專利名稱：：基于水蛭素氨基酸序列的凝血酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用作凝血酶抑制劑的肽衍生物，具體涉及基于含氨基酸45-65的水蛭素片段序列的肽衍生物。凝血酶是凝血級聯(lián)系統(tǒng)的一種重要的絲氨酸蛋白酶組分。除了分裂血纖蛋白原而引發(fā)血液凝固之外，凝血酶還激活其它凝血劑因子，包括凝血因子V、VIII和XIII，并激活抗凝血酶蛋白C。凝血酶也是一種有效的血小板激活物，它可減少活體內(nèi)由組織纖溶酶原激活物介導(dǎo)的血栓溶解。所以，凝血酶的正反饋調(diào)節(jié)起增強止血作用，但引起血管畸變和腦血管動脈畸變而導(dǎo)致形成危及生命的血栓。已知該酶有多種功能，它若被有效的專一性化合物抑制，則會對血栓形成相關(guān)疾病的治療起不可估量的作用。這類疾病包括冠狀動脈疾病、腦血管疾病、末梢動脈堵塞疾病、深處靜脈血栓形成和肺栓塞。已知最有效的凝血酶抑制劑是水蛭素，它是一類從醫(yī)用水蛭這種水蛭的腺分泌物中分離而得的同工蛋白質(zhì)。很久以前人們就知道水蛭素的抗凝血性能。然而，迄今為止其治療價值很小，因為其腸內(nèi)吸收和皮膚吸收均相當(dāng)少，故難于將該蛋白質(zhì)配制成易于生效和易于施藥的形式，因此該蛋白質(zhì)不可能在血流中形成適當(dāng)?shù)臐舛?。此外，不可能臨床應(yīng)用從水蛭提取物中分離的水蛭素，這是由于受其有限質(zhì)量、費用和變應(yīng)性反應(yīng)的限制，其中的變應(yīng)性反應(yīng)系施藥水蛭素大小的外源蛋白質(zhì)時會經(jīng)常出現(xiàn)的反應(yīng)。在其題為“Pharmacologyofselectivethrombininhibitors”，(1988)，Nouv.Rev.Fr.Hematol.30，pp.161-165的出版物中，Markwardt基于對天然的和合成的凝血酶抑制劑的藥理研究結(jié)果而進(jìn)一步提供有關(guān)水蛭素的臨床資料。該作者對水蛭素作了全面實驗，指出含強酸性C端部分的肽對α-凝血酶有高度專一性。然后他推斷出水蛭素的C端部分有可能結(jié)合到該酶的陰離子結(jié)合位點區(qū)，而其致密的N端部分似乎結(jié)合到該酶的活性中心區(qū)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，天然的脫硫水蛭素45-65以劑量相關(guān)的方式抑制牛α-凝血酶和人α-凝血酶引起的血纖蛋白原凝血。牛α-凝血酶的IC50值為940±200nM，它與有關(guān)同樣片段形成血漿血纖蛋白血塊的報道值相當(dāng)吻合，且比水蛭素55-65低3倍，后者被指定為抗凝血活性所要求的極限核心(minimumcore)。還有人證實此肽抗人α-凝血酶比抗牛α-凝血酶始終更為有效。各種現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)也闡述了，水蛭素氨基酸序列的活性片段好象是包括氨基酸46-65的氨基酸序列。于是，人們試圖通過取代該序列中的某些氨基酸以增強此肽的抑制活性。Krstenansky等人在“AntithrombinpropertiesofC-terminusofhirudinusingsyntheticunsulfatedNα-acetyl-hirudin”，(1987)，F(xiàn)ebsLetters，Vol.211，No.1，pp.10-16中描述了未脫硫Nα-乙酰基水蛭素45-65的C端片段的合成。作者們參照先前的工作(Chang，J.-V.，F(xiàn)EBSLetters，164，307(1983))并提到該片段可能含兩個專一性結(jié)合區(qū)，一個結(jié)合到凝血酶的催化位點，而另一個結(jié)合到凝血酶的另一識別位點。兩組作者也推斷事實并非如此。作者們還是闡明了水蛭素的45-65序列具有抑制凝血活性和凝血酶釋放血纖肽A的能力。他們還提議，水蛭素45-65的同樣序列可能不直接參與同凝血酶的催化位點的結(jié)合，因為凝血酶對合成底物的酰胺分解性能未受干擾。在Krstenansky等人的標(biāo)題為“AnticoagulantpeptidesnatureoftheinteractionoftheC-terminalregionofhirudinwithanoncatalyticsiteonthrombin”，(1987)，J.Med.chem.，30，pp.1688-1691的論文中，作者們報道了在凝血酶的非催化結(jié)合位點處最小活性序列是水蛭素56-64。作者們基于這一設(shè)想報道了幾種C端水蛭素54-65類似物的合成及其抑制凝血酶引起的形成血纖蛋白凝血的能力，目的在于確定水蛭素56-64和凝血酶的非催化結(jié)合位點之間的性質(zhì)。在結(jié)論中，作者們提到水蛭素的C端區(qū)可能結(jié)合到與凝血酶連接的纖維蛋白原區(qū)，它不是迄今文獻(xiàn)中提出的區(qū)。