L-半胱氨酸(I)(3.0g)的冰冷乙醇(50ml)溶液滴加到攪拌下的2，2-二硫二吡啶(II)(7.5g)的乙醇(30ml)溶液中，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行18小時。離心該溶液以除去沉淀，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮上清液至40ml。然后將此反應(yīng)混合物滴加到400ml冰冷的苯中。PDC(III)在苯中結(jié)晶，過濾分離，重新溶解在40ml乙醇中，然后在400ml如上所述的冰冷苯中重結(jié)晶。過濾分離重結(jié)晶產(chǎn)物，真空干燥過夜，最后在干燥器中-20℃下保存。將PDC(100mg)(III)溶解在5mlDMF中，與100ml三乙胺混合，形成的懸液與DMF(5ml)中的棕櫚酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(IV)(250mg)于25℃反應(yīng)24小時，在此過程中懸液變清。用40mlpH3.0的冰冷水稀釋該溶液，10000rpm離心30分鐘分離沉淀，其中含有Pal-PDC(V)和棕櫚酸。將沉淀懸浮在pH7.0的水中，Pal-PDC(V)溶解，而棕櫚酸不溶，從而將Pal-PDC(V)與棕櫚酸分離。再用兩步上述酸沉淀步驟進(jìn)一步純化Pal-PDC(V)。實施例2偶聯(lián)物的合成除非另有說明，用于偶聯(lián)步驟的所有最終試劑(Pal-PDC和PDC)都用含熒光指示劑的硅酸薄層層析(TLC)板進(jìn)行了分析。這些板在分析前沒有熱活化。合成試劑的常規(guī)分析是將5μl含試劑的乙醇溶液(5mg/ml)點樣于板上，然后在用流動相平衡的溶劑室中展開，一旦溶劑前沿走過了足夠的距離，將板取出、干燥并在紫外燈下觀察。立即在板上標(biāo)出斑點位置，畫出板和斑點的圖，計算并記錄每一可見斑點的Rf值?？烧{(diào)節(jié)用于分析的流動相的組成，以達(dá)到試劑斑點的最佳分離。下面示例說明BBI偶聯(lián)物的合成。BBI是一種親水蛋白，其細(xì)胞攝入率低，不能口服吸收。另外，BBI在胃腸道中穩(wěn)定，耐受腸中哺乳動物蛋白酶的降解[Yavelow，J等(1983)癌癥研究43，2454s-2459s]。只有開發(fā)出BBI的口服吸收形式，其化學(xué)藥物預(yù)防應(yīng)用才能被接受。將BBI(20mg)溶解在1ml碳酸氫鈉溶液(0.3M，pH8.0)中，與SPDP(5mg/100μl，DMF)在25℃反應(yīng)2小時。用SephadexG50凝膠過濾層析純化BBI-PDP后，通過測定二硫蘇糖醇(DTT)還原BBI-PDP后所釋放的硫代吡啶評價BBI的PDP衍生化。用此方法，每個BBI分子約有4個氨基被SPDP修飾。BBI的衍生化水平可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)緩沖液的pH來控制BBI的修飾可被調(diào)節(jié)為pH7下反應(yīng)時的一個氨基/BBI分子，到pH8.5下反應(yīng)時的4.5個氨基/BBI分子。BBI-PDP(20mg)在PBS(1ml，pH5.0)中用DTT(25mM)還原30分鐘，然后用SephadexG50柱洗脫。含巰基的BBI流份在柱空體積下洗脫，用Elman′s試劑鑒別，然后在PBS(pH7.0)中與3倍過量(以BBI上每個巰基計)的Pal-PDC(V)在4℃反應(yīng)16小時。然后用HCl(1M)酸化反應(yīng)混合物至pH3.0，置于冰上30分鐘。上清液用SephadexG25凝膠過濾柱分析。離心分離沉淀，其含有BBI的棕櫚基二硫化偶聯(lián)物BBIssPal(VI)和過量的試劑，溶于DMF(2ml)中，在SephadexLH20柱上用DMF洗脫。分離BBIssPal(VI)流份(在柱空體積下洗脫)，對500ml水透析3次，然后冷凍干燥。用此方法偶聯(lián)物的收率為約80％(重量)。用與上所述相同的偶聯(lián)條件，[3H]-標(biāo)記的Pal-PDC(V)與BBI偶聯(lián)后證實并定量測定了Pal-PDC與BBI的偶聯(lián)。還用相同的方法合成了與油酸偶聯(lián)的BBI(BBIssOleic)。