專利名稱：：新的內(nèi)切葡聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的酶制劑，該酶制劑包含顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，其在工業(yè)應(yīng)用(如洗衣組合物、生物拋光(biopolishing)新制造的織物、提供纖維素織物或衣物磨損的外觀和處理紙漿)中性能良好。此外，本發(fā)明涉及編碼這種酶的DNA構(gòu)建體、提供編碼這種酶的基因的方法、產(chǎn)生所述酶的方法、包含這種酶的酶制劑以及這些酶在許多工業(yè)應(yīng)用中的用途。發(fā)明背景纖維素酶或溶纖酶是涉及纖維素水解的酶。在天然纖維素的水解中，已知涉及三種主要類型的纖維素酶，即纖維二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶EC3.2.1.91)、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(內(nèi)切1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶EC3.2.1.4)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。纖維素酶由大量微生物(包括真菌，放線菌，粘細(xì)菌和真細(xì)菌)合成，也由植物合成。已鑒別了各種特異性的特定的內(nèi)切葡聚糖酶。溶纖酶的一種十分重要的工業(yè)用途是用來處理纖維素織物原料或織物，例如作為洗滌劑組合物或織物軟化劑組合物中的組分、用于生物-拋光新織物(衣物修飾)和用于獲得含纖維素織物(尤其斜紋粗棉布)的＂石洗(stone-washing)＂外觀。在例如下列文獻(xiàn)中提出了幾種這樣的處理方法GB-A-1368599，EP-A-0307564和EP-A-0435876，WO91/172431WO91/10732，WO91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132。溶纖酶的另一個重要的工業(yè)用途是用于紙漿處理，例如為了改善導(dǎo)液(drainage)或使再利用紙脫墨。尤其是，對所論及的工業(yè)用途而言，內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)構(gòu)成了有意義的一組水解酶。內(nèi)切葡聚糖酶催化下列鍵的內(nèi)切水解纖維素、纖維素衍生物(如羧基甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-配糖鍵；混合的β-1，3葡聚糖(如谷類β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖)和其它含纖維素部分的植物材料中的β-1，4鍵。公認(rèn)的名稱是內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖基(glucano)水解酶，本發(fā)明中使用縮寫術(shù)語內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)?？梢詤⒁奣.-M.Enveri，＂微生物纖維素酶＂W.M.Fogarty，微生物酶和生物技術(shù)，應(yīng)用科學(xué)出版社，p.183-224(1983)；酶學(xué)方法，(1988)Vol.160，p.200-391(Wood，W.A.和Kellogg，S.T.編)；Béguin，P.，＂纖維素降解的分子生物學(xué)，微生物學(xué)年評(1990)，Vol.44，pp.219-248；Béguin，P.和Aubert，J-P.，＂纖維素的生物降解＂，F(xiàn)EMS微生物學(xué)回顧13(1994)p.25-58；Henrissat，B.，＂纖維素酶和它們與纖維素的相互作用＂，纖維素(1994)，Vol.1，pp.169-196。許多出版物中已描述了真菌內(nèi)切葡聚糖酶，特別是來源于例如尖鐮孢、Trichodermareesei，Trichodermalongibrachiatum，棘孢曲霉，Neocallimastixpatriciarum和例如Piromyces、腐質(zhì)霉屬，毀絲霉屬，Geotricum，青霉屬，耙菌屬，鬼傘屬的種的那些內(nèi)切葡聚糖酶。例如，真菌內(nèi)切葡聚糖酶已由下列文獻(xiàn)描述SheppardP.O.，等，用保守纖維素酶家族-特異性的序列從尖鐮孢克隆纖維素酶同系物cDNA，基因，(1994)，vol.15，pp.163-167；Saloheimo，A.，等，＂在酵母中表達(dá)的Trichodermareesei的新小內(nèi)切葡聚糖酶基因egI5＂，分子微生物學(xué)，(1994)vol.13(2)，pp.219-228；vanArsdell，J.N.等，(1987)，Trichodermareesei在啤酒糖酵母內(nèi)切葡聚糖酶I的克隆，特征確定和表達(dá)，生物/技術(shù)560-64；Penttil_，M.等，(1986)，＂Trichodermareesei纖維素酶基因之間的同源性內(nèi)切葡聚糖酶I基因的完整的核苷酸序列＂，基因45253263；Saloheimo，M.等，(1988)，＂EGIII，一種新的Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶基因和酶兩者的鑒定＂，基因63112l；Gonzales，R.等.，＂Trichodermalongibrachiatumegll基因的克隆、序列分析和酵母表達(dá)＂，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)，(1992)，vol.38，pp.370-375；Ooi，T.等棘孢曲霉纖維素酶(FI-CMCase)cDNA的克隆和序列分析＂，Curr.Genet.，(1990)，vol.18，pp.217222；Ooi，T.等，編碼棘孢曲霉纖維素酶(FI-CMCase)的基因的完整的核苷酸序列＂，核酸研究，(1990)，vol.18，No.19，P.5884；Xue，G.等，＂多種厭氧瘤胃真菌Neocallimastixpatriciarum纖維素酶cDNA在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)＂，J.Gen.Microbiol.，(1992)，vol.138，pp.1413-1420；XueG.等，＂編碼具有高內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和木聚糖酶活性的三個多功能催化區(qū)的Neocallimastixpatriciarum的新的多糖類水解酶cDNA(celD)＂，J.Gen.Microbiol.，(1992)，vol.138，pp.2397-2403；Zhou，L.等，＂來源于厭氧真菌Neocallimastixpatriciarum的編碼模式家族內(nèi)切葡聚糖酶的無內(nèi)含子celB″，生物化學(xué)雜志，(1994)，vol.297，pp.359364；Dalbφge，H.和Heldt-Hansen，H.P.，＂有效表達(dá)克隆真菌酶基因的新方法＂，Mol.Gen.Genet.，(1994)，vol.243，pp.253260；Ali，B.R.S.等，＂厭氧真菌Piromyces纖維素酶和半纖維素酶構(gòu)成多蛋白纖維素-結(jié)合復(fù)合物和由多基因族編碼＂，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊，(1995)，vol.125，No，1，pp.15′-21。此外，日本DNA數(shù)據(jù)庫(公眾可從Internet上獲得的DDBJ數(shù)據(jù)庫)包括從微紫青霉克隆的編碼內(nèi)切葡聚糖酶的兩個DNA序列(分別由A.Koch和G.Mernitz克隆)和從灰腐質(zhì)霉變種thermoidea克隆的編碼內(nèi)切葡聚糖酶DNA序列(由T.Uozumi克隆)。兩種Macrophominaphaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶已被克隆和測序，參見Wang，H.Y.和Jones，R.W.＂植物致病真菌Macrophominaphaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶-編碼基因的克隆，特征確定和功能性表達(dá)＂，基因，158125128，1995；和Wang，H.Y.和Jones，R.W.＂從植物致病真菌Macrophominaphaseolina克隆的單一內(nèi)切葡聚糖酶-編碼基因＂，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)，612004-2006，1995。這些內(nèi)切葡聚糖酶中的一個顯示與真菌Trichodermareeseieg13內(nèi)切葡聚糖酶的高同源性，另一個顯示與微生物植物病原體Pseudomonassolanacearumeg11的同源性，說明兩種內(nèi)切葡聚糖酶都屬于糖基水解酶5族(B.Henrissat，生物化學(xué)J280309-316(1991))。SchauweckerF.等(1995)公開了二態(tài)真菌玉米黑粉菌的纖維素酶基因的絲-特異性(filament-specific)表達(dá)。WO91/17243(NordiskA/S)公開了一種纖維素酶制劑，該制劑由與抗高度純化的43kDa內(nèi)切葡聚糖酶(得自HumicolainsolensDSM1800)的抗體免疫反應(yīng)性的同源內(nèi)切葡聚糖酶組成。WO91/17244(NordiskA/S)公開了一種新的(半)纖維素降解酶，如內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或β-葡糖苷酶，其可以來源于非木霉屬和展齒革菌屬的真菌；WO93/2019321公開了可以從棘孢曲霉獲得的內(nèi)切葡聚糖酶；WO94/21801(Genencor公司)涉及一種纖維素酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)是從顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的Trichodermalongibrachiatum分離到的；WO94/26880(GistBrocadesN.V.)公開了一種分離的纖維素降解酶混合物(優(yōu)選地是從木霉屬、Rspergillus或Disporotrichum獲得的)，其具有內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和木糖葡聚糖酶活性；WO95/02043(NordiskA/S)描述了一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的來源于Trichodermaharzianum的酶，該酶可以用于許多目的，包括例如植物細(xì)胞壁的降解或修飾。已知纖維素酶可以也可以不具有纖維素結(jié)合域(CBD)。CBD增加酶對包含纖維素纖維的結(jié)合，并增加酶的催化活性部分的功效。仍然需要提供可以用于需要纖維素酶尤其是內(nèi)切葡聚糖酶活性的場合的新的纖維素酶制劑。本發(fā)明的目的是提供新的酶制劑，該酶制劑實(shí)質(zhì)上在酸性、中性或堿性條件下具有溶纖活性，并在紙漿處理，織物處理和洗衣過程中或者在動物飼養(yǎng)中具有改進(jìn)的功效，優(yōu)選地是新的纖維素酶，更優(yōu)選地是性能良好的內(nèi)切葡聚糖酶的酶制劑，所述酶被嘗試由重組技術(shù)生產(chǎn)或產(chǎn)生。發(fā)明概述令人驚奇地是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一組內(nèi)切葡聚糖酶具有某些獨(dú)特的特征，在通常使用內(nèi)切葡聚糖酶的那些工業(yè)應(yīng)用中性能良好。這些獨(dú)特的特征可以以酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的保守區(qū)進(jìn)行描述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，具有某些保守區(qū)的溶纖酶(即顯示溶纖活性的酶)在處理要洗的衣物、處理新制造的織物和處理造紙紙漿中十分有效。因此，本發(fā)明第一方面涉及一種酶制劑，該制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶包含具有以下序列的由14個氨基酸殘基組成的第一氨基酸序列ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二氨基酸序列TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10、12和14號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個，其條件是在第一氨基酸序列中，(i)當(dāng)12號位置上的氨基酸殘基是Ser時，14號位置上的氨基酸殘基不是Ser，和(ii)當(dāng)12號位置上的氨基酸殘基是Gly時，14號位置上的氨基酸殘基不是Ala。盡管在性能良好的內(nèi)切葡聚糖酶內(nèi)發(fā)現(xiàn)其它相當(dāng)顯著的變異，但可清楚識別保守區(qū)的這一驚人的發(fā)現(xiàn)是大量真菌DNA序列研究的結(jié)果，所述DNA序列編碼具有有效的溶纖(尤其是內(nèi)切葡聚糖酶)活性之酶的特定氨基酸序列?；谶@一發(fā)現(xiàn)，開發(fā)了一種用于特異性篩選以編碼本發(fā)明的酶為特征的基因組DNA或cDNA的分子方法。構(gòu)建了作為其工具的三套簡并引物。因此，本發(fā)明在其第二方面涉及提供編碼具有上述保守區(qū)之溶纖酶基因的方法。通過使用這種方法(即供基因組DNAPCR篩選的引物套)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)編碼所述酶的DNA可以從寬范圍的真菌中發(fā)現(xiàn)，所述真菌屬于分類學(xué)上很不相同的生物體，并且棲息于生態(tài)學(xué)上十分不同的小生境中。進(jìn)一步地，通過使用這一方法，發(fā)現(xiàn)編碼所述酶核心區(qū)(催化活性區(qū)或域)而無任何連接的纖維素結(jié)合域(CBD)之DNA序列已經(jīng)可能，所述酶的核心區(qū)將不通過采用基于篩選方法的常規(guī)手段來選擇。發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CBD區(qū)與本發(fā)明的酶核心區(qū)(包括所述酶的催化活性區(qū)或域)的連接導(dǎo)致多域酶的功效明顯改善，例如，高出50倍的功效。因此，本發(fā)明提供了新的纖維素酶，尤其內(nèi)切葡聚糖酶，以其天然形式或者同源或異源形式產(chǎn)生的這些酶在工業(yè)應(yīng)用中具有改善的功效。另一方面，本發(fā)明涉及新的溶纖酶制劑，該制劑是可以從分類學(xué)上的特定門(phyli)、綱、目、科、屬和種產(chǎn)生的，例如可以從擔(dān)子菌門的(Basidiomycotous)層菌綱(Hymenomycetes)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)；或從綱盤菌綱(Discomycetes)、腔菌綱(腔菌綱)、不整囊菌綱(Plectomycetes)；Archaeascomycetes、半子囊菌綱(Hemiascomycetes)或者從間座殼目、炭角菌目(Xylariales)、假毛球殼目(Trichosphaeriales)、黑痣菌目(Phyllachorales)或從科叢赤殼科(Nectriaeae)、糞殼科(Sordariaceae)、毛殼科(Chaetomiaceae)、Ceratostomaceae、毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)；或從屬柱孢屬(Cylindrocarpon)、粘帚霉屬(Gliocladium)、周刺座霉屬(Volutella)、Scytalidium、頂孢霉屬(Acremonium)、或從種番茄鐮孢(Fusariumlycopersici)、Fusariumpassiflora、腐皮鐮孢(Fusariumsolani)、蛇形鐮孢(Fusariumanguioides)、早熟禾鐮孢(Fusariumpoae)、黑腐質(zhì)霉(Humicolanigrescens)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)產(chǎn)生的，尤其是實(shí)質(zhì)上由包含選自以下序列的氨基酸序列的酶組成的那些XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567；XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567；和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和在1和7號位置上，Xaa是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。更具體地說，本發(fā)明的酶制劑優(yōu)選地是可以從以上提到的分類學(xué)上的特定門(phyli)、綱、目、科、屬和種產(chǎn)生的，所述的所有微生物都產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶，該酶包含具有以下序列的由13個氨基酸殘基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。本發(fā)明另一方面提供了包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列之DNA構(gòu)建體，所述DNA序列包含分別在SEQIDNO1、4、5、10、12、16和19中所示的DNA序列或者它們的類似物。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體；涉及包含本發(fā)明DNA構(gòu)建體或重組表達(dá)載體的細(xì)胞；涉及產(chǎn)生本發(fā)明酶(例如，重組體酶)的方法；涉及通過使用本發(fā)明的酶使要洗的衣物顏色澄清的方法；涉及包含本發(fā)明的酶的洗衣組合物；涉及本發(fā)明的酶在降解或改性植物材料(例如細(xì)胞壁)，處理織物原料、織物或衣物，處理紙漿中的用途；并涉及富含本發(fā)明的酶的酶制劑。附圖簡要描述圖1是下列微生物的推定編碼的氨基酸序列的序列對比Acremoniumsp.(I)，Volutellacolletotrichoides，Crinipellisscabella，Acremoniumsp.(II)，Myceliophthorathermophila，Thielaviaterrestris，Macrophominaphaseolina。用Pileup程序(Feng和Doolittle1987)(GCG包，版本8.0)產(chǎn)生最好的序列對比。在至少四個序列中相同的殘基(方框中)在相應(yīng)的氨基酸周圍表示出來。圖2圖2a，b，c說明在真菌界內(nèi)的本文所討論的所有微生物(其能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶制劑和酶)的分類學(xué)分類。本文使用的分類學(xué)分類基于用于NIH數(shù)據(jù)庫(Entrez1996春天版)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以從WorldWideWeb(http//www3.nebi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX)獲得。對未包含在Entrez數(shù)據(jù)庫中的生物體的分類，使用了下列一般可獲得的和世界范圍內(nèi)接受的參考書對于子囊菌綱(Ascomycetes)Eriksson，O.E.&amp;Hawksworth，D.L.子囊菌綱系統(tǒng)，vol12(1993)。對于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)Jülich，W，擔(dān)子菌綱的較高分類群，BibliothecaMycologia85，485pp(1981)。對于接合菌綱O′Donnell，K.培養(yǎng)中的接合菌綱，佐治亞大學(xué)，美國，257pp(1979)。一般性的微生物學(xué)參考書Hawksworth，D.L.，Kirk，P.M.，Sutton，B.C.和Pegler，D.N.真菌詞典，國際真菌學(xué)研究所，616pp(1995)；VonArx，J.A，培養(yǎng)中形成孢子的真菌屬，424pp(1981)。迄今仍不清楚腐質(zhì)霉屬(Humicola)的分類學(xué)位置(implacement)。然而，糞殼目(Sordariales)廣泛選擇的18SRNA的研究已給出腐質(zhì)霉屬歸于糞殼目的有力的提示(Taylor，Clausen&amp;Oxenbφ11，未發(fā)表)。此外，這些數(shù)據(jù)表明腐質(zhì)霉屬與蛾柱霉屬(Scytalidium)一起與糞殼科、毛殼科，長喙殼科(Ceratostomataceae)和毛球殼科僅有相當(dāng)遠(yuǎn)的關(guān)系。依據(jù)上述，在這里將腐質(zhì)霉屬和Scytalidium置于糞殼目內(nèi)，科未知。圖3是推定的部分氨基酸序列的序列對比，所述序列來源于實(shí)施例5中描述的46種微生物中選擇的26種。發(fā)明詳述在本文中，術(shù)語“20種天然氨基酸殘基”指通常在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸殘基，照慣例被認(rèn)為是丙氨酸(Ala或A)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Ieu或L)、異亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或5)、蘇氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、天門冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、和組氨酸(His或H)。按照本發(fā)明，本發(fā)明提供了新的性能良好的內(nèi)切葡聚糖酶，其包含保守氨基酸序列區(qū)，尤其是具有以下序列的由14個氨基酸殘基組成的第一氨基酸序列ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二氨基酸序列TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10、12和14號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個，其條件是在第一氨基酸序列中，(i)當(dāng)12號位置上的氨基酸殘基是Ser時，14號位置上的氨基酸殘基不是Ser，和(ii)當(dāng)12號位置上的氨基酸殘基是Gly時，14號位置上的氨基酸殘基不是Ala。優(yōu)選地，本發(fā)明的酶是微生物來源的，即是可以從微生物(如真菌)獲得的。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一序列的9號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、并亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地選自脯氨酸和蘇氨酸。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一序列的10號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地是絲氨酸。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，在第一序列的12號位置上氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地選自丙氨酸和甘氨酸。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一序列的14號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，優(yōu)選地選自脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。優(yōu)選地，在第二序列的4號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，更優(yōu)選地選自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。更優(yōu)選的實(shí)施方案的例子是這樣的一些，其中，在第一序列中，第3號位置上的氨基酸殘基是酪氨酸；或在第4號位置上的氨基酸殘基是色氨酸；或在第8號位置上的氨基酸殘基是賴氨酸。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶包括選自以下序列的氨基酸序列ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysAlaTrp12345678910111213，ThrArgTyrTrpAspCysCysLysThrSerCysAlaTrp12345678910111213，和ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysGlyTrp12345678910111213.在第二方面，本發(fā)明提供了用于發(fā)現(xiàn)和克隆編碼這種酶的基因的方法，該方法包括在標(biāo)準(zhǔn)條件下與來源于任何保守區(qū)的寡核苷酸雜交(例如PCR擴(kuò)增)，如圖1所說明的。一種有用的寡核苷酸包含編碼包含在選自以下序列的肽中的至少五肽的核苷酸序列a.ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314在3或4在號位置上的氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在8號位置上的氨基酸是Arg、Lys或His；在9、10、12和14號位置上的氨基酸分別是20個天然氨基酸殘基中的任何一個；和b.TrpCysCysXaaCysTyr123456在4號位置上的氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個；和c.XaaProGlyGlyGlyXaaGlyXaaPhe1234567891號位置上的氨基酸是Met或Ile；6和8號位置上的氨基酸分別是Leu、Ile或Val；和d.GlyCysXaaXaaArgXaaAspTrpXaa123456789在3號位置上的氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個；在4和6號位置上的氨基酸分別是Trp、Tyr或Phe；并且在9號位置上的氨基酸是Phe或Met。所述有用的寡核苷酸也包括與以上所述序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸相應(yīng)于選自以下PCR引物的PCR引物有義，5’-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’反義1，5’-CTAGTCTAGATAA/GCAIGCA/GCAA/GCACC-3’；反義2，CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/GICCICCICCIGG-3’；和反義3，5’-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/GA/TAICG/TCC-3.在第三方面，本發(fā)明提供了一種酶制劑，該制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性和具有發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的保守區(qū)的酶組成，該酶包含具有下列序列的由7個氨基酸序列組成的肽XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567；和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和在1和7號位置上，Xaa是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。這種酶是可以從屬于擔(dān)子菌門的層菌綱菌株優(yōu)選地屬于蘑菇目、木耳目和非褶菌目的菌株，更優(yōu)選的屬于黑耳科、口蘑科、鬼傘科、裂褶菌科、煙管菌科和多孔菌科的菌株，特別是屬于黑耳屬、毛皮傘屬、層孔菌屬、斑褶菇屬、栓菌屬、裂褶菌屬和綿皮孔菌屬的菌株獲得的(參見圖2)。特定的例子是可以從屬于黑膠耳、Crinipellisscabella、木蹄層孔菌和Spongipellissp.的菌株，特別是可以從黑膠耳CBS277.96、CrinipellisscabellaCBS280.96、木蹄層孔菌CBS276.96和Spongipellissp.CBS283.96獲得的內(nèi)切葡聚糖酶。按照布達(dá)佩斯條約，黑膠耳于1996年3月12日以保藏號CBS277.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷蘭；Crinipellisscabella于1996年3月12日以保藏號CBS280.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷蘭；木蹄層孔菌于1996年3月12日以保藏號CBS276.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷蘭；Spongipellissp.于1996年3月12日以保藏號CBS283.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷蘭。本發(fā)明的酶制劑是也可以從屬于壺菌門的菌株，優(yōu)選地屬于壺菌綱的菌株，更優(yōu)選地屬于Spizellomycetales目的菌株，特別優(yōu)選地屬于Spizellomycetaceae科的菌株，尤其是屬于囊壺菌屬的菌株獲得的。所說菌株的特定的例子是屬于紅根囊壺菌的菌株，尤其是紅根囊壺菌CBS282.96。按照布達(dá)佩斯條約，紅根囊壺菌于1996年3月12日以保藏號CBS282.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷蘭。本發(fā)明的酶制劑也可以從屬于接合菌門的菌株，優(yōu)選地從屬于接合菌綱的菌株，更優(yōu)選地從毛霉目的菌株，尤其是從屬于毛霉科和枝霉科的菌株，尤其是屬于根毛霉屬、須霉屬和刺枝霉屬的菌株獲得。特定菌株的例子是屬于Rhizomucorpusillus，閃光須霉和弗雷生刺枝霉的菌株，特別是RhizomucorpusillusIFO4578、閃光須霉IFO4814和弗雷生刺枝霉NRRL2305。此外，本發(fā)明的酶制劑也可以從屬于Archaeascomycetes、盤菌綱，半子囊菌亞綱，腔菌綱和不整囊菌綱的菌株，優(yōu)選地從屬于由盤菌目、斑痣盤菌目(Rhytismatales)、座囊菌目和散囊菌目的菌株獲得。尤其是所述酶可以從屬于葫蘆霉科、糞盤菌科、斑痣盤菌科和發(fā)菌科的菌株，優(yōu)選地從屬于色二孢屬、Microsphaeropsis、Ulospora、殼球孢屬，糞盤菌屬，Saccobolus、青霉屬和Thermomyces的菌株獲得。特定的例子是可以從以下菌株獲得的酶，所述菌株是屬于由棉色二孢、Microsphaeropsissp.、Ulosporabilgramii、Aureobasidiumsp.、Macrophominaphaseolina、Ascobolusstictoides、Saccobolusdilutellus、盤菌屬(Peziza)、疣孢青霉、產(chǎn)黃青霉和Thermomycesverrucosus的菌株，特別是棉色二孢CBS274.96、UlosporabilgramiiNKBC1444、MacrophominaphaseolinaCBS281.96、SaccobolusdilutellusCBS275.96、疣孢青霉ATCC62396、產(chǎn)黃青霉ATCC9480和ThermomycesverrucosusCBS285.96。按照布達(dá)佩斯條約，棉色二孢于1996年3月12日以保藏號CBS274.96保藏在真菌菌種保藏中心；Macrophominaphaseolina于1996年3月12日以保藏號CBS281.96保藏在真菌菌種保藏中心；Saccobolusdilutellus于1996年3月12日以保藏號CBS275.96保藏在真菌菌種保藏中心；Thermomycesverrucosus于1996年3月12日以保藏號CBS285.96保藏在真菌菌種保藏中心。此外，所述酶可以從屬于間座殼目、炭角菌目、假毛球殼目和黑痣菌目的菌株，優(yōu)選地從屬于炭角菌科、黑腐皮殼科和Phyllachoraceae的菌株，更優(yōu)選地從屬于由間座殼屬、刺盤孢屬、黑孢屬、炭角菌屬、Nodulisporum和孔座殼屬的菌株獲得。特定的菌株的例子是屬于Diaporthesyngenesia、葫蘆科刺盤孢、鹿角團(tuán)炭角菌、Nigrosporasp.、Nodulisporumsp.和點(diǎn)孔座殼的菌株，特別是DiaporthesyngenesiaCBS278.96、葫蘆科刺盤孢ATCC52609、Nigrosporasp.CBS272.96、鹿角團(tuán)炭角菌CBS284，96。按照布達(dá)佩斯條約，Diaporthesyngenesia于1996年3月12日以保藏號CBS278.96保藏在真菌菌種保藏中心；Nigrosporasp.于1996年3月12日以保藏號CBS272.96保藏在真菌菌種保藏中心；鹿角團(tuán)炭角菌于1996年3月12日以保藏號CBS284.96保藏在真菌菌種保藏中心。所述酶也可從按照布達(dá)佩斯于1996年3月12日分別以保藏號CBS270.96、CBS271.96和CBS273.96保藏在真菌菌種保藏中心的未鑒別的真菌(有絲分裂孢子的，coleomycetous)獲得。所述酶也可從以下菌株獲得，所述菌株是屬于柱孢屬、粘帚霉屬、赤殼屬、周刺座霉屬、糞殼屬、Scytalidium、梭孢殼屬、Syspastospora、Cladorrhinum、毛殼屬、Myceliphthora和頂孢霉屬的菌株，特別是屬于Cylindrocarponsp.