專利名稱：：用分離的未加工多肽對正鏈rna病毒的診斷和免疫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及用于正鏈RNA病毒的高特異、高敏感的診斷方法和組合物。本方法和組合物還適于刺激動物的免疫應(yīng)答，及免疫動物抗正鏈RNA病毒。本發(fā)明的背景獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)是由已知為HIV的一組逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的(Barre-Sinoussi等，科學(xué)220868-871，1983；Gallo等，科學(xué)225500-503，1984；Coffin等，科學(xué)232697，1986)。該組的第一個(gè)成員已命名為HIV-1，其為世界范圍內(nèi)主要的AIDS病例的原因。它與從WAf發(fā)現(xiàn)的HIV-2分離株(Clavel等，科學(xué)233343-346，1986)不同。雖然HIV-2象HIV-1一樣可造成人的免疫缺損綜合癥，但它還是在遺傳學(xué)上與HIV不同(Guyader等，自然326662-669，1987)。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒類似，HIV分離株的基因組包括三個(gè)基本的基因gag，pol和env(Weiss等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，1985)。而且基因組含有許多其他基因，其基因產(chǎn)物在病毒基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中起著重要的作用(Dayton等，細(xì)胞44941-947，1986；Fisher等，自然320367-371，1986；Sodroski等，自然321412-417，1986)。HIV-1的傳播典型地通過性接觸、暴露給血液或某些血液制品或由感染的母親傳播給她的嬰兒或孩子(Piot等，科學(xué)239573-579，1988)。首例輸血相關(guān)的HIV-2感染已發(fā)現(xiàn)(Courouce等，AIDS2261-265，1988)。因此，對敏感和特異地檢測血液中HIV的方法的需求是十分迫切的。已發(fā)展的EIA根據(jù)全病毒或病毒裂解物來檢測HIV。但是，已發(fā)現(xiàn)E1As和來自非HIV感染個(gè)體的樣本有不可接受的非特異反應(yīng)，如對自身免疫病、多妊娠史、抗-HLA、EBV感染或血液高丙種球蛋白病人。為了避免這些非特異反應(yīng)并試圖檢測樣品中的抗-HIV-1和抗-HIV-2，一種應(yīng)用HIV-1核心和HIV-1包膜和HIV-2包膜蛋白的ELISA已由進(jìn)行HIV感染血清學(xué)診斷的Abbott實(shí)驗(yàn)室研制并商品化。但是，這種ELISA還不能提供血液制品的超級保護(hù)或病人HIV的早期診斷所需的高特異、高敏感的檢測。因此，為了提供血液制品的超級保護(hù)和病人HIV的超級診斷，需要一種能高特異高敏感檢測HIV的產(chǎn)品和方法。還需要能刺激對HIV的免疫應(yīng)答，特別是對HIV的免疫保護(hù)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)品和方法。本發(fā)明可提供這些需要和其它相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。除了與HIV相關(guān)的問題之外，其它正鏈RNA病毒也是世界范圍內(nèi)重要的健康危險(xiǎn)因素。這種正鏈RNA病毒的一個(gè)例子就是丙型肝炎病毒(HCV)。HCV與其它形式的引起病毒相關(guān)性肝病的已知肝炎病毒如甲型肝炎病毒(HAV)和乙型肝炎病毒(HBV)不同。與HIV類似，HCV經(jīng)常通過輸血傳播；輸血后肝炎(PTH)約占輸血病人的10％，而HCV(即非甲非乙型肝炎(NANBH))占這些病例的90％以上。這種疾病所產(chǎn)生的主要問題是經(jīng)常向慢性肝損傷發(fā)展(25-55％)。因此，十分需要用于檢測污染的血液或血液制品中HCV的敏感特異的方法。丙型肝炎病毒(HCV)由Choo等(科學(xué)244359-362，1989)首先經(jīng)分子克隆并確定其RNA基因組而加以鑒定。然后經(jīng)酵母重組DNA方法，產(chǎn)生了應(yīng)用一種命名為C100-3的HCV抗原的特異性分析。該分析檢測抗HCV的抗體(科學(xué)244362-364)。HCV基因組和一些從其中衍生的cDNA序列和多肽以及關(guān)于這些物質(zhì)的方法學(xué)的詳細(xì)揭示提供在ChironCorporation的EP0318216A1中。特別是，該公開提供了一種可用于檢測一種類型的HCV抗體、含有363個(gè)病毒編碼氨基酸的合成多肽C100-3。目前，以C100-3抗原為基礎(chǔ)的檢測HCV抗體的試劑盒已由Abbott實(shí)驗(yàn)室商業(yè)化。如EP0318216A1所述，HCV可能是黃病毒或類黃病毒。在普通形態(tài)學(xué)方面，黃病毒含有由脂雙層環(huán)繞中心核衣殼。據(jù)認(rèn)為丙型肝炎病毒由包括一核衣殼(核心)蛋白(C)、兩個(gè)糖基化包膜蛋白(E1、E2)的結(jié)構(gòu)蛋白和許多非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-5)所組成。已證實(shí)由Choo等所發(fā)現(xiàn)的C100-3為HCV基因組的非結(jié)構(gòu)區(qū)3-4部分所編碼的一種蛋白。已發(fā)現(xiàn)并不能在所有的輸血后NANBH病例中檢測到抗-C100-3抗體。檢測抗-C100-3失敗可能是由于C100-3區(qū)核苷酸序列的超突變。除了非結(jié)構(gòu)C100-3抗原的工作，已發(fā)展了一種應(yīng)用HCV核心蛋白(p22)用于丙型肝炎病毒(HCV)感染的血清學(xué)診斷的酶聯(lián)免疫吸收分析。如Chiba等(美國科學(xué)院院報(bào)884641-4645，1991)所報(bào)道，用重組桿狀病毒合成該核心蛋白。但是，這種以核心為基礎(chǔ)的分析不能檢測到大量的HCV感染病例，甚至當(dāng)所得到的樣品體積非常大時(shí)。因此，如其它正鏈RNA病毒，需要能高特異、高敏感檢測HCV的產(chǎn)品和方法。如其它正鏈RNA病毒，還需要能刺激對HCV的免疫應(yīng)答，特別是對HCV的免疫保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了這些需要和其它優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的概述本發(fā)明是關(guān)于正鏈((+)鏈)RNA病毒結(jié)構(gòu)區(qū)的未加工完整多肽(如多蛋白)或未加工的顆粒多肽和非結(jié)構(gòu)區(qū)的蛋白能提供一超級抗原并因此而提供一改良的樣品中正鏈RNA病毒的檢測和診斷方法的概念。本發(fā)明還提供了改進(jìn)的免疫激活方法，包括改進(jìn)的動物的免疫保護(hù)性應(yīng)答。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了含有正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的正鏈RNA病毒衍生組合物。在另一方面，本發(fā)明提供包含如下成分的正鏈RNA病毒衍生組合物a)分離的含有連接到正鏈RNA病毒相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型(本文中對該多肽有時(shí)稱為“類核心抗原-相鄰蛋白”；和b)一種分離的正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。如下進(jìn)一步所述，本申請對類核心抗原-相鄰蛋白的所有闡明可相應(yīng)地應(yīng)用到正鏈RNA病毒的env蛋白，env蛋白一般至少含有一個(gè)與相鄰蛋白的未加工紐鏈。在優(yōu)選的與本發(fā)明的每個(gè)方面都相關(guān)的實(shí)施方案中，正鏈RNA病毒選自披蓋病毒科、冠狀病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科、杯狀病毒科和黃病毒科所構(gòu)成的組，更優(yōu)選來自由丙型肝炎病毒、人免疫缺損病毒(HIV)和人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)所構(gòu)成的組。除非特殊聲明，所有優(yōu)選的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的每個(gè)方面。另外除了HCV，正鏈RNA病毒可為任何正鏈RNA病毒。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，由適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞，特別是細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)產(chǎn)生該組合物。此外，該分離的多肽由不能加工該分離多肽的適當(dāng)真核宿主細(xì)胞產(chǎn)生。在另一方面，本發(fā)明提供了制備含有來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的組合物的方法。這一方面還提供了制備來自正鏈RNA病毒的多個(gè)多肽的方法，該方法含有下列步驟a)將能表達(dá)編碼分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽的核酸分子的第一個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入到第一個(gè)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)在適于表達(dá)載體產(chǎn)生多肽的條件下孵育第一個(gè)宿主細(xì)胞，c)純化多肽以制備純化的多肽，和d)將能表達(dá)編碼一分離的正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子的第二個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入到第二個(gè)宿主細(xì)胞中，e)在適于核酸分子產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白的條件下孵育第二個(gè)宿主細(xì)胞，f)純化非結(jié)構(gòu)蛋白以制備純化的非結(jié)構(gòu)蛋白，接著g)將純化的多肽和純化的非結(jié)構(gòu)蛋白組合在組合物中。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括a)將能表達(dá)編碼分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽的核酸分子的第一個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)在適于表達(dá)載體產(chǎn)生多肽和非結(jié)構(gòu)蛋白的條件下孵育宿主細(xì)胞，c)純化多肽和非結(jié)構(gòu)蛋白以制備純的多肽和純的非結(jié)構(gòu)蛋白。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括將本發(fā)明多肽結(jié)合到固體基質(zhì)上。另一方面，本發(fā)明提供了含有正鏈RNA病毒的分離的基本完整的未加工多蛋白的正鏈RNA病毒衍生組合物，其中多蛋白結(jié)合到固體基質(zhì)上。或者，組合物含有與固體基質(zhì)結(jié)合的類核心抗原-相鄰蛋白，優(yōu)選還含有與固體基質(zhì)結(jié)合的正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析包括a)提供一種分離的含有正鏈RNA病毒類核心抗原-相鄰蛋白的多肽，b)將分離的多肽在適當(dāng)?shù)臈l件下和樣品接觸充分的時(shí)間，保證多肽與一種或多種正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合多肽，和c)檢測抗體結(jié)合多肽，據(jù)此確定樣品中含有正鏈RNA病毒。在另一實(shí)施方案中，該方法包括a)提供一種分離的含有正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的多肽，b)將分離的多肽在適當(dāng)?shù)臈l件下和樣品接觸充分的時(shí)間，保證多肽與一種或多種正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合多肽，和c)檢測抗體結(jié)合多肽，據(jù)此確定樣品中含有正鏈RNA病毒。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法還包括a)步驟a)中，提供一種結(jié)合到固體基質(zhì)上的正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，b)步驟b)中，將非結(jié)構(gòu)蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下和樣品接觸充分的時(shí)間，保證非結(jié)構(gòu)蛋白與一種或多種正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合正鏈RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，和c)在步驟c)中，檢測抗體結(jié)合多肽，或抗體結(jié)合非結(jié)構(gòu)蛋白，據(jù)此確定樣品中含有正鏈RNA病毒。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分析還包括結(jié)合分離的多肽、非結(jié)構(gòu)蛋白、或結(jié)合在固體基質(zhì)的多蛋白的步驟。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品為未純化的樣品，一般來自動物，優(yōu)選來自人。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析選自對流免疫電泳(CIEP)分析、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)、斑點(diǎn)印跡分析、抑制或競爭分析、夾心分析、免疫黏附分析(dip-stick)、同時(shí)分析、免疫層析分析、免疫過濾分析、乳膠珠凝集分析、免疫熒光分析、生物傳感器分析和低光檢測分析所組成的組。該分析更優(yōu)選非蛋白印跡分析。還在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗體的方法，該方法包括下列步驟a)給動物施用分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)分離針對該多肽的抗體。或者，本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗體的方法，該方法包括下列步驟a)給動物施用分離的含有正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的多肽，b)分離針對該多蛋白的抗體。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法之一所制備的抗體，及文中所述的其它蛋白的抗體(如非結(jié)構(gòu)蛋白)?？贵w優(yōu)選結(jié)合在固體基質(zhì)上。另一方面，本法提供了用于檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，其中包括a)將樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下與上述一種或多種抗體接觸充分的時(shí)間，保證給定的抗體結(jié)合抗原蛋白，以產(chǎn)生結(jié)合抗體，和b)檢測結(jié)合抗體，據(jù)此確定樣品中含有正鏈RNA病毒。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品為未純化的樣品，一般來自動物，優(yōu)選來自人。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析方法選自對流免疫電泳(CIEP)分析、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)、斑點(diǎn)印跡分析、抑制或競爭分析、夾心分析、免疫黏附分析(dip-stick)、同時(shí)分析、免疫層析分析、免疫過濾分析、乳膠珠凝集分析、免疫熒光分析、生物傳感器分析和低光檢測分析所組成的組。該分析更優(yōu)選非蛋白印跡分析。另一方面，本發(fā)明還提供了能刺激動物免疫應(yīng)答的組合物，其含有分離的含有正鏈RNA病毒類核心抗原-相鄰蛋白的多肽的、并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。該組合物還優(yōu)選含有正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。另外，本發(fā)明還提供了能刺激動物免疫應(yīng)答的組合物，其含有正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白，并藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。對于本發(fā)明的免疫活性(及其它方面)的每個(gè)方面，動物優(yōu)選為人。本發(fā)明的另一方面還提供了針對正鏈RNA病毒的疫苗，其含有分離的含有正鏈RNA病毒類核心抗原-相鄰蛋白的多肽，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。該組合物還優(yōu)選含有正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。另外，本發(fā)明還提供了針對正鏈RNA病毒的疫苗，其含有正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)動物免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給動物施用一種與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合的、分離的含有正鏈RNA病毒類核心抗原-相鄰蛋白的多肽。該方法還優(yōu)選包括施用正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。另外，該方法包括給動物施用一種與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合的、正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白。本發(fā)明還提供了免疫接種動物的方法，該方法包括給動物施用一種與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合的、分離的含有正鏈RNA病毒類核心抗原-相鄰蛋白的多肽。該方法優(yōu)選還包括施用正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白?；蛘撸摲椒òńo動物施用一種與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合的、來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白。本發(fā)明的另一方面還提供了用于檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，該試劑盒包括a)連接在固體基質(zhì)上的、分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，和b)檢測該分離多肽的工具。試劑盒優(yōu)選含有正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白和檢測非結(jié)構(gòu)蛋白的工具?