實施例3偶聯(lián)物的轉(zhuǎn)運通過與0.5ml胰蛋白酶/EDTA溶液(0.5％胰蛋白酶，5.3mMEDTA)于37℃保溫10分鐘，從25cm2貯存培養(yǎng)燒瓶中解離人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)。然后將細(xì)胞懸浮在5mlDulbecco極限必需培養(yǎng)基中，其中補有15％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(1％)和必需氨基酸(1％)，并用計數(shù)器計數(shù)。將懸浮在1.5ml培養(yǎng)基中的Caco-2細(xì)胞以0.5百萬細(xì)胞/插板(insert)的密度種在轉(zhuǎn)孔板(transwell)的頂室中。然后向每個轉(zhuǎn)孔板的底室中加入2.5ml培養(yǎng)基。在無干擾下讓細(xì)胞吸附2天，然后每2天飼養(yǎng)一次，直到進(jìn)行實驗。在實驗前保持細(xì)胞約14-20天，每次實驗前24小時飼養(yǎng)細(xì)胞。接種一周內(nèi)的細(xì)胞單層具有約500-600Ωcm2的跨上皮電阻(TEER)，并保持該電阻達(dá)接種后的21天。用氯胺T方法[McConahey，P.C.和Dixon，F(xiàn).J.(1980)酶學(xué)方法，70，221-247]進(jìn)行BBI和BBIssPal的放射碘標(biāo)記。14天齡的成片細(xì)胞單層用無血清Dulbecco培養(yǎng)基洗滌，然后于37℃在其中培養(yǎng)30分鐘。隨后用含125I-BBI(10mg/ml)(BBI原始形式或為BBIssPal或BBIssOleic)的無血清培養(yǎng)基更換原培養(yǎng)基，細(xì)胞單層在37℃再培養(yǎng)60分鐘。該細(xì)胞單層用冰冷PBS洗三次，然后與胰蛋白酶(0.5％，EDTA5.3mM)在37℃作用10分鐘。將解離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，離心分離，用冰冷PBS洗滌三次，用計數(shù)器測定累積放射活性，最后用文獻(xiàn)方法測定細(xì)胞蛋白[Lowry，O.H.等(1951)生物學(xué)化學(xué)雜志193，265-275]。在一些實驗中測定了還原125I-BBIssPal的細(xì)胞攝入。125I-BBIssPal用DTT(50mM)于60℃下還原5分鐘，然后在37℃下還原25分鐘。在對照實驗中，125I-BBIssPal被置于相同溫度培養(yǎng)基中，而不與DTT接觸。按如下方法測定BSA(不含脂肪酸)存在下125I-BBIssPal的吸收。在加入細(xì)胞單層之前，125I-BBIssPal與含0.1％BSA的培養(yǎng)基在37℃保溫30分鐘。在一些吸收實驗中，BSA先與3倍摩爾過量的棕櫚酸混合，然后在實驗前與偶聯(lián)物一起保溫。在含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中測定125I-BBIssPal的吸收實驗中，將偶聯(lián)物簡單地加入到含規(guī)定量FBS的培養(yǎng)基中。2-3周齡、TEER值為約500Ωcm2的成片細(xì)胞單層，先在37℃下與含1％FBS的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基培養(yǎng)30分鐘，然后除去培養(yǎng)基，將1.5ml培養(yǎng)基中的125I-BBI(10mg/ml)偶聯(lián)物加入到轉(zhuǎn)孔板的頂室中。在底室中加入2.5ml培養(yǎng)基，37℃下保溫轉(zhuǎn)孔板。在預(yù)定的時間點從每個轉(zhuǎn)孔取出整個底室培養(yǎng)基(2.5ml)，并用γ計數(shù)器測定放射活性。在每一實驗中，一般在培養(yǎng)后1，2，3，4，5，6和24小時取7個樣品。取出24小時樣品后，細(xì)胞單層用冰冷PBS洗滌三次，從插板上移下，用γ計數(shù)器測定累積放射活性。用SephadexG50凝膠過濾層析研究轉(zhuǎn)運跨過細(xì)胞單層的125I-BBI偶聯(lián)物的完整性。