專利名稱：新的抗艾滋病免疫毒素的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及分子免疫學和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的治療方法。具體地說，本發(fā)明涉及用于治療艾滋病的新的免疫毒素。
相關(guān)技術(shù)的說明全世界有六百萬人感染了HIV病毒，因而迫切需要治療這種疾病的有效方法。雖然人們正致力于研究疫苗的開發(fā)，但是病毒的特殊性質(zhì)使得這種研究成為一項尤其艱難而持久的任務(wù)。而且，對目前的AIDS病例的治療受到嚴重的限制。在美國，目前只有一種藥物，即迭氮胸苷(AZT)已經(jīng)注冊可正式使用。但問題是不斷有抗AZT的HIV毒株產(chǎn)生。隨著病毒突變形式的出現(xiàn)，抗性不斷提高。目前盛行的有關(guān)病毒抗藥性的理論認為是病毒的變異速度之快使得抗性更高的變異形式以極快的速度出現(xiàn)。但是，最近的研究提出，抗藥性并不是高突變性的結(jié)果，而可能是病毒高水平復制的結(jié)果。
不論抗藥性的機制如何，AZT不會長期有效。而且，這種治療方法十分昂貴，并伴有副作用，例如惡心、癲癇發(fā)作、肝功能紊亂和骨髓抑制。AZT的其它化學變體，例如DDC和DDI，雖然在臨床試驗中具有治療前景但是藥效有限。雖然目前正在進行大量其它藥物和治療方案的研究，但是顯然需要別種藥物和新的方法來治療這種疾病。
實驗性的AIDS免疫療法顯示出一定的前景，但是多數(shù)療效十分不穩(wěn)定，這主要是因為靶分子的高度變異性。這些靶分子，例如HIV囊膜蛋白，在不同毒株和不同病人中都不相同。
但是，在抗體-毒素結(jié)合物的抗體部分有完全特異的靶存在時，免疫毒素療法被證明對幾種其他疾病十分有效。例如，可將假單胞菌外毒素與抗卵巢癌腫瘤的單克隆抗體偶聯(lián)。在小鼠模型中，它有效地抑制了人卵巢癌細胞的生長(Willingham，M.C.等，1987)。AIDS免疫療法所需要的是高度特異性的不變的靶。
HIV酶即逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)對病毒復制來說十分重要。這種酶在催化病毒遺傳物質(zhì)(RNA)的DNA拷貝形成中起主要作用。DNA然后被用于立即產(chǎn)生更多的病毒拷貝，或整合進病人的基因組，在以后表達病狀。很可能是這種重要的作用導致了逆轉(zhuǎn)錄酶高度保守的結(jié)構(gòu)。而且，最近證明，當細胞被HIV感染后，逆轉(zhuǎn)錄酶(或其部分)的拷貝與細胞的外表面結(jié)合。逆轉(zhuǎn)錄酶在細胞表面的表達甚至大大超過病毒囊膜蛋白的表達。
現(xiàn)有技術(shù)中缺少一種治療獲得性免疫缺陷綜合征的有效手段。本發(fā)明填補了該領(lǐng)域長期以來的這項空白。
發(fā)明綜述本發(fā)明實施方式之一提供了一種包含免疫毒素的組合物，其中所述的免疫毒素包含與抗病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體化學結(jié)合的毒素。
本發(fā)明實施方式之二提供了一種包含免疫毒素和藥學上認可的載體的藥物組合物，其中所述的免疫毒素包含與抗病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體化學結(jié)合的毒素。
本發(fā)明實施方式之三提供了一種治療獲得性免疫缺陷綜合征的方法，其步驟包括給患有所述綜合征的病人使用治療有效量的本發(fā)明的新型組合物。
本發(fā)明實施方式之四提供了治療被人免疫缺陷病毒感染的個體的方法，其步驟包括給所述個體使用治療有效量的本發(fā)明的新型組合物。
為了本發(fā)明的公開給出以下優(yōu)選實施例，本發(fā)明其它方面的內(nèi)容、特點和優(yōu)點將由此變得顯而易見。


為了獲得和充分理解本發(fā)明的上述特點、優(yōu)點和目的等，將參照附圖中表示的特定實施例對以上簡要說明的本發(fā)明進行具體的說明。這些附圖是本說明書的一部分。但需要指出的是，由于

的是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所以不能被認為是對本發(fā)明范圍的限定。
附圖1表示免疫毒素合成的總方案圖(圖1A，1R，1C和1D)。
圖2表示抗感染H9細胞的HIV毒株(HIV-AC-1)的免疫毒素即逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸(Podeweed)抗病毒蛋白對細胞作用24小時或48小時。