；蛘?，用于檢測正鏈RNA病毒的試劑盒包括a)連接在固體基質(zhì)上的、來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白，和b))檢測該分離的多蛋白的工具。本發(fā)明的另一方面還提供了用于檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，該試劑盒包括a)一種或多種上述抗體，和b)檢測抗體的工具。試劑盒還可含有a)能刺激免疫應(yīng)答的組合物、或疫苗，及b)給動物施用該組合物或疫苗的工具。轉(zhuǎn)到另一方面，本發(fā)明提供了含有下列組份的正鏈RNA病毒衍生組合物a)分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，和b)能與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。本發(fā)明還提供了制備這種含有包括一種或二種上述多肽的多個(gè)多肽的組合物；這些蛋白可來自相同的或不同的正鏈RNA病毒。本發(fā)明還提供含有第一種從正鏈RNA病毒分離的蛋白和第二種從正鏈RNA病毒(優(yōu)選從相同的正鏈RNA病毒)分離的蛋白，其中根據(jù)下文中本發(fā)明的其它實(shí)施方案所述的方法，選擇第一種和第二種蛋白，使得第一種和第二種蛋白在檢測正鏈RNA病毒和/或動物抗正鏈RNA病毒的免疫增強(qiáng)中具有協(xié)同作用。本發(fā)明還提供了連接在固體基質(zhì)上的、分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，其可以是單獨(dú)的或與連接在固體基質(zhì)上的能與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白組合。本發(fā)明的另一方面還提供了檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，該分析方法包括a)提供一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的一小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，和b)將分離的多肽在適當(dāng)?shù)臈l件下與樣品接觸充分的時(shí)間，保證多肽與一種或多種正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合多肽，和c)檢測抗體結(jié)合多肽，據(jù)此確定樣品中含有正鏈RNA病毒。該方法還可包括a)步驟a)中，提供一種結(jié)合到固體基質(zhì)上的能與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白，b)步驟b)中，將第二種蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下與樣品接觸充分的時(shí)間，保證與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，和c)在步驟c)中，檢測結(jié)合的抗體，據(jù)此確定樣品中含有正鏈RNA病毒。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分析還包括將分離的多肽或第二種蛋白結(jié)合在固體基質(zhì)上的步驟。該分析優(yōu)選地選自對流免疫電泳(CIEP)分析、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)、斑點(diǎn)印跡分析、抑制或競爭分析、夾心分析、免疫黏附分析(dip-stick)、同時(shí)分析、免疫層析分析、免疫過濾分析、乳膠珠凝集分析、免疫熒光分析、生物傳感器分析和低光檢測分析所組成的組。該分析更優(yōu)選為非蛋白印跡分析。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生抗體的方法，該方法包括a)給動物施用分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)分離針對多肽的抗體。該方法還可包括給動物施用能與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。本發(fā)明以如上制備的抗體為特征，這些抗體可結(jié)合在固體基質(zhì)上。這些抗體也可如上所述用于分析。本發(fā)明的另一方面還提供了能刺激動物免疫應(yīng)答的組合物，其含有分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽(其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型)，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。本組合物還可含有能與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。該組合物優(yōu)選為疫苗。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)動物免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給動物施用一種與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合的、分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型。該方法優(yōu)選包括給動物施用能與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。該方法更優(yōu)選包括疫苗接種。本發(fā)明的另一方面還提供了用于檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，該試劑盒包括a)結(jié)合在固體基質(zhì)上的、分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽，其中相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，和b)檢測該分離多肽的工具。該試劑盒優(yōu)選還含有能與連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白和檢測第二種蛋白的工具。或者，用于檢測正鏈RNA病毒的試劑盒可含有a)如上所述制備的抗體，和b)檢測抗體的工具。參考下面的詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將變得十分明了。而且，如上所指明，更為詳細(xì)地描述某些步驟和組份(如，質(zhì)粒，等)的各種參考將置于整個(gè)本專利說明書中；這些參考文獻(xiàn)被全面被引入本文。圖例的簡要描述圖1A表明編碼含有連接到HCV包膜區(qū)的氨基末端部分的HCV核心抗原蛋白的多肽的核酸分子的核苷酸序列。圖1B表明圖1A所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。圖2顯示表達(dá)載體pEN-2的結(jié)構(gòu)，該載體通過插入編碼連接到HCV包膜區(qū)的氨基末端部分的HCV核心抗原蛋白的cDNA到質(zhì)粒中構(gòu)建而成。該圖還顯示了表明載體pEN-2某些重要特征的限制性酶切圖譜。圖3A表明編碼含有NS5非結(jié)構(gòu)區(qū)的多肽的核酸分子的核苷酸序列。圖3B表明圖3A所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。圖4顯示了表達(dá)載體pEN-1的結(jié)構(gòu)，該載體通過插入編碼NS5非結(jié)構(gòu)區(qū)的cDNA到質(zhì)粒中構(gòu)建而成。該圖還顯示了表明載體pEN-2某些重要特征的限制性酶切圖譜。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明以發(fā)現(xiàn)最初從正鏈RNA病毒基因組翻譯的未加工多蛋白含有在加工的蛋白中并不存在的表位構(gòu)型為基礎(chǔ)。特別是，當(dāng)對編碼核心蛋白的基因組區(qū)(如基因)和編碼與核心蛋白氨基末端相鄰的蛋白的基因組區(qū)(例如HCV的包膜蛋白)之間的剪接位點(diǎn)進(jìn)行加工時(shí)，核心蛋白區(qū)(或其它由病毒編碼的、與“核心”蛋白作用相當(dāng)?shù)牡鞍?會喪失一表位構(gòu)型。如下文闡明的實(shí)施例部分所述，核心區(qū)未加工的表位構(gòu)型具有驚人的提高檢測樣品中正鏈RNA病毒、或抗正鏈RNA病毒抗體的能力，樣品包括未純化的樣品或體積非常小的樣品(當(dāng)測試來自嬰兒或可用于檢測的血液(或其它適用的材料)很少的人時(shí)，這一點(diǎn)特別有用)。甚至更令人驚奇的是，將未加工的核心區(qū)和非結(jié)構(gòu)蛋白(如來自HCV的NS5蛋白或一未加工的NS4-NS5融合蛋白)組合，可產(chǎn)生能明顯增強(qiáng)由未加工的核心區(qū)所產(chǎn)生的已提高的敏感性和特異性的協(xié)同作用。這些抗原性和表位構(gòu)型的重要優(yōu)點(diǎn)還可提供用于能明顯增強(qiáng)誘導(dǎo)動物的免疫應(yīng)答的組合物和方法，及增強(qiáng)的動物免疫接種。因此，本發(fā)明以應(yīng)用來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的組合物和方法為特征。本發(fā)明還以應(yīng)用一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰蛋白的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的多肽的組合物和方法為特征，其中正鏈RNA病毒包衣區(qū)的氨基末端部分的大小使得多肽具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰蛋白區(qū)特異的表位構(gòu)型。本發(fā)明還以在組合物和方法中這一未加工核心-相鄰蛋白區(qū)和非結(jié)構(gòu)蛋白的組合，從而對給定的正鏈RNA病毒產(chǎn)生驚人敏感和特異的反應(yīng)為特征。本發(fā)明首次提供了關(guān)于完整多蛋白具有獨(dú)特的構(gòu)型及這一構(gòu)型導(dǎo)致抗原性的重要區(qū)別的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明還首次提供了關(guān)于在核心蛋白-相鄰蛋白區(qū)中存在一丟失的表位構(gòu)型的發(fā)現(xiàn)。來自正鏈RNA病毒的“分離的、基本完整的未加工多蛋白”為最初從正鏈RNA病毒基因組翻譯的多蛋白。這種多蛋白沒有進(jìn)行加工，因此多蛋白的蛋白之間的加工位點(diǎn)并未剪切。多蛋白也是分離的，是指多蛋白已從其編碼的基因組中分離出來。當(dāng)多蛋白保留產(chǎn)生本發(fā)明的免疫活性特點(diǎn)所必須的功能性元件，特別是只存在于多蛋白中而不存在于從多蛋白得到的加工的蛋白或亞單位的表位構(gòu)型時(shí)，則多蛋白為基本完整的。但是，對于本發(fā)明的該蛋白或其它蛋白，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)行保守性氨基酸取代或微小的氨基酸插入、修飾或缺失，這樣可改變蛋白的氨基酸序列而不明顯改變蛋白的功能(即，仍保留著未加工的表位構(gòu)型)。而當(dāng)需要時(shí)，這一修飾可缺失蛋白的加工信號和/或位點(diǎn)。這些修飾在下文將進(jìn)一步討論。例如多蛋白的完整性可通過SDS-PAGE和隨后的氨基酸測序確定。完整性還可通過在下文所討論的一種或多種分析中應(yīng)用所述多蛋白和檢測未加工狀態(tài)特異的表位構(gòu)型的作用來確定?！邦惡诵摹钡鞍诪楫a(chǎn)生與HCV核心蛋白同樣類型功能的結(jié)構(gòu)蛋白。來自其它病毒的“類核心”蛋白的例子為日本腦炎病毒核心蛋白和HIVgag蛋白?！邦惡诵目乖鞍住笔侵负酗@示類核心蛋白抗原性的類核心蛋白部分的結(jié)構(gòu)性“類核心”蛋白。雖然加工時(shí)表位構(gòu)型的改變并非本領(lǐng)域所已知，但是對于抗原性十分重要的類核心蛋白和類核心蛋白區(qū)一般為本領(lǐng)域所熟知(見，例如，Okamoto，等，病毒學(xué)雜志188331，1992；Wang，美國專利No.5,106,726)。如本領(lǐng)域所熟知，可通過常規(guī)核心類型抗原反應(yīng)性的ELISA或蛋白印跡或二者一起，來確定目的正鏈RNA病毒的類核心抗原蛋白。還可通過SDS-PAGE及隨后的氨基酸測序來確定類核心抗原蛋白。一般來說，類核心抗原蛋白連接到正鏈RNA病毒的相鄰蛋白或肽的氨基末端部分，形成本發(fā)明的未加工“類核心抗原-相鄰蛋白”。但是，在一些實(shí)施方案中，特別當(dāng)類核心蛋白不是多蛋白的的第一個(gè)蛋白區(qū)時(shí)，未加工形式的類核心蛋白就連接到正鏈RNA病毒的相鄰蛋白的羧基末端部分，形成本發(fā)明的未加工類核心抗原-相鄰蛋白。未加工形式是指類核心區(qū)和相鄰區(qū)一般并優(yōu)選準(zhǔn)確地保持其在天然的正鏈RNA病毒中它們的連接(即編碼)。對文中的多蛋白和其它蛋白，類核心抗原蛋白可輕微的修飾而不改變類核心抗原蛋白的本發(fā)明的功能。與類核心抗原蛋白相鄰的“相鄰蛋白”部分具有一定大小，使得融合蛋白具有對正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰蛋白特異的表位構(gòu)型。因此，相鄰蛋白區(qū)的氨基末端部分一般必須足夠長，以保證融合蛋白顯示出對未加工的類核心區(qū)特異的瞬時(shí)表位構(gòu)型。除了傳統(tǒng)的類核心蛋白，正鏈RNA病毒的env蛋白也能產(chǎn)生文中所述的類核心抗原-相鄰蛋白所表現(xiàn)出的驚人地增強(qiáng)的抗原構(gòu)象和作用。當(dāng)env蛋白也如文中所述與第二種蛋白組合使用時(shí)，尤其如此。env蛋白優(yōu)選包括一與文中揭示的類核心抗原-相鄰蛋白中所發(fā)現(xiàn)的相類似的與相鄰蛋白的未加工連接(自身可以是相鄰的env蛋白，例如HIV中的gp120和gp41)。而且，第二個(gè)蛋白可以是類核心蛋白，如HIV的gag蛋白。因?yàn)閑nv區(qū)產(chǎn)生的增強(qiáng)的檢測和免疫誘導(dǎo)，與本發(fā)明的類核心抗原-相鄰蛋白所示的相似。所以除非另有聲明或從文中清楚地看出，文中所指明的類核心抗原-相鄰蛋白同樣適用于env和/或env-相鄰蛋白。確定一給定的env或env-相鄰蛋白是否具有這一增強(qiáng)檢測和免疫誘導(dǎo)作用，可通過如下所述的對類核心抗原-相鄰蛋白的分析進(jìn)行。可如下進(jìn)行一給定的多肽是否具有本發(fā)明的類核心抗原-相鄰蛋白的表位構(gòu)型的確定。待定的類核心抗原-相鄰蛋白可包括在一含有已確定的類核心抗原-相鄰蛋白(如EN-80-2)的類核心抗原-相鄰蛋白系列中。將這一系列實(shí)驗(yàn)對象置于微孔板的一系列孔中。該系列也可包括其它具有不同長度相鄰蛋白的類核心抗原-相鄰蛋白。在另外的孔中加入一已確定的能與類核心抗原-相鄰蛋白如EN-80-1協(xié)同作用的非結(jié)構(gòu)蛋白或其它蛋白。針對已確定的類核心抗原-相鄰蛋白，選擇與類核心抗原-相鄰蛋白反應(yīng)較弱的并且與已確定的非結(jié)構(gòu)蛋白無反應(yīng)的血清。選擇的依據(jù)為抗血清將如預(yù)期地與單獨(dú)的蛋白反應(yīng)，但當(dāng)適當(dāng)?shù)念惡诵目乖?相鄰蛋白和已確定的非結(jié)構(gòu)蛋白都存在于樣品中時(shí)，抗血清的反應(yīng)將更強(qiáng)。這種抗血清的多個(gè)例子如下實(shí)施例所示，例如G614(稀釋8倍)、G614(稀釋16倍)、G615(稀釋8倍)、G615(稀釋16倍)和8-5。在適于引發(fā)并檢測抗血清和給定蛋白之間的反應(yīng)的條件下，將抗血清加入到樣品蛋白中，并檢測和測量這一反應(yīng)。然后將已確定的非結(jié)構(gòu)蛋白和類核心抗原-相鄰蛋白系列的每個(gè)成員的其它樣品組合。下一步，在適于引發(fā)并檢測抗血清和蛋白之間的反應(yīng)的條件下，將抗血清引入到組合的蛋白中，并檢測和測量這一反應(yīng)。那些能產(chǎn)生協(xié)同作用的類核心抗原-相鄰蛋白適于應(yīng)用于本發(fā)明。當(dāng)與抗血清與每一種蛋白單獨(dú)反應(yīng)的累加相比時(shí)，抗血清與組合蛋白的反應(yīng)優(yōu)選至少要強(qiáng)1.25或1.5倍?？寡宓姆磻?yīng)更優(yōu)選至少約強(qiáng)兩倍。根據(jù)本說明書，上述的每一步驟在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。類核心抗原-相鄰蛋白優(yōu)選為分離的，其是指類核心抗原-相鄰蛋白與最初從正鏈RNA病毒基因組翻譯的多蛋白的其余部分是分開的。類核心抗原-相鄰蛋白還優(yōu)選分離自其編碼核酸分子。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的類核心抗原-相鄰蛋白用于與第二種蛋白組合。第二種蛋白優(yōu)選來自正鏈RNA病毒，更優(yōu)選來自與類核心抗原-相鄰蛋白相同的正鏈RNA病毒，最優(yōu)選來自正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(優(yōu)選來自與類核心抗原-相鄰蛋白相同的正鏈RNA病毒)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二種蛋白為非結(jié)構(gòu)蛋白。如本領(lǐng)域所熟知，非HCV的其它的正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白也可用其它的名稱。根據(jù)本專利說明書，所有這種非結(jié)構(gòu)類似蛋白在文中稱為“非結(jié)構(gòu)蛋白”。如上所指明，正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)編碼分區(qū)為本領(lǐng)域所熟知。一種適于與類核心抗原-相鄰蛋白一起使用的適當(dāng)?shù)牡诙N蛋白的確定可如下進(jìn)行，該第二種蛋白可包括含有不止一種(或比整個(gè)一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白短)的非結(jié)構(gòu)蛋白的非結(jié)構(gòu)編碼區(qū)部分。待定的第二種蛋白可包括在一含已確定的第二種蛋白(如EN-80-1)的第二種蛋白系列中。將這一系列實(shí)驗(yàn)對象置于微孔板的一系列孔中。該系列也可包括其它具有不同長度相鄰蛋白的第二種蛋白。在另外的孔中加入一已確定的能與第二種蛋白協(xié)同作用的類核心抗原-相鄰蛋白，如EN-80-1。針對已確定的第二種蛋白，選擇與第二種蛋白反應(yīng)較弱的并且與已確定的類核心抗原-相鄰蛋白無反應(yīng)的血清。選擇的依據(jù)為抗血清將如預(yù)期地與單獨(dú)的蛋白反應(yīng)，但當(dāng)適當(dāng)?shù)牡诙N蛋白與已確定的類核心抗原-相鄰蛋白都存在于樣品中時(shí)，抗血清的反應(yīng)將更強(qiáng)。這種抗血清的多個(gè)例子如下實(shí)施例所示。在適于引發(fā)并檢測抗血清和給定蛋白之間的反應(yīng)的條件下，將抗血清加入到樣品蛋白中，并檢測和測量這一反應(yīng)。然后將已確定的類核心抗原-相鄰蛋白與第二種蛋白系列的每個(gè)成員的其它樣品組合。下一步，在適于引發(fā)并檢測抗血清和蛋白之間的反應(yīng)的條件下，將抗血清引入到組合的蛋白中，并檢測和測量這一反應(yīng)。那些能產(chǎn)生協(xié)同作用的第二種蛋白適于應(yīng)用于本發(fā)明。根據(jù)本專利說明書，上述的每一步驟在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。本發(fā)明還提供了針對本發(fā)明的基本完整的多蛋白、類核心抗原-相鄰蛋白、和/或非結(jié)構(gòu)蛋白及其它本發(fā)明的蛋白的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。抗體優(yōu)選組合應(yīng)用以產(chǎn)生對樣品中正鏈RNA病毒的特別敏感和特異的檢測。