簡言之，在24小時時取底室培養(yǎng)基后，1.0ml培養(yǎng)基以2000rpm離心，然后用PBS從G50柱(10ml)上洗脫；每份1ml收集，用γ計數(shù)器測定各流份的放射活性。完整的偶聯(lián)物在柱空體積處被洗脫，小于1kDa的片段在柱體積處或以上被洗脫。表1中列出了在不同量FBS存在下游離蛋白形式或與棕櫚酸偶聯(lián)形式的125I-BBI的吸收結(jié)果。當(dāng)偶聯(lián)物與細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，BBIssPal的吸收比BBI大約140倍。存在含1％FBS的培養(yǎng)基時，BBIssPal的內(nèi)在化比BBI高35倍。提高血清濃度至10％，BBIssPal的細(xì)胞吸收進(jìn)一步降至僅有BBI水平的10倍。血清存在下BBIssPal向Caco-2細(xì)胞中的內(nèi)在化急劇減小，在含1％和10％FBS的培養(yǎng)基中的值分別為無血清時的14％和2.3％。表1</tables>細(xì)胞單層與10μg/ml的125I標(biāo)記的偶聯(lián)物37℃培養(yǎng)60分鐘。結(jié)果用三個單層的平均值±SEM表示。吸收實驗是在Dulbecco培養(yǎng)基中，加和不加FBS條件下進(jìn)行的。因為我們相信BBIssPal的細(xì)胞吸收是由偶聯(lián)物上的棕櫚酸配體介導(dǎo)的，所以研究了125I-BBIssPal在用DTT還原前后被Caco-2吸收的情況。因為血清存在于培養(yǎng)介質(zhì)對偶聯(lián)物的細(xì)胞吸收有抑制作用，因此在無血清培養(yǎng)基中研究吸收作用。結(jié)果示于表2中，未處理的125I-BBIssPal的細(xì)胞吸收比125I-BBI高80倍。用DTT處理125I-BBI不引起其吸收降低。而用DTT還原125I-BBIssPal使得偶聯(lián)物的細(xì)胞吸收約降低80％。用DTT還原BBIssPal引起棕櫚酸從偶聯(lián)物中解離。因此可見，125I-BBIssPal的吸收是由疏水性棕櫚酸配體介導(dǎo)的。表2</tables>游離蛋白或BBIssPal形式的125I-BBI在用DTT(50mM)60℃還原5分鐘和37℃還原25分鐘前和后測定其細(xì)胞吸收。已知牛血清白蛋白(BSA)是體內(nèi)脂肪酸載體并含有疏水區(qū)可緊密結(jié)合脂肪酸。由于血清的存在降低125I-BBssPal的吸收，我們研究了BBIssPal結(jié)合于FBS中存在的BSA上的可能性。研究了含無脂肪BSA或載脂肪酸BSA的培養(yǎng)基中125I-BBIssPal和125I-BBI的細(xì)胞吸收，結(jié)果示于表3中。在無BSA的培養(yǎng)基中，如在前述實驗結(jié)果中看到的，125I-BBIssPal的細(xì)胞吸收是BBI的80倍。當(dāng)脫脂BSA(無脂肪酸的BSA)(0.1％)存在于培養(yǎng)基中時，125I-BBIss-Pal的吸收降低82％，而125I-BBI的吸收未受影響。無脂BSA用3倍摩爾過量的棕櫚酸處理，產(chǎn)生載脂肪酸的BSA，在這種BSA(0.1％)存在下，125I-BBI的吸收仍未受影響。因此，125I-BBIssPal與BSA強烈結(jié)合，而且這種結(jié)合取決于BSA上已結(jié)合的脂肪酸數(shù)目。表3</tables>該吸收實驗是在Dulbecco培養(yǎng)基中在無脂肪酸BSA(BSA)或載脂肪酸BSA(BSA/FA)存在或不存在的條件下進(jìn)行的。游離BBI或與棕櫚酸或油酸偶聯(lián)物形式的125I-BBI在無血清培養(yǎng)基中在Caco-2細(xì)胞中吸收的研究結(jié)果如圖1所示。結(jié)果以內(nèi)在化BBI的平均ng數(shù)±SEM(n＝3)表示。125I-BBssPal的細(xì)胞吸收比125I-BBI約大100倍。類似地，125I-BBIssOleic的細(xì)胞吸收比125I-BBI約大108倍。125I-BBIssPal和125I-BBIssOleic的吸收差異不顯著。實施例4生物分布測定實驗動物是重20-25g的2-3周齡雌性CF-1小鼠，實驗前自由攝取食物和水。