專利名稱：噻唑鎓化合物用于預防和逆轉高級糖基化終產物形成的用途的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及由于蛋白質和葡萄糖或其它還原糖反應而引起的蛋白質老化，更具體地講，本發(fā)明涉及抑制非酶促糖基化蛋白的反應以及裂解由于隨后高級糖基化終產物的形成而引起的交聯(lián)。
人們對于葡萄糖和蛋白質之間的反應已有了一段時間的認識。最初的發(fā)現(xiàn)是在烹調食物時出現(xiàn)棕色的色素，Maillard于1912年對其進行了鑒定，他發(fā)現(xiàn)葡萄糖或其它還原糖可與氨基酸反應生成加合物，形成的加合物經歷一系列的脫水和重排過程形成穩(wěn)定的棕色色素。進一步的研究表明，儲藏和加熱處理過的食物由于葡萄糖和多肽鏈之間的反應而經歷非酶促的褐變，并且蛋白質也會因此發(fā)生交聯(lián)而相應地表現(xiàn)出降低的生物活性。
在體內也存在著還原糖和食物蛋白之間的反應。已證實血紅蛋白可以發(fā)生葡萄糖與蛋白質上游離氨基之間形成穩(wěn)定的1-脫氧酮糖基加合物(稱為Amadori產物)的非酶促反應，其中血紅蛋白β鏈上的氨基末端通過與葡萄糖的反應而發(fā)生重排，形成被稱為血紅蛋白Alc的加合物。還發(fā)現(xiàn)多種其它的體內蛋白，如晶狀體、膠原和神經蛋白也可以發(fā)生這種反應。參見Bucala等，“高級糖基化；糖尿病和衰老的化學、生物學及有關因素”，藥理學進展，23卷，1-34頁，Academic Press(1992)。
此外，在許多長壽命的蛋白質(例如老年個體的晶狀體蛋白和膠原蛋白)內也觀察到了與后期的Maillard產物具有相似波譜和熒光特性的棕色色素。在20至90歲之間，可以在人硬腦膜膠原內觀察到色素隨年齡的線性增加。令人感興趣的是，可以在體外通過葡萄糖誘導的交聯(lián)來模仿膠原的老化；并且還注意到膠原可以俘獲其它蛋白并形成加合物，這被認為是通過交聯(lián)反應而發(fā)生的，并且確信這是在腎基膜內觀察到白蛋白和抗體積累的原因。
在美國專利4,758,583中，公開了用于抑制高級糖基化終產物形成的方法及有關試劑，該方法包括將所述試劑與靶蛋白和葡萄糖之間的最初反應所形成的早期糖基化產物進行反應。于是，推定產生了抑制作用，因為抑制劑和早期糖基化產物之間的反應似乎中斷了隨后糖基化蛋白和加入的蛋白物質形成交聯(lián)的后期產物的反應。被確認為抑制劑的試劑之一是氨基胍，進一步的試驗結果證實了其在該方面的效果。
盡管在氨基胍以及相似化合物上取得的成功大有前途，但仍需尋找和開發(fā)其它抑制劑，以擴展可用度和該潛在活性的范圍，以及其在診斷和治療中的用途。此外，還需要尋找不僅能夠抑制該反應及其后果，并且還能夠裂解由已存在的高級糖基化終產物所形成的交聯(lián)物從而逆轉其產生的影響的試劑。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，公開了抑制蛋白質高級糖基化(蛋白質老化)并裂解高級糖基化終產物(AGEs)之間或AGEs與其它蛋白質之間形成的交聯(lián)物的方法和組合物。本發(fā)明的方法和組合物還可預防和逆轉由體內或食物中存在的其它活潑糖(包括核糖、半乳糖和果糖)所引起的高級糖基化終產物和交聯(lián)。
具體地講，該組合物含有用于抑制高級糖基化終產物形成并逆轉已形成的高級糖基化終產物、并裂解所形成的交聯(lián)物的試劑。盡管不愿受到任何理論的束縛，但我們確信已形成的高級糖基化終產物及交聯(lián)物的裂解是由于高級糖基化終產物中存在的α-二羰基蛋白交聯(lián)物的裂解。因此，本發(fā)明的方法和組合物涉及具有產生上述裂解能力的試劑，該試劑可同時在體外和體內用于裂解已形成的高級糖基化終產物和交聯(lián)物，并消除它們所產生的有害作用。
可用于本發(fā)明的試劑是一類被稱為的化合物。
該試劑包括具有如下結構式的噻唑鎓化合物及其混合物
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子；以及加入的載體。
本發(fā)明所用的化合物及其組合物似乎可以和早期的糖基化產物反應，從而防止該產物進一步形成高級糖基化終產物，所述高級糖基化終產物可導致交聯(lián)物、分子和蛋白質老化以及其它不利的分子結果。另外，它們還可與已形成的高級糖基化終產物反應從而減少該產物的量。
本發(fā)明還涉及抑制蛋白質老化以及其它不利的分子結果的方法，該方法包括將早期糖基化產物階段的最初的糖基化分子與一定量的一種或多種本發(fā)明的試劑或含有該試劑的組合物接觸；本發(fā)明還涉及裂解已形成的高級糖基化終產物以減少該產物量的方法，該方法包括裂解高級糖基化終產物中存在的α-二羰基交聯(lián)物。當本發(fā)明的方法在工業(yè)中應用時，可考慮對蛋白施用一種或多種試劑，例如，將試劑加入到蛋白提取物形式的蛋白質的混合物中，或將試劑施用或加入到易于發(fā)生高級糖基化和交聯(lián)的食物中，這些均是為了防止食物的提前老化和變質，并逆轉已形成的高級糖基化終產物的影響。
在體內抑制高級糖基化終產物形成并逆轉已形成的高級糖基化產物的能力使其可應用于所有高級糖基化及伴隨的分子交聯(lián)是嚴重損害的情況。因此，例如在食品加工領域，通過使那些較不穩(wěn)定的食物變得不易變質來阻止食物變質從而使消費者更易得到，將會帶來顯著的經濟和社會效益。減少變質的同時，檢查、移走和替換的費用將會降低，并且食物可被更多的人得到，這些將有助于市場上食物價格的穩(wěn)定。同樣，在存在蛋白質變質問題的其它工業(yè)應用中，在含有所述蛋白質的物質中加入本發(fā)明試劑的混合物將有助于所述物質的有效期延長。已知目前使用的食物防腐劑和變色預防劑如二氧化硫可以產生毒性，包括在動物中引起過敏和哮喘，這些物質可用例如文中所述的化合物代替。
本發(fā)明的方法作為Maillard方法，迅速影響體內的數(shù)種顯著蛋白質量有特別的治療應用，所述蛋白質是膠原，彈性蛋白，晶狀體蛋白和腎小球基膜。這些蛋白質隨年齡(因此有“蛋白質老化”的應用術語)和糖尿病的結果而變質。因此，延緩或基本上抑制體內高級糖基化終產物的形成，并減少高級糖基化終產物與其它蛋白質之間形成的交聯(lián)物量給治療糖尿病并發(fā)癥和例如衰老，并由此改善生活質量，而且可能延長動物和人的生命帶來了希望。
本發(fā)明的試劑還用于個人美容和衛(wèi)生，因為他們通過有抗-斑特性的陽離子抗微生物劑，如洗必泰可以抑制并逆轉牙齒菌斑。
本發(fā)明還包括新的分析方法，用于確定生成的非酶促終產物的“裂解”或逆轉。在本文中，本發(fā)明還擴大到鑒定并使用新交聯(lián)結構，認為所述交聯(lián)結構是作為體外和體內高級糖基化結果而形成的顯著數(shù)量的分子交聯(lián)物。更具體地說，所述交聯(lián)結構包括能夠經二親核的噻唑鎓類化合物裂解的糖衍生的α-二羰基片段或部分，如二酮。具體說，所述交聯(lián)結構可以是下式
其中A和B分別獨立地是與生物分子的親核原子結合的位點。
因此，本發(fā)明的主要目的是通過相應地抑制高級糖基化終產物的形成以及裂解已發(fā)生的高級糖基化介導的交聯(lián)，而提供抑制高級糖基化終產物形成和分子廣泛交聯(lián)的方法，和裂解由已存在的高級糖基化終產物形成之交聯(lián)物的方法，所述高級糖基化終產物是由于敏感性分子如蛋白質與葡萄糖和其它活潑糖反應而產生的。
本發(fā)明的另一目的是提供前述方法，其特征在于鑒定為早期糖基化產物的初始糖基化蛋白質反應。
本發(fā)明的另一目的是提供前述方法，所述方法抑制所述早期糖基化產物為形成所述高級糖基化重產物而進行的重排和交聯(lián)。
本發(fā)明的另一目的是提供能夠參與與前述方法中所述早期糖基化產物反應的試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供通過裂解高級糖基化終產物中的α-二羰基蛋白質交聯(lián)物而裂解或逆轉作為前述高級糖基化反應的結果而形成的高級糖基化終產物的試劑。
本發(fā)明的另一目的是借助前述方法和試劑，提供治療分子不利結果或蛋白質老化的治療方法。
本發(fā)明的另一目的是借助前述方法和試劑，提供抑制和逆轉、使牙齒脫色的方法。本發(fā)明的另一目的是提供組合物、包括藥物組合物，它們均摻有本發(fā)明的試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供用于本發(fā)明方法和組合物中的新化合物以及其制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供新的分析方法，用于測定具有“裂解”或逆轉生成的非酶促糖基化終產物和其隨后產生的交聯(lián)物之能力的化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供用本文所述能夠用裂解或逆轉生成的高級糖基化終產物的試劑裂解的交聯(lián)結構，所述交聯(lián)結構特異性抗體及其診斷和治療用途。
參考下列說明性附圖和描述，其它目的和優(yōu)點對于本領域專業(yè)人員來說是顯而易見的。
附圖概述
圖1為SDS-PAGE凝膠，它顯示與本發(fā)明的3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物(命名為ALT-766)一起保溫的正常和糖尿病小鼠尾腱膠原的CNBr肽圖。圖2為SDS-PAGE凝膠，它顯示本發(fā)明的化合物3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物裂解交聯(lián)的AGE-BSA的物理證據(jù)。
優(yōu)選實施方案的詳細描述根據(jù)本發(fā)明，開發(fā)了確信可以在大量靶分子(包括尤其是存在于動物和植物中的蛋白質)中抑制高級糖基化終產物形成并逆轉已形成的高級糖基化終產物的試劑、含有所述試劑的組合物(包括藥物組合物)及有關方法。具體地講，本發(fā)明涉及含有一種或多種試劑的組合物，所述試劑包括具有裂解高級糖基化終產物中存在的α-二羰基分子交聯(lián)物能力的化合物。例如，可使用的試劑包括具有如下結構式的化合物及其混合物
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基、或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子；以及加入的載體。
上述低級烷基含有1-6個碳原子，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基，及其相應的支鏈異構體。低級炔基含有2至6個碳原子。同樣，低級烷氧基也含有1至6個碳原子，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基，及其相應的支鏈異構體。這些基團被一個或多個鹵素、羥基、氨基或低級烷氨基選擇性地取代。
上式所包含的低級酰氧基(低級)烷基包括在酰氧基部分含有2至6個碳原子并且在低級烷基部分含有1至6個碳原子的基團。酰氧基部分一般為乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基，及其相應的支鏈異構體。低級烷基部分如上所述。
上式所包含的芳基為含有6-10個碳原子的基團，例如萘基、苯基和低級烷基取代的苯基(如甲苯基和二甲苯基)，并且該基團被1-2個鹵素、羥基、低級烷氧基或二(低級)烷氨基選擇性地取代。優(yōu)選的芳基是苯基、甲氧苯基和4-溴苯基。
上式中的鹵原子可以是氟、氯、溴或碘。
為了本發(fā)明的目的，將式(I)化合物制成生物及藥物可接受的鹽?？蓱玫柠}形式是鹵化物(特別是溴化物和氯化物)、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽和均三甲苯磺酸鹽。其它的相關鹽可用類似的無毒并且生物及藥物可接受的陰離子制成。
在式I所包括的化合物中，某些取代基為優(yōu)選。例如，其中的R1或R2是低級烷基的化合物為優(yōu)選。還特別優(yōu)選其中Y是氨基、2-氨基-2-氧乙基、2-苯基-2-氧乙基或2-[取代苯基]-2-氧乙基的化合物。
本發(fā)明的代表性的化合物是3-氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-氨基-4，5-二甲氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；2，3-二氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；3-氨基-4甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-苯基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物；3，4-二甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓碘化物；3-乙基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；3-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物；2，3-(二氨基)苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-(2-氨基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-氨基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；3-(2-氨基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物；3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物；3-氨基-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物；2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物；2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(2’，4’-二甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(2’，4’-二氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-炔丙基-噻唑鎓溴化物；3-炔丙基-4-甲基噻唑鎓溴化物；3-炔丙基-5-甲基噻唑鎓溴化物；3-炔丙基-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物；3-炔丙基-4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物；2