專利名稱：P16表達(dá)構(gòu)建物及其在癌治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體涉及腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及編碼腫瘤抑制基因的核酸及其在抑制腫瘤生長中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼p16的表達(dá)構(gòu)建物及其在抑制癌中的應(yīng)用。
癌是人類疾病的主要病因之一，在美國每年有526,000人死于癌癥(Boring等，1993)。僅肺癌的致死人數(shù)在美國每年就有140,000人以上。近年來，在適齡婦女中肺癌的死亡率高于乳腺癌。盡管實(shí)行減少抽煙的措施已減弱了抽煙的盛行，但進(jìn)入21世紀(jì)后肺癌死亡率仍會(huì)很高。遺憾的是，已知目前醫(yī)治癌的方法，包括放射療法、外科術(shù)和化學(xué)療法都療效有限。合理開發(fā)肺癌的新療法大致取決于在分子水平更好地了解癌的生物學(xué)。
隨著分子遺傳學(xué)和生物學(xué)的進(jìn)展，人們認(rèn)識(shí)到正常基因表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致引發(fā)轉(zhuǎn)化作用，于是致使產(chǎn)生癌細(xì)胞。惡性腫瘤的慣常療法例如化學(xué)療法和放射療法，集中于大量殺傷細(xì)胞而不是專一的導(dǎo)向，常產(chǎn)生損傷性副作用。癌療法的一個(gè)新發(fā)展方向是遞送正?；蛞灾脫Q或修正突變基因，于是改變轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡生表型。業(yè)已開發(fā)了數(shù)種表達(dá)構(gòu)建物以高效遞送基因至體細(xì)胞。
細(xì)胞是依正調(diào)節(jié)方式(刺激性的)和負(fù)調(diào)節(jié)方式(抑制性的)而被調(diào)節(jié)的。細(xì)胞生長中負(fù)調(diào)節(jié)的喪失常見于惡性細(xì)胞中。累積的分子遺傳作用揭示，正常細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)物的減少或正調(diào)節(jié)物的增加會(huì)使細(xì)胞生長出現(xiàn)異常。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，被稱為腫瘤抑制因子的多數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)物(Marx，1993；Grunicke和Maly，1993)包括于細(xì)胞周期的直接控制(direct control)中(例如，Rb，p53，WT-1)或?qū)е录?xì)胞生長和分化的信號(hào)途徑中(例如NF-1)。此外，近期資料認(rèn)為，與維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和極性相關(guān)的基因也可起腫瘤抑制因子的作用(Marx，1993；Fearon等，1990；Trofatter等，1993)。
真核細(xì)胞周期的主要轉(zhuǎn)變是由依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶或CDK′s引發(fā)的。一種CDK，即依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶4(CDK4)，調(diào)節(jié)G1期間的進(jìn)展。該酶的活性可使Rb在G1后期磷酸化。CDK4的活性由活性亞單位D型細(xì)胞周期蛋白和抑制性亞單位p16INK4蛋白控制。業(yè)已由生化鑒定p16INK4為蛋白質(zhì)，它專一性地結(jié)合和抑制CDK4，因而能調(diào)節(jié)Rb磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。由于p16INK4蛋白是CDK4抑制劑(Serrano，1993)，所以缺失該基因會(huì)提高CDK4的活性，導(dǎo)致Rb蛋白的過磷酸化。已知p16也調(diào)節(jié)CDK6的功能。
p16INK4屬于新近被描述的CDK抑制蛋白類，這類蛋白質(zhì)還包括p15B、p21WAF1和p27KIP1。p16INK4基因定位至9p21，它是許多種腫瘤中常缺失的染色體區(qū)。p16INK4基因的純合性缺失和突變常見于人腫瘤細(xì)胞系中。該現(xiàn)象啟示p16INK4基因是一種腫瘤抑制因子。然而這種解釋受到如下觀測(cè)結(jié)果的挑戰(zhàn)即，初生未培養(yǎng)腫瘤中p16INK4基因變化的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于培養(yǎng)的細(xì)胞系中p16INK4基因變化的頻率(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)。用質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染而恢復(fù)野生型p16INK4功能減少某些人癌細(xì)胞系集落形成(Okamtot，1994；Arap，1995)。
本發(fā)明通過提供含編碼p16的核酸的表達(dá)構(gòu)建物闡述對(duì)肺癌和與p16相關(guān)的其它癌的改進(jìn)療法的需要。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供應(yīng)用這種組合物的方法，具體地說，其中的應(yīng)用是指在治療癌中的應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括利用表達(dá)構(gòu)建物中的p16核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還包括這種表達(dá)構(gòu)建物，它含有在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸，該核酸受該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該表達(dá)構(gòu)建物進(jìn)一步包括聚腺苷酸化信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)建物進(jìn)一步包括一個(gè)選擇性標(biāo)記。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該表達(dá)構(gòu)建物是腺病毒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該表達(dá)構(gòu)建物是至少缺少部分E1區(qū)的腺病毒。
在一些實(shí)施方案中，該核酸是cDNA。在其它實(shí)施方案中該核酸是基因組DNA。還有其它實(shí)施方案包括cDNA和基因組DNA例如在小基因構(gòu)建物中的組合。在一個(gè)實(shí)施方案實(shí)例中，該核酸以相對(duì)于所述啟動(dòng)子的有義取向定位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸以反義取向定位。
本發(fā)明還包括藥物組合物，它包含表達(dá)構(gòu)建物，該構(gòu)建物中包含有在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸，同時(shí)包含藥物上可接受的緩沖劑、溶劑或稀釋劑。在一些實(shí)施方案中，以試劑盒提供表達(dá)構(gòu)建物和藥物上可接受的緩沖劑、溶劑和稀釋劑。
本發(fā)明還提供這種方法它使缺乏p16功能的或者表達(dá)被不適當(dāng)?shù)貐^(qū)室化的功能性p16的細(xì)胞恢復(fù)合適的p16功能。該方法包括使這種細(xì)胞與上述表達(dá)構(gòu)建物接觸，其中的核酸以有義取向定位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案實(shí)例中，該細(xì)胞是轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且該接觸使轉(zhuǎn)化的表型反向。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是肺、膀胱、白血病或黑素瘤癌細(xì)胞和，在又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建物是腺病毒。
本發(fā)明還包括抑制細(xì)胞中p16功能的方法。該方法包括使這種細(xì)胞與上述表達(dá)構(gòu)建物接觸，其中的核酸以反義取向定位。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建物是腺病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供治療患癌哺乳動(dòng)物的方法。該方法包括向動(dòng)物施用含表達(dá)構(gòu)建物的藥物組合物，該表達(dá)構(gòu)建物具有在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16、以有義取向定位的核酸，該組合物于藥物上可接受的緩沖劑、溶劑或稀釋劑中。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是指人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施藥方式是靜脈注射。在又一個(gè)實(shí)施方案中，癌是指肺癌。
在進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過檢測(cè)p16或者編碼p16的核酸而檢測(cè)樣品中癌細(xì)胞的方法。
對(duì)圖的簡(jiǎn)要描述

圖1A-p16的核苷酸序列。(SEQ ID NO1)圖1B-p16的氨基酸序列。(SEQ ID NO2)圖2-Ad-p16感染的細(xì)胞系的細(xì)胞生長曲線。在感染24小時(shí)前，于60mm培養(yǎng)皿中以5×104的密度接種細(xì)胞，再在50PFU/細(xì)胞下用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ感染細(xì)胞。單獨(dú)用培養(yǎng)基模擬感染。從感染后第1天至第6天每天計(jì)數(shù)各次處理后每個(gè)細(xì)胞系的三聯(lián)體培養(yǎng)物。根據(jù)三次試驗(yàn)的代表性分析結(jié)果標(biāo)繪曲線(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
圖3A-D-腫瘤內(nèi)注射Ad-p16、對(duì)照病毒AD5CMV-lacZ或PBS后小鼠內(nèi)腫瘤生長情況(每組5只小鼠)。將5×106個(gè)H460細(xì)胞于0.1ml PBS中的懸浮液注入裸鼠背側(cè)脅腹而形成皮下腫瘤結(jié)。在細(xì)胞植入16天后處理腫瘤結(jié)(180～220mm3)。進(jìn)行直接腫瘤內(nèi)注射Ad-p16、Ad5CMV-lacZ或PBS。對(duì)于每個(gè)腫瘤結(jié)，將分成3個(gè)相等劑量、1010PFU的Ad-p16或Ad5CMV-lacZ隔天注射達(dá)6天。PBS注射用作對(duì)照。注射后隔天用線型測(cè)徑器在兩個(gè)正交方向測(cè)定腫瘤大小并計(jì)算腫瘤體積(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。(A)H322細(xì)胞；(B)HBL100細(xì)胞；(C)H460細(xì)胞；(D)H226Br細(xì)胞。
現(xiàn)在累積跡象表明，細(xì)胞周期的控制中包括的某些基因調(diào)節(jié)異常歸因于細(xì)胞的惡性發(fā)展。例如，細(xì)胞過早進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期階段會(huì)導(dǎo)致不完全修復(fù)DNA損傷和后續(xù)的基因組不穩(wěn)定性。如前所述，依賴于細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用。已知p16INK4蛋白能與細(xì)胞周期蛋白D1-CDK4復(fù)合而抑制其與Rb的相互作用，于是推遲通過細(xì)胞周期。在高百分率的癌細(xì)胞系中點(diǎn)突變和純合性缺失的存在進(jìn)一步啟示p16INK4可能起腫瘤抑制因子的作用。
業(yè)已報(bào)道了初生人食管癌和胰腺癌、膀胱癌、黑素瘤和NSCLC轉(zhuǎn)移瘤中的突變，不過初生腫瘤中的突變速率小于細(xì)胞系的那些(Mori等，1994；Okamoto等，1994；Okamoto等，1995；Zhou等，1994；Cairns等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Gruis等，1995)。然而，缺失和突變可能不是p16INK4失活的最初方式，因?yàn)榕c轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)的p16INK4的過甲基化(hypermethylation)常見于肺癌、頭和頸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和新腫瘤，并沒有缺失或突變(Herman等，1995)。
本文的資料首次說明p16作為活體內(nèi)腫瘤抑制因子。這樣，本發(fā)明闡述了對(duì)于有關(guān)肺癌和與p16相關(guān)的其它疾病的改進(jìn)療法的需要。具體而言，能表達(dá)功能性p16產(chǎn)物的表達(dá)構(gòu)建物可用于抑制腫瘤細(xì)胞增生。此外，本發(fā)明包括將針對(duì)p16的反義方法用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或提高細(xì)胞生長的速率或程度。下列描述更詳細(xì)地解釋本發(fā)明的這些和其它方面。
還有證據(jù)表明，p-16定向的處理在抗血管形成的研究中有治療意義。對(duì)于很多種疾病希望減少脈管系統(tǒng)。此外，p16處理還有益于過量增生類疾病如再狹窄。
A.p16和與p16相關(guān)的核酸本發(fā)明的核酸能編碼整個(gè)p16基因，功能性p16蛋白區(qū)，或任意p16多肽，足以抑制CDK4的肽或片段。p16核酸可得自基因組DNA，即直接從特定的有機(jī)體基因組克隆而得。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼p16的核酸應(yīng)包括互補(bǔ)DNA(cDNA)或cDNA加一個(gè)內(nèi)含子即小基因。
術(shù)語“cDNA”表示應(yīng)用信使RNA(mRVA)作模板制備的DNA。應(yīng)用cDNA，而不用基因組DNA或者從基因組的、未處理或部分處理的RNA模板聚合的DNA，優(yōu)點(diǎn)在于cDNA不含任何非編碼序列，而只含有相應(yīng)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。有時(shí)完整的或部分的基因組序列是優(yōu)選的，例如當(dāng)需要供最佳表達(dá)的非編碼區(qū)或者當(dāng)例如內(nèi)含子的非編碼區(qū)將在反義方法中導(dǎo)向時(shí)。
本申請(qǐng)中，術(shù)語“p16”與其別名-MTS1、CDK4I和CDKN2同義。術(shù)語“p16”還表示得自除指定的那些之外其它種的所有p16同源物。
還考慮到，給定的p16可由這種天然變體代表即，它們的一級(jí)序列略有不同，而相互間的生物功能相同(見下文)。為了起依本發(fā)明的作用，所要求的是p16與CDK4結(jié)合。為測(cè)試這種結(jié)合作用，只需簡(jiǎn)單地分析由p16核酸編碼的體外結(jié)合蛋白質(zhì)或者應(yīng)用由Serrano等，1993，描述、并入本文作參考的轉(zhuǎn)染方法。