在下列文獻(xiàn)中Dodt等人(Interactionofsitespecifichirudinvariantswithα-thrombin，(1988)，F(xiàn)ebsLetters，Vol.229，No.1，pp.87-90)，Degryse等人(Pointmutationsmodifyingthethrombininhibitionkineticsandantithromboticactivityinvivoofrecombinanthirudin，(1989)，ProteinEngineering，Vol.2，No.6，pp.459-465)和Braun等人(Useofsite-directedmutagenesistoinvestigatethebasisforthespecificityofhirudin，(1988)，Biochemistry，27，pp.6517-6522)，作者們報道了在水蛭素基因上進(jìn)行的定位誘變結(jié)果，研究了突變體水蛭素肽對凝血酶的抑制作用。在這些出版物中，作者們研究了在整個蛋白質(zhì)進(jìn)行的突變且其自身并不限制于水蛭素的45-65片段。此外，對45-65片段進(jìn)行的修飾均局限于單個修飾，常在47號位置，雖然這些出版物還顯示了在位置51、57、58、61和62處的突變，但它說明該殘基不與活性中心相互作用。Dodt等人以類似方式在論文“DistinctbindingsitesofAla48-Hirudin1-47andAla48-Hirudin48-65onα-thrombin”，(1990)，TheJournalofBiologicalChemistry，Vol.265，No.2，pp.713-718中描述了一些實驗，旨在進(jìn)行在水蛭素序列48號位置上的定位誘變。Dodt等人在此處所做的工作似乎被局限于在該位置上用脯氨酸取代丙氨酸，以促進(jìn)他們的實驗中所需的蛋白酶解。最后，Maraganore等人，在“Anticoagulantactivityofsynthetichirudinpeptides”，(1989)，TheJournalofBiologicalChemistry，Vol.264，No.15，pp.8692-8698中，Dennis等人在“Useoffragmentsofhirudintoinvestigatethrombin-hirudininteraction”，(1990)，Eur.J.Biochem.188，pp.61-66中，以及Chang等人在“ThestructuralelementsofhirudinwhichbindtothefibrinogenrecognitionsiteofthrombinareexclusivelylocatedwithinitsacidicC-terminaltail”，(1990)，F(xiàn)ebs.，Vol.26l，No.2，pp.287-290中描述了一些肽的合成和抗凝血性能，這些肽的序列基于天然水蛭素不同片段的序列。具有抗凝血性能的化合物是有用的治療劑，它們可用于活體內(nèi)治療各種病理狀態(tài)。其中抗凝血療法將會實用的最重要病例有心肌梗塞、肺栓塞和腦血管疾病、深處靜脈血栓形成和血栓形成類疾病的其它指征。目前可獲得的抗凝血劑在很多方面不理想。例如，業(yè)已應(yīng)用肝素來抑制凝血酶的活性因而治療如靜脈血栓形成和血栓栓塞的疾病。但是，肝素表現(xiàn)出許多種不利副作用，說明要求表現(xiàn)更合意的毒性水平的抗凝血劑。低分子量和專一性凝血酶抑制劑的設(shè)計中利用遠(yuǎn)離或連接催化中心的輔助性結(jié)合位點，這類似于纖維蛋白原或水蛭素與凝血酶的結(jié)合方式，在蛋白質(zhì)化學(xué)中構(gòu)成挑戰(zhàn)?？梢韵胂螅@種多功能抑制劑結(jié)合兩個或多個被適當(dāng)?shù)拈g隔臂分離的識別性單元，有利于多種同時的相互作用，因而可顯示效果和專一性的提高。結(jié)合具有低分子量結(jié)構(gòu)的“外源”化學(xué)單元可賦與對蛋白酶解的抗性和良好的生物利用率。而且，因為它們比水蛭素小，所以這些化合物在用它們進(jìn)行治療的病人體內(nèi)不大可能刺激不良的免疫響應(yīng)。PCT申請WO91/02750指出，某些凝血酶抑制劑具有可被緩慢分裂或根本不能分裂的CSDMs。然而，它們都是在Arg和Gly或Pro之間有修飾鍵，例如Arg[psiCH2-NH]-Gly、β-HomoArg-Gly、β-HomoArg-Pro、β-HomoArg-Val或Arg-[ψCO-CH2]-CH2-(CONH)-Gly。但沒指示Gly或Pro氨基酸可被完全消去再接上完全抗凝血酶分裂的合成接頭。本發(fā)明的化合物是式(D)-Phe-Pro-Arg-(CH2)4(CO)-[NH-(CH2)4CO]2-DFEPIPL的肽衍生物(I)，它模擬含殘基45-65的水蛭素的羧基區(qū)。字母D、F、E、P、I和L表示按已知的單字母密碼表示的氨基酸。本發(fā)明的另一個方面是提供治療血栓形成類疾病的藥物組合物，它包括有效量的肽衍生物(I)(D)-Phe-Pro-Arg-(CH2)4(CO)-[NH(CH2)4CO]2-DFEPIPL及其藥物上可接受的鹽。本發(fā)明的又一個方面是提供治療或預(yù)防與血栓形成有關(guān)的血管疾病的方法，它包括對病人施藥有效量的組合物，該組合物包含有效量的肽衍生物(I)D-Phe-Pro-Arg-(CH2)4(CO)-[NH(CH2)4CO]2-DFEPIPL。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的化合物也可用于以下方面的組合物和方法中活體內(nèi)診斷成像、體外貯存體外的血液和涂敷外來器具(invasivedevices)，以及來自體內(nèi)的血液處理。