、Nectriapinea、Volutellacolletotrichoides、糞生糞殼、大孢糞殼、Thielaviaterrestris、Thielaviathermophila、Syspastosporaboninensis、Cladorrhinumfoecundissimum、墻毛殼、Chaetomiumvirescens、Chaetomiumbrasiliensis、Chaetomiumcunicolorum、Myceliophthorathermophila、鏈孢粘帚霉、Scytalidiumthermophila和Acremoniumsp的菌株，尤其是NectriapineaCBS279.96、VolutellacolletotrichoidesCBS400.58、糞生糞殼ATCC52644、大孢糞殼ATCC60255、ThielaviaterrestrisNRRL8126、ThielaviathermophilaCBS174.70、墻毛殼CBS163.52、ChaetomiumvirescensCBS547.75、ChaetomiumbrasiliensisCBS122.65、ChaetomiumcunicolorumCBS799.83、SyspastosporaboninensisNKBC1515、CladorrhinumfoecrundissimumATCC62373、MyceliophthorathermophilaCBS117.65、ScytalidiumthermophilaATCC28085、鏈孢粘帚霉ATCC10523和Acremoniumsp.CBS478.94。按照布達(dá)佩斯條約，Nectriapinea于1996年3月12日以保藏號CBS279.96保藏在真菌菌種保藏中心；Acremoniumsp.于1994年9月28日以保藏號CBS478.94保藏。所述酶也可以從屬于腐皮鐮孢、蛇形鐮孢、早熟禾鐮孢、尖鐮孢ssp.lycopersici、尖鐮孢ssp.passiflora、黑腐質(zhì)霉和灰腐質(zhì)霉的菌株，尤其是番茄尖鐮孢ssplycopersiciCBS645.78、尖鐮孢ssppassitloraCBS744.79、腐皮鐮孢IMI107.511、蛇形鐮孢IFO4467、早熟禾鐮孢ATCC60883、黑腐質(zhì)霉CBS819.73和灰腐質(zhì)霉ATCC22726獲得。應(yīng)當(dāng)注意灰腐質(zhì)霉不同于灰腐質(zhì)霉thermoidea變種。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶制劑來源于所公開的綱、目、科、屬和種，并且實(shí)質(zhì)上由下述酶組成，所述酶包含具有以下序列的由13個氨基酸殘基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。優(yōu)選地，在第一序列的9號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，更優(yōu)選地選自脯氨酸和蘇氨酸；在第一序列的10號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地是絲氨酸；在第一序列的12號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地選自丙氨酸和甘氨酸；在第二序列的4號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，更優(yōu)選地選自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。另一方面，本發(fā)明提供了一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的類似物或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)與分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10512已于1996年2月2日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10511已于1996年2月2日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10571已于1996年3月6日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10576已于1996年3月12日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10583已于1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10584已于1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10585已于1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10586已于1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10587已于1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM10588已于1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM9770已于1995年2月24日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM10082已于1995年6月30日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM10080已于1995年6月30日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM10081已于1995年6月30日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)。與SEQIDNO1有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從毀絲霉屬的菌株，特別是M.thermophila的菌株，尤其是M.thermophilaCBS117.65的DNA文庫分離或者基于該文庫產(chǎn)生。與SEQIDNO4和6有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從頂孢霉屬的菌株，尤其是Acremoniumsp.CBS478.94的DNA文庫分離或者基于該文庫產(chǎn)生。與SEQIDNO8有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從梭孢殼屬的菌株，特別是Thielaviaterrestris的菌株，尤其是ThielaviaterrestrisNRRL8126的DNA文庫分離或者基于該文庫產(chǎn)生。與SEQIDNO10有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從殼球孢屬的菌株，特別是M.phaseolina的菌株，尤其是M.phaseolinaCBS281.96的DNA文庫分離或者基于該文庫產(chǎn)生。與SEQIDNO12有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從毛皮傘屬的菌株，特別是C.scabella的菌株，尤其是C.scabellaCBS280.96的DNA文庫分離或者基于該文庫產(chǎn)生。與SEQIDNO19有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從糞殼屬的菌株，特別是糞生糞殼的菌株的DNA文庫分離或者基于該文庫產(chǎn)生。在本發(fā)明中，分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的＂類似物＂意指任何編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列，其具有性質(zhì)i)-iv)的任一或全部。類似的DNA序列a)可以基于分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列，采用例如本文所公開的方法，從產(chǎn)生具有內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的其它或者相關(guān)(例如，相同)生物體分離；同系物可以是包含本文所示的DNA序列的DNA序列的等位變體，即經(jīng)突變產(chǎn)生的基因的另一種形式。突變可以是沉默的(在編碼的酶上無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的酶；所述DNA序列的同系物也可以是屬或種同系物，編碼來源于另一個種的具有類似性質(zhì)的酶。b)可以基于分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列構(gòu)建，例如通過引入不產(chǎn)生另一個由所述DNA序列編碼的內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列(但其相應(yīng)于用于產(chǎn)生所述酶的生物體的密碼子使用)的核苷酸取代，和能夠產(chǎn)生一種不同的氨基酸序列的核苷酸取代。然而，在后一種情況下，氨基酸的變化優(yōu)選地是次要性質(zhì)的改變(其是保守氨基酸取代，不明顯地影響蛋白質(zhì)的折疊或活性)、小的缺失(典型地是1到約30個氨基酸)；小的氨基-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨酸殘基)，至大約20-25個殘基的小的接頭肽或有利于純化的小的延伸(如聚-組氨酸束，抗原表位或結(jié)合域)，總的情況參見Ford等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，295-107，1991。保守取代的例子在下列氨基酸的范圍內(nèi)堿性氨基酸(如精氨酸，賴氨酸，組氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以進(jìn)行這樣的取代，其在對所述分子的功能關(guān)鍵性的區(qū)域之外，并且仍然產(chǎn)生活性多肽?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法鑒別對本發(fā)明的DNA構(gòu)建體編碼的多肽之活性必需的氨基酸，所述方法例如定向誘變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)244，1081-1085，1989)。在后一技術(shù)中，在分子中的任何殘基上引入突變，試驗(yàn)形成的突變體分子的生物學(xué)(即內(nèi)切葡聚糖酶)活性，以鑒別對所說分子活性關(guān)鍵性的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也可以通過晶體結(jié)構(gòu)(由核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光親和性標(biāo)記法之類的技術(shù)測定的)分析測定。參見例如deVos等，科學(xué)255306-312，1992；Smith等，分子生物學(xué)雜志.224899-904，1992；Wlodaver等，F(xiàn)EBSLett.30959-64，1992。由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的DNA序列編碼的內(nèi)切葡聚糖酶可以包括纖維素結(jié)合域(CBD)，以編碼完整酶一部分存在，或者其它來源的CBD可以引入進(jìn)內(nèi)切葡聚糖酶酶，由此產(chǎn)生酶雜合體。在本文中，術(shù)語＂纖維素-結(jié)合域＂應(yīng)如PeterTomme等“不溶性碳水化合物的酶促降解”中的“纖維素-結(jié)合域分類和性質(zhì)”，JohnN.SaddlerandMichaelH.Penner(編者)，ACS專題研討系列No.618，1996所定義的來理解。這一定義把120種以上的纖維素-結(jié)合域(CBD)分類成10個家族(I-X)，并且其說明CBD在各種酶中發(fā)現(xiàn)，如纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和殼多糖酶。CBD也在藻類中發(fā)現(xiàn)，例如，作為-非水解多糖類-結(jié)合的紅藻Porphyrapurpurea蛋白質(zhì)，參見PeterTomme等，同上。然而，大多數(shù)CBD來源于纖維素酶和木聚糖酶。CBD在蛋白質(zhì)的N或C末端或內(nèi)部發(fā)現(xiàn)。酶雜合體在本領(lǐng)域是已知的，參見例如WO90/00609和WO95/16782，并且可以通過將包含至少一種編碼纖維素-結(jié)合域的DNA片段(其帶有或不帶有接頭，與編碼目的酶的DNA序列連接)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中，并培養(yǎng)該宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基因來制備。酶雜合體可以用下式來描述CBD-MR-X，其中CBD是相應(yīng)于至少纖維素-結(jié)合域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)；MR是中間區(qū)(接頭)，和可以是化學(xué)鍵或者短的連接基團(tuán)，這些基團(tuán)優(yōu)選地具有約2至100個碳原子，更優(yōu)選地具有2至40碳原子；或者優(yōu)選地是約2至約100個氨基酸，更優(yōu)選地是2至40個氨基酸；X是由本發(fā)明的DNA序列編碼的多肽的N-末端或者C-末端區(qū)。以兩種序列之間的等同性的程度測定以上i)中提及的同源性，表示第一序列和第二序列的差別。同源性可以用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序合適地測定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物學(xué)雜志，48443-453，1970)。采用GAP和下列設(shè)置進(jìn)行DNA序列比較GAP產(chǎn)生罰分5.0和GAP延伸罰分0.3，所述DNA序列的編碼區(qū)顯示與分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列具有優(yōu)選地至少60％，更優(yōu)選地至少65％，更優(yōu)選地70％，更優(yōu)選地至少80％，尤其是至少90％的等同性程度。以上ii)中提及的雜交意指在某些特點(diǎn)的條件下(在此后的材料和方法中詳細(xì)描述)，類似的DNA序列雜交到編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列的相同探針上。所使用的寡核苷酸探針是相應(yīng)于分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列之內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列。以兩種序列之間的等同性的程度測定以上iii)中提及的同源性，表示第一序列和第二序列的差別。同源性可以用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序合適地測定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物學(xué)雜志，48443-453，1970)。采用GAP和下列設(shè)置進(jìn)行DNA序列比較GAP產(chǎn)生罰分3.0和GAP延伸罰分0.1，所述DNA序列的編碼區(qū)顯示與分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列具有優(yōu)選地至少55％，更優(yōu)選地至少60％，更優(yōu)選地65％，更優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少80％，尤其是至少90％的等同性程度。關(guān)于以上iv)提及的性質(zhì)，意指分別由從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576分離的DNA序列編碼和由用所說DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物體產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶酶，或者分別由Myceliophthorathermophila、Acremoniumsp.、Thielaviaterrestris、Macrophominaphaseolina、Crinipellisscabella、Volutellacolletotrichoides或糞生糞殼天然內(nèi)切葡聚糖酶?？梢杂靡韵虏牧虾头椒ú糠置枋龅姆椒y定免疫學(xué)反應(yīng)性。本發(fā)明的另一方面涉及具有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體、包含所說DNA構(gòu)建體和表達(dá)載體的細(xì)胞以及產(chǎn)生顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的方法，該方法包括在可以產(chǎn)生所說酶的條件下培養(yǎng)所說的細(xì)胞，并從培養(yǎng)物回收所說的酶。本發(fā)明的另一方面涉及一種顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，這種酶a)由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體編碼b)用本發(fā)明的方法產(chǎn)生c)與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體是免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。以上c)中提及的內(nèi)切葡聚糖酶可以是由從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576分離的DNA序列編碼和由用所說DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物體產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶，或者分別由Myceliophthorathermophila、Acremoniumsp.、Thielaviaterrestris、Macrophominaphaseolina、Crinipellisscabella、Volutellacolletotrichoides或糞生糞殼天然相應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶。一般地，在本文中，術(shù)語＂酶＂被理解為包括成熟蛋白質(zhì)或其前體形式以及其實(shí)質(zhì)上具有全長酶活性的功能性片段。此外，術(shù)語＂酶＂旨在包括所說酶的同系物。所述酶的同系物可以具有一個或多個氨基酸取代，缺失或者添加。這些變化優(yōu)選地是次要性質(zhì)的改變(其是保守氨基酸取代，不明顯地影響蛋白質(zhì)的折疊或活性)、小的缺失(典型地是1到約30個氨基酸)；小的氨基-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨酸殘基)，多至大約20-25個殘基的小的接頭肽或有利于純化的小的延伸(如聚-組氨酸束，抗原表位或結(jié)合域)，總的情況參見Ford等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，295-107，1991。保守取代的例子在下列氨基酸的范圍內(nèi)堿生氨基酸(如精氨酸，賴氨酸，組氨酸)，酸性的氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以進(jìn)行這樣的取代，其在對所述分子的功能關(guān)鍵性的區(qū)域之外，并且仍然產(chǎn)生活性酶。可以按照本領(lǐng)域已知的方法鑒別對本發(fā)明的DNA構(gòu)建體編碼的酶之活性必需的氨基酸，所述方法例如定向誘變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)244，1081-1085，1989)。在后一技術(shù)中，在分子中的任何殘基上引入突變，試驗(yàn)形成的突變體分子的生物學(xué)(即內(nèi)切葡聚糖酶)活性，以鑒別對所說分子活性關(guān)鍵性的氨基酸殘基。配體-受體相互作用的位點(diǎn)也可以通過晶體結(jié)構(gòu)(由核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光親和性標(biāo)記法之類的技術(shù)測定的)分析測定。參見例如deVos等，1992；Smith等，1992；Wlodaver等，1992。同系物可以是等位變體，即經(jīng)突變產(chǎn)生的基因的另一種形式或可以是由突變基因編碼的改變的酶(但具有與本發(fā)明的酶實(shí)質(zhì)上相同的活性)。由此突變可以是沉默的(編碼的酶無改變)或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的酶。所述酶的同系物也可以是屬或種同系物，即來源于另一物種的具有類似性質(zhì)的酶。所述酶的同系物可以通過本文描述的方法分離。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)分子篩選和克隆使用從合適的來源(例如任何本文提及的生物體)分離的基因組DNA或者雙鏈cDNA和基于本文公開的DNA序列和氨基酸序列制備的合成寡核苷酸引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行本發(fā)明的DNA序列的分子篩選。例如，合適的寡核苷酸引物可以是在材料和方法部分中所描述的引物。依據(jù)眾所周知的方法，在分子篩選中所產(chǎn)生的PCR片段可以被分離和亞克隆進(jìn)合適的載體中。經(jīng)例如菌落或者噬斑雜交，PCR片段可以用于篩選DNA文庫。酵母中的克隆表達(dá)可以通過一般性的方法分離編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的本發(fā)明的DNA序列，所述方法包括-在合適的載體中從合適的來源(例如任何本文提及的生物體)克隆DNA文庫，-用所說的載體轉(zhuǎn)化合適的酵母宿主細(xì)胞，-在合適的條件之下培養(yǎng)所說宿主細(xì)胞，以表達(dá)由DNA文庫中的克隆編碼的任何興趣酶，-通過測定由這些克隆產(chǎn)生的酶的任何內(nèi)切葡聚糖酶活性篩選陽性克隆，-從這些克隆分離編碼所述酶的DNA。在WO94/14953中進(jìn)一步公開了一般性的方法，該文獻(xiàn)的內(nèi)容本文一并參考。篩選方法更詳細(xì)的描述在以下實(shí)施例1中給出?？梢苑蛛x編碼酶的DNA序列，所述分離是例如通過篩選Macrophominaphaseolina、Crinipellisscabella、糞生糞殼或Volutellacolletotrichoides的cDNA文庫，并選擇表達(dá)合適的酶活性(即內(nèi)切葡聚糖酶活性)的克隆進(jìn)行分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1996年2月2日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascherodcrWeg16，D-38124Braunschweig，德國)的大腸桿菌DSM10512分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1996年2月2日保藏在DSM的大腸桿菌DSM10511分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1996年3月12日保藏在DSM的大腸桿菌DSM10576分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1996年3月6日保藏在DSM的大腸桿菌DSM10571分離；或者通過篩選MyceliphthorathermophilaCBS117.65、Acremoniumsp.CBS478.94或ThielaviaterrestrisNRRL8126的cDNA文庫，并選擇表達(dá)合適的酶活性(即內(nèi)切葡聚糖酶活性)的克隆進(jìn)行分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年2月24日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig，德國)的啤酒糖酵母DSM9770分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM10082分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM10080分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM10081分離。然后，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法(如實(shí)施例1中所描述的)從所述克隆分離合適的DNA序列。核酸構(gòu)建體本文使用的術(shù)語＂核酸構(gòu)建體＂旨在指任何cDNA、基因組DNA、合成DNA或者RNA來源的核酸分子。術(shù)語＂構(gòu)建體＂旨在指核酸區(qū)段，其可以是單鏈或雙鏈，并且其可以是基于編碼興趣酶的全部或部分天然核苷酸序列。所述構(gòu)建體可以含有可以不含有其它核酸區(qū)段。編碼本發(fā)明酶的核酸構(gòu)建體可以是基因組或cDNA來源的，例如通過制備基因組或者cDNA文庫，并按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見Sambrook等，1989)使用合成寡核苷酸探針經(jīng)雜交篩選編碼全部或部分酶的DNA序列獲得。編碼酶的核酸構(gòu)建體也可以用已建立的標(biāo)準(zhǔn)的方法經(jīng)合成制備，所述方法例如由Beaucage和Caruthers(1981)描述的氨基亞磷酸酯方法，或Matthes等(1984)描述的方法。按照氨基亞磷酸酯方法，在例如自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火，連接和在合適的載體中克隆。此外，所述核酸構(gòu)建體可以是合成和基因組，合成和cDNA或基因組和cDNA混合來源的，其是經(jīng)按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成、基因組或者cDNA來源的片段(相應(yīng)于完整的核酸構(gòu)建體的各種部分的片段)制備(以合適的方式)的。也可以采用特定的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)制備所述的核酸構(gòu)建體，例如按照美國專利4,683,202或Saiki等(1988)描述的方法制備。核酸構(gòu)建體優(yōu)選地是DNA構(gòu)建體，這一術(shù)語將一直用于本說明書與權(quán)利要求書中。重組載體包含編碼本發(fā)明的酶的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是任何易于進(jìn)行DNA操作的載體，載體的選擇常常取決于其所要引入的宿主細(xì)胞。這樣，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。另外，載體可以是這樣一種，當(dāng)其被引入宿主細(xì)胞時，整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，并且與其整合進(jìn)的染色體一道復(fù)制。所述載體優(yōu)選地是表達(dá)載體，在其中編碼本發(fā)明的酶的DNA序列可操作地連接到該DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加區(qū)段上。一般來說，表達(dá)載體是來自質(zhì)?；虿《綝NA的或可以包含它們的成分。術(shù)語＂可操作連接＂指所述區(qū)段排列得使它們對預(yù)期的目的協(xié)調(diào)起作用，例如轉(zhuǎn)錄在啟動子開始，并且經(jīng)由編碼酶的DNA序列進(jìn)行。啟動子可以是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性，并且可以來源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。用于酵母宿主細(xì)胞的合適的啟動子的例子包括來源于酵母糖解基因(Hitzeman等，生物化學(xué)雜志.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志，1(1982)，419-434)或酒精脫氫酶基因(Young等，化學(xué)品的基因工程和微生物學(xué)(Hollaender等，編者)，Plenum出版社，紐約，1982)的啟動子，或者TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，自然，304(1983)，652-654)啟動子。用于絲狀真菌細(xì)胞的合適的啟動子是例如ADH3啟動子(McKnight等，TheEMBOJ.4(1985)，2093-2099)或tpiA啟動子。其它有用的啟動子的例子是來源于編碼下列酶的基因的那些，所述酶是米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucormiehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。優(yōu)選的是TAKA-淀粉酶和gluA啟動子。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的合適的啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥淀粉酶基因、地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶基因、液解化淀粉桿菌BAN淀粉酶基因、枯草桿菌堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動子或噬菌體λPR或PL啟動子或者大腸桿菌lac、trp或tac啟動子。如果需要，編碼本發(fā)明的酶的DNA序列也可以可操作地與合適的終止子連接。本發(fā)明的重組載體還可以包含使得所述載體在所說的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述載體也可以包含選擇性標(biāo)記，例如，其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞缺陷的基因，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母TPI基因(由P.R.Russell，基因40，1985，pp.125-130描述)。對于絲狀真菌，選擇性標(biāo)記包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC。為了引導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，也可以在重組載體中包含分泌信號序列(也稱作前導(dǎo)序列、前序列原或前序列)，將分泌信號序列在正確的讀框中與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號序列一般被置于編碼酶的DNA序列的5′。分泌信號序列可以是通常與所述酶相關(guān)的或者可以是來源于編碼另一個分泌蛋白質(zhì)的基因的。為了從酵母細(xì)胞分泌，分泌信號序列可以編碼任何信號肽，該肽確保所表達(dá)的酶以有效的方向進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。信號肽可以是天然信號肽或其功能性部分，或者其可以是合成肽。已發(fā)現(xiàn)合適的信號肽是α-因子信號肽(參見美國專利4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶信號肽(參見0.Hagenbuchle等，自然2891981，pp.643-646)，修飾的羧肽酶信號肽(參見L.A.Vails等，細(xì)胞48，1987，pp.887-897)，酵母BAR1信號肽(參見WO87/02670)或酵母天冬氨蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等，酵母，6，1990，pp.127-137)。為了在酵母中有效地分泌，也可以將編碼前導(dǎo)肽的序列插入到信號序列的下游和編碼酶的DNA序列的上游。前導(dǎo)肽的功能在于允許所表達(dá)的酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被引導(dǎo)到達(dá)高爾基體，并進(jìn)一步到達(dá)分泌泡以便分泌到培養(yǎng)基中(即酶穿過細(xì)胞壁或至少穿過細(xì)胞膜進(jìn)入酵母細(xì)胞的周質(zhì)空間的輸出)。前導(dǎo)肽可以是酵母α-因子前導(dǎo)肽(其用途在例如US4,546,082，EP16201，EP123294，EP123544和EP163529中描述)。另外，前導(dǎo)肽可以是合成的前導(dǎo)肽，這就是說前導(dǎo)肽不是天然發(fā)現(xiàn)的。合成的前導(dǎo)肽可以按照例如WO89/02463或WO92/11378中的描述構(gòu)建。對于在絲狀真菌中的使用，所述信號肽可以方便地來源于編碼Aspergillussp.淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼Rhizomucormiehei脂酶或蛋白酶，Humicolalanuginosa脂酶的基因。所述信號肽優(yōu)選地是來源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸-穩(wěn)定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。分別用于連接編碼所述酶的DNA序列、啟動子以及可操作的終止子和/或分泌信號序列的方法和將它們插入到包含復(fù)制所需信息的合適載體中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見，例如，Sambrook等，以上引用的)。宿主細(xì)胞引入到宿主細(xì)胞的編碼所述酶的DNA序列對所說的宿主細(xì)胞而言可以是同源的或者是異源的。如果對宿主細(xì)胞是同源的，即由宿主細(xì)胞天然，則其典型地被可操作連接到另一啟動子或者(可用的話)另一分泌信號序列和/或終止子序列上，而不是在其天然環(huán)境中。術(shù)語＂同源的＂旨在包括編碼所說宿主細(xì)胞天然酶的cDNA序列。術(shù)語＂異源的＂旨在包括所說宿主細(xì)胞天然不表達(dá)的DNA序列。這樣，所說的DNA序列可以來源于另一個生物體，或者其可以是合成的序列。