專(zhuān)利名稱(chēng)：用于病原體及相關(guān)抗生素抗性基因檢測(cè)以進(jìn)行診斷的種、屬特異性和通用的探針及引物的制作方法
背景技術(shù)：
用于細(xì)菌鑒定和敏感性試驗(yàn)的傳統(tǒng)方法在過(guò)去，通常是使用例如API20ETM系統(tǒng)(bioMe′rieux)等生物測(cè)試方法，根據(jù)細(xì)菌利用不同的底物作為碳和氮源的能力來(lái)鑒定細(xì)菌的。就敏感性試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用的方法包括平板擴(kuò)散、瓊脂稀釋和肉湯微量稀釋法。雖然基于生物化學(xué)試驗(yàn)和抗菌敏感性試驗(yàn)的鑒定方法是有效的，但由于需要鑒定臨床樣品中的細(xì)菌及確定其對(duì)抗微生物藥劑的敏感性而必須經(jīng)過(guò)連續(xù)兩次過(guò)夜培養(yǎng)，所以至少要用兩天時(shí)間才能得到初步鑒定結(jié)果。為進(jìn)行快速微生物鑒定和敏感性試驗(yàn)，已有一些市售的使用高級(jí)和貴重裝置的自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)(即Dade DiagnoticsCorp.的MicroScan系統(tǒng)和bioMe′rieux的Vitek系統(tǒng))(Stager andDavis，臨床微生物綜述，5302-327)。這些系統(tǒng)需要較短的保溫時(shí)間，因而可在不到6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成大多數(shù)細(xì)菌鑒定和敏感性試驗(yàn)。然而，這些快速系統(tǒng)總是需要首先將細(xì)菌分離成純培養(yǎng)物，這一過(guò)程對(duì)于純培養(yǎng)物要花費(fèi)至少18小時(shí)，對(duì)于混合培養(yǎng)物則需2天時(shí)間。最快的鑒定系統(tǒng)是auto SCAN-Walk-AwayTM系統(tǒng)(Date DiganosticsCorp.)，其可在2小時(shí)內(nèi)從標(biāo)準(zhǔn)化接種物中鑒定出革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，并在5.5小時(shí)內(nèi)得到對(duì)大多數(shù)抗生素的敏感性模式。然而，該系統(tǒng)對(duì)腸細(xì)菌以外菌種的非確定性鑒定的比例特別高(即3.3至40.5％)。對(duì)腸細(xì)菌的非確定性鑒定比例為2.7至11.4％(CroizeJ.，1995，Lett.Infectiol.，10109-113；York等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，302903-2910)。
在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中可常規(guī)分離并鑒定臨床樣品中的各種細(xì)菌和真菌。表1和2中列出了各種類(lèi)型臨床樣品中最常分離到的細(xì)菌和真菌病原體的出現(xiàn)率。這些病原體常常與人們?cè)卺t(yī)院和公共場(chǎng)所獲得的感染有關(guān)，因而被認(rèn)為是最具臨床重要性的。在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)的臨床樣品臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中收到的大多數(shù)樣品是尿樣和血樣。在I′Universite′Laval中心醫(yī)院(CHUL)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，尿樣和血樣分別占收到樣品的大約55％和30％(表3)。剩下15％的臨床樣品包括各種生物液體，包括痰、膿、腦脊液、滑液等(表3)。尿道、呼吸道和血流感染通常是由細(xì)菌所致，需要抗微生物治療。事實(shí)上，對(duì)臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中收到的所有臨床樣品的檢測(cè)通常是鑒定細(xì)菌和敏感性測(cè)試。臨床樣品中常規(guī)病原體的鑒定尿樣對(duì)尿樣中病原體的檢查在常規(guī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中非常普遍，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了許多測(cè)試方法。然而，通用的標(biāo)準(zhǔn)仍然是經(jīng)典的半定量性平板培養(yǎng)物方法，其中將1μl尿液在平板上劃線，并培養(yǎng)18-24小時(shí)。然后對(duì)菌落計(jì)數(shù)以確定每升尿液中菌落形成單位(CFU)的總數(shù)。細(xì)菌尿道感染(UTI)通常與尿液中細(xì)菌數(shù)為107CFU/L或更高有關(guān)。然而，尿液中細(xì)菌數(shù)為107CFU/L以下時(shí)也有可能造成感染，對(duì)于易患病或插入了導(dǎo)管的那些患者尤為如此(Stark和Maki，1984，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，311560-564)。重要的是，臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)的約80％的尿樣被視為是陰性的(即細(xì)菌計(jì)數(shù)小于107CFU/L；表3)。利用標(biāo)準(zhǔn)生化測(cè)試方法對(duì)經(jīng)培養(yǎng)物鑒定為陽(yáng)性的尿樣進(jìn)一步鑒定以鑒別細(xì)菌病原體，還檢測(cè)其對(duì)抗生素的敏感性。這種生化和敏感性測(cè)試通常需要18-24小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。
細(xì)菌病原體的準(zhǔn)確和快速尿液篩選方法可使得更快速地鑒定出陰性樣品，并更有效地治療和護(hù)理患者。已將數(shù)種快速鑒別方法(UriscreenTM，UTIscreenTM，F(xiàn)lash TrackTMDNA探針等)與基于細(xì)菌病原體培養(yǎng)物的更慢的標(biāo)準(zhǔn)生化方法進(jìn)行了比較。這些快速測(cè)試方法雖然更為快速，但靈敏度較低，特異性也較差，而且假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果也很多(Koening等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，30342-345；Pezzlo等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，30640-684)。血樣對(duì)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中收到的血樣常常進(jìn)行培養(yǎng)。血液培養(yǎng)物系統(tǒng)可以是人工的、半自動(dòng)的或完全自動(dòng)的。BACTEC系統(tǒng)(BectonDickinson)和BacTALert系統(tǒng)(Organon Teknika公司)是最為廣泛使用的兩種自動(dòng)化血液培養(yǎng)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)將血液培養(yǎng)瓶置于細(xì)菌生長(zhǎng)最佳條件下培養(yǎng)。利用高靈敏性細(xì)菌生長(zhǎng)檢測(cè)儀連續(xù)地監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)，以便檢測(cè)出早期陽(yáng)性。一旦檢測(cè)到細(xì)菌生長(zhǎng)，即直接對(duì)血液培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，然后用于接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。隨后，用前述的自動(dòng)化系統(tǒng)，對(duì)分離的細(xì)菌菌落進(jìn)行細(xì)菌鑒定和敏感性測(cè)試。如果培養(yǎng)6-7天后未檢測(cè)到病原體生長(zhǎng)，通常將這種培養(yǎng)瓶報(bào)告為陰性。正常情況下，絕大部分血液培養(yǎng)物報(bào)道為陰性。例如，CHUL的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在1994年2月至1995年1月期間陰性血液培養(yǎng)物的比例為93.1％(表3)。
其他臨床樣品在由臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室接受后，處理除血液和尿液以外的正常情況下得自無(wú)菌部位的所有其他體液(即腦脊液、滑液、胸腔液、心包液等)以進(jìn)行直接顯微鏡檢查和繼后培養(yǎng)。同樣，大多數(shù)臨床樣品都是培養(yǎng)陰性的(表3)。
對(duì)于那些并非得自無(wú)菌部位的臨床樣品，如痰和糞便樣品來(lái)說(shuō)，由于有正常菌群污染，所以用培養(yǎng)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)診斷的問(wèn)題較多。從污染物中純化出可能與感染相關(guān)的細(xì)菌病原體，然后按以前描述的方法進(jìn)行鑒定。當(dāng)然，細(xì)菌的常用檢測(cè)法并不適用于診斷這些非無(wú)菌部位的細(xì)菌感染。另一方面，用于這些樣品的種或?qū)俚臋z測(cè)和鑒定及抗生素抗性基因檢測(cè)的基于DNA的試驗(yàn)應(yīng)是很有用的，并且相比于傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定和敏感性試驗(yàn)方法有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。用任何臨床樣品進(jìn)行的基于DNA的檢測(cè)法顯然需要建立由臨床樣品直接檢測(cè)和鑒定細(xì)菌的快速和準(zhǔn)確的診斷試驗(yàn)?；贒NA的技術(shù)迅速而且準(zhǔn)確，并且可能大大改善對(duì)傳染性疾病的診斷(Persing et al.，1993，診斷分子生物學(xué)原理與應(yīng)用，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。作為本發(fā)明主題的DNA探針和擴(kuò)增引物適用于直接從血液培養(yǎng)物、血液、尿液、痰、腦脊液、膿及其他標(biāo)本(表3)等任何一種臨床標(biāo)本檢測(cè)并鑒定細(xì)菌或真菌。從迅速和準(zhǔn)確的角度看，本發(fā)明中提出的基于DNA的試驗(yàn)優(yōu)于目前微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室用于由任何臨床樣品進(jìn)行常規(guī)診斷的標(biāo)準(zhǔn)生化方法。因?yàn)檫@些試驗(yàn)只在大約1小時(shí)內(nèi)完成，所以它們?yōu)榕R床醫(yī)生提供了新的診斷工具，從而有利于提高抗微生物劑的治療效率。也可用這些檢測(cè)法測(cè)試得自人以外生物體(例如其它靈長(zhǎng)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、植物、哺乳動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、家畜等)的臨床標(biāo)本。高百分比的培養(yǎng)陰性標(biāo)本在所接受的用于常規(guī)診斷的所有臨床標(biāo)本中，大約80％的尿樣和更多(約95％)的其他類(lèi)型臨床標(biāo)本都是細(xì)菌病原體陰性的(表3)。除了在種或?qū)偎缴翔b定給定標(biāo)本中的細(xì)菌外，還希望用檢測(cè)任何細(xì)菌存在的試驗(yàn)(即通用細(xì)菌檢測(cè))篩選出高比例的陰性臨床標(biāo)本。這樣一種篩選試驗(yàn)可以是基于對(duì)所有細(xì)菌中的高保守的基因靶進(jìn)行的DNA的PCR擴(kuò)增。細(xì)菌陰性的標(biāo)本不會(huì)被此檢測(cè)法擴(kuò)增。另一方面，細(xì)菌陽(yáng)性的那些標(biāo)本用此檢測(cè)法檢測(cè)會(huì)得到陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)。