本發(fā)明涉及用作凝血酶抑制劑的肽衍生物。業(yè)已發(fā)現(xiàn)包括殘基45-65的水蛭素天然片段能與凝血酶上兩個獨立且相隔較遠(yuǎn)的位點同時相互作用，其中的一個位點是推定的陰離子外位點(exosite)，而另一個是負(fù)責(zé)蛋白酶解的催化位點。這種結(jié)合方式模擬但不同于天然水蛭素分子的機制，現(xiàn)已證實天然水蛭素分子是通過其N端三個殘基與凝血酶的活性位點相互作用的。因此，好象是殘基45、46和47在天然蛋白質(zhì)中不起結(jié)合作用，而是在缺乏N端核心時盡管較弱地，但在空間上先傾向于恰當(dāng)?shù)叵嗷プ饔谩；谠撚^察，我們合成了在分子的兩個抑制性組分上進(jìn)行了修飾的肽衍生物，且該衍生物表現(xiàn)的抗凝血酶活性高于任一部分單獨的水平。此外，新形成易斷裂鍵的化學(xué)修飾提供更活潑的化合物，它對凝血酶具有蛋白酶解穩(wěn)定性優(yōu)點。該肽衍生物用作抗凝血劑和血小板凝聚的抑制劑，于是降低動脈血栓形成和其它有關(guān)心血管病的指征中的危險因素。本發(fā)明的化合物也可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移如癌的病例。當(dāng)用于α-氨基酸時，術(shù)語“殘基”指通過脫去其羧基的羥基和α-氨基的一個氫而得自相應(yīng)的α-氨基酸的基團(tuán)。文中所用指單個的殘基的縮寫是基于theIUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature[Biochemistry，11，1726-1732，(1972)]的推薦。文中所用的術(shù)語“氨基酸”包括天然生成的氨基酸和非天然的類似物如化學(xué)合成和肽化學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員常用的那些非天然類似物。非天然氨基酸一覽表可參見“ThePeptides”，vol.5，1983，AcademicPress，Chapter6byD.C.RobertsandF.Vellaccio。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防與血栓形成有關(guān)的血管疾病的方法，該方法包括對病人施藥有效量的組合物，此組合物含與藥物上可接受的載體摻和的肽衍生物。本發(fā)明還涉及在用溶栓劑醫(yī)治病人時減少再灌注時間或提高再閉塞(reocclusion)時間的方法。該方法包括對病人施藥有效量的組合物，此組合物含本發(fā)明的肽衍生物和與藥物上可接受的載體摻合的溶栓劑。依本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的肽衍生物可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。此衍生物治療腫瘤時的效果通過對轉(zhuǎn)移生長的抑制來體現(xiàn)。這基于某些癌細(xì)胞中存在的促凝血酶。該酶激活凝血級聯(lián)系統(tǒng)中凝血因子X和凝血因子Xa的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致血纖蛋白沉積，它反過來又作為腫瘤生長的底物。通過抑制凝血酶而抑制纖維蛋白沉積，本發(fā)明的分子可作為有效的抗轉(zhuǎn)移瘤劑?？捎帽景l(fā)明的凝血酶抑制劑治療的轉(zhuǎn)移瘤實例包括但不限于腦癌、肝癌、肺癌、骨癌和瘤形成的漿細(xì)胞癌。依本發(fā)明的另一方面，凝血酶抑制劑可用于涂敷外來器具表面用的組合物和方法中，致使接受這類器具的病人體內(nèi)血塊形成或血小板活化的危險性更低?？捎帽景l(fā)明的組合物涂敷的表面例如有假體、人造瓣膜、血管移植物、斯坦特固定模和導(dǎo)管。涂敷這些器具的方法和組合物是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的，它們包括使含凝血酶抑制劑的組合物化學(xué)交聯(lián)或物理吸附在器具表面。依本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案，凝血酶抑制劑可用于病人的診斷用血栓成像。在該實施方案中，用放射性同位素標(biāo)記凝血酶抑制劑。放射性同位素的選擇基于人們熟悉的一些因素例如毒性、生物半衰期和鑒別率。優(yōu)選的同位素包括但不限于125I、123I和111In。標(biāo)記凝血酶抑制劑的方法是本領(lǐng)域中為人熟知的。最優(yōu)選地，放射性同位素是123I且用123I-Bolton-Hunter試劑來進(jìn)行標(biāo)記。將已標(biāo)記的凝血酶抑制劑施藥給病人并讓其與含于血塊中的凝血酶結(jié)合。然后利用人們熟知的方法如利用聯(lián)到計算機成像系統(tǒng)上的可檢測放射性的攝像機來觀測此血塊。該技術(shù)也產(chǎn)生血小板結(jié)合的凝血酶和meizothrombin的成像。在另一方面，上述凝血酶抑制劑或其組合物可用作來自體內(nèi)處理血液或體外血液用的抗凝血劑。文中用到的術(shù)語“來自體內(nèi)”處理包括從病人體內(nèi)抽出血液，接受體外處理，再返回到病人的過程，如滲析法、血液過濾或外科手術(shù)時的血液分流術(shù)。