將125I-BBI(3mg/kg)(游離BBI或BBIssPal或BBIssOleic偶聯(lián)物形式)通過尾靜脈給予動物。注射后0.5、3和24小時，處死每實驗組的3只動物，取其血液(200ml)、腎、肺和肝，用冰冷PBS洗滌，測定累積放射活性。記錄各器官重量并用于計算器官中偶聯(lián)物的濃度。在腹膜內(nèi)給藥生物分布研究中，將游離BBI或BBIssPal形式的125I-BBI(3mg/kg)注入每只動物腹腔的左下部。然后按以上描述的靜脈給藥生物分布研究中相同的方法處理動物。靜脈給藥后BBI和BBIssPal的生物分布結(jié)果示于圖2中，以每克器官累積百分劑量±SEM表示。結(jié)果表明BBI被迅速排泄出體外而未達(dá)到高的血濃度，BBIssPal以較高濃度累積在血中，而且明顯地從循環(huán)中清除速度慢。腎的生物分布結(jié)果表明，BBI在腎中迅速累積，而BBIssPal則不然。BBIssPal在肝中的累積約比BBI高5倍，而且BBIssPal在注射后24小時仍在肝中保持高水平。BBIssPal在肺中的累積也比BBI高2倍，但該結(jié)果可能由器官切除后其中的殘存血液所引起。很明顯，BBIssPal在血液和肝中保留時間更長、濃度更高。另外，BBIssPal的腎清除比游離BBI約低4倍。還在CF-1小鼠中研究了BBI和BBIssOleic的靜脈給藥生物分布。結(jié)果示于圖3中，以每克器官的累積百分劑量±SEM(n＝3，在0.5、3和24小時)表示。BBIssOleic的生物分布與BBIssPal非常相似，BBIssOleic的血液水平高于BBI，從循環(huán)中的清除明顯要慢。在相同時間點上，BBIssOleic的血液水平比BBI的高約4倍。BBIs-sOleic的腎清除比游離BBI低約4倍，肝累積高出約4倍。BBIs-sOleic在肝中保留時間延長，注射后24小時肝中仍存在顯著水平的偶聯(lián)物。BBIssOleic的肺水平約比游離BBI水平高2倍，但這一結(jié)果可能由肺中較高的殘留血量引起。125I-BBIssPal在CF-1小鼠中的腹膜內(nèi)給藥生物分布示于圖4中，以注射后0.5小時(圖4A)、3小時(圖4B)或24小時(圖4C)的每克器官百分劑量累積±變程(棒)表示。125I-BBIssPal在0.5和3小時時間點的腎累積比游離125I-BBI低4倍。在24小時時，腎中125I-BBIssPal水平高于125I-BBI。0.5小時時125I-BBIssPal的血濃度與125I-BBI的相似，3小時時高1.5倍，24小時時比BBI高約3倍。125I-BBIssPal的肝累積比125I-BBI的在0.5小時時高1.5倍，3小時時高2.5倍，24小時時高約4倍。在24小時時肝和腎中存在較大量的125I-BBIssPal。實施例5體外轉(zhuǎn)化研究按文獻(xiàn)方法[Reznikoff，C.A.等(1973)癌癥研究，33，3239-3249；Reznikoff，C.A.等(1973)癌癥研究，33，3231-3238]，用C3H10T1/2(克隆8)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗。每七天進(jìn)行每75cm2燒瓶傳代50000細(xì)胞的方法維持無支原體細(xì)胞的貯存培養(yǎng)物。按此方法，在達(dá)到匯合前的2天要進(jìn)行細(xì)胞傳代。貯存培養(yǎng)物生長在補有10％FBS、青霉素(100單位)和鏈霉素(100μg)的Eagle基本培養(yǎng)基中，并在第9-14代時用于轉(zhuǎn)化實驗。用PBS中的胰蛋白酶(0.1％)處理貯存細(xì)胞5分鐘，再用5ml培養(yǎng)液淬滅胰蛋白酶，以進(jìn)行細(xì)胞傳代。調(diào)節(jié)該方法使得貯存培養(yǎng)物中自發(fā)轉(zhuǎn)化減至最小，而培養(yǎng)皿中平板接種效力最高。對用于培養(yǎng)的FBS貯液進(jìn)行了預(yù)篩選，以保證該血清能支持轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表達(dá)和生長。為進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗，將C3H10T1/2細(xì)胞(1000/平皿)接種在60mm培養(yǎng)皿中，讓其在補有10％FBS、青霉素(100單位)和鏈霉素(100μg)的Eagle基本培養(yǎng)基中在濕潤的5％CO2氣氛下生長24小時。