圖3表示免疫毒素即抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白對HIV細胞系H-9和HIV毒株P(guān)M-213作用24、48或72小時后的效果。
圖4表示培養(yǎng)1天之后本發(fā)明的免疫毒素構(gòu)建物即抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白其細胞毒性的劑量效應(yīng)關(guān)系。
圖5表示本發(fā)明的抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-gelonin免疫毒素其細胞毒性的劑量效應(yīng)關(guān)系。
圖6表示免疫毒素抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白對H9細胞+HIV-IIIB的作用。
圖7表示用本發(fā)明的免疫毒素的抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白處理H9+MN細胞3天后的效果。
圖8表示培養(yǎng)1天后本發(fā)明的gelonin免疫毒素對H9細胞+HIV-MN的作用。
圖9表示本發(fā)明的gelonin免疫毒素對H9細胞+HIV-MN的作用。
本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明公開了一種利用免疫毒素治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的新方法。治療途徑的設(shè)計以釋放極為有效的對AIDS病毒感染細胞具特異性的毒素為基礎(chǔ)，這種特異性是通過利用抗病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體來使之以被感染細胞為目標而獲得的。
大多數(shù)HIV感染細胞在細胞表面表達病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。而且，不同毒株和不同分離物的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶之間的結(jié)構(gòu)差異很小。這與大多數(shù)具高度變異性的HIV病毒蛋白不同。本發(fā)明公開了利用抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的不同單克隆抗體和多種單鏈和雙鏈的催化性核糖體滅活的毒素制備的免疫毒素，這些毒素包括商陸抗病毒蛋白、gelonin、蓖麻毒蛋白A鏈、modeccin和dodecandrin。
免疫毒素的效果與抗體和毒素均相關(guān)。決定細胞結(jié)合、內(nèi)化作用、由細胞表面向內(nèi)部轉(zhuǎn)運和總的細胞毒性的因素是復雜而難以預計的。所以，很難確定將哪一種單克隆抗體與特定的毒素結(jié)合。
本發(fā)明確定了MAb-PAP(商陸抗病毒蛋白)和MAb-Gelonin免疫結(jié)合物的理想的量效曲線。這些量效曲線有助于與其它類型的免疫結(jié)合物制劑進行比較。本發(fā)明還公開了免疫結(jié)合物的制備方法，利用相同的單克隆抗體，但包含毒素蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A鏈和dodecandrin，因為它們具有抗HIV感染細胞的細胞毒性。
本發(fā)明還公開了抗HIV-1-逆轉(zhuǎn)錄酶的其他單克隆抗體。然后，這些單克隆抗體分別與PAP(商陸抗病毒蛋白)、gelonin、麻麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A鏈或dodecandrin偶聯(lián)，然后測定細胞毒性。
本發(fā)明描述了一種包含免疫毒素的組合物，所述的免疫毒素包含與抗病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體化學結(jié)合的毒素。制備了一組共70多種抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的鼠單克隆抗體。它們在IgG和IgM種類和亞型上有所不同。HIV逆轉(zhuǎn)錄酶特異性單克隆抗體的代表性實例包括HIVRT10-1-a，HIVRT2-2-F8，HIVRT11-1-b，HIVRT6-1-a，HIVRT12-1-c，HIVRT6-9，HIVRT15-3，HIVRT16-4，HIVRT14-1-d，HIVRT18-1，HIVRT2-3-b，HIVRT10-1-b和HIVRT10-4。