文中用到的“體外血液”這一術(shù)語是指體外貯存的、最終用于病人的血液制品，也指收集自病人、有待用于各種測定的血液。這類制品包括全血、血漿或需要抑制凝血的任意血液組分。本發(fā)明的肽衍生物可用本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟悉的各種方法合成。例如，此肽類可用Stewartet.al.在“Solidphasepeptidesynthesis”，F(xiàn)reeman&amp;Co.，SanFrancisco，1969中描述的固相法，在合適的肽合成儀上合成。肽衍生物的非氨基酸區(qū)要求在將該部分通過慣常的固相合成法與其它氨基酸連接以生成所需的肽之前先進(jìn)行化學(xué)合成。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將會懂得，熟練的有機化學(xué)家容易制備此肽衍生物的合成區(qū)。肽衍生物的合成可用BOC-GlnPAM樹脂(AppliedBiosystems；0.64mmol/克)作固相載體，在AppliedBiosystems430A肽合成儀上合成肽衍生物。氨基酸偶聯(lián)可由二環(huán)己基碳化二亞胺/N-羥基苯并三唑介導(dǎo)，再如下進(jìn)行脫保護(hù)先與50％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷作用3分鐘，接著循環(huán)20分鐘。側(cè)鏈保護(hù)基為Asp(Chx)、Arg(Tos)。然后可用含苯甲醚和甲硫醚(10vol.％)的液態(tài)氟化氫在-5℃下對充分保護(hù)的肽樹脂處理60分鐘。接著用氮氣流除去過量的HF，并用醚提取殘留固體，再過濾。然后用冰醋酸和水提取樹脂，接著冷凍干燥。肽衍生物的純化和分析所得凍干的粗肽可利用慣常認(rèn)可的肽純化技術(shù)純化成勻質(zhì)物。一種合適的方法是反相色譜法在Vydac十八烷基二氧化硅玻璃柱(15，1.5×30cm，40psi)上利用如下線性梯度溶劑系統(tǒng)A，500ml500ml0.1％TFA/H2O和B，含0.1％TFA的1L60％乙腈(Acelonitrite)/H2O。各級分的分析可用反相HPLC在VarianLC上進(jìn)行，其中利用VvdacC18分析柱，在215nm處測定?？珊喜⒓兌仍?9％以上的各級分并冷凍干燥。肽含量可通過氨基酸分析法在Beckmanmodel6300氨基酸分析儀上進(jìn)行測定。然后在WatersPico-TagWorkStation中干燥試樣。往小瓶中加入含1％苯酚的恒沸HCl(200μl)，并交替(用干燥的氮氣)吹洗，吹洗三次后抽真空。最后，將含試樣的小瓶在150℃下的真空中加熱1小時。可在裝有離子噴射入口源的SCIEXAPIIII譜儀上進(jìn)行質(zhì)譜分析。這樣，可由正確的氨基酸組成和質(zhì)譜確認(rèn)合成的肽的結(jié)構(gòu)和序列，其中的質(zhì)譜是為了證明與計算的分子量相符。藥物組合物本發(fā)明的肽衍生物可以治療上可接受的鹽的形式獲得。由于肽衍生物的殘基具有酸和/或堿的官能，那么就可以衍生出有機酸(如乙酸、三氟乙酸、乳酸、丁二酸或蘋果酸)或堿(如鈉、鉀或鈣)的鹽。肽衍生物的這些鹽具有充分的生物活性。可以用R.A.Boissonas等人，Helv.Chim.Acta.43，1849(1960)描述的方法，應(yīng)用合適的離子交換樹脂將治療上可接受的鹽從一種鹽形式轉(zhuǎn)變成另一種形式。本發(fā)明的肽衍生物或其治療上可接受的鹽，可單獨地或組合地用于治療或預(yù)防血栓形成引起的血管病。將它與藥物上可接受的載體系統(tǒng)施藥給溫血動物如人、馬或狗，其組成比例依溶解性和選用的施藥方法而定。本發(fā)明的肽衍生物與藥物上可接受的載體組合后可以靜脈內(nèi)、皮下或肌肉注射來施藥。合適的載體實例見于權(quán)威藥學(xué)教材，如“Remington’sPharmaceuticalSciences”，16thedition，MackPublishingCompany，Easton，Penn.，1980。肽衍生物的劑量將隨施藥方式并可能隨具體的鹽形式而變化。至于注射，肽衍生物的治療有效劑量是在約0.05mg/kg～10mg/kg體重的劑量范圍內(nèi)。除了活性成分外，組合物通常還含合適的緩沖劑例如磷酸鹽緩沖劑，以維持適當(dāng)?shù)膒H；并含有氯化鈉、葡萄糖或甘露糖醇以使溶液具有等滲性。本發(fā)明的肽衍生物可單獨地或與其它藥物組合施藥。例如，肽衍生物可與溶纖劑如組織纖溶酶原激活物、鏈激酶或尿激酶組合施藥以防止冠狀動脈的再閉塞。肽衍生物也可與肝素或低分子量肝素一起施藥，這是一種可有利地減少肝素或低分子量肝素的劑量的組合形式。可與肽衍生物一起施用的其它化合物包括血栓烷和EPIIb3a。下述實施例中用到的縮寫包括，BOC叔丁氧基羰基；Tos對-甲苯磺酰；CH2Cl2二氯甲烷；TEA三乙胺；BOP苯并三唑基N-氧化三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽；DMF二甲基甲酰胺；EtOAc乙酸乙酯；DCCN，N’-二環(huán)己基碳化二亞胺；DPPA二苯基磷酰疊氯化物THF四氫呋喃；HF氟化氫；CBZ芐氧基碳酰。