然后，用25ml3-甲基膽蒽(MCA)的丙酮溶液(0.25mg/ml)處理，達(dá)終濃度1μg/mlMCA(5μg/5ml)以誘發(fā)細(xì)胞。讓細(xì)胞在有致癌劑或溶劑存在下生長24小時，然后用不含致癌劑或溶劑的新鮮培養(yǎng)液更換每個平皿中的培養(yǎng)液。在實驗的頭兩周，每周更換兩次培養(yǎng)液，在剩余四周內(nèi)每周更換一次。旨在測定偶聯(lián)物轉(zhuǎn)化抑制活性的實驗中，實驗的頭三周中細(xì)胞保持在含偶聯(lián)物(1μg/ml)的培養(yǎng)液中，然后保持在不加偶聯(lián)物的培養(yǎng)液中。致癌劑處理后6周，在顯微鏡下觀察細(xì)胞與培養(yǎng)皿的粘附，用PBS洗滌，然后固定在100％甲醇中。然后固定的細(xì)胞單層用Giem-sa染液染色。每次實驗中每組處理20個平皿。除實驗組外，所有轉(zhuǎn)化實驗至少包括其他三組陰性對照(未用致癌劑或溶劑處理)，丙酮對照(用25μl丙酮處理)和陽性對照[用25ml丙酮中的MCA(1μg/ml)處理]。在顯微鏡下研究平板中的轉(zhuǎn)化灶(直徑＞3mm)，并按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)分類為I、II或III型(Landolph，J.R.(1985)現(xiàn)有細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化方法機理和應(yīng)用(Kakunaga，T.和Yamasaki，H.編)IARC科學(xué)出版社，法國里昂，185-201頁]。簡言之，III型灶是緊密、多層、嗜堿的細(xì)胞生長區(qū)，它被Giemsa染液染成深藍(lán)色并有粗糙的十字邊緣。II型灶也是緊密多層的細(xì)胞生長區(qū)，但Gimesa染色染成紫色，邊緣比III型灶光滑、規(guī)則。在本實驗中未記錄I型灶。與每個轉(zhuǎn)化實驗相關(guān)還研究了細(xì)胞的平板接種效力(PE)。為測定不同處理組中細(xì)胞的PE，將細(xì)胞(200細(xì)胞/平皿)接種在每個實驗組的三個培養(yǎng)皿中，按與轉(zhuǎn)化實驗細(xì)胞相同的方式處理。這些實驗中的細(xì)胞在第10天終止，固定在100％甲醇中，用Gimesa染液染色；對顯微鏡下可見的50個或更多細(xì)胞的集落計數(shù)。平板接種效力定義為(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100。BBI、BBIssPal和BBIssOleic的體外抗轉(zhuǎn)化活性示于表4中。在轉(zhuǎn)化實驗的頭三周中MCA處理后立即向培養(yǎng)物中加入1.0μg/mlBBI(游離蛋白形式或與棕櫚酸或油酸的偶聯(lián)形式)。MCA處理細(xì)胞，用溶于25μl丙酮的3-甲基膽蒽以1μg/ml的濃度處理24小時。丙酮處理細(xì)胞，僅用25μl丙酮處理24小時。實驗組用MCA處理24小時，然后在實驗的頭三周用偶聯(lián)物處理。未處理細(xì)胞不與MCA也不與丙酮接觸。統(tǒng)計分析(chi平方)第4組對第3組，p＜0.05；第5組對第3組，0.05＜p＜0.1；第6組對第3組，p＜0.05。接種后約14天平皿中對照的未處理細(xì)胞達(dá)到匯合，形成良好的粘附的、接觸抑制的單層。這些平皿在實驗結(jié)束時沒有轉(zhuǎn)化灶。丙酮處理的細(xì)胞在接種后14天也達(dá)到匯合，形成良好粘附的單層，且不含轉(zhuǎn)化灶。但MCA處理的平皿含有形態(tài)轉(zhuǎn)化的灶所記錄的19個平皿中6個含有III型灶。BBI處理組不含轉(zhuǎn)化灶，說明BBI能抑制這些細(xì)胞中MCA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。BBIssPal處理的細(xì)胞，實驗中記錄的20個平皿中有一個含II型灶。BBIssOleic處理的細(xì)胞不含轉(zhuǎn)化灶。該實驗所有組別的PE在20％到25％之間。