專利名稱：絲狀藍(lán)藻水溶性多糖及胞外多糖的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻多糖的提取分離，特別涉及絲狀藍(lán)藻水溶性多糖及胞外多糖的提取分離方法。
藍(lán)藻或稱藍(lán)細(xì)菌是自然界分布最廣的光合原核生物，可以生活在海水和淡水中，也可以生活在亞氣生的潮濕土壤和巖石上，還可以出現(xiàn)在各種非常惡劣的環(huán)境中。有些絲狀藍(lán)藻長(zhǎng)期以來(lái)被用作食品來(lái)源，如螺旋藻被用作有價(jià)值的食品添加劑；在我國(guó)，發(fā)菜、葛仙米和地木耳等念珠藻是傳統(tǒng)的珍奇佳肴，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有良好的食用和藥用價(jià)值，在《本草綱目》和《本草綱目拾遺》等書(shū)上有詳細(xì)記載。藻類多糖是迄今藻類產(chǎn)品中應(yīng)用最多的產(chǎn)品且極具應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景，但至今對(duì)藻類多糖的研究主要集中在大型海藻，對(duì)藍(lán)藻和其它微藻多糖的研究極少，國(guó)內(nèi)對(duì)藍(lán)藻多糖的研究幾乎僅局限于螺旋藻的多糖。
中國(guó)專利文獻(xiàn)1、螺旋藻水溶性多糖的提取方法，分類號(hào)C08B 37/04，申請(qǐng)日94.05.16，公告日95.11.22，申請(qǐng)?zhí)?4105389，申請(qǐng)人華南師范大學(xué)。該發(fā)明是一種螺旋藻水溶性多糖的提取方法，具體是采用堿溶液抽提，用有機(jī)酸中和。2、從螺旋藻中提取蛋白質(zhì)和多糖的方法及其應(yīng)用，分類號(hào)C07K 1/14，申請(qǐng)日94.08.24，公告日95.08.09，申請(qǐng)?zhí)?4112454，申請(qǐng)人沈陽(yáng)醫(yī)藥工業(yè)研究所。該發(fā)明涉及從螺旋藻中提取蛋白質(zhì)和多糖的方法，具體是在5-15℃時(shí)浸泡提取5-20小時(shí)，重復(fù)三次，經(jīng)進(jìn)一步提取、沉淀等方法制得蛋白質(zhì)和多糖。以上二項(xiàng)專利只是針對(duì)螺旋藻水溶性多糖而言，未對(duì)胞外多糖進(jìn)行提取分離。
中國(guó)非專利文獻(xiàn)1、螺旋藻抗輻射多糖的提純和分析，龐啟深、郭寶江、阮繼紅，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1989.21:445-449。該文獻(xiàn)報(bào)道了從螺旋藻中提取具有抗輻射活性的水溶性多糖的方法。2、極大螺旋藻多糖的分離、純化及其抗氧化特性的研究，周志剛、劉志禮、劉雪嫻，植物學(xué)報(bào)，1997,39:77-81。該文獻(xiàn)報(bào)道螺旋藻多糖具有顯著的清除羥自由基的作用。以上2篇文獻(xiàn)只是針對(duì)螺旋藻的水溶性多糖進(jìn)行了提取和純化，未對(duì)胞外多糖進(jìn)行研究。3、藍(lán)細(xì)菌多糖及其應(yīng)用研究概況，黃澤波、劉永定，生物技術(shù)通報(bào)，1997，第4期26-32。該文獻(xiàn)介紹了藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)藻)多糖的研究進(jìn)展并分析了它們潛在的應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)藍(lán)藻多糖的提取分離方法未進(jìn)行系統(tǒng)綜述。