發(fā)展基于DNA的快速診斷試驗(yàn)快速診斷試驗(yàn)對(duì)處理感染將具有重要影響。DNA探針和DNA擴(kuò)增技術(shù)比鑒定臨床樣品中的病原體和抗生素抗性基因的常規(guī)方法表現(xiàn)有幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)(Rersing et al.，1993，診斷分子微生物學(xué)原理與應(yīng)用，American Society for Microbiology，Washington，D.C.；Ehrlich和Greenberg，1994，感染性疾病基于PCR的診斷，Blackwell Scientific Publications，Boston，MA)。由于可直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中的生物體，故沒(méi)有必要培養(yǎng)細(xì)菌病原體，從而減少了分離和鑒定病原體的時(shí)間。此外，就鑒定細(xì)菌來(lái)說(shuō)，基于DNA的檢測(cè)法比目前使用的基于生化試驗(yàn)的表型鑒定系統(tǒng)更為準(zhǔn)確。目前市場(chǎng)上可得到的基于DNA的技術(shù)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中主要用于檢測(cè)和鑒定結(jié)核桿菌、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏球菌等難養(yǎng)菌以及檢測(cè)各種病毒(Podzorski and Persing，微生物的分子檢測(cè)與鑒定，P.Murray etal.，1995，《臨床微生物學(xué)手冊(cè)》，ASM press，Washington D.C.)。還有一些進(jìn)行培養(yǎng)物證實(shí)檢測(cè)的其他市場(chǎng)可得到的基于DNA的檢測(cè)法。
其他一些人已建立了基于DNA的用于細(xì)菌病原體檢測(cè)和鑒定的方法(作為本發(fā)明的主題)葡萄球菌屬種(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)US5437978)、奈瑟氏球菌屬種(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)US5162199和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)EP 0337896131)以及單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)US5389513和US5089386)。但這些專(zhuān)利中描述的診斷試驗(yàn)是基于rRNA基因或與本發(fā)明所述者不同的遺傳靶的試驗(yàn)。
雖然有一些診斷試劑盒或方法已被用于臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，但為了改善常規(guī)細(xì)菌感染診斷的準(zhǔn)確性和速度，仍需要更先進(jìn)的試驗(yàn)以替代常規(guī)培養(yǎng)鑒定法。由于細(xì)菌基因型(如DNA水平)比細(xì)菌表型更加穩(wěn)定(例如代謝水平)，所以基于DNA的診斷試驗(yàn)除了比目前使用的標(biāo)準(zhǔn)生化診斷試驗(yàn)更快速外，而且還更加準(zhǔn)確。
如根據(jù)得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列數(shù)目所證實(shí)的，有關(guān)細(xì)菌和真菌基因組序列的知識(shí)不斷增加?；诳珊苋菀椎米詳?shù)據(jù)庫(kù)的序列，并不能指示將其用于診斷目的的能力。為了確定適用于診斷目的的好的候選序列，可選擇那些適于進(jìn)行下列基于DNA的檢測(cè)法的序列(i)對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌或真菌病原體進(jìn)行種特異性檢測(cè)和鑒定，(ii)對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌或真菌病原體進(jìn)行屬特異性檢測(cè)和鑒定，(iii)對(duì)細(xì)菌或真菌病原體進(jìn)行一般檢測(cè)，和/或(iv)對(duì)抗生素抗性基因進(jìn)行特異性檢測(cè)和鑒定?？蓪?duì)各種臨床標(biāo)本或微生物培養(yǎng)物直接完成上述基于DNA的所有試驗(yàn)類(lèi)型。
在我們的共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng)US08/526840和PCT/CA/95/00528中，我們描述了適于進(jìn)行下列檢測(cè)的DNA序列(i)12種臨床上重要的細(xì)菌病原體的種特異性檢測(cè)和鑒定，(ii)細(xì)菌常規(guī)檢測(cè)和(iii)17種抗生素抗性基因的檢測(cè)。該共同待批專(zhuān)利申請(qǐng)描述了有優(yōu)先權(quán)的DNA序列和選自數(shù)據(jù)庫(kù)的DNA序列(兩種情況下，片段均至少100個(gè)堿基對(duì))，以及由這些序列衍生的寡核苷酸探針與擴(kuò)增引物。本專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的所有核酸序列均加入能進(jìn)行下述檢測(cè)的診斷試劑盒和方法的組合物中(a)檢測(cè)細(xì)菌的存在，(b)特異性檢測(cè)12種細(xì)菌和17種抗生素抗性基因。然而，由于理想的試劑盒和方法應(yīng)能夠診斷近100％的微生物病原體和抗生素抗性基因，所以仍需對(duì)這些方法和試劑盒進(jìn)行改進(jìn)。例如，因?yàn)槭耗c球菌對(duì)許多抗生素具有抗性，所以由之引起的感染已逐漸成為一個(gè)臨床難題。最好是能夠檢測(cè)這些細(xì)菌并估計(jì)其抗性特征。此外，還希望得到能夠識(shí)別相同及其他微生物病原體或同一及其他抗生素抗性基因的新的DNA序列(探針和引物)，以有助于檢測(cè)更多的靶基因并充實(shí)我們的早期專(zhuān)利申請(qǐng)。
發(fā)明的要點(diǎn)本發(fā)明的目的是提供一種使用探針和/或擴(kuò)增引物，在估計(jì)含有下列來(lái)源核酸的任何樣品中檢測(cè)所述核酸的存在和/或其量的特異性的、普遍適用的并且靈敏的方法-選自鏈球菌屬種、無(wú)乳鏈球菌、葡萄球菌屬種、腐生葡萄球菌、腸球菌屬種、屎腸球菌、奈瑟氏球菌屬種、腦膜類(lèi)奈瑟氏球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、假絲酵母屬種和白假絲酵母的特定微生物種或?qū)伲?選自blatem、blarob、blashv、blaoxa、blaZ、aadB、aacCl、aacC2、aacC3、aacA4、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、mecA、vanA、vanB、vanC、satA、aac(6′)-aph(2″)、aad(6′)、vat、vga、msrA、sul和int的抗生素抗性基因，以及任選地-任何菌種，其中每種所說(shuō)的核酸或其變體或部分均包括可與所說(shuō)的探針或引物雜交的選擇性靶區(qū)域；所說(shuō)的方法包括使所說(shuō)的樣品與所說(shuō)的探針或引物接觸，并檢測(cè)作為所說(shuō)的任何菌種、特定微生物種或?qū)偌翱股乜剐曰虻拇嬖诤?或量之指征的雜交探針或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和/或量。
在一特定實(shí)施方案中，分別提供了涉及每個(gè)特定微生物種或?qū)贆z測(cè)與鑒定、抗生素抗性基因檢測(cè)，及通用細(xì)菌檢測(cè)的相似方法。
在一更特定的實(shí)施方案中，該方法使用根據(jù)其靈敏地、特異地和普遍適用地檢測(cè)靶細(xì)菌或真菌核酸的能力而選擇的DNA片段(有優(yōu)先權(quán)的片段和得自數(shù)據(jù)庫(kù)的片段)。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，已從較長(zhǎng)的DNA片段得到了長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的寡核苷酸，并將其作為探針或擴(kuò)增引物用于本方法。
有優(yōu)先權(quán)的寡核苷酸(探針和引物)也是本發(fā)明的另一個(gè)主題。
包含用于檢測(cè)選自下列一組中的微生物種或?qū)俚奶结樆驍U(kuò)增引物的診斷試劑盒也是本發(fā)明的主題鏈球菌屬種、無(wú)乳鏈球菌、葡萄球菌屬種、腐生葡萄球菌、腸球菌屬種、屎腸球菌、奈瑟氏球菌屬種、腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、假絲酵母屬種和白假絲酵母。
還包括用于檢測(cè)選自下列一組中的抗生素抗性基因之探針或擴(kuò)增引物的診斷試劑盒也是本發(fā)明的主題blatem、blarob、blashv、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aacA4、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、mecA、vanA、vanB、vanC、satA、aac(6′)-aph(2″)、aad(6′)、vat、vga、msrA，sul和int。
進(jìn)一步包括用于檢測(cè)任何細(xì)菌或真菌菌種之探針或擴(kuò)增引物的診斷試劑盒-其中包括或不包括用于檢測(cè)上列特定微生物種或?qū)俚哪切┨结樆驍U(kuò)增引物，并且進(jìn)一步包括或不包括用于檢測(cè)上列抗生素抗性基因的探針和引物-也是本發(fā)明的主題。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的試劑盒可用于分離或同時(shí)檢測(cè)與鑒定上列微生物種或?qū)?、抗生素抗性基因及檢測(cè)任何細(xì)菌。
在上述方法和試劑盒中，擴(kuò)增反應(yīng)可包括a)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，b)連接酶鏈反應(yīng)，c)基于核酸序列的擴(kuò)增，d)自動(dòng)維持的序列復(fù)制，e)鏈置換擴(kuò)增，f)分支DNA信號(hào)擴(kuò)增，g)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增，h)循環(huán)探針技術(shù)(CPT)，i)嵌套PCR，或j)多重PCR。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供每次擴(kuò)增循環(huán)都包括以下步驟的PCR程序于45-55℃進(jìn)行30秒的退火步驟和于95℃僅進(jìn)行1秒鐘的變性步驟，延伸步驟不設(shè)置特別的時(shí)間。已實(shí)現(xiàn)了該P(yáng)CR方法的標(biāo)準(zhǔn)化，以使之適于用所有選定的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而大大有利于測(cè)試，因?yàn)檫@樣即可在相同循環(huán)條件下用通用的、種特異性的、屬特異性的引物及抗生素抗性基因PCR引物測(cè)試各種臨床樣品。此外，亦可在多重PCR試驗(yàn)中使用各種不同的引物對(duì)組合。
我們意欲發(fā)展一種快速試驗(yàn)或試劑盒，以迅速排除細(xì)胞陰性的所有樣品，然后檢測(cè)并鑒定上述細(xì)菌和/或真菌菌種和屬，并迅速確定細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性。雖然可從數(shù)據(jù)庫(kù)中得到選定抗生素抗性基因的序列，并已將其用于發(fā)展基于DNA的檢測(cè)試驗(yàn)，但我們的研究工作代表了對(duì)當(dāng)前的基于細(xì)菌培養(yǎng)的全方位診斷方法的重要改進(jìn)，因而是獨(dú)特的。由于使用可同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)與鑒定和抗生素抗性基因檢測(cè)的擴(kuò)增方法，故不需要在試驗(yàn)前培養(yǎng)臨床樣品。此外，已發(fā)展了改良的PCR試驗(yàn)程序，從而可在相同的擴(kuò)增條件下大約1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)所有的靶DNA序列。這一程序?qū)⑼ㄟ^(guò)使治療最佳化而拯救生命，因?yàn)橥队幂^少的抗生素而減小抗生素抗性，減少貴重的廣譜抗生素的使用，因不用住醫(yī)院或縮短住醫(yī)院時(shí)間而降低保健醫(yī)療費(fèi)用，并且減少與臨床實(shí)驗(yàn)室檢查相關(guān)的時(shí)間和花費(fèi)。