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；2，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；2，6-二氨基苯并噻唑鎓二鹽酸鹽；2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；2，6-二氨基-3-[2-(3’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；2，6-二氨基-3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；2，6-二氨基-3-(2-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物；2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物；3-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑基-乙基乙酸酯均三甲苯磺酸鹽；2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(2’，6’-二氯苯乙氨基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(2’，6’-二異丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯芐氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-[2-(4’-甲酯基-3’-羥基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；2，3-二氨基-4-甲基-5-羥乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；2，3-二氨基-5-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽；3-[2-(1’，4’-苯并二氧雜環(huán)己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-[1’，4’-苯并二氧雜環(huán)己烷-6-基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-苯并噻唑鎓溴化物；1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓溴化物；3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物；3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-(3’-甲氧芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓氯化物；3-(2’，6’-二氯芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓氯化物；3-(2’-硝基芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物；3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物；和3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物。
式I所代表的某些化合物是新化合物，這些化合物代表本發(fā)明的另一個實施方案。這些化合物由下式表示
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；條件是Y和Z中至少有一個是氨基，并且另一個條件是當Y是氨基并且R2是Z均是氫時，則R1不是低級烷基；并且X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
其它的新化合物是下式的化合物
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級酰氧基(低級)烷基、低級烷基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)；Z是氫或氨基；Y是炔甲基、或下式的基團
其中R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；并且X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
上述化合物能夠抑制靶分子，包括例如蛋白質上高級糖基化終產物的形成并能夠裂解或逆轉所述蛋白質上已形成的高級糖基化終產物。因高級糖基化終產物形成而引起的蛋白質交聯(lián)對其它蛋白質的捕獲產生影響，而且導致體內疾病的發(fā)展，如皮膚的彈性降低并起皺，某些腎病，動脈粥樣硬化，骨關節(jié)炎等。相似的，經非酶促褐變的植物物質變質，在食品的情況下，會腐敗或變硬，結果不能食用，難吃或失去營養(yǎng)。因此本發(fā)明所用的化合物可以抑制所述后期的Maillard反應并干預上述的有害變化，降低已經在蛋白質物質中存在的高級糖基化終產物的水平。
本發(fā)明的基本原理是使用阻斷并逆轉糖基化后步驟，如熒光色基和交聯(lián)物的形成的試劑，所述熒光色基和交聯(lián)物的存在是與糖尿病和衰老相關并導致糖尿病和衰老的有害后發(fā)癥。理想的試劑是抑制所述色基和蛋白質鏈之間交聯(lián)物的形成以及蛋白質捕獲到其它蛋白質上，如在關節(jié)炎和腎中所發(fā)生的，并逆轉已存在的所述交聯(lián)形成的水平。
認為本發(fā)明化合物可與之反應的早期糖基化產物的化學性質可以改變，因此本文用術語“早期糖基化產物”來包括任何和所有在其范圍內的變化。據(jù)推斷，通過與本發(fā)明化合物反應可以阻斷高級糖基化終產物形成中不可缺少的羰基部分的早期糖基化產物。在一實施方案中，預計早期糖基化產物可以包括Amadori產物的活潑羰基部分或其進一步的縮合，脫水和/或重排產物，它們可以縮合形成高級糖基化終產物。在另一方案中，Amadori或其它早期糖基化終產物的裂解可以形成含一個或多個羰基部分的活潑羰基化合物(糖醛，甘油醛或葡糖醛酮)，隨后再與胺或Amadori產物反應，可以形成含羰基的高級糖基化產物如烷基甲酰基-糖基吡咯。
一些研究人員已經研究了高級糖基化產物形成的機制。Eble等在體外的研究中(1983)“非酶促糖基化和葡萄糖依賴的蛋白質交聯(lián)”，生物化學雜志，2589406-9412，研究了在不存在葡萄糖的條件下，糖基化蛋白質與非糖基化蛋白質的交聯(lián)。Eble等尋求闡明Maillard反應的機制，因此用控制的RNase的初始糖基化作為模型系統(tǒng)，然后在不同的條件下檢測。在一方面，分離糖基化蛋白物質，然后放在無葡萄糖的環(huán)境中，由此觀察以確定交聯(lián)的程度。
由此，Eble等觀察不僅與糖基化蛋白質而且與非糖基化蛋白質也繼續(xù)發(fā)生交聯(lián)。Eble等的一個觀察結果是糖基化蛋白質與蛋白質物質之間的反應似乎發(fā)生在所述蛋白質的氨基酸側鏈上。就此而論，Eble等完成的證明性試驗表明游離賴氨酸與RNase上的賴氨酸競爭結合糖基化蛋白質。因此，從這些數(shù)據(jù)可以推知，賴氨酸可以作為高級糖基化抑制劑，但該結論和導致該結論的基本觀察結果應限于Eble等制備和檢測的模型系統(tǒng)內。顯然，就抑制體外和體內的蛋白質高級糖基化而言，Eble等沒有意識到，也未表明作為本發(fā)明基礎的發(fā)現(xiàn)。
Eble等的試驗未說明在總是存在葡萄糖的情況下，體內形成的高級糖基化終產物的活潑裂解產物機制或任何其它機制。事實上，其它研究人員支持所述解釋體內高級糖基化形成的機制(例如參見Hayase等，生物化學雜志，2633758-3764(1989)；Sell和Monnier，生物化學雜志，26421597-21602(1989)；Oimomi等，農業(yè)生物化學，53(6)1727-1728(1989)；和糖尿病研究和臨床實踐，6311-313(1989))。因此，在Eble等的模型中，用賴氨酸作為抑制劑，在體內存在葡萄糖的條件下，與用本發(fā)明化合物抑制高級糖基化終產物形成和糖尿病和衰老并發(fā)癥的惡化無關。
盡管不希望局限于任何特定的理論來說明本發(fā)明化合物逆轉已形成的高級糖基化終產物的機制，但還是進行了研究以闡明可能的機制。早期檢測Amadori產物(AP)結果的研究已確定了一種可能導致共價葡萄糖衍生的蛋白質交聯(lián)物形成的途徑。如下方案A所示，該途徑經AP連續(xù)的β消除而完成脫水。因此AP脫掉4-羥基(1)就得到了1，4-二脫氧-1-烷氨基-2，3-己二酮糖(AP-二酮)(2)。通過用AGE-抑制劑氨基胍捕獲模型AP分離了具有氨基-1，4-二脫氧酮結構的AP二酮。隨后消除5-羥基得到1，4，5-三脫氧-1-烷氨基-2，3-己酮糖-4-烯(AP-烯-二酮)(3)，該物質以其1，2-烯醇的三乙?；苌锏男问椒蛛x得到。預計Amadori-二酮，特別是AP-烯-二酮對于蛋白交聯(lián)反應是高度活潑的，可以作為與蛋白質中含有胺(Lys，His)或巰基(Cys)的親核物質加成的靶分子，由此生成形式(4)的穩(wěn)定交聯(lián)物。
應當注意到，盡管在上述方案A中只給出了6-員環(huán)的形式，但是線性AP-烯-二酮(3)及穩(wěn)定交聯(lián)物(4)可以環(huán)化形成5-或者6-員的鄰羥基內醚環(huán)。
通過設計試驗以檢測體內該途徑的出現(xiàn)率，以及對所得α-二羰基蛋白交聯(lián)物的特異性裂解的作用，研究了葡萄糖衍生的交聯(lián)物形成的主要途徑是通過AP-烯--二酮中間產物這種可能性。因此認為本發(fā)明的噻唑鎓化合物可作為新的“二配位基”親核物質，特別旨在作用于交聯(lián)物兩個羰基之間的碳-碳裂解反應，例如下方案B所示的生理條件下的裂解。該方案給出了質子轉移的式Iα-二酮裂解劑(N-苯酰噻唑鎓溴化物)與AP-烯-二酮衍生的交聯(lián)物的反應。
為了闡明該反應的進一步的試驗涉及式I化合物N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物與1-苯基-1，2-丙二酮生成預計的裂解產物苯甲酸的反應。N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物和1-苯基-1，2-丙二酮之間的反應迅速并且很容易地進行，從而證明了該可能的機制。
在蛋白質上一旦形成早期葡萄糖衍生的加成產物，接著還可以發(fā)生其它反應以導致共價蛋白質-蛋白質交聯(lián)反應。就這點而言，當AGE-修飾的BSA(AGE-BSA)與未修飾的天然膠原反應時，可以使式I的化合物，N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物與形成的AGE交聯(lián)物反應。這會導致從預形成的AGE-介導的復合物中以濃度依賴方式釋放BSA。另外，該研究證明，在試驗條件下形成的大部分AGE-交聯(lián)物由對裂解敏感的α-二酮或相關結構組成，所述裂解有益的是由式I的二配位基型分子化合物在生理條件下進行的。
為了證明體內的相同情況，在溴化氰消化和凝膠電泳分析前，用式I的化合物(N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物)處理患糖尿病32周之大鼠尾腱的分離的膠原。隨后的電泳表明處理過的膠原與未處理的非糖尿病(對照)膠原難以區(qū)分，與通常從糖尿病動物中分離的AGE-修飾的高度交聯(lián)的，消化抗性膠原明顯相反。
本發(fā)明還涉及抑制高級糖基化終產物形成并逆轉已形成的高級糖基化終產物水平的方法，所述方法包括將靶分子與本發(fā)明的組合物接觸。在食品中含所述靶蛋白質的情況下，無論是植物還是動物源的，都可以通過各種常規(guī)方法，將含本發(fā)明試劑的組合物應用于所述食品。
在食品工業(yè)中，數(shù)年前，發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽可以抑制Maillard反應，因此常將其用于食品加工和貯存。但最近，食品中的亞硫酸鹽與哮喘病中嚴重甚至致命的反應有關。結果，禁止用亞硫酸鹽處理新鮮水果和蔬菜。該致敏反應的機制尚未可知。因此，本發(fā)明組合物和試劑提供了代替亞硫酸鹽的非毒性方法，用所述方法可以處理食品。
從本發(fā)明的討論情況可以看出，本發(fā)明方法和組合物給抑制、以及某種程度逆轉動物和植物中關鍵蛋白的老化帶來了希望，并同時可推知其結果將產生經濟和醫(yī)療效益。在食品的情況下，施用本發(fā)明組合物給延緩食物變質，由此食品的上架期延長，而且更易被消費者得到帶來了希望。用非毒性的生物相容化合物代替目前施用的防腐劑，如已知引起人過敏和哮喘的二氧化硫是本發(fā)明的另一優(yōu)點。
本發(fā)明治療的并發(fā)癥涉及抑制、并且在某種程度逆轉因高級糖基化和交聯(lián)而引起的衰老過程，所述衰老過程如上文說明的，已經得到鑒定并用關鍵蛋白質的老化來舉證。因此，體內蛋白，特別是結構體內蛋白，如膠原，彈性蛋白，晶狀體蛋白，神經蛋白，腎小球基膜和其它血管外基質組分均可由于本發(fā)明的實踐而在其壽命和運作方面受益。因此，本發(fā)明降低了與因交聯(lián)靶蛋白而引起的蛋白質沉積有關的疾病發(fā)病率，如視網膜病、白內障、糖尿病性腎病、腎小球硬化癥、外周血管疾病、閉塞性動脈硬化、外周神經病、中風、高血壓、粥樣硬化、骨關節(jié)炎、關節(jié)周強直、皮膚失去彈性和起皺、關節(jié)強直、腎小球腎炎等。同樣，所有這些疾病在患有因高血糖而引起的糖尿病的患者中，都是顯而易見的，而且一般會加速發(fā)生。因此本發(fā)明治療方法適用于治療高齡患者中的上述和相關疾病或患有所述病理學的那些疾病。
通過高級糖基化產物形成而發(fā)生的分子交聯(lián)會降低結構蛋白如膠原在血管壁中的可溶性而且還會將血清蛋白，如脂蛋白捕獲到膠原上。這樣還會導致內皮滲透性的增加，從而使?jié)B出的血漿蛋白與次內皮基質共價結合，降低了血漿和基質蛋白對酶促生理降解的敏感性。出于這些原因，已經推測因慢性高血糖引起的漸進性糖尿病性血管堵塞是由于糖衍生的，特別是葡萄糖衍生的交聯(lián)物的過量形成而引起的。用本發(fā)明的組合物和方法，通過化學抑制逆轉高級糖基化產物的形成，可以有效地防止并逆轉所述糖尿病性微血管改變和微血管堵塞。
研究表明靶器官中的慢性糖尿病性損傷的發(fā)展主要與高血糖有關，因此嚴格的代謝控制可以延緩或甚至防止終器損傷。參見Nicholls等，實驗室研究；60第4期，486頁(1989)，其中討論了在鼠糖尿病性腎病中，胰島異體移植和氨基胍的作用。這些研究進一步說明氨基胍消除了糖尿病大鼠中主動脈壁的蛋白質交聯(lián)，而且證實了Brownlee等人〔科學，2321629-1632(1986)〕對糖尿病的這種其它器官并發(fā)癥所進行的早期研究。此外，其它研究表明氨基胍減少在腎中捕獲的免疫球蛋白〔Brownlee等人，糖尿病，35(1)42A(1986)〕。