實施例1合成(2S)-2-(BOC)-N-甲氧基-N-甲基-5-甲苯磺酰胍基(guanadino)戊酰胺在0℃的冰浴中，向含有TEA(0.4ml，3mmol)和N，O-二甲基羥基胺鹽酸化物(146mg，1.5mmol)的Nα-BOC-NG-甲苯磺酰精氨酸(428mg，1mmol)于30mlDMF的溶液中，加入BOP試劑(500mg，1.1mmol)(B.Castro，J.R.Dormoy，G.Elvin，C.Selve，TetrahedronLetters#14，pp.1219-1222，1975)。在4℃下攪拌反應(yīng)達(dá)15小時，然后高真空蒸發(fā)掉溶劑。殘余物溶于50mlEtOAc并用水洗滌。有機相進(jìn)一步用5％NaHCO3、1NHCl各萃取三次，再在Na2SO4上干燥。溶劑在硅藻土上過濾后真空濃縮。往濃縮物中加入少量己烷，沉積的白色固體(500mg)為標(biāo)題化合物。質(zhì)譜分析M/Z＝472(M+H)+。實施例2合成6-BOC-9-甲苯磺酰胍基-1-壬烯-5-酮往實施例1的產(chǎn)物(600mg，1.3mmol)于25mlTHF的溶液中加入10當(dāng)量制備自4-溴-1-丁烯的格利雅試劑(制備釋注滴加1.75g4-溴-1-丁烯處理312mg鎂屑(13mmol)于50ml無水乙醚的溶液維持緩慢回流)，待金屬全部消耗后用注射器將此格利雅溶液在氬氣中轉(zhuǎn)入THF混合物。用NH4Cl水溶液使整個THF混合物驟冷，TLC之后顯示起始原料已消失(是在Kieselgel60F254，Merck，玻璃板上進(jìn)行TLC的)。進(jìn)行相分離，有機相進(jìn)一步用1NHCl和H2O洗滌，干燥(Na2SO4)并真空蒸發(fā)。在硅膠上進(jìn)行色譜分離(用4∶1EtOAc/己烷洗脫)得清亮的油狀標(biāo)題化合物。質(zhì)譜分析M/Z＝469(M+H)+。實施例3合成5-BOC-4-氧基-8-甲苯磺酰胍基辛酸將實施例2的產(chǎn)物(2.5g，5.3mmol)溶于50ml乙腈，接著加入高碘酸鈉(8g，37.5mmol)于50ml水中的溶液。用100mg氯化釕處理此混合物。室溫下強烈攪拌一小時后，用TLC未測出起始原料。用100mlH2O和100ml乙醚稀釋該混合物。進(jìn)行相分離，水相進(jìn)一步用乙醚萃取。合并的有機萃取物用H2O洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)至干，得1.5g標(biāo)題化合物的泡沫體。M/Z＝485(M+H)+。實施例4合成6-BOC-5-氧基-9-甲苯磺酰胍基壬酸本實施例的標(biāo)題化合物以類似于實施例1～3的方法合成。簡言之，用制備自鎂和5-溴-1-戊烯的格利雅試劑與實施例1的產(chǎn)物反應(yīng)。分離生成的加合物得類似于實施例3的油狀產(chǎn)物，接著用高碘酸鈉和氯化釕的組合處理得本實施例的標(biāo)題同系物。M/Z＝499(M+H)+。實施例5合成7-BOC-6-氧基-10-甲苯磺酰胍基癸酸本實施例的標(biāo)題化合物以類似于實施例1～4的方法制備。在本實施例中，用制備自鎂和6-溴-1-己烯的格利雅試劑與實施例1的產(chǎn)物反應(yīng)。接著如實施例2中所述用硅膠凝膠色譜分離該加合物，再將此加合物與高碘酸鈉和氯化釕反應(yīng)。分離產(chǎn)物得油狀的標(biāo)題化合物。M/Z＝513(M+H)+。實施例64N-t-BOC-3-氧基-7-甲苯磺酰胍硫代庚酸乙酯(混合酐法)混合酐的形成于-20℃下，在攪拌時往1g(2.4mmol)(L)-Nα-BOC-Arg(Nw)TOS)OH和0.66ml(0.48mmol)三乙胺于15ml無水四氫呋喃的溶液中，滴加0.40ml(0.3mmol)氯甲酸異丁酯達(dá)15分鐘。1小時后用15ml乙醚稀釋該混合物，濾去沉淀出的固體物。含混合酐的濾液于0℃下貯存。同時，在0℃和氬氣保護(hù)下，往二異丙胺(3.4ml，24mmol)于25ml無水乙醚的溶液中，在攪拌下滴加一當(dāng)量正丁基Li的THF溶液達(dá)30分鐘。然后，冷卻該反應(yīng)混合物至-60℃并用2.5ml硫代乙酸乙酯處理。于60℃下攪拌30分鐘后，用6gMgBr2乙醚配合物處理，且繼續(xù)攪拌30分鐘。最后，用預(yù)先形成的混合酐處理此混合物，繼續(xù)攪拌5小時直至反應(yīng)完全(依HPLC測定)。滴加6MNH4Cl處理該反應(yīng)混合物并進(jìn)行相分離。有機相用50mlEtOAc稀釋，再用1NHCl(3X)、H2O(3X)萃取，用Na2SO4干燥后高真空蒸發(fā)得油狀標(biāo)題化合物，M/Z＝515(M+H)+。實施例7偶聯(lián)實施例6的硫代酯至α-氨基酸酯和去保護(hù)的氨基乙酰聚苯乙烯樹脂。將得自實施例6已保護(hù)的精氨酰statone(2當(dāng)量)溶于CH2Cl2，并加入到含生長多肽鏈的α-氨基酸酯(1當(dāng)量)或聚苯乙烯樹脂混合物中。向該混合物中加入碘化亞銅(2當(dāng)量)和三乙胺(2當(dāng)量)。至于氨基酸酯，用HPLC監(jiān)測反應(yīng)；或者在聚苯乙烯結(jié)合的肽的情況下，則用慣常的水合茚三酮試驗監(jiān)測反應(yīng)。實施例8制備式II-〔NH-CH2-CH＝CH-CH2-(CO)〕3-的合成間隔基亞基模擬(CoxM.T.，HestonD.W.andHorburyJ.，J.Chem.Soc.Chem.Comm.，1980，799-800)進(jìn)行合成并作大量修改。全過程略述如下a)合成反-β-氫化粘康酸二甲酯。