在本申請(qǐng)中用到的術(shù)語“編碼p16的核酸”表示無全部細(xì)胞核酸、分離到的核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及大致如圖1A提出的核酸序列(SEQ ID NO1)。術(shù)語“如圖1A提出的”表示核酸序列基本相當(dāng)于圖1A的部分且具有較少幾個(gè)密碼子，這幾個(gè)密碼子不同于圖1A的密碼子或功能上與其相當(dāng)。本文所用的術(shù)語“功能上相當(dāng)?shù)拿艽a子”表示編碼相同氨基酸的密碼子，例如對(duì)于精氨酸或絲氨酸的6個(gè)密碼子，還表示編碼生物等效氨基酸(如下文的表1所示)的密碼子。
表1氨基酸 密碼子丙氨酸Ala AGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys CUGC UGU天冬氨酸 Asp DGAC GAU谷氨酸Glu EGAA GAG苯丙氨酸 Phe FUUC UUU甘氨酸Gly GGGA GGC GGG GGU組氨酸His HCAC CAU異亮氨酸 Ile IAUA AUC AUU賴氨酸Lys KAAA AAG亮氨酸Leu LUUA UUG CUA CUC CUG CUU蛋氨酸Met MAUG天冬酰胺 Asn NAAC AAU脯氨酸Pro PCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Gln QCAA CAG精氨酸Arg RAGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸Ser SAGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸Thr TACA ACC ACG ACU纈氨酸Val VGUA GUC GUG GUU色氨酸Trp WUGG酪氨酸Tyr YUAC UAU
考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，具有約50％～約75％，或者更優(yōu)選約76％～99％與圖1A核苷酸相同的核苷酸的序列將是“如圖1A中提出的”?；旧吓c圖1A中提出的那些相同的序列也可在功能上定義為能與含有圖1A的補(bǔ)體(complement)的核酸區(qū)段在標(biāo)準(zhǔn)條件下雜交的序列。
合適的雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如在某些應(yīng)用中，通過定點(diǎn)誘變?nèi)〈被?，希望要求?yán)格性更低的條件。在這些條件下，甚至當(dāng)探針序列和靶鏈序列不完全互補(bǔ)，而在一個(gè)或多個(gè)位置上錯(cuò)配時(shí)也能產(chǎn)生雜交。增大鹽濃度或降低溫度可使條件的嚴(yán)格性更低。例如，中等的嚴(yán)格條件可由在約37℃～約55℃的溫度下約0.1～0.25M NaCl提供，而低的嚴(yán)格條件可由在約20℃～約55℃的溫度范圍內(nèi)約0.15M～約0.9M鹽提供。因此，雜交條件易于操縱，而且通常成為一種依賴于所需結(jié)果的選擇方法。
在其它實(shí)施方案中，例如可在下述條件下完成雜交50mMTris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，在約20℃～約37℃的溫度下進(jìn)行。用到的其它雜交條件包括大約10mMTris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5μM的MgCl2，在約40℃～約72℃的溫度范圍內(nèi)。也可用甲酰胺和SDS來改變雜交條件。
當(dāng)然，本發(fā)明也包括與圖1A中提出的序列互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的DNA區(qū)段。“互補(bǔ)的”核酸序列是能依標(biāo)準(zhǔn)的沃森-克里克互補(bǔ)法則進(jìn)行堿基配對(duì)的那些。本文用到的術(shù)語“互補(bǔ)序列”表示實(shí)際上互補(bǔ)的核酸序列，可通過前面提出的相同核苷酸比較來估測(cè)，或定義為能與圖1A的核酸區(qū)段在較嚴(yán)格的條件(如本文所述的那些)下雜交的核酸序列。這類序列可編碼整個(gè)p16分子或其功能性片段。
備擇地，雜交區(qū)段可以是更短的寡核苷酸。長為17個(gè)堿基的序列在人基因組中應(yīng)只出現(xiàn)一次，因而足以規(guī)定單一的靶序列。雖然更短的低聚體更易于制備并提高活體內(nèi)可及性，但測(cè)定雜交的特異性包括許多其它因子。寡核苷酸與其互補(bǔ)靶的結(jié)合親和性和序列特異性都隨著長度的增長而增大。預(yù)期應(yīng)用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸。這種寡核苷酸例如可用作擴(kuò)增反應(yīng)中的探針和引物。
本發(fā)明的DNA區(qū)段包括編碼生物功能相等的p16蛋白質(zhì)和肽的那些。這種序列可由已知在核酸序列和由此編碼的蛋白質(zhì)中自然出現(xiàn)的密碼子豐余性和功能等效性而產(chǎn)生。備擇地，功能上等效的蛋白質(zhì)或肽可通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生，其中可基于被交換氨基酸的性能而改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。人工設(shè)計(jì)的改變可通過應(yīng)用定點(diǎn)誘變技術(shù)引入或者隨機(jī)引入隨后篩選所需的功能。
如果需要的話，也可制備融合蛋白和肽，例如，將p16編碼區(qū)與其它蛋白質(zhì)或肽的編碼區(qū)融合而具有所要求的功能，例如用于純化、免疫檢測(cè)、穩(wěn)定化或?qū)?。此外，這些融合蛋白或融合肽可含有將會(huì)指導(dǎo)其轉(zhuǎn)運(yùn)至選定的細(xì)胞區(qū)室、特別是細(xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向序列。這些融合蛋白或融合肽可從已被遞送至動(dòng)物細(xì)胞的DNA構(gòu)建物而得以表達(dá)。
還應(yīng)明白，氨基酸和核酸序列可包括其它殘基，例如其它的N端或C端氨基酸或者5′或3′序列，而仍基本上如本文公開的序列之一中提出的那樣，只要序列符合前面提出的準(zhǔn)則，包括保持與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的生物蛋白質(zhì)活性。末端序列的加入特別適用于這樣的編碼核酸序列它們例如可包括編碼區(qū)的5′部分或3′部分的各種非編碼序列側(cè)翼，如啟動(dòng)子。此外，親和部分或者檢測(cè)部分，例如異羥洋地黃毒甙元或親和素，可被加入核酸序列。
如前所述，可對(duì)p16的一級(jí)結(jié)構(gòu)作修飾和改變(如圖1B所例舉的)而仍可獲得具有類似特性或所需特性的分子。例如，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可用其它氨基酸取代某些氨基酸而不會(huì)明顯損失例如下列結(jié)構(gòu)的活性結(jié)合能力抗體的抗原結(jié)合區(qū)或者底物分子、受體、或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物(transduction)上的結(jié)合位點(diǎn)。由于是蛋白質(zhì)的活性能力和性質(zhì)限定蛋白質(zhì)的生物功能活性，所以可在蛋白質(zhì)序列(當(dāng)然也可以是其隱含的DNA密碼序列)中取代某些氨基酸序列仍然得到具有類似(拮抗)性能的蛋白質(zhì)。同樣，可采用相同的考慮方法產(chǎn)生具有補(bǔ)償(例如拮抗)性能的蛋白質(zhì)或多肽。因此，發(fā)明人預(yù)計(jì)可對(duì)p16蛋白或肽(或隱含的DNA)的序列作各種改變而不會(huì)明顯損失其生物效用或活性。
熟練的技術(shù)人員也很清楚生物功能相等的蛋白質(zhì)或肽的本身意義是指，可在分子的限定部分內(nèi)作出改變的量是有限的，且所得分子仍具有可接受的相等生物活性。因此生物功能相等的肽在本文定義為這些肽其中某些而不是大部分或全部氨基酸可被取代。具體地說，如果涉及p16蛋白的N端，希望在給定的肽中只有約16個(gè)或者更優(yōu)選約5個(gè)氨基酸可被改變。當(dāng)然，易于制備具有不同取代的許多各不相同的蛋白質(zhì)/肽，并將其用于本發(fā)明。
氨基酸取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等等。對(duì)于氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類別的分析表明精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸都大小相似；而且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有大致相似的形狀。因此，基于這些考慮事項(xiàng)，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；在本文被定義為生物功能相等物。
進(jìn)行改變時(shí)，可考慮氨基酸的水療指數(shù)(hydropathicindex)?；谒鼈兊氖杷院碗姾商卣鞫_定了每種氨基酸的水療指數(shù)，它們是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域一般懂得氨基酸水療指數(shù)在賦與蛋白質(zhì)活性生物功能中的重要性(Kyte & Doolittle，1982，并入本文作參考)。已知某些氨基酸可取代具有相似水療指數(shù)或分?jǐn)?shù)的其它氨基酸而仍然保持類似的生物活性。在基于水療指數(shù)進(jìn)行改變時(shí)，水療指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，在±1以內(nèi)的那些是特別優(yōu)選的，而在±0.5以內(nèi)的那些是最優(yōu)選的。
應(yīng)懂得，一個(gè)氨基酸可取代另一個(gè)具有相似親水性值(hydrophilicity value)的氨基酸而仍得到生物上相等的蛋白質(zhì)。如美國專利4,554,101中詳述，對(duì)于如下氨基酸殘基確定了親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基于類似的親水性值進(jìn)行改變時(shí)，親水性值在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，在±1以內(nèi)的那些是特別優(yōu)選的，而在±0.5以內(nèi)的那些是最優(yōu)選的。
雖然前述討論已集中于由氨基酸改變而產(chǎn)生的功能相等的多肽，但應(yīng)懂得這些改變可通過編碼DNA的改變而實(shí)現(xiàn)，還應(yīng)考慮到遺傳密碼是簡(jiǎn)并的，而且兩個(gè)或更多個(gè)密碼子可以編碼相同的氨基酸。
除了本文所述的肽基化合物之外，發(fā)明人們還期望能配制立體結(jié)構(gòu)相似的其它化合物以模擬肽結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分?？煞Q為肽模擬物(peptidomimetics)的這類化合物，能以本發(fā)明肽的相同的方式應(yīng)用，因而也是功能相等物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的制作模型和化學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)功能相等物。應(yīng)懂得，所有這些立體結(jié)構(gòu)類似的構(gòu)建物均屬于本發(fā)明的范圍。
B.反義構(gòu)建物在另一個(gè)實(shí)施方案中，p16核酸可編碼任意前述全長或片斷核酸的反義形式(antisense version)。有義構(gòu)建物或編碼構(gòu)建物通?？捎糜谝种颇[瘤增生的方法中，其中p16功能缺乏成為問題并需要置換p16功能。然而，在超量表達(dá)p16成為問題的實(shí)施方案中，例如當(dāng)需要抑制p16表達(dá)時(shí)，可應(yīng)用反義分子。
術(shù)語“反義核酸”表示與p16-編碼DNA或RNA的堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸。當(dāng)反義寡核苷酸被引入靶細(xì)胞后，就會(huì)與它們的靶核酸特異性地結(jié)合并干擾轉(zhuǎn)錄、RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和/或穩(wěn)定性。導(dǎo)向雙鏈(ds)DNA與寡聚體(oligos)或寡核苷酸一起可形成三股螺旋；導(dǎo)向RNA將導(dǎo)致形成雙螺旋。
反義構(gòu)建物可被設(shè)計(jì)成與下列物質(zhì)結(jié)合啟動(dòng)子和基因的其它控制區(qū)、外顯子、內(nèi)顯子甚或外顯子-內(nèi)顯子邊界。反義RNA構(gòu)建物，或者編碼這種反義RNA的DNA，可被用于在體外或者活體內(nèi)抑制宿主細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯或二者，例如在包括人的宿主動(dòng)物內(nèi)。包括“互補(bǔ)核苷酸”的核酸序列是能依標(biāo)準(zhǔn)的沃森-克里克互補(bǔ)規(guī)則進(jìn)行堿基配對(duì)的那些。也就是說，更大的嘌呤將與更小的嘧啶進(jìn)行堿基配對(duì)而形成如下組合與胞嘧啶配對(duì)的鳥嘌呤(GC)和就DNA而言為與胸腺嘧啶配對(duì)的腺嘌呤(AT)，或者就RNA而言為與尿嘧啶配對(duì)的腺嘌呤(AU)。雜交序列中包含較少見的堿基例如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤和其它堿基不會(huì)干擾配對(duì)。
本文中用到的“互補(bǔ)的”或“反義序列”表示其全長是基本互補(bǔ)的和具有很少堿基錯(cuò)配的核酸序列。例如，長度為15個(gè)堿基的核酸序列，當(dāng)它們?cè)?3個(gè)或14個(gè)位置上有互補(bǔ)核苷酸、只有1個(gè)錯(cuò)配堿基時(shí)就可稱為互補(bǔ)的。當(dāng)然，“完全互補(bǔ)的”核酸序列應(yīng)是這種核酸序列即在其全長是完全互補(bǔ)的且沒有堿基錯(cuò)配。
同源性程度更低的其它序列也考慮在內(nèi)。例如，可設(shè)計(jì)具有有限的高同源性區(qū)、但還包含一個(gè)非同源區(qū)的反義構(gòu)建物(例如核酶)。這些分子，雖然具有小于50％的同源性，但能在合適的條件下結(jié)合靶序列。
雖然基因序列的全部或部分可被用于反義構(gòu)建情形中，但據(jù)統(tǒng)計(jì)，在人基因組中，長度為17個(gè)堿基的任何序列應(yīng)只出現(xiàn)一次，因此，足以確定獨(dú)特的靶序列。盡管更短的寡聚物易于制備并可提高活體內(nèi)可及性，但在測(cè)定雜交特異性中包括許多其它因子。寡核苷酸與其互補(bǔ)靶的結(jié)合親和性和序列特異性都隨長度的增長而增大?？紤]應(yīng)用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸。只簡(jiǎn)單地測(cè)試體外構(gòu)建物以確定內(nèi)源基因的功能是否受影響或者具有互補(bǔ)序列的相關(guān)基因的表達(dá)是否受影響，就易于測(cè)定給定的反義核酸在導(dǎo)向相應(yīng)的宿主細(xì)胞基因時(shí)是否有效。
在一些實(shí)施方案中，可能希望應(yīng)用包括其它元件的反義構(gòu)建物，例如包括C-5丙炔嘧啶的那些。業(yè)已證實(shí)，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔同源物的寡核苷酸能高親和性地結(jié)合RNA并有可能成為基因表達(dá)的反義抑制劑(Wagner等，1993)。