Brownlee等人(1988，同上文)從腎形態(tài)學變化(這是糖尿病性腎病的標志)說明，在鏈尿菌素-糖尿病大鼠模型中，施用氨基胍干擾了糖尿病腎病的發(fā)展。這些研究人員報道用氨基胍阻止了腎小球基膜厚度的增加(這是糖尿病性腎病的主要結構失常特征)。
綜合考慮，這些數(shù)據(jù)清楚地表明根據(jù)本發(fā)明的教導，抑制并逆轉高級糖基化終產物(AGE)的形成可以防止以及在某種程度上逆轉因糖尿病引起的晚期及早期結構損傷，和因AGE形成而引起的衰老過程中的改變。
糖尿病誘導的紅細胞變形能力的改變(導致細胞膜更不易彎)是交聯(lián)和氨基胍的另一特征，已經表明在體內得到抑制。在所述研究中，用患誘導性長期糖尿病的新西蘭白兔研究試驗化合物對紅細胞(RBC)變形能力(df)的影響。以100mg/kg的速率將試驗化合物經口管飼于糖尿病大鼠。
糖尿病的另一后果是高血糖誘導的骨基質分化，這導致通常與慢性糖尿病有關的骨形成減少。在動物模型中，糖尿病誘導70％誘導性的骨基質分化。
在將本發(fā)明組合物用于體內或治療目的情況下，需要注意其中所用的化合物或試劑是生物相容的?？梢杂弥委熡行Я康谋景l(fā)明試劑或化合物制備藥物組合物，而且所述藥物組合物可以包含選自已知用于該目的的可藥用載體。根據(jù)施用方法，可以以各種形式制備所述組合物。另外，還可以使用式I化合物的各種可藥用加成鹽。
在通過靜脈內，肌肉內或腹膜內注射施用的情況下，可以使用液體形式。適宜時，可以制備固體劑型，如片劑，膠囊或液體劑型，如溶液和懸浮液等以用于口服。對于用于皮膚或眼的局部或經皮給藥，可以將試劑配制在適宜載體如水、乙醇、丙二醇(可以包括有助于透過皮膚或眼的載體)中制備溶液、洗劑或軟膏。例如局部制劑可包括高達約10％的式I的化合物。對其它身體組織而言，還可以考慮使用適宜的給藥形式。
在本發(fā)明方法是治療應用的情況下，以適宜的藥物形式，給待治療的動物施用一定量的一種或多種試劑。施用可通過已知技術如口服、局部和非腸道技術，如真皮內、皮下、靜脈內或腹膜內注射，以及其它常規(guī)方法來完成?？梢砸愿哌_30mg/kg的劑量水平，在較長的期間施用試劑。
如上文說明的，本發(fā)明還包括抑制和逆轉因口腔中的非酶促褐變而引起的牙齒色變，所述方法包括給治療對象按治療需要施用有效量含式I結構試劑的組合物以抑制并逆轉高級糖基化終產物的形成。
在口腔中發(fā)生的非酶促褐變反應導致牙齒色變。目前所用的抗-齒斑劑加速了這種非酶促褐變反應和牙齒色斑。最近，用有顯著抗齒斑特性的陽離子抗微生物劑配制了一種漱口水，用于日常使用殺滅口中的細菌。這些陽離子抗菌劑包括雙胍啶、鯨蠟基吡啶鎓氯化物、葡萄糖酸洗必泰、雙辛氫啶和潔爾滅。
因洗必泰和其它抗齒斑劑產生的牙齒色斑顯然起因于Maillard反應的增加。Nordbo(牙科研究雜志，581429(1979))報道了洗必泰和潔爾滅可催化體外褐變反應。將洗必泰加入含有糖衍生物和氨基源的混合物中可增加由Maillard反應引起的顏色形成。還已知使用洗必泰可導致牙表膜的增加。Nordbo認為洗必泰以兩種方式導致牙齒色斑第一種，增加含更多氨基的表膜形成，第二，催化導致有色產物的Maillard反應。
根據(jù)所述方法，將式I的化合物配制成適用于口腔的組合物。特別適宜的制劑是摻入了活性試劑的漱口水和牙膏。
在本發(fā)明的實踐中，使用了常規(guī)的配制技術以及無毒、可藥用的載體，所述載體一般以漱口水和牙膏的配制中公知的量和組合進行應用。
將式I的試劑以有效抑制并逆轉高級糖基化終產物形成的量配制在組合物中。當然，所述量可隨所用的特定試劑和特定劑量形式而變化，但通常為特定制劑重的0.01％-1.0％。
式I所包含的化合物可用本領域公知的化學合成法制備。式I所包含的某些化合物是公知化合物，可以從化學物質供應商處方便地購得和/或可以用為其具體公開的合成方法制得。例如，3，4-二甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓碘化物、3-乙基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物、3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物和3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物可以從Aldrich Chem.Co.購得。
式I中所包含的記載于化學和專利文獻中、或可以通過其中記載的方法直接制得化合物是，例如3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物和3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物[Potts等，有機化學雜志，41187-191(1976)]。
式(I)中的一些化合物是新化合物，是現(xiàn)有技術中未知的。這些化合物是由式Ia所表示的化合物
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；條件是Y和Z中至少有一個是氨基，并且另一個條件是當Y是氨基并且R2是Z均是氫時，則R1不是低級烷基；并且X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
其它的新化合物是如下的式I化合物，其中Y是炔甲基或下式的基團
其中R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基。
如下的式I化合物，其中Y是下式的基團
其中R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基；或下式的基團-CH2R’
其中R’是氫或低級烷基、低級炔基或芳基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子；可以根據(jù)Potts等，有機化學雜志，41187(1976)；和Potts等，有機化學雜志，421648(1977)中所記載的方法，或按照以下方案I所示進行制備。
方案I
其中的R1、R2、Z和R如上所定義，并且X是鹵原子。
在反應方案I中，將適當取代的式II噻唑化合物(其中的R1、R2和Z如上所定義)與適當式III的鹵代化合物(其中的R和X如上所定義)反應，生成所述的式I化合物，其中的R1、R2、Z、R和X如上所定義。
該反應一般在回流溫度下進行大約1-3小時。
進行該反應時一般使用極性溶劑例如乙醇。
其中Y是氨基的式I化合物可以根據(jù)Tamura等，合成，1(1977)中所記載的方法，或按照以下方案II所示進行制備。
方案II
其中的R1、R2和Z如上所定義。
方案II所示的反應一般在室溫下和無水極性溶劑中進行，一般的反應溫度范圍是從室溫至回流溫度，一般的時間從1小時至大約4小時。該反應可生成均三甲苯磺酸鹽，通過一般的交換反應可將其選擇性地轉變?yōu)槠渌泥邕蜴f鹽。
本發(fā)明還涉及新的夾心酶免疫檢測方法，該方法可通過檢測AGE-交聯(lián)蛋白上AGE(高級糖基化終產物)部分的裂解來確定試驗化合物“裂解”或逆轉已形成的高級糖基化終產物的能力。該方法包括a)將AGE-修飾的牛血清白蛋白(AGE-BSA)在微滴定板的膠原包被孔中于37℃下保溫2-6小時；b)用PBS-吐溫洗滌孔；c)向洗滌后的步驟b的孔中加入試驗化合物；d)在約37℃下將加到洗滌孔中的試驗化合物再保溫12-24小時；然后e)用抗AGE-核糖核酸酶抗體檢測AGE-裂解，或用抗BSA抗體檢測交聯(lián)物的裂解。
以下實施例是對本發(fā)明的說明。
實施例13-(2-甲氧基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物將噻唑(850mg，10mmol)、溴乙酸甲酯(1.52g，10mmlol)和無水乙醇(50ml)回流2小時。在冷卻過程中析出鹽，將其用無水乙醇重結晶得到標題化合物(1.59g)，m.p.189-190℃(分解)。
實施例23-氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽向冰冷的4，5-二甲基噻唑(2.26g，20mmol)的無水二氯甲烷(15ml)溶液中滴加O-均三甲苯磺?；u胺(4.3g，20mmol)的無水二氯甲烷(15ml)溶液。室溫下攪拌2小時后，加入無水乙醚(10ml)。在冷卻過程中析出無色針狀的標題化合物，3-氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽(3.48g)，m.p.165-168℃。
實施例3
使用以上實施例1和2中所述的方法，制得以下化合物。3-氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.102-104℃；2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.173-175℃；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.184-185℃(分解)；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.149-151℃(分解)；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.218-220℃(分解)；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.212-213℃(分解)；3-氨基-4甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.143-144℃；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.193-194℃(分解)；3-(2-苯基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.193-194℃；3-(2-[4’-溴苯基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.269-270℃(分解)；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.248-249℃(分解)；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.216-217℃；3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.223-224℃(分解)；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.137-138℃；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.180-181℃；3-(2-[4’-溴苯基]-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.251-252℃(分解)；3，4-二甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓碘化物，m.p.85-87℃；3-乙基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.84-85℃；3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物，m.p.144-146℃；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.144-145℃(分解)；3-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.240-241℃(分解)；3-(2-[4’-溴苯基]-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.261-262℃(分解)；3-(羧甲基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.250℃(分解)；2，3-二氨基-苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.212-214℃(分解)；3-(2-氨基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.205-206℃；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.220-222℃；3-(2-氨基-2-氧乙基)-5-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.179-180℃；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.147-148℃；3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.223-223℃；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.182-183℃；3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.94-95℃(分解)；3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物，m.p.178-179℃；3-氨基-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.118-120℃；3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.217-218℃；3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.217-218℃；3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-乙酰氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.233-234℃；2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.191-192℃；2-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.236-237℃；2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