國(guó)外非專利文獻(xiàn)1.Polysaccharides from cyanobacteria.Bertocchi,C.,Navarini,L.,Ces*ro,A.&Anastasio,M.,Carbohydrate Polymers,1990,12:127-153，該文獻(xiàn)對(duì)藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)藻)多糖的研究進(jìn)行了綜述，著重闡述了藍(lán)藻多糖的組分，但對(duì)藍(lán)藻多糖的提取分離方法未進(jìn)行闡釋。2．Polysaccharides in desert reclamation:compositions of exocellularproteoglycan complexes produced by filamentous blue-green andunicellular green edaphic algae.Flaibani,A.,Olsen,Y.&Painter.T.J.,Carbohydrate Research,1989,190:235-238。該文獻(xiàn)對(duì)一種念珠藻(和一種單細(xì)胞綠藻)分泌的胞外多糖的組分進(jìn)行了分析。3．Extraction,purification and identification of polysaccharides of Spirulina(Arthrospira)platensis(Cyanophyceae).Tseng,C.T.&Zhao.Y.Algological Studies,1994,75:303-312。該文獻(xiàn)針對(duì)螺旋藻的水溶性多糖進(jìn)行了提取和分析。
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于常見(jiàn)絲狀藍(lán)藻水溶性多糖及其分泌到培養(yǎng)基中的胞外多糖的高效通用提取分離技術(shù)，為充分利用絲狀藍(lán)藻的多糖提供一種方便實(shí)用的方法。
為了實(shí)現(xiàn)該目的，其主要技術(shù)方案是通過(guò)脫色去雜、熱水提取、乙醇沉淀、真空干燥等步驟提取水溶性多糖；通過(guò)離心抽濾、減壓濃縮、透析脫鹽、真空干燥等步驟提取胞外多糖；酸性胞外多糖也可在脫細(xì)胞培養(yǎng)液中直接用季銨鹽沉淀制得；通過(guò)脫蛋白、陰離子交換層析、真空干燥等步驟分離純化水溶性多糖與胞外多糖。
應(yīng)用本技術(shù)方案，對(duì)常見(jiàn)的19種絲狀藍(lán)藻普通念珠藻(Nostoc commune,地木耳)、發(fā)狀念珠藻(N.flagelliforme，發(fā)菜)、擬球狀念珠藻(N.sphaeroides，葛仙米)、念珠藻(Nostoc sp.)HB856、稻田魚(yú)腥藻(Anabaenaoryzae)HB13、固氮魚(yú)腥藻(A.azotica)HB686、球孢魚(yú)腥藻(A.sphaerica)HB1017、多變魚(yú)腥藻(A.variabilis)HB1058、魚(yú)腥藻(Anabaena sp.)HB1042、魚(yú)腥藻(Anabaeua sp.)HB1105、繁育管鏈藻(Aulosirafertilissima)、微囊藻(Microcystis spp.)、裂須藻(Schizothrix sp.)、微鞘藻(Microcoleus sp.)、席藻(Phormidium sp.)、單歧藻(Tolypothrix sp.)、偽枝藻Scytonema sp.)、鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)和極大螺旋藻(S.maxima)等水溶性多糖及胞外多糖進(jìn)行提取分離試驗(yàn)比較，表明有如下效果
1、本提取分離方法適用于絲狀藍(lán)藻；2、可同時(shí)從絲狀藍(lán)藻藻體和培養(yǎng)液中分別提取分離水溶性多糖和胞外多糖，充分利用其資源；3、酸性胞外多糖可在制得脫細(xì)胞培養(yǎng)液后直接用季銨鹽沉淀制得；4、數(shù)種念珠藻多糖具有很強(qiáng)的補(bǔ)體激活活性和很高的粘度，可用作免疫增強(qiáng)劑和食品工業(yè)中的增稠劑；5、操作方便，不需要特殊設(shè)備，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