在本文下述的方法和試劑盒中，已從較大序列(即至少有100個(gè)堿基對(duì)的DNA片段)衍生得到了寡核苷酸探針及擴(kuò)增引物，所有DNA片段都是從有優(yōu)先權(quán)的諸片段或數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的。由于是根據(jù)其診斷能力而選擇的，所以這些從數(shù)據(jù)庫(kù)中選出的DNA片段都是最新用于本發(fā)明的檢測(cè)方法中的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以清楚地理解到，也可從有優(yōu)先權(quán)的諸片段或選定數(shù)據(jù)庫(kù)序列中推導(dǎo)出除附錄VI中列出者以外的適用于(i)通用細(xì)菌檢測(cè)，(ii)檢測(cè)和鑒定上述微生物種或?qū)伲约?iii)檢測(cè)抗生素抗性基因的其它寡核苷酸序列。例如，寡核苷酸引物或探針可以比我們已選擇的更短或更長(zhǎng)；也可以從有優(yōu)先權(quán)的DNA片段或選定數(shù)據(jù)庫(kù)序列的其它地方選擇；它們也可以是同一寡核苷酸的變體。如果靶DNA或其變體可與給定的寡核苷酸雜交，或者可由給定的寡核苷酸PCR引物對(duì)擴(kuò)增出靶DNA或其變體，則反過(guò)來(lái)也是成立的；給定的靶DNA可與變體寡核苷酸探針雜交，或可由變體寡核苷酸PCR引物擴(kuò)增出來(lái)?；蛘撸蓮娜魏蜠NA片段序列設(shè)計(jì)寡核苷酸，以用于除PCR外的其它擴(kuò)增方法中。因此，本發(fā)明的核心是鑒定通用的、種特異性的、屬特異性的和抗性基因特異性的基因組或非基因組DNA片段，以將它們用作特異的和普遍適用的寡核苷酸探針和/或擴(kuò)增引物的來(lái)源。雖然選擇和評(píng)定適于診斷目的的寡核苷酸需要作許多工作，但本領(lǐng)域技術(shù)人員完全有可能由選定DNA片段設(shè)計(jì)出適于診斷目的的、附錄VI中所列者以外的寡核苷酸。如果基于其特異性和普遍適用性選擇有優(yōu)先權(quán)的片段或數(shù)據(jù)庫(kù)序列，即可增加其亞組亦將是特異的和普遍適用的這種可能性。
因?yàn)楦弑壤呐R床樣品是細(xì)菌陰性的(表3)，所以從有優(yōu)先權(quán)的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列中選擇那些極適于作為通用寡核苷酸探針或引物來(lái)源的DNA片段。從細(xì)菌和真菌中高度保守的基因中選擇擴(kuò)增引物，并用于檢測(cè)臨床標(biāo)本中任何細(xì)菌病原體的存在，以迅速(約1小時(shí))確定被檢物是細(xì)菌陽(yáng)性還是陰性。稱(chēng)為tuf的選定基因編碼一種在蛋白質(zhì)合成期間參與翻譯過(guò)程的蛋白質(zhì)(EF-Tu)。用于衍生通用引物的tuf基因序列對(duì)比分析包括有優(yōu)先權(quán)的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列(實(shí)施例1和附錄1)。這一策略使得可以迅速篩選出交付細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)的大量陰性臨床標(biāo)本(約為所收到的標(biāo)本的80％，參見(jiàn)表3)。表4、5和6中列出了用于試驗(yàn)PCR引物和DNA探針之特異性的細(xì)菌或真菌菌種。表7中給出了對(duì)作為本發(fā)明的主題的每種種特異性、屬特異性和通用擴(kuò)增試驗(yàn)的簡(jiǎn)要描述。表8、9和10提供了為診斷目的而選擇的有優(yōu)先權(quán)的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列的某些相關(guān)信息。發(fā)明的詳細(xì)描述用于微生物的種特異性、屬特異性、通用和抗生素抗性基因特異性DNA探針及擴(kuò)增引物的產(chǎn)生從數(shù)據(jù)庫(kù)序列中選擇適于診斷目的的序列為了選擇適于對(duì)細(xì)菌或真菌進(jìn)行種特異性或?qū)偬禺愋詸z測(cè)與鑒定、或者適于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行通用檢測(cè)的序列，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的序列信息和對(duì)這些序列進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，基于其用于診斷目的的能力而選擇數(shù)據(jù)庫(kù)序列(GenBank，EMBL和Swiss-Port)。首先，仔細(xì)分析可為靶微生物種或?qū)偎玫乃行蛄袛?shù)據(jù)。依據(jù)基因序列信息和由Genetics Computer Group(GCG，Wisconsin)程序完成的與其他種或?qū)俚奈⑸镏邢鄳?yīng)基因的序列比較，選擇出最有希望用于診斷目的的基因序列，以用于PCR試驗(yàn)。借助OligoTM40引物分析軟件(NationalBiosciences Inc.，P1ymouth，Minn，)，從經(jīng)選擇的數(shù)據(jù)庫(kù)序列中選出最宜用的PCR擴(kuò)增引物。在PCR試驗(yàn)中測(cè)試所選出的引物對(duì)靶微生物種或?qū)俚奶禺愋约捌毡檫m用性。一般說(shuō)來(lái)，在得到對(duì)靶微生物種或?qū)偬禺惖暮推毡檫m用的引物對(duì)之前，須對(duì)幾個(gè)首選基因序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析和PCR試驗(yàn)，以鑒定那些從中得到適于種特異性或?qū)偬禺愋詸z測(cè)與鑒定之?dāng)U增引物的數(shù)據(jù)庫(kù)序列。附錄VI列出了選出的特異的和普遍適用的PCR引物對(duì)。附錄I至V和實(shí)施例1至4舉例說(shuō)明了用于從tuf基因中或從recA基因中選擇種特異性、屬特異性及通用PCR引物的策略。
寡核苷酸引物和探針的設(shè)計(jì)與合成使用我們測(cè)序的DNA片段或從數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank and EMBL)中選擇的DNA片段作為用于診斷目的的寡核苷酸的來(lái)源。以PCR法和本文后述的雜交法測(cè)試從選自數(shù)據(jù)庫(kù)的各種基因組DNA片段(大小在100個(gè)堿基對(duì)以上)衍生的一系列適當(dāng)寡核苷酸引物或探針的特異性和通用性。值得注意的是，數(shù)據(jù)庫(kù)序列是基于可得到的序列信息及深入分析的結(jié)果，根據(jù)其對(duì)細(xì)菌或真菌進(jìn)行種特異性、屬特異性或通用檢測(cè)的潛在能力而選擇的，并且一般說(shuō)來(lái)，為獲得預(yù)期的特異性、普遍適用性及靈敏性，須測(cè)試幾個(gè)候選數(shù)據(jù)庫(kù)序列。
使用自動(dòng)DNA合成儀(Perkin-Elmer Corp.，AppliedBiosystems Division)合成由選自數(shù)據(jù)庫(kù)序列的種特異性片段衍生的寡核苷酸探針及擴(kuò)增引物。在合成之前，使用標(biāo)準(zhǔn)程序(即GeneticsComputer Group(GCG)程序和引物分析軟件OligoTM4.0)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，估計(jì)所有寡核苷酸(雜交探針和DNA擴(kuò)增引物)是否適用于雜交或通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的DNA擴(kuò)增。也可在合成之前通過(guò)證實(shí)有無(wú)一種核苷酸的長(zhǎng)分支及在3′末端的高比例G或C殘基等不希望存在的特征估計(jì)PCR引物對(duì)的潛在適用性(Persing et al.，1993，診斷分子生物學(xué)原理及應(yīng)用，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。
可由雙股DNA的任一條鏈衍生得到寡核苷酸引物或探針。引物或探針可由堿基A、G、C或T或類(lèi)似物組成，它們可在一個(gè)或多個(gè)選定的寡核苷酸位置上發(fā)生簡(jiǎn)并。引物或探針可以有任何適當(dāng)長(zhǎng)度，并且可在得自有優(yōu)先權(quán)的片段或選定的數(shù)據(jù)庫(kù)序列的DNA序列內(nèi)任何地方選擇，DNA序列應(yīng)適用于(i)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行通用檢測(cè)，(ii)對(duì)屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和白假絲酵母進(jìn)行種特異性檢測(cè)和鑒定，(iii)對(duì)鏈球菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬和奈瑟氏球菌屬種進(jìn)行屬特異性檢測(cè)，或(iv)檢測(cè)上文提到的26種臨床上重要的抗生素抗性基因。
給定的靶細(xì)菌基因的變體是天然存在的，其產(chǎn)生是由于在進(jìn)化期間基因內(nèi)發(fā)生序列變異的結(jié)果(Watson et al.，1987，基因的分子生物學(xué)；第4版，The Benjamin/Cummings Publishing Company，MenloPark，CA；Lewin，1989，Genes N，John Wiley & Sons，New York，NY)。例如，同一細(xì)菌種的不同菌株可在寡核苷酸雜交位點(diǎn)上有一個(gè)或多個(gè)核苷酸變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道特定基因存在細(xì)菌或真菌變體DNA序列，而且知道序列變異的發(fā)生頻率取決于進(jìn)化期間給定基因產(chǎn)物受到的選擇壓力?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列而證實(shí)對(duì)兩個(gè)PCR引物間的區(qū)域內(nèi)變體序列的檢測(cè)。為了顯示引物雜交處序列變體的存在，必須用位于雜交位點(diǎn)外面的PCR引物擴(kuò)增較大的DNA靶。測(cè)定該較大片段的序列將得以確定該位點(diǎn)上的序列變異。相似的策略也適用于顯示探針雜交位點(diǎn)處的變體。既然靶序列或其部分的差異并不影響擴(kuò)增引物或探針的特異性及普遍適用性，因此變異的細(xì)菌DNA均屬于本發(fā)明的范圍。也可使用選定引物或探針的變體擴(kuò)增變體DNA，或與之雜交。
測(cè)定各種細(xì)菌和真菌的tuf基因的序列測(cè)定各種細(xì)菌和真菌之部分tuf基因的核苷酸序列。使用可擴(kuò)增約890bp之部分tuf基因的擴(kuò)增引物SEQ ID NO107和108測(cè)定細(xì)菌tuf基因的核苷酸序列。使用可擴(kuò)增約830bp之部分tuf基因的擴(kuò)增引物SEQ ID NO109和172測(cè)定真菌tuf基因的核苷酸序列。兩對(duì)引物均可擴(kuò)增tuf A和tuf B基因。這并不難理解，因?yàn)檫@兩個(gè)基因幾乎完全相同。例如，大腸桿菌的完整tuf A和tuf B基因只在13個(gè)核苷酸位置處有所不同(Neidhardt et al.，1996大腸桿菌和沙門(mén)氏菌細(xì)胞與分子生物學(xué)，第2版，American Society for MicrobiologyPress，Washington，D.C.)。這些擴(kuò)增引物在幾個(gè)核苷酸位置處具有簡(jiǎn)并，并含有次黃苷，從而得以擴(kuò)增更大范圍的tuf序列。用于選擇這些擴(kuò)增引物的策略相似于如附錄1所舉例說(shuō)明的用于選擇通用引物的策略?？墒褂脭U(kuò)增引物SEQ ID NO107和108擴(kuò)增任何細(xì)菌菌種的tuf基因?？墒褂脭U(kuò)增引物SEQ ID NO109和172擴(kuò)增任何真菌菌種的tuf基因。