本發(fā)明還提供了用于激活動物免疫應(yīng)答(體液或細(xì)胞或二者)的組合物和方法。該組合物和方法甚至還能免疫接種動物抗正鏈RNA病毒。本發(fā)明的包括那些檢測、免疫應(yīng)答激活和免疫接種的方法和組合物優(yōu)選應(yīng)用于人。本發(fā)明的一個(gè)例子為丙型肝炎病毒(HCV)。下面的論述一般著重于HCV，甚至更著重于連接到HCV包膜區(qū)的氨基末端部分的HCV核心抗原蛋白。該論述還著重于這一類核心抗原-相鄰蛋白和HCV非結(jié)構(gòu)蛋白(特別是HCVNS5和NS3-NS4非結(jié)構(gòu)蛋白)的組合，或與另一正鏈RNA病毒的第二種蛋白(特別是HIV包膜蛋白和HTLV-1包膜蛋白)的組合。如上所指明的，本論述一般為由正鏈RNA病毒類核心抗原-相鄰蛋白所得到的預(yù)期結(jié)果。該論述也一般為由正鏈RNA病毒，特別是HCV的基本完整多蛋白所得到的預(yù)期結(jié)果。編碼本發(fā)明未加工多肽和其它多肽的核酸分子如上所指明，本發(fā)明包括編碼含有基本完整正鏈RNA病毒多蛋白的多肽的核酸分子。本發(fā)明還提供了編碼含有類核心抗原-相鄰蛋白，如連接到HCV包膜區(qū)的氨基末端部分的HCV核心抗原蛋白的多肽的核酸分子。本發(fā)明還提供了編碼含有這種正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的多肽的核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子為DNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子為編碼一未加工的核心抗原-包膜蛋白的DNA分子，其分離自存在于HCV感染病人的血漿中核酸序列。如下進(jìn)一步所述，核酸的分離步驟包括從病人的血漿中分離病毒顆粒，提取并純化病毒核酸序列，然后經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆目的DNA分子。用于克隆的引物如下(i)5′-GGATCCATGAGCACAAATCCTAAACCT-3′(SEQIDNo1)和(ii)5′-GAATTCGGTGTGCATGATCATGTCCGC-3′(SEQIDNo2)為了鑒定它，將克隆的DNA分子測序。將得到的分子命名為EN-80-2。分子EN-80-2的DNA序列給出在圖1A(SEQIDNo.7)中并具有699bp。分子EN-80-2的氨基酸序列給出在圖1B(SEQIDNo.8)中并具有233個(gè)殘基。在大腸桿菌BL12(DE3)中的分子EN-80-2于1993年7月14日保存在AmericanTypeCultureCollection(ATCC)RockvilleMaryland20852，并已登記為ATCC入藏號55451。培養(yǎng)物是在布達(dá)佩斯條約條件下保藏的。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子為編碼HCVNS5非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA分子，其分離自存在于HCV感染病人的血漿中的核酸序列。如上未加工核心抗原-包膜蛋白的分離中所述(雖然用了不同的病人)，分離步驟包括從病人的血漿中分離病毒顆粒，提取并純化病毒核酸序列，然后經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆目的DNA分子。用于PCR的引物如下(i)5′-GGATCCCGGTGGAGGATGAGAGGGAAATATCCG-3′(SEQIDNo3)和(ii)5′-GAATTCCCGGACGTCCTTCGCCCCGTAGCCAAATTT-3′(SEQIDNo4)為了鑒定它，將克隆的DNA分子測序。將得到的分子命名為EN-80-1。分子EN-80-1的DNA序列給出在圖3A(SEQIDNo.9)中并具有803bp。分子EN-80-1的氨基酸序列給出在圖3B(SEQIDNo.10)中并具有267個(gè)殘基。在大腸桿菌BL12(DE3)中的分子EN-80-1于1993年7月14日保存在AmericanTypeCultureCollection(ATCC)RockvilleMaryland20852，并已登記為ATCC入藏號55450。培養(yǎng)物是在布達(dá)佩斯條約條件下保藏的。圖2顯示了一表達(dá)質(zhì)粒PNE-2，該質(zhì)粒含有用上述引物SEQIDNo1和2分離的編碼未加工核心抗原-包膜蛋白的DNA分子。圖4顯示了一表達(dá)質(zhì)粒PNE-1，該質(zhì)粒含有用上述引物SEQIDNo1和2分離的編碼NS5非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA分子。這一通用的方法已用于從HCV的NS3-NS4非結(jié)構(gòu)區(qū)分離代表性的核酸分子。又見Simmonds，Lancet3361469-1472，1990。用于克隆的引物如下(i(“ED3”))5′-CACCCAGACAGTCGATTTCAG-3′(SEQIDNo5)和(ii(“ED4”))5′-GTATTTGGTGACTGGGTGCGTC-3′(SEQIDNo6)得到的分子命名為EN-80-4。經(jīng)SDS-PAGE電泳測定，由分離到的分子編碼的多肽的分子量約為20,000道爾頓。用作第二種蛋白的多肽的其它例子包括HIV包膜蛋白(分子量約18,000道爾頓)和HTLV-1包膜蛋白(分子量約18,000道爾頓)。本發(fā)明還提供了經(jīng)培養(yǎng)含有能表達(dá)上述基因的構(gòu)建物的宿主細(xì)胞而進(jìn)行的上述核酸分子的操作和表達(dá)。各種適用于本發(fā)明的核酸分子的載體結(jié)構(gòu)可作為便利的材料使用。在本發(fā)明中，載體結(jié)構(gòu)應(yīng)一般理解為是指DNA分子或這種分子的克隆(單鏈或雙鏈)，它已經(jīng)過人工修飾而含有DNA組合和并置而成的片段(整體上看其不是天然存在的)。本發(fā)明的載體結(jié)構(gòu)含有適當(dāng)?shù)剡B接到對于第一個(gè)DNA片段表達(dá)所需的其他DNA片段上的編碼一種或多種未加工類核心抗原-相鄰蛋白的第一個(gè)DNA片段。在本發(fā)明中，其他的DNA片段包括啟動子，一般包括轉(zhuǎn)錄終止子，還可包括增強(qiáng)子和其它元件。見W094/25597和W0/25598。表達(dá)本發(fā)明蛋白的核苷酸序列的誘變優(yōu)選保留編碼序列的讀碼框架。而且，突變優(yōu)選不產(chǎn)生能雜交而形成mRNA二級結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)，如莖環(huán)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，它們可對mRNA的翻譯產(chǎn)生不利影響。雖然突變位點(diǎn)可以是預(yù)定的，但是突變本身的性質(zhì)是不必預(yù)定的。例如，為了篩選在一給定位置上的最適突變，可在靶密碼子上進(jìn)行隨機(jī)誘變并經(jīng)表現(xiàn)的生物學(xué)活性篩選表達(dá)的突變體。可通過合成含有突變序列的寡聚核苷酸將突變引入到特定位置，該寡聚核苷酸的旁側(cè)帶有能使其連接到天然序列片段上的限制性酶切位點(diǎn)。連接之后，形成的重新構(gòu)建的序列編碼一帶有需要的氨基酸插入、取代或缺失的衍生物。或者，寡聚核苷酸引導(dǎo)的定點(diǎn)誘變可用于產(chǎn)生帶有根據(jù)取代、缺失和插入需要而改變的特定密碼子改變的基因。上述進(jìn)行改造的方法的例子由Walder等(基因42133，1986)；Bauer等(基因3773，1985)Craik(生物技術(shù)，1985年一月，12-19)；Smith等(遺傳工程原理和方法，Plenum出版，1981)；和Sambrook等(supra)。上述蛋白的一級氨基酸結(jié)構(gòu)可通過與其它化學(xué)基團(tuán)形成共價(jià)或凝集偶聯(lián)物加以修飾，如糖基團(tuán)、脂、磷酸、乙?；蚺c其它的蛋白或多肽，只要這些修飾不影響蛋白的抗原性。(見美國專利No.4,851,341；又見Hopp等，生物技術(shù)61204，1988)。例如，這些修飾不應(yīng)影響對未加工的類核心抗原-相鄰蛋白特異的表位構(gòu)型(包括接近表位和其它抗原上的考慮)。載體結(jié)構(gòu)的優(yōu)選類型已知為表達(dá)載體。如上指明的，質(zhì)粒pEN-1和pEN-2即為分別含編碼HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)和未加工HCV核心抗原-包膜蛋白的核酸分子的這種表達(dá)載體的例子。為了表達(dá)，如上所述將核酸分子(一般為DNA)插入到適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)構(gòu)中，其又可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞來表達(dá)。用于表達(dá)本發(fā)明的基因序列的宿主細(xì)胞優(yōu)選為原核宿主細(xì)胞，更優(yōu)選一細(xì)菌，如大腸桿菌。其它適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括沙門氏桿菌、芽孢桿菌、志賀氏菌、假單孢菌、鏈霉菌和其它本領(lǐng)域已知的屬。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為含DE3溶原體或T7RNA聚合酶的大腸桿菌，如BL21(DE3)、JM109(DE3)或BL21(DE3)pLysS。用于在細(xì)菌宿主中表達(dá)克隆的DNA序列的載體一般含有選擇標(biāo)記，如抗生素抗性基因，和在宿主細(xì)胞中有功能的啟動子。適當(dāng)?shù)膯幼影╰rp(Nichols和Yanofsky，酶學(xué)方法101155-164，1983)、lac(Casadaban等，細(xì)菌學(xué)雜志143971-980，1980)和λ噬菌體(Queen，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志，21-10，1983)啟動子系統(tǒng)。表達(dá)單位還可包括轉(zhuǎn)錄終止子。用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌的質(zhì)粒包括pUC質(zhì)粒(Messing，酶學(xué)方法10120-78，1983；Vieira和Messing，基因19259-268，1982)、pBR322(Bolibvar等，基因295-113，1977)、pCQV2(Queen，ibid)及其衍生質(zhì)粒。質(zhì)?？珊胁《竞图?xì)菌的元件。在另一實(shí)施方案中，如果改造宿主細(xì)胞使其不能加工未加工的類核心抗原-相鄰蛋白或未加工的非結(jié)構(gòu)區(qū)(例如NS3-NS4非結(jié)構(gòu)蛋白)，或者改造未加工多肽中的加工信號和/或加工位點(diǎn)使其不再對加工敏感(這種改造不能影響未加工蛋白的抗原性)，宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞。適用于本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞包括哺乳動物、鳥類、植物、昆蟲和真菌細(xì)胞。優(yōu)選的真核細(xì)胞包括培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞系(如，嚙齒類和人的細(xì)胞系)、昆蟲細(xì)胞系(如，Sf-9)和包括各種酵母(如，糖酵母菌株，特別是啤酒糖酵母，裂殖糖酵母菌株，或克魯維氏酵母菌株)或絲狀真菌(如，曲霉菌株，鏈孢霉菌株)的真菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化這些宿主細(xì)胞的技術(shù)和表達(dá)克隆于其中的外源DNA序列的方法為本領(lǐng)域所熟知(見，如，Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1982；Sambrook等，supra，“基因表達(dá)技術(shù)”，酶學(xué)方法，185卷，Goeddd(編輯)學(xué)術(shù)出版，SanDiego，Calif.，1990；“酵母遺傳和分子生物學(xué)指導(dǎo)”，酶學(xué)方法，Guthrie和Fink(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，SanDiego，Calif.，1991；Hizeman等，生物化學(xué)雜志25512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志1419-434，1982；Young等，于化學(xué)微生物遺傳工程，Hollaender等(編輯)，p355，Plenum，紐約，1982；Ammerer，酶學(xué)方法101192-201，1983；McKnight等，美國專利No.4,935,349)。一般來說，宿主細(xì)胞的選擇是根據(jù)其產(chǎn)生高水平目的蛋白的能力。這樣，引入到宿主細(xì)胞中的克隆DNA序列的數(shù)目最少，而能達(dá)到最大的生物活性蛋白總產(chǎn)量。根據(jù)本文的教導(dǎo)，啟動子、終止子和將編碼本發(fā)明蛋白的表達(dá)載體導(dǎo)入到需要的宿主細(xì)胞中的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解。然后培養(yǎng)含有本發(fā)明的載體結(jié)構(gòu)的宿主細(xì)胞，來表達(dá)上述的DNA分子。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法，在含有選擇的宿主細(xì)胞生長所需營養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。各種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基為本領(lǐng)域所熟知，一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)及其它特定宿主細(xì)胞所需的成分，如生長因子或血清。生長培養(yǎng)基一般可選擇含DNA結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，例如通過藥物篩選或缺少必需的營養(yǎng)，后者可由DNA結(jié)構(gòu)上的選擇標(biāo)記或其轉(zhuǎn)染DNA結(jié)構(gòu)來互補(bǔ)。含有本發(fā)明未加工多肽的多肽如上所指明的，本發(fā)明提供了含有來自正鏈RNA病毒的未加工的、基本完整的多蛋白的多肽。本發(fā)明還提供了含有結(jié)合到相鄰蛋白的氨基末端部分(例如HCV包膜區(qū))的類核心抗原蛋白(例如HCV核心蛋白)。本發(fā)明還提供了某些非結(jié)構(gòu)蛋白。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，類核心抗原蛋白的氨基酸序列為圖1B(SEQIDNo.8)所示。在這一優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量約為25,000道爾頓，并已推定含有約223個(gè)氨基酸。正鏈RNA病毒的未加工多肽能結(jié)合對正鏈RNA病毒特異的抗體。這一點(diǎn)在HCV上已通過蛋白印跡和酶聯(lián)免疫吸收(ELISA)加以證實(shí)。已發(fā)現(xiàn)未加工核心抗原-包膜蛋白與HCV病人血清特異地反應(yīng)，但不與無HCV的人血清反應(yīng)。正鏈RNA病毒的未加工多肽能檢測樣本中正鏈RNA病毒特異抗體的存在，并因此能用于患者(特別是人)中正鏈RNA病毒的檢測和診斷。本發(fā)明還提供了合有正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的多肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，類核心抗原蛋白的氨基酸序列為圖3B(SEQIDNo.10)所示。圖3B的多肽經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳測定分子量約為29,000道爾頓，并已推是含有約267個(gè)氨基酸。正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白能結(jié)合對正鏈RNA病毒特異的抗體。這一點(diǎn)在HCV上已通過文中所示的NS5和NS3-NS4非結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白印跡和酶聯(lián)免疫吸收(ELISA)加以證實(shí)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的非結(jié)構(gòu)蛋白與HCV病人血清特異地反應(yīng)，但不與無HCV的人血清反應(yīng)。非結(jié)構(gòu)蛋白還能檢測樣本中的和布達(dá)佩斯條約條件下的正鏈RNA病毒特異的抗體的存在，并因此能用于患者(特別是人)中正鏈RNA病毒的檢測和診斷。當(dāng)本發(fā)明的蛋白是由天然基因、天然基因的衍生物的部分來編碼，或已做其它的修飾時(shí)，蛋白基本保持與天然蛋白的相同的生物活性。例如，相當(dāng)于正鏈RNA病毒的未加工的、基本完整的多蛋白、類核心抗原-相鄰蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)，可例如應(yīng)用P/CGene或IntelligeneticsSuite(Intelligenetics，MountainView，Calif.)的疏水性繪圖功能，或者根據(jù)Kyte和Doolittle所述的方法(分子生物學(xué)雜志157105-132，1982)，從其最初的翻譯產(chǎn)物來預(yù)測。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的蛋白。蛋白可通過培養(yǎng)適當(dāng)?shù)乃拗骱洼d體系統(tǒng)來產(chǎn)生本發(fā)明的重組翻譯產(chǎn)物等各種方法來分離。蛋白可以不分泌或分泌到上清中，為了分離目的蛋白，該細(xì)胞系的上清或蛋白包涵體或全細(xì)胞可用各種純化方法處理。例如，上清首先可用商業(yè)上可獲得的濾器濃縮，如Amicon或MilliporePellicon超濾單位。濃縮后，將濃縮物用于適當(dāng)?shù)募兓|(zhì)上，如結(jié)合到適當(dāng)支持物上的抗蛋白抗體。或者，可以應(yīng)用陰離子或陽離子交換樹脂以純化蛋白。作為另一種選擇，可以應(yīng)用一步或多步反向高效液相色譜(RT-HPLC)來進(jìn)一步純化蛋白。其它的分離本發(fā)明蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見W094/25597和W0/25598。如果按照SDS-PAGE分析和隨后的考馬斯亮蘭染色沒有檢測到其它(非目的)蛋白，則該蛋白在本發(fā)明中被認(rèn)為是“分離的”。在其它實(shí)施方案中，可以分離目的蛋白使得按照SDS-PAGE分析和隨后的銀染檢測不到其它蛋白，優(yōu)選沒有脂多糖(LPS)。在其它實(shí)施方案中，如果在蛋白中不存在其它具有明顯抗原性能明顯干擾檢測分析和免疫學(xué)事件的蛋白，則該蛋白是分離的。本發(fā)明的未加工多肽的結(jié)合模式本發(fā)明還提供針對未加工的正鏈RNA病毒多蛋白、正鏈RNA病毒的類核心抗原-相鄰蛋白或該正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白或本發(fā)明的其它蛋白的單克隆和多克隆抗體。應(yīng)用本發(fā)明的多肽作為免疫原，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的制備雜交瘤步驟和/或其它方法制備抗體。形成的抗體特別適用于檢測樣品中，優(yōu)選人的樣品中的正鏈RNA病毒。見WO94/25597和WO/25598。多克隆抗體可很容易地由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從各種溫血?jiǎng)游锶珩R、牛、山羊、綿羊、狗、雞、驢、兔子、小鼠或大鼠中制備。