物，m.p.209-210℃；2-氨基-3-(2-氨基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.234-235℃；3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.248-249℃(分解)；3-[2-(2’，4’-二甲氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.214-216℃(分解)；3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.209-210℃(分解)；3-[2-(2’，4’-二氟苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.226-228℃(分解)；3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.233-235℃(分解)；3-炔丙基-噻唑鎓溴化物，m.p.64-66℃；3-炔丙基-4-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.213-215℃；3-炔丙基-5-甲基噻唑鎓溴化物，m.p.127-129℃；3-炔丙基-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物，m.p.198-200℃；3-炔丙基-4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.132-134℃；3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.224-225℃；3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.164-165℃；3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.215-217℃；2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.228-230℃；2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.204-205℃；3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.145-147℃；2，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.224-246℃；2，6-二氨基苯并噻唑鎓二鹽酸鹽，m.p.318-320℃(分解)；2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.243-245℃(分解)；2，6-二氨基-3-[2-(3’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.217-218℃(分解)；2，6-二氨基-3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.223-225℃(分解)；2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.258-259℃(分解)；2，6-二氨基-3-(2-(2-苯基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物，m.p.208-210℃(分解)；2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物，m.p.251-252℃(分解)；3-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑基-乙基乙酸酯均三甲苯磺酸鹽，m.p.糖漿狀物質；2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.149-152℃；3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.219-220℃；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.206-207℃；3-[2-(2’，6’-二氯苯乙氨基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.193-195℃；3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.78-80℃；3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.204-206℃；3-[2-(2’，6’-二異丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.166-168℃；3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯芐氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.164-166℃；3-[2-(4’-甲酯基-3’-羥基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.222-223℃；2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.166-168℃；2，3-二氨基-4-甲基-5-羥乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽，m.p.132-134℃；2，3-二氨基-5-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽， m.p.224-226℃；3-[2-(1’，4’-苯并二氧雜環(huán)己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.196-198℃；3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.164-166℃；3-(2-[1’，4’-苯并二氧雜環(huán)己烷-6-基]-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.238-239℃；3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.246-248℃；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.226-228℃(分解)；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.210-211℃；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物，m.p.243-244℃(分解)；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-苯并噻唑鎓溴化物，m.p.239-294℃(分解)；1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓溴化物，m.p.148-150℃；3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.218-220℃(分解)；3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.178-180℃(分解)；3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.184-186℃(分解)；3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物，m.p.176-177℃；3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物，m.p.208-209℃；3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.211-212℃；3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.186-187℃；3-(3’-甲氧芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓氯化物，m.p.135-136℃；3-(2’，6’-二氯芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓氯化物，m.p.192-194℃；3-(2’-硝基芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.215-216℃；3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物，m.p.239-241℃(分解)；3-[2-(4’-氯苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.240-251℃(分解)；和3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物，m.p.229-231℃(分解)。
實施例4mg/片式I化合物50淀粉 50甘露糖醇 75硬脂酸鎂 2硬脂酸 5將化合物、部分淀粉和乳糖合并并用淀粉糊濕法制粒。將濕的顆粒置于托盤上并在45℃下干燥過夜。將干燥的顆粒在造粒機中粉碎至顆粒大小為大約20目。加入硬脂酸鎂、硬脂酸以及余量淀粉并將整個混合物進行混合，然后用合適的壓片機壓片。用11/32″的沖以232mg的重量進行壓片，硬度為4kg。根據(jù)USP XVI中所述的方法，這些藥片在半小時內崩解。
實施例5洗劑 mg/g式I化合物 1.0乙醇 400.0聚乙二醇400 300.0羥丙基纖維素 5.0丙二醇加至1.0g實施例6漱口水式I化合物 1.4％葡萄糖酸洗必泰0.12％乙醇 11.6％糖精鈉0.15％FD&C Blue No.l0.001％薄荷油0.5％甘油 10.0％吐溫600.3％水至100％實施例7牙膏式I化合物 5.5％山梨糖醇，70％水溶液 25％糖精鈉0.15％十二烷基硫酸鈉1.75％聚羰乙烯934，6％分散液15％薄荷油1.0％氫氧化鈉，50％水溶液 0.76％二堿價磷酸鈣二水合物 45％水至100％實施例8交聯(lián)抑制試驗用下列方法評估本發(fā)明化合物抑制糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)與大鼠尾腱膠原包被的96孔平板交聯(lián)的能力。
通過在37℃將200mg/ml的BSA與200mM葡萄糖在0.4M pH7.4的磷酸鈉緩沖液保溫12星期來制備AGE-BSA。將糖基化BSA在磷酸緩沖溶液(PBS)徹底透析48小時，換5次緩沖液。首先用300ul的superbloc阻斷緩沖液(Pierce#37515X)將大鼠尾腱膠原包被的平板阻斷1小時。用NUNC-多探頭或DynatechELISA-平板洗滌器，通過用PBS-吐溫20(0.05％吐溫20)將平板洗滌兩次而從中除去阻斷溶液。37℃，通過加入各50ul PBS或試驗化合物溶液稀釋的AGE-BSA，用和不用以所需濃度溶解在pH7.4的PBS緩沖液中的試驗化合物，使AGE-BSA(根據(jù)AGE-BSA的批次，每孔1-10ug)與大鼠尾腱膠原包被平板交聯(lián)4小時。將含有或不含有試驗化合物的PBS緩沖液中的未褐變BSA加到不同孔中作為空白。然后通過用PBS-吐溫緩沖液將孔洗滌三次而除去未交聯(lián)的AGE-BSA。接著用抗AGE-RNase的多克隆抗體定量分析與尾腱膠原包被平板交聯(lián)的AGE-BSA的量。在保溫1小時后，通過用PBS-吐溫洗滌4次除去AGE抗體。
然后通過加入辣根過氧化物酶-結合的二級抗體-山羊抗-兔免疫球蛋白，并保溫30分鐘來檢測結合的AGE抗體。加入底物2，2-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑鎓啉磺酸)(ABTS-色原)。使反應再進行15分鐘，用Dynatech平板閱讀器讀出410nm的吸收值。
如下計算各試驗化合物的％抑制。％抑制＝｛[光密度(沒有化合物)-光密度(有化合物)]/光密度(沒有化合物的)｝×100％試驗化合物的IC50值或在各濃度的抑制作用如下試驗化合物 IC50交聯(lián)抑制的(mM) 相對值(10mM)抑制數(shù)據(jù)3-氨基-4，5-二甲氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 2.82，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 ＞0.1027％3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物 0.253-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物 0.483-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物 58％3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物 5.63-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物 37％3-氨基-4甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽46％3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物 3.23-(2-苯基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物 12.63-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化物 37％3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物2.923-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓溴化物 38％3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓溴化物 ＞10 