如表4中所示，BBIss-Pal和BBIssOleic都保持了BBI的原始生物活性。表4實施例6單一偶聯(lián)物和多重偶聯(lián)物的轉(zhuǎn)運用轉(zhuǎn)孔板和六孔板進(jìn)行頂端膜結(jié)合的125I-BBIssPal的轉(zhuǎn)運研究。在六孔板實驗中，125I-BBI或125I-BBIssPal(10μg/ml)與Caco-2細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)1小時，然后用冰冷PBS洗滌細(xì)胞三次，再分成兩組。第一組在胰蛋白酶消化并分離細(xì)胞后測定偶聯(lián)物的內(nèi)在化。第二組中，細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)，并追蹤從細(xì)胞釋放的偶聯(lián)物計24小時；每隔一小時取出培養(yǎng)液并測定放射活性。在追蹤結(jié)束后，細(xì)胞用胰蛋白酶處理、分離并測定累積放射活性。測定每個實驗的總計數(shù)(培養(yǎng)液+細(xì)胞的cpm數(shù))，并測了不同時間釋放的總計數(shù)百分比。在轉(zhuǎn)孔板實驗中，偶聯(lián)物與細(xì)胞的頂側(cè)37℃培養(yǎng)1小時。然后用冰冷PBS洗滌轉(zhuǎn)孔板三次，然后再與無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。通過在不同時間對整個底側(cè)或頂側(cè)培養(yǎng)液計數(shù)，跟蹤向頂側(cè)及底側(cè)培養(yǎng)液中所釋放偶聯(lián)物計24小時。計算跟蹤結(jié)束時所獲總計數(shù)(轉(zhuǎn)孔板+培養(yǎng)液計數(shù))和不同時間點偶聯(lián)物的釋放(總數(shù)的百分比)。為了保證24小時時在轉(zhuǎn)孔板中所獲計數(shù)是出于細(xì)胞中偶聯(lián)物的存在，而非塑料表面的非特異結(jié)合，轉(zhuǎn)孔板用胰蛋白酶處理10分鐘，用冰冷PBS洗滌三次，然后測定累積放射活性。用2個或4個棕櫚酸修飾BBI，在轉(zhuǎn)孔板中測定其轉(zhuǎn)運。BBI、4棕櫚酸修飾的BBI[BBIssPal(4)]和2棕櫚酸修飾的BBI[BBIssPal(2)]在Caco-2細(xì)胞單層中的累積轉(zhuǎn)運示于圖5A中；結(jié)果用BBI(ng/單層)±SEM(n＝3)表示。轉(zhuǎn)運程度的順序是BBIssPal(4)＞BBI＞BBIssPal(2)。各偶聯(lián)物向相同細(xì)胞中內(nèi)在化的結(jié)果示于圖5B中，用單層的內(nèi)在化BBI(ng)表示。正如所料，BBIssPal(4)的細(xì)胞攝入最高，其次是BBIssPal(2)和BBI。用G50柱分析24小時處所得底層培養(yǎng)液，結(jié)果示于圖6中。如前述已觀察到的那樣，BBI和BBIssPal(4)都不能被轉(zhuǎn)胞跨過細(xì)胞單層。但BBIssPal(2)的底層培養(yǎng)液中少量(但顯著)是由完整偶聯(lián)物構(gòu)成的。其量占底層培養(yǎng)液總放射活性的約10％到20％。實施例7BBIssPal的皮膚吸收將來自無毛小鼠的新鮮皮膚架在小環(huán)上。向每塊皮膚0.38cm2面積上施以0.5mg/ml濃度的125I-標(biāo)記的BBI或BBIssPal樣品5ml。每次處理使用2片皮膚，將其保持在室溫(23℃)下潮濕環(huán)境中。30分鐘后，先用PBS小心洗滌皮表面；然后取下皮膚并在100mlPBS中浸泡兩次；然后用濾紙吸干并用γ計數(shù)器計數(shù)。用標(biāo)記BBI或BBIssPal的比放射活性計算保留在皮膚上的BBI量。吸收進(jìn)入小鼠皮膚的BBI和BBIssPal分別為0.14和1.6μg/cm2。這說明，當(dāng)用Pal-PDC修飾多肽時，使BBI的皮膚吸收提高了10倍以上。實施例8棕櫚酸化辣根過氧化物酶(HRPssPal)的合成25℃下混合0.5mlPBS中10mg辣根過氧化物酶(分子量40，000；SigmaP8375)和0.1mlDMF中2mlSPDP計2小時。用0.5mlPBS稀釋終止反應(yīng)，4℃下在500mlPBS中透析。