簡要地講，目的蛋白或多肽用于免疫動物，一般通過腹膜內(nèi)、肌肉、眼內(nèi)或靜脈注射。使用佐劑，如弗氏完全或不完全佐劑，可提高蛋白或目的肽的免疫原性。多次加強(qiáng)免疫之后，采集小量的血液樣品，檢測多目的蛋白或肽的反應(yīng)性。一旦動物的滴度達(dá)到與蛋白的反應(yīng)性的平臺，可經(jīng)每周采血或動物放血獲得大量的多克隆抗血清。單克隆抗體也可應(yīng)用已知的技術(shù)較容易地得到(見美國專利NoRE32,011，4,902,614，4,543,439，和4,411,993；又見單克隆抗體，雜交瘤生物學(xué)分析的新方式，plenum出版，Kennett，McKearn，和Bechtol(編輯)，1980，和抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，supra)。簡要地講，在一實(shí)施方案中受試動物如大鼠或小鼠用目的蛋白或肽注射。如果需要，可應(yīng)用各種技術(shù)以提高蛋白所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和產(chǎn)生較高的抗體反應(yīng)。例如，目的蛋白或肽可與其它蛋白偶聯(lián)，如卵白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，或者通過應(yīng)用弗氏完全或不完全佐劑。初始的免疫應(yīng)答激活可通過腹膜內(nèi)、肌肉、眼內(nèi)或靜脈注射。初始免疫1到2周之后，動物用加強(qiáng)免疫再免疫。然后對動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性采血并應(yīng)用上述的分析測試血清中未加工多肽的結(jié)合。還可進(jìn)行額外的免疫，直到動物達(dá)到其與目的蛋白或肽的反應(yīng)性平臺。然后給動物以最后的目的蛋白和肽的加強(qiáng)免疫，3到4天后處死動物。這次收集脾和淋巴結(jié)并通過將器官過篩子或破壞包圍細(xì)胞的脾或淋巴結(jié)的膜而變成單細(xì)胞懸液。在一實(shí)施方案中，加入低滲溶液將紅細(xì)胞完全裂解，然后立即變回等滲狀態(tài)。在另一實(shí)施方案中，通過體外免疫技術(shù)獲得適于產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。簡要地講，處死動物，如上所述取出脾和淋巴結(jié)細(xì)胞。制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞置于含有適于如上所述產(chǎn)生免疫應(yīng)答的形式的目的蛋白和多肽的培養(yǎng)基中。接著，如上所述收獲并融合淋巴細(xì)胞。通過如上所述應(yīng)用體外免疫或來自免疫動物的細(xì)胞可用病毒轉(zhuǎn)染(如Epstein-Bar病毒(EBV))而永生化。(見Glasky和Reading，雜交瘤8(4)377-389，1989)或者，在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，收獲的脾和/或淋巴結(jié)細(xì)胞懸液與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞融合，以產(chǎn)生分泌單克隆抗體的“雜交瘤”。適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞系優(yōu)選為抗體構(gòu)建和表達(dá)缺損的，并與來自免疫動物的細(xì)胞具有額外的協(xié)同作用。許多這種細(xì)胞系為本領(lǐng)域所熟知，并能從如AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，Rockville，Maryland(見，雜交瘤和細(xì)胞系的目錄，第6版，ATCC，1988)的來源獲得。代表性的骨髓瘤細(xì)胞系包括人的，UC729-6(ATCCNo.CRL8061)、MC/CAR-Z2(ATCCNo.CRL8147)、和SK0-007(ATCCNo.CRL8033)；小鼠的，SP2/0-Ag14(ATCCNo.CRL1581)、和P3X63Ag8(ATCCNo.TIB9)；和大鼠的，Y3-Ag1.2.3(ATCCNo.CRL1631)，和YB2/0(ATCCNo.CRL1662)。特別優(yōu)選的融合系包括NS-1(ATCCNo.TIB18)和P3X63-Ag8.653(ATCCNo.CRL1580)，它們可用于融合小鼠、大鼠或人的細(xì)胞系?？赏ㄟ^各種方法完成骨髓瘤細(xì)胞系和來自免疫動物的細(xì)胞之間的融合。這些方法包括應(yīng)用聚乙二醇(PEG)(見抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，supra)或電融合(見Zimmerman和Vienken，膜生物學(xué)雜志67165-182，1982)。融合之后，細(xì)胞置于含例如RPMI1640或DMEM(Dulbecco′sModifiedEaglesMedium，JRHBiosciences，Lenexa，Kan.)的適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基還可含有添加的組份，如胎牛血清(FBS，如，來自Hyclone，Logan，Uth，或JRHBiosciences)、從與用于免疫的動物相同種類的幼小動物收獲的胸腺細(xì)胞?；蚬潭ㄅ囵B(yǎng)基的瓊脂。另外，培養(yǎng)基應(yīng)該含有選擇性地允許融合的脾和骨髓瘤細(xì)胞生長的試劑。特別優(yōu)選使用HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)(SigmaChemicalCo.，St.Louis，Mo.)。約7天后，可篩選生成的融合細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞，以確定識別所述HCV的核心包膜區(qū)或HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體的存在。許多克隆稀釋和重新分析后，可分離到產(chǎn)生結(jié)合目的蛋白的抗體的雜交瘤。其它技術(shù)也可用于制備單克隆抗體。(見Huse等，“λ噬菌體的大型免疫球蛋白所有組份的組合文庫的產(chǎn)生”，科學(xué)2461275-1281，1989；又見Sastry等，“大腸桿菌中產(chǎn)生單克隆催化抗體的免疫球蛋白所有組份的克隆重鏈可變區(qū)特異的cDNA文庫的構(gòu)建”，美國科學(xué)院院報(bào)865728-5732，1989；又見Aliting-Mess等，“單克隆抗體表達(dá)文庫雜交瘤的快速替代物”，分子生物學(xué)方法31-9，1990；這些參考文獻(xiàn)描述了購自Stratacyte，LaJolla，California的商業(yè)化的系統(tǒng)，它能通過重組技術(shù)產(chǎn)生抗體。)簡要地講，從B細(xì)胞群中分離mRNA，并用于在λIMMUNOZAP(H)和λIMMUNOZAP(L)中形成重鏈和輕鏈免疫球蛋白cDNA表達(dá)文庫。這些載體可單獨(dú)篩選或共表達(dá)，以形成Fab或抗體(見Huse等，supra；又見Sastry等，supra)。然后將陽性噬菌體轉(zhuǎn)變成可在大腸桿菌中高水平表達(dá)單克隆抗體的非裂解性質(zhì)粒。也可相似地應(yīng)用重組DNA技術(shù)引入編碼特異結(jié)合抗體基因的可變區(qū)來構(gòu)建結(jié)合配偶體。根據(jù)文中所提供的教導(dǎo)，這些結(jié)合配偶體的結(jié)構(gòu)可容易地由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完成。(見Larrick等，“應(yīng)用混合引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從單一的雜交瘤細(xì)胞克隆人單克隆抗體可變區(qū)基因”，生物技術(shù)7934-938，1989；Riechmann等，“用于治療的再建人抗體”，自然，332323-327，1988；Roberts等，“蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生具有增強(qiáng)的親和性和針對抗原的特異性的抗體”，自然，328731-734，1987；Verhoeyen等，“再建人抗體改變抗溶菌酶活性”，科學(xué)，2391534-1536，1988Chaudhary等，“由融合到假單孢外毒素的兩個(gè)抗體可變區(qū)所組成的重組免疫毒素”自然339394-397，1989；又見美國專利No.5,132,405，題為“生物合成的抗體結(jié)合位點(diǎn)”)。簡要地講，在一實(shí)施方案中，編碼目的蛋白或肽的特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA片段可從產(chǎn)生特異性結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤中擴(kuò)增，并被直接插入產(chǎn)生人抗體的細(xì)胞的基因組中。(見Verhoeyen等，supra；又見Reichmann等，supra.)。這一技術(shù)可將特異性結(jié)合的小鼠或大鼠的單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)入到人的抗體中。這種抗體優(yōu)選用于人的治療，因?yàn)樗鼈儧]有如大鼠或小鼠抗體的抗原性。在另一實(shí)施方案中，應(yīng)用針對可變區(qū)的引物可擴(kuò)增來自產(chǎn)生目的單克隆抗體的雜交瘤的編碼可變區(qū)的基因。這些引物可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員合成，或購自商業(yè)可獲得的來源。例如，對小鼠和人可變區(qū)的引物包括各種針對VHa、VHb、VHc、VHd、CH1、VL和CL區(qū)的引物，可由Stratacyte(La，Jolla，Calif.)獲得。這些引物可用于擴(kuò)增重鏈或輕鏈可變區(qū)，然后分別插入到載體中，如λIMMUNOZAP(H)和λIMMUNOZAP(L)(Stratacyte)。接著這些載體可導(dǎo)入到大腸桿菌中表達(dá)。應(yīng)用這些技術(shù)，可產(chǎn)生大量的含有融合的VH和VL結(jié)構(gòu)域的單鏈蛋白(見Bird等，科學(xué)242423-426，1988)。單克隆抗體和結(jié)合配偶體可在各種宿主系統(tǒng)中產(chǎn)生，這些宿主系統(tǒng)包括組織培養(yǎng)、細(xì)菌、真核細(xì)胞、植物和其它本領(lǐng)域已知的宿主系統(tǒng)。一旦得到適當(dāng)?shù)目贵w和結(jié)合配偶體，可經(jīng)許多對于那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)分離和純化它們(見抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1988；美國專利No.4,736,110；和美國專利No.4,486,530)。適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)包括肽和蛋白的親和柱、HPLC或RP-HPLC、A蛋白和G蛋白純化柱或這些技術(shù)的任何組合。在本發(fā)明中用于限定抗體和結(jié)合配偶體的詞條“分離的”是指“基本不合其它血液組份”。本發(fā)明的抗體和結(jié)合配偶體具有許多用途。如下進(jìn)一步論述，本發(fā)明的抗體和結(jié)合配偶體在檢測和診斷正鏈RNA病毒中特別有用。其它應(yīng)用包括，例如流式細(xì)胞儀分揀具有多種本發(fā)明蛋白的細(xì)胞。簡要地講，為了檢測細(xì)胞上的目的蛋白和肽，細(xì)胞和與目的蛋白特異性結(jié)合的標(biāo)記單克隆抗體孵育。隨后檢測結(jié)合抗體的存在。這些步驟還可包括洗滌去除未結(jié)合抗體的附加步驟。本發(fā)明中適用的標(biāo)記為本領(lǐng)域所熟知，包括各種異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅素(PE)、辣根過氧化物酶(HRP)和膠體金。特別優(yōu)選用于流式細(xì)胞儀的是FITC，它可根據(jù)Kelkamp的“異硫氰酸熒光素和抗體的偶聯(lián)，I偶聯(lián)條件的實(shí)驗(yàn)”免疫學(xué)18865-873，1970中的方法，偶聯(lián)到純化的抗體上。(又見Kelkamp，“異硫氰酸熒光素和抗體的偶聯(lián)，II可重現(xiàn)的方法”免疫學(xué)18875-881，1970；Goding，“抗體和異硫氰酸熒光素的偶聯(lián)對標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)”，免疫學(xué)方法13215-226，1970)。檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析如上所指明，本發(fā)明提供了含有來自正鏈RNA病毒的未加工、基本完整多蛋白的多肽。本發(fā)明還提供了含有類核心抗原-相鄰蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的多肽。本發(fā)明還提供了檢測樣品中這種多肽的方法。如本領(lǐng)域所知，分析一般以檢測正鏈RNA病毒表現(xiàn)的抗原或產(chǎn)生的抗正鏈RNA病毒的抗體為基礎(chǔ)，但也可包括核酸為基礎(chǔ)的分析(一般根據(jù)雜交)。該方法的特征為本發(fā)明的多肽能被抗正鏈RNA病毒的抗體結(jié)合，制備的抗正鏈RNA病毒的抗體能結(jié)合樣品中正鏈RNA病毒的抗原。令人驚奇的是，本發(fā)明的未加工多肽提供一明顯改善的更敏感的對正鏈RNA病毒的檢測。例如，以HCV為參照，未加工核心抗體-包膜蛋白所提供的對樣品中HCV的檢測比單獨(dú)的加工的核心蛋白(有時(shí)指p22)或核心蛋白的片段要明顯好得多。還令人驚奇的是，分析中正鏈RNA病毒的未加工類核心抗原-相鄰蛋白和一非結(jié)構(gòu)蛋白的同時(shí)應(yīng)用能產(chǎn)生協(xié)同作用，使得對正鏈RNA病毒的檢測比單獨(dú)應(yīng)用未加工類核心抗原-相鄰蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白要明顯地更敏感。一優(yōu)選的檢測正鏈RNA病毒的分析為夾心分析法，如酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，ELISA包括以下步驟(1)將本發(fā)明的核心抗原包膜蛋白包被在固相上，(2)在適當(dāng)?shù)臈l件下，將懷疑含有HCV抗體的樣品和包被在固相上的多肽孵育，允許抗原-抗體復(fù)合物的形成，(3)加入偶聯(lián)有標(biāo)記的抗-抗體(例如抗-IgG)，被所形成的結(jié)合在固相上的抗體-抗原復(fù)合物捕捉，和(4)測定捕捉的標(biāo)記并據(jù)此確定樣品中是否有HCV抗體。雖然上述舉出了一優(yōu)選的分析，但是為了檢測特異性結(jié)合樣品中的目的蛋白的抗體，或者檢測結(jié)合樣品中一種或多種抗體的目的蛋白，各種分析方法都能應(yīng)用。作為例子的分析方法詳細(xì)描述在抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1988。這種分析的代表性實(shí)例包括對流免疫電泳分析(CIEP)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、斑點(diǎn)印跡分析、抑制或競爭分析、夾心分析、免疫黏附分析(dip-stick)、同時(shí)分析、免疫層析分析、免疫過濾分析、乳膠珠凝集分析、免疫熒光分析、生物傳感器分析和低光檢測分析(low-lightdetectionassays)(見美國專利No4,376,110和4,486,530；WO94/25597；WO/25598；又見抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，supra)。熒光標(biāo)記抗體實(shí)驗(yàn)(FA-test)應(yīng)用了一種熒光標(biāo)記的能結(jié)合一種本發(fā)明的蛋白的抗體。為了檢測，由技術(shù)員利用熒光顯微鏡進(jìn)行目測，產(chǎn)生一定性的結(jié)果。在一實(shí)施方案中，該分析用于檢查組織學(xué)切片的組織標(biāo)本。在乳膠珠凝集實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的一種或多種蛋白的抗體偶聯(lián)在乳膠珠上。然后偶聯(lián)在乳膠珠上的抗體在允許抗體結(jié)合樣品中目的蛋白的條件下與樣品接觸。然后目測結(jié)果，產(chǎn)生一定性的結(jié)果。在一實(shí)施方案中，該方法可用于定位實(shí)驗(yàn)。酶免疫分析(E1A)包括各種不同的能應(yīng)用本發(fā)明所提供的抗體的分析。例如，異源間接E1A使用偶聯(lián)本發(fā)明的抗體的固相和一親和純化的抗-IgG免疫球蛋白制品。固相優(yōu)選為聚苯乙烯微孔板。然后將抗體和免疫球蛋白制品在允許抗體結(jié)合的條件下與樣品接觸，條件為本領(lǐng)域所熟知。這一分析的結(jié)果可以目測，但是優(yōu)選用分光光度計(jì)讀數(shù)，例如ELISA板讀出器，來產(chǎn)生一定量的結(jié)果。另一中固相EIA方法包括塑料包被的鐵珠，它能在檢測步驟中利用磁鐵取出。還有另一方法為低光檢測免疫分析。在這一高敏感方法中，由適當(dāng)標(biāo)記的結(jié)合抗體所產(chǎn)生的光發(fā)射可自動定量。該反應(yīng)優(yōu)選用微孔板進(jìn)行。在另外的實(shí)施方案中，在用放射性示蹤物取代EIA中酶介導(dǎo)的檢測就形成了放射免疫分析(RIA)。在捕捉-抗體夾心酶分析中，目的蛋白結(jié)合于附著在優(yōu)選聚苯乙烯微孔板的固相上的抗體和標(biāo)記抗體之間。結(jié)果優(yōu)選用分光光度計(jì)測量，如ELISA板讀出器。該分析為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。在順序分析方法中，允許試劑與捕捉抗體逐步孵育。首先測試的樣品與捕捉抗體孵育。洗滌步驟之后，與標(biāo)記抗體孵育。在同時(shí)分析中，順序分析中所述的兩個(gè)孵育階段合并在一起。這去掉了一個(gè)孵育階段加一洗滌步驟。量尺/免疫黏附方法基本上是一種免疫分析方法，其中固相用聚苯乙烯的槳或量尺代替聚苯乙烯微孔板。試劑是一樣的，方法可以是同時(shí)的或順序的。在色譜帶檢測方法中，一捕捉抗體和標(biāo)記抗體在色譜帶上干燥，這一色譜帶一般為結(jié)合到醋酸纖維素的硝酸纖維素或高孔隙率的尼龍。捕捉抗體往往噴在帶的一端干燥成一條線。在這一末端有吸附材料與帶接觸。標(biāo)記的抗體位于帶的另一端，防止被吸收到膜里。附著于抗體的標(biāo)記一般為乳膠珠或膠體金。通過在緊靠標(biāo)記抗體之前加樣品來啟動反應(yīng)。免疫過濾和免疫濃縮方法將一大的固相表面與樣品/試劑的物流組合在一起，其濃縮和加快了抗原和抗體的結(jié)合。在一優(yōu)選的方法中，測試的樣品預(yù)先與標(biāo)記的抗體孵育，然后置于固相上，如纖維濾器或硝基纖維素膜或其它類似物。固相可預(yù)先用包被有捕捉抗體的乳膠或玻璃珠覆蓋。分析好的檢測跟標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析一樣。樣品/試劑的流速可由真空或放在底部的吸附材料的燈芯作用來調(diào)整。臨界值生物傳感器分析為敏感的借助于設(shè)備的分析法，能低費(fèi)用地篩查大量的樣品。在一實(shí)施方案中，這種分析包括接受光的電位計(jì)傳感器的應(yīng)用，其中反應(yīng)涉及到檢測目的蛋白與捕捉抗體、橋連抗體和脲酶偶聯(lián)抗體的結(jié)合而導(dǎo)致的pH改變。結(jié)合所導(dǎo)致的pH改變的影響由于轉(zhuǎn)化成電能而測量(微伏)。該分析一般在非常小的體積中進(jìn)行并且非常敏感。而且，據(jù)報(bào)道分析的檢測極限為每分鐘1000分子的脲酶。刺激對HCV免疫應(yīng)答的組合物和方法本發(fā)明還提供了刺激對正連RNA病毒的體液、細(xì)胞或二者的免疫應(yīng)答的組合物和方法，免疫應(yīng)答優(yōu)選由抗正鏈RNA病毒的疫苗所誘導(dǎo)，因此是免疫保護(hù)性免疫應(yīng)答。