36％3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物2.953-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物 ＞10 35％3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物 16％2，3-二氨基-苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 0.07493-(2-氨基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物 0.533-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-噻唑鎓溴化物0.73-(2-氨基-2-氧乙基)-5-甲基-噻唑鎓溴化物0.02893-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物 9.93-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物 0.023-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物1.423-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽3.6×10-53-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物11.1 34％3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物29％2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 33％2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽40％3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽11.32，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 23.2％(2mm)2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物 61％3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物 0.8％(10mm)3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴 8.8％(1mm)化物3-[2-(2’，6’-二異丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑 19％鎓溴化物3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯芐氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲苯磺酸 26.5％(3mm)鹽3-[2-(4’-甲酯基-3’-羥基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-17.6噻唑鎓溴化物2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 39％2，3-二氨基-4-甲基-5-羥乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 18％2，3-二氨基-5-(3’，4’三亞甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽40％@3mM3-[2-(1’，4’-苯并二氧雜環(huán)己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙 13％基)-噻唑鎓溴化物3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻 4.4％唑鎓溴化物3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物 45％3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓溴化24％@0.3mM物3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓溴化 0.78 69％@1mM物3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻唑鎓 0.16溴化物1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓溴化 4.5物3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物 ND3-[2-(4’-正戊基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化 1.53 52％@3mM物3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴 2.8化物3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物 ND3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻 ND唑鎓溴化物上述試驗表明這種類型的藥物治療有益于降低與蛋白質的高級糖基化和蛋白質與其它大分子形成交聯(lián)物有關的病理學?？捎盟幬镏委燁A防在糖尿病和導致后發(fā)癥如視網膜損傷及血管外的腱，韌帶和其它關節(jié)損傷的衰老中發(fā)生的蛋白質捕獲增加和交聯(lián)增加。這種治療可以延緩隨糖尿病和衰老發(fā)生的動脈粥樣硬化和結締組織改變?？煽紤]經局部、口服和非腸道途徑給藥以提供局部和系統(tǒng)治療。
實施例9交聯(lián)物裂解試驗為了確定本發(fā)明化合物“裂解”或逆轉已形成的高級糖基化終產物的能力，開發(fā)了一種新的可以檢測從AGE-交聯(lián)蛋白上裂解AGE(高級糖基化終產物)部分的夾心酶免疫檢測法。該檢測利用市售的膠原包被的96孔微滴定平板。在膠原包被的孔中，將按照例如實施例8所述制備的AGE-修飾蛋白(AGE-BSA)保溫4小時，用PBS-吐溫洗滌所述孔，然后加入試驗化合物溶液。在保溫16小時(37℃)后，用抗AGE-核糖核酸酶抗體或用抗BSA抗體檢測交聯(lián)物裂解情況。在該檢測中的陽性結果表明化合物通過裂解交聯(lián)物并釋放在隨后的洗滌步驟中被洗去的物質，能夠減少已與膠原交聯(lián)的AGE-BSA量。該檢測的詳細內容如下材料免疫化學物質和化學物質牛血清白蛋白(V型)，(BSA)Calbiochem右旋糖Superbloc，Pierce，Inc.兔抗-牛血清白蛋白辣根過氧化物酶(HRP)-山羊-抗兔，ZymedHRP底物緩沖液，ZymedABTS色原，Zymed磷酸緩沖鹽吐溫20，Sigma儀器ELISA平板洗滌器，DynatechELISA平板閱讀器，Dynatech精確水浴Corning數(shù)字pH測量儀玻璃儀器和塑料儀器Finneppette Multichannel Pipettor，BaxterEppendorf移液管，BaxterEppendorf轉換移液管，Baxter用于Finneppetter的移液管沖頭，Baxter用于Eppendorf的移液管沖頭，Baxter玻璃試驗試管，13×100mm，Baxter用于96孔平板的Mylar密封帶，ComingBiocoat Cellware大鼠尾膠原1型包被的96孔平板，Collaborative BiomedicalProducts方法制備溶液和緩沖液1.按如下制備AGE-BSA原種溶液。通過將一堿價6克磷酸鈉溶解在100ml蒸餾水中，將7克二堿價磷酸鈉(0.4M)溶解在100ml蒸餾水中，然后用一價酸鹽溶液將二價酸鹽溶液的pH調到7.4，來制備磷酸鈉緩沖液(0.4M)。每100ml體積加入0.02g疊氮化鈉以抑制細菌生長。按如下制備BSA將400mgV型BSA(牛血清白蛋白)加到每ml磷酸鈉緩沖液(上述)中。通過將7.2g右旋糖溶解在100ml磷酸鈉緩沖液(上述)中來制備400mM葡萄糖溶液。將BSA和葡萄糖溶液以1∶1混合，然后在37℃保溫12個星期。每星期監(jiān)測所述保溫化合物的pH，如果需要，將pH調到7.4。12個星期后，將AGE-BSA溶液對PBS透析48小時，換4次緩沖液，每次溶液與透析緩沖液的比例為1∶500。用大Lowry法確定蛋白質濃度。將AGE-BSA原種溶液分成小份，于-20℃貯存。于-20℃貯存時，AGE-BSA的稀釋溶液不穩(wěn)定。
2.按如下制備用于交聯(lián)和裂解研究的研究溶液。將試驗化合物溶解在PBS中，如果需要，將pH調到7.4。為了測量最大交聯(lián)，將AGE-BSA原種溶液用PBS和用于檢測化合物抑制活性的抑制劑溶液稀釋。通過初始滴定各組AGE-BSA來確定達到最佳敏感性所需的AGE-BSA濃度。
3.按如下制備洗滌緩沖液(“PBS-吐溫”)。通過將下列鹽溶解在1升蒸餾水中來制備PBSNaCl，8g；KCl，0.2g，KH2PO4，1.15g；NaN3，0.2g。加入吐溫20達到0.05％(v/v)的終濃度。
4.通過用蒸餾水以1∶10稀釋HRP底物緩沖液，然后在使用前以1∶50與ABTS色原混合來制備用于檢測二級抗體結合的底物。檢測過程1.用300ul“Superbloc’阻斷Biocoat平板。在室溫將平板阻斷1小時，然后在加入試驗試劑之前，用Dynatech平板洗滌器，經PBS-BSA洗滌三次。
2.用下列方法完成各試驗。用Biocoat平板的前三個孔作為試劑空白對照。將50ulGAE-BSA溶液一式三份加到試驗孔中，在空白孔中只加PBS。將所述平板在37℃保溫4小時，然后用PBS-吐溫洗滌三次。將50ulPBS加到對照孔中，同時將50ul的試驗“AGE交聯(lián)裂解劑”化合物加到試驗孔和空白孔中。將平板與“試驗AGE交聯(lián)裂解劑”化合物保溫過夜(約16小時)，在加入一級抗體前用PBS洗滌(下文)。
3.在該檢測中，通過制備系列稀釋物(1∶500-1∶2000)，然后將50ul的各稀釋物鋪在Biocoat平板中來檢測各組一級抗體、抗BSA或抗-RNase的最佳結合能力。從飽和動力學確定最佳一級抗體。加入通過初始滴定確定的適當稀釋度的50ul一級抗體，在室溫保溫1小時。然后用PBS-吐溫洗滌平板。
4.將平板與用PBS以1∶4000稀釋的并作為最終二級抗體的二級抗體HRP-(山羊-抗-兔)保溫。在室溫保溫30分鐘。
5.按如下檢測最佳交聯(lián)和AGE交聯(lián)的裂解。將HRP底物(100ul)加到平板的各孔中，然后在37℃保溫15分鐘。用Dynatech ELISA-平板閱讀器讀數(shù)。將樣品濾紙定為“1”，將參考濾紙定為“5”。標準操作過程預備步驟1.按表4所述滴定各新組的AGE-BSA制品，并從飽和動力學確定ELISA試驗的最佳AGE-BSA濃度。
2.在那天開始時，用熱水沖洗平板洗滌器的頭，用蒸餾水和50％乙醇漂洗。用PBS-吐溫(0.05％)添滿平板洗滌器的容器，在使用前將該系統(tǒng)清洗三次。
3.按下文“試驗方案”第2中所述制備用于啟始試驗的檢測模板。試驗方案1.將Superbloc試劑加熱到37℃。將300ul Superbloc加到Biocoat平板的各孔中，然后在37℃放置60分鐘。用PBS-吐溫(0.05％)將孔洗滌三次。將平板轉翻180度，然后重復該洗滌循環(huán)。
2.用PBS稀釋AGE-BSA以便使50μl稀釋樣品含有最小交聯(lián)和用pimagedine(氨基胍)最低抑制所需量的AGE-BSA，該量是用上述的初始滴定確定的。通過將非褐變BSA以與GAE-BSA相同的濃度溶解在PBS中來制備陰性對照。將50ul AGE-BSA或BSA加到相當于模板上“AGE-BSA”和“BSA”標記的各孔中。
3.以30mM的濃度將試驗化合物溶解在PBS中以進行初級評估。必須檢測pH并將其調至7.4(如需要的話)。用AGE-BSA預處理膠原包被的平板以獲得最大交聯(lián)。通過以與用于AGE-BSA相同的蛋白質濃度，將BSA溶解在抑制溶液中來制備用于抑制試驗的陰性對照。將50ul AGE-BSA或BSA的抑制劑溶液加到模板上分別相當于“ALT#+AGE-BSA”和“ALT#空白”的孔中。將平板在37℃保溫4小時。AGE-BSA與平板共價結合后，在準備檢測反應(見下)時用PBS-吐溫洗滌平板。
4.按如下完成一級抗體與Biocoat平板的結合。在保溫4小時結束時，用PBS-吐溫洗滌孔。用PBS制備適當稀釋度(如由初始滴定確定)的兔-抗-AGE-RNase或兔-抗-BSA抗體，向各孔中加入50ul，將所述平板在室溫下放置60分鐘。
5.用PBS-吐溫洗滌二級抗體結合孔，將50ul用PBS稀釋到1-4000的HRP(辣根過氧化物酶)(山羊抗-兔血清)加到各孔中。將所述平板在室溫放置30分鐘。