作為定向反義送遞的替代物，可應(yīng)用定向核酶。術(shù)語“核酶”表示能導(dǎo)向和裂解p16DNA與RNA中特定堿基序列的基于RNA的酶。核酶或者以結(jié)合核酶序列的RNA寡核苷酸的形式被直接定向至細(xì)胞，或者作為編碼所需核酶RNA的表達(dá)構(gòu)建物被引入細(xì)胞?？梢琅c所述對(duì)于反義核酸幾乎相同的方法應(yīng)用核酶。也可依與所述對(duì)于反義核酸幾乎相同的方法修飾核酶序列。例如，可以摻和非沃森-克里克堿基，或制備混合的RNA/DNA寡核苷酸，或修飾磷酸二酯主鏈。
C.表達(dá)構(gòu)建物在本申請(qǐng)書中，術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建物”表示含有編碼基因產(chǎn)物的核酸的任意基因構(gòu)建物，其中部分或者全部核酸編碼序列可被轉(zhuǎn)錄。該轉(zhuǎn)錄物可被翻譯成蛋白質(zhì)，但它不需翻譯。所以，在某些實(shí)施方案中，表達(dá)包括p16基因的轉(zhuǎn)錄和p16mRNA被翻譯成p16基因產(chǎn)物。在其它實(shí)施方案中，表達(dá)只包括編碼p16的核酸的轉(zhuǎn)錄。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼p16衍生產(chǎn)物的核酸受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制?！皢?dòng)子”表示由細(xì)胞的合成機(jī)構(gòu)(syntheticmachinery)識(shí)別的DNA序列，或是引入合成機(jī)構(gòu)、需要引發(fā)基因的特異性轉(zhuǎn)錄的DNA序列?！笆苻D(zhuǎn)錄控制”這一短語表示啟動(dòng)子相對(duì)于核酸處于正確位置和取向以控制RNA聚合酶引發(fā)和基因的表達(dá)。
本文所用的啟動(dòng)子這一術(shù)語表示一組轉(zhuǎn)錄控制組件，這些組件聚集在RNA聚合酶II的引發(fā)位點(diǎn)周圍。有關(guān)啟動(dòng)子是如何組構(gòu)的很多想法得自對(duì)于數(shù)種病毒啟動(dòng)子的分析，包括關(guān)于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的那些。這些研究，加上最近的工作，業(yè)已證實(shí)啟動(dòng)子由分立的功能組件構(gòu)成，每一個(gè)包括大約7-20bp的DNA，并包含用于轉(zhuǎn)錄激活蛋白或阻抑蛋白的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。
在每個(gè)啟動(dòng)子中至少有一個(gè)組件起定位RNA合成的起始位點(diǎn)的作用。這里最熟悉的實(shí)例是TATA框，但某些啟動(dòng)子中缺乏TATA框，例如用于哺乳動(dòng)物的末端脫氧核糖酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和用于SV40晚期基因的啟動(dòng)子，壓在起始位點(diǎn)上的分立元件自身幫助固定引發(fā)位置。
其它啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄引發(fā)頻率。它們通常位于起始位點(diǎn)上游的區(qū)30-110bp中，不過最近業(yè)已證實(shí)一些啟動(dòng)子也含有起始位點(diǎn)下游的功能元件。啟動(dòng)子元件之間的間隙經(jīng)常是可變的，所以當(dāng)元件內(nèi)翻或相互間運(yùn)動(dòng)時(shí)，啟動(dòng)子功能得以保持。在tk啟動(dòng)子中，在活性下降前，啟動(dòng)子元件之間的間隙可增大至相距50bp。視啟動(dòng)子而定，似乎各元件能協(xié)同作用或者單獨(dú)作用以激活轉(zhuǎn)錄。
用于控制編碼p16的核酸表達(dá)的特定啟動(dòng)子不是很重要，只要它能在定向細(xì)胞中表達(dá)核酸即可。因此，當(dāng)人細(xì)胞被定向時(shí)，優(yōu)選使核酸編碼區(qū)的位置毗鄰啟動(dòng)子并受啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子能在人細(xì)胞中被表達(dá)。通常說來，這種啟動(dòng)子可包括人啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子。
在各實(shí)施方案中，人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子和Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)序列可用于獲得p16的高水平表達(dá)。應(yīng)用其它本領(lǐng)域熟知的病毒啟動(dòng)子或哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子或細(xì)菌噬菌體啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)p16的表達(dá)也是預(yù)期的，只要表達(dá)水平滿足給定的目的即可。
通過應(yīng)用具有熟知性能的啟動(dòng)子，就可優(yōu)化轉(zhuǎn)染后P16的表達(dá)水平和模式。例如，選擇在肺細(xì)胞中具有特異活性的啟動(dòng)子，如酪氨酸酶(黑素瘤)、甲胎蛋白和白蛋白(肝腫瘤)、CC10(肺腫瘤)和前列腺特異性抗原(前列腺腫瘤)，將允許組織特異性表達(dá)p16。而且，選擇響應(yīng)特異性生理信號(hào)而被調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可允許誘導(dǎo)型表達(dá)p16。例如，由人PAI-1啟動(dòng)子表達(dá)編碼p16的核酸，表達(dá)可由腫瘤壞死因子誘導(dǎo)。表2和3列出了幾種因子/啟動(dòng)子，它們可用于本發(fā)明以調(diào)節(jié)p16的表達(dá)。該表并不想窮舉啟動(dòng)p16表達(dá)中包括的所有可能的因子，而僅僅是舉例而已。
增強(qiáng)子最初被檢測(cè)為遺傳因子，它們位于相同DNA分子中較遠(yuǎn)位置上，通過啟動(dòng)子來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。這種長距離上起作用的能力在慣常的原核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)研究中甚少有先例。隨后的工作證明，具有增強(qiáng)子活性的DNA區(qū)都很象啟動(dòng)子那樣組構(gòu)。也就是說，它們由很多獨(dú)立的因子構(gòu)成，每個(gè)因子結(jié)合一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄蛋白。
增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的基本特性是可操縱的。增強(qiáng)子區(qū)整體上必須能遠(yuǎn)距離刺激轉(zhuǎn)錄；而對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)或其組件不需這么嚴(yán)格要求。另一方面，啟動(dòng)子必須具有直接引發(fā)特定位點(diǎn)上依特定取向RNA合成的一個(gè)或多個(gè)因子，而增強(qiáng)子缺少這些規(guī)定。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子通常是重疊和毗連的，通常似乎具有很相似的模件結(jié)構(gòu)。
下述是病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的表(表2和3)，它們可在表達(dá)構(gòu)建物中與編碼p16的核酸組合使用。其它任意啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(按照真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫EPDB)也可用于驅(qū)動(dòng)p16的表達(dá)。T3、T7或SP6胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用則是另一個(gè)可能的實(shí)施方案。如果作為部分遞送復(fù)合體或者作為其它基因表達(dá)構(gòu)建物提供合適的細(xì)菌聚合酶，真核細(xì)胞就能支持從某些細(xì)菌啟動(dòng)子的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。
表2
表2(續(xù)
<p>表2(續(xù))
表3
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過在表達(dá)構(gòu)建物中包括標(biāo)記物而在體外或者活體內(nèi)鑒定細(xì)胞內(nèi)核酸的遞送。該標(biāo)記物將對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生可鑒定的變化，從而能容易地鑒定表達(dá)。通常地，包括的藥物選擇標(biāo)記物有助于克隆化和選擇轉(zhuǎn)化體。備擇地，可應(yīng)用酶例如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)(真核的)或者氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)(原核的)。還可應(yīng)用免疫標(biāo)記物。所應(yīng)用的選擇性標(biāo)記不很重要，只要它能與編碼p16的核酸同時(shí)被表達(dá)即可。選擇性標(biāo)記的進(jìn)一步實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
如果要用到cDNA插入片段，通常需要包括聚腺苷酸化信號(hào)以實(shí)現(xiàn)p16轉(zhuǎn)錄物合適的聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信號(hào)的性質(zhì)對(duì)于成功地實(shí)施本發(fā)明并非至關(guān)重要，故可應(yīng)用任意這種序列。本發(fā)明人考慮應(yīng)用了SV40聚腺苷酸化信號(hào)，因?yàn)樗椎?，并且已知它在?yīng)用的靶細(xì)胞內(nèi)起良好的作用。還考慮表達(dá)盒的一種元件是終止子。這些元件能用來提高信息量和將從該盒到其它序列的閱讀減至最少。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建物包括病毒和得自病毒基因組的工程構(gòu)建物。某些病毒經(jīng)由受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的能力和整合入宿主細(xì)胞基因組并穩(wěn)定且有效地表達(dá)病毒基因的能力，使它們成為將外源基因轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的良好候選物(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。最初用作基因載體的病毒是DNA病毒，它們包括乳多空病毒(猴病毒40、牛乳頭瘤病毒和多瘤)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。這些病毒對(duì)于外源DNA序列具有較低容量且具有受限的宿主范圍。此外，它們?cè)谠试S細(xì)胞中的致癌可能性和致細(xì)胞病變效應(yīng)會(huì)引起安全問題。它們只能容納至多8千堿基的外源基因材料但易于被引入很多細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986)。
(i)逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RNA病毒，其特征在于能在感染的細(xì)胞中通過逆轉(zhuǎn)錄過程將它們的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA(Coffin，1990)。然后所得DNA作為原病毒穩(wěn)定地整合入細(xì)胞染色體并指導(dǎo)病毒蛋白的合成。這種整合作用導(dǎo)致病毒基因序列保留于受體細(xì)胞及其后代細(xì)胞中。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有三種因基gag、pol和env，它們分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜成分。從gag基因上游發(fā)現(xiàn)的、被稱為Ψ的序列，起基因組包裝入病毒顆粒用的信號(hào)的作用。有兩種長末端重復(fù)序列(LTR)存在于病毒基因組的5′端和3′端。它們含有強(qiáng)啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列，并且也被要求整合入宿主細(xì)胞基因組(Coffin，1990)。
為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼p16的核酸插入病毒基因組內(nèi)某些病毒序列中以產(chǎn)生復(fù)制缺損型病毒。為了產(chǎn)生病毒顆粒而構(gòu)建其中含有g(shù)ag、pol和env基因但沒有LTR和Ψ組分的包裝細(xì)胞系(Mann等，1983)。當(dāng)含有人cDNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR序列和Ψ序列的重組質(zhì)粒被引入該細(xì)胞系(例如通過磷酸鈣沉淀)后，Ψ序列允許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物被包裝入病毒顆粒，然后病毒顆粒被分泌入培養(yǎng)基(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。接著收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，也可以濃縮，再用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染很多種細(xì)胞。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要分裂宿主細(xì)胞(Paskind等，1975)。
近期開發(fā)了一種旨在允許特異性導(dǎo)向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的新方法，該方法基于通過化學(xué)法往病毒包膜中加入乳糖殘基而對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行化學(xué)修飾。這種修飾允許經(jīng)由唾液酸糖蛋白受體對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行特異性感染。
設(shè)計(jì)了一種不同的、導(dǎo)向重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法，其中用到抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和抗特異性細(xì)胞受體的生物素化抗體。應(yīng)用抗生蛋白鏈菌素借助于生物素組分使這些抗體偶合(Roux等，1989)。應(yīng)用抗主要組織相容性復(fù)合體I型和II型抗原的抗體，他們闡述了多種人細(xì)胞的感染，其中的細(xì)胞具有那些表面抗原與體外親嗜性病毒(Roux等，1989)。
