專利名稱：來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的核糖體失活蛋白及其制備和應用。
在本文中，核糖體失活蛋白可被定義為至少具有下列活性之一的蛋白質RNA-N糖苷酶活性，引產蛋白活性，抗病毒特別是抗HIV的活性。該蛋白是寡聚的單肽鏈的簡單蛋白或糖蛋白。
來源于高等植物的核糖體失活蛋白基于它們的分子結構主要分為兩類，類型I蛋白僅有單肽鏈和致核糖體失活活性，該蛋白典型的例子是來自葫蘆科的天花粉蛋白(Trichosanthin簡稱TCS)，苦瓜子蛋白(Momorcharin簡稱MOM)，絲瓜子蛋白(Luffin)，來自石竹科的肥皂草素(Saporin)。類型II蛋白具有二條肽鏈，A鏈具致核糖體失活活性，B鏈具凝集素類活性。該類蛋白的典型代表是蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白。雖然兩種類型蛋白所含肽鏈數不同，但它們都通過裂解核糖體內28S rRNA的4324位腺嘌呤的N-糖苷鍵，而使真核生物細胞核糖體60S亞基失活(Endo and Tsurugi 1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F.et al.1988，Nucl.Acid Res.161349-1357)。
已經從葫蘆科，石竹科，商陸科，大戟科植物的不同組織分離到許多種核糖體失活蛋白。從葫蘆科植物的瓜蔞塊根中分離出天花粉蛋白和TAP29，從瓜蔞種子中分離出Trichokilin，從苦瓜子種子中分離出α-Momorcharin和β-Momorcharin(簡稱α，β-MOM)，從絲瓜(Luffa cylindrica)中分離出Luffin-a，b。目前Trichosanthin，α，β-Momorcharin和Luffin-a，b已經測定了完整的氨基酸順序。
H.W.Yeung et al也曾從八棱絲瓜中分離出一種Luffaculin(H.W.Yeunget al.Int.J.Peptide Protein Res.38，1991，15-19)，但他們所獲得的八棱瓜蛋白產率低(120mg/Kg種子)活性低(只相當于Luffin的1/9)。
本發(fā)明的目的在于尋找一種產率更高，而且純度更高的新的核糖體失活蛋白。
本發(fā)明從八棱絲瓜種子中分離出2種核糖體失活蛋白，SDS-PAGE顯示它們的分子量為28KD，等電點PI＞9。蛙卵活性測試(熊用周等，中國科學B輯，587-594，1992)表明它們具有強烈抑制細胞內核糖體蛋白質合成活性。其中一種Luffaculin 1的N端5個氨基酸順序已被測定為Asp-Val-Ser-Phe-Ser-，并比較了它與同屬的Luffa cylindrica種子中分離的Luffin-a，b的頭幾個氨基酸順序以及TCS、α，β-MOM的頭幾個氨基酸順序皆有不同，見附錄。
本發(fā)明采用簡化、溫和的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、硫酸銨沉淀、CM-纖維素梯度洗脫、DEAE-纖維素過濾、CM-纖維素再次梯度洗脫。本發(fā)明的方法比現在技術采用脫殼、有機試劑脫脂更簡化、更溫和。同時在第一次CM-纖維素梯度洗脫后增加了DEAE-纖維素過濾和CM-纖維素再次層析，獲得了高產率、高純度和高活性的蛋白。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以用作引產藥物并用于治療滋養(yǎng)層細胞有關的腫瘤、惡性腫瘤疾病，如絨癌等，也可以作為天花粉蛋白的替代藥物，用于克服反復使用產生的免疫反應。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以用作抗病毒，特別是抗HIV的試劑，也可作為天花粉蛋白治療艾滋病的替代藥物，用于克服反復使用產生的免疫反應。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以作為N-糖苷酶用于分子生物學和免疫學研究。
本發(fā)明與現有技術相比，具有以下積極效果(1).可以利用來源豐富的八棱絲瓜種子，采用溫和的提取方法，收率高(可達500mg/Kg種子)，而且對細胞體內蛋白質合成活性比Heung獲得的蛋白高出8-9倍(蛙卵活性測試)。
(2).已經檢測了八棱瓜蛋白1的N端5個氨基酸順序為DVSFS，與現有已知的核糖體失活蛋白的N端順序均不同，因此可以作為這類引產、抗病毒蛋白的替代品以克服核糖體失活蛋白(如TCS)反復使用產生的免疫反應。
現在對附圖作圖面說明

圖1.顯示對Luffaculin 1和2進行純化的陽離子交換色譜。
圖2.顯示對Luffaculin 1進行再純化的陽離子交換色譜。
圖3.顯示對Luffaculin 1進行純度鑒定的毛細管色譜。
圖4.顯示圖1的Luffaculin 1和2的SDS-PAGE圖。
圖5.顯示圖2的Luffaculin 1的SDS-PAGE圖。