本發(fā)明還提供了一種治療獲得性免疫缺陷綜合征的方法，包括給患有所述綜合征的病人使用治療有效量的權(quán)利要求4所述的組合物步驟。
而且，本發(fā)明提供了治療感染了人免疫缺陷病毒的個體的方法，包括給所述個體使用治療有效量的本發(fā)明組合物的步驟。
本發(fā)明特別考慮可以利用本發(fā)明新的免疫毒素來制備藥物組合物。此時，藥物組合物包含本發(fā)明新的免疫毒素和藥學上認可的載體。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員無需過多實驗即可方便地確定給予本發(fā)明的不同免疫毒素的合適劑量和途徑。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明新免疫毒素和藥學上認可的載體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物適用于各種藥物釋放系統(tǒng)。有關(guān)目前藥物釋放方法的簡要綜述可參見Langer，《科學》(Science)，2491527-1533(1990)。制備可使用的化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或是顯而易見的，在Remington的《藥物科學》(Pharmaceutical Science)，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1988)中有詳細的說明。
在任何治療方案中，本發(fā)明的免疫毒素可以單獨使用，也可以以包含兩種或兩種以上免疫毒素、包括但不限于免疫抑制劑、耐受性誘導劑、增效劑和副作用緩解劑在內(nèi)的其它治療藥物、組合物之類的混合物的形式使用。尤其好的是用于在宿主中抑制變態(tài)反應(yīng)的免疫抑制劑。較好的免疫抑制劑包括潑尼松，潑尼松龍，DECADRON，環(huán)磷酰胺，環(huán)孢菌素，甲氨喋呤和硫唑嘌呤。較好的增效劑包括莫能星，氯化銨，哌克昔林，維拉帕米和金剛烷胺。以上藥物均按本領(lǐng)域熟知的一般有效劑量使用。此外，如果病人確實對特定的免疫結(jié)合物有免疫反應(yīng)，可以在此后使用別的免疫結(jié)合物，這種免疫結(jié)合物的單克隆抗體和毒素成分其中之一或兩者可與前一種不同。
可將本發(fā)明的免疫毒素配制成注射制劑后再使用。腸胃外制劑是眾所周知的，而且適用于本發(fā)明，例如肌內(nèi)或靜脈內(nèi)劑型。含有治療有效量的免疫毒素的制劑是無菌溶液、懸浮液或凍干制劑，而且最好包含穩(wěn)定劑和賦形劑。凍干制劑用合適的稀釋劑，例如注射用水、鹽水、0.3％甘氨酸等溶解，給藥劑量約為每公斤宿主體重0.01mg至10mg，此時的生物活性低于或等于以網(wǎng)織紅細胞裂解物檢定時測出的20ng/ml。通常，包含本發(fā)明免疫毒素的藥物組合物在約每kg病人體重0.01mg至約5mg的范圍內(nèi)，使用數(shù)天至約2周，每天靜脈輸注給藥。在賦形劑中的確切使用濃度由為了優(yōu)化療效而進行的適當?shù)膶嶒灤_定。
為了達到向肺局部釋放，本發(fā)明的免疫毒素可以制成氣霧劑來使用。這需要制備包含免疫毒素的水性氣霧劑，脂質(zhì)體制劑或固體顆粒。一般來說，水性氣霧劑是通過將免疫毒素的水溶液或懸浮液與常規(guī)載體和穩(wěn)定劑配制在一起而制成的。載體和穩(wěn)定劑根據(jù)具體的免疫毒素的要求而不同，但通常包括非離子性表面活性劑、球蛋白之類的無毒蛋白、脫水山梨糖醇酯、卵磷脂、甘氨酸之類的氨基酸和緩沖劑、鹽、糖或糖醇。
或者，本發(fā)明的免疫毒素可以利用如Steiner等的美國專利4,925,673中所述的類蛋白膠囊之類的釋放系統(tǒng)口服。通常，本發(fā)明免疫毒素的口服治療有效劑量在約每天每kg體重0.01mg至約50mg之間。較好的有效量范圍約為每天每kg體重0.05mg至約5mg。
本發(fā)明的免疫毒素可以以溶液的形式使用。溶液的pH應(yīng)該在pH5至pH9.5，pH6.5至7.5更好。免疫毒素或其衍生物所在的溶液必需具有合適的藥學上認可的緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷HCl或檸檬酸鹽緩沖液等。緩沖劑的濃度應(yīng)該在1至100mM之間。免疫毒素溶液還可以含有濃度為50-150mM的某種鹽，例如氯化鈉。其中還可以包含有效量的穩(wěn)定劑，例如白蛋白、球蛋白、明膠、魚精蛋白或魚精蛋白鹽。