實(shí)施例1．水溶性多糖的提取(1)脫色去雜 取絲狀藍(lán)藻(鮮藻或干藻)若干，粉碎后加80％(v/v)的乙醇溶液浸泡。干藻不易粉碎的，可直接浸泡，待以下第(2)步水浸后再攪碎；浸泡量因藍(lán)藻種類不同而異，浸泡干藻時(shí)一般為每克藻樣加20-100ml乙醇溶液。
藻樣在用80％的乙醇溶液在室溫下浸泡過(guò)夜后，于50℃攪拌提取2小時(shí)，過(guò)濾以除去小分子和有色雜質(zhì)。收集藻樣，加上述浸泡量一半體積以上的乙醇溶液再提取1小時(shí)。過(guò)濾收集藻樣，加無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，并讓乙醇自然揮發(fā)。
(2)熱水提取 上述脫色去雜后的藻樣，加蒸餾水在室溫下浸泡過(guò)夜。加水量因藍(lán)藻種類不同而異，為藻樣干重的10-100倍一般種類加水10-20倍，葛仙米、地木耳等極易吸水的種類則加水50-100倍。
藻樣浸透后，在80-100℃下攪拌提取2-3小時(shí)，自然冷卻至室溫，離心(5000-6000g,15-30分鐘)，保留上清液。藻渣再加上述用水量一半以上的蒸餾水在同樣溫度下提取1小時(shí)，離心收集上清液，合并二次提取液。過(guò)于粘稠的提取物，如葛仙米的提取液，在難以離心時(shí)可采用4層紗布趁熱過(guò)濾等方法來(lái)分離提取液與不溶物。
(3)減壓濃縮 將上述提取液在40-50℃下減壓濃縮至原體積的五到二十分之一。
(4)乙醇沉淀 將上述濃縮液用乙醇進(jìn)行沉淀，乙醇的終濃度為80％(v/v)。過(guò)濾收集沉淀物，用無(wú)水乙醇、無(wú)水丙酮洗滌數(shù)次以進(jìn)一步脫色去雜。沉淀物經(jīng)真空干燥制得粗多糖。
實(shí)施例2．胞外多糖的制備(1)脫細(xì)胞 離心收集絲狀藍(lán)藻后的培養(yǎng)液，經(jīng)抽濾并過(guò)0.45m多孔濾膜，制得脫細(xì)胞培養(yǎng)液。
(2)減壓濃縮 將上述脫細(xì)胞培養(yǎng)液在40-50℃下減壓濃縮至原體積的十到二十分之一。
(3)脫鹽、沉淀 將上述濃縮液先經(jīng)透析(分子截流量為3500道爾頓)脫鹽、去除小分子雜質(zhì)，再冷凍干燥制得胞外多糖?；?qū)⑸鲜鰸饪s液直接按實(shí)施例1之(4)的方法用乙醇沉淀、反復(fù)數(shù)次以脫鹽去雜，再用無(wú)水乙醇、無(wú)水丙酮洗滌，真空干燥，制得胞外多糖。
若制備酸性胞外多糖，可采用加少量季銨鹽的方法直接將多糖從脫細(xì)胞培養(yǎng)液中沉淀出來(lái)，再經(jīng)80％(v/v)乙醇溶液、無(wú)水乙醇、無(wú)水丙酮洗滌后干燥，從而制得胞外多糖。沉淀胞外多糖時(shí)所加的季銨鹽有溴代十六烷基三甲銨(CTAB)、十六烷基鹽酸吡啶(CPC)等，用量為100-200mg/L，方法一般是將CTAB或CPC等配制成小于10％的溶液后再加入，但也可以直接溶于脫細(xì)胞培養(yǎng)液。
實(shí)施例3．多糖的分離純化(1)去蛋白 如果需要將粗多糖中的蛋白質(zhì)去掉，可采用Sevag法或蛋白酶解法進(jìn)行。若采用Sevag法，一般是加入與多糖溶液(1-10％)等體積的氯仿-正丁醇(5∶1,v/v)混合液，充分混勻，離心(1500g,10分鐘)，取上層水相。重復(fù)進(jìn)行數(shù)次后，加入乙醇(終濃度80％,v/v)沉淀多糖。
采用酶解法時(shí)，可分別向多糖溶液加入胃蛋白酶和胰蛋白酶在37±2℃下分別酶解1-2小時(shí)。所加酶量因酶活單位和藻種不同而有較大差異，以酶解、透析(MWCO=3500)后多糖樣品中蛋白含量降至合乎要求為準(zhǔn)(如小于2％)。
(2)陰離子交換層析 將粗多糖或上述去蛋白后的多糖樣品加熱溶解于蒸餾水(-1-10mg/ml)，過(guò)0.45m多孔濾膜后在DEAE-Sepharose等陰離子交換層析柱上進(jìn)行層析，用蒸餾水、1.0M和2.0M NaCl進(jìn)行逐步洗脫，用苯酚-硫酸法監(jiān)測(cè)糖量，分部收集洗出物，分別濃縮、透析后凍干，或用乙醇沉淀后真空干燥。所得各部多糖樣品中，水洗出物為中性多糖，鹽洗出物為酸性多糖。