下面結合附圖通過實施例來進一步描述本發(fā)明實施例1.從八棱瓜種子中純化Luffaculins取200g的八棱瓜種子(購自福建漳州菜籽店)，經粉碎機粉碎后加500ml的0.2MNaCl溶液，置4℃浸泡，勻漿二次，用幾層紗布過濾或離心得濾液700ml，加1N HCl調pH3.8靜置2h，用濾紙過濾或離心得濾液600ml，加固體硫酸銨至40％飽和度，過濾去掉殘渣，上清液續(xù)加固體硫酸銨至95％飽和度，靜置后離心得硫酸銨沉淀，加10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2 100ml溶解。裝入透析袋，然后對5mM磷酸鈉緩沖液pH6.5溶液透析24h，其間三次換透析外液。透析后粗提液離心(10,000rpm 15’，4℃)后上CM-纖維素-52柱(Backman產品)(28×2.6cm)(預先用5mM磷酸鈉緩沖液pH6.5平衡好)經洗脫2個床體積平衡液后，用0～0.3MNaCl 5mM磷酸鈉緩沖液pH6.5作梯度洗脫，洗脫液通過實時測量于280nM吸收率而檢驗蛋白，見圖1。組分73-77即為Luffaculin 1，組分86、87即為Luffaculin 2。SDS-PAGE見附圖4，合并組分73-77，裝入透析袋，對10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2透析，透析液加入DEAE-纖維素-52(Backman產品)(預先用10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2平衡)攪拌后過濾，濾液上CM-纖維素-52(Backman產品)(11×1.6cm)(預先用10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2平衡)，然后用0～0.5MNaCl于10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2梯度洗脫，洗脫液通過實時測量于280nM吸收率而檢驗蛋白，見附圖2，組分103和104即為純化的Luffaculin 1，見附圖5。實施例2.Luffaculin 1純度分折經二次CM-纖維素-52純化的Luffaculin 1用PF公司的ABI173 MicroBlotte Capillary HPLC System PE-173毛細管色譜儀C18柱，洗脫液A液(0.1％三氟乙酸)，B液(100％乙腈+0.086％三氟乙酸)以15％B-65％B作為梯度洗脫(140分鐘)并于210nM檢測蛋白，在保留時間84分鐘處獲得單一蛋白峰，見附圖3。毛細管色譜分析表明本發(fā)明的提取方法獲得的蛋白純度高，同時還可以從實施例3中可以看出，經二次CM-纖維素-52分離純化的Luffaculin 1已達N端一致。實施例3.Luffaculin 1N端氨基酸順序分析經二次CM-纖維素-52純化的Luffaculin 1用PE公司的AppliedBiosysterns 476A Protein Sequencer分析N端氨基酸順序，結果如下Asp-Val-Ser-Phe-Ser-實施例4.
本發(fā)明的八棱瓜蛋白1和2經蛙卵活性測試表明其活性比Heung獲得的蛋白高出8-9倍。該項測試表明本發(fā)明的Luffaculin 1和2可以作為TCS、Luffin類高效的引產蛋白和抗病毒蛋白及其替代物。
附錄八棱瓜蛋白1與Luffin-a.b、TCS、α，β-MOM，N端氨基酸順序比較Luffaculin 1DVSFSLuffin-aDVRFSLSGSSLuffin-bANVSFSLSGADTCS DVSFRLSGATα-MOM DVSFRLSGATβ-MOM DVNFDLSTAT
權利要求
1.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白——八棱瓜蛋白1(Luffaculin 1)，其特征在于N端氨基酸順序為Asp-Val-Ser-Phe-Ser-，分子量(SDS-PAGE檢測)為28KD。
2.根據權利要求1所述的八棱瓜蛋白1，其特征在于，它具有強烈抑制細胞內核糖體蛋白質合成活性。
3.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白——八棱瓜蛋白2(Luffaculin 2)，其特征在于，它的分子量(SDS-PAGE檢測)為28KD。
4.根據權利要求3所述的八棱瓜蛋白2，其特征在于，它具有強烈抑制細胞內核糖體蛋白質合成活性。
5.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、硫酸銨沉淀、CM-纖維素梯度層析、DEAE-纖維素過濾、CM-纖維素二次層析，其特征在于通過DEAE-纖維素過濾和CM-纖維素二次層析。
6.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白——八棱瓜蛋白，其特征在于，它能作為引產蛋白用于引產，治療相關腫瘤病、癌癥和病毒性感染疾病，特別是艾滋病毒感染。
全文摘要
從葫蘆科植物八棱絲瓜種子中分離出2種核糖體失活蛋白—八棱瓜蛋白1和2,其分子量都是28KD(SDS－PAGE檢測)。八棱瓜蛋白1的N端5個氨基酸殘基為DVSFS。采用了簡化的溫和的提取方法,獲得了高產率,高純度,高活性的蛋白。該蛋白具有作為引產藥物和抗病毒制劑的商業(yè)應用,并可作為N－糖苷酶用于分子生物學和免疫學研究。
文檔編號C07K7/06GK1199738SQ9711260
公開日1998年11月25日 申請日期1997年5月16日 優(yōu)先權日1997年5月16日
發(fā)明者陳明晃, 林玉娟, 葉曉明 申請人:中國科學院福建物質結構研究所