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體引入其中的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌，酵母，真菌和高等真核細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子是革蘭氏-陽性菌，例如芽胞桿菌屬的菌株(如枯草芽胞桿菌、地衣形芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、Bacillusalkalophilus、液解化淀粉桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽胞桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株)或鏈霉菌屬的菌株(例如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌的菌株)，或者革蘭氏-陰性菌，例如大腸桿菌?？梢杂靡阎椒ń?jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或者使用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌的轉(zhuǎn)化(參見Sambrook等，同上)。當(dāng)在細(xì)菌(如大腸桿菌)中表達(dá)酶時，酶可以被保留在細(xì)胞質(zhì)中(典型地是以被稱作包含體的不溶性顆粒)或由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)空間中。在前一種情況下，裂解細(xì)胞，回收顆粒并變性，此后經(jīng)稀釋變性劑使酶再折疊。在后一種情況下，可以經(jīng)裂解細(xì)胞從周質(zhì)空間回收所說酶，如通過超聲波或滲透沖擊以釋放周質(zhì)空間的內(nèi)含物并回收酶。合適的酵母細(xì)胞的例子包括Saccharomycesspp.或Schizosaccharomycesspp.的細(xì)胞，啤酒糖酵母或者克魯弗酵母的特定菌株。用于用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并且從此產(chǎn)生異源酶的方法在例如US4,599,311，US4,931,373，US4,870,008，5,037,743，和US4,845,075(所有這些本文一并參考)中有描述。轉(zhuǎn)化細(xì)胞由通過選擇性標(biāo)記確定的表型選擇。所述選擇性標(biāo)記一般是對藥物的抗性或者在缺少特殊營養(yǎng)物(例如亮氨酸)的情況下的生長能力。用于酵母的一個優(yōu)選的載體是US4,931,373中公開的POT1載體。編碼本發(fā)明的酶的DNA序列可以在信號序列和可有可無的前導(dǎo)序列之前，例如如以上所述的。合適的酵母細(xì)胞的例子是克魯維酵母屬(如乳酸克魯維酵母)、漢遜酵母屬(例如多形漢遜酵母)或畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母)的菌株(參見Gleeson等，遺傳微生物學(xué)雜志1321986，pp.34593465；US4,882,279)。其它真菌細(xì)胞的例子是絲狀真菌的細(xì)胞，例如Aspergillusspp.，Neurosporaspp.，F(xiàn)usariumspp.或Trichodermaspp.，尤其是米曲霉，構(gòu)巢曲霉，黑曲霉或禾谷鐮孢的菌株。EP272277和EP230023中描述了Aspergillusspp.用于表達(dá)蛋白質(zhì)的用途。尖鐮孢的轉(zhuǎn)化可以例如按照Malardier等，1989，基因78147-156的描述進(jìn)行。當(dāng)絲狀真菌用作宿主細(xì)胞時，其可以用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，通常是將所說DNA構(gòu)建體整合進(jìn)宿主染色體中以獲得重組體宿主細(xì)胞。這一整合一般被認(rèn)為是有利的，因?yàn)樗鯠NA構(gòu)建體很可能穩(wěn)定保持在細(xì)胞中。可以按照常規(guī)方法(如同源或者異源重組)將所述DNA構(gòu)建體整合進(jìn)染色體中。然后在可以表達(dá)所說酶的條件下在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)以上描述的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，接著從培養(yǎng)物中回收所形成的酶。用于培養(yǎng)所說細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何常規(guī)的適于培養(yǎng)所說宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如含有適當(dāng)補(bǔ)充物的最小或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可以從供應(yīng)商獲得或者可以按照出版的(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中)配方制備。然后，由所述細(xì)胞產(chǎn)生的酶可以用常規(guī)方法從培養(yǎng)基回收，所述方法包括經(jīng)離心和過濾從培養(yǎng)基分離宿主細(xì)胞，借助鹽(如硫酸銨)沉淀上層清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)組份，依據(jù)所述酶的類型，用各種色譜分離方法(如離子交換色譜，凝膠色譜，親合色譜)純化等。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生按照本發(fā)明的酶的方法，其中在可以產(chǎn)生所述酶的條件下培養(yǎng)合適的用編碼酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所形成的酶。用分類學(xué)和生態(tài)學(xué)進(jìn)行的酶篩選設(shè)計(jì)來檢測和選擇所說類型的興趣酶的象分子篩選之類的強(qiáng)有力的工具其自身仍不能滿足需要。為了使興趣發(fā)現(xiàn)的機(jī)會最大，在這一研究中將分子篩選方法與小心選擇待篩選的真菌組合。通過全面考慮真菌的鑒別法、分類學(xué)類別和種系發(fā)生關(guān)系進(jìn)行選擇。如果包括生態(tài)學(xué)方法，則可以僅進(jìn)一步地充分探討溶纖酶產(chǎn)生的分類學(xué)熱點(diǎn)。設(shè)計(jì)聰明的篩選和取得成功的選擇菌株和待研究的生態(tài)小生境需要適應(yīng)各種底物的全面的知識(尤其植物材料的腐生、神經(jīng)營養(yǎng)或活體營養(yǎng)降解)。本文所公開的分類學(xué)和生態(tài)學(xué)方法兩者的目標(biāo)都是在分子篩選程序中最多地發(fā)現(xiàn)所述酶。然而，仍然有幾百(或者如果包括了所有初期工作)幾千種真菌被培養(yǎng)，以便檢測本文報道的所說類型的溶纖酶的53個目標(biāo)?？梢园匆韵滤鲞M(jìn)行篩選和克隆材料和方法生物體列表啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081或大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576分別含有質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含在穿梭載體pYES2.0中的編碼本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶的全長DNA序列。大腸桿菌DSM10583、10584、10585、10586、10587和10588。棉色二孢Cooke菌株的保藏保藏號CBS274.96分類位置子囊菌門(Ascomycota)，腔菌綱，座囊菌目，葫蘆霉科Ulosporabilgramii(Hawksw等)Hawksw等菌株的保藏號NKBC1444，日本大學(xué)，(Prof.Tubaki保藏中心)分類位置子囊菌門，腔菌綱，座囊菌目，(科未分類)Microsphaeropsissp.分離自在中國云南省昆明植物園中生長的山茶的葉片(茶科，Guttiferales)分類位置子囊菌門，腔菌綱腔菌綱，座囊菌目，(科未分類)Macrophominaphaseolina(Tassi)Goidannich別名Rhizoctoniabataticola菌株的保藏保藏號CBS281.96分離自在泰國生長的Glycinemax(Leguminosa)cvCMM60的種子，1990分類位置子囊菌門，盤菌綱，斑痣盤菌目，斑痣盤菌科RscobolusstictoideusSpeg.分離自挪威，Svalbard，鵝糞分類位置子囊菌門，盤菌綱，盤菌目，糞盤菌科Saccobolusdilutellus(Fuck.)Sacc.菌株的保藏保藏號CBS275.96分類位置子囊菌門，盤菌綱，盤菌目，糞盤菌科疣孢青霉Peyronel物種的保藏號ATCC62396分類位置子囊菌門，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科產(chǎn)黃青霉Thom菌株的保藏號ATCC9480分類位置子囊菌門，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科ThermomycesverrucosusPugh等菌株的保藏保藏號CBS285.96分類位置子囊菌門，不整囊菌綱，散囊菌目，(科未分類；affiliation基于18SRNA，測序以及同源性)鹿角團(tuán)炭角菌L.exGreille菌株的保藏保藏號CBS284.96分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科點(diǎn)孔座殼(Fr.exL.)Fr.分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科Nodulisporumsp.分離自在中國云南省昆明植物園中生長的山茶的葉片(茶科，Guttiferales)分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科Cylindrocarponsp.分離自海上樣品，Bahamas分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，(科未分類)Acremoniumsp菌株的保藏保藏號CBS478.94分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科蛇形鐮孢Sherbakoff菌株的保藏號IFO4467分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科早熟禾鐮孢(Peck)Wr.物種的保藏號ATCC60883分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科腐皮鐮孢(Mart.)Sacc.emnd.Snyd&amp;Hans.菌株的保藏號IMI107.511分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科番茄尖鐮孢ssplycopersici(Sacc.)Snyd.&amp;Hans.菌株的保藏號CBS645.78分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科尖鐮孢ssppassiflora菌株的保藏號CBS744.79分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科鏈孢粘帚霉Gillman&amp;Abbott菌株的保藏號CBS227.48分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科NectriapineaDingley菌株的保藏保藏號CBS279.96分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，小赤殼科Volutellacolletotrichoides菌株的保藏號CBS400.58分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，肉座菌目，(科未分類)大孢糞殼Auerswald物種的保藏號ATCC60255分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，糞殼科糞生糞殼(Roberge)CesatietDeNotaris物種的保藏號ATCC52644分離自H.Dissing的糞，ISP，KU，丹麥分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，糞殼科灰腐質(zhì)霉Traeen物種的保藏號ATCC22726來源HatfieldPolytechnic分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，(科未分類)黑腐質(zhì)霉Omvik菌株的保藏號CBS819.73分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，(科未分類)Scytalidiumthermophilum(CooneyetEmerson)Austwick菌株的保藏號ATCC28085分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，(科未分類)ThielaviathermophilaFergusetSinden(別名Corynascusthermophilus)菌株的保藏號CBS174.70，IMI145.136分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科分離自蘑菇堆肥Thielaviaterrestris(Appinis)MallochetCain菌株的保藏號NRRL8126分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科CladorrhinumfoecundissimumSaccardoetMarchal物種的保藏號ATCC62373分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛球殼科分離自牙買加達(dá)拉斯山Selandinsp(Compositaceae，Asterales)的葉片Syspastosporaboninensis菌株的保藏號NKBC1515(日本大學(xué)，profeTubaki保藏中心)分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，Cerastomataceae管毛殼Fuckel菌株的保藏號CBS799.83分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科巴西毛殼BatistaetPotual菌株的保藏號CBS122.65分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科墻毛殼Corda菌株的保藏號CBS163.52分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科Chaetomiumvirescens(vonArx)Udagawa菌株的保藏號CBS547.75分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科Myceliophthorathermophila(Apinis)Oorschot菌株的保藏保藏號CBS117.65分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科Nigrosporasp菌株的保藏保藏號CBS272.96分離自在牙買加Christiana中生長的Artocarpusaltilis的葉片，Moraceae，Urticales分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，Trichosphaeriales，(科未分類)Nigrosporasp分離自云南昆明植物園的Pinusyuannanensis的葉片分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，假毛球殼目，Abietaceae，Pinales.Diaporthesyngenesia菌株的保藏保藏號CBS278.96分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，Diaporthales，黑腐皮殼科葫蘆科刺盤孢(Passerini)EllisetHalsted別名圍小叢殼orbiculare變種JenkinsetWinstead物種的保藏號ATCC52609分類位置子囊菌門，Pyrenomycetes，黑痣菌目黑膠耳Fr.菌株的保藏保藏號CBS277.96分類位置擔(dān)子菌門，層菌綱，木耳目，黑耳科Crinipellisscabella(ALb.Schw.Fr.)Murr菌株的保藏號CBS280.96分類位置擔(dān)子菌門，層菌綱，蘑菇目網(wǎng)紋斑褶菇(Fr.)Gill.菌株的保藏號CBS275.47分類位置擔(dān)子菌門，層菌綱，蘑菇目，鬼傘科木蹄層孔菌(L.)Fr.菌株的保藏保藏號CBS276.96分類位置擔(dān)子菌門，層菌綱，非褶菌目，F(xiàn)omitaceaeSpongipellissp.菌株的保藏保藏號CBS283.96分類位置擔(dān)子菌門，層菌綱，非褶菌目，煙管菌科(由18S序列和同源性分類學(xué)鑒別和相聯(lián)系)血紅栓菌(Fr.)Lloyd別名血紅多孔菌；血紅密孔菌(L.Fr.)菌株的保藏號AKU5062(京都大學(xué)培養(yǎng)物保藏中心)分類位置擔(dān)子菌門，非褶菌目，多孔菌科SchizophyllumcommuneFr.物種的保藏號ATCC38548分類位置擔(dān)子菌門，非褶菌目，裂褶菌科紅根囊壺菌(deBary&amp;Wor)Fischer菌株的保藏號CBS282.96分類位置壺菌門，壺菌綱，Spizellomycetales，SpizellomycetaceaeRhizomucorpusillus(Lindt)Schipper別名微小毛霉菌株的保藏號IFO4578物種的保藏號ATCC46883分類位置接合菌門，接合菌綱，毛霉目，毛霉科閃光須霉(Kunze)vanTieghem&amp;LeMonnier菌株的保藏號IFO4814物種的保藏號ATCC16327分類位置接合菌門，接合菌綱，毛霉目，毛霉科弗雷生刺枝霉vanTieghem&amp;LeMonnier別名.Helicostylumfresenii菌株的保藏號NRRL2305分類位置接合菌門，接合菌綱，毛霉目，rhamnidiaceae未分類的粉紅單端孢菌株的保藏號IFO5372Coniotheciumsp植物內(nèi)寄生菌，分離自在中國云南省昆明的未鑒別的高等植物的葉片未分類和未鑒別的菌株的保藏保藏號CBS271.96分離自牙買加Christiana生長Artocarpusaltilis(桑科，Urticales)的葉片菌株的保藏保藏號CBS273.96分離自牙買加達(dá)拉斯山生長的Pimentadioica(桃金娘科，Myrtales)的葉片菌株的保藏號CBS270.96分離自牙買加達(dá)拉斯山生長的Pseudocalymmaalliaceum(紫葳科，Solanales)葉片其它菌株大腸桿菌MC1061和DH10B。酵母菌株所使用的啤酒糖酵母菌株是W3124(MATα；ura3-52；leu2-3，112；his3-D200；pep4-1137；prclHIS3；prb1LEU2；cir+)。質(zhì)粒曲霉屬表達(dá)載體pHD414是質(zhì)粒p775(在EP238023中描述)的衍生物。pHD414的構(gòu)建在WO93/11249中有進(jìn)一步的描述。pYES2.0(Invitrogen)。pA2C477，pA2C193，pA2C357，pA2C371，pA2C385，pA2C475，pA2C488，pA2C502(參見實(shí)施例1、2、3和4)。分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的分離通過用本領(lǐng)域已知的方法(Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)經(jīng)抽提質(zhì)粒，可以分別從保藏的生物體啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081、大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576獲得全長DNA序列，這些全長DNA序列包含分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16或19中所示的編碼本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA序列。分子篩選本發(fā)明的纖維素酶的PCR引物四個簡并的含脫氧肌苷的寡核苷酸引物(有義；s和反義；as1、as2和as3)相應(yīng)于四個高度保守氨基酸區(qū)，這些區(qū)在Thielaviaterrestris纖維素酶、Myceliophthorathermophilum纖維素酶和兩種來源于Acremoniumsp.的纖維素酶的推定的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)，按照Myceliophthorathermophilum序列對殘基編號。在引物序列中脫氧肌苷由I表示，限制位點(diǎn)上有下劃線。2735NH2-ThrArgTyrTrpAspCysCysLysPro/Thr-COOHs5′-CCCCAAGCTTACIAGITACTGGGACTGCTGCAAAAC-3′HindIIICTTTTGC106111NH2-TrpCysCysAlaCysTyr-COOHasl3′-CCACAACACGIACAATAGATCTGATC-5′GGGXbaI145152NH2-ProGlyGlyGlyLeu/ValGlyIle/LeuPhe-COOHas23′-GGICCICCICCIAAICCIAAIAAAGATCTGATC-5′CGXbaIGT193198NH2-TrpArgPhe/TyrAspTrpPhe-COOHas33′-CCGCIAAACTAACCAAAAGATCTGATC-5′TTGGGXbaI經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行分子篩選基因組DNA和雙鏈cDNA的體外擴(kuò)增按照以下描述從5微克poly(A)+RNA定向合成雙鏈cDNA。按照Yelton等的描述分離基因組DNA。在PCR緩沖液中經(jīng)PCR擴(kuò)增約10至20ng雙鏈纖維素酶-誘導(dǎo)的cDNA或100至200ng選擇的真菌菌株的基因組DNA，所說緩沖液(10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.01％(w/v)明膠)包含200μM各dNTP和100pmol按以下組合的各簡并引物1)有義，5′-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’反義1，5’-CTAGTCTAGATAA/GCAIGCA/GCAA/GCACC-3’；或2)有義，5’-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’反義2，CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/CICCICCICCIGG-3’；或3)有義，5’-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’反義3，5’-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/GA/TAICC/TCC-3；一種DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)和2.5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，US)。采用以下循環(huán)方式進(jìn)行PCR的三十個循環(huán)在94℃變性1分鐘，64℃退火2分鐘，72℃延伸3分鐘。以HaeIII-消化的φX174RFDNA為大小標(biāo)記，通過在3％瓊脂糖凝膠(NuSieve，F(xiàn)MC)中的電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的10微升等分試樣。PCR產(chǎn)物的直接測序按照制造商的說明使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，US)純化PCR產(chǎn)物的80微升等分試樣。經(jīng)雙脫氧鏈-終止方法，使用50-150ng模板，Taq尾端脫氧循環(huán)測序試劑盒(Perkin-Elmer，USA)，熒光標(biāo)記的終止劑，和5pmol有義引物5′-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3′直接在純化的PCR產(chǎn)物上測定擴(kuò)增的PCR片段的核苷酸序列。按照Devereux等的描述對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆PCR片段的亞克隆將如以上所述所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物25微升等分試樣在0.8％低膠凝溫度瓊脂糖(SeaPlaqueGTG，F(xiàn)MC)凝膠上進(jìn)行電泳，從凝膠上切下相關(guān)的片段。通過添加0.1體積10×瓊脂糖酶緩沖液(NewEnglandBiolabs)和2單位/100微升熔化的瓊脂糖到樣品中，接著在45℃溫育1.5小時，經(jīng)瓊脂糖酶處理回收。用酚和三氯甲烷抽提樣品，經(jīng)添加2體積96％EtOH和0.1體積3MNaAc(pH5.2)沉淀。經(jīng)離心回收PCR片段，在70％EtOH中洗滌，干燥和再懸浮于20微升限制酶緩沖液(10mMTris-HCl，10mMMgCl2，50mMNaCl，1mMDTT)中。以HindIII和XbaI消化片段，用酚和三氯甲烷提取，經(jīng)2體積96％EtOH和2體積NaAc(pH5.2)沉淀回收，并亞克隆進(jìn)HindIII/XbaI-切割的pYES2.0載體中。篩選cDNA文庫和陽性克隆的特征確定。以相應(yīng)的隨機(jī)引導(dǎo)的(Feinberg和Vogelstein)32P-標(biāo)記的(＞1×10cpm/微克)PCR產(chǎn)物作為探針，經(jīng)菌落雜交(Sambrook，1989)篩選按以下所說構(gòu)建的啤酒糖酵母和大腸桿菌的cDNA文庫。于65℃在2×SSC(Sambrook，1989)、5×Denhardt′s溶液(Sambrook，1989)、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml變性鮭精DNA中進(jìn)行雜交20小時，接著于25℃在5×SSC(2×15分鐘)中、于65℃在2×SSC、0.5％SDS(30分鐘)中、于65℃在0.2×SSC、0.5％SDS(30分鐘)，最后于25℃在5×SSC(2×15分鐘)中洗滌。采用以下方法確定陽性cDNA克隆的特征，所述方法是用pYES2.0多接頭引物(Invitrogen，USA)測序cDNA插入物的末端，用雙脫氧鏈終止法(Sanger等)采用熒光標(biāo)記的終止劑測定兩條鏈的最長cDNA的核苷酸序列。按照制造商的說明，采用應(yīng)用生物系統(tǒng)373A自動測序儀，用Taq脫氧末端循環(huán)測序試劑盒(PerkinElmerUSA)和pYES2.0多接頭引物(Invitrogen，USA)或合成寡核苷酸引物測序Qiagen純化的質(zhì)粒DNA(QiagenUSA)。按照Devereux等描述的方法進(jìn)行序列數(shù)據(jù)分析。用硫氰酸胍進(jìn)行總RNA的抽提，接著經(jīng)5.7MCsCl墊層超離心法，采用WO94/14953中描述的方法經(jīng)寡(dT)-纖維素親合色譜法進(jìn)行poly(A)+RNA的分離。cDNA合成采用RNaseH方法(Gubler和Hoffman(1983)基因25263-269，Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY)用F.S.Hagen(pers.comm.)開發(fā)的發(fā)夾修飾從5微克poly(A)+RNA合成雙鏈cDNA。在預(yù)硅烷化的無核糖核酸酶的Eppendorph試管中于70℃加熱poly(A)+RNA(在5μlDEPC處理的水中的5μg)8分鐘，在冰上驟冷，添加逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液至終體積50微升，所述逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(50mMTris-Cl(pH8.3)、75mMKCl、3mMMgCl2，10mMDTT，Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)包含1mMdATP、dGTP和dTTP；0.5mM5′-甲基-dCTP(Pharmacia)；40單位人類胎盤核糖核酸酶抑制劑(RNasin，Promega)；1.45微克oligo(dT)18-NotI引物(Pharmacia)以及1000單位SuperScriptII核糖核酸酶H逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)。通過在45℃溫育反應(yīng)混合物1小時合成第一鏈cDNA。在合成之后，將mRNAcDNA雜交混合物按照制造者的說明經(jīng)MicroSpinS-400HR(Pharmacia)旋轉(zhuǎn)柱凝膠過濾。在凝膠過濾之后，將雜交體用第二鏈緩沖液稀釋，所述緩沖液(20mMTris-HCl(pH7.4)、90mMKCl、4.6mMMgCl2、10mM(NH4)2SO4、0.16mM(NAD+)包含200μM各種dNTP、60單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Pharmacia)、5.25單位核糖核酸酶H(Promega)和15單位大腸桿菌DNA連接酶(Boehringer曼海姆)。通過在16℃下溫育反應(yīng)試管2小時和在25℃下溫育15分鐘進(jìn)行第二鏈cDNA合成。由添加乙二胺四乙酸至最終濃度20mM終止反應(yīng)，其后用酚和三氯甲烷抽提。Mung大豆核酸酶處理通過于-20℃下添加2體積的96％EtOH、0.2體積的10MNH4Ac沉淀雙鏈cDNA12小時，離心回收，用70％EtOH洗滌，干燥并再懸浮于30微升Mung大豆核酸酶緩沖液中，該緩沖液(30mMNaAc(pH4.6)、300mMNaCl，1mMZnSO4，0.35mMDTT，2％甘油)包含25單位Mung大豆核酸酶(Pharmacia)。通過在30℃溫育反應(yīng)物30分鐘，接著添加70微升10mMTris-HCl(pH7.5)、1mM乙二胺四乙酸，苯酚抽提以及在冰上用2體積96％乙醇和0.1體積3MNaAc(pH5.2)沉淀來剪切單鏈發(fā)夾DNA。用T4DNA聚合酶鈍化末端離心回收雙鏈cDNA，在30微升含0.5mM各種dNTP和5單位T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)的T4DNA聚合酶緩沖液中16℃溫育1小時，使末端鈍化。加入EDTA至終濃度20mM，然后用苯酚和氯仿提取，加入2體積96％EtOH和0.1體積3MNaAc(pH5.2)于-20℃沉淀12小時。銜接子連接，NotI消化和大小選擇在填充反應(yīng)完成后，經(jīng)離心回收cDNA，用70％EtOH洗滌并干燥。將cDNA沉淀重懸于25微升連接緩沖液中，所述緩沖液(30mMTris-HCl(pH7.8)、10mMMgCl2、10mMDTT、0.5mMATP)包含2.5微克非回文BstXI銜接子(Invitrogen)和30單位T4連接酶(Promega)，在16℃溫育12小時。通過在65℃加熱20分鐘然后在冰上冷卻終止反應(yīng)。連接的cDNA用NotI限制酶消化，其是通過添加20微升水，5微升10×NotI限制酶緩沖液(NewEnglandBiolabs)和50單位NotI(NewEnglandBiolabs)，接著在37℃溫育2.5小時進(jìn)行的。65℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。經(jīng)凝膠電泳在1×TBE中的0.8％SeaPlaqueGTP低熔化溫度瓊脂糖凝膠(FMC)上大小分級分離cDNA，以分離未連接的銜接子和小的cDNA。按照制造者的說明，由切下0.7kb并用β-瓊脂糖酶(NewEnglandBiolabs)從凝膠救援出，并且于-20℃添加2體積96％EtOH和0.1體積3MNaAc(pH5.2)沉淀12小時來進(jìn)行cDNA的大小選擇。文庫的構(gòu)建通過離心回收定向的、選擇了大小的cDNA，在70％EtOH中洗滌，干燥并懸浮在30μl的10mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA中。按照制造廠商的說明通過MicroSpinS-300HR(Pharmacia)旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)行凝膠過濾使cDNA脫鹽。在10μl包含5μl雙鏈cDNA(反應(yīng)試管#1和#2)、15單位的T4連接酶(Promega)以及30ng(試管#1)、40ng(試管#2)和40ng(試管#3，載體背景對照)的BstXI-NotI裂解的pYES2.0載體的連接緩沖液(30mMTris-HCl(pH7.8)、10mMMgCl2、10mMDTT、0.5mMATP)中進(jìn)行三種試驗(yàn)連接。通過在16℃下溫育12小時、在70℃下加熱20分鐘、然后向每個試管添加10μl的水進(jìn)行連接反應(yīng)。如上所述把1μl的每種連接混合物電穿孔進(jìn)40μl電感受態(tài)的(electrocompetent)大腸桿菌DH10B細(xì)胞(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)中(Sambrook等，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY)。使用最優(yōu)條件在包含庫的大腸桿菌中建立文庫。各庫通過在LB+氨芐青霉屬素瓊脂平板涂布轉(zhuǎn)化的大腸桿菌并在37℃下培養(yǎng)24小時產(chǎn)生15000-30000克隆/平板制作。把20mlLB+氨芐青霉素添加到平板上并懸浮細(xì)胞。使細(xì)胞懸浮液于37℃下在50ml試管中振蕩1小時。使用QIAGEN質(zhì)粒試劑盒按照按照制造廠商的說明從細(xì)胞分離質(zhì)粒DNA并在-20℃下保存。把得自各個庫的1μl純化質(zhì)粒DNA(100ng/μl)的等分試樣通過電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)啤酒糖酵母W3124中(Becker和Guarante(1991)酶學(xué)方法，194182-187)，把轉(zhuǎn)化體平板接種于包含2％葡萄糖的SC瓊脂上并在30℃下培養(yǎng)。陽性菌落的鑒別在生長3-5天之后，把瓊脂平板復(fù)制接種于一組包含0.1％AZCLHE纖維素的SC+半乳糖-尿嘧啶瓊脂平板上。將這些平板在30℃下培養(yǎng)3-7天。內(nèi)切葡聚糖酶陽性菌落鑒定為藍(lán)環(huán)圍繞的菌落。