使用下述擴(kuò)增程序直接從細(xì)菌或酵母培養(yǎng)物擴(kuò)增tuf基因?qū)?μl細(xì)菌懸液直接移入19μl含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、0.1％Triton X-100、2.5mM MgCl2、各1μM的兩種引物、各200μM的四種dNTP、0.5單位TaqDNA聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)的PCR反應(yīng)混合物中。使用MJ Research PTC-200熱循環(huán)儀(MJRearch Inc.，Watertown，Mass.)按下述步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)96℃3分鐘，隨后是95℃變性1分鐘，于30-50℃退火1分鐘，并于72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)。然后，在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳分辨20μl經(jīng)PCR擴(kuò)增的混合物。然后用亞甲基蘭染色以顯現(xiàn)凝膠分離物(Flores et al.，1992，Biotechniques，13203-205)。經(jīng)與100bp分子量梯度進(jìn)行比較以估計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。從瓊脂糖凝膠上切下相當(dāng)于特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶(即分別為890或830bp的細(xì)菌或真菌tuf序列)，并使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(QIAGEN Inc.，Chatsworth，CA)純化之。然后將經(jīng)凝膠純化的DNA片段直接用于測(cè)序步驟。使用Applied Biosystems自動(dòng)DNA序列儀(373A型)，連用其PRISMTMSequenase終止區(qū)雙鏈DNA測(cè)序試劑盒(Perkin-ElmerCorp.，Applied Biosystems Division，F(xiàn)oster City，CA)，以雙脫氧核苷酸鏈終止測(cè)序法測(cè)定tuf基因擴(kuò)增產(chǎn)物兩條鏈的序列。測(cè)序反應(yīng)均使用擴(kuò)增引物(SEQ ID NO107至109和172)和各100ng經(jīng)凝膠純化的擴(kuò)增產(chǎn)物完成。為了確保所測(cè)定的序列不含有因PCR偽象造成的錯(cuò)誤，我們測(cè)定了從兩次獨(dú)立PCR擴(kuò)增得到的經(jīng)凝膠純化的tuf擴(kuò)增產(chǎn)物兩份制劑的序列。對(duì)于所有靶微生物種來(lái)說(shuō)，就兩種擴(kuò)增產(chǎn)物制劑所確定的序列是完全相同的。此外，兩條鏈的序列是100％互補(bǔ)的，從而證實(shí)所確定的序列是高度準(zhǔn)確的。使用上述策略確定的tuf序列均列于序列表中(即SEQ ID NO118至146)。表13中給出了原微生物種和序列表中各tuf序列的來(lái)源。
將我們確定的tuf序列或從數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇的tuf序列進(jìn)行對(duì)比，可以清楚地看出測(cè)序部分的tuf基因的長(zhǎng)度是可變的。其中可以有幾個(gè)氨基酸的插入和缺失。這一現(xiàn)象說(shuō)明了為什么不同細(xì)菌和真菌菌種的已測(cè)序之tuf擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是有所變化。我們發(fā)現(xiàn)，在我們研究小組確定的tuf序列中可插入和缺失多達(dá)5個(gè)氨基酸或15個(gè)核苷酸。因此，附錄I至V上列出的核苷酸位置與具有插入或缺失的tuf序列并不符合。
還應(yīng)提到的是，我們測(cè)定的各種tuf序列偶爾表現(xiàn)有簡(jiǎn)并現(xiàn)象。由于擴(kuò)增引物可擴(kuò)增兩種tuf基因，所以這些簡(jiǎn)并的核苷酸相當(dāng)于tuf A和tuf B基因之間的序列變異。因?yàn)閮蓷l鏈的序列是完全相同的，并且用凝膠純化的兩份tuf擴(kuò)增產(chǎn)物制劑測(cè)得的序列也是相同的，所以這些核苷酸變異并不是由于taq DNA聚合酶造成的核苷酸錯(cuò)誤摻入。
從tuf序列選擇擴(kuò)增引物使用由我們測(cè)定的或從數(shù)據(jù)庫(kù)選擇的tuf序列選擇用于下列目的的PCR引物(i)細(xì)菌的通用檢測(cè)，(ii)腸球菌屬種和葡萄球菌屬種的屬特異性檢測(cè)和鑒定，以及(iii)白假絲酵母的種特異性檢測(cè)和鑒定。用于選擇這些PCR引物的策略是基于對(duì)各個(gè)tuf序列的多重序列對(duì)比分析。有關(guān)從tuf序列中選擇PCR引物的更詳細(xì)的說(shuō)明請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例1至3和附錄I至IV。
從recA中選擇擴(kuò)增引物比較得自各種細(xì)菌(包括5種鏈球菌)之recA基因的核苷酸序列后得以選擇出鏈球菌屬特異性PCR引物。有關(guān)從rec中選擇PCR引物的詳細(xì)說(shuō)明請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例4和附錄V。
用任意引物PCR法從腐生葡萄球菌中分離DNA片段用任意引物PCR法(AP-PCR)得到用于種特異性檢測(cè)和鑒定腐生葡萄球菌的未知編碼能力的DNA序列。
AP-PCR是一種可用于產(chǎn)生微生物特異性DNA探針的方法(Faniet al.，1993 Mol.Ecol，2243-250)。對(duì)用于從腐生葡萄球菌中分離種特異性基因組DNA片段的AP-PCR步驟的描述如下。用得自3個(gè)腐生葡萄球菌菌株(均得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)No15305、35552和43867)的DNA和得自4個(gè)其他葡萄球菌菌種(金黃色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 14990、溶血葡萄球菌ATCC 29970和人葡萄球菌ATCC 35982)的DNA系統(tǒng)地試驗(yàn)20種長(zhǎng)度為10個(gè)核苷酸的不同寡核苷酸引物。對(duì)所有細(xì)菌菌種來(lái)說(shuō)，均從調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)0.5McFarland的細(xì)菌懸液(相當(dāng)于大約1.5×108個(gè)細(xì)菌/ml)進(jìn)行擴(kuò)增。將1μl標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)菌懸液直接轉(zhuǎn)移到19μl含有50mM KCl、10mMTris-HCl(pH9.0)、0.1％Triton X-100、2.5mM MgCl2、1.2μM 20種不同的AP-PCR引物OPAD中的僅一種)、各200μM的四種dNTP和0.5單位Taq DNA聚合酶(Promega Crop.，Madison，WI)的PCR反應(yīng)混合物中。使用MJ Research PTC-200熱循環(huán)儀(MJ Reasearch Inc.)按下述熱循環(huán)步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)96℃3分鐘，隨后95℃變性1分鐘，32℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。35輪循環(huán)后進(jìn)行72℃7分鐘的最后延伸步驟，以確保PCR產(chǎn)物的完整延伸。然后，在含有0.25μg/ml溴乙錠的2％瓊脂糖凝膠中電泳分辨20μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)與50bp分子量梯度比較而估計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。
用AP-PCR引物OPAD-9(SEQ ID NO25)觀察到腐生葡萄球菌特異的擴(kuò)增模式。用該引物擴(kuò)增，所有腐生葡萄球菌菌株都總是顯示一條相當(dāng)于約450bp DNA片段的帶，但試驗(yàn)的所有四種其他葡萄球菌則都不顯示這樣一條帶。試驗(yàn)選自CHUL微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物保藏庫(kù)的10種以上腐生葡萄球菌臨床分離物及選自表5中所列革蘭氏陽(yáng)性菌的菌株，進(jìn)一步證實(shí)了這一種特異性模式。
從瓊脂糖凝膠中切下相當(dāng)于大約450bp擴(kuò)增產(chǎn)物(基于AP-PCR證實(shí)其為腐生葡萄球菌特異的和普遍存在的)的帶，并使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(QIAGEN Inc.)純化之。使用T4 DNA連接酶(NewEngland BioLabs)將經(jīng)凝膠純化的DNA片段克隆到pCR2.1TM質(zhì)粒載體(Invitrogen Inc.)的T/A克隆位點(diǎn)中。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。按Birnboim和Doly(核酸研究，71513-1523)的小批量制備方法分離質(zhì)粒DNA。用EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶消化所有質(zhì)粒DNA制劑，以確保重組質(zhì)粒中存在有約450bp的AP-PCR插入物。然后，使用QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒從選出的顯示攜帶有AP-PCR插入物的兩個(gè)克隆大批量制備高度純化的質(zhì)粒DNA制劑。使用這些質(zhì)粒制劑進(jìn)行自動(dòng)DNA測(cè)序。
使用前述Applied Biosytems自動(dòng)DNA測(cè)序，用SP6和T7測(cè)序引物，通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止測(cè)序法測(cè)定兩個(gè)選定克隆的AP-PCR插入物的雙鏈序列。分析所得序列，揭示出從各克隆所得兩條鏈的DNA序列是100％互補(bǔ)的。此外，還顯示所測(cè)得的各克隆的完整序列都是相同的。這些測(cè)序數(shù)據(jù)證實(shí)所測(cè)得的438bp序列(SEQ ID NO29)有100％的準(zhǔn)確性。已借助引物分析軟件OligoTM4.0從測(cè)序的AP-PCR腐生葡萄球菌DNA片段選擇出了最適擴(kuò)增引物。為證實(shí)其特異性和普遍適用性，已用PCR檢測(cè)法試驗(yàn)了選出的引物序列(表7)。因?yàn)橛脧谋?和5中選擇的除腐生葡萄球菌外的細(xì)菌的DNA沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增，所以這些PCR引物是特異的。此外，由于用這一PCR檢測(cè)法有效地?cái)U(kuò)增了260個(gè)腐生葡萄球菌菌株中的245個(gè)菌株，所以這一檢測(cè)法是普遍適用的。當(dāng)與其他腐生葡萄球菌特異性PCR檢測(cè)法(其為我們的共同待批美國(guó)(N.S.08/526,840)和PCT(PCT/CA/95/00528)專(zhuān)利申請(qǐng)的主題)合用時(shí)，對(duì)260個(gè)菌株的普遍適用性即達(dá)到100％。
DNA擴(kuò)增為了用廣泛使用的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增，從有優(yōu)先權(quán)的DNA片段或數(shù)據(jù)庫(kù)序列得到引物時(shí)。合成之前，使用OligoTM4.0軟件分析可能適用的引物對(duì)，以證實(shí)它們是用于PCR擴(kuò)增的較好候選引物。