本發(fā)明各個(gè)方面中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用有一定的限制。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常整合入細(xì)胞基因組中的隨機(jī)位點(diǎn)。這就會(huì)導(dǎo)致通過間斷宿主基因或者通過插入能干擾側(cè)翼基因功能的病毒調(diào)節(jié)序列而插入誘變(Varmus等，1981)。有關(guān)缺損型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用的另一個(gè)問題是，有可能在包裝細(xì)胞中出現(xiàn)野生型可復(fù)制病毒。這可產(chǎn)生于重組過程，其中來自重組病毒的完整Ψ序列插入整合入宿主細(xì)胞基因組中的gag、pol、env序列的上游。不過，現(xiàn)在可得到新的包裝細(xì)胞系，它們應(yīng)能大為降低重組的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。
活體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用的一個(gè)限制因子是產(chǎn)生大于106感染U/ml的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體滴度的能力有限。而很多活體內(nèi)應(yīng)用場(chǎng)合需要高出10～1000倍的滴度。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的如下一些性能限制了它在肺癌治療中的應(yīng)用(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991)；(i)由逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染依賴于宿主細(xì)胞分裂。在人癌中，腫瘤損傷內(nèi)很少見到有絲分裂細(xì)胞(Warner和Heston，1991)。(ii)逆轉(zhuǎn)錄病毒整合入宿主基因組會(huì)對(duì)于靶細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，因?yàn)閻盒约?xì)胞都具有高度的基因不穩(wěn)定性。(iii)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染常受一定的宿主范圍限制。(iv)逆轉(zhuǎn)錄病毒與哺乳動(dòng)物和脊椎動(dòng)物內(nèi)的許多惡性腫瘤有關(guān)。(v)逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度通常比腺病毒的小100～1000倍。
(ii)腺病毒了解了腺病毒的基因結(jié)構(gòu)即36kB、線型和雙鏈DNA病毒，就能用多達(dá)7kB的外源序列取代大段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，腺病毒DNA在宿主細(xì)胞中感染不會(huì)導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA能以附加型方式復(fù)制而沒有潛在的基因毒性。而且，腺病毒是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的，在徹底擴(kuò)增后檢測(cè)不出基因組重排。腺病毒實(shí)際上能感染全部上皮細(xì)胞而不管其細(xì)胞周期階段如何。迄今，腺病毒感染似乎只與輕度疾病如人急性呼吸疾病有關(guān)。
腺病毒特別適用作基因轉(zhuǎn)移載體，這是由于它中等大小的基因組、易于操縱、高滴度、寬靶細(xì)胞范圍和高感染性。該病毒基因組兩端均含有100～200個(gè)堿基對(duì)(bp)的末端反向重復(fù)序列(ITR)，它們是病毒DNA復(fù)制和包裝所需的順式元件。該基因組的早期(E)區(qū)和晚期(L)區(qū)含有不同的轉(zhuǎn)錄單位，它們受病毒DNA復(fù)制啟動(dòng)而被分開。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼的蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)該病毒基因組和少量細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)導(dǎo)致合成用于病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)包括于DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞切斷中(Renan，1990)。該晚期基因的產(chǎn)物，包括該病毒衣殼蛋白的主要部分，只是在有效加工由主要晚期啟動(dòng)子(MLP)產(chǎn)生的單一初級(jí)轉(zhuǎn)錄物后被表達(dá)。該MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期特別有效，而且由該啟動(dòng)子產(chǎn)生的所有mRNAs都具有5′三聯(lián)前導(dǎo)(TL)序列，后者使它們成為適于翻譯的優(yōu)選mRNAs。
在現(xiàn)有系統(tǒng)中，重組腺病毒產(chǎn)生于穿梭載體和原病毒載體之間的同源重組。由于兩種原病毒載體有可能重組，所以野生型腺病毒可產(chǎn)生于該過程。因此，極重要的是從單個(gè)噬斑分離病毒的單克隆并檢測(cè)其基因組結(jié)構(gòu)。YAC系統(tǒng)的應(yīng)用是產(chǎn)生重組腺病毒的另一種方法。
現(xiàn)有復(fù)制缺損型腺病毒載體的產(chǎn)生和增殖，依賴于被稱為293的獨(dú)特輔助細(xì)胞系，它是用Ad5 DNA片段從人胚胎腎細(xì)胞轉(zhuǎn)化的，能組成型地表達(dá)E1蛋白(Graham等，1977)。由于E3區(qū)不是腺病毒基因組必需的(Jones和Shenk，1978)，所以在293細(xì)胞協(xié)助下現(xiàn)有腺病毒載體可在E1區(qū)、E3區(qū)或者兩個(gè)區(qū)中攜帶外源DNA(Graham和Prevec，1991)。在性質(zhì)上，腺病毒能包裝大約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)，提供約另外的2kB DNA的容量。在E1區(qū)和E3區(qū)結(jié)合大約5.5kB可置換的DNA后，則現(xiàn)有腺病毒載體的最大容量在7.5kB以內(nèi)，或者約為載體全長的15％。在載體主鏈中保持80％以上的腺病毒病毒基因組，它是載體帶有的細(xì)胞毒性的起源。還有，缺失E1的病毒的復(fù)制缺損并不完全。例如，對(duì)于目前可獲得的腺病毒載體在高感染復(fù)數(shù)下已觀測(cè)到病毒基因表達(dá)的滲漏(Mulligan，1993)。
輔助細(xì)胞系可得自人細(xì)胞如人胚胎腎細(xì)胞、肌細(xì)胞、造血細(xì)胞或者其它的人胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。輔助細(xì)胞也可得自容許人腺病毒的其它種類哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這種細(xì)胞例如包括Vero細(xì)胞或其它的猴胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。如前所述，優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。
除了要求腺病毒載體是復(fù)制缺損型，或者至少是條件缺損之外，認(rèn)為腺病毒載體的性質(zhì)對(duì)于成功地實(shí)施本發(fā)明不是至關(guān)重要。腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞組A-F的任意一種。亞組C的5型腺病毒是優(yōu)選的起始原料以獲得用于本發(fā)明的方法中的條件復(fù)制缺損型腺病毒載體。這是由于5型腺病毒是一種人腺病毒，業(yè)已了解有關(guān)它的很多生化信息和遺傳信息，而且它已用于以腺病毒為載體的大多數(shù)構(gòu)建場(chǎng)合中。
如前所述，本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺損型且不具有腺病毒E1區(qū)。所以，將會(huì)很方便地在除去E1編碼序列的位置上引入編碼p16的核酸。然而，在腺病毒序列中p16編碼區(qū)的插入位置對(duì)于本發(fā)明來說不很重要。編碼p16轉(zhuǎn)錄單位的核酸也可如先前Karlsson等(1986)所述那樣作為缺失的E3區(qū)的替代物被插入E3置換型載體中或者被插入其中輔助細(xì)胞系或輔助病毒補(bǔ)充E4缺失的E4區(qū)。
在體外和活體內(nèi)，腺病毒易于生長和操縱且表現(xiàn)寬的宿主范圍。這類病毒可在很高的滴度例如109～1011個(gè)噬斑形成單位(PFU)/ml下獲得，而且它們是高度感染性的。腺病毒的生命周期不要求整合入宿主細(xì)胞基因組。由腺病毒載體遞送的外源基因都是附加型基因，所以對(duì)宿主細(xì)胞具有低的基因毒性。在用野生型腺病毒接種的研究中未報(bào)道過有副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，說明它們作為活體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體時(shí)具有安全性和治療可能性。
腺病毒載體業(yè)已用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。近來，動(dòng)物研究表明，重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991，Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。對(duì)不同組織施用重組腺病毒的實(shí)驗(yàn)包括氣管滴注法(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)，肌肉注射(Ragot等，1993)，外周靜脈注射(Herz和Gerard，1993)，和定向接種入大腦(Le Gal La Salle等，1993)。
(iii)作為表達(dá)構(gòu)建物的其它病毒載體其它病毒載體可用作本發(fā)明中的表達(dá)構(gòu)建物?？蓱?yīng)用得自下列病毒的載體痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)，腺伴隨病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和皰疹病毒。它們?yōu)楦鞣N哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供數(shù)個(gè)有吸引力的特性(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
隨著近期對(duì)缺損型乙肝病毒的識(shí)別，獲得了對(duì)于不同病毒序列的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的新認(rèn)識(shí)。體外研究表明，盡管缺失其多達(dá)80％的基因組，該病毒能保持依賴于輔助病毒的包裝和逆轉(zhuǎn)錄。(Horwich等，1990)。這說明大部分基因組可被外源基因物質(zhì)代替。親肝性和持久性(整合)都是適于肝定向基因轉(zhuǎn)移的特別引人注意的性能。Chang等人近來將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因引入鴨乙肝病毒基因組中聚合酶、表面和前表面編碼序列的位置中。它與野生型病毒被共轉(zhuǎn)染入禽肝癌細(xì)胞系中。含有高滴度的重組病毒的培養(yǎng)基被用于感染幼鴨初級(jí)肝細(xì)胞。至少在轉(zhuǎn)染24天后檢測(cè)到穩(wěn)定的CAT基因表達(dá)(Chang等人，1991)。
D.基因轉(zhuǎn)移的方法為了有效表達(dá)有義或反義p16構(gòu)建物，表達(dá)構(gòu)建物必須被遞送入細(xì)胞。這種遞送可在體外完成，如在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)操作過程中；或者在活體內(nèi)或來自體內(nèi)(見下文)，如在某些疾病的治療中。如上所述，遞送的優(yōu)選機(jī)制是經(jīng)由病毒感染，其中表達(dá)構(gòu)建物在感染病毒粒子中被衣殼化。
將表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的幾種非病毒方法也是本發(fā)明預(yù)期的。這些方法包括磷酸鈣沉淀(Graham和VanDer Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)，DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)，電穿孔法(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)，直接顯微注射(Harland和Weintraub，1985)，DNA-負(fù)載的脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-DNA復(fù)合體，細(xì)胞超聲處理(Fechheimer等，1987)，用高速微粒進(jìn)行的基因轟擊(Yang等，1990)，和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。這些方法的某幾種可成功地適合于活體內(nèi)或來自體內(nèi)應(yīng)用。
一旦表達(dá)構(gòu)建物已被遞送入細(xì)胞，編碼p16的核酸就可被定位和在不同位點(diǎn)被表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，編碼p16的核酸可被穩(wěn)定地整合入細(xì)胞的基因組。這種整合可以經(jīng)由同源重組在同源位置和方向上進(jìn)行(基因置換)或者它可被整合入隨機(jī)的非特異性位置(基因添補(bǔ))。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該核酸可作為DNA的單獨(dú)附加型區(qū)段而被穩(wěn)定地保持在細(xì)胞內(nèi)。這種核酸區(qū)段或“附加體”編碼這些序列，它們足以允許不依賴于宿主細(xì)胞周期的或與之同步化的維持和復(fù)制。表達(dá)構(gòu)建物是如何被遞送至細(xì)胞的和核酸保留于細(xì)胞中何處，取決于所應(yīng)用的表達(dá)構(gòu)建物類別。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建物可以只由裸重組DNA或質(zhì)粒構(gòu)成。構(gòu)建物的轉(zhuǎn)移由上述的任意方法進(jìn)行，它們通過物理或化學(xué)法透化處理細(xì)胞膜。這特別適合于體外轉(zhuǎn)移，但也可用于活體內(nèi)。Dubensky等(1984)成功地在成熟的和新生小鼠肝和脾內(nèi)注射了呈CaPO4沉淀形式的多瘤病毒DNA，證實(shí)了活性病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也證明直接腹膜內(nèi)注射CaPO4沉淀的質(zhì)粒導(dǎo)致表達(dá)轉(zhuǎn)染的基因。預(yù)計(jì)編碼p16的DNA也可在活體內(nèi)依類似方式被轉(zhuǎn)移并表達(dá)p16。
用于將裸DNA表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案可以包括粒子轟擊。該方法依賴于如下能力即將DNA涂覆的微粒加速至高速度而使它們穿入細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞又不會(huì)殺傷它們(Klein等，1987)。已設(shè)計(jì)出幾種加速小粒子的裝置。一種裝置借助于高壓放電以產(chǎn)生電流，它反過來提供驅(qū)動(dòng)力(Yang等，1990)。所用微粒由生物惰性物質(zhì)如鎢或金粒組成。