本發(fā)明還提供了治療人體獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的方法，其中包括給病人使用治療有效量的本發(fā)明免疫毒素，其目的在于抑制HIV病毒的復制。
以下實施例是為了說明本發(fā)明的各種實施方式，而不是以任何一種形式來限定本發(fā)明。
實施例1毒素的制備利用標準的公知的方法可以純化被認為可以用作免疫毒素組成部分的各種毒素。從提取物中純化核糖體滅活的蛋白質(zhì)的方法對所有這類蛋白質(zhì)都是相類似的。這些蛋白質(zhì)在帶電時多呈堿性，不與DEAE-纖維素之類的陰離子交換樹脂結(jié)合。用于商陸抗病毒蛋白的典型方法可參見Irvin，J.D.生物化學與生物物理學報(Arch.Biochem.Biophys.)169，522-528(1975)；Irvin，等，生物化學與生物物理學報(Arch.Biochem.Biophys.)200，418-425(1980)；Barbieri等，生物化學雜志(Biochem.J.)20355-59(1982)；純化gelonin的方法可參見Lambert，J.等，“免疫毒素”第177頁(1988)，Stirpe等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)255，6947-6953(1980)，純化dodecandrin的方法可參見ReadyJ.D.等，Biochim.Biophys.Acta791，314-319(1984)。為了獲得可能進行的臨床試驗所要求的超高純度，還設(shè)計了用于PAP的抗體親和柱。該方法容易經(jīng)修改而用于其他毒素。
實施例2HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的制備根據(jù)Kohlstaedt和Steitz在美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)891259(1989)中所述的方法制備HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。用于制備HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的純化方案使用了Summers和D’Aquila(1989)所述的一種逆轉(zhuǎn)錄酶表達克隆，是通過NIH，NIAID，AIDS室，AIDS研究和參比制劑程序獲得的，制劑號pKRT2，目錄號393，由Richard D’Aquila博士和William C.Summers博士提供。
實施例3單克隆抗體的制備以下是產(chǎn)生雜交瘤細胞系的典型方案。取兩只雄性(RTI和RTII)及兩只雌性(RTIII和RTIV)6周齡的balb/c小鼠，預先放血用作陰性對照，然后每只注射以10μg重組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。在SDS凝膠上檢驗這些蛋白質(zhì)的純度。每只小鼠用逆轉(zhuǎn)錄酶增強免疫3次，每次2μg。然后采取每只小鼠的血樣，測得效價在60,000至80,000之間(方法見后文)。將兩只雌性小鼠殺死，取出脾臟。取自經(jīng)免疫的脾臟的細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合。在與骨髓瘤融合的骨髓瘤細胞不能生長的選擇性培養(yǎng)基(1×HAT)上培養(yǎng)這些融合細胞。該培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷。與骨髓瘤融合的脾細胞被稱為雜交瘤。用ELISA法測試各親代雜交瘤(參見后文的間接ELISA)。對測試結(jié)果為陽性的雜交瘤進行第二次測試。如果雜交瘤第二次測試為陽性，取一部分該親代克隆進行培養(yǎng)(擴增)后冷凍；另一部分進行亞克隆。仍然用ELISA測試這些第一代的亞克隆。測試結(jié)果為陽性的第一代亞克隆擴增后冷凍，一部分再次亞克隆。仍然將測試為陽性的第二代亞克隆擴增后冷凍。取自這些測試結(jié)果為陽性的第二代亞克隆的上清液含有可提取和純化的單克隆抗體。