6.按如下完成顯色。按上述步驟4洗滌平板。用水稀釋HRP-底物緩沖液。加入200ul的ABTS溶液，攪拌，將100ul的該試劑加到各孔中。在37℃保溫15分鐘。在Dynatech ELISA平板閱讀器上，用定到“1”和樣品濾紙和定到“5”的參考濾紙讀出410nm的光密度。按上述計算所述化合物的抑制百分比。就其逆轉并降低了高級糖基化終產物的水平而言，認為減少了免疫活潑量的化合物是有治療用途的。試驗化合物 IC50(mM) 裂解抗AGE/抗BSA 抗AGE/抗BSA(mM)3-氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 0.005/3.0 71％/67％(30)3-氨基-4，5-二甲氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 63％/44％(10)2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 0.28/0.18 79％/90％(10)3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物 38％/41％(30)3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物 63％/47％(30)3-(2-甲氧基-2-氧乙基)4-甲基噻唑鎓溴化物54％/51％(30)3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物 0.23/0.30 68％/66％(30)3-(2-苯基-2-氧乙基)-4，5-二甲基噻唑鎓溴化物56％/ND(30)3-氨基-4甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 55％/ND(30)3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-5-甲基噻唑鎓溴化物 72％/27％(30)3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]噻唑鎓溴化物76％/25％(30)3-(2-甲氧基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物 14.3/112.0 67％/13％(30)3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基-噻唑鎓氯化物0.42/0.55 65％/61％(30)3-(2-甲氧基-2-氧乙基)苯并噻唑鎓溴化物 1.20/25.9 66％/37％(30)3-(羧甲基)苯并噻唑鎓溴化物 63.7％/17.9％(30)2，3-二氨基-苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 87％/54％(30)3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-噻唑鎓溴化物4.70/38.6 89％/44％(30)3-(2-氨基-2-氧乙基)-4，5-二甲基-噻唑鎓溴化物 61％/16％(30)3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物 0.4/0.5277％/65％3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物0.012/0.120 65％/57％3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽0.18/0.50 76％/48％3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物0.83/0.75 56％/93％3-(2-苯基-氧乙基)噻唑鎓溴化物 0.020/0.014 73％/98％3-(2-[3’-甲氧苯基]-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物 22％/44％(10)2，3-二氨基-4-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 21％/26％(10)2，3-二氨基-4-甲基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽25％/30％(10)3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽ND/2.0 51％/74％(10)2，3-二氨基-6-氯苯并噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 25％/51％(10)2，6-二氨基-3-[2-(4’-甲氧苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物 29％/35％(10)2，6-二氨基-3-[2-(4’-溴苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物27％/44％(10)2，6-二氨基-3-[2-(4’-氟苯基)-2-氧乙基]苯并噻唑鎓溴化物24％/40％(10)2，3-二氨基-5-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 14％/17％(10)3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物 52％/61％(10)3-(2-二丁氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化 25％/38％(1 0)物3-[2-(4’-乙酯基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻 48％/57％(10)唑鎓溴化物3-[2-(2’，6’-二異丙基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙31％/48％(10)基)-噻唑鎓溴化物3-氨基-4-甲基-5-[2-(2’，6’-二氯芐氧基)乙基]-噻唑鎓均三甲 31％/54％(10)苯磺酸鹽3-[2-(4’-甲酯基-3’-羥基苯胺基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙 24％/18％(10)基)-噻唑鎓溴化物2，3-二氨基-4，5-二甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽24％/23％(10)2，3-二氨基-4-甲基-5-羥乙基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽 20％/18％(10)2，3-二氨基-5-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-噻唑鎓均三甲苯磺 13％/42％(1)酸鹽3-[2-(1’，4’-苯并二氧雜環(huán)己烷-6-基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’- 11％/21％(3)羥乙基)-噻唑鎓溴化物3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-(2’-羥乙 34％/0％(10)基)-噻唑鎓溴化物3-[2-(3’，4’-三亞甲基二氧苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物17％/18％(10)3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-噻唑鎓 14％/2％(0.3)溴化物3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基-噻唑鎓 3/0.74 65％/69％(1)溴化物3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4，5-二甲基-噻 48％/49％(10)唑鎓溴化物1-甲基-3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-咪唑鎓 56％/38％(10)溴化物3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物 ND/0.1 62％/82％(1)3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯 ND/0/60％ 32％/50％(0.3)基-噻唑鎓溴化物3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-噻唑鎓溴化物 28％/37％(10)3-(2-叔丁基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物 4％/19％(10)3-(3’-甲氧芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓氯化物14％/25％(10)3-(2’，6’-二氯芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓氯化物 6％/27％(10)3-(2’-硝基芐基)-4-甲基-5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物11％/13％(10)
實施例10為了確定在鏈尿菌素誘導的糖尿病大鼠中，本發(fā)明化合物降低與循環(huán)紅細胞交聯(lián)的IgG量的能力，用下列試驗測量。將試驗化合物口服或腹膜內給予試驗動物，在給藥后的不同時間如4，7或19天收集試驗的血樣以評估效力。RBC-IgG試驗方法A.制備紅細胞將大鼠的血液收集在肝素化試管中，然后以2000xg離心10分鐘，仔細取出血漿。然后，每ml血液加入約5mlPBS，緩慢混合，再離心。吸出上清液。將所述洗滌過程重復兩次以上。然后，用移液管從試管底部取出0.2-0.3ml的RBC，加到PBS中以得到1∶10的稀釋液。再用PBS將所述稀釋物以1∶25和1∶50稀釋。B試驗方案1.將Superbloc溫熱到37℃。
2.取一Multiscreen-HA，0.45u平板，纖維素酯膜-密封的96孔平板(MilloporeMAHAS 45)。
3.用100ul PBS將孔潤濕。
4.將300ul Superbloc加到各孔中，然后在37℃保溫1小時5.將平板放在Millititer Vacuum支持器上，轉到真空，將平板向下緊壓一次。抽吸掉孔中的液體。用300ul PBS-吐溫0.05％洗滌孔。
6.關掉真空，將100ul PBS加到各孔中。
7.緩慢旋轉RBC樣品，吸50ul放到孔中，作出記錄表，用前三個孔作為試劑空白。剩另三個孔作為抗體空白。
8.按上述抽吸掉液體，然后用PBS將RBC洗滌兩次。
9.用PBS以1∶25000稀釋AP(Rb-抗-大鼠)(Sigma A-6066)。
10.向孔中加50ul，然后在室溫放置2小時。
11.按上述抽吸掉液體，然后用PBS將RBC洗滌兩次。
12.加入pNPP底物(1mg/ml DEA緩沖液中)，每孔100ul。
13. 37℃顯色2小時。
14.將96孔coming微滴定板放在真空室中。
15.將樣品平板放在真空支管上。確保平板底部完全干燥。
16.施加真空約5分鐘。將100ul PBS加到所有孔中，再施加5分鐘真空。輕拿起平板，確保在平板底部未掛上液體珠。如果需要的話，再施加幾分鐘真空。在Dynatech平板閱讀器上讀出收集在Coming平板中的溶液的OD，樣品濾紙定為1，參考濾紙定為4。
17.計算裂解百分比100*(OD410對照-OD410處理的)/OD410對照。以10mg/kg體重的口服劑量，在動物中的抑制百分比如下3-氨基-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓均11±1@19天三甲苯磺酸鹽3-[2-(2’-萘基)-2-氧乙基]-4-甲基- 40±24@19天5-(2’-羥乙基)-噻唑鎓溴化物3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基-苯65±15@19天基)-2-氧乙基-5-甲基-噻唑鎓溴化物3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙58±21@19天烯基-噻唑鎓溴化物申請人從這些研究中所觀察到的逆轉交聯(lián)的廣泛程度強調了兩個重要結論。首先，體內形成的較大百分比的交聯(lián)物對本發(fā)明二親核的噻唑鎓化合物的攻擊和裂解均很敏感，因此得出結論，這些交聯(lián)物含有與方案A和B中所示模型一致的α-二酮片段。第二，本發(fā)明的交聯(lián)裂解劑是以催化形式起作用的，從這個意義上說，本發(fā)明的一個二親核的噻唑鎓分子可以攻擊并裂解不止一個糖基化交聯(lián)物。
實施例11本實施例描述了來自正常和用式I化合物，即3-(2-苯基-2氧代乙基)噻唑鎓溴化物(ALT766)治療后的糖尿病動物的大鼠尾腱膠原的CNBr肽圖譜。將來自鏈尿菌素糖尿病大鼠和年齡匹配的對照動物的膠原纖維(5mg)用landPBS在60℃水合1小時，除去可溶性膠原，沉淀用PBS洗滌數(shù)次，然后用濃度為30 mM的3-(2-苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴化物處理16小時。保溫后，將沉淀離心，洗滌，用CNBr(在甲酸中，40mg/ml)于30℃處理48小時。重復凍干CNBr消化物以除去CNBr和酸，然后在減壓條件下除去SDS-PAGE(20％丙烯酰胺)(道1、2和9，MWS；道3、4和5，3和5是用3-(2-苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴化物處理的非糖尿病動物的尾腱膠原，4是用PBS處理的；道6、7和8，6和8是用3-(2-苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴化物處理的糖尿病動物的尾腱膠原，7是用PBS處理的)。所得的凝膠示于圖1中。
實施例12制備AGE-BSA和交聯(lián)的AGE-BSA制備下列溶液1.緩沖液0.4M磷酸鈉，pH7.4。
NaH2PO46g/100mlNa2HPO47g/100ml用二堿價鹽將一堿價磷酸鈉的pH調到7.4，每100ml緩沖液加入0.02g疊氮化鈉。
2.BSA溶液BSACalbiochemV型；在緩沖液1中為400mg/ml。共制備50g/125ml。通過0.45u濾紙過濾到滅菌的1升Coming燒瓶中。
3.葡萄糖溶液，400uM葡萄糖400mM，9g/125ml的緩沖液。通過0.45u濾紙過濾到滅菌的1升Coming燒瓶中。反應方案在1升Coming滅菌燒瓶中，將BSA和葡萄糖溶液(各100ml)混合，蓋緊蓋子，然后56℃保溫，不振蕩。將該瓶每星期打開一次，以取出等分試樣用于試驗。反應持續(xù)9個星期，直到觀察到形成了AGE-BSA聚合物。裂解聚合物用PBS洗滌AGE-BSA凝膠片，直到在上清液中不再有蛋白濾出，用紙巾印干。將約50mg洗滌的凝膠與PBS或10mM 3-(2-苯基-2氧乙基)噻唑鎓溴化物(ALT766)于37℃保溫過夜。用SDS-PAGE分析上清液，用考馬斯藍染色。圖2顯示了所得凝膠。
實施例13為了進一步研究本發(fā)明的AGE交聯(lián)抑制和逆轉劑防止表面，如在牙齒表面發(fā)生的蛋白質變色，將進行下列表面褐變試驗。作為表膜覆蓋的牙齒表面的替代物，使用為曝光和顯色的照片紙以便在紙背面提供固定蛋白質(明膠，即膠原)的表面。沖壓出5mm的環(huán)，然后在50℃，含3mM疊氮化鈉的100mM葡萄糖-6-磷酸鹽的0.5M磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)中浸一星期。葡萄糖-6-磷酸鹽是一種能夠以比葡萄糖更快的速率參與非酶促褐變的糖。除葡萄糖-6-磷酸鹽外，還包含了洗必泰和/或式I的化合物。保溫后，用水漂洗明膠/紙盤，觀察褐色并照相。
僅在葡萄糖-6-磷酸鹽中保溫與僅浸在緩沖液中保溫的盤相比顯出淡褐色。包含了洗必泰(洗必泰終濃度為0.04％的Peridex形式)有明顯的褐色。將式I化合物加到洗必泰中完全抑制了明膠的褐變，與沒有洗必泰而包含式I化合物時的一樣。葡萄糖-6-磷酸鹽單獨作用于明膠表面而形成的淡褐色和其受到式I化合物的抑制表明，本發(fā)明實用性在于抑制牙齒表明的非酶促褐變。存在洗必泰褐變程度增加和其受到式I化合物的抑制表明，本發(fā)明可用于抑制因洗必泰而發(fā)生的抗齒斑劑增強的非酶促褐變。