在活體內(nèi)被轟擊的器官選自大鼠和小鼠的肝、皮膚和肌肉組織(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。這可能要求外科暴露(Surgical exposure)組織或細(xì)胞，以消除介于注射器(thegun)和靶器官之間的任何組織，即來自體內(nèi)處理。又一次地，編碼p16的DNA也可由該方法遞送且仍并入本發(fā)明。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建物可被包載于脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體都具有泡囊結(jié)構(gòu)，其特征在于磷脂雙層膜和內(nèi)部含水介質(zhì)。多層狀脂質(zhì)體具有由含水介質(zhì)分開的多層脂質(zhì)。當(dāng)磷脂被懸浮于過量水溶液時(shí)，它們就自動(dòng)形成多層狀脂質(zhì)體。在形成封閉結(jié)構(gòu)之前，脂質(zhì)組分經(jīng)歷自身重排并且在脂質(zhì)雙層之間包載水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。還考慮了脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-DNA復(fù)合體。
脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送和表達(dá)外源DNA已在體外完全獲得成功。Wong等(1980)證明了有可能在培養(yǎng)的雞胚胎細(xì)胞、Hela細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)由脂質(zhì)體介導(dǎo)的遞送和表達(dá)外源DNA。Nicolau等(1987)成功地完成了在靜脈內(nèi)注射后大鼠體內(nèi)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可與血細(xì)胞凝集病毒(HVJ)復(fù)合。業(yè)已證實(shí)這樣有利于與細(xì)胞膜融合和促使脂質(zhì)體包囊化DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可與細(xì)胞核的非組蛋白染色體蛋白質(zhì)(HMG-1)復(fù)合或一同應(yīng)用(Kato等，1991)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可與HVJ和HMG-1二者復(fù)合或一同應(yīng)用。由于這種表達(dá)構(gòu)建物已成功地用于在體外和活體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)核酸，所以它們適于本發(fā)明。如果細(xì)菌啟動(dòng)子被用于DNA構(gòu)建物中，還希望在脂質(zhì)體中包括合適的細(xì)菌聚合酶。
可用于將編碼p16的核酸遞送入細(xì)胞的其它表達(dá)構(gòu)建物有受體介導(dǎo)的遞送載體。這些載體的優(yōu)點(diǎn)在于通過在幾乎所有真核細(xì)胞中受體介導(dǎo)的胞吞作用可選擇性地?cái)z入大分子。由于各種受體的細(xì)胞類型特異性分布，遞送可以是高度特異性的(Wu和Wu，1993)。
受體介導(dǎo)的基因?qū)蜉d體通常包括兩部分細(xì)胞受體特異性配體和DNA結(jié)合劑。有數(shù)個(gè)配體業(yè)已用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。最深入鑒定的配體有脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)和運(yùn)鐵蛋白(Wagner等，1990)。近來，一種識(shí)別與ASOR相同的受體的合成新糖蛋白已用作基因遞送載體(Ferkol等，1993；Perales等，1994)而且表皮生長因子(EGF)也已被用于將基因遞送至多鱗的癌細(xì)胞(Myers，EPO 0273085)。
在其它實(shí)施方案中，遞送載體可包括配體和脂質(zhì)體。例如，Nicolau等(1987)將乳糖基神經(jīng)酰胺即一種半乳糖末端無唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(asialganglioside)摻入脂質(zhì)體，并觀察到肝細(xì)胞攝取胰島素基因量增加。因此，有可能通過任意數(shù)量、有或無脂質(zhì)體的受體-配體系統(tǒng)將編碼p16的核酸也特異性地遞送入例如肺細(xì)胞、上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞等類細(xì)胞。例如，表皮生長因子(EGF)可作為受體用于在表現(xiàn)為正調(diào)節(jié)EGF受體的許多腫瘤細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)遞送編碼p16的核酸。甘露糖可用于在肝細(xì)胞上導(dǎo)向甘露糖受體。而且，抗CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T細(xì)胞白血病)和MAA(黑素瘤)的抗體可類似地用作導(dǎo)向部分。
在某些實(shí)施方案中，基因轉(zhuǎn)移在來自體內(nèi)的條件下更易于進(jìn)行。來自體內(nèi)基因治療涉及從動(dòng)物分離出細(xì)胞，再在體外將核酸遞送入細(xì)胞，然后將已修飾的細(xì)胞返回入動(dòng)物。這可能包括外科去除動(dòng)物的組織/器官或者細(xì)胞和組織的原代培養(yǎng)。全文并入本文作參考的、Anderson等的美國專利5,399,346公開了來自體內(nèi)的治療方法。
原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可用多種方法制備。為了使細(xì)胞在體外能存活并同表達(dá)構(gòu)建物接觸，要求保證細(xì)胞與恰當(dāng)比率的氧氣和二氧化碳和營養(yǎng)物保持接觸但要防止微生物污染。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在文獻(xiàn)(Freshner，1992)中有詳細(xì)記載且并入本文作參考。
在體外培養(yǎng)條件下，表達(dá)構(gòu)建物就可以將編碼p16的核酸遞送和表達(dá)入細(xì)胞。最后，可將細(xì)胞再引入原來的動(dòng)物，或者以藥物上可接受的形式通過下述任意方法施藥給不同的動(dòng)物。因此，對(duì)患病的哺乳動(dòng)物提供來自體內(nèi)的療法屬于本發(fā)明的范圍。
E.與其它療法組合的p16表達(dá)構(gòu)建物腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷劑的抗性反映了臨床腫瘤學(xué)中的主要問題?，F(xiàn)在癌研究中的一個(gè)目的是尋找方法以通過與基因治療組合提高化學(xué)療法和放射治療的療效。例如，當(dāng)將單純皰疹-胸苷激酶(HS-tK)基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)遞送至腦瘤時(shí)，成功地引起了對(duì)于抗病毒劑9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤的易感性(Culver等，1992)。在本發(fā)明中，考慮到p16置換療法可類似地與化學(xué)療法或放射治療的介入組合使用。
為殺傷細(xì)胞如惡性細(xì)胞或轉(zhuǎn)移細(xì)胞，應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物，一般就可使“靶”細(xì)胞與p16表達(dá)構(gòu)建物和至少一種DNA損傷劑接觸。這些組合物被提供的量應(yīng)能終止或抑制細(xì)胞增殖。處理方法可包括將細(xì)胞同時(shí)與p16表達(dá)構(gòu)建物和DNA損傷劑或因子接觸。這可通過如下方法而完成將細(xì)胞與包括這兩種物質(zhì)的單一組合物或藥物配制劑接觸；或者使細(xì)胞同時(shí)與兩種不同的組合物或配制劑接觸，其中一種組合物包括p16表達(dá)構(gòu)建物而另一種包括DNA損傷劑。
備擇地，p16處理可以在從數(shù)分鐘至數(shù)周的時(shí)間間隔中先于或后于DNA損傷劑處理。在其中DNA損傷因子和p16表達(dá)構(gòu)建物被分別應(yīng)用于細(xì)胞的實(shí)施方案中，通常應(yīng)保證在每次遞送之間的有效時(shí)間段不能終止，這樣DNA損傷劑和p16表達(dá)構(gòu)建物就仍能對(duì)細(xì)胞施加有利的結(jié)合效應(yīng)。在這種情況下，希望細(xì)胞與兩種物質(zhì)相互在約12～24小時(shí)內(nèi)接觸，更優(yōu)選相互在約6～12小時(shí)內(nèi)，僅約12小時(shí)的延時(shí)時(shí)間是最優(yōu)選的。在某些場(chǎng)合中，希望延長有效處理的時(shí)間段，然而，每次施藥后如果相隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7)至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)就會(huì)失效。
還可設(shè)想，不止一次地施用p16或者DNA損傷劑將是所需的?？刹捎酶鞣N組合方式，其中p16表示為“A”，而DNA損傷劑表示為“B”A/B/AB/A/B B/B/A A/A/BB/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/BA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B為了殺死細(xì)胞，將可殺死細(xì)胞的結(jié)合有效量的這兩種物質(zhì)遞送至細(xì)胞。
DNA損傷劑或因子在本文是指當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)可引起DNA損傷的任意化學(xué)物質(zhì)或處理方法。這種物質(zhì)和因子包括引起DNA損傷的輻射和波例如γ-照射、X-射線、UV-照射、微波、電子發(fā)射等等。有很多化合物，也稱為“化療劑”，起誘導(dǎo)DNA損傷的作用，所有這些化合物可用于本文公開的結(jié)合處理方法。預(yù)期應(yīng)用的化療劑例如包括阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、鬼臼亞乙苷(VP-16)、喜樹堿、放射菌素-D、絲裂毒素C、順式鉑氨(CDDP)和甚至過氧化氫。本發(fā)明還包括一種或多種DNA損傷劑的組合應(yīng)用，或是基于輻射的或是實(shí)際的化合物，例如X-射線與順式鉑氨的應(yīng)用或者順式鉑氨與鬼臼亞乙苷的應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，順式鉑氨與p16表達(dá)構(gòu)建物組合應(yīng)用特別優(yōu)選作為該化合物。
在依本發(fā)明治療瘤時(shí)，應(yīng)將腫瘤細(xì)胞與除p16表達(dá)構(gòu)建物之外的DNA損傷劑接觸。這可通過用DNA損傷輻射線如X-射線、UV光、γ-射線甚或微波對(duì)局部腫瘤部位進(jìn)行照射來完成。備擇地，可通過對(duì)受治療者施用治療上有效量的藥物組合物使腫瘤細(xì)胞與DNA損傷劑接觸，其中的藥物組合物包括DNA損傷化合物如阿霉素、5-氟尿嘧啶、鬼臼亞乙苷、喜樹堿、放射菌素-D、絲裂霉素C，或更優(yōu)選為順式鉑氨。DNA損傷劑可以組合的治療組合物或試劑盒形式制備和應(yīng)用，是通過將它與p16表達(dá)構(gòu)建物如上述那樣結(jié)合。
本文設(shè)想并給出直接交聯(lián)核酸，特別是DNA的物質(zhì)，最后產(chǎn)生DNA損傷導(dǎo)致協(xié)同的抗腫瘤組合效果?？捎玫脑噭├缬许樖姐K氨和其它DNA烷基化試劑。順式鉑氨業(yè)已廣泛用于治療癌，臨床應(yīng)用的有效劑量為每隔兩周20mg/m2(5天)，共三個(gè)療程。順式鉑氨不是經(jīng)口吸收的，因而必須經(jīng)過靜脈注射、皮下注射、腫瘤內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射遞送。
損傷DNA的試劑也包括干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和染色體分離的化合物。這類化療化合物包括阿霉素(adriamycin)，也稱為阿霉素(doxorubicin)，鬼臼亞乙苷，異博定、鬼臼毒素等等。廣泛用于臨床治療腫瘤時(shí)，這些化合物以靜脈內(nèi)藥團(tuán)注射液形式施藥，劑量范圍從對(duì)阿霉素來說以21天間隔為25～75mg/m2至對(duì)鬼臼亞乙苷來說靜脈注射35～50mg/m2或者經(jīng)口服用2倍于靜脈注射的劑量。
破壞核酸前體和亞單位的合成和保真性的試劑也導(dǎo)致DNA損傷。照此研制了一些核酸前體。特別適用的試劑是已經(jīng)過全面測(cè)試和易于獲得的試劑。這樣，試劑例如5-氟尿嘧啶(5-FU)優(yōu)選適用于腫瘤組織，使該試劑特別適用于導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞。盡管有相當(dāng)大的毒性，但5-FU適用于寬范圍的載體，包括表面的載體，不過，常用的是劑量范圍是3～15mg/kg/天的靜脈內(nèi)施藥。
能引起DNA的損傷并業(yè)已廣泛應(yīng)用的其它因子包括通常已知的如γ-射線、X-射線和/或?qū)⒎派湫酝凰囟ㄏ蜻f送至腫瘤細(xì)胞。其它形式的DNA損傷因子例如微波和UV輻射也是期望的。所有這些因子最有可能寬范圍地影響到損傷DNA、DNA的前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)和染色體的裝配和維護(hù)。X-射線的劑量范圍從在延長的時(shí)間段(3～4周)日劑量為50～200倫琴，至單次劑量為2000～6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍變化很大，且依賴于同位素半衰期、放射射線的強(qiáng)度和類型和腫瘤細(xì)胞攝取能力。
熟練的技術(shù)人員可參考“Remington′s PharmaceuticalSciences”15th Edition(第15版)，chapter33(第33章)，特別是624～652頁。視受治療者病況而定，有必要對(duì)于劑量作某些改變。負(fù)責(zé)施藥的人員無論如何應(yīng)決定各位受治療者的合適劑量。此外，對(duì)人施藥時(shí)，制劑應(yīng)符合FDA Office of Biologics Standard所要求的無菌、致熱性、一般的安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明人建議，將p16表達(dá)構(gòu)建物局部遞送至患有與p16相關(guān)的癌的病人，將是遞送治療上有效的基因以消除臨床疾病的很有效方法。類似地，化學(xué)療法或放射治療可定向于受治療體特定的、疾病侵襲區(qū)。備擇地，系統(tǒng)性遞送p16表達(dá)構(gòu)建物或DNA損傷劑可適合于某些情況，例如當(dāng)發(fā)生廣泛的轉(zhuǎn)移時(shí)。
除了將p16定向治療與化學(xué)療法和放射治療結(jié)合之外，還考慮到它與其它基因治療結(jié)合將會(huì)有益。例如，同時(shí)導(dǎo)向p16和p53突變體可以增進(jìn)抗癌治療。可能以該方式導(dǎo)向的任何其它與腫瘤相關(guān)的基因例如有p21，Rb，APC，DCC，NF-1，NF-2，WT-1，MEN-I，MEN-II，BRCAl，VHL，F(xiàn)CC，MCC，ras，myc，neu，raf，erb，src，fms，jun，trk，ret，gsp，hst，bcl and abl.