實施例4利用間接ELISA測試小鼠血清的抗體效價稀釋逆轉(zhuǎn)錄酶抗原，使得平底96孔微量滴定板(NUNC-Immunoplate，ThomasScientific)上每孔含50ng抗原?？乖谑覝叵聹赜?小時。溫育后，攤開抗原，每孔用100μl封閉緩沖液(0.1M磷酸鉀，0.5％吐溫20，1％牛血清白蛋白，pH7.0)在室溫下封閉30分鐘。滴定板洗滌三次(洗滌緩沖液-0.1M磷酸鉀，0.5％吐溫，pH7.0)，加入經(jīng)稀釋的血清樣品，并在4℃溫育過夜。稀釋范圍是1∶250至1∶80,000。在第二天，全部升溫至室溫，洗滌滴定板，制備與過氧化物酶結(jié)合的AffiniPure Donkey抗小鼠IgG(Jackson免疫研究實驗室公司)1∶1000的稀釋液。將此稀釋液加至每個孔中，滴定板在室溫下溫育30分鐘。再次洗滌滴定板，每孔加入100μl底物溶液(0.7mg/ml的2，2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽[ABTS])(Moss，Inc)，反應(yīng)20分鐘。然后每孔加入100μl草酸終止反應(yīng)。用ELISA讀數(shù)儀(BioRad，2550型)讀取414nm處的吸光度。選取相當于陽性結(jié)果的光密度(OD)讀數(shù)為大于0.500，按此標度，4只小鼠都具有1∶80,000的效價。
實施例5陽性雜交瘤的篩選通過檢測細胞上清液來檢出陽性雜交瘤的篩選方法與間接ELISA的方法相同。用100μl洗滌緩沖液(0.1M磷酸鉀，0.05％吐溫20，1mg/ml牛血清白蛋白，pH7.0)按1∶1稀釋細胞上清液。使用的抗原是純化的逆轉(zhuǎn)錄酶，每孔加50ng。再次測試所有陽性的第一代亞克隆，如果它們再次表現(xiàn)為陽性，就進行第二次亞克隆。仍然利用ELISA法測試第二代亞克隆。如果第二代亞克隆再次表現(xiàn)為陽性，擴增并冷凍該第二代亞克隆以備以后用于生產(chǎn)單克隆抗體。
實施例6單克隆抗體腹水的產(chǎn)生利用6周齡的雌性balb/c小鼠來產(chǎn)生腹水。首先注射pristine來引發(fā)腹水的產(chǎn)生。給12只小鼠注射雜交瘤HIVRT-10-1-a。10天后，小鼠的腹膜腔內(nèi)發(fā)生明顯的腫脹。這表明存在軟性的充滿液體的腫瘤，可以使用20.5的Precision Glide針頭抽取其中的腹水。在靠近大腿上部處將針頭插入腹膜腔。每天變換穿刺位點以盡可能減輕不適。由每只小鼠采集的腹水量在0.2ml至3.0ml之間。將同一天采集自同一組小鼠的腹水合并。然后，腹水在經(jīng)滅菌、預平衡的15ml試管中用Sorvall GSA轉(zhuǎn)子在Sorvall Superspeed RC2-B離心機上以3000g離心15分鐘。除去上層的脂肪層，將腹水與管底的細胞碎片沉淀分離。在軟性的充滿液體的腫瘤變硬，而且從腹膜腔中抽不出腹水時終止采集。此時，將小鼠殺死。然后將取自每一雜交瘤系的腹水合并。將腹水在4℃保存于滅菌試管中。
實施例7利用G蛋白純化單克隆抗體將來自HIVRT-10-1-a雜交瘤系的小鼠的腹水上樣在G蛋白柱上。G蛋白-瓊脂糖4B購自Sigma，產(chǎn)品號54HO145。根據(jù)生產(chǎn)商的方法說明，所有的G蛋白步驟均在4℃進行。為了估計單克隆抗體組分中的蛋白質(zhì)濃度，使用Bradford測定法(Bradford，M.，1976)。使用購自Bio-Rad的這種測定的微量試劑盒(no.500-0006)(Bio-Rad，1984)。利用SDS聚丙烯酰胺電泳來檢測最終抗體的純度，經(jīng)檢測，純度高于95％。
實施例8免疫毒素的合成方案實施以下一般方法的步驟來合成免疫毒素(1)將毒素與接頭偶聯(lián)(圖1A)；(2)將單克隆抗體與接頭偶聯(lián)(圖1B)；(3)將毒素+接頭還原(圖1C)；和(4)將毒素與單克隆抗體連接(圖1D)。圖1顯示了用到的典型化學反應(yīng)。如果要獲得滿意的總合成結(jié)果，就必需高得率地實施以上每一步并純化產(chǎn)物。在本例中，利用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)將植物毒素通過二硫鍵與單克隆抗體連接，以使毒素與抗體的平均比在1至2∶1之間。該技術(shù)被證明在產(chǎn)生均勻結(jié)合的免疫毒素方面不單具有重現(xiàn)性而且高效。以下將詳細說明制備單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白結(jié)合物的方法。