這些組合物和方法一般包括與一藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合的含有本發(fā)明的未加工多肽的免疫原。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物和方法含有HCV的未加工核心抗原—胞膜蛋白和HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白，更優(yōu)選NS5非結(jié)構(gòu)蛋白或NS3-N84非結(jié)構(gòu)蛋白。該組合物和方法還包括含有本發(fā)明蛋白的滅活制品和減毒制品。因此，本發(fā)明的另一方面還提供了分離的能刺激免疫應(yīng)答的抗原，優(yōu)選能免疫動物的免疫原。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，其包含圖1A、1B、3A或3B所示的或從這些圖所示序列衍生而來的氨基酸序列或分子或其實(shí)際對等物。作為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解的是，可對本發(fā)明的多肽的氨基酸序列做輕微修飾而不影響免疫原的免疫原性。上述蛋白的實(shí)際對等物包括完全保持與原始氨基酸相同的電荷和疏水性的氨基酸保守取代。保守取代包括用異亮氨酸和亮氨酸代替纈氨酸，谷氨酸代替天冬氨酸，及其他性質(zhì)相同的取代(見，Dayhoff等(編輯)，“AtlasofProteinSequenceandStructure”，Natl.Biomed.Res.Fdn.，1978)作為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解的是，上述的免疫原(包括其實(shí)際對等物)可在不同的動物中刺激不同水平的免疫應(yīng)答。可檢測上述免疫原(包括其實(shí)際對等物)作為疫苗的效力。這些測試包括T-細(xì)胞增殖分析、刺激后測定淋巴因子的產(chǎn)生、和免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。簡要地說，T細(xì)胞增殖分析可用作細(xì)胞介導(dǎo)免疫能力的指標(biāo)。另外，經(jīng)免疫原刺激后產(chǎn)生淋巴因子的現(xiàn)象可用于確定由免疫原產(chǎn)生保護(hù)的能力。總之，為了測定對動物的保護(hù)作用，按如下所述進(jìn)行精確的免疫保護(hù)檢測。但是對于人，首先選擇按下列方法篩查感染HCV的病人的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)而非免疫保護(hù)檢測。簡要地講，應(yīng)用Ficoll密度梯度離心從稀釋的全血中分離PBL，并按如下所述用[3H]-胸腺嘧啶進(jìn)行細(xì)胞增殖研究。然后篩選陽性肽并用于靈長類的試驗(yàn)?？蓱?yīng)用許多其他本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來制備本發(fā)明的免疫原或多肽(見Sambrook等，supra，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。含有本發(fā)明的多肽的免疫原可與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合，并按照本領(lǐng)域已知的各種方法(見WO94/25597和WO/25598)給患者施用。根據(jù)本發(fā)明，溫血?jiǎng)游锇ㄈ撕挽`長類動物及其他種類。能用于本發(fā)明的許多適用的載體和稀釋劑包括各種鹽溶液，緩沖鹽溶液和與非特異的血清白蛋白混合的鹽溶液。這種藥物組合物還可含有其他賦形劑成分，包括佐劑、緩沖液、抗氧化劑、糖(如葡萄糖，蔗糖或葡聚糖)和絡(luò)合劑，如EDTA。在本發(fā)明一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，佐劑和免疫原一起使用。這種佐劑的例子包括用于人的明礬和氫氧化鋁。給藥的劑量和頻率在臨床實(shí)驗(yàn)中確定，這依賴于如其想要保護(hù)的正鏈RNA病毒種類、特定的抗原、所需保護(hù)的程度和許多其它因素。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫采用口服給藥。另外，疫苗可經(jīng)靜脈途徑或其它途徑進(jìn)行非腸道給藥。根據(jù)具體應(yīng)用，注射的佐劑載體中免疫原的量從50μg到幾毫克變化，優(yōu)選約100μg到1mg，與生理適用的載體和稀釋劑組合。4-6周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。本發(fā)明還包括給動物施用能表達(dá)HCV未加工類核心抗原-包膜蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白(或二者)的核酸載體，其中核酸分子能激活免疫應(yīng)答，優(yōu)選免疫動物抗核酸分子表達(dá)的蛋白因此抗HCV。在一本方法的實(shí)施方案中，可將裸露DNA導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，如肌細(xì)胞，該DNA可產(chǎn)生隨后將呈現(xiàn)在細(xì)胞表面的蛋白，從而刺激宿主細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答(CTL)。這比激活的應(yīng)答包括特異性抗體的傳統(tǒng)免疫原有優(yōu)勢。特異性抗體一般為株特異性而且不能識別不同株上的相應(yīng)抗原。在其它方面，CTL對保守抗原特異而且能對不同株表達(dá)的相應(yīng)抗原有應(yīng)答(Ulmer等，“經(jīng)注射編碼病毒蛋白的DNA產(chǎn)生抗流感的異源保護(hù)”科學(xué)2591754-1759，1993；Lin等，“直接注射DNA后體內(nèi)心肌中重組基因的表達(dá)”循環(huán)822217-21，1990；Wolff等，“小鼠肌肉中質(zhì)粒DNA的長期存在和外源基因的表達(dá)”人類分子遺傳學(xué)1363-69，1992)。裸露載體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到動物細(xì)胞中，然后結(jié)構(gòu)能表達(dá)它所攜帶的核酸分子(一般為基因)，該基因優(yōu)選含有一個(gè)(或多個(gè))HCV的未加工核心抗原-包膜蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白。因此，表達(dá)目的肽可激活宿主動物的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答優(yōu)選包括能對呈現(xiàn)目的蛋白的不同菌株應(yīng)答的CD8+CTL。實(shí)施發(fā)明的各個(gè)方面的試劑盒本發(fā)明還提供了用于分析樣品中存在的正鏈RNA病毒的抗原和抗體的試劑盒。該試劑盒含有本發(fā)明的多肽或抗體及適當(dāng)?shù)墓滔?。多肽?yōu)選結(jié)合在固相上。試劑盒還能提供一種或多種試劑和/或裝置用于檢測HCV抗原或抗體。包含在試劑盒中的各種操作流程、試劑和裝置，包括檢測抗原或抗體的工具如文中所述。本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的試劑盒。該試劑盒含有與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合的本發(fā)明多肽的組合物，還提供了給藥或輔助給藥的裝置。同時(shí)還提供了其它適于應(yīng)用本發(fā)明特點(diǎn)的試劑盒。提供下面的實(shí)施例作為例證，但并不作為限定。實(shí)施例下面的實(shí)施例被分成三組。首先是涉及適用的類核心抗原-相鄰蛋白即HCV未加工核心抗原-包膜融合蛋白的分離和制備及其在沒有非結(jié)構(gòu)蛋白的情況下的應(yīng)用的實(shí)施例。第二組為涉及一種與類核心抗原-相鄰蛋白-起使用的適當(dāng)?shù)牡诙鞍祝碒CV非結(jié)構(gòu)蛋白的分離和制備及其在沒有HCV核心抗原-包膜融合蛋白的情況下使用的實(shí)施例。第三組為涉及類核心抗原-相鄰蛋白和第二蛋白如HCVNS5蛋白、HCVNS3-NS4蛋白、HIV包膜蛋白和HTLV-1包膜蛋白的組合和應(yīng)用的實(shí)施例。第四是制備類核心抗原-相鄰蛋白的單克隆抗體的實(shí)施例。第五是涉及使用適當(dāng)?shù)念惡诵目乖?相鄰蛋白即HCV未加工核心抗原-包膜融合蛋白誘導(dǎo)動物的免疫應(yīng)答的實(shí)施例。類核心抗原-相鄰蛋白的分離和制備1.HCVcDNA的克隆收集感染丙型肝炎病毒的病人的血漿并4℃超離心，然后得到病毒顆粒。接著使用異硫氰酸胍和酸性苯酚(Chomczynski等，生化年鑒162156-159，1987)從病毒顆粒中提取和純化病毒核酸(RNA)。下列寡聚核苷酸序列(i)5′-GGATCCATGAGCACAAATCCTAAACCT-3′(SEQIDNo1)和(ii)5′-GAATTCGGTGTGCATGATCATGTCCGC-3′(SEQIDNo2)用作克隆cDNA的引物。利用隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板制備單鏈DNA分子。利用Taq聚合酶和引物(i)和(ii)，通過PCR方法擴(kuò)增含有HCV核心-包膜區(qū)序列的雙鏈DNA分子?？寺〉腄NA分子進(jìn)行序列分析鑒定。獲得的分子稱為EN-80-2。分子EN-80-2的DNA序列給出在圖1A(SEQIDNo7)。該DNA分子衍生自HCV核心和包膜區(qū)并具有669bp。2.含HCVcDNA的質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI處理分子EN-80-2，得到含需要的HCVcDNA的DNA片段。得到的片段插入到預(yù)先用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI切過的載體質(zhì)粒中，得到表達(dá)質(zhì)粒，稱為pEN-2。HCVcDNA的表達(dá)在T7啟動子的調(diào)控下。表達(dá)質(zhì)粒pEN-2的結(jié)構(gòu)和限制性酶切圖譜如圖2所示。3.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布在氨芐青霉素平板中并置于37℃孵箱中過夜。通過用SDS-PAGE和蛋白印跡篩選它們的表達(dá)產(chǎn)物，來選擇產(chǎn)生HCVcDNA抗原蛋白的大腸桿菌菌落。4.未加工核心抗原-包膜蛋白的制備轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落孵育在條件培養(yǎng)基中。離心菌落并經(jīng)反復(fù)凍融和溶菌酶消化裂解。未加工核心抗原-包膜蛋白產(chǎn)物由裂解的細(xì)胞所釋放并經(jīng)柱層析純化。多肽的純度超過90％。經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺電泳測定，未加工的核心抗原-包膜蛋白具有約25,000道爾頓的分子量。5.蛋白印跡中HCV核心抗原與HCV抗體的免疫反應(yīng)性純化的未加工核心抗原-包膜蛋白應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE凝膠用去離子水4℃洗滌15分鐘，并用印跡緩沖液(0.15M磷酸鈉緩沖液，pH6.7)4℃洗滌20分鐘。然后在印跡緩沖液中1.3A1-1.5小時(shí)內(nèi)將凝膠上的多肽電印跡到硝酸纖維素膜上。用洗滌緩沖液(PBS-吐溫20，pH7.4)洗膜并用封閉緩沖液(0.1MNaCl，5mMEDTA，50mMTris，pH7.2-7.4，0.2％牛血清白蛋白，0.05％NP40，1M尿素)封閉過夜。該膜與感染/未感染丙型肝炎病毒的人血清40℃反應(yīng)2小時(shí)，血清預(yù)先用40％胎牛血清/Tris-HCl(pH7.4)10×稀釋。反應(yīng)后，用洗滌緩沖液洗膜三次。膜與抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物(如下文所述制備)40℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后，用洗滌緩沖液洗膜三次，然后與底物溶液(0.01％4-氯-1-萘酚，18％甲醇，0.04MTris，pH7.2-7.4，0.1MNaCl和0.01％H2O2)反應(yīng)20分鐘。本發(fā)明的未加工核心抗原-包膜蛋白與HCV病人的血清反應(yīng)，但不與正常人的血清反應(yīng)。6.HCV抗體的ELISA(A)微孔板的處理微孔板用適當(dāng)濃度的本發(fā)明純化的未加工核心抗原-包膜蛋白包被，并用含牛血清白蛋白的緩沖液封閉。處理過的微孔板存放在2-8℃。(B)抗-higGHRPO偶聯(lián)物的制備用NaIO4將純的抗-人免疫球蛋白G(抗-hIgG)與辣根過氧化物酶(HRPO)偶聯(lián)，得到抗-IgGHRPO偶聯(lián)物。偶聯(lián)物用層析法純化。(C)試劑成分(a)洗滌溶液含0.9％NaCl和硫柳汞的磷酸緩沖液。(b)抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物溶液如上所制備的抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物溶解在含蛋白穩(wěn)定劑和防腐劑的Tris緩沖液中。(c)樣品稀釋液含蛋白穩(wěn)定劑和防腐劑的Tris緩沖液(d)OPD底物溶液鄰苯二胺(OPD)溶解在含H2O2的檸檬酸-磷酸緩沖液中。(如果溶液變成桔黃色，表明溶液已污染而不能再使用)(e)終止溶液2NH2SO4溶液(f)陽性/陰性對照感染/未感染丙型肝炎病毒的人血清樣品用含蛋白穩(wěn)定劑和防腐劑的磷酸緩沖液適當(dāng)濃度稀釋。(D)步驟(a)100和50微升(μl)的測試樣品用樣品稀釋液稀釋(1∶10)，陽性/陰性對照加入到處理過的微孔板中。保留一些孔作為底物空白。(b)經(jīng)搖晃輕輕混合板并在37-40℃孵育1小時(shí)。(c)用每孔0.3μl洗滌溶液洗板三次。(d)每孔加入100μl抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物溶液。(e)經(jīng)搖晃輕輕混合板并在37-40℃孵育30分鐘。(f)洗板5次。(g)每孔加入100μlOPD底物溶液，黑暗中15-30℃孵育板30分鐘。(h)每孔加入100μl終止溶液并輕輕混合終止反應(yīng)。(i)在分光光度計(jì)上測量每孔的492nm的OD值。(E)確定每孔的OD492nm值減去空白的平均讀數(shù)(背景)。陽性對照(PCx)和陰性對照(NCx)的平均值的差(PCx-NCx)應(yīng)等于或大于0.5。按下列公式計(jì)算截?cái)嘀?CO)CO＝PCx×0.15+Ncx當(dāng)測試樣品的讀數(shù)小于CO值時(shí)，則認(rèn)為該樣品為陰性(即樣品中未能檢測到HCV抗體)。當(dāng)測試樣品的讀數(shù)等于或大于CO值時(shí)，則認(rèn)為該樣品為陽性；但是，最好是樣品多次重復(fù)分析。如果重復(fù)樣品的讀數(shù)中有小于CO值的時(shí)，則認(rèn)為該樣品為陰性。如果重復(fù)樣品都大于或等于截?cái)嘀禃r(shí)，則認(rèn)為該樣品為陽性。當(dāng)測試樣品的讀數(shù)大于NCx但小于CO值20％時(shí)，該樣品應(yīng)作為可疑樣品并必須重復(fù)分析那些樣品。根據(jù)本發(fā)明用ELISA測試了27份樣品。同時(shí)，樣品也用HCV抗體分析Abbott試劑盒(II)檢測，該試劑盒含有結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白(即，核心(氨基酸1-151)，NS-3和NS-4)。Abbott試劑盒(II)和本發(fā)明的分析結(jié)果的比較給出在表1中。應(yīng)注意的是，根據(jù)Abbott試劑盒(II)樣品G229的結(jié)果為陰性，但根據(jù)本發(fā)明的分析為陽性。樣品G229證實(shí)為HCV陽性。表1樣品編號OD492nm結(jié)果Abbott試劑盒(II)參照TSGH56＞2.0陽性陽性TSGH57＞2.0陽性陽性G231.469陽性陽性G30＞2.0陽性陽性G32＞2.0陽性陽性G49＞2.0陽性陽性G56＞2.0陽性陽性G58＞2.0陽性陽性G1141.559陽性陽性G128＞2.0陽性陽性G186＞2.0陽性陽性G208＞2.0陽性陽性G214＞2.0陽性陽性G231＞2.0陽性陽性G250＞2.0陽性陽性Y1＞2.0陽性陽性USB9＞2.0陽性陽性USB19＞2.0陽性陽性USB20＞2.0陽性陽性USB230.952陽性陽性USB270.753陽性陽性G110.147陰性陰性G120.077陰性陰性G130.061陰性陰性G140.116陰性陰性G150.139陰性陰性G2290.517陽性陰性適用的第二蛋白HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的分離和制備7.編碼NS5非結(jié)構(gòu)蛋白的HCVcDNA的克隆收集感染丙型肝炎病毒的病人的血漿并4℃超離心，然后得到病毒顆粒。接著使用異硫氰酸胍和酸性苯酚(Chomczynski等，生化年鑒162156-159，1987)從病毒顆粒中提取和純化病毒核酸(RNA)。下列寡聚核苷酸序列(i)5′-GGATCCCGGTGGAGGATGAGAGGGAAATATCCG-3′(SEQIDNo3)和(ii)5′-GAATTCCCGGACGTCCTTCGCCCCGTAGCCAAATTT-3′(SEQIDNo4)用作克隆cDNA的引物。利用隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板制備單鏈DNA分子。利用Taq聚合酶和引物(i)和(ii)，通過PCR方法擴(kuò)增含有NS-5序列的雙鏈DNA分子?？寺〉腄NA分子進(jìn)行序列分析鑒定。獲得的分子稱為EN-80-1。分子EN-80-1的DNA序列給出在圖3A，該分子所編碼的氨基酸序列給出在圖3B中。DNA分子衍生自HCV基因組非編碼區(qū)5并具有803bp(SEQIDNo9)。分子EN-80-1的氨基酸序列給出在圖3B(SEQIDNo10)中并具有267個(gè)殘基。8.含HCVcDNA的質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI處理分子EN-80-1，得到含需要的HCVcDNA的DNA片段。得到的片段插入到預(yù)先用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI切過的載體質(zhì)粒中，得到表達(dá)質(zhì)粒，稱為pEN-1。HCVcDNA的表達(dá)在T7啟動子的調(diào)控下。表達(dá)質(zhì)粒pEN-1的結(jié)構(gòu)和限制性酶切圖譜如圖4所示。9.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布在氨芐青霉素平板中并置于37℃孵箱中過夜。通過用SDS-PAGE和蛋白印跡篩選它們的表達(dá)產(chǎn)物，來選擇產(chǎn)生HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的大腸桿菌菌落。10.NS5非結(jié)構(gòu)蛋白的制備轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落孵育在條件培養(yǎng)基中。離心菌落并經(jīng)反復(fù)凍融和溶菌酶消化裂解。蛋白產(chǎn)物由裂解的細(xì)胞所釋放并經(jīng)柱層析純化。多肽的純度超過90％。經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺電泳測定，該多肽具有約29,000道爾頓的分子量。11.蛋白印跡中NS5非結(jié)構(gòu)蛋白與HCV抗體的免疫反應(yīng)性純化的多肽應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE凝膠用去離子水4℃洗滌15分鐘，并用印跡緩沖液(0.15M磷酸鈉緩沖液，pH6.7)4℃洗滌20分鐘。然后在印跡緩沖液中1.3A1-1.5小時(shí)內(nèi)，將凝膠上的多肽電印跡到硝酸纖維素膜上。