F.作為標(biāo)記物的編碼p16的核酸或p16在某些實(shí)施方案中，編碼p16的核酸或p16肽可用于診斷目的。編碼p16的p16核酸不存在或其含量減小/增大可預(yù)示例如癌的病況。所以，本發(fā)明還包括把編碼p16的核酸或p16用作標(biāo)記物。有多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可被用于檢測(cè)編碼p16的核酸或者p16。兩種檢測(cè)編碼p16的核酸的常見方法是DNA分析和RNA分析及其變化形式。p16信息的量可用作預(yù)示致瘤性的標(biāo)記物。
實(shí)施例I中還描述了用免疫測(cè)定檢測(cè)p16的其它方法，其中在蛋白質(zhì)印跡法和FACS分析中應(yīng)用與p16結(jié)合的抗體。兩種方法均被用于檢測(cè)細(xì)胞表面的p16表達(dá)。人們易于懂得檢測(cè)并不限于上述方法，而且有很多其它方法可包括于本發(fā)明中。
優(yōu)選的其它免疫測(cè)定法有本領(lǐng)域已知的各種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA′s)和放射免疫測(cè)定(RIA′s)。應(yīng)用組織切片的免疫組織化學(xué)檢測(cè)也特別有用。
在ELISA′s中，抗p16的抗體(例如本文公開的Ab669)被固定于表現(xiàn)出蛋白質(zhì)親和性的被選表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。然后，將含細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)的測(cè)試組合物例如臨床樣品加入孔中。在結(jié)合并洗滌以除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合體之后，就可檢測(cè)結(jié)合的p16。檢測(cè)過程一般是通過加入另一種與可檢測(cè)標(biāo)記物連接的抗p16抗體而完成的。這種ELISA是簡(jiǎn)單的“夾心式ELISA”。檢測(cè)過程也可通過加入第二種抗p16抗體，接著加入對(duì)第二種抗p16抗體具有結(jié)合親和性的第三種抗體而完成，其中第三種抗體與可檢測(cè)的標(biāo)記物連接。
在另一個(gè)ELISA實(shí)例中，含待測(cè)定p16含量的細(xì)胞物質(zhì)的樣品被固定于孔表面然后與抗p16抗體接觸。在結(jié)合和適當(dāng)洗滌之后，檢測(cè)結(jié)合的免疫復(fù)合體。如果初始抗p16抗體與可檢測(cè)的標(biāo)記物連接，則可直接檢測(cè)該免疫復(fù)合體。又一次地，該免疫復(fù)合體可應(yīng)用對(duì)第一種抗p16抗體具有結(jié)合親和性的第二種抗體來檢測(cè)，其中第二種抗體與可檢測(cè)的標(biāo)記物連接。
競(jìng)爭(zhēng)ELISA′s也有可能，其中測(cè)試樣品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合已知量的已標(biāo)記p16抗原或抗體。未知樣品中活性物質(zhì)的量可通過在與涂覆孔溫育之前或期間將樣品與已知的標(biāo)記物混合而測(cè)定。樣品中存在的活性物質(zhì)可減少與孔結(jié)合的已標(biāo)記物質(zhì)的量，從而減少基本的信號(hào)。
不管采用的形式如何，ELISA′s具有某些常見特征例如涂覆，溫育或結(jié)合，洗滌以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)，和檢測(cè)結(jié)合的免疫復(fù)合體。這些被描述如下在用抗原或抗體涂覆板時(shí)，一般可將板孔與抗原或抗體的溶液保溫一夜或規(guī)定的小時(shí)數(shù)。然后洗滌板孔以除去不完全吸附的物質(zhì)。殘余的任何有效孔表面再用對(duì)于待測(cè)抗血清呈抗原中性的非特異性蛋白質(zhì)“涂覆”。這些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明膠和奶粉溶液。封閉溶液通常還含有去污劑吐溫20，它大大有助于減弱非特異性結(jié)合。涂層能封閉固定表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，于是減小由抗血清非特異性結(jié)合在表面上而引起的背景。
在ELISA′s中，更習(xí)慣于用二級(jí)或三級(jí)檢測(cè)方法而不是直接方法。例如，當(dāng)p16或抗p16抗體與孔結(jié)合、用非活性物質(zhì)涂覆以減小背景、洗滌以除去未結(jié)合物質(zhì)之后，在可以形成免疫復(fù)合體(抗原/抗體)的條件下使固定表面與待測(cè)臨床樣品或生物樣品接觸。于是免疫復(fù)合體的檢測(cè)需要標(biāo)記的二級(jí)結(jié)合配體或抗體，或者與標(biāo)記的三級(jí)抗體或第三結(jié)合配體連接的二級(jí)結(jié)合配體或抗體。
“在可以形成免疫復(fù)合體(抗原/抗體)的條件下”是指優(yōu)選包括如下處理的條件即，用例如BSA、牛丙種球蛋白(BGG)和磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)/吐溫20這樣的溶液稀釋抗原和抗體。這些添加劑還意在有助于減小非特異性背景。
合適的條件還意味著在足以使之有效結(jié)合的溫度和時(shí)間下溫育。溫育步驟通常為在溫度優(yōu)選大約為25℃～27℃下培養(yǎng)約1～2～4小時(shí)，或者在4℃左右培養(yǎng)一夜。
在ELISA中所有溫育步驟之后，洗滌接觸的表面以除去未復(fù)合的物質(zhì)。洗滌過程通常包括用PBS/吐溫20的溶液或者硼酸鹽緩沖液洗滌。當(dāng)測(cè)試樣品和初始結(jié)合物質(zhì)形成特異性免疫復(fù)合體和相繼洗滌之后，即使只產(chǎn)生微量的免疫復(fù)合體也能檢測(cè)到。
為提供檢測(cè)方法，第二或第三抗體應(yīng)具有相關(guān)的標(biāo)記物以便于檢測(cè)。它優(yōu)選是這種酶當(dāng)同適當(dāng)?shù)娘@色底物溫育時(shí)，它能顯色。這樣，例如，可能希望將第一或第二免疫復(fù)合體與脲酶、葡糖氧化酶、堿性磷酸酶或過氧化氫酶綴合的抗體接觸和溫育一段時(shí)間，其中溫育是在有利于進(jìn)一步形成的免疫復(fù)合體顯色的條件(例如，在室溫下于含PBS的溶液如PBS/吐溫20中溫育2小時(shí))下進(jìn)行。
在與標(biāo)記抗體溫育和洗滌以除去未結(jié)合物質(zhì)之后，就定量分析標(biāo)記物含量，例如當(dāng)以過氧化物酶作酶標(biāo)記時(shí)，通過與顯色底物如脲和溴甲酚紅紫或2，2′-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸ABTS)和H2O2溫育。然后通過測(cè)定生色度，例如利用可見分光光度計(jì)，而進(jìn)行定量分析。
F.藥物組合物和施藥途徑如果想要臨床應(yīng)用包括編碼p16的核酸的表達(dá)構(gòu)建物，則需要制備作為藥物組合物適用于預(yù)期應(yīng)用的復(fù)合體。通常必須制備基本上不合致熱原以及其它任何對(duì)人體或動(dòng)物有害的雜質(zhì)的藥物組合物。我們一般還想應(yīng)用合適的鹽和緩沖劑使復(fù)合體穩(wěn)定和使復(fù)合體可被靶細(xì)胞攝取。
本發(fā)明的含水組合物包括有效量的表達(dá)構(gòu)建物和核酸，它們?nèi)苡诨驊腋∮谒幬锷峡山邮艿妮d體或含水介質(zhì)中。這種組合物還可稱為接種物。短語“藥物上或藥理上可接受的”表示當(dāng)分子實(shí)體和組合物需要施藥給動(dòng)物或人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、變應(yīng)性的或其它不適反應(yīng)。本文應(yīng)用的“藥物上可接受的載體”包括任意和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸附延遲劑等等。用于藥物活性物質(zhì)的這類介質(zhì)和試劑是本領(lǐng)域中熟知的。除了與活性組分不相容之外，任何常用介質(zhì)或試劑都可以考慮它們?cè)谥委熃M合物中的應(yīng)用。組合物中還可摻入其它活性組分。
游離堿或藥理上可接受的鹽形式的活性化合物溶液可在與表面活性劑如羥丙基纖維素適當(dāng)混合的水中配制而成。分散劑也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和在油中配制。在通常的貯存和應(yīng)用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。
本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物和遞送載體可包括傳統(tǒng)的藥物制劑。施藥本發(fā)明的治療組合物可通過任何常見途徑進(jìn)行，只要靶組織可通過該途徑獲得即可。它包括經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道或者局部用藥。治療皮膚癌時(shí)局部施藥尤為有效，這樣可防止化療引起的脫發(fā)或者其它皮膚過量增生的疾病。也可通過常位的、真皮內(nèi)皮下的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或靜脈內(nèi)注射等方式施藥。這類組合物通常應(yīng)作為藥物上可接受的組合物施藥，該組合物包括生理上可接受的載體、緩沖劑或其它賦形劑。
本發(fā)明的治療組合物最好以作為液體溶液或懸浮液的可注射組合物形式而施藥；也可制備在注射前能溶于或懸浮于液體的固體制劑形式。這類制劑也可被乳化。這樣應(yīng)用的典型組合物包括藥物上可接受的載體。例如，這種組合物在每毫升磷酸鹽緩沖的鹽水中可含有10mg、25mg、50mg或多達(dá)約100mg人血清白蛋白。其它藥物上可接受的載體包括水溶液，無毒賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩沖劑等等。非水溶劑的實(shí)例有丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水，醇/水溶液，鹽水溶液，腸胃外載體如氯化鈉、林格葡萄糖等。靜脈載體包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。pH和藥物組合物各組分的準(zhǔn)確濃度依熟知參量調(diào)節(jié)。
其它配制劑適于經(jīng)口施藥?？诜渲苿┌ㄟ@種典型賦形劑如藥物級(jí)的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。組合物形式為溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋配制劑或粉狀物。如果是局部施藥，則藥物形式可以是乳油、軟膏、油膏或噴霧劑。
治療劑的有效量基于預(yù)期的目的而確定，例如(i)抑制腫瘤細(xì)胞增生或(ii)消除腫瘤細(xì)胞。術(shù)語“單位劑量”表示適用于受治療者的物理獨(dú)立的單位，每個(gè)單位含有預(yù)定量的治療組合物，計(jì)算的組合物量可產(chǎn)生上述預(yù)期響應(yīng)，與其施藥即合適的途徑和治療方案有關(guān)。待施藥的量依治療數(shù)量和單位劑量取決于受治療者、受治療者狀態(tài)和希望的防護(hù)。治療組合物的準(zhǔn)確量還依賴于醫(yī)師的診斷且因人而異。
G.試劑盒抑制腫瘤細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或檢測(cè)癌細(xì)胞所需的所有基本物質(zhì)和試劑可一起裝于試劑盒內(nèi)。它一般將包括選擇的表達(dá)構(gòu)建物。還包括復(fù)制該表達(dá)構(gòu)建物的各種介體和用于這種復(fù)制的宿主細(xì)胞。這類試劑盒包括盛放每種試劑的不同貯器。
當(dāng)試劑盒的組分以一種或多種液態(tài)溶液形式提供時(shí)，則液態(tài)溶液優(yōu)選是水溶液，而無菌水溶液是特別優(yōu)選的?；铙w內(nèi)應(yīng)用時(shí)，表達(dá)構(gòu)建物可被配制成藥物上可接受的可注射組合物。此時(shí)，貯器工具本身可以是吸入器、注射器、滴管、眼滴管或其它類似器械，配制劑可從這些器械被應(yīng)用于身體的感染區(qū)例如肺，被注入動(dòng)物，或者甚至應(yīng)用于試劑盒的其它組分并混合。
試劑盒的組分也可以干燥的或凍干的形式被提供。當(dāng)試劑或組分以干燥的形式提供時(shí)，通常加入適當(dāng)?shù)娜軇﹣碇匦屡渲?。預(yù)計(jì)該溶劑也可以另一個(gè)貯器工具提供。
本發(fā)明的試劑盒一般還包括盛裝小瓶的器械，其中的小瓶處于密封狀態(tài)以供商售，例如注射或吹塑成型的塑料貯器，其中裝有所需小瓶。
無論貯器的數(shù)量或類別如何，本發(fā)明的試劑盒還可包括或包裝有一個(gè)工具以便協(xié)助將最終復(fù)合體組合物注射/施藥或放置于動(dòng)物體內(nèi)。這種工具可以是吸入器、注射器、滴管、鉗子、測(cè)試匙(measured spoon)、眼滴管或任意這類醫(yī)療上許可的遞送工具。
下述實(shí)施例旨在闡述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)懂得，在代表本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)技術(shù)的實(shí)施例中公開的技術(shù)能很好地實(shí)施本發(fā)明，因而可視為構(gòu)成其實(shí)施時(shí)優(yōu)選的方式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書應(yīng)明白，可對(duì)于公開的具體實(shí)施方案作很多改變?nèi)阅塬@得相同的或類似的結(jié)果而不會(huì)脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和范圍。