實施例92-吡啶基二硫代丙酰-PAP(PDP-PAP)的制備在以pH7.0的40mM磷酸鈉緩沖的0.200ml最終體積中，通過0.16mM的PAP和0.48mM的SPDP反應(yīng)來制備PDP-PAP。在37℃溫育1小時后，在用pH6.0的50mM磷酸鉀平衡的HPLC Protein Pak 300SW上分離混合物。用25分鐘收集每份為1ml的流分。用真空離心蒸發(fā)濃縮器(Speedvac)濃縮峰流分。取部分該PDP-PAP濃縮流分進行凝膠電泳檢測其純度。
實施例10PDP-抗體的制備單克隆抗體與3倍摩爾過量的SPDP在40mM pH7.0的磷酸鈉中于37℃溫育1小時。在用50mM pH6.0的磷酸鉀平衡的大小排阻HPLC柱上分離樣品。用25分鐘的時間收集25份每份1ml的流分。用Speedvac濃縮峰流分。取一小部分PDP-MAb樣品進行SDS凝膠電泳來檢測純度。
實施例11PDP-抗體的制備單克隆抗體與3倍摩爾過量的SPDP在40mM pH7.0的磷酸鈉中于37℃溫育1小時。在用50mM pH6.0的磷酸鉀平衡的大小排阻HPLC柱上分離樣品。用25分鐘的時間收集25份每份1ml的流分。用Speedvac濃縮峰流分。取一小部分PDP-MAb樣品進行SDS凝膠電泳來檢測純度。
許多交聯(lián)物質(zhì)可在本發(fā)明的方法中用于將單克隆抗體與毒素化學連接。交聯(lián)劑的代表性實例包括間馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)，N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)，鹽酸α-亞氨基噻茂烷(α-iminothiolane hydrochloride)，3-巰基丙亞胺酸甲酯(methyl 3-mercaptopropionimidate)，4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)，4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB)和4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亞胺酯(SMPB)。
多種毒素均可與本文中的單克隆抗體化學連接。合適的毒素的代表性實例包括商陸抗病毒蛋白，gelonin，蓖麻毒蛋白，紅豆毒素，modeccin，dodecandrin，皂草素，volkensin，vicumin。
或者，本發(fā)明的免疫結(jié)合物也可以是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因工程方法制備的融合蛋白。這樣的融合蛋白將包含抗體分子的抗原識別位點和毒素的細胞毒部分。
實施例12免疫結(jié)合物的細胞毒性利用多種細胞系在體外驗證了結(jié)合物的效果，即特異性地殺死被感染細胞與非感染細胞的比值。將各種濃度的免疫毒素加入一種或多種非感染細胞及對應(yīng)的慢性感染細胞培養(yǎng)物中，后者來自各種病毒感染性致細胞病變效應(yīng)。每天利用碘化丙錠的排斥和EPICS Profile流動細胞計數(shù)儀上的光散射來監(jiān)測細胞的存活和生長。
利用前文制備的商陸抗病毒蛋白和gelonin以二硫鍵連接的免疫結(jié)合物對不同的細胞系和/或HIV毒株進行三個獨立的系列的細胞毒性實驗。這些細胞毒性實驗的代表性實例如下文所述。
圖2和表1顯示的是不同量的免疫毒素作用于細胞24小時或48小時的實驗結(jié)果，該毒素為抗感染H9細胞的HIV毒株(HIV-AC-1)的抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素。溫育24小時后，抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素殺死了約65％的被HIV感染的細胞，但只殺死了約15％的非感染細胞(對照)。而在溫育48小時后，抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素殺死了約95％的被HIV感染的細胞，但只殺死了約20％的非感染細胞(對照)。值得注意的是免疫毒素對HIV感染細胞的高度特異性。
表I抗AC-1毒株的免疫毒素處理后的天數(shù) 靶細胞培養(yǎng)基 死亡細胞％1μl 10μl 100μl1 H94％ 3％5％ 17％H9+ACl4％ 19％ 32％68％2 H96％ 4％6％ 23％H9+ACl6％ 15％ 48％96％圖3和表II顯示的是抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素作用于HIV細胞系H-9和HIV毒株P(guān)M-213經(jīng)24、48或72小時的作用結(jié)果。溫育72小時后，抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素實際殺死100％HIV感染的細胞但只殺死約20％的非感染細胞(對照)。