為了在瓊脂上分離單個菌落，涂布得自酶-陽性菌落的細(xì)胞，為了鑒別產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶的菌落，選擇產(chǎn)生酶的單個菌落。陽性克隆的鑒定陽性克隆作為單個菌落獲得，使用生物素化的多接頭引物直接從酵母菌落擴(kuò)增cDNA插入片段，通過磁性小珠(DynabeadM-280，Dynal)系統(tǒng)純化，并通過使用鏈-末端方法(Sanger等(1977)美國科學(xué)院學(xué)報，745463-5467)和Sequenase系統(tǒng)(美國生物化學(xué))測定每個cDNA克隆的5′-末端序列單個地確定其特征。使用熒光標(biāo)記的終止子通過雙脫氧鏈終止方法(Sanger等)測定得自兩條鏈的最長cDNA的核苷酸序列。通過如下所述轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌救援(rescue)質(zhì)粒DNA。使用AppliedBiosystems373A自動測序儀按照制造廠商的說明用Taq脫氧末端循環(huán)測序試劑盒(PerkinElmer，US)和pYES2.0多接頭引物(Invitrogen，USA)或合成的寡核苷酸引物測定Qiagen純化的質(zhì)粒DNA(Qiagen，USA)的序列。序列數(shù)據(jù)的分析按照Devereux等進(jìn)行。在曲霉中表達(dá)的cDNA基因的分離把產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶的酵母菌落接種于在50ml玻璃試管中的20mlYPD培養(yǎng)液中。試管在30℃下振蕩2天。通過在3000rpm下離心10分鐘收獲細(xì)胞。按照WO94/14953分離DNA并將其溶解在50μl水中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法把DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌。使用標(biāo)準(zhǔn)方法從大腸桿菌分離質(zhì)粒DNA并通過限制酶分析進(jìn)行分析。使用適當(dāng)?shù)南拗泼盖谐齝DNA插入片段并連接進(jìn)曲霉表達(dá)載體中。米曲霉或黑曲霉的轉(zhuǎn)化如WO95/02043的16頁，21行-17頁，12行(本文一并參考)所述制備原生質(zhì)體。把100μl的原生質(zhì)體懸浮液和5-25μg在10μlSTC(1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH＝7.5，10mMCaCl2)中的適當(dāng)DNA混合。將原生質(zhì)體與p3SR2(攜帶A.nidulansamdS基因的質(zhì)粒)混合?；旌衔镌谑覝叵路胖?5分鐘。添加0.2ml60％PEG4000(BDH29576)、10mMCaCl2、10mMTris-HCl(pH7.5)并小心地混合(兩次)，最后添加0.85ml的相同溶液并小心地混合?；旌衔镌谑覝叵路胖?5分鐘，在2500g下旋轉(zhuǎn)15分鐘，把沉淀懸浮在2ml的1.2M山梨醇中。在再次沉淀之后把原生質(zhì)體涂布在最小的包含1.0M蔗糖(pH7.0)，10mM乙酰胺作為氮源以及20mMCsCl以抑制背景生長的平板上(Cove，生物化學(xué)學(xué)報，113(1966)51-56)。于37℃下培養(yǎng)4-7天之后，選擇孢子并涂布以形成單個菌落。重復(fù)該過程，保存第二次再分離之后的單個菌落的孢子作為所定義的轉(zhuǎn)化體。米曲霉轉(zhuǎn)化體的試驗(yàn)把每個轉(zhuǎn)化體接種在10ml的YPM中并繁殖。在于37℃下接種2-5天之后，除去10ml的上清液。如上所述通過AZCLHE纖維素鑒別內(nèi)切葡聚糖酶活性。用于評價本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的性質(zhì)ii)的雜交條件測定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間的雜交的合適條件包括在5×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽)中預(yù)浸漬包含待雜交DNA片段或RNA的濾膜10分鐘，濾膜在5×SSC(Sambrook等1989)、5×Denhardt′s溶液(Sambrook等1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的聲處理的鮭精DNA(Sambrook等1989)中預(yù)雜交，然后在包含隨機(jī)引物的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)生物化學(xué)年評，1326-13)、32P-dCTP-標(biāo)記的(比活＞1×109cpm/μg)的探針的相同溶液中于約45℃下雜交12小時。然后濾膜在2×SSC、0.5％SDS中洗滌兩次30分鐘，溫度優(yōu)選地不高于50℃，更優(yōu)選地不高于55℃，更優(yōu)選地是不高于60℃，更優(yōu)選地是不高于70℃，尤其是不高于75℃。用于雜交的核苷酸探針是對應(yīng)于分別在SEQIDNO1、4、6、8、10、12或16中所示的DNA序列和/或分別可以從在啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列。免疫交叉反應(yīng)用于測定免疫交叉反應(yīng)的抗體可以通過使用純化的纖維素酶制備。更具體地說，抗本發(fā)明的纖維素酶的抗血清可通過按照N.Axelsen在“定量免疫電泳手冊”，Blackwell科學(xué)出版社，1973，23章中或A.Johnstone和R.Thorpe，實(shí)踐免疫化學(xué)，Blackwell科學(xué)出版社，1982(更具體地說在27-31頁)中描述的方法制備。純化的免疫球蛋白可從抗血清獲得，如通過鹽沉淀((NH4)2SO4)并進(jìn)行滲析和離子交換色譜(如在DEAE-Sephadex上)。蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)定性可通過Outcherlony雙擴(kuò)散分析(O.Ouchteriony試驗(yàn)免疫學(xué)手冊(D.M.Weir，Ed.)，Blackwell科學(xué)出版社，1967，655-706頁)、交叉免疫電泳(N.Axelsen等，同上，第3和4章)或火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)完成。培養(yǎng)基YPD10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900ml。高壓滅菌，添加100ml20％的葡萄糖(無菌過濾的)。YPD10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900ml。高壓滅菌，添加100ml20％的麥芽糖糊精(無菌過濾的)。10×堿鹽(baselsalt)75g酵母氮堿(nitrogenbase)，113g琥珀酸，68gNaOH，加H2O至1000ml，無菌過濾。SC-URA100ml10×堿鹽，28ml無維生素的20％酪蛋氨基酸，10ml1％的色氨酸，加H2O至900ml，高壓滅菌，添加3.6ml5％蘇氨酸以及100ml20％葡萄糖或20％半乳糖。SC-URA瓊脂SC-URA，添加20g/l瓊脂。PD瓊脂39g馬鈴薯右旋糖瓊脂，DIFCO0013；添加去離子水至1000ml；高壓滅菌(121℃下15-20分鐘)。PC瓊脂馬鈴薯和胡蘿卜(研磨，每種20g)，添加水至1000ml，煮沸1小時；瓊脂(20g/lMerck1614)；高壓滅菌(121℃下20分鐘)。PC液態(tài)培養(yǎng)基如PC瓊脂，但沒有瓊脂。PD液態(tài)培養(yǎng)基24g馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液，Difco0549，添加去離子水至1000ml；高壓滅菌(121℃下15-20分鐘)。具有纖維素的PC和PD液態(tài)培養(yǎng)基每1000ml添加30gSolcafloc(Dicacel可從Dicalite-Europe-Nord，9000Gent，比利時獲得)。PB-9液態(tài)培養(yǎng)基:把12gRofec(Roquette101-0441)和24g葡萄糖添加至1000ml水中；把pH值調(diào)整到5.5；每1000ml添加5ml礦物油和5gCaCO3。高壓滅菌(121℃下40分鐘)。YPG液態(tài)培養(yǎng)基4g酵母提取物(Difco0127)，1gKH2PO4(Merck4873)，0.5gMgSO4·7H2OMerck5886，15g右旋糖，Roquette101-0441，0.1mlPluronic(101-3088)；添加去離子水至1000ml；高壓滅菌(121℃下20分鐘)稀釋鹽溶液(DS)制備兩種母液P-母液13.61gKH2PO4；13.21g(NH4)2PO4，17.42gKH2PO4；添加去離子水至100ml。Ca/Mg母液7.35gGaGl2·2H2O，10.17gMgCl2·6H2O，添加去離子水至100ml；把pH值調(diào)整至7.0；高壓滅菌(121℃；20分鐘)把0.5mlP-母液和0.1mlCa/Mg母液混合添加去離子水至1000mlAZCLHE纖維素(Megazyme，澳大利亞)。用途在洗滌和穿著過程中，染色的織物或衣物的染料通常滲色，從而使衣物看起來已褪色和穿舊。從織物表面除去纖維將部分地恢復(fù)織物初始的顏色和外觀。本文所使用的術(shù)語“顏色澄清”是指通過多次洗滌循環(huán)織物或衣物的初始顏色部分地恢復(fù)。術(shù)語“除去丸狀物”指從織物表面除去丸狀物。術(shù)語“浸泡液體”指這樣的一種含水的液體，要洗的衣物在進(jìn)行常規(guī)洗滌過程前要浸泡在其中。浸泡液體可包含一種或多種通常用于洗滌或洗滌方法的組分。術(shù)語“洗液”指這樣的一種含水的液體，在其中要洗的衣物進(jìn)行洗滌過程，即通常是一種手工或在洗衣機(jī)中的化學(xué)或機(jī)械結(jié)合的作用。通常，洗液是粉劑或液體洗滌劑組合物的水溶液。術(shù)語“沖洗液體”指這樣的一種含水的液體，為了沖洗要洗的衣物，即實(shí)質(zhì)上從要洗的衣物中除去洗滌劑溶液，在其中浸泡并處理要洗的衣物，通常是在洗滌過程之后立即進(jìn)行。沖洗液體可包含織物條理或軟化組合物。按照本發(fā)明的方法要洗的衣物可以是常規(guī)的可洗的衣物。優(yōu)選地，要洗的衣物的主要部分是縫合或未縫合的織物，包括從棉制造的編織物(knits)、編織物(wovens)、斜紋粗棉布、紗線和毛巾、棉混紡物或天然或人造纖維素(如制自包含木聚糖的纖維素織物，如制自木漿)或其混合物?；旌衔锏睦邮蔷哂幸环N或多種輔助材料的棉或人造纖維/纖維膠(如羊毛、合成纖維(如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚偏二氯乙烯纖維、聚氨甲酸乙酯纖維、聚脲纖維、aramid纖維)以及包含纖維素的纖維(如人造纖維/纖維膠、苧麻、亞麻/亞麻布、黃麻、乙酸纖維素纖維、lyocell)。洗滌劑組合物按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶可典型地是洗滌劑組合物的組分。同樣地，它們可以以非塵狀粒劑、穩(wěn)定液體或受保護(hù)的酶形式包括在洗滌劑組合物中。非塵狀粒劑可按照，如在US4,106,991和4,661,452所(二者都屬于NovoIndustriA/S)公開的方法產(chǎn)生并可有可無地按照本領(lǐng)域的方法包衣。蠟狀的表面蓋覆劑的例子是平均分子量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇(其中醇包含12至20個碳原子，具有15至80個環(huán)氧乙烷單位)；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油單、雙和三酸酯。在專利GB1483591中給出了通過流化床技術(shù)制成的適于應(yīng)用的形成薄片的表面蓋覆劑的例子。如液態(tài)酶制劑可按照已制定的方法通過添加多羥基化合物(如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸)穩(wěn)定。其它酶穩(wěn)定劑在本領(lǐng)域中是已知的。受保護(hù)的酶按照在EP238,216中公開的方法制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，如粉劑、粒劑、糊劑或液體。液體洗滌劑可是水溶液，典型地包含多達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或非水溶液。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，每種活化劑可以是陰離子、非離子、陽離子或兩性離子的。洗滌劑通常包含0-50％陰離子表面活性劑，如線性烷基苯磺酸鹽(LAS)、α-烯烴磺酸鹽(AOS)、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)(AS)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽(AEOS或AES)、仲烷烴磺酸鹽(SAS)、α-硫代脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。它可以包含0-40％的非離子表面活性劑，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺或聚羥烷脂肪酸酰胺(如如在WO92/06154中所描述的)。洗滌劑組合物還可包含一種或多種其它酶，如淀粉酶、脂酶、角質(zhì)酶、蛋白酶、過氧化物酶和氧化酶，如漆酶。洗滌劑可包含1-65％洗滌劑助洗劑或配位劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯、檸檬酸鹽、次氨基三乙酸(NTA)、乙二氨四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)庸杷猁}(如得自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑也可無助洗劑，即實(shí)質(zhì)上不含洗滌劑助洗劑。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。例子是羧甲基纖維素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可包含漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含H2O2源，如與形成過酸的漂白活化劑(如四乙基乙二胺(TAED)或壬酰氧苯磺酸鹽(NOBS))結(jié)合的過硼酸鹽或過碳酸鹽。另外，漂白系統(tǒng)可包含過酸，如酰胺、酰亞胺或砜型。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規(guī)的穩(wěn)定劑穩(wěn)定，如多羥基化合物(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸酯，組合物可按照在如WO92/19708和WO92/19709中所述制成制劑。洗滌劑也可包含其它常規(guī)的洗滌劑組份，如織物調(diào)理劑，包括粘土、泡沫輔助劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑或香料。pH(于使用濃度下在水溶液中測量)通常是中性或堿性的，如在7-11的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)洗滌劑組合物的具體形式包括1)一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>2)一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>3)一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>4)一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含5)一種水溶液洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>8)一種制成粒劑的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>9)一種制成粒劑的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables></tables>10)一種液體洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>11)一種液體洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>12)一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables></tables>13)如在1)-12)中所述的洗滌劑制劑，其中線性烷基苯磺酸鹽全部或部分由(C12-C18)烷基硫酸鹽取代。14)一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>15)一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含</tables>16)如在1)-15)中所述的洗滌劑制劑，該制劑包含作為另外的組分或作為已經(jīng)指出的漂白系統(tǒng)的替代物的穩(wěn)定或膠囊化的過酸。17)如在1)、3)、7)、9)和12)中所述的去垢組合物，其中所說的過硼酸鹽被過碳酸鹽替代。18)如在1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的去垢組合物，該組合物還包含錳催化劑。錳催化劑可以是，例如在“用于低溫漂白的有效的錳催化劑”，自然369，1994，637-639中所描述的一種化合物。19)制成非水溶液洗滌劑液體的去垢組合物，該組合物包含液態(tài)非離子表面活性劑如線性的烷氧基化伯醇、助洗劑系統(tǒng)(如磷酸鹽)、酶和堿。洗滌劑也可以包含陰離子表面活性劑和/或漂白系統(tǒng)。內(nèi)切葡聚糖酶可以以通常用于洗滌劑的濃度摻入。它包含在本發(fā)明的洗衣組合物中，纖維素酶可以以對應(yīng)于每升洗液中0.0001-10mg(以純化的酶蛋白質(zhì)計(jì)算)的纖維素酶添加。按照本發(fā)明的另一個方面，內(nèi)切葡聚糖酶可典型地是織物調(diào)節(jié)劑或軟化組合物的組分。通常的軟化組合物的例子在例如EP0233910中公開。紡織中的應(yīng)用在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶在生物拋光過程的用途。生物拋光是紗表面的特異性處理，這種處理改進(jìn)了織物的手感和外觀的質(zhì)量，而不失去織物可濕性。生物拋光最重要的作用可通過很少起毛和形成丸狀物、增加光彩/光澤、改進(jìn)的織物手感、增加的耐用軟度以及改變的吸水能力表征。生物拋光通常發(fā)生在針織和編織的織物制造的濕處理之中。濕處理包含如下步驟脫漿、沖洗、漂白、洗滌、染色/印花和涂飾。在每個這樣的步驟期間，織物或多或少地進(jìn)行機(jī)械作用。通常，在針織和編織織物之后，織物進(jìn)行到脫漿階段，其后為沖洗階段等。脫漿是從織物除去漿糊的作用。在機(jī)械織機(jī)上編織之前，為了增加彎曲的紗線的抗張強(qiáng)度，常常用漿糊淀粉或淀粉衍生物包被。在編織之后，漿糊包被物在進(jìn)一步處理織物之前必須除去以確保均勻和防洗效果。已知為了達(dá)到生物拋光的效果，需要溶纖和機(jī)械作用的組合。還已知當(dāng)用纖維素酶處理和用軟化劑的常規(guī)處理結(jié)合時可達(dá)到“超軟化”。可以設(shè)想本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶用于纖維素織物的生物拋光是有優(yōu)勢的，如可達(dá)到更徹底的拋光。生物拋光可通過應(yīng)用例如在WO93/20278中所描述的方法獲得。石洗已知可通過在浮石存在下洗滌斜紋粗棉布或從這樣的織物制造的牛仔褲以提供所需的織物顏色的局部發(fā)亮或通過酶促處理織物(具體來說是用溶纖酶)在染色的織物(具體來說是在斜紋粗棉布織物或牛仔褲中)上提供“石洗的”外觀(局部顏色磨損)?？梢詥为?dú)(如在US4,832,864中所公開的)或與比在傳統(tǒng)的方法較少量的浮石一起或與珍珠巖一起(如在WO95/09225中公開的)進(jìn)行本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶的處理。紙漿和紙上的應(yīng)用在造紙紙漿工業(yè)中，本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶有利地應(yīng)用到如下方面-用于剝樹皮在機(jī)械轉(zhuǎn)筒中剝樹皮之前，用內(nèi)切葡聚糖酶的預(yù)處理可降解形成層，從而有利于節(jié)能。-用于脫纖維因?yàn)槔w維素酶對內(nèi)部纖維表面的水解作用，在精制或打漿之前用內(nèi)切葡聚糖酶處理含纖維素纖維的材料可導(dǎo)致能量消耗的減少。使用內(nèi)切葡聚糖酶與使用已知的酶相比可導(dǎo)致改進(jìn)的節(jié)能，因?yàn)槿藗兿嘈疟景l(fā)明的酶組合物具有更高的穿透纖維壁的能力。-用于纖維改性，即纖維性質(zhì)的改進(jìn)，其中需要跨纖維壁的部分水解，這需要更深的穿透酶(如為了使粗糙的纖維更柔韌)。迄今為止，纖維的深度處理對高產(chǎn)量的紙漿(如機(jī)械紙漿或再循環(huán)紙漿的混合物)是不可能的。這歸結(jié)于纖維壁結(jié)構(gòu)的性質(zhì)(因?yàn)槔w維壁的孔基質(zhì)的物理限制，該性質(zhì)阻止酶分子的通過)。設(shè)想本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶能滲入纖維壁。-排水改進(jìn)。造紙紙漿的排水能力可通過用水解酶(如纖維素酶)處理紙漿得到改進(jìn)。木素纖維素紙漿的處理可按照例如在WO91/14819、WO91/14822、WO92/18688和WO92/17573中的描述進(jìn)行。植物材料的降解在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及按照本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶和/或酶制劑用于植物材料(如細(xì)胞壁)降解的用途。本發(fā)明涉及為了增加產(chǎn)量在酒、水果或蔬菜汁中應(yīng)用本發(fā)明新內(nèi)切葡聚糖酶和/或酶制劑。按照本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶也可用于各種植物細(xì)胞衍生的材料或廢材料的酶促水解，如農(nóng)業(yè)殘余物，如麥秸桿、玉米穗軸、整株玉米植物、核果殼、草、蔬菜殼、豆殼、谷殼、甜菜漿等。為了改進(jìn)不同種類的加工、促進(jìn)其它組分的純化或提取(如從谷物中純化β-葡聚糖或β-葡聚糖低聚物)、改進(jìn)食物價值、減少水結(jié)合量、在廢水植物中提高降解、提高(如秣草保藏法的草和谷類的)轉(zhuǎn)化等，可以降解植物材料。下列實(shí)施例說明本發(fā)明。實(shí)施例1通過表達(dá)克隆檢測了4種真菌的溶纖酶，這4種真菌屬于子囊菌綱的兩個目之內(nèi)的3個科；測定了相應(yīng)的DNA序列；異源表達(dá)和通過液體發(fā)酵產(chǎn)生的酶在顏色澄清測定中進(jìn)行特征分析，表明其具有良好的性能。使分離物CBS117.65、CBS478.94、NRRL8126和ATCC10523在振蕩燒瓶培養(yǎng)器中在富含纖維素的馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液中生長，在26℃下培養(yǎng)5天(振蕩條件，150rpm)。A.Myceliophthorathermophila、Acremoniumsp.、Thielaviaterrestris和Volutellacolletotrichoides的內(nèi)切葡聚糖酶的克隆和表達(dá)分別分離Myceliophthorathermophila、Acremoniumsp.、Thielaviaterrestris和Volutellacolletotrichoides的mRNA，這些生物體生長在含有纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)基(振蕩培養(yǎng)基以確保充分換氣)中。在生長3-5天后收獲菌絲，立即把菌絲在液氮中冷凍，并且儲存在-80℃下。在所描述的大腸桿菌中利用1％的載體背景分別構(gòu)建Myceliophthora、thermophilaAcremoniumsp.，Thielaviaterrestris和Volutellacolletotrichoides的文庫，每個文庫中含有大約106個單個克隆。把每一個文庫的一些集合的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到酵母中，從每一個集合中得到了含有250-400個酵母菌落的50-100個平板。利用AZCLHE纖維素測定法在SC-瓊脂平板上鑒別和分離內(nèi)切葡聚糖酶-陽性菌落。從酵母菌落直接擴(kuò)增cDNA插入物，并且利用以上材料和方法部分中描述的方法進(jìn)行性質(zhì)分析。SEQIDNO1顯示了編碼Myceliophthorathermophila的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO1也顯示了相應(yīng)氨基酸序列。從DSM9770的質(zhì)粒中可以獲得此cDNA。編碼Acremoniumsp.的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列列于SEQIDNO4中，相應(yīng)氨基酸序列列于SEQIDNO5中。從DSM10082的質(zhì)粒中可以獲得此cDNA。編碼Thielaviaterrestris的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列列于SEQIDNO8中，相應(yīng)氨基酸序列列于SEQIDNO9中。從DSM10081的質(zhì)粒中可以獲得此cDNA。編碼Volutellacolletotrichoides的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列列于SEQIDNO16中，相應(yīng)氨基酸序列列于SEQIDNO17中。從DSM10571的質(zhì)粒中可以獲得該cDNA。從酵母菌落分離出總DNA，并且通過轉(zhuǎn)化以上所述的大腸桿菌救援質(zhì)粒DNA。為了在米曲霉屬中表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化DNA，在凝膠上進(jìn)行片斷分級分離，分別純化與Myceliophthorathermophila、Acremoniumsp.、Thielaviaterrestris和Volutellacolletotrichoides內(nèi)切葡聚糖酶基因相應(yīng)的片段，其后把基因連接到用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化的pHD414中，分別形成了質(zhì)粒pA2C357、pA2C193、pA2C385和pA2C488。在大腸桿菌中擴(kuò)增DNA之后，把質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到以上所述的米曲霉中。米曲霉轉(zhuǎn)化體試驗(yàn)如上所述試驗(yàn)每個轉(zhuǎn)化體的內(nèi)切葡聚糖酶的活性。一些轉(zhuǎn)化體比米曲霉背景具有更大的內(nèi)切葡聚糖酶活性。這表明了在米曲霉中內(nèi)切葡聚糖酶的有效表達(dá)。利用YPM培養(yǎng)基在500ml搖瓶中選擇和接種了具有最高的內(nèi)切葡聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化體。在發(fā)酵(為確保良好的通氣進(jìn)行充分的攪拌)3-5天后，把培養(yǎng)液以2000g離心10分鐘，并且回收上清液。B.內(nèi)切葡聚糖酶活性的測定可以測定內(nèi)切葡聚糖酶相當(dāng)于分析標(biāo)準(zhǔn)物的溶纖活性，并且以單位S-CEVU表示。溶纖酶水解CMC，因此減少了培養(yǎng)混合物的粘度?？梢酝ㄟ^振動粘度計(jì)(例如法國Sofraser，MIVI3000)測定產(chǎn)生的粘度減弱?？梢园凑誂F301.1分析方法進(jìn)行以S-CEVU測量的溶纖活性的測定，這種方法可以向本申請人索取。通過測量樣品的減少羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力，S-CEVU測定方法量化了樣品中的催化活性。測定在40℃、pH7.5的條件下進(jìn)行，同時利用了降低CMC底物粘度的相關(guān)的酶標(biāo)準(zhǔn)物。利用磷酸飽和纖維素(PASC)以SAVI單位測定內(nèi)切葡聚糖酶活性的測定方法定義1SAVI-U是形成一定量的還原碳水化合物(相當(dāng)于每分鐘1μmol的葡萄糖)的酶量。測定條件酶溶液0.5ml0.1M緩沖液中的4g/PASC2.0ml20分鐘，40℃敏感性最大0.1SAVIU/ml＝大約1S-CEVU/ml(CMC粘度)最小0.01SAVIU/ml＝大約0.1S-CEVU/ml還原糖形成的測定按照Lever，M.比色法測定碳水化合物的一種新反應(yīng)(生物化學(xué)年報1972.vol47(273-279))進(jìn)行還原基團(tuán)的測定。通過把1.5克對羥苯甲酸氫酸(PHBILH)和5克酒石酸鈉在100ml的2％氫氧化鈉中混合制備試劑混合物。底物利用冰凍丙酮和磷酸按照下面的方式制備PASC貯液。把5克纖維素(Avicel)用水濕潤，加入150ml85％的冰凍正磷酸。把混合物放置在冰浴中，緩慢攪拌1小時。然后加入100ml冰凍丙酮并且攪拌。把漿液轉(zhuǎn)移到帶有燒結(jié)的3號pyrex盤的Buchner過濾器中，并且用冰凍丙酮洗滌三次，每次洗滌之后盡可能吸干。最后把濾餅用500ml水洗滌兩次，每次洗滌之后盡可能吸干。把PASC與去離子水混合，使總體積達(dá)到300ml，均勻混合(使用超Turrax均化器)，并且保存在冰箱中(達(dá)一個月)。用緩沖液平衡底物20克磷酸飽和的纖維素PASC貯液以5000rpm.離心20分鐘，倒出上清液；沉淀在30ml緩沖液中再懸浮并在5000rpm.下離心20分鐘。倒出上清液，將總共60克的沉淀以5克纖維素/升的濃度懸浮在緩沖液中。pH8.5的測定緩沖液0.1M巴比妥。pH10的測定緩沖液0.1M甘氨酸。方法1.酶樣品的稀釋將酶溶液在與底物相同的緩沖液中稀釋。2.酶反應(yīng)將緩沖溶液中的底物在42℃下預(yù)熱5分鐘(2ml)。然后加入0.5ml酶溶液(稀釋至0.2-1S-CEVU/ml)，混合5秒鐘。通過在酶溶液中添加終止試劑獲得酶空白。40℃下培養(yǎng)20分鐘。通過加入0.5ml2％NaOH溶液并混合5秒鐘終止反應(yīng)。將樣品以5000rpm.離心20分鐘。將1ml上清液與0.5mlPHBAH試劑混合，并且煮沸10分鐘。試管在冰水浴中冷卻。3.還原末端基團(tuán)的確定使用分光光度計(jì)在410nm測量吸收率。通過在加入酶溶液之前加入氫氧化鈉制備空白。利用在相同緩沖液中的5，10，15和25mg/l濃度的葡萄糖和在煮沸之前加入PHBAH試劑獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋放的還原葡萄糖當(dāng)量。4.催化活性的計(jì)算測量410nm的吸收率1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(葡萄糖)-(H2O)對葡萄糖的濃度2)酶樣品(樣品)-(空白)按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖濃度活性(SAVIU/ml)C.M.termophila的內(nèi)切葡聚糖酶的純化和性質(zhì)分析將pA2C193轉(zhuǎn)化的米曲霉在YPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天。然后將液體離心并無菌過濾。利用20kD閾值的DOW膜GR61PP通過在AMICON室中的超濾作用濃縮樣品。分析超濾濃縮物的S-CEVU/ml和SaviU/ml，得到下列結(jié)果</tables>純化把2毫升UF-濃縮物稀釋5倍，以降低其離子強(qiáng)度，并通過0.22μm圓板過濾器過濾。將樣品加入到用50mMTris/HCl緩沖液(pH7.5)平衡的MonoQHR/5Pharmacia柱上，流速為1毫升/分鐘。在用緩沖液A洗脫到基線時，用含有1MNaCl(緩沖液B)的Tris/HCl緩沖液(pH7.5)洗脫，梯度洗脫是在1小時之內(nèi)緩沖液B從0-50％變化。36分鐘后，出現(xiàn)高峰復(fù)合物，收集每份1ml的流份，將最初的10個流份在羧甲基纖維素/瓊脂糖/剛果紅的平板上顯示纖維素酶活性。合并這些流份，并利用20kD閾值的DOW膜GR61PP通過在AMICON室中的超濾作用濃縮至3毫升。將樣品加入到用100mMTris/HCl緩沖液(pH6.35)平衡的HiLoad2660Superdex75TMprep梯度Pharmacia柱上，流速為1毫升/分鐘。82分鐘后，出現(xiàn)高峰，每份1ml收集流份，最初的10個流份在羧甲基纖維素/瓊脂糖/剛果紅的平板上顯示纖維素酶活性。合并這些流份，得到的結(jié)果如下A280＝0.15A280/A260＝1.62Mw(SDS)＝22kDpI＝3.5-5SDS-PAGE上的純度＝100％S-CEVU/ml＝28.5S-CEVU/A280＝188S-CEVU/mg＝436消光系數(shù)＝54880(計(jì)算的)Mw(計(jì)算的)＝22kD消光系數(shù)是以由所附的SEQIDNO1(氨基酸序列)的序列計(jì)算的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的含量為基礎(chǔ)。在NOVEXPre-Cast凝膠4-20％Tris-甘氨酸凝膠1.0mm×10孔上進(jìn)行SDS-Page。在PharmaciaPAG板(pH3.5-9.5)上進(jìn)行IEF，由羧甲基纖維素-剛果紅覆蓋顯現(xiàn)出活性。KM和Kcat的測定在pH8.5和底物濃度多達(dá)8克/毫升的情況下，以與測定SAVI單位相同的方式測定Km和Kcat。得到下列結(jié)果Kcat為38/每秒，Km為5g/l，磷酸飽和纖維素，pH8.5。在pH7.5時對羧甲基纖維素的比活性每毫克蛋白質(zhì)436S-CEVU。D.M.thermophila的內(nèi)切葡聚糖酶的pH和溫度分布圖的確定在下列條件下測定pH的分布圖通過把0.1MTri-磷酸鈉與0.1M檸檬酸混合制備pH值在2.5-10.0之間的緩沖液。稀釋純化的內(nèi)切葡聚糖酶以便確保測定反應(yīng)在測定的線性范圍內(nèi)。底物是0.4％AZCL-HE-纖維素(MegaZyme)的懸液，其以1∶1和檸檬酸/磷酸鹽緩沖液混合，使最終的底物濃度為0.2％AZCL-HE-纖維素。