實(shí)施例4．葛仙米、地木耳和發(fā)菜等念珠藻天然樣品補(bǔ)體激活活性多糖的提取分離及其運(yùn)動(dòng)粘度(1)脫色去雜 取葛仙米、地木耳和發(fā)菜風(fēng)干天然藻樣若干，浸泡于80％(v/v)的乙醇溶液，浸泡量為每克藻樣40ml乙醇溶液。在室溫下浸泡過(guò)夜后，于50-C攪拌提取2小時(shí)，過(guò)濾，收集藻樣，加同體積80％的乙醇溶液再提取1小時(shí)。過(guò)濾收集藻樣，加無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，并讓乙醇自然揮發(fā)。
(2)熱水提取 上述脫色去雜后的藻樣，用適量蒸餾水在室溫下浸泡過(guò)夜。用攪拌器將吸水膨脹后的藻樣打散，再加適量蒸餾水(二次加水總體積為每克藻樣100毫升)后在100*C下攪拌提取3小時(shí)。趁熱用4層紗布過(guò)濾以分離葛仙米提取液與不溶物；但地木耳和發(fā)菜的提取液，在自然冷卻至室溫后，采用離心(6000g,30分鐘)法分離，保留上清液。藻渣再加同體積的蒸餾水在同樣溫度下提取1小時(shí)，紗布過(guò)濾(葛仙米)或離心(地木耳、發(fā)菜)，合并二次提取液。
(3)乙醇沉淀 將上述提取液在40℃下減壓濃縮至原體積的五分之一后，加入乙醇進(jìn)行沉淀，乙醇的終濃度為80％(v/v)。過(guò)濾收集沉淀物，用無(wú)水乙醇、無(wú)水丙酮洗滌數(shù)次，經(jīng)真空干燥制得粗多糖。這樣制得的粗多糖都為絮狀物，色澤基本為白色，但葛仙米和地木耳多糖略帶微黃色，發(fā)菜多糖略帶灰色。葛仙米、地木耳和發(fā)菜多糖的得率分別為40％、30％和17％。
(4)粗多糖的精制 取上述紗布過(guò)濾的葛仙米粗多糖加熱溶解于適量蒸餾水，冷卻后離心，取上清液，采用上述乙醇沉淀、無(wú)水乙醇和無(wú)水丙酮洗滌、真空干燥的辦法精制。
取三種念珠藻的粗多糖加熱溶解于蒸餾水配制成10％的水溶液，采用Sevag法去蛋白，即加入與多糖溶液等體積的氯仿-正丁醇(5∶1,v/v)混合液，充分混勻，離心(1500g,10分鐘)，取上層水相。重復(fù)進(jìn)行4次后，加入乙醇(終濃度80％,v/v)沉淀多糖，用無(wú)水乙醇、無(wú)水丙酮洗滌后真空干燥。
(5)陰離子交換層析將多糖樣品加熱溶解于蒸餾水(1.5mg/ml)，過(guò)0.45m多孔濾膜(Acro 50A)后在DEAE-Sepharose Fast Flow柱(5-40cm,Pharmacia)上進(jìn)行陰離子交換層析，用蒸餾水、1.0M和2.0M NaCl進(jìn)行逐步洗脫，用苯酚-硫酸法監(jiān)測(cè)糖量，分部收集洗出物，分別濃縮、透析后凍干。其中，發(fā)菜多糖在經(jīng)該層析柱后用2.0M NaCl進(jìn)行洗脫時(shí)未檢測(cè)到糖樣。
(6)生物活性 經(jīng)檢測(cè)，按上述方法制備的多糖(包括粗多糖和分離純化后的多糖)具有很強(qiáng)的補(bǔ)體激活活性。其中，經(jīng)陰離子交換層析后，酸性多糖的活性明顯高于中性多糖。
(7)運(yùn)動(dòng)粘度 上述多糖具有較高的粘度，0.1％的上述各類多糖水溶液在25±0.01℃下的運(yùn)動(dòng)粘度(a)經(jīng)4層紗布過(guò)濾制得的葛仙米粗多糖為4.79厘斯，該多糖經(jīng)溶解于蒸餾水、離心、乙醇沉淀、干燥后制得的多糖為6.61厘斯，該樣品經(jīng)陰離子交換層析后制得的蒸餾水、1M和2M NaCl洗脫物分別為0.95、141、1.45厘斯；(b)地木耳粗多糖、經(jīng)陰離子交換層析后制得的蒸餾水、1M和2M NaCl洗脫物分別為4.16、1.76、1.18、1.12厘斯；(c)發(fā)菜粗多糖、經(jīng)陰離子交換層析后制得的蒸餾水和1M NaGl洗脫物分別為3.10、1.20、1.20厘斯。