將22g(153mmol)反-β-氫化粘康酸溶于含500mg對甲苯磺酸和100ml甲醇的200ml苯中。溶液保持回流達(dá)5小時，再用100ml水處理。進(jìn)行相分離，有機層進(jìn)一步用5％NaHCO3和H2O萃取。干燥(Na2SO4)后，真空蒸發(fā)掉溶劑，蒸餾(83～85℃，0.5mmHg)殘余物得19g標(biāo)題化合物。b)合成反-β-氫化粘康酸單甲酯將5g(27.5mmol)步驟a)的產(chǎn)物懸浮于0.1MKH2PO4的100ml溶液，接著加入20mg豬肝酯酶。滴加1MNaOH溶液而維持溶液的pH為7。在加入相當(dāng)于1摩爾當(dāng)量二酯的1MNaOH后，用活性炭處理溶液，攪拌5分鐘并用硅藻土過濾。用乙醚萃取濾液，廢棄合并的有機萃取物。用3NHCl調(diào)節(jié)水相至酸性，再用乙醚萃取。合并的乙醚萃取物被干燥(Na2SO4)后真空蒸發(fā)。減壓蒸餾(105-110℃，0.5mmHg)殘余物，余留4g油狀標(biāo)題化合物。c)合成4-甲氧基羰基-2-脫氫異氰酸丁酯將1.22g(7.3mmol)步驟b)的單酯溶于25ml苯。滴加0.76ml(8.7mmol)草酰氯達(dá)15分鐘，劇烈攪拌溶液3小時。真空蒸發(fā)此溶液，將殘余物溶于10ml丙酮后加入預(yù)先冷卻的(0℃)疊氮化鈉lg于20ml50％水/丙酮的溶液。30分鐘后用水(50ml)稀釋此混合物，并用每份20ml的苯萃取3次。將合并的有機提取物干燥(Na2SO4)并過濾。濾液在80℃的油浴中加熱直至無氮氣放出為止。真空蒸發(fā)溶劑，再減壓蒸餾(80-85℃，0.5mmHg)殘余物得700mg標(biāo)題化合物。d)合成4-N-丁氧基羰基-戊-3-烯酸將890mg(12.2mmol)叔丁醇加入含步驟c)的產(chǎn)物(1g，6.1mmol)的25ml苯溶液中。全部溶液被回流10小時，然后真空蒸發(fā)。殘余物用步驟b)中所述的豬肝酯酶處理，再用該步驟中所述方法處理得700mg標(biāo)題化合物。然后將得自步驟d)的產(chǎn)物用作制備合成的間隔臂II的單元。利用本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟悉的技術(shù)組合這些單元而形成間隔臂(II)。實施例9制備P79Ac-(D)Phe-Pro45-Arg-(COCH2)CH2-(CO)-Gln-Ser50-His-Asn-Asp-Gly-Asp55-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro60-Glu-Glu-Tyr-Leu-GlnOH將1g叔丁氧基羰基-Gln苯基乙酰氨基甲基樹脂(AppliedBiosystems；0.64mmol/g)進(jìn)行16輪合成，其中包括nα-側(cè)鏈去保護(hù)(50％TFA于CH2Cl2中)和利用2.5meq被保護(hù)的氨基酸/DCC與N-羥基苯并三唑的偶聯(lián)。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基如下Asp(環(huán)己基)、Glu(芐基)、His(芐氧基甲基)、Tyr(溴芐基)、Ser(芐基)。也用DCC/N-羥基苯并三唑?qū)⒌米詫嵤├?的合成保護(hù)氨基酸偶聯(lián)至Gln49。為得到最佳結(jié)果，N-BOC-(D)-Phe-Pro-OH可代替各氨基酸以單個的單元加入。在-5℃的特氟隆容器中，用含苯甲醚和二甲硫(10vol％)的氟化氫處理已完全保護(hù)的肽樹脂(500mg)達(dá)60分鐘。通N2氣流除去過量的HF，殘余物用乙醚萃取后過濾。用冰醋酸和水萃取該樹脂三次，接著冷凍干燥。凍干后的粗肽利用反相色譜在十八烷基二氧化硅(15，Vydac)玻璃柱(1.5×30cm，40psi)上純化至均質(zhì)物，它利用的線性梯度溶劑系統(tǒng)包括(a)500ml0.1％TFA/H2O和(B)含0.1％TFA的1升60％乙腈H2O溶液。合并純度達(dá)98％或更高的各級分并冷凍干燥。氨基酸分析指示Asp(3)，Ser(1)，Glu(6)，Gly(1)，Ile(1)，Leu(1)，Tyr(1)，Phe(2)，His(1)，Pro(2)。所得的肽表現(xiàn)為假分子離子，相應(yīng)于2548.6。實施例10制備P183。Ac-(D)-Phe-Pro-Arg-[(CO)-CH2]-CH2CH2CH2-(CO)-[NH-CH2-CH＝CH-CH2-(CO)]-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH。基本上依關(guān)于P79及其類似物的作了較小修改的那樣合成并純化該標(biāo)題肽衍生物。例如，用叔丁氧基羰基-Leu苯基乙酰氨基甲基聚苯乙烯樹脂(AppliedBiosystems，0.64mmol/g)開始固相合成。至于Asp殘基后續(xù)的t-BOC基的脫保護(hù)，用到含10％甲基乙基硫醚、50％TFA于CH2Cl2中的溶液。這樣，由HPLC(在215nm處的UV吸收)測得最佳化標(biāo)題肽的產(chǎn)率大于60％。以類似于P183的方法制備P184和P185P184Ac-(D)-Phe-Pro-Arg-[(CO)CH2]CH2CH2CH2(CO)-[NH-CH2-CH＝CH-CH2-(CO)]2-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH。氨基酸分析指示Asp(1.00)，Glu(1.08)，Ile(0.96)，Leu(1.01)，Phe(1.91)，Pro(3.48)。假分子離子1553。P185Ac-(D)-Phe-Pro-Arg-[(CO)CH2]CH2CH2CH2-(CO)-[NH-CH2-CH＝CH＝CH2-(CO)]3-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH。氨基酸分析指示Asp(1.00)，Glu(1.06)，Ile(0.93)，Leu(0.98)，Phe(1.88)，Pro(3.6)。假分子離子1647肽衍生物(I)(D)-Phe-Pro-Arg-(CH2)4(CO)-[NH(CH2)4CO]2-DFEPIPL以類似于P183、P184和P185的方法制備，只是用合成殘基氨基戊酸代替[NH-CH2-CH＝CH-CH2-(CO)]。氨基酸分析指示Asp(0.97)，Glu(1.00)，Ile(1.04)，Leu(1.02)，Phe(1.96)，Pro(2.86)。實施例11凝血酶活性的酰胺分解測定Tos-Gly-Pro-Arg-pNA的凝血酶催化水解是在VarianCary2000雙光束分光光度計上于405nm處監(jiān)控的，其中利用底物濃度為2.5，3.5，5和10μM，終體積為1ml。水解反應(yīng)的進(jìn)行條件于25℃下、pH7.8、含0.1MNaCl和0.1％PEG6000的0.1MTris-HCl緩沖液中。是這樣開始反應(yīng)的將溶于pH7.8的0.1MTris-HCl緩沖劑中的底物加至酶(0.4或0.04nM)和溶于相同緩沖劑中的各濃度抑制劑的預(yù)溫育的溶液。記錄初始速率，并依如下方法測定Ki值對于競爭性抑制用圖解法，通過Dixon圖的加權(quán)線性回歸；或者對于雙曲線抑制用Baici的方法(Baici，1981)。采用與上述熒光操作方式中相同的條件和儀器來進(jìn)行熒光團(tuán)分析，以比率(λex＝383nm，λem＝455nm)表示。用已知濃度的7-氨基-4-甲基香豆素溶液校正熒光強度。本發(fā)明的合成肽衍生物對人α-凝血酶的專一性也可通過比較它對人α-凝血酶和牛α-凝血酶的相對抑制活性來測定，而對胰蛋白酶的專一性則通過比較凝血酶活性的酰胺分解分析中測得的Ki值來測定。這樣，本發(fā)明的肽衍生物對凝血酶的抑制活性也可通過測定已混合重構(gòu)的正常人血漿的凝血酶原時間(PT，外源途徑)或活化部分促凝血酶原激酶時間(APTT，內(nèi)在途徑)來檢定，其中利用Coag-A-Mate2001儀(GeneralDiagnosticsInc.，MorrisPlanes，NewJersey)或其它合適的光譜儀。因此，若測定凝血酶原時間，將50μl重構(gòu)含檸檬酸鹽的正常人血漿(Sigma，St-Louis，MO.)與50μl促凝血酶原激酶溶液在37℃下混合于400μl小容器中。然后用200μlpH7.8的Tris-HCl緩沖液(含0.1MNaCl，0.1％PEG6000)或不同濃度抑制劑的相同緩沖液處理此混合物。用100μl25mMCaCl2再鈣化后記錄凝血時間。不含抑制劑時的凝血時間為19-22sec。利用同樣方法來測定活化部分促凝血酶原激酶時間，但需用腦磷脂(Sigma，St-Louis，MO.)活化重構(gòu)血漿達(dá)3分鐘。肽衍生物對凝血酶的抑制活性可通過它抑制凝血酶介導(dǎo)的血小板凝聚的能力來表現(xiàn)，它由BioDataPAP-4集合度計測得的透光度的增大而指示。血纖蛋白原凝血分析對血纖蛋白原凝血形成的抑制可用分光光度法在37℃下的VarianDMS90上于405nm處測定。將300μl含0.1MNaCl、0.1％PEG600的0.1％血纖蛋白原(Sigma)于0.1MpH7.8Tris-HCl中的溶液與不同濃度抑制劑于相同緩沖劑中的溶液混合于聚苯乙烯小容器中，加入酶(人或牛α-凝血酶0.4nM)引發(fā)反應(yīng)，其中總體積為1mL。記錄不同抑制劑濃度下從混合至因形成凝血而引起光線偏轉(zhuǎn)的時間，并用對數(shù)概率值分析法計算IC50值。本分析中抑制劑的濃度基于肽含量。也可用其它不同的分析法來測定本發(fā)明的肽衍生物的抗凝血活性。所以，肽衍生物對凝血酶的抑制活性也可通過抑制活化部分促凝血酶原激酶的時間(APTT內(nèi)在途徑或凝血酶原時間PT外源途徑)來分析。因此，可用Coag-A-Mate2001儀(GeneralDiagnosticsInc.，MorrisPlabes，NewJersey)分析已混合正常人血漿的APTT而測定抗凝血活性。此外，本發(fā)明的肽衍生物對于凝血酶催化水解三肽基對-硝基苯胺(tripeptidylP-nitroanilide)底物甲苯磺酰-Gly-Pro-Arg-對-硝基苯胺(ChromozymTH，Boehringer-Mannheim，Indianapolis，In.)的抑制作用可這樣測試，即用分光光度法在Cary219雙光束分光光度計上于420nm處測定。將凝血酶溶液與Tris-HCl，pH7.4，NaCl緩沖液混合而預(yù)備該反應(yīng)。當(dāng)利用本發(fā)明的肽衍生物來進(jìn)行這些分析時，表明它起對凝血酶的雙功能抑制劑作用。確實，已證實肽鏈上引入由合適的間隔臂分開的兩個關(guān)鍵性區(qū)可提供強凝血酶抑制劑。結(jié)果如表I所示。