表II抗PM-213毒株的免疫毒素處理后的天數(shù) 靶細胞培養(yǎng)基 死亡細胞％1μl 10μl 100μl1 H93％2％5％2％H9+2136％4％8％21％2 H92％1％4％8％H9+2135％8％24％ 46％3 H94％1％3％19％
H9+2137％12％30％100％用于上述研究的H-9細胞系衍生自單一的T細胞克隆，該克隆來自用HIV-1時允許高度生長而被選出的特異性HUT78細胞系。有關(guān)該細胞系的其它信息可以在國立衛(wèi)生研究院AIDS參比研究制劑目錄(National Institutes of Health AIDSReference Research Reagent Catalog)(一月，1995)中找到。用于制備圖2和圖3所示實驗中使用的免疫毒素的單克隆抗體由M.G.Sarngadharan博士提供。細胞在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中生長并保溫。
用含商陸抗病毒蛋白(PAP)和含gelonin的免疫結(jié)合物進行第二組實驗。這一次，使用的單克隆抗體(HIVRT 10-1-a)是在Austin的Texas大學如前文所述制備的。同樣，使用的細胞系是H-9而HIV毒株是PM213，并以同樣的方式進行細胞毒性的測試。圖4顯示的是用本發(fā)明的抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素溫育一天后的細胞毒性的量效關(guān)系。隨著免疫毒素濃度的增高，可以看見針對HIV感染的細胞的細胞毒性增加。同樣，圖5表明本發(fā)明抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-gelonin免疫毒素的細胞毒性量效關(guān)系。用包含PAP和gelonin的免疫毒素都可以觀察到對HIV感染的細胞的選擇性殺滅。
使用與第二組實驗中相同的包含PAP和gelonin的構(gòu)建物和細胞毒性測試方法進行第三組和其它系列實驗。在這些實驗中，在H-9細胞系中使用毒株HIV-IIIB和HIV-MN，進行3天的溫育。國立衛(wèi)生研究院AIDS參比研究制劑目錄(NationalInstitutes of Health AIDS Reference Research Reagent Catalog)(一月，1995)中對HIV-IIIB和HIV-MN毒株進行了描述。
圖6和表III顯示的是抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素對H-9細胞+HIV-IIIB的作用。在劑量為1ng/ml時，商陸抗病毒蛋白的免疫毒素在3天后殺死約77％的細胞。10ng/ml的劑量殺死約90％的細胞。對非感染細胞的毒性極小。
表IIIPAP免疫毒素處理后的天數(shù) 靶細胞培養(yǎng)基 死亡細胞％1 3.4101 H9 7 8 11 19H9+HIVIIIB 9 2630 34H9+HIVMN 9 1211 172 H9 4 5 9 7H9+HIVIIIB 5 5965 70H9+HIVMN 7 2524 393 H9 6 9 12 9H9+HIVIIIB 7 7789 92H9+HIVMN 7 5154 68H9表示非感染細胞系。免疫毒素的劑量按μg/ml表示。
圖7和表III顯示的是用本發(fā)明的抗逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體-商陸抗病毒蛋白免疫毒素處理H9+MN細胞3天后的效果。在劑量為1ng/ml時，PAP免疫毒素在3天后殺死約50％的細胞。10ng/ml的劑量在本試驗期間殺死約68％的細胞。對非感染細胞的毒性仍然很低。
圖8和表IV顯示的是溫育3天后本發(fā)明的gelonin免疫毒素對H9細胞+HIV-IIIB的效果。3天后，劑量為1ng/ml的gelonin免疫毒素殺死約80％的細胞。3.4ng/ml的該免疫毒素殺死約90％的細胞。
圖9和表IV顯示的是本發(fā)明的gelonin免疫毒素對H9細胞+HIV-MN的效果。在劑量為1ng/ml時，gelonin免疫毒素在3天后殺死約80％的細胞。10mg/mlgelonin免疫毒素的劑量殺死約93％的細胞。