實(shí)施例A.原料和方法細(xì)胞系。細(xì)胞系293被保存于Eagle′s改進(jìn)的基本培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)加10％熱滅活的馬血清。人NSCLC細(xì)胞系H226Br、H322生長于含有5％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中。人正常乳腺細(xì)胞系HBL100生長于補(bǔ)加10％胎牛血清的F12培養(yǎng)基中。
p16INK4cDNA亞克隆化。利用引物5′-ATGGAGCCTTCGGC TGACTGG-3′(SEQ ID NO3)和5′-CCTGTAGGACCTTCGGTGACT-3′(SEQID NO4)通過RT-PCRTM從正常人淋巴細(xì)胞的總RNA擴(kuò)增初始的p16INK4cDNA。PCRTM產(chǎn)物在pCRTM載體(Invitrogen，SanDiego，CA)中被亞克隆化并由雙鏈DNA測(cè)序而檢定。因?yàn)閜16INK4cDNA序列在GenBank中的校正，有42個(gè)堿基對(duì)的另一序列后來通過兩個(gè)PCRTM步驟被加入已克隆的p16INK4cDNA的5′端。第一個(gè)PCRTM步驟用到引物A(5′-GATCCGGCGG CGGGGGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGG-3′；SEQ ID NO5)和引物C(5′-GCCTCTCTGGTTCTTTCA-3′；SEQ ID NO6)。第二個(gè)PCRTM步驟用到引物B(5′-CGGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCGG CGGCGGGGAGC-3′；SEQ ID NO7)和引物C。pCRTM載體(pCR-p-16)中的最后的野生型p16INK4cDNA序列也由雙鏈DNA測(cè)序而檢定。
pAd-p16構(gòu)建。穿梭載體pEC53(Zhang等人，1994)被限制酶HinDIII和Hpa I消化。載體主鏈從p53 cDNA分離是通過使消化的DNA穿過1％瓊脂糖凝膠而進(jìn)行的并由該凝膠純化。p16INK4cDNA從pCR-p16切除后被連接到純化的穿梭載體主鏈上。最終產(chǎn)物pAd-p16攜帶p16INK4表達(dá)盒，該表達(dá)盒中包含人CMV啟動(dòng)子(Boshart等，1985)野生型p16INK4cDNA，和SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)。
重組p16INK4腺病毒的產(chǎn)生。重組Ad5CMV-lacZ腺病毒DNA用限制酶XbaI和ClaI消化，且32kb部分腺病毒DNA片段用0.3％瓊脂糖凝膠純化。該DNA片段和pAd-p16質(zhì)粒DNA由CaPO4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞被保持在培養(yǎng)基中直至開始出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)。新產(chǎn)生的p16INK4重組腺病毒(Ad-p16)通過對(duì)從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液制備的DNA樣品進(jìn)行PCRTM分析而得以鑒定。攜帶大腸桿菌(E.coli)的lacZ基因的重組腺病毒Ad5CMV-lacZ，具有類似于Ad-p16的結(jié)構(gòu)，所以用作這些研究中的對(duì)照物。
病毒貯存物，滴度和感染。Ad-p16和Ad5CMV-lacZ病毒各自的克隆均得自噬斑純化并按Graham和Prevec(1991)的方法在293細(xì)胞內(nèi)增殖。病毒滴度由噬斑分析測(cè)定。細(xì)胞系是這樣感染的將病毒溶液加入細(xì)胞單層，再在室溫下培養(yǎng)30min，其間每5min略微攪動(dòng)一次。然后加入培養(yǎng)基，再將感染后的細(xì)胞返回到37℃培養(yǎng)箱中。
致瘤性分析。在MOI為50PFU/細(xì)胞下用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ感染H460細(xì)胞。用培養(yǎng)基只作為模擬感染處理等量細(xì)胞。感染24小時(shí)之后，收集處理過的細(xì)胞并用PBS清洗兩次。每次處理時(shí)，將在0.1ml PBS中的5×106個(gè)細(xì)胞經(jīng)皮下注入BALB/c nu/nu小鼠(Harlan Sprague-Dawley Co.，Houston，TX)的背側(cè)。注射后每周檢查處理過的小鼠。3周周期結(jié)束時(shí)評(píng)估腫瘤生長情況。假設(shè)腫瘤為球形，由腫瘤平均直徑計(jì)算腫瘤體積；其中腫瘤平均直徑是作為正交直徑的乘積的平方根計(jì)算而得。
B.結(jié)果Ad-p16重組病毒的產(chǎn)生。腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體的優(yōu)點(diǎn)之一在于它在寬范圍的宿主細(xì)胞內(nèi)具有高感染性(Berkner，1988)。用于人癌基因治療、得自腺病毒的一種穿梭載體pEC53是以前構(gòu)建的(Zhang等人，1994)。得自該載體的重組病毒Ad5CMV-p53，在包括H460、H322和H226Br的幾種肺癌細(xì)胞系中感染性為97％-100％(Zhang等人，1994)。在該研究中，pEC53中的p53基因由全長p16INK4cDNA置換。最終產(chǎn)物pAd-p16攜帶p16INK4基因表達(dá)盒，其中含有人CMV啟動(dòng)子(Boshart等，1985)、野生型p16INK4cDNA、和SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)。通過Xba I消化重組病毒Ad5CMV-lacZ的DNA生成的腺病毒DNA的32kB部分片段，與pAd-p16質(zhì)粒一起被共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞供同源重組。重組病毒產(chǎn)物Ad-p16的基因組結(jié)構(gòu)類似于Ad5CMV-lacZ的結(jié)構(gòu)，只是lacZ基因被p16INK4基因置換了。由于重組腺病毒的E1區(qū)被p16INK4基因或lacZ基因表達(dá)盒取代了，所以它們只能在補(bǔ)充E1缺失的293細(xì)胞內(nèi)增殖。Ad5CMV-lacZ被用作Ad-p16的病毒對(duì)照物。
在人肺癌細(xì)胞中表達(dá)外源p16INK4蛋白質(zhì)。選取3種人NSCLC細(xì)胞系用于該研究H460、H322和H226Br。H460攜帶純合性p16INK4基因缺失(Kamb等，1994)，但p53基因(Takahashi等，1989)和Rb基因(Harbour等，1988)都是野生型。H322攜帶純合性p16INK4基因缺失(Okamoto等，1994)，野生型Rb基因(Harbour等，1988)，和在密碼子248上的純合性p53突變(Mitsudomi等，1992)。H226Br攜帶p16INK4基因，該基因由DNA印跡法和PCRTM分析檢測(cè)，它未曾被測(cè)序，但不在蛋白質(zhì)水平表達(dá)p16INK4。它在密碼子254上具有純合性p53突變(Fujiwara等，1994)并表達(dá)野生型Rb蛋白質(zhì)(Harbour等，1988)。培養(yǎng)的正常人乳腺上皮細(xì)胞系HBL100，表達(dá)野生型p16INK4、野生型p53和野生型RB基因，而且在本研究中用作正常細(xì)胞系對(duì)照物。只有細(xì)胞系HBL100在病毒感染前表達(dá)p16INK4蛋白質(zhì)。為達(dá)到高水平表達(dá)外源p16INK4蛋白質(zhì)，將人CMV啟動(dòng)子(Boshart等，1985)用于驅(qū)動(dòng)p16INK4基因的表達(dá)。在用Ad-p16感染后的H460、H322和H226Br細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高水平外源p16INK4蛋白質(zhì)表達(dá)。在Ad-p16感染后，HBL100中p16INK4的含量要高得多，指示該細(xì)胞系內(nèi)的外源p16INK4蛋白質(zhì)表達(dá)。然后，在如下分析中檢驗(yàn)該引入的p16INK4蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞系的效應(yīng)。
p16INK4蛋白質(zhì)對(duì)肺癌細(xì)胞生長的影響。NSCLC細(xì)胞系H460、H322和H226Br以及正常乳腺細(xì)胞系HBL100在50PFU/細(xì)胞下用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ感染。對(duì)于三組感染的和模擬感染的細(xì)胞每天計(jì)數(shù)達(dá)6天，計(jì)算每天的平均細(xì)胞數(shù)。如圖2所示，Ad-p16感染的H460、H322和H226Br細(xì)胞生長速度與Ad5CMV-lacZ感染的細(xì)胞相比分別被抑制94％、85％和97％。但是，用Ad-p16感染的HBL100生長速度與Ad5CMV-lacZ感染的HBL100細(xì)胞相比被抑制小于3％。這表明，將p16INK4基因引入這些細(xì)胞系會(huì)通過恢復(fù)p16INK4表達(dá)而特異性地抑制細(xì)胞增殖。對(duì)于所有細(xì)胞系來說，Ad5CMV-lacZ處理的細(xì)胞的生長速度小于模擬感染的細(xì)胞，指示由表達(dá)的病毒蛋白質(zhì)和lacZ基因引起的細(xì)胞毒性。當(dāng)應(yīng)用更高的MOI時(shí)，該病毒相關(guān)的細(xì)胞毒性得以增大。這些細(xì)胞系對(duì)于該效應(yīng)有不同的敏感性。
由Ad-p16介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯。已知p16INK4蛋白質(zhì)能抑制CDK4和CDK6的活性，因而封阻增殖細(xì)胞從G1階段進(jìn)入S階段(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。為了研究由Ad-p16介導(dǎo)的生長速度抑制機(jī)理，如生長速度分析中所述那樣感染H460、H322、H226Br和HBL100細(xì)胞，再在感染24小時(shí)后收集細(xì)胞用于由流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞周期分析。如表4所示，Ad-p16介導(dǎo)的p16INK4蛋白質(zhì)的表達(dá)，顯著增大p16INK4缺失的腫瘤細(xì)胞系內(nèi)G1階段中的細(xì)胞數(shù)并減少S階段和(G2+M)階段中的細(xì)胞數(shù)，表明引起了G1停滯。反之，在p16INK4蛋白質(zhì)陽性的正常乳腺細(xì)胞系HBL100中未觀測(cè)到G1停滯。這些結(jié)果說明，p16INK4蛋白質(zhì)通過在不表達(dá)p16INK4的細(xì)胞系內(nèi)介導(dǎo)G1停滯而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
表4流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析由Ad-p16介導(dǎo)的p16INK4的細(xì)胞周期效應(yīng)各階段中細(xì)胞百分?jǐn)?shù)細(xì)胞類別 &amp; 感染的病毒G0/G1S G2/MHBL100/Ad-p1636 4222HBL100/Ad5CMV-lacZ 31 4425HBL100/培養(yǎng)基31 4227H460/Ad-p16 88 9 3H460/Ad5CMV-lacZ 41 3227H460/培養(yǎng)基 39 3526H322/Ad-p16 80 6 14H322/Ad5CMV-lacZ 30 3634H322/培養(yǎng)基 30 3634H226Br/Ad-p1680 119H226Br/Ad5CMV-lacZ 20 5327H226Br/培養(yǎng)基26 4430給出了代表性分析的結(jié)果。按細(xì)胞生長速度測(cè)定分析中相同的方法感染細(xì)胞。感染24小時(shí)之后，用1％吐溫20處理細(xì)胞，并用碘化丙錠(propidium iodide)染色，然后由流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析DNA合成和細(xì)胞周期狀況。用裝有空氣冷卻的15mW 488nm氬激光的FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量分析。紅色熒光是通過長通濾波器(long pass filter)(截止波長650nm)測(cè)定的。
由Ad-p16介導(dǎo)的致瘤性的抑制。為了確定Ad-p16病毒是否能抑制人NSCLC細(xì)胞的致瘤性，對(duì)BALB/c nu/nu小鼠皮下注射H460細(xì)胞以導(dǎo)致形成腫瘤。每只小鼠接受5×106個(gè)細(xì)胞的一次注射，這些細(xì)胞已經(jīng)用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ在50PFU/細(xì)胞下感染達(dá)24小時(shí)。只用培養(yǎng)基處理過的H460細(xì)胞用作模擬感染的對(duì)照物。每次處理4只小鼠。觀測(cè)這些小鼠，當(dāng)出現(xiàn)腫瘤后對(duì)它們進(jìn)行為期3周的測(cè)試。進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立的研究以確證再現(xiàn)性，兩次研究的數(shù)據(jù)歸納于表5中。Ad-p16處理的細(xì)胞顯著抑制了活體內(nèi)腫瘤生長。接受了培養(yǎng)基處理過的細(xì)胞的100％小鼠和接受了Ad5/CMV-lacZ處理過的細(xì)胞的87.5％小鼠長出了腫瘤。另一方面，在兩個(gè)研究中，接受了Ad-p16處理過的細(xì)胞的小鼠只有50％長出腫瘤，而且腫瘤的平均體積只有Ad5CMV-lacZ病毒處理過的小鼠腫瘤的11％和培養(yǎng)基處理過的小鼠腫瘤的6％(p＜0.001，由雙側(cè)學(xué)生T-檢驗(yàn)檢定)。因此，肺癌細(xì)胞的致瘤性通過預(yù)先用Ad-p16處理而得以抑制，說明p16INK4蛋白質(zhì)能具有治療功效。