用洗滌緩沖液(PBS-吐溫20，pH7.4)洗膜并用封閉緩沖液(0.1MNaCl，5mMEDTA，50mMTris，pH7.2-7.4，0.2％牛血清白蛋白，0.05％NP40，1M尿素)封閉過夜。該膜與感染/未感染丙型肝炎病毒的人血清40℃反應(yīng)2小時(shí)，血清預(yù)先用40％胎牛血清/Tris-HCl(pH7.4)，10×稀釋。反應(yīng)后，用洗滌緩沖液洗膜三次。膜與抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物(如下文所述制備)40℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后，用洗滌緩沖液洗膜三次，然后與底物溶液(0.01％4-氯-1-萘酚，18％甲醇，0.04MTris，pH7.2-7.4，0.1MNaCl和0.01％H2O2)反應(yīng)20分鐘。本發(fā)明的未加工核心抗原-包膜蛋白與HCV病人的血清反應(yīng)，但不與正常人的血清反應(yīng)。12.HCV抗體的ELISA(A)微孔板的處理微孔板用適當(dāng)濃度的本發(fā)明的NS5非結(jié)構(gòu)蛋白包被，并用含牛血清白蛋白的緩沖液封閉。處理過的微孔板存放在2-8℃。(B)抗-higGHRPO偶聯(lián)物的制備用NaIO4將純的抗-人免疫球蛋白G(抗-hIgG)與辣根過氧化物酶(HRPO)偶聯(lián)，以得到抗-IgGHRPO偶聯(lián)物。偶聯(lián)物用層析法純化。(C)試劑成分(a)洗滌溶液含0.9％NaCl和硫柳汞的磷酸緩沖液。(b)抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物溶液如上所制備的抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物溶解在含蛋白穩(wěn)定劑和防腐劑的Tris緩沖液中。(c)樣品稀釋液含蛋白穩(wěn)定劑和防腐劑的Tris緩沖液(d)OPD底物溶液鄰苯二胺(OPD)溶解在含H2O2的檸檬酸-磷酸緩沖液中。(如果溶液變成桔黃色，表明溶液已污染而不能再使用)(e)終止溶液2NH2SO4溶液(f)陽性/陰性對照感染/未感染丙型肝炎病毒的人血清樣品用含蛋白穩(wěn)定劑和防腐劑的磷酸緩沖液適當(dāng)濃度稀釋。(D)步驟(a)100和50微升(μl)的測試樣品用樣品稀釋液稀釋(1∶10)，陽性/陰性對照加入到處理過的微孔板中。保留一些孔作為底物空白。(b)經(jīng)搖晃輕輕混合板并在37-40℃孵育1小時(shí)。(c)用每孔0.3μl洗滌溶液洗板三次。(d)每孔加入100μl抗-hIgGHRPO偶聯(lián)物溶液。(e)經(jīng)搖晃輕輕混合板并在37-40℃孵育30分鐘。(f)洗板5次。(g)每孔加入100μlOPD底物溶液，黑暗中15-30℃孵育板30分鐘。(h)每孔加入100μl終止溶液并輕輕混合終止反應(yīng)。(i)在分光光度計(jì)上測量每孔的492nm的OD值。(E)確定每孔的OD492nm值減去空白的平均讀數(shù)(背景)。陽性對照(PCx)和陰性對照(NCx)的平均值的差(PCx-NCx)應(yīng)等于或大于0.5。按下列公式計(jì)算截?cái)嘀?CO)CO＝PCx×0.15+Ncx當(dāng)測試樣品的讀數(shù)小于CO值時(shí)，則認(rèn)為該樣品為陰性(即樣品中未能檢測到HCV抗體)。當(dāng)測試樣品的讀數(shù)等于或大于CO值時(shí)，則認(rèn)為該樣品為陽性；但是，最好是樣品多次重復(fù)分析。如果重復(fù)樣品的讀數(shù)中有小于CO值的時(shí)，則認(rèn)為該樣品為陰性。如果重復(fù)樣品都大于或等于截?cái)嘀禃r(shí)，則認(rèn)為該樣品為陽性。當(dāng)測試樣品的讀數(shù)大于NCx但小于CO值20％時(shí)，該樣品應(yīng)作為可疑樣品并必須重復(fù)分析那些樣品。根據(jù)本發(fā)明用ELISA測試了18份樣品。同時(shí)，樣品也用含非結(jié)構(gòu)蛋白C100-3的HCV抗體分析Abbott試劑盒(I)和含有結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白(即，核心(氨基酸1-151)，NS-3和NS-4)的HCV抗體分析Abbott試劑盒(II)檢測。Abbott試劑盒和本發(fā)明的分析結(jié)果的比較給出在表2中。應(yīng)注意的是，根據(jù)Abbott試劑盒(I)，樣品G30和樣品G128的結(jié)果為陰性，但根據(jù)本發(fā)明的分析為陽性。這些樣品證實(shí)為HCV陽性。表2樣品編號OD492nm結(jié)果Abbott試劑盒參考(I)(II)TSGH56＞2.0陽性陽性陽性G230.813陽性陽性陽性G261.607陽性陽性陽性G30＞2.0陽性陰性陽性G32＞2.0陽性陽性陽性G56＞2.0陽性陽性陽性G128＞2.0陽性陰性陽性G186＞2.0陽性陽性陽性G208＞2.0陽性-陽性G214＞2.0陽性-陽性G231＞2.0陽性-陽性Y1＞2.0陽性-陽性USB9＞2.0陽性-陽性USB19＞2.0陽性-陽性USB20＞2.0陽性-陽性G2010.062陰性-陰性G2020.072陰性-陰性G2110.059陰性-陰性利用類核心抗原-相鄰蛋白和第二蛋白的檢測13.使用未加工的核心抗原-包膜蛋白和一NS5非結(jié)構(gòu)蛋白的HCVELISAA.核心抗原-包膜蛋白和NS5非結(jié)構(gòu)蛋白與ABBOTTHCV分析的分析比較I.第一次分析方法與上述的ELISA類似，只是未加工核心抗原-包膜蛋白與NS5非結(jié)構(gòu)蛋白組合(9∶1)(已知為EverNew抗-HCVEIA)。在第一次分析中，按上述方法檢測24份樣品。同時(shí)，樣品也用Abbott(II)試劑盒檢測。結(jié)果給出在表3中。在本分析中，Abbott(II)試劑盒的結(jié)果和應(yīng)用本發(fā)明的抗原的分析結(jié)果相同。表3樣品編號OD492nm結(jié)果Abbott試劑盒(II)參照TSGH56＞2.0陽性陽性TSGH57＞2.0陽性陽性G231.469陽性陽性G26＞2.0陽性陽性G30＞2.0陽性陽性G32＞2.0陽性陽性G49＞2.0陽性陽性G56＞2.0陽性陽性G58＞2.0陽性陽性G114＞2.0陽性陽性G128＞2.0陽性陽性G186＞2.0陽性陽性G214＞2.0陽性陽性G231＞2.0陽性陽性G250＞2.0陽性陽性Y1＞2.0陽性陽性USB9＞2.0陽性陽性USB19＞2.0陽性陽性USB20＞2.0陽性陽性USB23＞2.0陽性陽性USB27＞2.0陽性陽性G920.038陰性陰性G930.056陰性陰性G940.071陰性陰性II.第二次分析供血者的EverNew抗-HCVEIA的臨床檢測報(bào)告如表4所示醫(yī)院臺北第三服務(wù)總醫(yī)院樣品來源從血庫收集樣品分類志愿獻(xiàn)血員參照試劑盒Abbott試劑盒(II)結(jié)果表4ABBOTT+-合計(jì)+5(2.5％)1(0.5％)6(3％)EverNew-1(0.5％)193(96.5％)194(97％)合計(jì)6(3％)194(97％)200(100％)表4的結(jié)果顯示兩種分析方法產(chǎn)生了同樣的檢測結(jié)果。III.第三次分析高危病人的EverNew抗-HCVEIA的臨床檢測報(bào)告如表5所示醫(yī)院臺北退伍軍人總醫(yī)院樣品來源從臨床病毒科收集分類NANB，散發(fā)20NANB，PHT12HCC15肝硬化9慢性B型肝炎與攜帶者10膽道結(jié)石4酒精性肝病3脂肪肝2急性肝炎，病因？2肝血吸蟲病1肝囊腫1膽管病-CA1非肝膽疾病6無資料2合計(jì)88參照試劑盒ABBOTTHCVE1A第二代結(jié)果表5ABBOTT+-合計(jì)+54(61.36％)0(0％)54(61.36％)EverNew-1(1.14％)@33(37.5％)34(38.64％)合計(jì)55(62.5％)33(37.5％)88(100％)@HCVRT/PCR方法陰性臨床數(shù)據(jù)和HCVRT/PCR結(jié)果表明EverNew抗-HCV抗體檢測的效果好于美國FDA許可的ABBOTTHCVEIA第二代。B.顯示類核心抗原-相鄰蛋白和不同的第二蛋白的協(xié)同作用的分析和HCV核心抗原-包膜蛋白和HCV顆粒核心蛋白的比較I.第一次分析該分析表明ELISA的結(jié)果與上文的類似，并顯示出HCV的EN-80-2和EN-80-1蛋白的協(xié)同作用關(guān)系。ELISA的方法如下包被緩沖液0.05MTris-HCl/0.15NNaCl/6M尿素pH7.4±0.2洗滌緩沖液含0.05％吐溫20的PBS包被后緩沖液含1％BSA的PBS緩沖液包被步驟將EN-80-1和EN-80-2蛋白加入到包被緩沖液中(終濃度約1.5μg/ml)并于室溫混合30分鐘?；旌虾?，將稀釋的EN-80-1和EN-80-2蛋白加入到微孔板的孔中，100μl/孔，在40℃孵箱中孵育24小時(shí)。然后洗微孔板的孔，將包被后緩沖液加入到微孔板的孔中。接著微孔板的孔保持在4℃過夜。包被后處理后，包被的微孔板的孔可用于抗-HCV抗體的檢測。樣品稀釋液0.1MTris-HClpH7.4±0.2，含40％NBBS，1％BSA和2％鼠血清偶聯(lián)用NaIO4將抗-人IgG單克隆抗體與HRPO偶聯(lián)。偶聯(lián)后，用S-200凝膠過濾純化抗人IgGHRPO偶聯(lián)物并稀釋于樣品稀釋液中。OPD片購自Beckman底物稀釋液含H2O2的檸檬酸-磷酸緩沖液終止液2NH2SO4陽性對照稀釋于樣品稀釋液中的抗HCV陽性血清陰性對照重新鈣化的人血清，其對HBV標(biāo)記，抗-HIV，抗-HTLV1和抗-HCV沒有反應(yīng)。分析步驟100μl樣品稀釋液加入到每個(gè)孔中。50μl樣品、陽性對照和陰性對照加入到適當(dāng)?shù)目字?。樣品孵?0±1℃孵育30±2分鐘樣品洗滌用洗滌緩沖液洗孔三次100μl抗-人IgGHRPO偶聯(lián)物加入到每個(gè)孔中。偶聯(lián)物孵育40±1℃孵育30±2分鐘偶聯(lián)物的洗滌用洗滌緩沖液洗孔6次洗滌之后，加入100μl底物溶液(將一片OPD溶解在底物稀釋液來制備底物溶液)，然后將混合物在室溫保持10分鐘。為了避光，微孔板用黑色蓋子覆蓋。向每個(gè)孔加入100μl終止液，輕輕混合。測量在分光光度計(jì)上492nm測量每個(gè)孔的OD值。闡明截?cái)嘀档拇_定截?cái)嘀担絇Cx×0.25+Ncx吸光度等于或大于截?cái)嘀当砻鞣磻?yīng)為陽性，即有抗-HCV抗體反應(yīng)。吸光度小于截?cái)嘀当砻鞣磻?yīng)為陰性，即無抗-HCV抗體反應(yīng)。表6所列的分析樣品來源如下樣品來源IG83，G191，G205和G235為GPT異常樣品，其為抗-HCV抗體陰性并收集自臺北獻(xiàn)血中心。樣品來源IIG614和G615為抗-HCV抗體陽性，購自美國。樣品來源III8-5為抗-HCV陽性，收集自臺春獻(xiàn)血中心。樣品來源IVN345為病人血清。表6@492nm吸光度#用對HBV、HCV和HIV反應(yīng)陰性的再鈣化人血清稀釋樣品。$用Abbott試劑盒(II)發(fā)現(xiàn)該樣品為陰性。這些數(shù)據(jù)表明當(dāng)組合EN-80-2和EN-80-1蛋白時(shí)，對抗-HCV陽性樣品的492nm吸光度為協(xié)同性，而非加和性。因此，可發(fā)現(xiàn)EN-80-2和EN-80-1蛋白之間的協(xié)同作用關(guān)系。例如，這一協(xié)同作用的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)如樣品N345所示，用Abbott試劑盒(II)發(fā)現(xiàn)該樣品為HCV陰性，但由于協(xié)同作用用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)為陽性。這些數(shù)據(jù)還表明該協(xié)同作用有助于篩查樣品的抗-HCV抗體，特別是在早期診斷情況下。II.第二次分析該分析的進(jìn)行如上文第一次分析所述，并包括提供一本發(fā)明的核心-包膜融合蛋白與鑒定為EN-80-4的NS3-NS4蛋白組合的單一孔。ELISA結(jié)果如表7所示。表7</tables>@492nm吸光度#用對HBV、HCV和HIV反應(yīng)陰性的鈣化人血清稀釋樣品。表7中的數(shù)據(jù)表明當(dāng)組合EN-80-2和EN-80-4蛋白時(shí)，抗-HCV陽性樣品的492nm吸光度顯示出協(xié)同效應(yīng)，而并非只是累加效應(yīng)。因此，可發(fā)現(xiàn)HCV的EN-80-2和EN-80-4蛋白之間的協(xié)同作用關(guān)系。III.第三次分析該分析的進(jìn)行如上文第一次分析所述，并包括提供一本發(fā)明的核心-包膜融合蛋白與HIV包膜蛋白組合的單一孔。ELISA結(jié)果如表8所示。表>@492nm吸光度#用對HBV、HCV和HIV反應(yīng)陰性的鈣化人血清稀釋樣品。表8中的數(shù)據(jù)表明當(dāng)組合HCV的EN-80-2(即核心-包膜融合蛋白)和HIV包膜蛋白時(shí)，抗-HCV陽性樣品的492nm吸光度顯示出協(xié)同效應(yīng)，而并非只是累加效應(yīng)。因此，可發(fā)現(xiàn)HCV的EN-80-2與HIV包膜蛋白之間的協(xié)同作用關(guān)系。IV.第四次分析該分析的進(jìn)行如上文第一次分析所述，并包括提供一本發(fā)明的核心-包膜融合蛋白與HTLV-I包膜蛋白組合的單一孔。ELISA結(jié)果如表9所示。表9</tables>@492nm吸光度#用對HBV、HCV和HIV反應(yīng)陰性的再鈣化人血清稀釋樣品。表9中的數(shù)據(jù)表明當(dāng)組合HCV的EN-80-2(即核心-包膜融合蛋白)和HTLV-1包膜蛋白時(shí)，抗-HCV陽性樣品的492nm吸光度顯示出協(xié)同效應(yīng)，而并非只是累加效應(yīng)。因此，可發(fā)現(xiàn)HCV的EN-80-2和HTLV-1包膜蛋白之間的協(xié)同作用關(guān)系。V.第五次分析該分析的進(jìn)行如上文第一次分析所述，并包括提供一本發(fā)明的核心-包膜融合蛋白與HTLV-Ipol蛋白組合的單一孔。ELISA結(jié)果如表10所示。表10&HTLV-1pol蛋白的分子量約為16,000道爾頓。@492nm吸光度。#用對HBV、HCV和HIV反應(yīng)陰性的再鈣化人血清稀釋樣品。表10中的數(shù)據(jù)表明當(dāng)組合HCV的EN-80-2(即核心-包膜融合蛋白)和HTLV-1pol蛋白時(shí)，抗-HCV陽性樣品的492nm吸光度顯示出協(xié)同效應(yīng)，而并非只是累加效應(yīng)。因此，可發(fā)現(xiàn)HCV的EN-80-2和HTLV-1pol蛋白之間的協(xié)同作用關(guān)系。VI.第六次分析表11表明分析結(jié)果和第五次分析(V)類似，并顯示出HBV抗原HBsAg和HBcAg與HCV的EN-80-1蛋白沒有協(xié)同作用關(guān)系。HBsAg從HBsAg陽性人血清中純化。HBcAg衍生自HBVcDNA片段。樣品來源IG30和G49為GPT異常樣品，其為抗-HCV抗體陽性并收集自臺北獻(xiàn)血中心。樣品來源IIG612、G613、G614和G615為抗-HCV抗體陽性，購自美國。表11@用對HBV、HCV和HIV反應(yīng)陰性的再鈣化人血清系列稀釋樣品。#492nm吸光度。表11中的數(shù)據(jù)表明當(dāng)HBsAg和HBcAg與EN-80-1(NS5)蛋白一起包被時(shí)，抗-HCV陽性樣品的492nm吸光度沒有協(xié)同效應(yīng)。沒有發(fā)現(xiàn)HBsAg與EN-80-1蛋白，或HBcAg和EN-80-1蛋白之間明顯的作用關(guān)系。VII.第七次分析表12顯示了EverNew抗-HCVEIA和Abbott試劑盒(II)檢測抗-HCV抗體的比較。從下列來源得到測試樣品樣品來源IG23、G26、G30、G49、G58、G114、G128、G186、G231、G250和G262為GPT異常樣品，其為抗-HCV抗體陽性性并收集自臺北獻(xiàn)血中心。樣品來源IIG612、G613、G614和G615為抗-HCV抗體陽性，購自美國。樣品來源IIIVGH7、VGH11、VGH12、VGH13、VGH16、VGH26、VGH27、VGH29、VGH30、VGH32、VGH33、VGH40、VGH43、VGH46和VGH52為抗-HCV抗體陽性性并收集自臺北退伍軍人總醫(yī)院。來自來源III的樣品的分類VGH7IHD結(jié)石VGH11NANB，散發(fā)VGH12NANB，散發(fā)VGH13NANB，PTHVGH16HCCVGH26肝硬變VGH27NANB，散發(fā)VGH29IDH結(jié)石VGH30肝血吸蟲病VGH32NANB，散發(fā)VGH33肝硬變VGH40無資料VGH43NANB，散發(fā)VGH46HCC致肝硬變VGH52NANB，散發(fā)對照再鈣化的人血清(與HBV、HCV和HIV無反應(yīng))、這一人血清可用于稀釋上述抗-HCV陽性樣品。測試的試劑盒EverNew抗-HCVE1A…用EN-80-1抗原包被的微孔EverNew抗-HCVE1A…用EN-80-2抗原包被的微孔EverNew抗-HCVE1A…用EN-80-1和EN-80-2抗原包被的微孔。參照試劑盒Abbott試劑盒(II)。結(jié)果表12樣品稀釋倍數(shù)EN-80-1EN-80-2EN-80-1+ABB0TTEN-80-2再鈣化人血清n/a陰性陰性陰性陰性(對照)G2320X@陰性$陽性#陽性陽性40X陰性陰性陽性陽性G268X陰性陽性陽性陽性16X陰性陰性陽性陽性G3051X陰性陰性陽性陽性102X陰性陰性陽性陽性G3251X陽性陰性陽性陽性102X陰性陰性陽性陽性G4921X陰性陰性陽性陽性42X陰性陰性陽性陽性G5816X陰性陽性陽性陽性32X陰性陰性陽性陽性G11410X陰性陽性陽性陽性20X陰性陰性陽性陽性G128120X陰性陰性陽性陽性240X陰性陰性陽性陰性G18642X陰性陰性陽性陽性84X陰性陰性陰性陰性G231336X陰性陰性陽性陽性672X陰性陰性陽性陰性G250168X陰性陰性陽性陽性336X陰性陰性陽性陽性G26284X陰性陽性陽性陽性168X陰性陰性陽性陽性G612402X陰性陰性陽性陽性804X陰性陰性陽性陰性G61326X陰性陰性陽性陽性52X陰性陰性陽性陽性G6148X陰性陽性陽性陽性16X陰性陰性陽性陽性G6158X陰性陽性陽性陽性16X陰性陰性陽性陽性VGH742X陰性陽性陽性陽性84X陰性陰性陽性陽性VGH11126X陽性陰性陽性陽性252X陰性陰性陽性陽性VGH12252X陰性陰性陽性陽性504X陰性陰性陽性陽性VGH13252X陰性陽性陽性陽性504X陰性陰性陽性陽性VGH16252X陰性陰性陽性陽性504X陰性陰性陽性陽性VGH2684X陰性陰性陽性陽性168X陰性陰性陽性陽性VGH2742X陰性陰性陽性陰性84X陰性陰性陽性陰性VGH2942X陰性陽性陽性陽性84X陰性陰性陽性陰性VGH3042X陽性陰性陽性陽性84X陰性陰性陽性陰性VGH32504X陰性陰性陽性陰性1008X陰性陰性陽性陰性VGH3384X陰性陽性陽性陰性168X陰性陰性陽性陰性VGH409X陰性陰性陽性陰性18XN.D.&N.D.陰性陰性VGH439X陰性陰性陽性陰性18XN.D.N.D.陽性陰性VGH469X陰性陰性陽性陽性12XN.D.N.D.陽性陽性VGH52126X陰性陰性陽性陽性252X陰性陰性陰性陰性@用對HBV、HCV和HIV反應(yīng)陰性的鈣化人血清系列稀釋樣品。$陰性…與抗-HCV抗體無反應(yīng)。#陽性…與抗-HCV抗體有反應(yīng)。&N.D.…未做。表12中黑體的數(shù)據(jù)顯示了HCV核心抗原-包膜蛋白與非結(jié)構(gòu)(NS5)區(qū)的協(xié)同作用的例子。黑體的數(shù)據(jù)還表明了本發(fā)明所提供的檢測優(yōu)于參照Abbott試劑盒(II)HCV檢測試劑盒的例子。這些數(shù)據(jù)表明用EN-80-1和EN-80-2抗原包被的微孔板的孔的檢測能力比單獨(dú)用用EN-80-1抗原和EN-80-80-2抗原包被的微孔板的孔效率更高。而且，樣品G128240X、G231672X、G612804X、VGH2742X、VGH2784X、VGH2984X、VGH3084X、VGH32504X、VGH321008X、VGH3384X、VGH33168X、VGH409X、VGH439X和VGH4318X中的抗-HCV抗體可用EverNew抗-HCVEIA(用EN-80-1和EN-80-2抗原包被的微孔)檢測，但用Abbott試劑盒(II)檢測不到。VIII.第八次分析本分析顯示了按照上文第一次分析所述的方法進(jìn)行ELISA的結(jié)果，其中部分核心蛋白與HCV的EN-80-1(NS5)蛋白組合。