向Eppendorf_1.5ml聚丙烯管中的1ml底物加入10μl酶溶液，并在Eppendorf_控溫?zé)峄旌蟽x(Thermomixer)中培養(yǎng)15分鐘，然后將酶在另一熱混合儀中95℃下熱滅活20分鐘。離心，并將200μl的各上清液轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板的各個孔中，通過ELISA讀數(shù)儀(LabsystemsMultiskan_MCC/340)在620nm測量OD。最適pH的培養(yǎng)溫度是30℃。對于每個pH值，三個管中都加入了酶并在熱滅活之前培養(yǎng)，而一個管(空白)加入酶并立即熱滅活。計(jì)算了三個培養(yǎng)樣品的平均值，并減去空白值。測定了下列pH下分布可以看出內(nèi)切葡聚糖酶在pH4.0和8.0之間有60％以上的活性，最佳活性在pH5.0-6.0溫度分布在pH5.5下以相同的方式確定最佳溫度。溫度范圍從30℃到80℃。對于每種溫度，進(jìn)行三個培養(yǎng)，并計(jì)算平均值。通過酶的即刻熱滅活產(chǎn)生三個空白，并從培養(yǎng)的樣品值減去空白的平均值?？梢钥闯鰞?nèi)切葡聚糖酶在50-70℃時具有最佳活性。</tables>在pH5.5和30℃下，以相同的方式測定溫度穩(wěn)定性，并將所說的酶溶液在此溫度下預(yù)熱1小時。下表顯示沒有預(yù)熱的酶樣品的百分活性</tables>E.以毀絲霉屬纖維素酶(SEQIDNO.1)除去表面纖絲和從含有纖維素纖維的織物中突出的纖維為指標(biāo)測量其對顏色的凈化儀器Terg-O-tometer液體體積100ml攪拌150次/分鐘的垂直攪拌器沖洗時間自來水5分鐘洗滌溫度40℃洗滌液體0.05M磷酸鹽緩沖液pH7.0洗滌時間30分鐘重復(fù)2次酶毀絲霉屬SEQIDNO.1B劑量500和2500S-CEVU/l織物2塊舊的黑色100％棉布樣品，5×6cm(0.9克)干燥滾動干燥評價由DatacolorElrepho反射分光光度計(jì)測量光反射(Remission)。將反射值計(jì)算成ΔL(Hanter實(shí)驗(yàn)室值)。當(dāng)纖維素酶除去表面纖絲和從紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑，并得到更低的L值。將所說的樣品和對照樣品(即沒有酶洗滌的樣品)比較沒有纖維素酶500ECU/l2500ECU/l0.00-1.41-1.91ΔL值和對照樣品比較。所得的數(shù)據(jù)顯示在試驗(yàn)的條件下，沒有CBD的毀絲霉屬纖維素酶給出很好的顏色澄清作用。F.Myceliophthorathermophila的內(nèi)切葡聚糖酶和Humicolainsolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的基因融合體的構(gòu)建這兩種構(gòu)建的目的在于制造M.thermophila的內(nèi)切葡聚糖酶的衍生物，這種衍生物具有接頭和H.insolens(在WO91/17243中公開)的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的CBD。M.thermophila的天然內(nèi)切葡聚糖酶沒有接頭和/或纖維素結(jié)合域(CBD)。CM1構(gòu)建體1由M.thermophila的內(nèi)切葡聚糖酶(225個氨基酸)和H.insolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的72個C-末端氨基酸組成。CM2構(gòu)建體2由M.thermophila的內(nèi)切葡聚糖酶(225個氨基酸)和H.insolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的83個C-末端氨基酸組成。以從Taka-啟動子轉(zhuǎn)錄內(nèi)切葡聚糖酶基因的方法將H.insolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶cDNA克隆到pHD414中。形成的質(zhì)粒命名為pCaHj418。以相似的方法將M.thermophila的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA克隆到pHD414中，形成的質(zhì)粒命名為pA2C193。引物15′-CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGG-3′引物25′CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGCTCCG-3′引物35′-CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTAACGACGACGGCAACTTCCCTGCCG-3′引物45′-CGGCAGGGAAGTTGCCGTCGTCGTTACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGCTCCG-3′Taka-pro.引物5′CAACATCACATCAAGCTCTCC-3′AMG-term.引物5′CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3′通過如Higuchi等(1988)描述的PCR重疊延伸方法構(gòu)建內(nèi)切葡聚糖酶融合體。構(gòu)建體1反應(yīng)A利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物1和AMG-term.引物之間的pCaHj418的片段(H.insolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的接頭和CBD部分)。反應(yīng)BpA2C193中的Taka-pro引物和引物2之間的片段(M.thermophila的內(nèi)切葡聚糖酶基因)的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)C在整個側(cè)翼區(qū)引物(即Taka-pro引物和AMG-term.引物)存在的情況下，在第三個PCR中利用前面的兩個純化的片斷。構(gòu)建體2利用同樣的方法，其中引物3和引物4分別替代引物1和引物2。純化反應(yīng)C中擴(kuò)增的片段，以限制酶XbaI和BsstEII消化。將純化的消化片段連接在以限制酶XbaI和BsstEII消化的pA2C193上。用連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αF′(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)的感受態(tài)細(xì)胞，并分離包含基因融合體的克隆。通過DNA測序驗(yàn)證克隆部分的序列。SEQIDNO2A和SEQIDNO.3A顯示了兩個構(gòu)建體的基因序列。在如Perkin-Elmer推薦的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)A和B以94℃2分鐘開始，之后是20個循環(huán)(30秒鐘，94℃；30秒鐘，50℃；1分鐘，72℃)，并以72℃4分鐘結(jié)束。反應(yīng)C以(2分鐘，94℃；1分鐘，52℃；和2分鐘，72℃)開始，之后是15個循環(huán)(30秒鐘，94℃；30秒鐘，52℃；90秒鐘，72℃)，并以72℃4分鐘結(jié)束。如上面所述，將這兩個構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到米曲霉中。G.克隆的帶有纖維素結(jié)合域的纖維素酶的純化和性質(zhì)分析發(fā)酵后，從生產(chǎn)菌的胞外液分離回收克隆產(chǎn)物。然后，在含pH7.5的20mM磷酸鈉的漿液中使用150克的微晶纖維素，通過親合層析高度純化大約1克的纖維素酶。將所說的微晶纖維素與共含約1克纖維素酶的粗發(fā)酵液混合。在4℃下混合20分鐘后，將所說的微晶纖維素酶裝入大小為50×200mm的總體積400毫升的柱中。將柱用200ml緩沖液洗滌，然后在相同的緩沖液中以0.5MNaCl洗滌直到不再有蛋白質(zhì)洗脫液。然后以500ml20mm的Tris(pH8.5)洗滌。最后以1％三乙胺(pH11.8)洗脫純化的全長酶。將洗脫下來的酶溶液調(diào)至pH8，并利用帶有膜DOWGR61PP(閾值為20kD的聚丙烯)的Amicon室濃縮至每毫升含有5mg以上的蛋白質(zhì)。純化的纖維素酶性質(zhì)分析如下MwPI庫爾E.280S-CEVUSDS-PAGE/A.280毀絲霉屬(SEQIDNo.2)43kD474.950135頂孢霉屬(SEQIDNo.5)40kD568.020185梭孢殼屬(SEQIDNo.9)35kD4.352.47075活性超過50％N末端熱穩(wěn)定性DSC的pH毀絲霉屬(SEQIDNo.2)5.0-9.0封阻的80℃頂孢霉屬(SEQIDNo.5)6.0-9.5封阻的61℃梭孢殼屬(SEQIDNo.9)5.0-9.0ASGSG---83℃通過SDS-PAGE分析纖維素酶的分子量，并利用Pharmacia的標(biāo)準(zhǔn)LMW蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒計(jì)算纖維素酶的分子量。分子量明顯高于編碼氨基酸的組成的分子量，這是因?yàn)榻宇^區(qū)是O-糖基化的，結(jié)果導(dǎo)致高分子量。使用Pharmacia兩性電解質(zhì)PAG板(pH3.5至9.5)并再使用帶有已知PI的蛋白質(zhì)的Pharmacia試劑盒確定PI。利用已知吸收率的色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸以氨基酸組成為基礎(chǔ)計(jì)算摩爾消光系數(shù)。利用羧甲基纖維素作為底物，以0.5pH為間隔在40℃下培養(yǎng)20分鐘并計(jì)算還原糖的形成而獲得pH活性分布圖。計(jì)算了不同pH下的相對活性，表中包含有超過50％相對活性的間隔點(diǎn)。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)模型473A測序儀確定了純化的纖維素酶的N-末端。按照制造商的說明操作此蛋白質(zhì)測序儀。兩個纖維素酶被封阻，這是因?yàn)樾纬芍聼峁劝彼猁}的N-末端谷氨酰胺，無法檢測致熱谷氨酸鹽，并且其阻斷了進(jìn)一步的測序。利用MicroCalc公司的具有連續(xù)掃描速率的MC熱量計(jì)(calorimeter)，并將溫度以每小時90℃的速率從20℃升至90℃，在中性pH(7.0)下進(jìn)行DSC差示掃描量熱法。產(chǎn)生抗體。利用毀絲霉屬、頂孢霉屬和梭孢殼屬的纖維素酶在兔中產(chǎn)生抗體。將0.1毫克純化的溶解在0.9％NaCl溶液中的纖維素酶在注射前與弗氏佐劑混合。以一周間隔將兔免疫10次。通過硫酸銨沉淀(25％飽和)純化免疫球蛋白G組分(IgG)。在水中溶解沉淀，然后對乙酸鈉緩沖液(pH5.0，50mM)(隨去離子水的改變而改變)進(jìn)行徹底透析。過濾后，IgG組分由疊氮化鈉(0.01％)穩(wěn)定。利用瓊脂平板中的免疫擴(kuò)散，三個纖維素酶都和其同源的抗血清形成單一的免疫沉淀物，在3個克隆的纖維素酶和抗其它兩種纖維素酶產(chǎn)生的抗血清之間沒有見到沉淀。H-I.在緩沖液中測量構(gòu)建體1內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNo.2)除去表面纖絲和除去含纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-O-tometer液體體積100ml攪拌150次/分鐘(rpm)沖洗時間自來水5分鐘洗滌溫度40℃水硬度1mMCaCl2洗滌液體0.05M磷酸鹽緩沖液pH7.0洗滌時間30分鐘重復(fù)2次織物2塊舊黑色100％棉布樣品，5×6cm干燥滾動干燥評價由MacbethColorEye7000反射分光光度計(jì)測量光的反射。將反射值計(jì)算成ΔL(Hanter實(shí)驗(yàn)室值)。當(dāng)由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更亮，并得到更低的L值。結(jié)果</tables>所得的數(shù)據(jù)顯示在試驗(yàn)條件下，本發(fā)明的酶給出很好的顏色澄清度。H-II.在緩沖液中測定克隆的梭孢殼屬的內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNo.9)除去表面纖絲和除去含纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-O-tometer液體體積100ml攪拌150次/分鐘，垂直攪拌沖洗時間自來水10分鐘洗滌溫度40℃洗滌液體0.05M磷酸鹽緩沖液pH7.0洗滌時間30分鐘重復(fù)2次織物2塊舊黑色100％棉布樣品，5×6cm干燥滾動干燥評價由MacbethColorEye7000反射分光光度計(jì)測量光的反射。將反射值計(jì)算成ΔL(Hanter實(shí)驗(yàn)室值)。當(dāng)由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑和更好，并得到更低的L值。結(jié)果</tables>所得的數(shù)據(jù)顯示在試驗(yàn)的條件下，本發(fā)明的酶給出很好的顏色澄清度。H-III.在緩沖液中測定Volutellacolletrichoides的內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNo.17)除去表面纖絲和除去含有纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-O-tometer液體體積100ml攪拌150次/分鐘，垂直攪拌沖洗時間自來水5分鐘洗滌溫度40℃洗滌液體0.05M磷酸鹽緩沖液pH7.0洗滌時間30分鐘重復(fù)2次劑量2.5S-CEVU/ml織物2塊舊黑色100％棉布樣品，5×6cm(0.9克)干燥滾動干燥評價由DatacolorElrepho反射分光光度計(jì)測量光的反射。將反射值計(jì)算成ΔL(Hanter實(shí)驗(yàn)室值)。當(dāng)由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑，并得到更低的L值。將此樣品和對照樣品(即沒有酶洗滌的樣品)比較沒有纖維素酶有纖維素酶0.00-0.57和對照樣品比較的ΔL反射值。所得的數(shù)據(jù)顯示在試驗(yàn)條件下，Volutellhcolletrichoides纖維素酶給出很好的顏色澄清度。H-IV.在高pH高載洗滌劑中測量克隆的Thielaviaterrestris和Aclemoniumsp.CBS478.94的纖維素酶除去表面纖絲和除去含有纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-O-tometer液體體積150ml攪拌150次/分鐘，垂直攪拌沖洗時間自來水10分鐘洗滌溫度35℃洗滌液體1.0g/l的US型HDG(沸石/蘇打助劑，陰離子/非離子重量比＞2.5)pH10.0硬度1.0mMCaCl20.34mMMgCl2洗滌時間12分鐘重復(fù)6次織物2塊舊黑色棉布樣品，5×6cm(約150g/m2)2塊深色針織棉布樣品，5×6cm(約600g/m2)干燥滾動干燥評價由DatacolorElrepho反射分光光度計(jì)測量光的反射。將反射值計(jì)算成△L(Hanter實(shí)驗(yàn)室值)。當(dāng)由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑和更好，并得到更低的L值。分別試驗(yàn)了Thielaviaterrestris(SEQIDNO9)和Acremoniumsp.CBS478.94(SEQIDNO5)的克隆纖維素酶的不同劑量(分別稱為A和B)。結(jié)果</tables>所得的數(shù)據(jù)顯示在試驗(yàn)條件下，兩種纖維素酶都給出很好的顏色澄清度。H-V.測量從Thielaviaterrestris和Aclemoniumsp.CBS478.94以及構(gòu)建體1(SEQIDNo.2)克隆的纖維素酶除去表面纖絲和除去含纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-O-tometer液體體積150ml攪拌150次/分鐘，垂直攪拌沖洗時間自來水10分鐘洗滌溫度35℃硬度1.0mMCaCl20.34mMMgCl2洗滌液體2.0g/l的HDL(中性，檸檬酸助劑HDL，非離子/陰離子重量比＞0.5)pH7.0洗滌時間30分鐘重復(fù)2次織物2塊舊黑色棉布樣品，5×6cm(約150g/m2)2塊深色針織棉布樣品，4×7cm(約600g/m2)干燥滾動干燥評價由DatacolorElrepho反射分光光度計(jì)測量光的反射。將反射值計(jì)算成△L(CIE實(shí)驗(yàn)室值)。當(dāng)由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑和更好，并得到更低的L值。分別試驗(yàn)了Thielaviaterrestris(SEQIDNO9)和Acremoniumsp.CBS478.94(SEQIDNO5)及構(gòu)建體1(SEQIDNO2)的克隆纖維素酶的不同劑量(分別稱為A和B及C)。結(jié)果所得的數(shù)據(jù)顯示在試驗(yàn)條件下，所有的纖維素酶都給出很好的顏色澄清度。I.應(yīng)用Thielaviaterrestris和Acremoniumsp.及構(gòu)建體1(SEQIDNO.2)的內(nèi)切葡聚糖酶對斜紋粗棉布修整實(shí)驗(yàn)儀器洗滌機(jī)WascatorFL120液體體積20升織物1.1kg斜紋粗棉布織物，14.5OZ100％棉布脫漿10分鐘，55℃，pH750mlAquazyme120L2.5g/l磷酸鹽緩沖液磨蝕2小時；pH和溫度根據(jù)下表變化</tables>滅活15分鐘，80℃1g/l碳酸鈉沖洗在冷的自來水中，三個沖洗循環(huán)，各5分鐘評價利用Texflash2000作為磨蝕水平的測量手段，在420nm下測定織物的反射。用本發(fā)明的不同內(nèi)切葡聚糖酶處理斜紋粗棉布織物，結(jié)果列于下表</tables></tables>在斜紋粗棉布實(shí)驗(yàn)中，所有試驗(yàn)纖維素酶都顯示極好的性能，盡管每一種酶有其自身的作用方式。當(dāng)在斜紋粗棉布實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用SEQIDNO2的酶時，可能達(dá)到較高的磨蝕水平，同時強(qiáng)度損失很小。當(dāng)使用SEQIDNO9的酶處理斜紋粗棉布時，可以達(dá)到非常高的洗褪效果，幾乎使織物達(dá)到漂白的外觀。當(dāng)使用SEQIDNO5的酶進(jìn)行斜紋粗棉布實(shí)驗(yàn)時，在較低的最佳溫度下，能達(dá)到很高的磨蝕水平，這使得可能減少加熱并節(jié)約能源。J.Acremoniumsp.和Thielaviaterrestris的克隆纖維素酶用于Lyocell纖維的生物拋光以商品名Tencel出售的Lyocell纖維是在以水為基礎(chǔ)的溶劑中由木漿纖維素紡成的，所用的溶劑較用于正常粘膠纖維產(chǎn)生的溶劑更有利于環(huán)保。然而，當(dāng)把此種纖維加工成織物時，其有形成纖絲的趨勢，這種情況在織物表面可見，并稱為“絨毛”。利用纖維素酶，有可能永久地除去這種暴露的絨毛狀的纖維，極大地改進(jìn)成品織物的外觀，這種處理一般稱為“生物拋光”。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶尤其適于除去Lyocell表面的纖維。材料和方法紡織底物或者是100％編織的或者是不同種的深藍(lán)色的針織運(yùn)動衫的Tencel。為了提高視覺效果，黑色的和編織的運(yùn)動衫是優(yōu)選的，這使評價簡單化。編織的70/30Tencel/Rayon也可以限量使用?；蛘咭?00ml的規(guī)模，利用Launder-O-meter完成測定；或者以20升的規(guī)膜，利用Wascator完成測定。處理時間是wascator中55℃，60分鐘；LOM中60-90分鐘。緩沖液為2g/l的乙酸鈉(用醋酸調(diào)整pH至5)?？椢锖鸵后w的比率是1∶10，但是在Launder-O-meter中，使用了20個直徑14mm的鋼球(每個11克)，以獲得足夠的機(jī)械磨蝕效果。生物拋光后，立即在2g/l的碳酸鈉中80℃下進(jìn)行滅活15分鐘，之后用冷水沖洗。利用從1到5的絨毛分值評價所得的結(jié)果，其中1代表起始材料的纖絲的外觀，5代表高質(zhì)量的外觀，其表面上沒有可見的纖維。既然內(nèi)切纖維素酶是特別針對表面處理的，重量的損失低于2％，因此此項(xiàng)不包括在評價的指標(biāo)中。評價了兩種纖維素酶Acremoniumsp.(SEQlDNO.5)和Thielaviaterrestris(SEQIDNO.9)的克隆纖維素酶。兩種纖維素酶對Tencel及Tencel混合的織物都能去纖絲。利用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶，除去的只是很小的纖絲，而當(dāng)利用木霉屬的酸性纖維素酶混合物時，除去的是整個纖維。因此，利用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶時，被處理織物的強(qiáng)度損失保持在最小水平。下列劑量給出了良好的去纖絲作用，即絨毛分值為4或者以上每克織物15S-CEVU的Acremoniumsp.纖維素酶(SEQIDNO5)；和每克織物10S-CEVU的Thelaviaterrestris纖維素酶(SEQIDNO9)。實(shí)施例2通過表達(dá)克隆以及通過PCR克隆檢測由植物病原體產(chǎn)生的新的溶纖酶，這種植物病原體從大豆種子中分離出來，并鑒定為Macrophominaphaseolina。產(chǎn)生供PCR的生物量和表達(dá)克隆的方法使CBS281.96的分離物在振蕩燒瓶培養(yǎng)器中在富含纖維素馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液中生長，在26℃下培養(yǎng)5天(振蕩條件150rpm)。A.Macrophominaphaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶的克隆和表達(dá)從Macrophominaphaseolina分離mRNA，這種病原體生長在包含纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌以確保通氣良好。在生長3-5天之后收獲菌絲，立即在液氮中冷凍，并保存在-80℃。按所述方法，用1％的載體背景在大腸桿菌中構(gòu)建Macrophominaphaseolina的含有大約106單個克隆的文庫。用一些庫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化酵母，并從每一個庫中獲得包含250-400個酵母菌落的50-100個平板。鑒定內(nèi)切葡聚糖酶陽性菌落，并通過AZCLHE纖維素測定方法在SC瓊脂平板上分離。從酵母菌落上直接擴(kuò)增cDNA插入物，并如上面的材料和方法部分的描述進(jìn)行其性質(zhì)分析。SEQIDNO10中顯示了編碼內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO11中顯示了相應(yīng)的氨基酸序列。從DSM10512質(zhì)粒中能夠獲得該cDNA。從酵母菌落分離總DNA，并通過轉(zhuǎn)化如上述的大腸桿菌救援質(zhì)粒DNA。為了在曲霉屬中表達(dá)所說的內(nèi)切葡聚糖酶，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶f的DNA，在凝膠上對各個片斷進(jìn)行分級分離，將相應(yīng)于內(nèi)切葡聚糖酶基因的片段純化。將得到的基因連接到用適當(dāng)?shù)南拗泼赶膒HD414上，結(jié)果形成質(zhì)粒pA2C477。在大腸桿菌中進(jìn)行DNA擴(kuò)增之后，用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述的米曲霉。通過雜交篩選cDNA文庫和陽性克隆的特征分析利用隨機(jī)引物32P-標(biāo)記的M.phaseolina的PCR產(chǎn)物作為雜交探針篩選大腸桿菌中的MacrophominaphaseolinacDNA文庫的大約6000克隆形成單位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。通過對cDNA插入物末端進(jìn)行測序和通過確定兩條鏈中最長的cDNA的核苷酸序列而確定陽性cDNA克隆。SEQIDNO10顯示了編碼內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO11顯示了相應(yīng)的氨基酸序列。B.Macrophominaphaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶和Humicolainsolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶基因融合體的構(gòu)建制備一種構(gòu)建體的目的是制造M.phaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶的衍生物，這種衍生物具有H.insolens(在WO91/17243中公開)的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的接頭和CBD。M.phaseolina的天然內(nèi)切葡聚糖酶沒有接頭和/或纖維素結(jié)合域CBD。此構(gòu)建體由M.phaseolina的內(nèi)切萄聚糖酶(223個氨基酸)和H.insolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的72個C-末端氨基酸組成。將H.insolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA以此內(nèi)切葡聚糖酶基因從Taka-啟動子轉(zhuǎn)錄的方式克隆到pHD414中。形成的質(zhì)粒命名為pCaHj418。將編碼M.phaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA作為BstXI/NotI片段克隆到pYES2.0中，形成的質(zhì)粒命名為pClC477。引物引物15′-GGTCGCCCGGACTGGCTGTTCCCGTACCCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGG-3′引物25′-CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGGGTACGGGAACAGCCAGTCCGGGCGACC-3′pYES2.0F.HT引物5′-CGGACTACTAGCAGCTGTAATACG-3′AMG-term.引物5′-CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3′通過如Higuchi等(1988)描述的PCR重疊延伸方法構(gòu)建內(nèi)切葡聚糖酶融合體。反應(yīng)A利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物1和AMG-term.引物之間的pCaHj418的片段(H.insolens的43kD內(nèi)切葡聚糖酶的接頭與CBD部分)。反應(yīng)BpYES2.0F.HT引物和引物2之間的pClC477的片段(M.phaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶基因)的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)C在整個側(cè)翼區(qū)引物(即pYES2.0F.HT引物和AMG-term.引物)存在的情況下，在第三個PCR中利用前面的兩個純化的片段。純化反應(yīng)C中擴(kuò)增的片段，以限制酶XbaI和BamHI消化。將純化的消化片段連接在以限制酶XbaI和BamHI消化的pHD414上。用連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αF′(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)的感受態(tài)細(xì)胞，并分離包含基因融合體的菌落。通過DNA測序驗(yàn)證克隆部分的序列。在如Perkin-Elmer推薦的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)A和B以94℃2分鐘開始，之后是20個循環(huán)(30秒鐘，94℃；30秒鐘，52℃；1分鐘，72℃)，并以72℃4分鐘結(jié)束。反應(yīng)C以(2分鐘，94℃；1分鐘，52℃；和2分鐘，72℃)開始，之后是20個循環(huán)(30秒鐘，94℃；30秒鐘，52℃；90秒鐘，72℃)，并以72℃4分鐘結(jié)束。如上面所述，將此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到米曲霉中。實(shí)施例3Acremoniumsp.和糞生糞殼的內(nèi)切葡聚糖酶的克隆和表達(dá)。表達(dá)克隆的生物量的產(chǎn)生方法使CBS478.94的分離物和ATCC52644分別在振蕩燒瓶培養(yǎng)器中在富含纖維素的馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液中生長，在26℃下培養(yǎng)5天(振蕩條件150rpm)。分別從Acremoniumsp.CBS478.94和糞生糞殼ATCC52644中分離mRNA，這兩種生物體生長在包含纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌以確保通氣良好。在生長3-5天之后收獲菌絲，立即在液氮中冷凍，并保存在-80℃。如上所述，用1％的載體背景在大腸桿菌中分別構(gòu)建Acremoniumsp.CBS478.94和糞生糞殼ATCC52644(每個含有大約106單個克隆)的文庫。用每一個文庫中一些集合質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化酵母，并從每一個集合中獲得包含250-400個酵母菌落的50-100個平板。鑒定內(nèi)切葡聚糖酶陽性菌落，并通過AZCLHE纖維素測定方法在SC瓊脂平板上分離。從酵母菌落上直接擴(kuò)增cDNA插入物，并如上面的材料和方法部分的描述進(jìn)行其性質(zhì)分析。SEQIDNO6中顯示了編碼Acremoniumsp.的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO7中顯示了相應(yīng)的氨基酸序列。從DSM10080的質(zhì)粒中能夠獲得此cDNA。SEQIDNO19中顯示了編碼糞生糞殼的內(nèi)切葡聚糖酶之cDNA的部分DNA序列(cDNA的5′末端的核苷酸序列)，SEQIDNO20顯示了相應(yīng)的氨基酸序列。從DSM10576的質(zhì)粒中能夠獲得此cDNA。從酵母菌落分離總DNA，并通過轉(zhuǎn)化如上述的大腸桿菌救援質(zhì)粒DNA。為了在曲霉屬中表達(dá)所說的內(nèi)切葡聚糖酶，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶f的DNA，在凝膠上對各個片斷進(jìn)行分級分離，將分別相應(yīng)于Acremoniumsp.和糞生糞殼的內(nèi)切葡聚糖酶基因的片段純化。將得到的基因連接到用適當(dāng)?shù)南拗泼赶膒HD414上，結(jié)果分別形成質(zhì)粒pA2C371和pA2C502。在大腸桿菌中進(jìn)行DNA擴(kuò)增之后，用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述的米曲霉。實(shí)施例4A.由PCR克隆CrinipellisscabellaCBS280.96的內(nèi)切葡聚糖酶使CBS280.96的分離物在靜態(tài)的燒瓶培養(yǎng)器中含小麥麩的培養(yǎng)基(每燒瓶300g小麥麩添加450ml的鹽溶液)上生長，其中，在26℃下培養(yǎng)6天。培養(yǎng)后，以蒸餾水抽提小麥麩(每燒瓶300ml)，并在1％瓊脂糖(Litex瓊脂糖Medinova)中檢驗(yàn)提取物的內(nèi)切葡聚糖酶活性(0.1％AZCL-HE-纖維素(megazyme))。在pH為3.0，7.0和9.5的平板上觀察活性。從如上所述生長的Crinipellisscabella中分離mRNA。在生長3-5天之后收獲菌絲，立即在液氮中冷凍，并保存在-80℃。如上所述，用1％載體背景，在大腸桿菌中構(gòu)建Crinipellisscabella(每個含有大約106單個克隆)的文庫。利用隨機(jī)引物32P-標(biāo)記的C.scabella的PCR產(chǎn)物作為雜交探針，篩選大腸桿菌中的CrinipellisscabellacDNA文庫的大約10000克隆形成單位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。通過對cDNA插入物末端進(jìn)行測序和通過確定兩條鏈中最長的cDNA的核苷酸序列而確定陽性cDNA克隆。SEQIDNO12顯示了編碼內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO13顯示了相應(yīng)的氨基酸序列?？梢詮腄SM10511中的質(zhì)粒獲得此cDNA。從酵母菌落分離總DNA，并通過轉(zhuǎn)化如上述的大腸桿菌救援質(zhì)粒DNA。為了在曲霉屬中表達(dá)所說的內(nèi)切葡聚糖酶，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶f的DNA，在凝膠上對各個片段進(jìn)行分級分離，將分別相應(yīng)于所說的內(nèi)切葡聚糖酶基因的片段純化。接下來將得到的基因連接到用適當(dāng)?shù)南拗泼赶膒HD414上，結(jié)果形成質(zhì)粒pA2C475。在大腸桿菌中進(jìn)行DNA擴(kuò)增之后，用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述的米曲霉。Crinipellisscabella的內(nèi)切葡聚糖酶和Humicolainsolensinsolens的43kDa的內(nèi)切葡聚糖酶的接頭/CBD區(qū)的基因融合體的構(gòu)建Crinipellisscabella的天然內(nèi)切葡聚糖酶既沒有接頭也沒有纖維素結(jié)合域(CBD)。此外，全長cDNA在編碼內(nèi)切葡聚糖酶的開放讀框(ORF)的上游包含ATG起始密碼子，這可能導(dǎo)致基于異源cDNA表達(dá)的混雜翻譯的起始，如在酵母(啤酒酵母)和絲狀真菌(米曲霉)中。這樣，利用通過重疊延伸的剪接(SOE)已經(jīng)構(gòu)建了Crinipellisscabella的內(nèi)切葡聚糖酶和Humicolainsolens的43kD的內(nèi)切葡聚糖酶的接頭/CBD區(qū)(在WO91/17243中公開)的兩個基因融合體(Horton等，1989)。