實施例14為了證明本發(fā)明化合物在醫(yī)學相關生物分子中裂解有害交聯(lián)物的通用性，申請人用老年性癡呆癥的類淀粉肽進行了下列試驗。所述的14kDa肽主要成分是在老年性癡呆癥患者的腦實質中形成的大斑樣聚集物。認為所述類淀粉物斑的逐漸積累和其它不正常特征如血管周的類淀粉物和神經纖維纏結是這種癡呆的特定神經毒和其它致病過程的原因，而這些總是致命的而且目前是無法治愈的。已知老年性癡呆癥的類淀粉肽在體內積累AGE修飾物，而且在體內暴露于生理學相關濃度的葡萄糖后，糖基化增強了不溶性肽聚集物的形成，使人想起老年性癡呆癥的類淀粉斑。
基本上按用于制備AGE-BSA的制備方法，除用β-肽代替BSA作為糖基化底物外，通過將一份可溶性β-類淀粉肽(合成制備的并相當于老年性癡呆癥典型斑中所發(fā)現(xiàn)的β-類淀粉肽)在中性緩沖葡萄糖溶液中保溫3個月制備AGE-β-肽。在體內延長暴露于葡萄糖后，將糖基化和和交聯(lián)的AGE-β-肽通過大小排阻色譜(例如過PFD-10柱)與低分子量反應物分開，然后通過標準方法碘化以得到125I-AGE-β-肽，將其作為所需的放射性標記的試劑用于按照下列方法試驗或篩選有分子AGE-裂解活性的化合物。將等分125I-AGE-β-肽與或不與所加的預定濃度(如10mM化合物766)的本發(fā)明試驗化合物保溫預定的時間(如過夜)，此后，制備保溫混合物樣品用于變性凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后進行分析以便按照公知的方法確定表觀分子量。將在所得電泳凝膠上暴露的放射自顯影掃描成數(shù)字射線照相成像，用分析系統(tǒng)記錄放射性，作為表觀分子量的函數(shù)(在含SDS緩沖液中的電泳遷移率)。研究該試驗的結果表明如果不將125I-AGE-β-肽暴露于本發(fā)明的“AGE-裂解劑”化合物，則會洗脫一高分子量(＞40kDa)的帶，這說明其糖基化伴有穩(wěn)定共價交聯(lián)物的聚集和形成。但如果首先在本發(fā)明的AGE交聯(lián)-攜帶劑溶液中保溫125I-AGE-β-肽，則在終射線照片上呈現(xiàn)的低分子量(＞18kDa)碘化物質表明125I-AGE-β-肽不顯著聚集。該試驗表明不僅可以用本發(fā)明的二親核噻唑鎓類試劑水解蛋白質鏈之間的共價AGE-介導的交聯(lián)物，而且AGE的所述抑制和逆轉可以逆轉與人類疾病有關的蛋白上AGE積累的有害分子后果。
實施例15還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的交聯(lián)結構和相關化合物可用作抗原或半抗原以引發(fā)針對其的特異性抗體。而且本發(fā)明的所述抗體可用于鑒定本發(fā)明的AAA結構。通過建立使用本發(fā)明抗-交聯(lián)結構抗體的免疫檢測方法，例如可以測量所述交聯(lián)物修飾蛋白質的程度。如上所討論的，根據(jù)所修飾之蛋白質的半衰期，蛋白質樣品，如血紅蛋白上交聯(lián)表位的免疫化學測量可以作為最新AGE形成的指標。同樣，也可以通過循環(huán)和/或組織蛋白質上交聯(lián)表位的免疫化學檢測來監(jiān)測用本發(fā)明藥物的治療進程，其中所述試劑直接抑制高級糖基化并使其裂解。
用許多公知的二價偶聯(lián)劑，如象EDC的碳化二亞胺，通過將交聯(lián)結構與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)可以制備用作免疫原的交聯(lián)修飾的BSA。通過從保溫混合物中分離或直接合成的方法，可以很方便地制備各種其它半抗原、抗原和相應于本發(fā)明交聯(lián)結構(包括但不限于本文具體描述的那些)的結合免疫原。然后可以用所述交聯(lián)結構作為免疫原得到識別特異性表位或其分子特征的各種抗體。
在優(yōu)選的實施方案中，可以認為交聯(lián)結構本身就是半抗原，按照本領域廣泛使用的方法，可將其相應地與任何數(shù)種優(yōu)選載體蛋白偶聯(lián)，載體蛋白包括例如匙孔嘁血藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白和最優(yōu)選的牛血清白蛋白(BSA)。
由于用于交聯(lián)結構的分子特征之抗體特異性，可以在任何熟知的免疫方法中使用交聯(lián)結構(無論單獨或與載體蛋白結合)以產生具有許多應用的抗體和相關免疫試劑。
根據(jù)優(yōu)選的方法，可以免疫任何數(shù)種動物以產生直接抗交聯(lián)結構蛋白結合物的多克隆抗血清，所述動物包括例如小鼠，大鼠，倉鼠，山羊，兔和雞。上述的前三種動物特別適用于生產分泌半抗原特異性單克隆抗體的雜交瘤。用本領域常用的方法通過與適宜的細胞系，如骨髓瘤細胞系融合，可以很方便地產生來自免疫動物脾細胞的所述雜交瘤，所述方法描述了適用于使免疫脾細胞不死的條件。生產雜交瘤的所述方法還提供了篩選并克隆免疫脾細胞/骨髓瘤細胞雜交瘤和鑒定雜交瘤克隆的方法，所述雜交瘤克隆穩(wěn)定地分泌抗所需表位的抗體。象兔和山羊這樣的動物種更常用于生產多克隆抗血清，但無論最終需要的是多克隆抗血清還是單克隆抗體，開始將半抗原修飾的載體蛋白質與佐劑如完全弗氏佐劑一起施用。通過幾種途徑，通常以腹膜內，肌肉內或皮內進行免疫接種；在本領域中根據(jù)待接種的種和最終待產生的抗體類型來確定途徑是優(yōu)選的。隨后，通常與佐劑如明礬或不完全弗氏佐劑一起進行加強免疫。在開始接種后隔一段時間進行加強免疫；通常一個月是適宜的間隔，在每次加強接種后1到2星期之間取血樣。另外，有時用各種所謂超免疫方法以試圖優(yōu)先于抗-載體蛋白質抗體產生抗-半抗原抗體，超免疫通常及時使加強免疫在空間上更接近。
可以用數(shù)種方便的方式，包括例如Ouchterlony擴散凝膠和直接ELISA法可以將加強后血樣的抗體滴定度與半特異性免疫滴定度進行比較。在典型的直接ELISA中，將確定的抗原固定在檢測孔表面，通常用96孔或微滴定平板，然后進行一系列的保溫，并分別以漂洗檢測孔表面以除去未結合的配對物。作為非限制性實施例，將接受稀釋的、緩沖的半抗原/載體結合物的水溶液加到檢測平板孔中，優(yōu)選其中載體蛋白不同于用于免疫產生抗體的待試驗動物蛋白；例如可以檢測來自AAA/KLH結合物免疫之動物的血清抗裝有固定AAA/BSA結合物檢測孔的情況。另外，可以通過單獨與半抗原保溫來裝飾檢測表面。通常，然后將檢測孔的表面暴露于非相關蛋白溶液，如酪蛋白以阻斷塑料表面上的未占據(jù)的位點。用通常含鹽和洗滌劑以使非特異性作用最小的中性緩沖溶液漂洗后，將孔與一種系列稀釋的從所需血樣制備的血清(一級抗血清)接觸。再次漂洗后，經與所需半抗原或半抗原/載體結合物的相互作用，固定在檢測孔上的試驗抗體的程度可以通過與市售酶-抗體結合物一起保溫來評估，其中該二級結合物的抗體部分抗用于產生一級抗血清的種，例如，如果一級抗血清是在兔中產生的，就可以用在山羊中產生的并與數(shù)種酶中的一種，如辣根過氧化物酶結合的抗兔抗體的市售制劑作為二級抗體。按照制造商說明的方法，通過在比色試驗中相關結合物酶的活性就可以定量分析所述二級抗體的量。還可以使用許多相關ELISA或放射性免疫測量方法，如競爭性ELISA或夾心ELISA(所有這些均是本領域公知的)以鑒定該滴定度的所需抗血清；即在高稀釋度(大于1/1000，而且優(yōu)選大于1/10000)得出陽性結果的特定抗血清。
可以用相似的免疫測量方法評估雜交瘤培養(yǎng)上清液中抗體的滴定度，所述雜交瘤是從免疫動物的脾細胞制備的。這時表征抗血清或雜交瘤上清液，就要用各種對照保溫，例如與不同的載體蛋白、相關但結構不同的半抗原或抗原和在免疫測量方法中刪去各種試劑以使檢測中的非特異性信號最小并鑒定抗體特異性的確定決定基和來自假陽性和假陰性結果的滴定度。就該方面所用的對照保溫的類型也是公知的。還可以用經上述方法鑒定的的抗血清，使用相同的免疫測量方法，所述抗血清是高滴定度的而且抗交聯(lián)結構中的特異性結構決定基，所述交聯(lián)結構在生物樣品、食品或其它可食物，或其它攜帶胺的物質和所研究的生物分子上。為了方便操縱者，可以以試劑盒形式提供所需抗-醛-修飾Amadori產物抗體(多克隆或單克隆)與說明書以及可選的其它有用的試劑和稀釋劑，包括但不限于一組交聯(lián)結構的分子標準物一起的所述后種應用。
可以用其它形成概括或用其它方式完成本發(fā)明而不偏離本發(fā)明的精神或基本特征。因此，本發(fā)明公開在所有意義上講是說明性的，而不是限制性的，權利要求所表明的本發(fā)明范圍和等同意義和范圍內的所有改變均包括在本發(fā)明公開中。
權利要求
1.用于抑制靶蛋白高級糖基化并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的組合物，所述組合物含有有效量的選自一組由以下結構式的化合物組成的化合物及其混合物，以及可用的載體
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基、或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述化合物結構式中的Y是2-(取代或未取代的)苯基-2-氧乙基基團。
3.根據(jù)權利要求2的組合物，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
4.根據(jù)權利要求2的組合物，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
5.根據(jù)權利要求2的組合物，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
6.根據(jù)權利要求2的組合物，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
7.根據(jù)權利要求2的組合物，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
8.根據(jù)權利要求2的組合物，其中所述化合物為3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
9.根據(jù)權利要求1的組合物，其中Y是2-氨基-2-氧乙基基團。
10.根據(jù)權利要求8的組合物，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
11.根據(jù)權利要求8的組合物，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
12.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述化合物為2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
13.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述化合物為3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
14.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述化合物為3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
15.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述化合物為3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
16.用于對動物給藥從而在所述動物體內抑制靶蛋白高級糖基化并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的藥物組合物，所述組合物含有藥物有效量的選自一組由以下結構式的化合物組成的化合物及其混合物，以及可藥用的載體
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基、或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
17.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述化合物結構式中的Y是2-苯基-2-氧乙基基團。
18.根據(jù)權利要求17的組合物，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
19.根據(jù)權利要求17的組合物，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
20.根據(jù)權利要求17的組合物，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
21.根據(jù)權利要求17的組合物，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
22.根據(jù)權利要求17的組合物，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
23.根據(jù)權利要求17的組合物，其中所述化合物為3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
24.根據(jù)權利要求16的組合物，其中Y是2-氨基-2-氧乙基基團。
25.根據(jù)權利要求24的組合物，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
26.根據(jù)權利要求24的組合物，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
27.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述化合物為2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
28.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述化合物為3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
29.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述化合物為3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
30.根據(jù)權利要求16的組合物，其中所述化合物為3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
31.抑制靶蛋白高級糖基化并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的方法，包括將靶蛋白和有效量的含有選自下式化合物及其混合物，以及可用載體的組合物接觸