部核心蛋白由1到120位的氨基酸組成，由臺灣生物技術(shù)發(fā)展中心(DCB)惠贈。樣品來源IG235為GPT異常樣品，其為抗-HCV抗體陰性并收集自臺北獻(xiàn)血中心。樣品來源IIG614和G615為抗-HCV抗體陽性，購自美國。表13</tables>@492nm吸光度。表13中的數(shù)據(jù)表明當(dāng)部分核心(1到120位氨基酸)與EN-80-1蛋白一起包被時(shí)，抗-HCV陽性樣品的492nm吸光度沒有協(xié)同效應(yīng)。沒有發(fā)現(xiàn)部分核心與HCV的NS5蛋白之間明顯的作用關(guān)系。IX.第九次分析表14證實(shí)了上文給出的結(jié)果，并顯示了用部分核心(EN-80-5抗原，其為具有通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的分子量約為15,000道爾頓的HCV部分核心抗原)、核心抗原-包膜蛋白(EN-80-2抗原)和/或HCV非結(jié)構(gòu)蛋白(NS5；上文討論的EN-80-1抗原)的酶免疫分析檢測抗-HCV抗體的比較。分析的樣品為抗-HCV陽性樣品N8、N81、N89、N12和N302及抗-HCV陰性樣品N202、N203和N302。陽性樣品用含40％胎牛血清、1％BSA和2％鼠血清的0.1MTris-HClpH7.4(+/-0.2)在25X到672X之間稀釋。樣品的分析用單克隆抗-人IgGHRP0偶聯(lián)物溶液在微孔板的孔中進(jìn)行，加上下列抗原或抗原的組合a.)NS5；b.)核心抗原-包膜蛋白；c.)部分核心蛋白；d.)NS5和核心抗原-包膜蛋白e.)NS5和部分核心蛋白；f.)核心抗原-包膜蛋白和部分核心；和g.)NS5，核心抗原-包膜蛋白和部分核心。得到下列結(jié)果表14樣品NS5核心-包膜核心NS5+NS5+核心+NS5+ID核心-包膜核心核心-包膜核心+核心-包聯(lián)N850X@0.098*1.0090.952＞2.00.535＞2.0＞2.0100X0.0470.4730.4000.8690.2280.7810.781N81336X0.0181.5721.778＞2.00.696＞2.0＞2.0672X0.0190.6970.63307420.3440.9120.982N89336X0.083＞2.0＞2.0＞2.01.918＞2.0＞2.0672X0.0401.3010.7941.6710.5891.3211.694N1225X0.0191.848＞2.0＞2.00.676＞2.0＞2.050X0.0130.7750.8981.5870.2781.2970.966100X0.0090.3330.3170.5660.0920.3900.435N302168X0.188＞2.0＞2.0＞2.0＞2.0＞2.0＞2.0336X0.0781.1611.9681.6451.660＞2.0＞2.0672X0.0460.4960.8190.8290.6120.8051.025N2020.0430.0810.0690.0770.0480.0810.075N2030.1000.2080.1240.1850.1170.1890.169N2090.0230.0330.0540.0360.0370.0450.042樣品稀釋液#0.0180.0280.0180.0210.0250.0280.027@用樣品稀釋液稀釋的抗-HCV陽性血清*492nm吸光度。#樣品稀釋液0.1MTris-HClpH7.4±0.2，含40％胎牛血清，1％BSA和2％鼠血清。X.第十次分析第十次分析為應(yīng)用HIVgag蛋白與HIVenv蛋白組合的酶免疫分析，用于檢測人血清中抗-HIV-1抗體的存在。分析所使用的抗原如下第一，含有β-半乳糖苷酶的氨基末端片段(377氨基酸)融合到gag-17(氨基酸15-132)后隨gagp24(氨基酸133-363)和gagp15(氨基酸364-437)的重組融合蛋白。該蛋白分子量為92.8kDa，有831個(gè)氨基酸(包括間隔氨基酸)，其命名為EN-I-5抗原。用于分析的蛋白從大腸桿菌中純化，純度超過90％并為非糖基化的。第二，含有β-半乳糖苷酶的氨基末端片段(311氨基酸)融合到env即gp160的氨基酸474-863上的重組融合蛋白。該蛋白分子量為80.7kDa，有705個(gè)氨基酸(包括間隔氨基酸)，其命名為EN-I-6抗原。根據(jù)Ratner等，艾滋病研究和人的逆轉(zhuǎn)錄病毒3(1)57-69，1987的研究，發(fā)現(xiàn)gp160中的包膜剪切位點(diǎn)在氨基酸491和492之間。因此EN-I-6抗原包括gp120的羧基末端和gp41的氨基末端。用于分析的蛋白從大腸桿菌中純化，純度超過90％并為非糖基化的。分析的陽性樣品來自臨床證實(shí)HIV陽性的人，因此是已證實(shí)的抗-HIV-1陽性血清，并編號為T1、T2、T3、T4、T5、T6、P1、P2和P3。對照樣品編號為NC，為抗-HIV-1抗體陰性血清。樣品的分析用單克隆抗-人IgGHRPO偶聯(lián)物溶液在微孔板的孔中進(jìn)行，加上下列抗原或抗原的組合a.)EN-I-5抗原(1μg/ml，0.1ml/孔)；b.)EN-I-6抗原(1μg/ml，0.1ml/孔)；c.)EN-I-5和EN-I-6(各1μg/ml，抗原，0.1ml/孔)。得到下列結(jié)果表15樣品HIVgagHIVenvHIVgag+HIVenvp10.043@0.9421.586p20.0310.6981.142p30.0190.3420.468T124X#0.0070.9571.520T172X0.0000.4400.863T272X0.0000.4070.644T38X0.0000.3500.548T4648X0.0010.3190.488T572X0.0000.2270.353T672X0.0050.5600.799NC0.0190.0280.030NC4X0.0120.0270.025@492nm吸光度#用樣品稀釋液稀釋的樣品表15令人驚奇第顯示出HIV-1gag和env蛋白之間存在協(xié)同作用。XI.第十一次分析第十一次分析為應(yīng)用HIVenv蛋白與其它第二蛋白組合的酶免疫分析，檢測人血清中抗-HIV-1抗體的存在。分析所用的抗原為HIVenv蛋白(上述的EN-I-6抗原)、HCVNS5蛋白(上述EN-80-1抗原)和HCV類核心抗原-相鄰蛋白(上述EN-80-2抗原)。分析的陽性樣品為抗-HIV-1抗體陽性血清T1、T2、T3、T4、T5和T6；陰性對照為抗-HCV和抗-HIV-1抗體陰性血清N639、N626、N634、N632和N637。樣品的分析用單克隆抗-人IgGHRPO偶聯(lián)物溶液在微孔板的孔中進(jìn)行，使用下面表16所示的抗原或抗原的組合。分析的結(jié)果也如表16所示。表16HCVNS5&HCV核心env樣品HCVNS5HIVenvHIVenv&HIVenvHCV核心envT124X@0.048*0.8330.6020.9300.03872X0.0570.5990.4600.6790.048216X0.0550.2780.2130.3140.039N6390.0770.0920.0970.1100.069T224X0.0480.8760.5120.9470.02672X0.0520.5200.3770.6970.031216X0.0690.2280.1910.2840.037樣品0.0690.0520.0290.0400.047稀釋液T34X0.0290.5030.4920.5790.0308X0.0230.3740.3190.4430.03024X0.0230.1700.1380.1870.024N6260.0650.0790.0730.1010.094T472X0.0311.4241.2931.6660.084216X0.0511.0651.0081.2590.109648X0.0350.7240.6410.2330.099N6340.0760.0540.0590.1080.155T524X0.0210.5180.4230.5560.01672X0.0160.2620.2040.2970.006216X0.0140.0940.0740.0940.017N6320.0340.0360.0530.0410.051T624X0.0210.8640.7831.0480.02372X0.0180.5230.4750.6590.015216X0.0160.2720.2020.2840.026N6370.0510.0500.0420.0520.072@用樣品稀釋液(0.1MTris-HClpH7.4±0.2，含40％胎牛血清，1％BSA和2％鼠血清)稀釋的抗-HIV-1陽性樣品*492nm吸光度。這些結(jié)果表明HIVenv蛋白能與第二蛋白協(xié)同作用，這與上述的HCV核心-env蛋白所示的協(xié)同作用類似。類核心抗原-相鄰蛋白的單克隆抗體的制備14.抗HCV抗體的制備抗未加工核心抗原-包膜蛋白和NS5非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體按制備單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。特別是，用上文實(shí)施例2和10中所述的純化蛋白與佐劑混合免疫BALB/c小鼠；然后用聚乙二醇將脾細(xì)胞和鼠淋巴細(xì)胞(F0細(xì)胞系)融合，以形成雜合細(xì)胞。通過篩查由制備的雜交瘤克隆所產(chǎn)生的抗體的滴度，得到產(chǎn)生目的單克隆抗體的目的克隆。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，雜交瘤克隆命名為EN-80-1-99。HCV類核心抗原-相鄰蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的應(yīng)用15.HCV類核心抗原-相鄰蛋白的給藥方法核心抗原-包膜蛋白(EN-80-2)肌肉注射給6-8周齡的ICR小鼠。首次給藥方法、強(qiáng)化和取樣安排如下陰性對照組(IDno.0-1和0-2)0天無免疫。13天第一次采血。28天第二次采血。測試組1(IDno.1-1，1-2，1-3，1-4，1-5和1-6)0天50μg/鼠EN-80-2蛋白，采用完全Freund氏輔劑(CFA)(Gaithersburg，USA，20877)。13天第一次采血。28天第二次采血。39天第三次采血。測試組2(IDno.2-1，2-2，2-3，2-4，2-5和2-6)0天50μg/鼠EN-80-2蛋白，采用完全Freund氏輔劑(CFA)，GIBCO13天第一次加強(qiáng)，80μg/鼠EN-80-2蛋白，采用不完全Freund氏輔劑(IFA)，GIBCO(Gaithersburg，USA，20877)。28天第一次采血。39天第二次采血。測試組3(IDno.3-1，3-2，3-3，3-4，3-5和3-6)0天50μg/鼠EN-80-2蛋白，采用完全Freund氏輔劑(CFA)，GIBCO。13天第一次加強(qiáng)，80μg/鼠EN-80-2蛋白，采用不完全Freund氏輔劑(IFA)，GIBCO。28天第二次加強(qiáng)，80μg/鼠PBS內(nèi)的EN-80-2蛋白。39天第一次采血。16.核心抗原-包膜蛋白處理所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的檢測應(yīng)用兩個(gè)與上述的那些方法相似的酶免疫分析法(EIA)來確定實(shí)驗(yàn)動物中是否存在免疫應(yīng)答。在第一個(gè)EIA中，將大鼠抗-鼠HRPO偶聯(lián)物加入到已用核心抗原-包膜蛋白(EN-80-2)和鼠抗-鼠HRPO偶聯(lián)物一起包被的微孔板的孔中。第一個(gè)E1A的結(jié)果如下表17所示。表17樣品IDDay13Day28Day39陰性對照0-150X@0.141#0.160N.D.S500X0.0580.060N.D.2500X0.0080.025N.D.12500X0.0000.010N.D.62500X0.0000.012N.D.0-250X0.1880.160N.D.500X0.0480.050N.D.2500X0.0000.018N.D.12500X0.0000.013N.D.62500X0.0000.009N.D.組11-150X0.720N.D.N.D.500X0.144*N.D.N.D.2500X0.018N.D.N.D.12500X0.000N.D.N.D.62500X0.000N.D.N.D.1-250X0.257*＞2.0/＞2.0＞2.0500X0.0620.976/1.263＞2.02500X0.0040.187/0.278*0.56012500X0.0000.023/0.0620.132*62500X0.0000.000/0.0180.0271-350X0.213*＞2.0N.D.500X0.0420.424*N.D.2500X0.0000.058N.D.12500X0.0000.000N.D.62500X0.0000.000N.D.1-450X0.259*＞2.0/＞2.0＞2.0500X0.0501.882/＞2.0＞2.02500X0.0020.348/0.506*0.88612500X0.0000.048/0.0980.163*62500X0.0000.000/0.0370.0391-550X0.580＞2.0/＞2.01.616500X0.111*1.774/＞2.01.6462500X0.0100.336/0.471*0.313*12500X0.0000.041/0.0970.06762500X0.0000.000/0.0300.0211-650X0.4430.341N.D.500X0.161*0.191*N.D2500X0.0260.071N.D.12500X0.0000.025N.D.62500X0.0000.016N.D.組22-150X＞2.0/＞2.0＞2.0500X0.939/1.1611.4782500X0.161/0.200*0.280*12500X0.032/0.0380.05962500X0.016/0.0170.0222-250X＞2.0/＞2.0＞2.0500X＞2.0/＞2.0＞2.02500X1.092/1.3161.15812500X0.232/0.267*0.250*62500X0.050/0.0630.0612-350X0.544N.D.500X0.121*N.D.2500X0.028N.D.12500X0.010N.D.62500X0.013N.D.2-450X＞2.0/＞2.0＞2.0500X＞2.0/＞2.0＞2.02500X0.909/1.2090.79412500X0.177/0.232*0.156*62500X0.037/0.0580.0512-550X1.860＞2.0500X0.379*0.8362500X0.0710.155*12500X0.0180.03062500X0.0100.0192-650X＞2.0/＞2.0＞2.0500X1.475/1.7801.5772500X0.333/0.383*0.357*12500X0.066/0.0800.07562500X0.019/0.0780.025組33-150X＞2.0500X＞2.02500X＞2.012500X1.64762500X0.362*3-250X＞2.0500X＞2.02500X1.03212500X0.195*62500X0.0533-350X＞2.0500X1.8142500X0.312*12500X0.06062500X0.0263-450X＞2.0500X＞2.02500X0.89512500X0.181*62500X0.0483-550X＞2.0500X＞2.02500X＞2012500X0.70162500X0.146*3-650X＞2.0500X＞2.02500X＞2.012500X0.72662500X0.172*@用1％BSA50×、500×、2500×、12500×和62500×稀釋的鼠血清#492nm吸光度*檢測能力終點(diǎn)$N.D.因無血清可檢測而未做分析在第二個(gè)EIA中，將大鼠抗-鼠HRPO偶聯(lián)物加入到已用下列抗原或抗原組合包被的微孔板的孔中a.)NS5(EN-80-1抗原)；b.)核心抗原-包膜蛋白(EN-80-2抗原)；c.)部分核心蛋白(EN-80-5抗原)；d.)NS5和核心抗原-包膜蛋白；e.)NS5和部分核心蛋白；f.)核心抗原-包膜蛋白和部分核心；和g.)NS5，核心抗原-包膜蛋白，及部分核心。在第二個(gè)分析中所用的樣品如下0-2(50×稀釋，取自第28天)；0-2(500×稀釋，取自第28天)；2-2(2500×稀釋，取自第28天)；3-1(12500×稀釋，取自第39天)；3-4(2500×稀釋，取自第39天)；3-5(2500×稀釋，取自第39天)；3-6(2500×稀釋，取自第39天)；和3-6(12500×稀釋，取自第39天)。第二個(gè)EIA的結(jié)果如下表18所示。表18樣品NS5核心-包膜核心NS5+NS5+核心+NS5+ID核心-包膜核心核心-包膜核心+核心-包膜陰性對照0-250x0.018@0.0240.0250.0260.0200.0270.0290-2500X0.0080.0100.0110.0140.0140.0220.019組II2-20.0040.3980.0070.4890.0090.3130.3882500X組III3-10.0020.5060.0090.7600.0090.5130.47212500X3-40.0030.2200.0070.3440.0060.1920.2272500X3-50.0030.7050.0071.1680.0060.5920.7472500X3-60.0050.6930.0051.0120.0080.5420.7042500X3-60.0050.1440.0080.2240.0090.1260.13412500X@492nm吸光度。權(quán)利要求1.正鏈RNA病毒衍生的組合物，其中含有a)一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型；和b)一種所述正鏈RNA病毒的分離的非結(jié)構(gòu)蛋白。2.權(quán)利要求2的組合物，其中所述正鏈RNA病毒選自披蓋病毒科、冠狀病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科、杯狀病毒科和黃病毒科所構(gòu)成的組。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述正鏈RNA病毒選自人免疫缺損病毒(HIV)和人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)所構(gòu)成的組。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分離的多肽由適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞產(chǎn)生。5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分離的多肽由不能加工所述分離的多肽的真核宿主細(xì)胞產(chǎn)生。6.制備含有多種從正鏈RNA病毒獲得的多肽的組合物的方法，其中包括下列步驟a)將能表達(dá)編碼分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽的核酸分子的第一個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入到第一個(gè)宿主細(xì)胞中，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)在適于所述表達(dá)載體產(chǎn)生所述多肽的條件下孵育所述的第一個(gè)宿主細(xì)胞，c)純化所述多肽以產(chǎn)生純化多肽，并d)將能表達(dá)編碼所述正鏈RNA病毒的分離的非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子的第二個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入到第二個(gè)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，e)在適于所述核酸分子產(chǎn)生所述非結(jié)構(gòu)蛋白的條件下孵育所述的第二個(gè)宿主細(xì)胞，f)純化所述非結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生純化的非結(jié)構(gòu)蛋白，然后g)將所述純化的多肽和所述純化的非結(jié)構(gòu)蛋白組合以形成所述組合物。7.