構(gòu)建體1由編碼C.scabella的內(nèi)切葡聚糖酶的226個殘基的cDNA組成，此cDNA通過PCR與H.insolens的編碼位于H.insolens43kD內(nèi)切葡聚糖酶的COOH-末端的接頭和CBD區(qū)(72個氨基酸)的cDNA的3′-末端連接。第二個雜交構(gòu)建體和前述的基因構(gòu)建體相同，只是通過PCR缺失了推定的信號肽的前5′個殘基，結(jié)果使信號肽變短，此信號肽從第二個框內(nèi)起始密碼子開始。質(zhì)粒構(gòu)建體質(zhì)粒pClC475包含C.scabella的全長cDNA，將其克隆到BstXI/NotI-切口酵母表達(dá)載體pYES2.0中；質(zhì)粒pClC144包含H.insolens的全長cDNA，將其克隆到pYES2.0的BstXI位點(diǎn)上。經(jīng)重疊延伸的剪接利用50-100ng的pClC475為模板，各300-350pmol的正向引物(正向引物15′-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3′；正向引物25′-CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3′)，250pmol的反向引物(5′-GACCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGTTTACGAACACAGCCCGAGATATTAGTG-3′)，DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，USA)，在PCR緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.3；50mMKCl；1.5mMMgCl2；0.01％明膠；包含每種dNTP200μM)中產(chǎn)生編碼C.scabella的內(nèi)切葡聚糖酶的核心區(qū)的兩個PCR片段。利用循環(huán)方式(94℃變性1分鐘；55℃退火2分鐘；72℃延伸3分鐘)進(jìn)行三十個PCR循環(huán)。利用100ng的pClC144作為模板，250pmol的正向引物(5′-CACTAATATCTCGGGC-TGTGTTCGTAAACCCTCCAGCAGCACCA-GCTCTCCGGTC-3′)，250pmol的pYES2.0反向引物(5′-GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3′)，DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，USA)，在PCR緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.3；50mMKCl；1.5mMMgCl2；0.01％明膠；包含每種dNTP200(μM)中產(chǎn)生編碼H.insolens的內(nèi)切葡聚糖酶的接頭和CBD的PCR片段。如上文進(jìn)行三十個PCR循環(huán)。將PCR產(chǎn)物在0.7％低膠凝溫度的瓊脂糖凝膠(SeaPlaque，F(xiàn)MC)中進(jìn)行電泳，從凝膠中切割目的片段，并按照制造商的說明通過瓊脂糖酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，美國)處理，之后是苯酚抽提和在-20℃下通過加入2體積的96％EtOH和0.1體積的3MNaAc乙醇沉淀12小時回收目的片段。通過在兩種組合的PCR緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.3；50mMKCl；1.5mMMgCl2；0.01％明膠；包含每種dNTP200μM)中組合上述的重疊PCR片段(每個模板約50ng)產(chǎn)生Crinipellisscabella的內(nèi)切葡聚糖酶和Humicolainsolen的43kD的內(nèi)切葡聚糖酶的接頭/CBD區(qū)的重組雜合基因。利用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，USA)進(jìn)行SOE反應(yīng)。利用循環(huán)方式(94℃變性1分鐘；55℃退火2分鐘；72℃延伸3分鐘)進(jìn)行二個PCR循環(huán)，終止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入各末端引物(正向引物15′-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3′；正向引物25′-CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3′；反向引物5′-GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3′)，利用循環(huán)方式(94℃變性1分鐘；55℃退火2分鐘；72℃延伸3分鐘)進(jìn)行另外三十個PCR循環(huán)。用于米曲霉中異源表達(dá)的表達(dá)盒的構(gòu)建將PCR產(chǎn)生的重組片段在0.7％低膠凝溫度的瓊脂糖凝膠(SeaPlaque，F(xiàn)MC)中進(jìn)行電泳，從凝膠中切割目的片段，并按照制造商的說明通過瓊脂糖酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，美國)處理，之后是苯酚抽提和在-20℃下乙醇沉淀12小時回收目的片段。以HindIII和XbaI進(jìn)行DNA片段消化，將DNA片段連接在HindIII/XbaI切割的pHD414載體上，之后按照制造商的說明將構(gòu)建體電穿孔到大腸桿菌DH10B細(xì)胞(生命技術(shù)，美國)中。如材料和方法部分所描述的，從兩條鏈測定形成的基因融合體的核苷酸序列，SEQIDNO14A和15A。如所描述的，這些構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)化米曲霉。實(shí)施例5從46個絲狀真菌和單軸真菌(monocentricfungi)中用PCR檢測所說的溶纖酶類型，這些真菌代表23個科的32個屬，屬于7個綱的15個目，總而言之包括真菌的所有4個組子囊真菌、擔(dān)子真菌、壺真菌和接合真菌5.1材料1.棉色二孢菌株的保藏，保藏號CBS274.962.Ulosporabilgramii(Hawksw等)Hawksw等菌株的保藏號NKBC1444，3.Microsphaeropsissp4.AscobolusstictoideusSpeg.菌株的保藏號Q026(NovoNordisk保藏中心)分離自鵝糞，Svalbard，挪威5.Saccobolusdilutellus(Fuck)Sacc.菌株的保藏保藏號CBS275.966.疣孢青霉Peyronel物種的保藏號ATCC623967.產(chǎn)黃青霉Thom菌株的保藏號ATCC94808.ThermomycesverrucosusPugh等菌株的保藏保藏號CBS285.969.鹿角團(tuán)炭角菌L.exGreville菌株的保藏保藏號CBS284.9610.點(diǎn)孔座殼(Fr.exL.)Fr.參見A.Munk丹麥Pyrenomyceles，DanskBotaniskArkiv，Voll7，1195711.Nodulisporumsp分離自在中國云南省昆明植物園中生長的山茶的葉片(茶科，Guttiferales)12.Cylindrocarponsp分離自海上樣品，Bahamas13.蛇形鐮孢Sherbakoff菌株的保藏號IFO446714.早熟禾鐮孢(Peck)Wr.物種的保藏號ATCC6088315.腐皮鐮孢(Mart.)Sacc.emnd.Snyd&amp;Hans.菌株的保藏號IMI107.51116.番茄尖鐮孢(Sacc.)Snyd.&amp;Hans.菌株的保藏號CBS645.7817.尖鐮孢ssppassiflora菌株的保藏號CBS744.7918.鏈孢粘帚霉Gillman&amp;Abbott菌株的保藏號ATCC1052319.NectriapineaDingley菌株的保藏，保藏號CBS279.9620.大孢糞殼Auerswald物種的保藏號ATCC6025521.灰腐質(zhì)霉Traee物種的保藏號ATCC2272622.黑腐質(zhì)霉omvik菌株的保藏號CBS819.7323.Scytalidiumthermophilum(CooneyetEmerson)Austwick菌株的保藏號ATCC2808524.ThielaviathermophilaFergusetSinden(別名Corynascusthermophilus)菌株的保藏號CBS174.70，IMI145.13625.CladorrhinumfoecundissimumSaccardoetMarchal物種的保藏號ATCC6237326.Syspastosporaboninensis菌株的保藏號NKBC1515(日本大學(xué)，profeTubaki保藏中心)27.管毛殼Fuckel菌株的保藏號CBS799.8328.巴西毛殼BatiaetPotual菌株的保藏號CBS122.6529.墻毛殼Corda菌株的保藏號CBS163.5230.Chaetomiumvirescens(vonArx)Udagawa菌株的保藏號CBS547.7531.Nigrosporasp菌株的保藏保藏號CBS272.9632.Nigrosporasp分離自33.Diaporthesyngenesia菌株的保藏保藏號CBS278.9634.葫蘆科刺盤孢(Passerini)EllisetHalsted別名圍小叢殼VarorbiculareJenkinsetWinstead物種的保藏號ATCC5260935.黑膠耳Fr.菌株的保藏保藏號CBS277.9636.木蹄層孔菌(L.)Fr.菌株的保藏保藏CBS276.9637.綿皮孔菌屬(？)菌株的保藏號CBS283.9638.紅根囊壺菌(deBary&amp;Wor)Fischer菌株的保藏保藏號CBS282.9639.Rhizomucorpusillus(Lindt)Schipper別名微小毛霉菌株的保藏號IFO457840.閃光須霉(Kunze)vanTieghem&amp;LeMonnier菌株的保藏號IFO481441.弗雷生刺枝霉vanTieghem&amp;LeMonnier別名Helicostylumfresenii菌株的保藏號NRRL230542.粉紅單端孢菌株的保藏號IFO537243.ConiotheciumspEndophyte分離自中國云南省昆明的鮮花植物的葉片44.菌株的保藏物保藏號CBS271.96Coelomycete，分離自牙買加Christiana的Artocarpusaltilis的葉片(?？疲琔rticales)45.菌株的保藏物保藏號CBS273.96Coelomycete，分離自牙買加達(dá)拉斯山的Pimentadioica(桃金娘科，Myrtales)的葉片46.菌株的保藏號CBS270.96Coelomycete，分離自生長在牙買加達(dá)拉斯山的Pseudocalymmaalliaceum(Bignoniaceae，Solanales)的葉片5.2方法菌株的保持和生物量的產(chǎn)生將菌株保持在培養(yǎng)皿(9cm)中的瓊脂或斜面上(參見培養(yǎng)基表PCA和PDA)。在以下生長條件之下在搖瓶中培養(yǎng)44種菌株如PC、PD和PB9或YPG的普通培養(yǎng)基(參見培養(yǎng)基表)；培養(yǎng)時間3至9天；溫度26℃；rpm在175-150之間。使14號菌株(F.poae)在小麥麩上生長l5天(26℃；靜態(tài))。使38號菌株在加有1cm2高壓滅菌濾紙片的稀釋的鹽溶液(DS/2)中生長。活性試驗(yàn)在由1％瓊脂糖(HSB，Litex瓊脂糖，Medinova)制成的0.1％AZCL-HE-纖維素(Megazyme)平板(14cm培養(yǎng)皿)上試驗(yàn)活性。所有試驗(yàn)均以3份進(jìn)行，即將AZCL-HE-纖維素溶解在三種緩沖液中，調(diào)節(jié)至pH3，7或9.5(使用各種比例的以下兩種組分一水檸檬酸單水合物，Merck產(chǎn)品號100244(21.0g)，溶解在水中，使總體積為1000毫升；0.1Mdodecabrohydrate三鈉，Merck產(chǎn)品號6578(38g)，溶解在水中，使總體積為1000毫升。在臨用前混合。收獲生物量通過過濾(根據(jù)真菌的生長調(diào)節(jié)濾器網(wǎng)眼，最細(xì)的用于具有高度孢子形成菌絲體的真菌，例如Fusariumspp.)收獲生物量。將在濾器上的生物量刮至無菌塑料袋中，并立即冷凍(掩沒到液氮中)。5.3結(jié)果I.使用材料和方法中描述的PCR篩選與擴(kuò)增技術(shù)，獲得了下列部分cDNA序列Saccobolusdilutellus(Fuck)Sacc.CBS275.96SEQIDNO21(和在SEQIDNO22中的推定的氨基酸序列)；ThermomycesverrucosusCBS285.96SEQIDNO23(和在SEQIDNO24中的推定的氨基酸序列)；鹿角團(tuán)炭角菌CBS284，96SEQIDNO25(和在SEQIDNO26中的推定的氨基酸序列)；番茄尖鐮孢CBS645.78SEQIDNO27(和在SEQIDNO28中的推定的氨基酸序列)；NectriapineaCBS279.96SEQIDNO29(和在SEQIDNO30中的推定的氨基酸序列)；灰腐質(zhì)霉ATCC22726SEQIDNO31(和在SEQIDNO32中的推定的氨基酸序列)；黑腐質(zhì)霉CBS819.73SEQIDNO33(和在SEQIDNO34中的推定的氨基酸序列)；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373SEQIDNO35(和在SEQIDNO36中的推定的氨基酸序列)；SyspastosporaboninensisNKBC1515SEQIDNO37(和在SEQIDNO38中的推定的氨基酸序列)；Nigrosporasp.CBS272.96SEQIDNO39(和在SEQIDNO40中的推定的氨基酸序列)；弗雷生刺枝霉SEQIDNO41(和在SEQIDNO42中的推定的氨基酸序列)；黑膠耳CBS277.96SEQIDNO43(和在SEQIDNO44中的推定的氨基酸序列)；Coniotheciumsp.SEQIDNO45(和在SEQIDNO46中的推定的氨基酸序列)；保藏物CBS271.96SEQIDNO47(和在SEQIDNO48中的推定的氨基酸序列)；保藏物CBS270.96SEQIDNO49(和在SEQIDNO50中的推定的氨基酸序列)；棉色二孢CBS274.96SEQIDNO51(和在SEQIDNO52中的推定的氨基酸序列)；UlosporabilgramiiNKBC1444SEQIDNO53(和在SEQIDNO54中的推定的氨基酸序列)；疣孢青霉ATCC62396SEQIDNO55(和在SEQIDNO56中的推定的氨基酸序列)；點(diǎn)孔座殼SEQIDNO57(和在SEQIDNO58中的推定的氨基酸序列)；蛇形鐮孢，IFO4467SEQIDNO59(和在SEQIDNO60中的推定的氨基酸序列)；ThielaviathermophilaCBS174.70SEQIDNO61(和在SEQIDNO62中的推定的氨基酸序列)；管毛殼CBS799.83SEQIDNO63(和在SEQIDNO64中的推定的氨基酸序列)；ChaetomiumvirescensSEQIDNO65(和在SEQIDNO66中的推定的氨基酸序列)；葫蘆科刺盤孢SEQIDNO67(和在SEQIDNO68中的推定的氨基酸序列)；閃光須霉SEQIDNO69(和在SEQIDNO70中的推定的氨基酸序列)；和粉紅單端孢SEQIDNO71(和在SEQIDNO72中的推定的氨基酸序列)。II.使用材料和方法中描述的PCR篩選與擴(kuò)增技術(shù)，獲得了部分編碼本發(fā)明的酶的部分cDNA序列，按照布達(dá)佩斯條約保藏了質(zhì)粒大腸桿菌，DSM10583，保藏日1996年3月13日；來源于粉紅單端孢的cDNA；大腸桿菌，DSM10584，保藏日1996年3月13日；來源于Syspastosporaboninensis的cDNA；大腸桿菌，DSM10585，保藏日1996年3月13日；來源于Cheatomiummurorum的cDNA；大腸桿菌，DSM10587，保藏日1996年3月13日；來源于糞生糞殼的cDNA；大腸桿菌，DSM10588，保藏日1996年3月13日；來源于未鑒別的菌株CBS273.96的cDNA；大腸桿菌，DSM10586，保藏日1996年3月13日；來源于Spongipellissp的cDNA。粗上清液的顏色澄清作用在正常的洗滌期間，織物常常褪色。然而，如果織物用使顏色澄清的纖維素酶洗滌，則織物的外觀得到改善，原來的顏色得到更好地保持或保留。以除去含纖維素纖維的織物紗突出的表面纖絲和纖維的作用測定顏色的澄清作用。裝置Terg-o-tometer液體體積100毫升攪拌用垂直攪拌器150次/分鐘沖洗時間在自來水中5分鐘洗滌溫度40℃洗滌液0.05M磷酸鹽緩沖液pH7.0洗滌時間30分鐘重復(fù)2次酶以下所示菌株的粗上清液劑量200，500，1000或2500S-CEVU/l的兩種劑量織物2塊舊黑100％棉布，5×6cm(0.9克)干燥滾動干燥評價經(jīng)DatacolorElrepho反射分光光度測量反發(fā)射。以ΔL(Hunter實(shí)驗(yàn)值)計(jì)算反射。當(dāng)從紗突出的表面纖絲和纖維被纖維素酶除去時，黑色的織物的表面顯得更黑，獲得更低的L值。將樣品與一種對照樣品(即不用酶洗滌)比較。以下顯示了與對照樣品比較的ΔLR反射值。ECU/l菌株2005002000250013.蛇形鐮孢n.t.-0.71n.t.-1.2815.腐皮鐮孢n.t.-0.96n.t.-1.3724.Thieiaviathermophila-0.30n.t.-1.25n.t.25.Cladorrhinumfoecun.n.t-1.79n.t.-2.1837.Spongipeliis(？)n.t.-1.01n.t.-1.6339.Rhizomucorpusillusn.t.-1.90n.t.-2.6641.弗雷生刺枝霉n.t.-0.17n.t.-1.3345.保藏號CBS273.96n.t.-1.31n.t.-1.20數(shù)據(jù)表明，在試驗(yàn)條件下，所有菌株都給出良好的澄清作用(n.t.＝在這一劑量下未試驗(yàn))。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名NovoNordiskA/S(B)街道NovaAile(C)城市DK-2880Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵區(qū)代碼(ZIP)DK-2880(G)電話+4544448888(H)傳真+4544493256(ii)發(fā)明名稱新的內(nèi)切葡聚糖酶(iii)序列數(shù)72(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM-PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentlnRelease#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQIDNO1A的信息(i)序列特征(A)長度891個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物體啤酒糖酵母(B)菌株DSM9770(xi)序列描述SEQIDNO1AAAAGAAAGGCTCTCTGCTGTCGTCGCTCTCGTCGCTCTCGTCGGCATCCTCCATCCGTCC60GCCTTTGATAACCCGCTCCCCGACTCAGTCAAGACGACGCATACTTGGCACCATGCATCT120CTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGGACCAGCTCTCGGGCAT180CGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCGAGCTGCGCCTGGCCCGGCAAGGG240CCCCTCGTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGACGGCGGCTC300CACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAGAGCCCCTG360GGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGCAGCTCCGA420GTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTCGCGGGCAA480GAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCACTTTGACCT540GGCCATCCCCGGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTACGGCGCTCC600CCCGAACGGCTGGGGCGACCGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGCGAATCCTT660CCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCAAAACGCCGACAA720CCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTG780CTCCCGTTAAGAGGGAAGAGAGGGGGCTGGAAGGACCGAAAGATTCAACCTCTGCTCCTG840CTGGGGAAGCTCGGGCGCGAGTGTGAAACTGGTGTAAATATTGTGGCACACACAAGCTAC900TACAGTCCGTCTCGCCGTCCGGCTAACTAGCCTTGCTGCGGATCTGTCCAAAAAAAAAAA960(2)SEQIDNO1B的信息(i)序列特征(A)長度225個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO1BMetHisLeuSerAlaThrThrGlyPheLeuAlaLeuProValLeuAla151015LeuAspGlnLeuSerGlyIleGlyGlnThrThrArgTyrTrpAspCys202530CysLysProSerCysAlaTrpProGlyLysGlyProSerSerProVal354045GlnAlaCysAspLysAsnAspAsnProLeuAsnAspGlyGlySerThr505560ArgSerGlyCysAspAlaGlyGlySerAlaTyrMetCysSerSerGln65707580SerProTrpAlaValSerAspGluLeuSerTyrGlyTrpAlaAlaVal859095LysLeuAlaGlySerSerGluSerGlnTrpCysCysAlaCysTyrGlu100105110LeuThrPheThrSerGlyProValAlaGlyLysLysMetIleValGln115120125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGlyAspAsnHisPheAspLeuAla130135140IleProGlyGlyGlyValGlyIlePheAsnAlaCysThrAspGlnTyr145150155160GlyAlaProProAsnGlyTrpGlyAspArgTyrGlyGlyIleHisSer165170175LysGluGluCysGluSerPheProGluAlaLeuLysProGlyCysAsn180185190TrpArgPheAspTrpPheGlnAsnAlaAspAsnProSerValThrPhe195200205GlnGluValAlaCysProSerGluLeuThrSerLysSerGlyCysSer210215220Arg225(2)SEQIDNO2A的信息(i)序列特征(A)長度894個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體“構(gòu)建體1”(xi)序列描述SEQIDNO2AATGCATCTCTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGGACCAGCTC60TCGGGCATCGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCGAGCTGCGCCTGGCCC120GGCAAGGGCCCCTCGTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGAC180GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG240AGCCCCTGGGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC300AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC360GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC420TTTGACCTGGCCATCCCCGGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTAC480GGCGCTCCCCCGAACGGCTGGGGCGACCGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGC540GAATCCTTCCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCAAAAC600GCCGACAACCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAG660AGCGGCTGCTCCCGTCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACC720AGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGC780TGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGC840GTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGTAG894(2)SEQIDNO2B的信息(i)序列特征(A)長度297個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO2BMetHisLeuSerAlaThrThrGlyPheLeuAlaLeuProValLeuAla151015LeuAspGlnLeuSerGlyIleGlyGlnThrThrArgTyrTrpAspCys202530CysLysProSerCysAlaTrpProGlyLysGlyProSerSerProVal354045GlnAlaCysAspLysAsnAspAsnProLeuAsnAspGlyGlySerThr505560ArgSerGlyCysAspAlaGlyGlySerAlaTyrMetCysSerSerGln65707580SerProTrpAlaValSerAspGluLeuSerTyrGlyTrpAlaAlaVal859095LysLeuAlaGlySerSerGluSerGlnTrpCysCysAlaCysTyrGlu100105110LeuThrPheThrSerGlyProValAlaGlyLysLysMetIleValGln115120125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGlyAspAsnHisPheAspLeuAla130135140IleProGlyGlyGlyValGlyIlePheAsnAlaCysThrAspGlnTyr145150155160GlyAlaProProAsnGlyTrpGlyAspArgTyrGlyGlyIleHisSer165170175LysGluGluCysGluSerPheProGluAlaLeuLysProGlyCysAsn180185190TrpArgPheAspTrpPheGlnAsnAlaAspAsnProSerValThrPhe195200205GlnGluValAlaCysProSerGluLeuThrSerLysSerGlyCysSer210215220ArgProSerSerSerThrSerSerProValAsnGlnProThrSerThr225230235240SerThrThrSerThrSerThrThrSerSerProProValGlnProThr245250255ThrProSerGlyCysThrAlaGluArgTrpAlaGlnCysGlyGlyAsn260265270GlyTrpSerGlyCysThrThrCysValAlaGlySerThrCysThrLys275280285IleAsnAspTrpTyrHisGlnCysLeu290295(2)SEQIDNO3A的信息(i)序列特征(A)長度927個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體“構(gòu)建體2”(xi)序列描述SEQIDNO3AATGCATCTCTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGGACCAGCTC60TCGGGCATCGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCGAGCTGCGCCTGGCCC120GGCAAGGGCCCCTCGTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGAC180GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG240AGCCCCTGGGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC300AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC360GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC420TTTGACCTGGCCATCCCCGGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTAC480GGCGCTCCCCCGAACGGCTGGGGCGACCGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGC540GAATCCTTCCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCAAAAC600GCCGACAACCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAG660CGACGGCAACTTCCCTGCCGTCCAGATCCCCTCCAGCAGCAGCGGCTGCTCCCGTAACGACGACGGCAACTTCCCTGCCGTCCAGATCCCCTCCAGCAGC720ACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCG780AGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGCTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGC840GGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCA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rGlyPheAlaAlaThrAla354045LeuAlaGly50(2)SEQIDNO35的信息(i)序列特征(A)長度181個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體Cladorrhinumforcundissimun(B)菌株ATCC62373(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...181(xi)序列描述SEQIDNO35GTCAACCGCCCTGTCCTCGCCTGCGACGCAAACAACAACCCTCTGACC48ValAsnArgProValLeuAlaCysAspAlaAsnAsnAsnProLeuThr151015GACGCCGGCGTCAAGTCCGGATGTGATGGCGGTTCTGCATACACCTGT96AspAlaGlyValLysSerGlyCysAspGlyGlySerAlaTyrThrCys202530GCCAACAACTCCCCATGGGCAGTGAACGACCAGCTCGCCTACGGCTTT144AlaAsnAsnSerProTrpAlaValAsnAspGlnLeuAlaTyrGlyPhe354045GCCGCCACCAAACTGAGCGGCGGAACTGAGTCGTCA180AlaAlaThrLysLeuSerGlyGlyThrGluSerSer505560(2)SEQIDNO36的信息(i)序列特征(A)長度60個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO36ValAsnArgProValLeuAlaCysAspAlaAsnAsnAsnProLeuThr151015AspAlaGlyValLysSerGlyCysAspGlyGlySerAlaTyrThrCys202530AlaAsnAsnSerProTrpAlaValAsnAspGlnLeuAlaTyrGlyPhe354045AlaAlaThrLysLeuSerGlyGlyThrGluSerSer505560(2)SEQIDNO37的信息(i)序列特征(A)長度64個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體Syspastosporaboninensis(B)菌株NKBC1515(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...64(xi)序列描述SEQIDNO37GGCTGCGACGGCGGCAGCGCCTTCACCTGCTCCAACAACTCTCCATGG48GlyCysAspGlyGlySerAlaPheThrCysSerAsnAsnSerProTrpGCTGTGAACGAAGAT63AlaValAsnGluAsp(2)SEQIDNO38的信息(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO38GlyCysAspGlyGlySerAlaPheThrCysSerAsnAsnSerProTrpAlaValAsnGluAsp(2)SEQIDNO39的信息(i)序列特征(A)長度153個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體Nigrosporasp.