24小時后，取出透析管中的溶液，加入1MDTT50μl還原，再用SephadexG-50柱分離。收集并合并柱空體積處的流份，與pH9.6硼酸緩沖液中10倍摩爾過量的Pal-PDC于25℃混合4小時。然后反應(yīng)混合物于4℃徹底透析3天，經(jīng)測定最終產(chǎn)物中每分子HRP含有10個棕櫚酸殘基。HRP分子保留了約20％的原始酶活性。實施例9HRPssPal的細(xì)胞攝入小鼠成纖細(xì)胞L929的成片單層在六孔板無血清培養(yǎng)液中與30μg/ml游離形式或棕櫚酸偶聯(lián)物形式(HRPssPal)的HRP一起培養(yǎng)。37℃下一小時后，該細(xì)胞單層用PBS洗三次，然后溶解在1ml0.05％的Triton-X100中。通過測定每個細(xì)胞提取物的酶活性來確定攝入細(xì)胞的HRP，并轉(zhuǎn)化為每細(xì)胞單層的HRPng數(shù)。結(jié)果顯示HRP和HRPssPal的細(xì)胞吸收分別為7和229ngHRP/細(xì)胞單層。因而用Pal-PDC修飾HRP，使其細(xì)胞吸收提高了30倍。實施例10寡核苷酸的脂化用下述步驟硫醇化與單胺氧化酶B的mRNA互補的一種21mer反義寡核苷酸。在水溶性碳化二亞胺試劑EDC存在下將該寡核苷酸與兩倍摩爾過量的半胱胺混合?；旌衔镌?5℃下保持2小時，加入對半胱胺兩倍摩爾過量的DTT以還原二硫鍵。用SephadexG-25柱將寡核苷酸與游離半胱胺及DTT分離后，將少量硫醇化寡核苷酸與Ellman試劑反應(yīng)，用412nm處的吸光度測定巰基的濃度(假定ε＝1.36×104M-1)。然后再確定每個寡核苷酸上的巰基數(shù)目。該硫醇化寡核苷酸在pH8的碳酸氫鹽緩中液中與相對寡核苷酸中巰基數(shù)目兩倍摩爾過量的Pal-PDC混合。用SephadexG-25柱純化棕櫚酸化的寡核苷酸。從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定本發(fā)明的基本特征，而且在不背離其精神和范圍的情況下能使本發(fā)明適于各種用途和條件。按環(huán)境所需可進(jìn)行形式改變和等價替換，本文所用的任何具體術(shù)語只具有說明意義而非用于限制目的。權(quán)利要求1.通式VI的化合物其中P選自肽、蛋白和寡核苷酸；R1為氫、低級烷基或芳基；R2為包含脂基的含脂殘基；R3為-OH、包含脂基的含脂殘基或含一個或兩個氨基酸且末端為-CO2H或-COR2的氨基酸鏈。2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1為氫，R2為脂基，R3為-OH。3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1為氫，R2為-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3為-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一個含有脂基。4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述脂基是含約4-26個碳原子的疏水取代基。5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中所述脂基是含約5-19個碳原子的疏水取代基。6.一種提高選自肽、蛋白和寡核苷酸的含巰基化合物在哺乳動物細(xì)胞中吸收的方法，該方法包括從該含巰基化合物形成通式VI的化合物其中P從選自肽、蛋白和寡核苷酸的含巰基化合物衍生的殘基；R1為氫、低級烷基或芳基；R2為含脂殘基；R3為-OH、含脂殘基或含一個或兩個氨基酸且末端為-CO2H或-COR2的氨基酸鏈；給予細(xì)胞該通式VI化合物。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中R1為氫、R2為脂基，R3為-OH。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中R1為氫，R2為-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3為-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一個含有脂基。