表5.p16INK4對(duì)裸鼠內(nèi)H460細(xì)胞系致瘤性的影響處理方法腫瘤數(shù)/小鼠數(shù) 平均體積(％) (mm3±SD)培養(yǎng)基 4/4(100％)1047.3±104.7實(shí)驗(yàn)1Ad5/CMV-LacZ4/4(100％)740.5±205.5Ad-p16 0/4(0％) -培養(yǎng)基 4/4(100％)1158.6±200.2實(shí)驗(yàn)2Ad5/CMV-LacZ3/4(75％) 658.3±144.3Ad-p16 4/4(100％)71.2±19.6在MOI為50PFU/細(xì)胞下用病毒感染H460細(xì)胞24小時(shí)，以5×106個(gè)細(xì)胞/小鼠進(jìn)行皮下注射。在3周結(jié)束后測(cè)定腫瘤大小。
研究了Ad-p16在BALB/c nu/nu小鼠模型中的治療潛能。用5×106個(gè)H460細(xì)胞皮下注射小鼠20天之后長出了皮下腫瘤小結(jié)。用Ad-p16(1010PFU/腫瘤)、Ad5CMV-lacZ(1010PFU/腫瘤)或PBS直接注射產(chǎn)生的腫瘤。如圖3所示，注射18天后，Ad-p16處理過的腫瘤平均體積只有對(duì)照病毒處理過的腫瘤的49％和用PBS注射過的腫瘤的34％(p＜0.001，由雙側(cè)學(xué)生T-檢驗(yàn)檢定)。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OF TEXASSYSTEM(B)街名201 West 7th Street(C)城市Austin(奧斯汀)(D)州名Texas(得克薩斯)(E)國別美國(F)郵政編碼(ZIP)78701(ii)發(fā)明名稱p16表達(dá)構(gòu)建物及其在癌治療中的應(yīng)用(iii)序列數(shù)7(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MC-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)優(yōu)先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/502,881(B)申請(qǐng)日期1995.7.17(C)分類未知(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度987個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGAGAGGGG GAGAACAGAC AACGGGCGGC GGGGAGCAGC ATGGAGCCGG CGGCGGGGAG 60CAGCATGGAG CCTTCGGCTG ACTGGCTGGC CACGGCCGCG GCCCGGGGTC GGGTAGAGGA120GGTGCGGGCG CTGCTGGAGG CGGGGGCGCT GCCCAACGCA CCGAATAGTT ACGGTCGGAG180GCCGATCCAG GTCATGATGA TGGGCAGCGC CCGAGTGGCG GAGCTGCTGC TGCTCCACGG240CGCGGAGCCC AACTGCGCCG ACCCCGCCAC TCTCACCCGA CCCGTGCACG ACGCTGCCCG300GGAGGGCTTC CTGGACACGC TGGTGGTGCT GCACCGGGCC GGGGCGCGGC TGGACGTGCG360CGATGCCTGG GGCCGTCTGC CCGTGGACCT GGCTGAGGAG CTGGGCCATC GCGATGTCGC420ACGGTACCTG CGCGCGGCTG CGGGGGGCAC CAGAGGCAGT AACCATGCCC GCATAGATGC480CGCGGAAGGT CCCTCAGACA TCCCCGATTG AAAGAACCAG AGAGGCTCTG AGAAACCTCG540GGAAACTTAG ATCATCAGTC ACCGAAGGTC CTACAGGGCC ACAACTGCCC CCGCCACAAC600CCACCCCGCT TTCGTAGTTT TCATTTAGAA AATAGAGCTT TTAAAAATGT CCTGCCTTTT660AACGTAGATA TAAGCCTTCC CCCACTACCG TAAATGTCCA TTTATATCAT TTTTTATATA720TTCTTATAAA AATGTAAAAA AGAAAAACAC CGCTTCTGCC TTTTCACTGT GTTGGAGTTT780TCTGGAGTGA GCACTCACGC CCTAAGCGCA CATTCATGTG GGCATTTCTT GCGAGCCTCG840CAGCCTCCGG AAGCTGTCGA CTTCATGACA AGCATTTTGT GAACTAGGGA AGCTCAGGGG900GGTTACTGGC TTCTCTTGAG TCACACTGCT AGCAAATGGC AGAACCAAAG CTCAAATAAA960AATAAAATAA TTTTCATTCA TTCACTC987(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度156個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu1 5 10 15Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu20 25 30Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro35 40 45Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu50 55 60Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg65 70 75 80Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val85 90 95Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg100 105 110Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg115 120 125Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg130 135 140Ile Asp Ala Ala Glu Gly pro Ser Asp Ile Pro Asp145 150 155(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGGAGCCTT CGGCTGACTG G 21(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO4CCTGTAGGAC CTTCGGTGAC T 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCCGGCGG CGGGGAGCAG CATGGAGCCT TCGGCTGACT GG42(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO6GCCTCTCTGG TTCTTTCA 18(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO7CGGGCGGGGA GCAGCATGGA GCCGGCGGCG GGGAGC 3權(quán)利要求
1.包括在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸受所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。
2.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，它進(jìn)一步包括聚腺苷酸化信號(hào)。
3.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，它進(jìn)一步包括選擇性標(biāo)記。
4.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸是cDNA。
5.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸是基因組DNA。
6.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸是cDNA/基因組DNA雜交體。
7.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述表達(dá)構(gòu)建物是復(fù)制缺損型腺病毒。
8.權(quán)利要求7的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述腺病毒至少缺乏一部分E1區(qū)。
9.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸以相對(duì)于所述啟動(dòng)子的有義取向定位。
10.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸以相對(duì)于所述啟動(dòng)子的反義取向定位。
11.一種藥物組合物，它包括(i)包含在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸受所述啟動(dòng)予的轉(zhuǎn)錄控制，和(ii)藥物上可接受的緩沖劑、溶劑或稀釋劑。
12.使缺乏p16功能的細(xì)胞恢復(fù)p16功能的方法，該方法包括如下步驟(i)提供包含在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸的表達(dá)構(gòu)建物，所述核酸受所述啟動(dòng)子的控制而且核酸以相對(duì)于所述啟動(dòng)子的有義取向定位；和(ii)將所述表達(dá)構(gòu)建物與缺乏p16功能的所述細(xì)胞接觸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞且所述接觸使所述轉(zhuǎn)化的表型反向。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是肺癌、膀胱癌或黑素瘤細(xì)胞。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建物是復(fù)制缺損型腺病毒。
17.抑制細(xì)胞中的p16功能的方法，該方法包括(i)提供包含在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸的表達(dá)構(gòu)建物，所述核酸受所述啟動(dòng)子的控制而且以相對(duì)于所述啟動(dòng)子的反義取向定位；和(ii)將所述表達(dá)構(gòu)建物與所述細(xì)胞接觸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞通過所述接觸被轉(zhuǎn)化。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建物是復(fù)制缺損型腺病毒。
20.治療患癌的哺乳動(dòng)物的方法，它包括(i)提供藥物組合物，該組合物包括(a)包含在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸的腺病毒，所述核酸受所述啟動(dòng)子的控制且以相對(duì)于所述啟動(dòng)子的有義取向定位，和(b)藥物上可接受的緩沖劑、溶劑或稀釋劑；和(ii)對(duì)所述哺乳動(dòng)物施藥該藥物組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述施藥是通過靜脈注射進(jìn)行的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述施藥是通過常位注射進(jìn)行的。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述癌是肺癌、膀胱癌或黑素瘤。
25.一種試劑盒，它以合適的貯器方式包括含有在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和編碼p16的核酸的表達(dá)構(gòu)建物，其中所述核酸受所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制，和藥物上可接受的緩沖劑、溶劑或稀釋劑。
26.通過檢測(cè)編碼p16的核酸而檢測(cè)樣品中癌細(xì)胞的方法。
27.通過檢測(cè)p16而檢測(cè)樣品中癌細(xì)胞的方法。
全文摘要
公開了多種基因構(gòu)建物,它們可在體外或活體內(nèi)用于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域中癌的治療。具體地說,提供了含有p16編碼區(qū)和表達(dá)p16轉(zhuǎn)錄物所需的其它調(diào)節(jié)元件的表達(dá)構(gòu)建物。表達(dá)構(gòu)建物的一個(gè)型式是復(fù)制缺損型腺病毒載體。還提供了轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和抑制癌細(xì)胞增殖的方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1203632SQ9619653
公開日1998年12月30日 申請(qǐng)日期1996年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月17日
發(fā)明者X·金, J·羅斯 申請(qǐng)人:德克薩斯州立大學(xué)董事會(huì)