(B)菌株CBS272.96(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...153(xi)序列描述SEQIDNO39ACAAGAAACGACGGGCCCCTGTCCAGCCCCGATGCCGCCTCCGGCTGT48ThrArgAsnAspGlyProLeuSerSerProAspAlaAlaSerGlyCys253035GATGGCGGCGAAGCCTTTGCCTGTTCTAATACCTCGCCTTGGGCCGTC96AspGlyGlyGluAlaPheAlaCysSerAsnThrSerProTrpAlaVal404550AGCGACCAGCTCGCGTACGGATACGTCGCCACGTCCATCTCCGGCGGC144SerAspGlnLeuAlaTyrGlyTyrValAlaThrSerIleSerGlyGly556065ACCGAGTCA153ThrGluSer70(2)SEQIDNO40的信息(i)序列特征(A)長度51個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO40ThrArgAsnAspGlyProLeuSerSerProAspAlaAlaSerGlyCys151015AspGlyGlyGluAlaPheAlaCysSerAsnThrSerProTrpAlaVal202530SerAspGlnLeuAlaTyrGlyTyrValAlaThrSerIleSerGlyGly354045ThrGluSer50(2)SEQIDNO41的信息(i)序列特征(A)長度159個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體弗雷生刺枝霉(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...159(xi)序列描述SEQIDNO41GTCCGAACGTGTAGTGCCAACGACTCGCCCTTGTCCGACCCAAATGCC48ValArgThrCysSerAlaAsnAspSerProLeuSerAspProAsnAla556065CCAAGTGGGTGTGACGGTGGTAGCGCCTTCACTTGTTCCAACAACTCC96ProSerGlyCysAspGlyGlySerAlaPheThrCysSerAsnAsnSer707580CCGTGGGCAGTCGATGACCAGACAGCTTATGGCTTTGCGGCAACAGCC144ProTrpAlaValAspAspGlnThrAlaTyrGlyPheAlaAlaThrAla859095ATCAGTGGCCAGTCC159IleSerGlyGlnSer100(2)SEQIDNO42的信息(i)序列特征(A)長度53個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO42ValArgThrCysSerAlaAsnAspSerProLeuSerAspProAsnAla151015ProSerGlyCysAspGlyGlySerAlaPheThrCysSerAsnAsnSer202530ProTrpAlaValAspAspGlnThrAlaTyrGlyPheAlaAlaThrAla354045IleSerGlyGlnSer50(2)SEQIDNO43的信息(i)序列特征(A)長度153個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體Ecidiaglandulosa(B)菌株CBS277.96(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...153(xi)序列描述SEQIDNO43TGTGAGAAGAACGACAACCCCTTAGCTGACTTCAGCACGAAATCCGGG48CysGluLysAsnAspAsnProLeuAlaAspPheSerThrLysSerGly556065TGTGAAAGCGGAGGTTCGGCTTATACGTGTAACAACCAATCACCATGG96CysGluSerGlyGlySerAlaTyrThrCysAsnAsnGlnSerProTrp70758085GCCGTCAATGACTTGGTGTCGTATGGCTTCGCCGCCACAGCGATCAAT144AlaValAsnAspLeuValSerTyrGlyPheAlaAlaThrAlaIleAsn9095100GGTGGCAAT153GlyGlyAsn(2)SEQIDNO44的信息(i)序列特征(A)長度51個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO44CysGluLysAsnAspAsnProLeuAlaAspPheSerThrLysSerGly151015CysGluSerGlyGlySerAlaTyrThrCysAsnAsnGlnSerProTrp202530AlaValAsnAspLeuValSerTyrGlyPheAlaAlaThrAlaIleAsn354045GlyGlyAsn50(2)SEQIDNO45的信息(i)序列特征(A)長度171個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體Coniotheciumsp.(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...171(xi)序列描述SEQIDNO45AGCCGCCCCGTCGGAACCTGCAAGAGGAACGACAACCCCCTCTCCGAC48SerArgProValGlyThrCysLysArgAsnAspAsnProLeuSerAsp556065CCCGATGCCAAGTCCGGCTGCGACGGCGGCGGCGCCTTCATGTGCTCC96ProAspAlaLysSerGlyCysAspGlyGlyGlyAlaPheMetCysSer707580ACCCAGCAGCCGTGGGCCGTCAACGACAATCTGGCATATGGCTTCGCC144ThrGlnGlnProTrpAlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAla859095GCCACGGCCATCAGCGGCGGCAACGAG171AlaThrAlaIleSerGlyGlyAsnGlu100105(2)SEQIDNO46的信息(i)序列特征(A)長度57個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO46SerArgProValGlyThrCysLysArgAsnAspAsnProLeuSerAsp151015ProAspAlaLysSerGlyCysAspGlyGlyGlyAlaPheMetCysSer202530ThrGlnGlnProTrpAlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAla354045AlaThrAlaIleSerGlyGlyAsnGlu5055(2)SEQIDNO47的信息(i)序列特征(A)長度159個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株CBS271.96(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...159(xi)序列描述SEQIDNO47ACTTGCAACAAGAACGACGGGCCCCTGTCCAGCCCCGATGCCGCCTCC48ThrCysAsnLysAsnAspGlyProLeuSerSerProAspAlaAlaSer606570GGCTGTGATGGCGGCGAAGCCTTTGCCTGTTCTAATACCTCGCCTTGG96GlyCysAspGlyGlyGluAlaPheAlaCysSerAsnThrSerProTrp758085GCCGTCAGCGACCAGCTCGCGTACGGATACCTCGCCACGTCCATCTCC144AlaValSerAspGlnLeuAlaTyrGlyTyrLeuAlaThrSerIleSer9095100105GGCGGCACCGAGTCG159GlyGlyThrGluSer110(2)SEQIDNO48的信息(i)序列特征(A)長度個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO48ThrCysAsnLysAsnAspGlyProLeuSerSerProAspAlaAlaSer151015GlyCysAspGlyGlyGluAlaPheAlaCysSerAsnThrSerProTrp202530AlaValSerAspGlnLeuAlaTyrGlyTyrLeuAlaThrSerIleSer354045GlyGlyThrGluSer50(2)SEQIDNO49的信息(i)序列特征(A)長度84個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株CBS270.96(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...84(xi)序列描述SEQIDNO49CCAGTTTTCTCCTGTGACAAGTACGACAACCCTCTACCTGACGCCAAT48ProValPheSerCysAspLysTyrAspAsnProLeuProAspAlaAsn556065GCTGTGTCCGGGTGTGACCCCGGAGGTACTGCCTTC84AlaValSerGlyCysAspProGlyGlyThrAlaPhe707580(2)SEQIDNO50的信息(i)序列特征(A)長度28個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO50ProValPheSerCysAspLysTyrAspAsnProLeuProAspAlaAsn151015AlaValSerGlyCysAspProGlyGlyThrAlaPhe2025(2)SEQIDNO51的信息(i)序列特征(A)長度147個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株棉色二孢，CBS274.96(xi)序列描述SEQIDNO51ACCTGCGACGCCTGCGACAGCCCCCTCAGCGACTACGACGCCAAGTCCGGCTGCGACGGC60GGTAGCGCATACACCTGCACCTACTCTACCCCCTGGGCCGTCGACGACAACCTCTCCTAC120GGTTTCGCCGCCGCCAAGCTGAGCGGA147(2)SEQIDNO52的信息(i)序列特征(A)長度49個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO52ThrCysAspAlaCysAspSerProLeuSerAspTyrAspAlaLysSer151015GlyCysAspGlyGlySerAlaTyrThrCysThrTyrSerThrProTrp202530AlaValAspAspAsnLeuSerTyrGlyPheAlaAlaAlaLysLeuSer354045Gly(2)SEQIDNO53的信息(i)序列特征(A)長度135個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株Ulosporabilgramii，NKBC1444(xi)序列描述SEQIDNO53CCACTAGCAGATTTCACCGGTGGAACCGGCTGTAATGGCGGTTCGACATTCTCATGCTCA60AACCAACAACCATGGGCGGTCAACGACACATTCTCGTACGGCTTTGCGGGCATCTTTATC120ACAGGCCATGTCGAG135(2)SEQIDNO54的信息(i)序列特征(A)長度45個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO54ProLeuAlaAspPheThrGlyGlyThrGlyCysAsnGlyGlySerThr151015PheSerCysSerAsnGlnGlnProTrpAlaValAsnAspThrPheSer202530TyrGlyPheAlaGlyIlePheIleThrGlyHisValGlu354045(2)SEQIDNO55的信息(i)序列特征(A)長度114個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株疣孢青霉，ATCC62396(xi)序列描述SEQIDNO55GCCAAATCTGGATGTGATGCTGGTGGAGGTCAAGCCTACATGTGCTCCAACCAACAACCT60TGGGTAGTCAACGACAACCTCGCCTACGGTTTCGCCGCAGTCAACATTGCCGGC114(2)SEQIDNO56的信息(i)序列特征(A)長度38個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO56AlaLysSerGlyCysAspAlaGlyGlyGlyGlnAlaTyrMetCysSer151015AsnGlnGlnProTrpValValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAla202530AlaValAsnIleAlaGly35(2)SEQIDNO57的信息(i)序列特征(A)長度113個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株點(diǎn)孔座殼(xi)序列描述SEQIDNO57TTCGACGTCCGGGTGCGACAATGGCGGCAGCGCCTTCATGTGCTCTAACCAAAGCCCCTG60GGCCGTCAACGACGATCTGGCCTACGGCTGGGCCGCCGTCTCAATCGCGGGCC113(2)SEQIDNO58的信息(i)序列特征(A)長度37個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO58SerThrSerGlyCysAspAsnGlyGlySerAlaPheMetCysSerAsn151015GlnSerProTrpAlaValAsnAspAspLeuAlaTyrGlyTrpAlaAla202530ValSerIleAlaGly35(2)SEQIDNO59的信息(i)序列特征(A)長度177個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株蛇形鐮孢，IFO4467(xi)序列描述SEQIDNO59TCAACACCGGTGCAGACGTGCGACCGCAACGACAACCCGCTCTACGACGGCGGGTCGACG60CGGTCCGGCTGCGACGCCGGCGGCGGCGCCTACATGTGCTCGTCGCACAGCCCGTGGGCC120GTCAGCGACAGCCTCTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCCGCATCGCCGGCCAGTCCGAG177(2)SEQIDNO60的信息(i)序列特征(A)長度59個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO60SerThrProValGlnThrCysAspArgAsnAspAsnProLeuTyrAsp151015GlyGlySerThrArgSerGlyCysAspAlaGlyGlyGlyAlaTyrMet202530CysSerSerHisSerProTrpAlaValSerAspSerLeuSerTyrGly354045TrpAlaAlaValArgIleAlaGlyGlnSerGlu55(2)SEQIDNO61的信息(i)序列特征(A)長度150個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株Thielaviathermophila，CBS174.70(xi)序列描述SEQIDNO61AACGACAACCCCATCTCCAACACCAACGCTGTCAACGGTTGTGAGGGTGGTGGTTCTGCT60TACGCTTGCTCCAACTACTCTCCCTGGGCTGTCAACGATGACCTTGCCTACGGTTTCGCT120GTTACCAAGATCTCCGGTGGCTCCGAGGCC150(2)SEQIDNO62的信息(i)序列特征(A)長度50個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO62AsnAspAsnProIleSerAsnThrAsnAlaValAsnGlyCysGluGly151015GlyGlySerAlaTyrAlaCysSerAsnTyrSerProTrpAlaValAsn202530AspAspLeuAlaTyrGlyPheAlaValThrLysIleSerGlyGlySer354045(2)SEQIDNO63的信息(i)序列特征(A)長度180個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體管毛殼，CBS799.83(xi)序列描述SEQIDNO63GTCAATCAGCCCATCCGAACGTGTAGTGCCAACGACTCGCCCTTGTCCGACCCAAATACC60CCAAGTGGCTGTGACGGTGGTAGCGCCTTCACTTGTTCCAACAACTCCCCGTGGGCAGTC120GATGACCAGACAGCTTATGGCTTTGCGGCAACAGCCATCAGTGGCCAGTCCGAGAGCAGC180(2)SEQIDNO64的信息(i)序列特征(A)長度60個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SE9IDNO64ValAsnGlnProIleArgThrCysSerAlaAsnAspSerProLeuSer151015AspProAsnThrProSerGlyCysAspGlyGlySerAlaPheThrCys202530SerAsnAsnSerProTrpAlaValAspAspGlnThrAlaTyrGlyPhe35404AlaAlaThrAlaIleSerGlyGlnSerGluSerSer505560(2)SEQIDNO65的信息(i)序列特征(A)長度159個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源Chaetomiumvirescens，CBS547.75(xi)序列描述SEQIDNO65ACCTGCGACAAGAAGGACAACCCCATCTCTGATGCCAACGCCAAGAGCGGCTGTGATGGC60GGTTCTGCTTTCGCCTGCACCAACTACTCTCCCTTCGCCGTCAACGACAACCTCGCCTAC120GGTTTCGCTGCCACCAAGCTTGCTGGAGGCTCCGAGGCT159(2)SEQIDNO66的信息(i)序列特征(A)長度53個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO66ThrCysAspLysLysAspAsnProIleSerAspAlaAsnAlaLysSer151015GlyCysAspGlyGlySerAlaPheAlaCysThrAsnTyrSerProPhe202530AlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThrLysLeuAla354045GlyGlySerGluAla50(2)SEQIDNO67的信息(i)序列特征(A)長度81個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株葫蘆科刺盤孢(xi)序列描述SEQIDNO67ACCTGCTACGCCAATGACCAGCGCATCGCCGACCGCAGCACCAAGTCCGGCTGCGACGGC60GGCTCGGCCTACTCCTGTTCT81(2)SEQIDNO68的信息(i)序列特征(A)長度27個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO68ThrCysTyrAlaAsnAspGlnArgIleAlaAspArgSerThrLysSer151015GlyCysAspGlyGlySerAlaTyrSerCysSer2025(2)SEQIDNO69的信息(i)序列特征(A)長度160個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌株閃光須霉(xi)序列描述SEQIDNO69ACCTGTGACAAGAAGGACAACCCCATCTCAAACTTGAACGCTGTCAACGGTTGTGAGGGT60GGTGGTTCTGCCTTCGCCTGCACCAACTACTCTCCTTGGGCGGTCAATGACAACCTTGCC120TACGGCTTCGCTGCAACCAAGCTTGCCGGTGGCTCCGAGG160(2)SEQIDNO70的信息(i)序列特征(A)長度53個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO70ThrCysAspLysLysAspAsnProIleSerAsnLeuAsnAlaValAsn151015GlyCysGluGlyGlyGlySerAlaPheAlaCysThrAsnTyrSerPro202530TrpAlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThrLysLeu354045AlaGlyGlySerGlu50(2)SEQIDNO71的信息(i)序列特征(A)長度165個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源粉紅單端孢，IFO5372(xi)序列描述SEQIDNO71CCAGTAGGCACCTGCGACGCCGGCAACAGCCCCCTCGGCGACCCCCTGGCCAAGTCTGGC60TGCGAGGGCGGCCCGTCGTACACGTGCGCCAACTACCAGCCGTGGGCGGTCAACGACCAG120CTGGCCTACGGCTTCGCGGCCACGGCCATCAACGGCGGCACCGAG165(2)SEQIDNO72的信息(i)序列特征(A)長度55個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO72ProValGlyThrCysAspAlaGlyAsnSerProLeuGlyAspProLeu151015AlaLysSerGlyCysGluGlyGlyProSerTyrThrCysAlaAsnTyr202530GlnProTrpAlaValAsnAspGlnLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThr354045AlaIleAsnGlyGlyThrGlu5055參考文獻(xiàn)本發(fā)明的背景GB-A-1368599EP-A-O307564EP-A-O435876WO91/17243WO91/10732WO91/17244WO95/24471WO95/26398酶學(xué)方法，1988，Vol.160，p.200-391(Wood，W.A.和Kellogg，S.T.編).Beguin，P.，＂纖維素降解的分子生物學(xué)＂，微生物學(xué)年評(1990)，Vol.44，pp.219-248.Henrissat，B.，＂纖維素酶和它們與纖維素的相互作用＂，纖維素(1994)，Vol.1，pp.169-196.T.-M.Enveri，＂微生物纖維素酶＂，W.M.Fogarty，微生物酶和生物技術(shù)，應(yīng)用科學(xué)出版社，183-224(1983)。Béguin，P.和Aubert，J-P.，＂纖維素的生物降解＂，F(xiàn)EMS微生物學(xué)回顧13(1994)25-58.Sheppard，P.O.等，＂保守纖維素酶家族特異性序列在克隆Fusariumoxysporum纖維素酶同系物cDNA上的用途，基因，(1994)，Vol.15，pp.163-167.Saloheimo，A.等，＂經(jīng)在酵母中表達(dá)分離的Trichodermareesei的新的小內(nèi)切葡聚糖酶基因，egI5″，分子生物學(xué)(1994)，Vol.13(2)，pp.219-228.vanArsdell，J.N.等，(1987)Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶I在啤酒糖酵母中的克隆、特征確定和表達(dá)，生物/技術(shù)560-64.Penttil_，M.等，(1986)Trichodermareesei纖維素酶基因之間的同源性內(nèi)切葡聚糖酶I基因的完整的核苷酸序列，基因15253-263.Saloheimo，M.等，(1988)EGIII，一種新的Trichodermareesei內(nèi)切葡聚糖酶基因和酶兩者的特征，基因6311-21.Gonzéles，R.等，＂Trichodermalongibrachiatumegll基因的克隆、序列分析和在酵母中的克?。?，應(yīng)用微生物生物學(xué)(1992)，Vol.38，pp.370-375.Ooi，T等＂棘孢曲霉的纖維素酶(FI-CMCase)cDNA的克隆和序列分析＂Curr.Genet.(1990)，vol.18，pp.217-222.Ooi，T等，＂編碼Aspergillusaculeatus纖維素酶(FI-CMCase)的基因的完整的核苷酸序列＂核酸研究(1990)，vol.18，No.19，P.5884.Xu，G.等，＂多種厭氧rumen真菌Neocallimastixpatriciarum纖維素酶cDNA在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)＂，遺傳微生物學(xué)雜志(1992)，vol，138.pp.1413-1420.Xu，G.等，＂新的編碼具有高的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和木聚糖酶活性的三個-多功能催化區(qū)的Neocallimastixpatriciarum多糖類水解酶cDNA(celD)＂，遺傳微生物學(xué)(1992)，vol.138，pp.2397-2403.Zhou，L.等，＂厭氧真菌Neocallimastixpatriciarum的無內(nèi)含子celB編碼模式家族內(nèi)切葡聚糖酶＂，生物化學(xué)雜志(1994)，vol.297，pp.359-364.Dalbφge，H.和Heldt-Hansen，H.P.，＂用于真菌酶基因有效表達(dá)克隆的新方法＂，Mol.Gen.Genet.(1994)，vol.243，pp.253-260.Ali，B.R.S等，＂厭氧真菌Piromyces的纖維素酶和半纖維素酶構(gòu)成多蛋白纖維素-結(jié)合復(fù)合物和被多基因家族編碼＂，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊(1995)，vol.125，No.1，pp.15-21.日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ).Wang，H.Y.和Jones，R.W.＂phytopathogenic真菌Macrophominaphaseolina內(nèi)切葡聚糖酶-編碼基因的克隆、特征確定和功能性表達(dá)＂，基因，158125128，1995.Wang，H.Y.和Jones，R.W.＂從phytopathogenic真菌Macrophominaphaseolina克隆的單一內(nèi)切葡聚糖酶一編碼基因＂，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)，6120042006.1995.Henrissat生物化學(xué)雜志，280309316，1991.Schauwecker，F(xiàn).L.S.F.，Wanner，G.，Kahmann，R.＂dimorphic真菌Ustilagomaydis中纖維素酶基因的filament-特異性表達(dá)＂，1995，生物化學(xué)Hoppe-Seyler，376617-625.WO93/20193WO94/21801WO94/26880WO95/02043附圖Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.25351-360.NIH數(shù)據(jù)庫(Entrez1996春天版)，在WorldWrdeWeb上可以獲得(htt-p//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX).Eriksson，O.E.&amp;Hawksworth，D，L.SystemaAscomycetumvol12(1993).Jillich，W.擔(dān)子菌綱的高級分類，BibliothecaMycologia，85485pp(1981).O′Donnell，K.培養(yǎng)中的接合菌綱，佐治亞大學(xué)，US，257pp(1979).Hawksworth，D.L.，Kirk，p.M.，，Sutton，B.C.和Pegler，D.N.真菌辭典，國際Mycological研究所，616pp(1995)；VonArx，J.A.培養(yǎng)中形成孢子的真菌屬，424pp(1981).詳細(xì)描述Ford等，肽表達(dá)和純化295-107，1991.Cunningham和Well，科學(xué)244，1081-1085，1989.deVos等，科學(xué)255306-312，1992.Smith等，分子生物學(xué)雜志.224899-904，1992.Wlodaver等，F(xiàn)EBSLett.30959-64，1992.Tomme，P等＂纖維素-結(jié)合域分類和性質(zhì)＂在＂不溶性碳水化合物的酶促降解＂中，JohnN.Saddler和MichaelH.Penner(編者)，ACS專題研討系列No.618，1996.WO90/00609WO95/16782Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物學(xué)雜志，48443-453，1970.WO94/14953Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.&amp;Maniatis，T.1989.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊.冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約.Beaucage和Caruthers，Tetrahed；四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、Spizellomycetales、肋壺菌目(Harpochytriales)和芽枝霉目(Blastocladiales)。23.按照權(quán)利要求22的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于Spizellomycetaceae科的菌株獲得的，優(yōu)選的是可以從屬于囊壺菌屬(Rhizophlyctis)的菌株獲得的，更優(yōu)選的是可以從屬于紅根囊壺菌(Rhizophlyctisrosea)的菌株獲得的，尤其是可以從紅根囊壺菌CBS282.96獲得的。24.一種酶制劑，該酶制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以從屬于接合菌門(Zygomycota)的菌株獲得的，這種酶包含選自以下序列的氨基酸序列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567；XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567；和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和在1和7號位置上，Xaa是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。25.按照權(quán)利要求24的酶制劑，其中在7號位置上的氨基酸殘基是半胱氨酸(Cys)。26.按照權(quán)利要求24的酶制劑，其中在1號位置上的氨基酸殘基選自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。27.按照權(quán)利要求24-26之任一的酶制劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個氨基酸殘基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。28.按照權(quán)利要求24-27之任一的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于接合菌綱(Zygomycetes)的菌株獲得的，優(yōu)選的是可以從屬于毛霉目(Mucorales)的菌株獲得的。29.按照權(quán)利要求28的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由毛霉科(Mucoracea)和枝霉科(Thamnidiaceae)的菌株獲得的，優(yōu)選的是可以從屬于由根毛霉屬(Rhizomucor)、須霉屬(Phycomyces)和刺枝霉屬(Chaetostylum)的菌株獲得的。30.按照權(quán)利要求29的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由Rhizomucorpusillus、閃光須霉(Phycomycesnitens)、弗雷生刺枝霉(Chaetostylumfresenii)的菌株獲得的，優(yōu)選地是可以從屬于由以下菌株的菌株獲得的RhizomucorpusillusIFO4578、閃光須霉IFO4814和弗雷生刺枝霉NRRL2305。31.一種酶制劑，該酶制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以從屬于由Archaeascomycetes、盤菌綱(Discomycetes)、Hermiascomycetes、腔菌綱(Loculoascomycetes)和不整囊菌綱(Plectomycetes)的菌株獲得的，這種酶包含選自以下序列的氨基酸序列XaaThrArgXaapheAspXaa1234567；XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567；和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和在1和7號位置上，Xaa是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。32.按照權(quán)利要求31的酶制劑，其中在7號位置上的氨基酸殘基是半胱氨酸(Cys)。33.按照權(quán)利要求31的酶制劑，其中在1號位置上的氨基酸殘基選自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。34.按照權(quán)利要求31-33之任一的酶制劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個氨基酸殘基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。35.按照權(quán)利要求31-34之任一的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由以下目的菌株獲得的盤菌目(Pezizales)、Phytismatales、座囊菌目(Dothideales)和散囊菌目(Eurotiales)。36.按照權(quán)利要求35的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由以下科的菌株獲得的葫蘆霉科(Cucurbitariaceae)、斑痣盤菌科(Rhytismataceae)、糞盤菌科(Ascobolaceae)和發(fā)菌科(Trichocomaceae)；優(yōu)選地是由屬于由以下屬的菌株產(chǎn)生的色二孢屬(Diplodia)、Microsphaeropsis、Ulospora、殼球孢屬(Macrophomina)、糞盤菌屬(Ascobolus)、Saccobolus、青霉屬(Penicillium)和Thermomyces。