在用PCR法擴(kuò)增DNA期間，使用分別與得自細(xì)菌基因組之熱變性靶DNA的每條鏈結(jié)合的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)連續(xù)熱循環(huán)使每次循環(huán)時(shí)DNA變性、引物退火并合成新的靶，從而以指數(shù)形式體外擴(kuò)增靶DNA(Persing et al.，1983，診斷分子微生物學(xué)原理及應(yīng)用，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.)。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，PCR程序如下在含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、2.5mM MgCl2、各0.4μM的每種引物、各200μM的四種dNTP和0.5單位與TaqStartTM抗體(Clontech Laboratories Inc.，PaloAlto，CA)結(jié)合的0.5單位Taq DNA聚合酶(Promega)的20μl PCR反應(yīng)混合物中擴(kuò)增經(jīng)過(guò)處理的臨床標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌或真菌懸液(詳見(jiàn)下文)。向所有PCR反應(yīng)中加入針對(duì)Taq DNA聚合酶的中和性單克隆抗體Taq StartTM抗體，以提高擴(kuò)增的特異性和靈敏性(Kellogg etal.，1994，Biotechniques 161134-1137)。由于各種不同類(lèi)型標(biāo)本所需的組合物和靈敏性水平不同，因此對(duì)臨床標(biāo)本的方法隨所試驗(yàn)的標(biāo)本的類(lèi)型而異。在快速方法中，包括裂解細(xì)菌細(xì)胞并消除PCR抑制作用(有關(guān)尿標(biāo)本的制備參見(jiàn)實(shí)施例11)。為了從細(xì)菌或真菌培養(yǎng)物擴(kuò)增，可不作任何預(yù)處理而直接將樣品加到PCR擴(kuò)增混合物中(參見(jiàn)實(shí)施例10)。使用由細(xì)菌16S核糖體RNA基因的高保守區(qū)域衍生的引物序列，以作為所有PCR反應(yīng)的內(nèi)部對(duì)照。另外，也可由不見(jiàn)于微生物中或人基因組中的序列得到內(nèi)部對(duì)照。將內(nèi)部對(duì)照加到所有擴(kuò)增反應(yīng)中以證實(shí)PCR試驗(yàn)法的效率，并確保沒(méi)有明顯的PCR抑制。也可使用衍生于rRNA的內(nèi)部對(duì)照監(jiān)測(cè)細(xì)菌裂解步驟的效率。
然后使用PTC-200熱循環(huán)儀(MJ Research Inc.)對(duì)PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)(95℃3分鐘，然后是95℃1秒鐘的變性步驟和55℃30秒的退火-延伸步驟，共30個(gè)循環(huán))，并用標(biāo)準(zhǔn)溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行分析。PCR試驗(yàn)中進(jìn)行的循環(huán)數(shù)根據(jù)所需的靈敏度水平而有所不同。例如，直接從臨床標(biāo)本檢測(cè)微生物時(shí)，血液標(biāo)本所需的靈敏度水平要比尿標(biāo)本高，這是因?yàn)榕c敗血病相關(guān)的微生物濃度比與尿路感染相關(guān)的微生物濃度低得多。因此，對(duì)于直接檢測(cè)血液標(biāo)本來(lái)說(shuō)，需要使用有更多次熱循環(huán)的更為靈敏的PCR檢測(cè)法。同樣，直接從細(xì)菌或真菌培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)可能比直接從臨床標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)的靈敏性低些，因?yàn)檎Ｇ闆r下臨床標(biāo)本中靶微生物的數(shù)目要比微生物培養(yǎng)物中靶微生物的數(shù)目低得多。
很顯然，可以使用更快速而且更適用于常規(guī)診斷的其他特異性擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法。這種方法可能是基于檢測(cè)擴(kuò)增后的熒光(例如使用Perkin Elmer公司的TaqManTM系統(tǒng)或Biotronics公司的AmphisensorTM)。因?yàn)榛跈z測(cè)熒光的方法十分快速、可定量并且可以自動(dòng)化(實(shí)施例14)，所以特別適用于進(jìn)行常規(guī)診斷。
也可以使用能與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的種特異性內(nèi)部DNA探針，通過(guò)固相載體或液相雜交法檢測(cè)和鑒定微生物病原體。這樣的探針可從作為本發(fā)明主題的任何種特異性或?qū)偬禺愋訢NA擴(kuò)增產(chǎn)物得到?；蛘撸部蓮挠赏ㄓ脭U(kuò)增檢測(cè)法產(chǎn)生的擴(kuò)增子得到用于種或?qū)贆z測(cè)與鑒定的內(nèi)部探針?？捎蒙锼鼗蜓蟮攸S毒苷或任何其他報(bào)道分子標(biāo)記寡核苷酸探針。
為確保PCR效率，可使用甘油、二甲基亞砜(DMSO)或其他相關(guān)溶劑，以增加PCR靈敏性，并克服擴(kuò)增有高GC含量或形成強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)的靶DNA時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題(Dieffenbach and Dveksler，1995，PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。甘油和DMSO的濃度范圍分別為5-15％(V/V)和3-10％(V/V)。對(duì)于PCR反應(yīng)混合物，擴(kuò)增引物和MgCl2的濃度范圍分別為0.1-1.5μM和1.5-3.5mM。也可以使用改良的標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測(cè)程序，其中使用外部和嵌套引物(即嵌套PCR)或使用一個(gè)以上的引物對(duì)(即多重PCR)(Persing et al.，1993，診斷分子微生物學(xué)原理與應(yīng)用，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。有關(guān)PCR方法和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法的更詳細(xì)說(shuō)明參見(jiàn)實(shí)施例9-14。
其他一些快速擴(kuò)增法，例如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增法(TMA)、自身維持的序列復(fù)制(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。鏈置換擴(kuò)增(SDA)、分支DNA(bDNA)和循環(huán)探針技術(shù)(CPT)等都是DNA擴(kuò)增領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的(Lec et al.，1997，核酸擴(kuò)增技術(shù)疾病診斷中的應(yīng)用，Eaton Publishing，Boston，MA；Pevsing et al.，1993，診斷分子微生物學(xué)原理與應(yīng)用，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.)。本發(fā)明的范圍并不限于使用PCR擴(kuò)增法，而且還包括使用任何其他快速核酸擴(kuò)增方法或者可用于提高試驗(yàn)速度及靈敏度的任何其他方法。本說(shuō)明書(shū)中所包括的任何適于通過(guò)PCR以外的方法擴(kuò)增核酸的任何寡核苷酸，和衍生于種特異性、屬特異性與通用DNA片段和選自抗生素抗性基因序列的任何寡核苷酸均屬于本發(fā)明的范圍。
用寡核苷酸探針進(jìn)行的雜交檢測(cè)法在雜交實(shí)驗(yàn)中，單鏈寡核苷酸(小于100個(gè)核苷酸)在檢測(cè)細(xì)菌方面優(yōu)于DNA片段探針，例如容易大量合成、批次間的結(jié)果恒定，并且有好的化學(xué)穩(wěn)定性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，為了進(jìn)行雜交，利用T4多核苷酸激酶(Pharmacia)用γ-32P(dATP)這種放射性核苷酸標(biāo)記寡核苷酸的5′末端(Sambrook et al.，1989，分子克隆實(shí)施室手冊(cè)，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使標(biāo)記的寡核苷酸通過(guò)Sephadex G-50TM柱以除去未摻入的放射性核苷酸?；蛘撸部捎蒙锼鼗蜓蟮攸S毒苷標(biāo)記寡核苷酸，可以在其3′末端經(jīng)酶促標(biāo)記或在合成期間在其5′末端直接摻入。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到，也可使用上述三種方法以外的其他標(biāo)記方法。
然后使各個(gè)寡核苷酸探針與得自選自于表4，5，和6的各種細(xì)菌和真菌菌種的DNA雜交，以測(cè)試其特異性。試驗(yàn)的所有細(xì)菌或真菌均可能是與常見(jiàn)感染或分離自臨床標(biāo)本的潛在污染物相關(guān)的病原體。使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)處理方法裂解細(xì)菌細(xì)胞，以從中釋放出靶DNA(Sambrook et al.，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。然后，用常規(guī)方法使DNA變性并不可逆地固定于固相載體(如尼龍或硝酸纖維素膜)上或游離于溶液中。然后使固定的單鏈靶DNA與寡核苷酸探針雜交(Sambrook et al.，文獻(xiàn)同上)。預(yù)雜交條件是在1M NaCl+10％葡聚糖硫酸酯+1％SDS+100μg/μl鮭精DNA中65℃15分鐘。在含有標(biāo)記探針的新鮮預(yù)雜交溶液中于65℃雜交過(guò)夜。雜交后的洗滌條件是在含1％SDS的3×SSC中洗兩次，在含1％SDS的2×SSC中洗兩次，在含1％SDS的1×SSC中洗兩次(全部三種洗滌均是在65℃下15分鐘)，最后在含1％SDS的0.1×SSC中洗一次(25℃，15分鐘)。對(duì)洗過(guò)的濾膜進(jìn)行放射自顯影，以檢測(cè)選擇性雜交的探針。由于使用高嚴(yán)格性的洗滌條件，所以探針與特異靶DNA雜交即表明這兩種DNA的核苷酸序列間有高度相似性。
只有當(dāng)寡核苷酸探針只與其來(lái)源的種或?qū)傥⑸锏腄NA雜交時(shí)才認(rèn)為它是特異的。然后將已發(fā)現(xiàn)為特異的寡核苷酸探針與得自感興趣之種或?qū)俚呐R床分離物(包括ATCC菌株)的微生物DNA雜交以試驗(yàn)其普遍性(即識(shí)別大多數(shù)或所有靶微生物種或?qū)俚姆蛛x物的普遍性探針)。變性處理靶種或?qū)倬甑腄NA，固定在尼龍膜上并按上述方法雜交。如果探針與至少80％的靶種或?qū)俜蛛x物的DNA特異性雜交，即認(rèn)為該探針是普遍適用的。
寡核苷酸引物和探針的特異性和普遍適用性按前兩部分中所述方法，通過(guò)擴(kuò)增DNA或與選自表4、5和6中所列的細(xì)菌或真菌菌種雜交，測(cè)試衍生于我們測(cè)序的或選自數(shù)據(jù)庫(kù)的DNA片段的寡核苷酸引物和探針的特異性。然后再擴(kuò)增(引物)或與靶微生物種或?qū)僦蛛x物的細(xì)菌DNA雜交(探針)，測(cè)試發(fā)現(xiàn)為特異的寡核苷酸的普遍適用性。表7中總結(jié)了寡核苷酸引物的特異性和普遍適用性測(cè)試的結(jié)果。從細(xì)菌或真菌菌種的培養(yǎng)物(見(jiàn)實(shí)施例9和10)直接測(cè)試使用選定擴(kuò)增引物對(duì)之PCR測(cè)試的特異性和普遍適用性。
作為本發(fā)明的主題的各個(gè)種特異性和屬特異性PCR檢測(cè)法都是特異的。對(duì)于細(xì)菌種或?qū)偬禺惖腜CR檢測(cè)法來(lái)說(shuō)，這意味著從靶種或?qū)僖约斑x自表4和5以外的多種細(xì)菌分離的DNA不能被擴(kuò)增。對(duì)于對(duì)白假絲酵母特異的PCR檢測(cè)法來(lái)說(shuō)，則意味著表6所列真菌菌種及選自表4和5之各種細(xì)菌的基因組DNA不能被擴(kuò)增。