表IVGELONIN免疫毒素處理后的天數(shù) 靶細胞 培養(yǎng)基死亡細胞％1 3.4 101 H9 6 5 4 8H9+HIVIIIB 7 302946H9+HIV MN5 1516212 H9 6 118 10H9+HIVIIIB 6 404461H9+HIV MN5 3130373 H9 6 10118H9+HIVIIIB 7 809190H9+HIV MN7 797895H9表示非感染細胞系。免疫毒素的劑量按μg/ml表示。
總之，以上細胞毒性實驗直接證明兩種不同的抗HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體可以與兩種不同類型的植物毒素結(jié)合并選擇性地殺死被數(shù)種不同的HIV毒株感染的細胞。以上結(jié)果表明可以利用多種抗HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體和多種毒素組成免疫結(jié)合物來選擇性地滅活被HIV感染的細胞。
以上說明書中提及的全部專利和出版物均代表著本發(fā)明所涉領(lǐng)域技術(shù)人員的研究水平。本文對全部專利和出版物均作了相同程度的參考引用，即對每一篇文獻均作了單獨而專門的引證說明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的是，本發(fā)明可加以改變而實現(xiàn)本文所提及的以及本發(fā)明所固有的目標并獲得所述的結(jié)果和優(yōu)點。以上說明的實施例以及方法、步驟、處理方法、分子和具體的化合物都代表優(yōu)選實施方式，都是示范性的，并不是為了限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出在其中可作的改動以及其它用途，這些都包括在由權(quán)利要求的范圍所定義的本發(fā)明精神之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，它包含一種免疫毒素，所述的免疫毒素包含與抗HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體化學結(jié)合的毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的毒素選自商陸抗病毒蛋白，gelonin，蓖麻毒蛋白，紅豆毒素，modeccin，dodecandrin，皂草素，volkensin和vicumin。
3.一種藥物組合物，其中包含權(quán)利要求1所述的組合物和藥學上認可的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的免疫毒素利用以下交聯(lián)劑化學交聯(lián)，間馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)，N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)，鹽酸α-亞氨基噻茂烷(α-iminothiolanehydrochloride)，3-巰基丙亞胺酸甲酯(methyl 3-mercaptopropionimidate)，4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)，4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB)和4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亞胺酯(SMPB)。
5.一種治療獲得性免疫缺陷綜合征的方法，包括一步給患有所述綜合征的病人使用治療有效量的權(quán)利要求3所述的組合物。
6.一種治療被人免疫缺陷病毒感染的個體的方法，包括一步給所述個體使用治療有效量的權(quán)利要求3所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的抗艾滋病免疫毒素。這種免疫毒素包含與抗病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的單克隆抗體化學結(jié)合的毒素。本發(fā)明還提供了使用這種新的免疫毒素的各種方法,其中包括治療各種疾病的方法。
文檔編號C07K16/40GK1184484SQ96193981
公開日1998年6月10日 申請日期1996年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月14日
發(fā)明者G·B·基托 申請人:研究發(fā)展基金會