37.按照權(quán)利要求36的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由以下種的菌株獲得的棉色二孢(Diplodiagossypina)、Microsphaeropsissp、Ulosporabilgramii、Macrophominaphaseolina、Rscobolusstictoides、Saccobolusdilutellus、疣孢青霉(Penicilliumverruculosum)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)和Thermomycesverrucosus；優(yōu)選地是可以從屬于由以下菌株的菌株獲得的棉色二孢CBS274.96、UlosporabilgramiiNKBC1444、MacrophominaphaseolinaCBS281.96、SaccobolusdilutellusCBS275.96、疣孢青霉ATCC62396、產(chǎn)黃青霉ATCC9480和ThermomycesverrucosusCBS285.96。38.一種酶制劑，該酶制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以從屬于由間座殼目(Diaportales)、炭角菌目(Xylariales)、Trichoaphaeriales和黑痣菌目(Phyllachorales)的菌株獲得的，這種酶包含選自以下序列的氨基酸序列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567；XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567；和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和在1和7號位置上，Xaa是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。39.按照權(quán)利要求38的酶制劑，其中在7號位置上的氨基酸殘基是半胱氨酸(Cys)。40.按照權(quán)利要求38的酶制劑，其中在1號位置上的氨基酸殘基選自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。41.按照權(quán)利要求38-40之任一的酶制劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個氨基酸殘基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。42.按照權(quán)利要求38-41之任一的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由以下科的菌株的菌株獲得的炭角菌科(Xylariaceae)、黑腐皮殼科(Valsaceae)和Phyllachoraceae，優(yōu)選地是可以從屬于由以下屬的菌株獲得的間座殼屬(Diaporthe)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、黑孢屬(Nigrospora)、炭角菌屬(Xylaria)、Nodulisporum和孔座殼屬(Poronia)。43.按照權(quán)利要求42的酶，其中所說的酶是可以從屬于由以下種的菌株獲得的Diaporthesyngenesia、葫蘆科刺盤孢(Colletotrichumlagenarium)、Nigrosporasp.、鹿角團(tuán)炭角菌(Xylariahypoxylon)、Nodulisporumsp.和點(diǎn)孔座殼(Poroniapunctata)，優(yōu)選地是可以從屬于由以下菌株的菌株獲得的DiaporthesyngenesiaCBS278.96、葫蘆科刺盤孢ATCC52609、Nigrosporasp.CBS272.96和鹿角團(tuán)炭角菌CBS284.96。44.一種酶制劑，該酶制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以從屬于由小赤殼科(Nectriaceae)，糞殼科(Sordariaceae)，毛殼科(Chaetomiaceae)，Ceratostomaceae，毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)的菌株和屬于頂孢霉屬(Acremonium)，粘帚霉屬(Gliocladium)，Scytalidium，柱孢屬(Cylindrocarpon)和周刺座霉屬(Volutella)的菌株獲得的，這種酶包含選自以下序列的氨基酸序列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567；XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567；和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和在1和7號位置上，Xaa是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。45.按照權(quán)利要求44的酶制劑，其中在7號位置上的氨基酸殘基是半胱氨酸(Cys)。46.按照權(quán)利要求44的酶制劑，其中在1號位置上的氨基酸殘基選自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。47.按照權(quán)利要求44-46之任一的酶制劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個氨基酸殘基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。48.按照權(quán)利要求44-47之任一的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由以下屬的菌株獲得的柱孢屬(Cylindrocarpon)、叢赤殼屬(Nectria)、周刺座霉屬(Volutella)、糞殼屬(Sordaria)、梭孢殼屬(Thielavia)、Sypastospora、毛殼屬(Chaetomium)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Scytalidium、Cladorrhinum、粘帚霉屬(Gliocladium)、頂孢霉屬(Acremonium)。49.按照權(quán)利要求48的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由以下種的菌株獲得的Cylindrocarponsp.、Nectriapinea、Volutellacolletotrichoides、糞生糞殼(Sordariafimicola)、大孢糞殼(Sordariamacrospora)、Thielaviaterrestrls、Thielaviathermophila、Syspastosporaboninensis、Cladorrhinumfoecundissimum、墻毛殼(Chaetomiummurorum)、Chaetomiumvirescens、Chaetomiumbrasiliensis、Chaetomiumcunicolorum、Myceliophthorathermophila、鏈孢粘帚霉(Gliocladiumcatenulatum)、Scytalidiumthermophila和Acremoniumsp.；優(yōu)選地是可以從屬于由以下菌株的菌株獲得的鏈孢粘帚霉ATCC10523和CBS227.48、NectriapineaCBS279.96、VolutellacolletotrichoidesCBS400.58、糞生糞殼ATCC52644、大孢糞殼ATCC60255、ThielaviaterrestrisNRRL8126、ThielaviathermophilaCBS174.70、墻毛殼CBS163.52、ChaetomiumvirescensCBS547.75、ChaetomiumbrasiliensisCBS122.65、ChaetomiumcunicolorumCBS799.83、SyspastosporaboninensisNKBC1515、CladorrhinumfoecundissimumATCC62373、MyceliophthorathermophilaCBS117.65、ScytalidiumthermophilaATCC28085和Acremoniumsp.CBS478.94。50.一種酶制劑，該酶制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以從屬于由番茄鐮孢(Fusariumlycopersici)、Fusariumpassiflora、腐皮鐮孢(Fusariumsolani)、蛇形鐮孢(Fusariumanguioides)、早熟禾鐮孢(Fusariumpoae)、黑腐質(zhì)霉(Humicolanigrescens)和灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)的菌株獲得的，這種酶包含選自以下序列的氨基酸序列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567；XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567；和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和在1和7號位置上，Xaa是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。51.按照權(quán)利要求50的酶制劑，其中在7號位置上的氨基酸殘基是半胱氨酸(Cys)。52.按照權(quán)利要求50的酶制劑，其中在1號位置上的氨基酸殘基選自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。53.按照權(quán)利要求50-52之任一的酶制劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個氨基酸殘基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個氨基酸殘基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的4號位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8號位置上，氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個。54.按照權(quán)利要求53之任一的酶制劑，其中所說的酶是可以從屬于由以下菌株的菌株獲得的番茄尖鐮孢(Fusariumoxysporumssplycopersici)CBS645.78、尖鐮孢ssppassifloraCBS744.79、腐皮鐮孢IMI107.511、蛇形鐮孢IFO4467、早熟禾鐮孢ATCC60883、黑腐質(zhì)霉CBS819.73和灰腐質(zhì)霉ATCC22726。55.按照權(quán)利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的9號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地選自脯氨酸和蘇氨酸。56.按照權(quán)利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的10號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地是絲氨酸。57.按照權(quán)利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的12號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地選自丙氨酸和甘氨酸。58.按照權(quán)利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第二序列的4號位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，選自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。59.按照權(quán)利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的第3號位置上的氨基酸殘基是酪氨酸；或在第4號位置上的氨基酸殘基是色氨酸；或在第8號位置上的氨基酸殘基是賴氨酸。60.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體編碼按照權(quán)利要求11-59之任一的酶。61.按照權(quán)利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶制劑，其中所說的第一序列包含選自以下序列的氨基酸序列ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysAlaTrp12345678910111213；ThrArgTyrTrpAspCysCysLysThrSerCysAlaTrp12345678910111213；和ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysGlyTrp12345678910111213.62.一種提供微生物菌株的方法，所述菌株包含編碼存在于按照權(quán)利要求1-9、11-59和61之任一酶制劑中的酶的基因，該方法包括在標(biāo)準(zhǔn)條件下與圖1所示的任何保守區(qū)的寡核苷酸雜交(例如PCR擴(kuò)增)。63.按照權(quán)利要求62的方法，其中所說的寡核苷酸包含編碼包含在選自以下序列的肽中的至少五肽的核苷酸序列a.ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314在3或4在號位置上的氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在8號位置上的氨基酸是Arg、Lys或His；在9、10、12和14號位置上的氨基酸分別是20個天然氨基酸殘基中的任何一個；和b.TrpCysCysXaaCysTyr123456在4號位置上的氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個；和C.XaaProGlyGlyGlyXaaGlyXaaPhe1234567891號位置上的氨基酸是Met或Ile；6和8號位置上的氨基酸分別是Leu、Ile或Val；和d.GlyCysXaaXaaArgXaaAspTrpXaa123456789在3號位置上的氨基酸是20個天然氨基酸殘基中的任何一個；在4和6號位置上的氨基酸分別是Trp、Tyr或Phe；并且在9號位置上的氨基酸是Phe或Met。64.按照權(quán)利要求62的方法，其中所說的寡核苷酸包含互補(bǔ)于權(quán)利要求63的序列的核苷酸序列。65.按照權(quán)利要求63的方法，其中所說的寡核苷酸相應(yīng)于選自以下PCR引物的PCR引物有義，5′-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’反義1，5′-CTAGTCTAGATAA/GCAIGCA/GCAA/GCACC-3’；反義2，5′-CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/GICCICCICCIGG-3’；和反義3，5’-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/GA/TAICG/TCC-3’.66.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示溶纖活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO1中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM9770中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO1中所示的DNA序列的類似物或可以從啤酒糖酵母DSM9770中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于，優(yōu)選地至少70％同源于SEQIDNO1中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM9770中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO1中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM9770中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于，優(yōu)選地至少65％同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO1中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM9770中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO1中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM9770中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。67.按照權(quán)利要求66的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，所述DNA文庫是屬于毛殼科的菌株，優(yōu)選地是屬于毀絲霉屬的菌株，特別是屬于M.thermophila的菌株，尤其是M.thermophilaCBS117.65的文庫。68.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO4中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO4中所示的DNA序列的類似物或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于，優(yōu)選地至少70％同源于SEQIDNO4中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO4中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于，優(yōu)選地至少60％同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO4中所示的DNA序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO4中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。69.按照權(quán)利要求68的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，所述DNA文庫是屬于肉座菌科(Hypocreaceae)的菌株，優(yōu)選地是屬于頂孢霉屬的菌株，特別是Acremoniumsp.CBS478.94的文庫。70.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO6中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO6中所示的DNA序列的類似物或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于，優(yōu)選地至少65％同源于SEQIDNO6中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO6中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于，優(yōu)選地至少70％同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO6中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO6中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。71.按照權(quán)利要求70的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，所述DNA文庫是屬于Chaetomiceae科的菌株，優(yōu)選地是屬于頂孢霉屬的菌株，特別是Acremoniumsp.CBS478.94的文庫。72.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO8中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO8中所示的DNA序列的類似物或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于，優(yōu)選地至少75％同源于SEQIDNO8中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO8中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于，優(yōu)選地至少70％同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO8中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO8中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。73.按照權(quán)利要求72的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，所述DNA文庫是屬于毛殼科的菌株，優(yōu)選地是屬于Thielaviaterrestris的菌株，特別是ThielaviaterrestrisNRRL8126的文庫。74.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO10中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10512中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO10中所示的DNA序列的類似物或可以從大腸桿菌DSM10512中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于，優(yōu)選地至少65％同源于SEQIDNO10中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10512中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO10中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10512中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于，優(yōu)選地至少55％同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO10中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10512中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化的內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO10中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10512中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。75.按照權(quán)利要求74的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的。所述DNA文庫是屬于斑痣盤菌科的菌株，優(yōu)選地是屬于殼球孢屬的菌株，特別是屬于Macrophominaphaseolina的菌株，尤其是M.phaseolicolaCBS281.96的文庫。76.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO12中所示的DNA序列的類似物或可以從大腸桿菌DSM10511中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于，優(yōu)選地至少60％同源于SEQIDNO12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于，優(yōu)選地至少60％同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。77.按照權(quán)利要求76的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，所述DNA文庫是屬于口蘑科的菌株，優(yōu)選地是屬于毛皮傘屬的菌株，特別是屬于Crinipellisscabella的菌株，尤其是C.scabellaCBS280.96的文庫。78.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO16中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO16中所示的DNA序列的類似物或可以從大腸桿菌DSM10571中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于，優(yōu)選地至少70％同源于SEQIDNO16中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO16中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于，優(yōu)選地至少60％同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO16中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO16中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。79.按照權(quán)利要求78的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，所述DNA文庫是屬于周刺座霉屬的菌株，優(yōu)選地是屬于Volutellacolletotrichoides的菌株，特別V.colletotrochoidesCBS400.58的文庫。80.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO19中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO19中所示的DNA序列的類似物或可以從大腸桿菌DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于SEQIDNO19中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO19中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO19中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO19中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。81.按照權(quán)利要求80的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎(chǔ)產(chǎn)生的，所述DNA文庫是屬于糞殼科的菌株，優(yōu)選地是屬于糞殼屬的菌株，特別屬于糞生糞殼的菌株，尤其是糞生糞殼ATCC52644的文庫。82.按照權(quán)利要求66-81之任一的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體還包含編碼纖維素-結(jié)合域的DNA序列。83.權(quán)利要求82的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體還包含編碼纖維素-結(jié)合域(CBD)的DNA序列，所述纖維素-結(jié)合域和由所述DNA構(gòu)建體之DNA序列編碼的酶的酶核心(催化活性域)是可操作連接的。84.一種重組表達(dá)載體，該載體包含按照權(quán)利要求62-83之任一的DNA構(gòu)建體。85.一種細(xì)胞，該細(xì)胞包含按照權(quán)利要求66-83之任一的的DNA構(gòu)建體或按照權(quán)利要求84的重組表達(dá)載體。86.按照權(quán)利要求85的細(xì)胞，該細(xì)胞是真核細(xì)胞，特別真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞，或所述基因所來源的內(nèi)源性細(xì)胞。87.按照細(xì)胞權(quán)利要求86的細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞屬于曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢屬(Fusarium)或木霉屬(Trichoderma)的菌株，特別是禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)的菌株。88.一種產(chǎn)生顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的方法，該方法包括在可以產(chǎn)生所述酶的條件下，培養(yǎng)按照權(quán)利要求85-87之任一的細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所述的酶。89.一種顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，該酶a)由按照權(quán)利要求66-83之任一的DNA構(gòu)建體編碼，b)由按照權(quán)利要求88的方法產(chǎn)生，或c)是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由序列表SEQIDNO1、4、6、8、10、12、16、19之任一所示的DNA序列編碼。90.一種使要洗的衣物顏色澄清的方法，該方法包括用包含按照權(quán)利要求1-9、11-61和89之任一的酶制劑的浸泡、洗滌或沖洗液體處理要洗的衣物。91.按照權(quán)利要求90的方法，其中所說的要洗的衣物用洗衣機(jī)處理。92.按照權(quán)利要求90或91的方法，其中所說的內(nèi)切葡聚糖酶在機(jī)器循環(huán)使用條件下，以每升液體1到1000S-CEVU，優(yōu)選地是5到200S-CEVU的有效量存在于浸泡、洗滌或沖洗液體中。93.按照權(quán)利要求90-92之任一的方法，其中所說的浸泡、洗滌或沖洗液體的最適pH在4和11之間，優(yōu)選地在6和10.5之間。94.按照權(quán)利要求90-93之任一的方法，其中溫度在15℃和60℃之間。95.按照權(quán)利要求90-94之任一的方法，其中所說的浸泡、洗滌或沖洗液體還包含一種或多種選自蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂酶、過氧化物酶和漆酶的酶。96.一種洗衣組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求1-9、11-61和89之任一的酶制劑，以及選自表面活性劑、助洗劑化合物和織物軟化劑的化合物。97.按照權(quán)利要96的洗衣組合物，該組合物還包含一種或多種選自蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶和漆酶的酶。98.按照權(quán)利要求97的組合物，其中所說的表面活性劑是非離子、陰離子、陽離子、兩性離子、兩性或兼性表面活性劑。99.按照權(quán)利要求98的組合物，其中所說的織物軟化劑是陽離子或非離子軟化劑，優(yōu)選地是季銨化合物，并且其可以進(jìn)一步包含或不包含一種或多種選自表面活性劑、電解質(zhì)、緩沖液、抗氧劑和液態(tài)載體的化合物。100.按照權(quán)利要求1-9、11-61和89之任一的酶在降解或修飾植物材料(例如細(xì)胞壁)上的用途。101.按照權(quán)利要求1-9、11-61和89之任一的酶在處理織物原料或織物，優(yōu)選地是在防止背染、生物拋光或“石洗”纖維素織物中的用途。102.按照權(quán)利要求1-9、11-61和89之任一的酶在處理紙漿，優(yōu)選地是在剝樹皮、脫纖維、纖維改性、酶促脫墨或改善排水中的用途。103.一種酶制劑，該制劑富含按照權(quán)利要求1-9、11-61和89的顯示溶纖活性的酶。104.按照權(quán)利要求103的制劑，該制劑還包含一種或多種選自半乳聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果膠乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶、果膠酸鹽裂解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、果膠甲酯酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、角質(zhì)酶、過氧化物酶、漆酶、纖維二糖水解酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶。全文摘要一種在洗滌劑,洗滌,紡織和造紙紙漿應(yīng)用中性能良好的酶制劑,該制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成,所述酶包含具有序列ThrArgX3X4AspCysCysX8X9X10CysX12TrpX14(其中X3和X4各自分別是Trp、Tyr或Phe;X8是Arg、Lys或His;X9、X10、X12和X13各自是20個天然氨基酸殘基中的任何一個)的14個殘基的第一氨基酸序列和具有序列TrpCysCysXX4Cys(其中XX4是20個天然氨基酸殘基中的任何一個)的5個殘基的第二氨基酸序列,其條件是在第一氨基酸序列中,(i)當(dāng)X12是Ser時,X14不是Ser,和(ii)當(dāng)X12是Gly時,X14不是Ala。文檔編號C07G99/00GK1182451SQ9619349公開日1998年5月20日申請日期1996年3月18日優(yōu)先權(quán)日1995年3月17日發(fā)明者M(jìn)·肖萊恩,L·N·安德森,S·F·拉森,M·S·考皮寧,L·朗厄,R·I·尼爾森,M·伊哈拉,S·塔卡基申請人:諾沃挪第克公司