實(shí)施例5．念珠藻胞外聚合物的制備及其運(yùn)動(dòng)粘度(1)培養(yǎng)條件 地木耳和發(fā)菜藻種為中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)提供的Nostoc commune FACHB 261、N.flagelliforme FACHB 838。葛仙米為從天然群體中無(wú)菌分離出的藻種。培養(yǎng)基為Woods Hole MBL液體培養(yǎng)基(有或無(wú)NaNO3)，容積為10升，溫度為28*1*C，光強(qiáng)為160mE·m-2·s-1，通加濕的壓縮空氣，接種量為20ml(光密度為1.0,1=750nm，光徑5cm)，共培養(yǎng)18天。
(2)胞外聚合物的制備 離心收獲念珠藻后的培養(yǎng)液，經(jīng)抽濾并過(guò)0.45m多孔濾膜(Acro 50A)，制得脫細(xì)胞培養(yǎng)液。在40℃下減壓濃縮至-500ml后，用Spectra/Por透析袋(MWCO=3500)進(jìn)行透析，冷凍干燥，制得胞外聚合物。從上述有氮和無(wú)氮培養(yǎng)基中分離的胞外聚合物與生物量的比例分別為葛仙米28％和31％；地木耳66％和15％；發(fā)菜22％和20％。其中，經(jīng)檢測(cè)，葛仙米的胞外聚合物含糖量較低，但地木耳和發(fā)菜胞外聚合物主要為多糖類物質(zhì)。
(3)運(yùn)動(dòng)粘度 在25±0.01℃下，從有氮和無(wú)氮培養(yǎng)基中分離的胞外多糖水溶液(0.1％)的運(yùn)動(dòng)粘度分別為葛仙米0.95和0.94厘斯；地木耳3.45和1.77厘斯；發(fā)菜1.01和1.08厘斯。
權(quán)利要求
1.一種適用于絲狀藍(lán)藻水溶性多糖及胞外多糖的提取分離方法，其特征是A、通過(guò)脫色去雜、熱水提取、乙醇沉淀、真空干燥步驟提取水溶性多糖；通過(guò)離心抽濾、減壓濃縮、透析脫鹽、真空干燥步驟提取胞多糖；酸性胞外多糖也可在脫細(xì)胞培養(yǎng)液中直接用季銨鹽沉淀制得；通過(guò)脫蛋白、陰離子交換層析、真空干燥步驟分離純化水溶性多糖與胞外多糖；B、葛仙米、地木耳和發(fā)菜天然樣品的補(bǔ)體激活活性粗多糖的提取得率分別為40％、30％和17％；在25±0.01℃下，它們水溶液(0.1％)的運(yùn)動(dòng)粘度分別為6.61、4.16和3.10厘斯；其胞外多糖的水溶液(0.1％)在同樣條件下的運(yùn)動(dòng)粘度分別為0.94-0.95厘斯、1.77-3.45厘斯、1.01-1.08厘斯。
全文摘要
本發(fā)明是一種適用于常見(jiàn)絲狀藍(lán)藻水溶性多糖及胞外多糖的高效通用提取分離方法。其中,水溶性多糖的提取主要包括脫色去雜、熱水提取、乙醇沉淀、真空干燥等步驟;胞外多糖的制備主要包括離心抽濾、減壓濃縮、透析脫鹽、真空干燥等步驟;酸性胞外多糖也可在脫細(xì)胞培養(yǎng)液中直接用季銨鹽沉淀得到;多糖的分離純化主要包括脫蛋白和陰離子交換層析等步驟。該方法適用于念珠藻、魚(yú)腥藻、微囊藻、螺旋藻、席藻等常見(jiàn)的絲狀藍(lán)藻,其中數(shù)種念珠藻多糖具有很強(qiáng)的補(bǔ)體激活活性和很高的粘度,可用作免疫增強(qiáng)劑和食品工業(yè)中的增稠劑。該方法簡(jiǎn)單易行,不需要特殊設(shè)備,適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1220999SQ97109350
公開(kāi)日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年12月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月25日
發(fā)明者黃澤波, 劉永定, 胡春香, 鄒永東, 陳浩峰, 沈銀武, 宋立榮, 何家菀 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所