作為本發(fā)明主題的各個(gè)種特異性和屬特異性PCR檢測(cè)法也都是普遍適用的(表7)。(i)屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和白假絲酵母的種特異性PCR檢測(cè)法擴(kuò)增了得自各種來(lái)源并代表測(cè)試靶種內(nèi)之差異性的所有或大多數(shù)菌株的基因組DNA(表7)。所有這些菌株的種鑒定均是基于臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)使用的傳統(tǒng)生化方法。(ii)腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌和奈瑟氏球菌屬種特異的屬特異性PCR試驗(yàn)擴(kuò)增了被試靶屬內(nèi)代表每個(gè)靶屬的臨床上重要的所有菌種的全部或大多數(shù)菌株。這些菌株得自各種來(lái)源，是每個(gè)靶屬內(nèi)多樣性的代表。同樣，對(duì)所有這些菌株的菌種鑒定是基于臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)使用的傳統(tǒng)生化方法。更具體地說(shuō)，四種屬特異性的PCR試驗(yàn)擴(kuò)增下列菌種的DNA(1)腸球菌屬特異性試驗(yàn)有效地?cái)U(kuò)增所試驗(yàn)的包括鳥(niǎo)腸球菌、鉛黃腸球菌，殊異腸球菌，耐久腸球菌，糞腸球菌，屎腸球菌，黃色腸球菌，鶉雞腸球菌，海氏腸球菌，蒙氏腸球菌和棉子糖腸球菌在內(nèi)的所有11種腸球菌的DNA。(2)奈瑟氏球菌屬特異性試驗(yàn)有效地?cái)U(kuò)增所試驗(yàn)的包括狗奈瑟氏球菌，灰色奈瑟氏球菌，長(zhǎng)奈瑟氏球菌，淺黃奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，乳糖奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，粘液奈瑟氏球菌，多糖奈瑟氏球菌，干燥奈瑟氏球菌，微黃奈瑟氏球菌和N.Weaveri在內(nèi)所有12種奈瑟氏球菌的DNA。(3)葡萄球菌屬特異性試驗(yàn)有效地?cái)U(kuò)增所試驗(yàn)的包括金黃色葡萄球菌，耳葡萄球菌，頭壯葡萄球菌，科氏葡萄球菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，路鄧葡萄球菌，腐生葡萄球菌，施氏葡萄球菌，模仿葡萄球菌，沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌在內(nèi)的14種葡萄球菌中13種的DNA。不能被擴(kuò)增的葡萄球菌菌種是松鼠葡萄球菌。(4)最后，鏈球菌屬特異性試驗(yàn)有效地?cái)U(kuò)增所試驗(yàn)的包括無(wú)乳鏈球菌，咽峽炎鏈球菌，牛鏈球菌，咽峽炎鏈球菌，嵴鏈球菌，停乳鏈球菌，馬鏈球菌，格氏鏈球菌，中間鏈球菌，緩癥鏈球菌，變異鏈球菌，口腔鏈球菌，副血鏈球菌，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，唾液鏈球菌，血鏈球菌，表兄鏈球菌，豬鏈球菌，乳房鏈球菌，前庭鏈球菌和綠色鏈球菌在內(nèi)的所有22種鏈球菌的DNA。另一方面，鏈球菌屬特異性試驗(yàn)并不擴(kuò)增9個(gè)變異鏈球菌菌株中的3個(gè)，和23個(gè)唾液鏈球菌菌株中的1個(gè)菌株，因而顯示對(duì)于這兩種鏈球菌的普遍適用性稍差一些。
附錄VI中列出了所研究的每個(gè)靶微生物種或?qū)倩蚩股乜剐曰虻乃刑禺愋院推毡檫m用性擴(kuò)增引物。測(cè)序的DNA片段中可以存在一些差異性，因?yàn)檫@些序列或其部分的差異性并不影響探針或擴(kuò)增引物的特異性。變種的細(xì)菌DNA也屬于本發(fā)明的范圍。
使用參考菌株及得自各種不同地理位置的臨床分離物試驗(yàn)附錄VI中所列的所有PCR擴(kuò)增引物的特異性和普遍適用性。用于測(cè)試擴(kuò)增和雜交檢驗(yàn)法的351個(gè)參考菌株(表4、5和6)得自(i)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)85％，(ii)Laboratoire de sant’epublique du Quebec(LSPQ)10％，(iii)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)3％，(iv)國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC)1％和(v)世界各地的幾個(gè)其他參考實(shí)驗(yàn)室1％。這些參考菌株代表了(i)90種革蘭氏陰性細(xì)菌(169個(gè)菌株；表4)(ii)97種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(154個(gè)菌株；表5)(iii)12種真菌(28個(gè)菌株；表6)。
抗生素抗性基因抗微生物抗性擾亂治療過(guò)程并常常導(dǎo)致治療失敗。此外，濫用抗生素必然會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌抗性的出現(xiàn)。我們的目的是在1個(gè)小時(shí)內(nèi)為臨床醫(yī)生提供開(kāi)具最佳治療方案所需的信息。除了用基于DNA的通用細(xì)菌檢測(cè)試驗(yàn)迅速鑒定陰性的臨床標(biāo)本，并用種特異性和/或?qū)偬禺愋缘幕贒NA的試驗(yàn)鑒定陽(yáng)性標(biāo)本中特異性病原體的存在之外，臨床醫(yī)生還定時(shí)需要關(guān)于細(xì)菌病原體對(duì)抗生素治療之耐受能力的信息。我們感到，迅速估計(jì)細(xì)菌對(duì)抗微生物劑之耐受能力的最有效策略就是直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中最常見(jiàn)的和臨床上最重要的抗生素抗性基因(即基于DNA的檢測(cè)抗生素抗性基因的試驗(yàn))。由于可從數(shù)據(jù)庫(kù)中得到最重要和最常見(jiàn)的細(xì)菌抗生素抗性基因的序列，所以我們的策略是使用部分或整個(gè)抗性基因的序列設(shè)計(jì)可用作建立基于DNA的快速試驗(yàn)之基礎(chǔ)的特異性寡核苷酸引物或探針。序列表中給出了基于其臨床相關(guān)性(即高發(fā)生率和重要性)而選擇的各個(gè)細(xì)菌抗生素抗性基因的序列。表9和10總結(jié)了所選擇的抗生素抗性基因的某些特征。因?yàn)榭稍谕籔CR擴(kuò)增條件下以多重檢測(cè)法同時(shí)進(jìn)行抗生素抗性基因檢測(cè)和細(xì)菌檢測(cè)與鑒定(實(shí)施例13)，所以我們的方法是獨(dú)特的。
附錄IV列出了在PCR檢測(cè)法中試驗(yàn)的選自26種臨床上重要的抗生素抗性基因的所有擴(kuò)增引物。試驗(yàn)幾種已知攜帶靶基因并得自不同國(guó)家的抗性細(xì)菌分離物，以確認(rèn)用于抗生素抗性基因檢測(cè)和鑒定的各種PCR檢測(cè)法。還測(cè)試了許多不攜帶靶抗性基因的菌株，以確保所有試驗(yàn)都是特異的。至此，已知所有抗生素抗性基因的PCR檢測(cè)法都是高度特異的，并檢測(cè)出了已知攜帶靶基因的所有對(duì)照抗性菌株。表11和12中給出了用于檢測(cè)和鑒定抗生素抗性基因的一系列PCR檢測(cè)法的某些臨床研究結(jié)果，以及這些基于DNA的檢測(cè)法與標(biāo)準(zhǔn)抗微生物劑敏感性試驗(yàn)方法的相互關(guān)系。
通用細(xì)菌檢測(cè)在常規(guī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，很大比例的細(xì)菌鑒定送檢臨床標(biāo)本都是培養(yǎng)陰性的(表4)。在進(jìn)行特異性鑒定并篩選出大量陰性標(biāo)本之前用通用擴(kuò)增引物或通用探針測(cè)試臨床樣品，以檢測(cè)細(xì)菌的存在是有用的。因?yàn)檫@樣可以節(jié)省費(fèi)用并有可能迅速修正對(duì)病人的臨床治療方案。因此從細(xì)菌tuf基因序列的高保守部分合成了多個(gè)擴(kuò)增引物和探針。通用引物的選擇是基于用實(shí)施例1和附錄1中所述的由我們測(cè)定的序列或選自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列構(gòu)成的多重序列對(duì)比。
為了鑒定適于細(xì)菌通用檢測(cè)的數(shù)據(jù)庫(kù)序列，我們利用了可得到兩種相隔較遠(yuǎn)的微生物(即屈曲支原體(Mycoplasma genitalium)和流感嗜血菌的完整基因組序列這一事實(shí)。比較由這兩種不同微生物的基因組編碼的所有蛋白質(zhì)的氨基酸序列，即可鑒定出高度同源的蛋白質(zhì)。分析這些同源蛋白質(zhì)即可選擇出某些可用于檢測(cè)細(xì)菌的基于DNA的通用檢測(cè)法的有希望的首選序列。由于從數(shù)據(jù)庫(kù)中可得到幾種其他微生物基因組的完整核苷酸序列，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員在比較屈曲支原體和流感嗜血菌以外微生物的基因組序列后可得出同樣的結(jié)論。選擇的tuf基因編碼在蛋白質(zhì)合成期間參予翻譯過(guò)程的一種蛋白質(zhì)(EF-Tu)。最后，用數(shù)據(jù)庫(kù)中可得到的tuf基因序列以及如前所述我們已確定的新的tuf序列進(jìn)行深入的核苷酸序列分析。利用GCG程序進(jìn)行氨基酸和核苷酸序列的所有計(jì)算機(jī)分析。然后借助OligoTM程序選擇出對(duì)細(xì)菌進(jìn)行通用擴(kuò)增的最佳PCR引物。使所選擇的引物在幾個(gè)核苷酸位置上發(fā)生簡(jiǎn)并，并含有幾個(gè)次黃苷以便擴(kuò)增所有臨床相關(guān)菌種(附錄1)的DNA。次黃苷是能夠與四種核苷酸A、C、G或T中的任何一種特異結(jié)合的一種核苷酸類(lèi)似物。簡(jiǎn)并的寡核苷酸是由在錯(cuò)配位置上具有四種核苷酸A、C、G或T中兩種或多種的寡核苷酸混合物組成的。在擴(kuò)增引物中包括次黃苷和/或簡(jiǎn)并可耐受錯(cuò)配，從而得以擴(kuò)增較寬系列的靶核苷酸序列(Dieffenbach and Dveksler，1995，PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，N Y)。
用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增的條件與用于種和屬特異性擴(kuò)增試驗(yàn)的條件基本相同，只是退火溫度為50℃而不是55℃。該通用PCR檢測(cè)對(duì)于檢測(cè)細(xì)菌是特異的，并且?guī)缀跏瞧毡檫m用的。經(jīng)擴(kuò)增分離自表6中所列12種真菌菌種的基因組DNA和得自Leishmania donovani、釀酒酵母及人淋巴細(xì)胞的基因組DNA，進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)細(xì)菌的特異性。上述真核細(xì)胞DNA制劑均不能用通用檢測(cè)法擴(kuò)增，從而提示該試驗(yàn)是細(xì)菌特異的。對(duì)代表95種臨床上最相關(guān)菌種之共116個(gè)參照菌株的基因組DNA的擴(kuò)增證實(shí)了通用檢測(cè)法的普遍適用性。這些菌種是從表4和表5中所列細(xì)菌菌種中選擇出來(lái)的。我們發(fā)現(xiàn)，這116個(gè)菌株中有104個(gè)可以得到擴(kuò)增。不能被擴(kuò)增的細(xì)菌菌種屬于棒桿菌屬(11種)和寡養(yǎng)單胞菌屬(1種)。最近已測(cè)定了得自這些菌種的tuf基因。已利用此測(cè)序數(shù)據(jù)選擇可能更為普遍適用的新的通用引物。這些引物正在受測(cè)試。我們還觀察到，為了獲得有效的擴(kuò)增，對(duì)幾個(gè)菌種必須將退火溫度降低到45℃。這些細(xì)菌種類(lèi)包括麻疹孿生球菌(Gemella morbilbrum)、利斯特氏菌(3種)和陰道加德納氏菌。特別值得提到的是，從表4和5中選擇出來(lái)用于試驗(yàn)通用檢測(cè)法之普遍適用性的95種細(xì)菌包括與人在公共場(chǎng)所或醫(yī)院內(nèi)獲得的各種感染(鼻粘膜感染)有關(guān)的所有臨床最相關(guān)的菌種。表1和2中列出了臨床上最重要的細(xì)菌和真菌病原體。
實(shí)施例和附錄下列實(shí)施例和附錄旨在舉例說(shuō)明本發(fā)明的各種方法和化合物，而不是限制其范圍。