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y.是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基、或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
32.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述化合物結構式中的Y是2-苯基-2-氧乙基基團。
33.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
34.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
35.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
36.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
37.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
38.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述化合物為3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
39.根據(jù)權利要求31的方法，其中Y是2-氨基-2-氧乙基基團。
40.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
41.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
42.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述化合物為2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
43.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述化合物為3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
44.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述化合物為3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
45.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述化合物為3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
46.用于治療動物從而在所述動物體內抑制靶蛋白高級糖基化終產物的形成并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的方法，所述方法包括給予有效量的藥物組合物，所述藥物組合物含有選自一組由下式化合物組成的化合物及其混合物，以及可藥用的載體
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基、或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
47.根據(jù)權利要求46的方法，其中所述化合物結構式中的Y是2-苯基-2-氧乙基基團。
48.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
49.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
50.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
51.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
52.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
53.根據(jù)權利要求47的方法，其中所述化合物為3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
54.根據(jù)權利要求46的方法，其中Y是2-氨基-2-氧乙基基團。
55.根據(jù)權利要求54的方法，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
56.根據(jù)權利要求54的方法，其中所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
57.根據(jù)權利要求46的方法，其中所述化合物為2，3-二氨基-噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
58.根據(jù)權利要求46的方法，其中所述化合物為3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
59.根據(jù)權利要求46的方法，其中所述化合物為3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
60.根據(jù)權利要求46的方法，其中所述化合物為3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
61.抑制并逆轉因口腔中的非酶促褐變所引起的牙齒變色的方法，包括給予有效量的抑制高級糖基化終產物形成并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的組合物，所述組合物含有選自一組由以下結構式的化合物組成的化合物及其混合物，以及可藥用的載體
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基、低級鏈烯基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)，該稠環(huán)被一個或多個氨基、鹵素或亞烷基二氧基團選擇性取代；Z是氫或氨基；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基、或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
62.逆轉由于高級糖基化反應而形成的高級糖基化終產物的方法，所述方法包括給予靶蛋白逆轉量的能夠裂解存在于高級糖基化終產物中的α-二羰基蛋白質交聯(lián)物的試劑。
63.在體外和體內均存在的糖衍生的非酶促形成的交聯(lián)結構，該結構中含有可被雙親核的噻唑鎓類化合物裂解的α-二羰基部分。
64.根據(jù)權利要求63的交聯(lián)結構，其中所述的α-二羰基部分是二酮結構。
65.根據(jù)權利要求63的交聯(lián)結構，其中所述的α-二羰基部分是如下結構的二酮結構
其中A和B彼此獨立地是與生物分子的親核原子結合的位點。
66.根據(jù)權利要求65的交聯(lián)結構，其中A是與生物分子結合的氨基結合位點。
67.根據(jù)權利要求62的交聯(lián)結構，其中所述裂解是生理條件下發(fā)生的。
68.根據(jù)權利要求63的交聯(lián)結構，其中所述裂解是以催化方式發(fā)生的。
69.根據(jù)權利要求65的交聯(lián)結構，其中X和Y是與蛋白質氨基結合的位點。
70.根據(jù)權利要求69的交聯(lián)結構，其中所述的交聯(lián)結構形成分子間交聯(lián)。
71.根據(jù)權利要求69的交聯(lián)結構，其中所述的交聯(lián)結構形成分子內交聯(lián)。
72.用于抑制靶生物分子高級糖基化并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的試劑，所述試劑含有能與權利要求63的交聯(lián)結構反應的物質。
73.用于抑制靶生物分子高級糖基化并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的組合物，所述組合物中含有有效量的權利要求71所述的試劑及載體。
74.用于對動物給藥從而在所述動物體內抑制靶生物分子高級糖基化并逆轉已形成的高級糖基化交聯(lián)物的藥物組合物，所述組合物中含有藥物有效量的權利要求71所述的試劑及可藥用的載體。
75.根據(jù)權利要求74的組合物，其中所述組合物及所述試劑可用于治療哺乳動物的糖尿病并發(fā)癥以及由于高級糖基化終產物積累而引起的衰老。
76.處理含蛋白質類物質的食物從而抑制所述食物中因靶蛋白形成高級糖基化終產物而引起的有害分子改變的方法，所述方法包括用有效量的權利要求73的組合物處理食物。
77.治療動物從而抑制所述動物體內靶生物分子形成高級糖基化終產物的方法，所述方法包括對所述動物給予有效量的權利要求74的藥物組合物。
78.根據(jù)權利要求77的方法，其中所述靶生物分子是蛋白質。
79.根據(jù)權利要求78的方法，其中所述靶生物分子選自膠原蛋白、彈性晶狀體蛋白、血管壁蛋白、神經蛋白和腎小球基膜蛋白。
80.篩選可用作高級糖基化交聯(lián)物抑制劑的試劑的方法，所述方法包括將試驗化合物與權利要求63的結構反應，然后測定形成的裂解副產物的量以評估所述試劑作為高級糖基化過程所引起的交聯(lián)的潛在抑制劑的用途。
81.權利要求63所述結構的抗體。
82.用權利要求81的抗體測定高級糖基化終產物積累程度的檢測方法，所述檢測方法通過檢測所述抗體與生物樣品的結合程度而實現(xiàn)。
83.下式化合物
其中Y和Z均是氨基，R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級烷基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
84.根據(jù)權利要求83的化合物，所述化合物是2，3-二氨基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽。
85.下式化合物
其中R1和R2和Z是氫；Y是氨基、下式的基團
其中的R是低級烷基、烷氧基、羥基、氨基或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、低級烷氧基、鹵素、二烷氨基、羥基、硝基或亞烷基二氧基團選擇性取代；下式的基團-CH2R’其中的R’是氫或低級烷基、低級炔基、或芳基；或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
86.下式化合物
其中R1和R2彼此獨立地選自氫、羥基(低級)烷基、乙酰氧(低級)烷基、低級酰氧基(低級)烷基、低級烷基，或R1和R2與其環(huán)上的碳原子一起可以是芳香稠環(huán)；Z是氫或氨基；Y是炔甲基、或下式的基團
其中的R″是氫并且R_是被芳基選擇性取代的低級烷基、或芳基，所述芳基被一個或多個低級烷基、鹵素或烷氧羰基選擇性取代；或R″和R_均是低級烷基；并且X是鹵化物、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽或均三甲苯磺酸鹽離子。
87.根據(jù)權利要求86的化合物，其中Y是2-(取代或未取代的)苯基-2-氧乙基基團。
88.根據(jù)權利要求86的化合物，所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
89.根據(jù)權利要求86的化合物，所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-5-甲基噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
90.根據(jù)權利要求86的化合物，所述化合物為3-[2-(3’，5’-二叔丁基-4’-羥基苯基)-2-氧乙基]-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
91.根據(jù)權利要求86的化合物，所述化合物為3-(2-苯基-2-氧乙基)-4-甲基-5-乙烯基-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
92.根據(jù)權利要求86的化合物，所述化合物為3-[2-(4’-二乙氨基苯基)-2-氧乙基]-噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
93.根據(jù)權利要求86的化合物，其中Y是2-氨基-2-氧乙基基團。
94.根據(jù)權利要求93的化合物，所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
95.根據(jù)權利要求93的化合物，所述化合物為3-(2-氨基-2-氧乙基)-苯并噻唑鎓溴化物或其另一種生物可接受的鹽。
96.化合物3-氨基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑鎓均三甲苯磺酸鹽或其另一種生物可接受的鹽。
97.化合物3-(2-甲基-2-氧乙基)噻唑鎓氯化物或其另一種生物可接受的鹽。
98.通過檢測AGE-交聯(lián)蛋白上AGE(高級糖基化終產物)部分的裂解來確定試驗化合物“裂解”或逆轉已形成的高級糖基化終產物的能力的夾心酶免疫檢測方法，該方法包括a)將AGE-修飾的蛋白(AGE-BSA)在微滴定板的膠原包被孔中保溫2-6小時；b)用PBS-吐溫洗滌孔；c)向洗滌后的步驟b的孔中加入試驗化合物；d)在約37℃下將加到洗滌孔中的試驗化合物再保溫12-24小時；然后e)用抗AGE-核糖核酸酶抗體或抗BSA抗體檢測AGE-裂解。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制和逆轉非酶促交聯(lián)(蛋白質老化)的組合物和方法。因此,公開了含有可抑制靶蛋白高級糖基化終產物形成的試劑的組合物,該試劑還可通過裂解高級糖基化終產物中存在的α－二羰基蛋白交聯(lián)物而逆轉高級糖基化終產物中已形成的交聯(lián)物?？蓱玫脑噭┦青邕蜴f鹽。所述方法包括將靶蛋白與組合物接觸。由于可處理食物變質和動物蛋白老化,可以預見本發(fā)明在工業(yè)和治療上的應用。還公開了用于檢測逆轉非酶促交聯(lián)的新免疫分析方法。
文檔編號C07D277/38GK1185736SQ96192393
公開日1998年6月24日 申請日期1996年1月18日 優(yōu)先權日1995年1月18日
發(fā)明者A·卡拉米, P·C·尤里奇, D·R·韋格爾, S·B·黃, S·維森, J·J·伊根 申請人:奧爾頓有限公司, 皮考瓦醫(yī)療研究院