9.一種延長選自肽、蛋白和寡核苷酸的含巰基化合物在血液和組織中保留時間的方法，該方法包括從該含巰基化合物形成通式VI的化合物其中P選自肽、蛋白和寡核苷酸；R1為氫、低級烷基或芳基；R2為含脂殘基；R3為-OH、含脂殘基或含一個或兩個氨基酸且末端為-CO2H或-COR2的氨基酸鏈；給予細(xì)胞通式VI的化合物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中R1為氫，R2為脂基，R3為-OH。11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中R1為氫，R2為-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3為-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一個含有脂基。12.通式V的化合物A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(＝O)R3V其中A為芳香活化殘基；R1為氫、低級烷基或芳基；R2為含有脂基的含脂殘基；R3為-OH、含有脂基的含脂殘基或含一個或兩個氨基酸且末端為-CO2H或-COR2的氨基酸鏈。13.根據(jù)權(quán)利要求12的化合物，其中A為2-吡啶基或4-硝基苯基。14.根據(jù)權(quán)利要求12的化合物，其中R1為氫，R2為脂基，R3為-OH。15.根據(jù)權(quán)利要求12的化合物，其中R1為氫，R2為-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3為-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一個含有脂基。16.通式VI化合物的制備方法，包括通式PSH化合物，其中P選自肽、蛋白和寡核苷酸，與通式V化合物反應(yīng)A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(＝O)R3V其中A為芳香活化殘基；R1為氫、低級烷基或芳基；R2為含有脂基的含脂殘基；R3為-OH、含有脂基的含脂殘基或含有一個或兩個氨基酸且末端為-CO2H或-COR2的氨基酸鏈。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中A為2-吡啶基或4-硝基苯基。18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中R1為氫，R2為脂基，R3為-OH。19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中R1為氫，R2為-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3為-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一個含有脂基。20.通式III的化合物A-S-S-CH2-CR1(NH2)C(＝O)R3III其中R3′為-OH或含一個或兩個氨基酸且末端為-CO2H的氨基酸鏈；A為芳香活化殘基；R1為氫、低級烷基或芳基。21.根據(jù)權(quán)利要求20的化合物，其中R1為氫，R3′為-OH。22.根據(jù)權(quán)利要求20的化合物，其中R1為氫，R3′為-NHCH2CO2H。全文摘要含巰基化合物(例如含巰基肽或蛋白)的脂肪酸衍生物,即含二硫鍵的脂肪酸—偶聯(lián)產(chǎn)物用于向哺乳動物細(xì)胞輸送該化合物。與未偶聯(lián)化合物的吸收率相比,這種修飾顯著提高了哺乳動物細(xì)胞對該化合物的吸收,而且延長了化合物在血液和組織中的保留時間。另外,偶聯(lián)物中的二硫鍵在細(xì)胞中不穩(wěn)定,在細(xì)胞中易于從脂肪酸部分釋放出完整的化合物。文檔編號C07K14/47GK1175902SQ96192128公開日1998年3月11日申請日期1996年1月25日優(yōu)先權(quán)日1995年1月25日發(fā)明者W－C·申,H·M·伊克拉密申請人:南加利福尼亞大學(xué)