各附錄顯示用于從tuf序列或recA基因挑選擴(kuò)增引物的策略(i)附錄1說(shuō)明用于從tuf序列中選擇通用擴(kuò)增引物的策略。(ii)附錄II顯示用于從tuf序列選擇腸球菌屬特異的擴(kuò)增引物的策略。(iii)附錄III說(shuō)明用于從tuf序列選擇葡萄球菌屬特異的擴(kuò)增引物的策略。(iv)附錄IV顯示用于從tuf序列中選擇對(duì)白假絲酵母特異的擴(kuò)增引物的策略。(v)附錄V舉例說(shuō)明用于從recA序列中選擇對(duì)鏈球菌屬特異的擴(kuò)增引物的策略。(vi)附錄VI給出所選擇的所有引物對(duì)。如這些附錄中所示，選出的擴(kuò)增引物可含有次黃苷和/或簡(jiǎn)并核苷酸。次黃苷是一種能夠與四種核苷酸A、C、G或T中任何一種特異結(jié)合的核苷酸類(lèi)似物?；蛘撸嗫墒褂糜稍阱e(cuò)配位點(diǎn)上具有A、C、G或T中兩種或多種核苷酸的寡核苷酸混合物組成的簡(jiǎn)并寡核苷酸。擴(kuò)增引物中包括次黃苷和/或簡(jiǎn)并核苷酸使之得以耐受錯(cuò)配，從而允許擴(kuò)增更寬系列的靶核苷酸序列(Dieffenbach and Dveksler，1995，PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
實(shí)施例實(shí)施例1從tuf序列中選擇通用PCR引物如附錄I中所示，比較各種細(xì)菌和真核物種的tuf序列得以選擇檢測(cè)細(xì)菌所通用的PCR引物。用于設(shè)計(jì)PCR引物的策略是基于對(duì)各種tuf序列的多重序列對(duì)比分析。該多重序列對(duì)比包括由我們確定的或選自數(shù)據(jù)庫(kù)的38種細(xì)菌和3種真核生物(表13)的tuf序列。仔細(xì)分析此多重序列對(duì)比即可以選出在真細(xì)菌內(nèi)保守但與真核生物的序列不同的引物序列，從而使得可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行通用檢測(cè)。如附錄I中所示，選出的引物含有幾個(gè)次黃苷和簡(jiǎn)并核苷酸。這是必要的，因?yàn)楸M管tuf基因是高度保守的，但細(xì)菌tuf序列間有相對(duì)較高的多態(tài)性。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)由我們確定的tuf序列中有許多核苷酸變異使一些氨基酸缺失和/或插入。所選出的通用引物對(duì)細(xì)菌是特異的和普遍適用的(表7)。試驗(yàn)了95種臨床上最重要的細(xì)菌，其中12未被擴(kuò)增。這些種屬于棒桿菌屬(11種)和寡養(yǎng)單胞菌屬(15種)。這些通用引物并不擴(kuò)增非細(xì)菌來(lái)源的DNA(包括人和其他類(lèi)型的真核DNA)。
實(shí)施例2從tuf序列中選擇屬特異性PCR引物如附錄2和3中所示，比較多種細(xì)菌的tuf序列得以選擇出對(duì)腸球菌或葡萄球菌屬特異的PCR引物。用于設(shè)計(jì)PCR引物的策略是基于對(duì)各種tuf序列的多重序列對(duì)比的分析。這些多重序列對(duì)比包括選自各個(gè)靶屬的4種有代表性的細(xì)菌的tuf序列及選自其他密切相關(guān)細(xì)菌屬之細(xì)菌種的tuf序列，仔細(xì)分析那些序列即可選擇出在靶屬內(nèi)保守但可以區(qū)分其他密切相關(guān)屬的序列的寡核苷酸序列，從而可以對(duì)靶細(xì)菌屬進(jìn)行屬特異性和普遍存在性檢測(cè)與鑒定。
為了選擇對(duì)腸球菌屬特異的引物(附錄II)，我們測(cè)定了鳥(niǎo)腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和鶉雞腸球菌的tuf基因約890bp的部分序列。序列對(duì)比中所使用的所有其他tuf序列都是由我們測(cè)序的或選自數(shù)據(jù)庫(kù)的。分析該序列對(duì)比即可選擇出對(duì)腸球菌屬種特異的和普遍適用的引物對(duì)(表7)。所有11種被試驗(yàn)的腸球菌均得到有效擴(kuò)增，而對(duì)其他屬的細(xì)菌種的基因組DNA沒(méi)有擴(kuò)增。
為了選擇對(duì)葡萄球菌屬特異的引物(附錄III)，我們還測(cè)定了金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌和模仿葡萄球菌之tuf基因約890bp的部分序列。序列對(duì)比中使用的所有其他tuf序列都是由我們測(cè)序的或選自數(shù)據(jù)庫(kù)的。分析該序列對(duì)比即可選擇出對(duì)葡萄球菌屬特異和普遍適用的兩對(duì)引物(表7)。附錄III顯示用于選擇這兩個(gè)PCR引物對(duì)之一的策略。利用同一策略選擇另一引物對(duì)。在所試驗(yàn)的14種葡萄球菌中，有1種(松鼠葡萄球菌)不能使用這兩對(duì)引物中任何一對(duì)通過(guò)葡萄球菌屬特異性PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。使用兩引物對(duì)中任何一對(duì)進(jìn)行PCR試驗(yàn)時(shí)，對(duì)其他細(xì)菌屬中各菌種的DNA均未見(jiàn)具有擴(kuò)增。
實(shí)施例3從tuf序列中選擇對(duì)白假絲酵母特異的PCR引物如附錄IV中所示，比較得自多種細(xì)菌和真核生物物種的tuf序列，即可選擇出對(duì)白假絲酵母特異的PCR引物。用于設(shè)計(jì)PCR引物的策略是基于對(duì)各種tuf序列之多重序列對(duì)比的分析。該多重序列對(duì)比包括由我們研究組確定的選自假絲酵母屬的5種有代表性真菌(即白假絲酵母、C.glabrata、克魯斯假絲酵母、近平滑假絲酵母和熱帶假絲酵母)的tuf序列以及得自其他密切相關(guān)真菌菌種的tuf序列。還包括各種細(xì)菌菌種的tuf序列。仔細(xì)分析該序列對(duì)比即可從白假絲酵母的tuf序列中選出引物；這些引物可以區(qū)分其他密切相關(guān)的假絲酵母和其他真菌菌種，從而可以對(duì)白假絲酵母進(jìn)行種特異性和普遍適用性檢測(cè)與鑒定(表7)。試驗(yàn)的所有88個(gè)白假絲酵母菌株均得到有效擴(kuò)增，而對(duì)其他種真菌或細(xì)菌和基因組DNA沒(méi)有擴(kuò)增。
實(shí)施例4從recA中選擇鏈球菌屬特異的PCR引物如附錄V中所示，依據(jù)對(duì)可從數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank和EMBL)得到的各種細(xì)菌recA基因序列的比較選擇對(duì)鏈球菌屬特異和普遍適用的PCR引物。由于可得到包括5種鏈球菌在內(nèi)的許多種細(xì)菌的recA基因序列，故有可能選擇出在鏈球菌屬內(nèi)保守但不同于其他細(xì)菌屬的recA序列的序列。當(dāng)這5種鏈球菌的recA基因序列間有錯(cuò)配時(shí)，即將一個(gè)次黃苷摻入引物中(附錄V)。經(jīng)選擇的各包括1個(gè)次黃苷并且沒(méi)有簡(jiǎn)并核苷酸的引物是鏈球菌屬種特異的和普遍適用的(表7)。該P(yáng)CR法擴(kuò)增了所試驗(yàn)的所有22種鏈球菌。然而，鏈球菌特異性檢測(cè)法并沒(méi)有擴(kuò)增9個(gè)變異鏈球菌菌株中的3個(gè)和3個(gè)唾液鏈球菌菌株中的1個(gè)菌株的DNA。對(duì)其他屬細(xì)菌的基因組DNA沒(méi)有擴(kuò)增(表7)。
實(shí)施例5DNA片段的核苷酸測(cè)序使用雙脫氧核苷酸鏈終止測(cè)序方法(Sanger et al.，1997，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，745463-5467)測(cè)定各種細(xì)菌或真菌的tuf基因的部分核苷酸序列。使用Applied Biosystems自動(dòng)DNA測(cè)序儀(373A型)及其PRISMTMSquenase終止子雙鏈DNA測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer Corp.，Applied Biosystems Division，F(xiàn)osterCity，CA)進(jìn)行序列測(cè)定。由于測(cè)序引物可與兩種細(xì)菌tuf基因(tufA和tuf B)雜交，所以測(cè)序策略并不能區(qū)分tuf A和tuf B基因。序列表中給出了這些DNA序列(SEQ ID NO.118至146)。由我們的研究小組確定的各種tuf基因序列中幾個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸的存在(表13)與tufA和tuf B之間的序列差異一致。
寡核苷酸引物和探針選擇。使用OligoTM程序，從給定的有優(yōu)先權(quán)的DNA片段或數(shù)據(jù)庫(kù)序列中選擇寡核苷酸探針和擴(kuò)增引物，并使用自動(dòng)ABI DNA合成儀(391型，Perkin-Elmer Corp.，Appliedbiosystems Diviosn)以亞磷酰胺化學(xué)法合成之。
實(shí)施例6標(biāo)記寡核苷酸以用于雜交試驗(yàn)。如前所述，通過(guò)T4多核苷酸激酶(Pharmacia)用γ-32P(dATP)5′末端標(biāo)記每個(gè)寡核苷酸。標(biāo)記物也可以是非放射活性的。
寡核苷酸探針的特異性試驗(yàn)。將所有標(biāo)記的寡核苷酸探針與前述表4、5和6中選出的各種細(xì)菌和真菌的DNA雜交，以試驗(yàn)其特異性。種特異性或?qū)偬禺愋蕴结樖侵慌c它們來(lái)源的微生物種或?qū)俚腄NA雜交的那些探針。按下述方法對(duì)發(fā)現(xiàn)為特異的寡核苷酸探針進(jìn)行普遍適用性試驗(yàn)。
寡核苷酸探針的普遍適用性試驗(yàn)。然后用得自各個(gè)不同國(guó)家并代表各靶種或?qū)賰?nèi)多樣性的、包括參考菌株及其他菌株的靶種或?qū)賰?nèi)菌株對(duì)特異性寡核苷酸探針進(jìn)行普遍適用性試驗(yàn)。將各分離物的染色體DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并用特異性試驗(yàn)中所述的標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。構(gòu)成每個(gè)靶種或?qū)俚姆蛛x物組包括參考的ATCC菌株以及得自各種來(lái)源的多種臨床分離物。普遍適用的探針是與靶種或?qū)俚倪@組臨床分離物中至少80％的DNA雜交的探針。
實(shí)施例7基本上與實(shí)施例6相同，但使用特異性寡核苷酸探針群進(jìn)行微生物鑒定，以便(i)提高靈敏度并保證有100％的普遍適用性，或(ii)同時(shí)鑒定一個(gè)以上的微生物種和/或?qū)佟？蓮奈⑸锱囵B(yǎng)物或直接從任何臨床標(biāo)本鑒定微生物。
實(shí)施例8基本上按照實(shí)施例6所述的方法直接檢測(cè)臨床樣品中的細(xì)菌或真菌。將生物學(xué)樣品直接上樣到點(diǎn)印跡裝置上，在原位裂解細(xì)胞，以進(jìn)行細(xì)菌或真菌檢測(cè)與鑒定。應(yīng)對(duì)血液樣品作肝素化處理，以避免因凝血而干擾其在點(diǎn)印跡裝置上的上樣。
實(shí)施例9PCR擴(kuò)增。利用PCR技術(shù)增加檢測(cè)法的靈敏度和速度。通過(guò)PCR檢測(cè)法直接由細(xì)菌菌落或標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)菌懸液試驗(yàn)各組引物(見(jiàn)實(shí)施例10)，以確定其特異性和普遍適用性(表7)。附錄VI中列出了特異并普遍適用的PCR引物對(duì)的實(shí)例。
擴(kuò)增引物的特異性和普遍適用性試驗(yàn)。對(duì)如前所述選自表4、5和6的多種細(xì)菌和真菌的DNA試驗(yàn)選出的所有PCR引物對(duì)的特異性。然后試驗(yàn)?zāi)切┌l(fā)現(xiàn)對(duì)每個(gè)種或?qū)偬禺惖囊飳?duì)的普遍適用性，以確保每組引物都能擴(kuò)增靶種或?qū)俚囊慌蛛x物中至少90％的DNA。構(gòu)成每個(gè)種的分離物組包括參考的ATCC菌株和代表各個(gè)種或?qū)賰?nèi)多樣性的采自世界各地的各種臨床分離物。
應(yīng)采取標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施以避免假陽(yáng)性PCR結(jié)果(Kwok andHiguchi，1989，自然，239237-238)。可使用失活PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(例如用尿嘧啶-N-糖基化酶失活)來(lái)控制PCR樣品遺留。