顯然，在單分子中引入兩個由合適的連接臂分開的結(jié)合區(qū)可大為增強該化合物對凝血酶的親和性。事實上，兩個獨立區(qū)單獨的IC50劑量的組合會導(dǎo)致凝血時間準(zhǔn)確加倍；而如果這兩個區(qū)通過連接臂相連，則可獲得更大的活性。因此，看來當(dāng)它們與凝血酶接觸時，本發(fā)明的雙功能抑制劑發(fā)生雙重協(xié)同結(jié)合。連接臂作為適當(dāng)?shù)拈g隔臂用于跨接輔助位點(區(qū)(ii))和催化位點(區(qū)(i))以及鄰接催化位點的非極性結(jié)合位點。氯化鐵損傷引起的血栓形成模型種大鼠，雄性，Sprague-Dawley重375-450gFeCl3引起的動脈損傷模型試驗依下列文獻(xiàn)報道的進(jìn)行Karz，K.D.，Main，R.W.，Sandusky，G.E.，Thrombosisresearch60；269-280，1990和Schumacher，W.A.等人J.pharmacologyandexperimentaltherapeutics267；1237-1242，1993。用尿烷麻醉雄性Sprague-Dawley(375-450g)(1500mg/kgIP)。使動物躺在維持在37℃的熱墊上。通過正中頸切開接近頸動脈，小心地用鈍器解剖法揭開脈管并將其與頸動脈鞘分離。用鑷子夾起動脈以讓出間隙在其下插入兩根小聚乙烯管(PE-205)。在PE-205和動脈之間放置溫度探頭(PhysitempMT23/3)TM。在應(yīng)用FeCl3之后監(jiān)測脈管的溫度60分鐘，用熱敏電阻(Cole-PalmerModel08533-41)記錄脈管的溫度變化。在溫度探頭上方頸動脈上敷貼預(yù)先浸入35％FeCl3溶液的WhatmanTM1號濾紙的小圓片(直徑為3mm)而引起損傷。試驗部位覆蓋鋁箔以防FeCl3被光降解。記錄介于敷貼氯化鐵時和脈管溫度劇降(＞2.4℃)時之間的時間，作為脈管的閉塞時間(TTO)。在開始實驗前，將血樣抽入(1ml)盛有0.105M檸檬酸鹽緩沖溶液的試管(來自眼竇)，最后將動物放血。所有的樣本保存于冰上，并于4℃時在2000Rpm下盡可能迅速地離心10min。在止血分析儀(haemostasisanalyzer)(STAGOST4TM)上分析血漿的活化部分促凝血酶原激酶時間，重復(fù)分析兩次。從一組4只動物所得兩條動脈于-80℃下貯存供進(jìn)一步分析，其它的動脈在40X的光學(xué)顯微鏡(LeicaTM)下觀察以量化閉塞(完全的、部分的、未閉塞)。血小板凝聚分析從捐獻(xiàn)的血液分離出人血小板，并依Packham等人描述的方法制備洗滌兩次的懸浮液。利用心臟穿刺術(shù)采集大鼠血液至ACD(6∶1，v/v)。按Ardlie等人描述的方法(Br.J.Haematol.1970，197，Proc.Soc.Exp.Bio.Med.1971，1361021)制備洗過的血小板懸浮液。最終懸浮介質(zhì)是修飾的Tyrode溶液(NaCl138mM，KCl2.9mM，HEPES20mM，NaH2PO40.42mM，CaCl21M，MgCl22mM，0.1％葡萄糖，0.35％白蛋白，腺苷三磷酸雙磷酸酯(1μl/ml)pH7.4)。調(diào)節(jié)血小板數(shù)至5000,000/ul。為了能測定致密顆粒內(nèi)含物的釋放程度，用14C-血清緊張素標(biāo)記第一次洗液中的血小板(1uCi/10ml洗液)，并測定釋出的14C-血清緊張素。加入Impramine(5uM最終濃度)以防釋出的血清緊張素被再攝取。應(yīng)用血小板集合度計來分析(4channelBioDataPAP4，Hatboro，PA，USA)。加入刺激劑(人的0.1U/ml最終濃度)3min后測定凝聚百分?jǐn)?shù)。在加刺激劑前，于37℃下將抑制劑預(yù)保溫1min。IC50值是指抑制血小板凝聚或分泌至對照樣的50％的濃度。表I</tables>引起加倍有效時間所需肝素的劑量是200U/kg?！?”表示未測到。表中的數(shù)據(jù)表示3-5次觀測平均值。對照組(鹽水處理的)大鼠的有效時間為19±1min(n＝11)?！?”在含血纖蛋白原的緩沖液中加倍凝血酶時間所要求的化合物濃度?！?*”抑制人血漿凝血時間達(dá)50％所要求的化合物濃度。權(quán)利要求1.肽衍生物(I)(D)-Phe-Pro-Arg-(CH2)4(CO)-[NH(CH2)4CO]2-DFEPIPL及其藥物上可接受的鹽。2.治療血栓形成類疾病的組合物，它包括有效量的肽衍生物(I)(D)-Phe-Pro-Arg-(CH2)4(CO)-[NH(CH2)4CO]2-DFEPIPL及其藥物上可接受的鹽。3.治療或預(yù)防與血栓形成有關(guān)的血管疾病的方法，該方法包括對病人施藥有效量的、權(quán)利要求2的組合物。全文摘要一種凝血酶抑制劑,它包括:大體積疏水性的第一部分,該部分能與負(fù)責(zé)蛋白酶解的凝血酶催化位點作用;和能維持下述氨基酸的疏水性和酸性的第二部分,其中的氨基酸是指天然水蛭素在C端非催化區(qū)N－乙?！嗡?5—65處的氨基酸55—60。在第一部分和第二部分之間是共價鍵連接部分。該化合物實用于治療血栓形成類疾病。文檔編號C07K14/815GK1182436SQ96193457公開日1998年5月20日申請日期1996年3月18日優(yōu)先權(quán)日1995年3月20日發(fā)明者J·迪邁奧申請人:加拿大國家研究委員會