制備含有多種從正鏈RNA病毒獲得的多肽的組合物的方法，其中包括下列步驟a)將能表達(dá)編碼分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽的第一種核酸分子的表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，所述表達(dá)載體也能表達(dá)含有來自所述正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的第二種蛋白，b)在適于所述表達(dá)載體產(chǎn)生所述多肽和所述非結(jié)構(gòu)蛋白的條件下孵育所述宿主細(xì)胞，和c)純化所述多肽和所述非結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生純化的多肽和純化的非結(jié)構(gòu)蛋白。8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述正鏈RNA病毒選自披蓋病毒科、冠狀病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科、杯狀病毒科和黃病毒科所構(gòu)成的組。9.含有結(jié)合在固相基質(zhì)上的來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的組合物。10.含有一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的并結(jié)合在固相基質(zhì)上的多肽的組合物，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型。11.權(quán)利要求10的組合物，其還含有結(jié)合在所述固相基質(zhì)上的所述正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。12.檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，其中包括a)提供一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)將所述分離的多肽在適當(dāng)?shù)臈l件下與所述樣品接觸充分的時(shí)間，保證所述多肽與所述樣品中一種或多種所述正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合多肽，和c)檢測所述抗體結(jié)合多肽，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。13.檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，其中包括a)提供一種分離的含有正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的多肽，b)將所述分離的多肽在適當(dāng)?shù)臈l件下與所述樣品接觸充分的時(shí)間，保證所述多肽與所述樣品中一種或多種所述正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合多肽，和c)檢測所述抗體結(jié)合多肽，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。14.權(quán)利要求12或13的分析方法，其中還包括a)在步驟a)中，提供一種結(jié)合到所述固相基質(zhì)上的所述正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，b)在步驟b)中，將所述非結(jié)構(gòu)蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下與所述樣品接觸充分的時(shí)間，保證所述非結(jié)構(gòu)蛋白與所述樣品中的一種或多種所述正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合的正鏈RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，和c)在步驟c)中，檢測所述抗體結(jié)合多肽，或所述抗體結(jié)合非結(jié)構(gòu)蛋白之一或二者，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。15.權(quán)利要求14的分析方法，其還包括將所述多肽、所述非結(jié)構(gòu)蛋白或所述多蛋白結(jié)合在固相基質(zhì)上的步驟。16.權(quán)利要求12、13或14的分析方法，其中所述樣品為未純化的樣品。17.權(quán)利要求12、13或14的分析方法，其還包括在所述的接觸之前從動物獲得所述樣品的步驟。18.權(quán)利要求17的分析方法，其中所述動物是人。19.權(quán)利要求12、13或14的分析方法，其中所述分析方法選自對流免疫電泳(CIEP)分析、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)、斑點(diǎn)印跡分析、抑制或競爭分析、夾心分析、免疫黏附分析(dip-stick)、同時(shí)分析、免疫層析分析、免疫過濾分析、乳膠珠凝集分析、免疫熒光分析、生物傳感器分析和低光檢測分析所組成的組。20.權(quán)利要求12、13或14的分析方法，其中所述分析方法不是蛋白印跡分析。21.制備抗體的方法，其中包括下列步驟a)給動物施用分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，和b)分離針對所述多肽的所述抗體。22.根據(jù)權(quán)利要求21制備的抗體。23.制備抗體的方法，其中包括下列步驟a)給動物施用分離的含有來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白的多肽，b)分離針對所述多蛋白的所述抗體。24.根據(jù)權(quán)利要求23制備的抗體。25.權(quán)利要求22或24的抗體，其中所述抗體結(jié)合在固相基質(zhì)上。26.檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，其中包括a)將所述樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下與權(quán)利要求22的抗體接觸充分的時(shí)間，保證所述抗體結(jié)合所述未加工正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白，以產(chǎn)生結(jié)合抗體，和b)檢測所述結(jié)合抗體，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。27.權(quán)利要求26的分析方法，其中還包括，a)在步驟a)中，將所述樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下與另一對正鏈RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白特異的抗體接觸充分的時(shí)間，保證所述另一抗體結(jié)合所述正鏈RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，以產(chǎn)生結(jié)合的另一抗體，和b)在步驟b)中，檢測所述結(jié)合抗體或所述結(jié)合的另一抗體之一或二者，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。28.檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，其中包括a)將所述樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下與權(quán)利要求24的抗體接觸充分的時(shí)間，保證所述抗體結(jié)合所述正鏈RNA病毒特異性抗原，以產(chǎn)生結(jié)合抗體，和b)檢測所述結(jié)合抗體，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。29.一種能刺激動物免疫應(yīng)答的組合物，其含有一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。30.權(quán)利要求29的組合物，其中還含有來自所述正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。31.一種能刺激動物免疫應(yīng)答的組合物，其含有來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。32.權(quán)利要求29、30或31的組合物，其中所述動物是人。33.一種抗正鏈RNA病毒的疫苗，其含有一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的一定大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。34.一種抗正鏈RNA病毒的疫苗，其含有來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。35.權(quán)利要求33或34的疫苗，其中還含有來自所述正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。36.檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，其中包括a)一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的氨基末端的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的并結(jié)合在固相基質(zhì)上的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的氨基末端部分的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，和b)用于檢測所述分離的多肽的試劑或裝置之一或二者。37.權(quán)利要求36的試劑盒，其還包括來自所述正鏈RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白和用于檢測所述非結(jié)構(gòu)蛋白的試劑或裝置之一或二者。38.檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，其中包括a)結(jié)合在固相基質(zhì)上的來自正鏈RNA病毒的分離的、基本完整的未加工多蛋白，和b)用于檢測所述分離的多蛋白的試劑或裝置之一或二者。39.檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，其中包括a)權(quán)利要求22的抗體，和b)用于檢測所述抗體的試劑或裝置之一或二者。40.權(quán)利要求39的試劑盒，其還包括對HCV非結(jié)構(gòu)蛋白特異的另一抗體和用于檢測所述另一抗體的試劑或裝置之一或二者。41.檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，其中包括a)權(quán)利要求24的抗體，和b)用于檢測所述抗體的試劑或裝置之一或二者。42.正鏈RNA病毒衍生的組合物，其中含有a)一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工核類心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型；和b)能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。43.制備含有多種多肽的組合物的方法，其中包括下列步驟a)將能表達(dá)編碼一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽的核酸分子的第一個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入到第一個(gè)宿主細(xì)胞中，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工核類心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)在適于所述表達(dá)載體產(chǎn)生所述多肽的條件下孵育所述的第一個(gè)宿主細(xì)胞，c)純化所述多肽以產(chǎn)生純化的多肽，并d)將能表達(dá)編碼能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白的核酸分子的第二個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入到第二個(gè)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，e)在適于所述核酸分子產(chǎn)生所述第二種蛋白的條件下孵育所述的第二個(gè)宿主細(xì)胞，f)純化所述第二種蛋白以產(chǎn)生純化的第二種蛋白，然后g)將所述純化的多肽和所述純化的第二種蛋白組合形成所述組合物。44.制備含有多種但其中至少一種來自正鏈RNA病毒的多肽的組合物的方法，其中包括下列步驟a)將能表達(dá)編碼一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽的第一種核酸分子的表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，所述表達(dá)載體也能表達(dá)能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白，b)在適于所述表達(dá)載體產(chǎn)生所述多肽和所述第二種蛋白的條件下孵育所述宿主細(xì)胞，和c)純化所述多肽和所述第二種蛋白以產(chǎn)生含有純化的多肽和純化的第二種蛋白的組合物。45.權(quán)利要求43或44的方法，其中所述第二種蛋白來自正鏈RNA病毒。46.含有一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的并結(jié)合在固相基質(zhì)上的多肽的組合物，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型。47.權(quán)利要求46的組合物，其中還含有能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的并結(jié)合在所述固相基質(zhì)上的第二種蛋白。48.檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，其中包括a)提供一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)將所述分離的多肽在適當(dāng)?shù)臈l件下與所述樣品接觸充分的時(shí)間，保證所述多肽與所述樣品中一種或多種所述正鏈RNA病毒特異的抗體結(jié)合，以產(chǎn)生抗體結(jié)合多肽，和c)檢測所述抗體結(jié)合多肽，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。49.權(quán)利要求48的分析方法，其還包括a)在步驟a)中，提供一種結(jié)合到所述固相基質(zhì)上的能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白，b)在步驟b)中，將所述第二種蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下與所述樣品接觸充分的時(shí)間，保證所述第二種蛋白與連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白能協(xié)同作用，和c)在步驟c)中，檢測結(jié)合抗體，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。50.權(quán)利要求49的分析方法，其還包括將所述分離的多肽或所述第二種蛋白結(jié)合在固相基質(zhì)上的步驟。51.制備抗體的方法，其中包括下列步驟a)給動物施用一種分離的含有連接到正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，b)分離針對所述多肽的所述抗體。52.權(quán)利要求51的方法，其還包括給所述動物施用能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。53.根據(jù)權(quán)利要求51或52制備的抗體。54.根據(jù)權(quán)利要求51或52制備的抗體，其中所述抗體結(jié)合在固相基質(zhì)上。55.檢測樣品中正鏈RNA病毒的分析方法，其中包括a)將所述樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下與根據(jù)權(quán)利要求51或52制備的抗體接觸充分的時(shí)間，保證所述抗體結(jié)合所述未加工正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白，以產(chǎn)生結(jié)合抗體，和b)檢測所述結(jié)合抗體，據(jù)此確定所述樣品中含有正鏈RNA病毒。56.一種能刺激動物免疫應(yīng)答的組合物，其含有一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。57.權(quán)利要求56的組合物，其還含有能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。58.一種抗正鏈RNA病毒的疫苗，其含有一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，并與藥物學(xué)適用的載體或稀釋劑組合。59.權(quán)利要求58的疫苗，其還含有能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白。60.用作活性治療物質(zhì)的權(quán)利要求1-5、9-11、29-32、42、46、47、56或57中任一項(xiàng)的組合物。61.用作活性治療物質(zhì)的權(quán)利要求33-35、58或59中任一項(xiàng)的疫苗。62.用于抑制、預(yù)防或治療動物HCV感染的藥物生產(chǎn)的權(quán)利要求1-5、9-11、29-32、42、46、47、56或57中任一項(xiàng)的組合物。63.用于抑制、預(yù)防或治療動物HCV感染的藥物生產(chǎn)的權(quán)利要求33-35、58或59中任一的疫苗。64.檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，其中包括a)一種分離的含有連接到所述正鏈RNA病毒的相鄰核酸區(qū)的正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的未加工形式的并結(jié)合在固相基質(zhì)上的多肽，其中所述相鄰核酸區(qū)的大小使得所述多肽具有對所述正鏈RNA病毒的未加工類核心-相鄰核酸區(qū)特異的表位構(gòu)型，和b)用于檢測所述分離的多肽的試劑和裝置之一或二者。65.權(quán)利要求64的試劑盒，其還包括能與所述連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白協(xié)同作用，以提高連接到所述正鏈RNA病毒的所述相鄰核酸區(qū)的所述正鏈RNA病毒類核心抗原蛋白的抗原性的第二種蛋白，和用于檢測所述第二種蛋白的試劑和裝置之一或兩者。66.檢測正鏈RNA病毒的試劑盒，其中包括a)根據(jù)權(quán)利要求51或52制備的抗體，和b)用于檢測所述抗體的試劑和裝置之一或二者。全文摘要最初從正鏈RNA病毒基因組翻譯的未加工多蛋白具有加工蛋白所沒有的表位構(gòu)型。當(dāng)加工編碼核心蛋白的基因組區(qū)和編碼核心蛋白相鄰蛋白(如HCV的包膜蛋白)的基因組區(qū)之間的剪接位點(diǎn)時(shí),特別是結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)喪失一表位構(gòu)型。本發(fā)明涉及診斷和檢測樣品中正鏈RNA病毒的存在或?qū)φ淩NA病毒的抗體的存在的組合物、方法和檢測分析。誘導(dǎo)動物免疫應(yīng)答和免疫接種動物的組合物和方法。未加工核心區(qū)和非結(jié)構(gòu)蛋白的組合(例如來自HCV的NS5或未加工的NS3－NS4融合體)。文檔編號C07K14/18GK1189838SQ96195184公開日1998年8月5日申請日期1996年5月31日優(yōu)先權(quán)日1996年5月31日發(fā)明者廖肇清,王震南申請人:拜奧諾瓦有限公司