實(shí)施例10直接從細(xì)菌或酵母培養(yǎng)物擴(kuò)增。直接對(duì)細(xì)菌菌落或細(xì)菌懸液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后者調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)McFarland 0.5(相當(dāng)于大約1.5×108個(gè)細(xì)菌/ml)。在直接從菌落擴(kuò)增的情況下，使用塑料棒將一部分菌落直接轉(zhuǎn)移到含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、0.1％TritonX-100、2.5mM MgCl2、各0.4μm的每一引物、各200μm的四種dNTP和與TaqStartTM抗體(Clontch Laboratories Inc.)聯(lián)用的0.5單位TaqDNA聚合酶(Promega)的20μl PCR反應(yīng)混合物內(nèi)。對(duì)于細(xì)菌懸液來(lái)說(shuō)，將1μl細(xì)胞懸液加到19μl同樣的PCR反應(yīng)混合物中。為了由酵母培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，將經(jīng)離心濃縮100倍的1μl標(biāo)準(zhǔn)McFarland1.0(相當(dāng)于大約3.0×108菌體/ml)直接加到PCR反應(yīng)中。對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行這種濃縮處理是因?yàn)榻湍讣?xì)胞的McFarland 0.5的細(xì)胞數(shù)大約比細(xì)菌細(xì)胞的McFarland 0.5低200倍。
使用PGC-200熱循環(huán)儀對(duì)PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)(95℃3分鐘，然后進(jìn)行95℃1秒種的變性步驟和55℃30秒鐘的退火-延伸步驟，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))。然后用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠(2％)電泳法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在紫外燈(254nm)下肉眼觀察含有0.25μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中的擴(kuò)增產(chǎn)物。在大約1小時(shí)內(nèi)完成整個(gè)PCR檢測(cè)法。
使用衍生于細(xì)菌16S核糖體RNA基因之高度保守區(qū)域的引物序列作為所有PCR反應(yīng)的內(nèi)部對(duì)照。或者，內(nèi)部對(duì)照也可衍生自未見(jiàn)于微生物中或人類(lèi)基因組中的其他序列。將內(nèi)部對(duì)照摻入所有擴(kuò)增反應(yīng)中，以證實(shí)PCR檢測(cè)法的效率并確保不存在明顯的PCR抑制。衍生于rRNA的內(nèi)部對(duì)照亦可用于監(jiān)測(cè)細(xì)菌裂解步驟的效率。多重PCR檢測(cè)法同時(shí)完成內(nèi)部對(duì)照和種特異性或?qū)偬禺愋詳U(kuò)增。
實(shí)施例11直接從尿標(biāo)本擴(kuò)增。為了直接從尿標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將1μl尿液與4μl含有500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH9.0)、1％TritonX-100的裂解溶液混合。室溫保溫至少15分鐘后，將1μl經(jīng)處理的尿液樣品直接加到19μl PCR反應(yīng)混合物中。PCR試劑的終濃度為50mMKCl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、0.1％Triton X-100、2.5mMMgCl2、各0.4μM的每一引物、各200μM的四種dNTP。此外，每20μl反應(yīng)混合物中含有與TaqStartTM抗體(Clontech Laboratory Inc.)結(jié)合的0.5單位TaqDNA聚合酶(Promega)。
內(nèi)部對(duì)照、PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測(cè)的策略如上文實(shí)施例10所述。
實(shí)施例12抗生素抗性基因的檢測(cè)。使用以前所述的PCR擴(kuò)增或雜交方法鑒定常見(jiàn)的和臨床上相關(guān)的特異性抗生素抗性基因的存在。從抗生素抗性基因序列中選擇用作基于DNA的試驗(yàn)之基礎(chǔ)的特異性寡核苷酸。可直接從臨床標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)菌懸液或細(xì)菌菌落進(jìn)行這些迅速估計(jì)細(xì)菌對(duì)抗抗微生物劑之抗性的試驗(yàn)，這種試驗(yàn)應(yīng)能對(duì)細(xì)菌通用檢測(cè)及種特異性和屬特異性微生物檢測(cè)與鑒定的診斷試驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充。
實(shí)施例13基本上與實(shí)施例10和11相同，但這里使用多重PCR方法(即在一個(gè)PCR反應(yīng)中使用幾對(duì)引物)以達(dá)到對(duì)特異性靶病原體的100％普遍適用性。對(duì)于更異源的微生物種或?qū)賮?lái)說(shuō)，可能需要PCR引物對(duì)組合，以檢測(cè)和鑒定靶種或?qū)俚乃写怼?br> 可使用多重PCR檢測(cè)法，以(i)同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)種或?qū)俚奈⑸?，或?ii)直接從臨床標(biāo)本或從細(xì)菌培養(yǎng)物檢測(cè)和鑒定細(xì)菌和/或真菌病原體，并同對(duì)檢測(cè)特異性抗生素抗性基因。
為了進(jìn)行這些檢測(cè)，應(yīng)調(diào)整擴(kuò)增子檢測(cè)方法以區(qū)分所產(chǎn)生的各種擴(kuò)增子?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳法，因?yàn)樗軌蚧诖笮?lái)分辨擴(kuò)增子。為此目的所采用的另一個(gè)有用的策略是使用以不同波長(zhǎng)發(fā)光的多種熒光染料進(jìn)行檢測(cè)。熒光染料可與連接到熒光猝滅劑上的特異性寡核苷酸偶聯(lián)，而猝滅劑則在擴(kuò)增期間發(fā)生降解而釋放熒光染料(如TaqManTM，Perkin Elmer)。
實(shí)施例14擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，也可使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳(實(shí)施例10)以外的可代用方法顯示擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣的方法可以是基于熒光偏振或基于擴(kuò)增后的熒光檢測(cè)(如AmplisensorTM，Biotronics；TaqManTM，Perkin-Elmer Corp.)或其他標(biāo)記如生物素(SHARP SignalTM系統(tǒng)，Digene Diagnistics)。這些方法是定量的，并且可以自動(dòng)化。將擴(kuò)增引物之一或衍生于種特異性、屬特異性或通用DNA片段的對(duì)擴(kuò)增子特異的內(nèi)部寡核苷酸探針與熒光染料或任何其他標(biāo)記物偶聯(lián)。因?yàn)榛跈z測(cè)熒光的方法快速而且可以變通(因可利用在不同波長(zhǎng)發(fā)射熒光的熒光染料)，所以這些方法特別適用于診斷試驗(yàn)。
實(shí)施例15可以在連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、自身維持的序列復(fù)制(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、循環(huán)探針技術(shù)(CPT)和分支DNA(bDNA)等其他快速擴(kuò)增方法或其它方法中使用種特異性、屬特異性、通用及抗生素抗性基因擴(kuò)增引物以提高試驗(yàn)的靈敏度?？梢詮姆蛛x的細(xì)菌培養(yǎng)物或直接從任何臨床標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增。因此本發(fā)明的范圍不只限于使用公開(kāi)序列表中的DNA序列進(jìn)行PCR反應(yīng)，而且包括使用能夠提高試驗(yàn)之快速性和靈敏度的任何方法來(lái)特異地檢測(cè)細(xì)菌DNA。
實(shí)施例16試驗(yàn)試劑盒應(yīng)包括若干組對(duì)各個(gè)種或?qū)傥⑸锾禺惖奶结?，以及一組通用探針。試劑盒為試驗(yàn)組分形式的，包括用于檢測(cè)特定類(lèi)型臨床樣品中各種病原體的以非放射活性標(biāo)記物標(biāo)記的一套通用探針及標(biāo)記的種或?qū)偬禺愋蕴结槨Ｔ噭┖幸舶ㄍ瓿深A(yù)雜交、雜交、洗滌步驟和雜交體檢測(cè)所必需的試驗(yàn)試劑。最后，還應(yīng)包括用于檢測(cè)已知抗生素抗性基因(或其衍生物)的試驗(yàn)成分。當(dāng)然，試劑盒也應(yīng)包括用作各雜交試驗(yàn)之陰性和陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
試驗(yàn)盒中的成分應(yīng)能適于每一種標(biāo)本類(lèi)型，以檢測(cè)該類(lèi)標(biāo)本中的常見(jiàn)病原體。還包括對(duì)細(xì)菌進(jìn)行通用檢測(cè)的試劑。根據(jù)感染的部位，可開(kāi)發(fā)出下列病原體特異性檢測(cè)試劑盒-常規(guī)檢測(cè)所有臨床標(biāo)本中的細(xì)菌或真菌病原體的試劑盒，其包括有幾套對(duì)微生物基因組高保守區(qū)特異的探針。
-用于檢測(cè)尿樣品中微生物病原體的試劑盒，其含有5種特異性試驗(yàn)成分(即用來(lái)檢測(cè)屎腸球菌、腸球菌屬種、腐生葡萄球菌、葡萄球菌屬種和白假絲酵母的探針組)。
-用于檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒，其含有3種特異性試驗(yàn)成分(即用于檢測(cè)葡萄球菌屬種、腸球菌屬種和白假絲酵母的探針組)。
-用于檢測(cè)血液樣品中的病原體的試劑盒，其含有10種特異性試驗(yàn)成分(即用于檢測(cè)鏈球菌屬種、無(wú)乳鏈球菌、葡萄球菌屬種、腐生葡萄球菌、腸球菌屬種、屎腸球菌、奈瑟氏球菌屬種、腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細(xì)菌增生利斯特氏菌和白假絲酵母的探針組)。該試劑盒也可用直接檢測(cè)和鑒定血液培養(yǎng)物中的病原體。
-用于檢測(cè)腦膜炎病原體的試劑盒，其含有5種特異性試驗(yàn)成分(即用于檢測(cè)鏈球菌屬種、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、奈瑟氏球菌屬種和葡萄球菌屬種的探針組)。
-用于檢測(cè)臨床上重要的抗生素抗性基因的試劑盒，其含有特異檢測(cè)下列26種抗生素抗性相關(guān)基因中至少一種的探針組blatem、blarob、blashv、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aacA4、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、mecA、vanA、vanB、vanC、satA、aac(6′)-aph(2″)、aad(6′)、vat、vga、msrA、sul和int。
-還可開(kāi)發(fā)適于檢測(cè)皮膚、腹部傷口或任何其他臨床相關(guān)感染的其他試劑盒。
實(shí)施例17基本上與實(shí)施例16相同，所不同的是試驗(yàn)試劑盒含有完成DNA擴(kuò)增檢測(cè)所需的所有試劑及對(duì)照物。診斷試劑盒適于以PCR(或其他擴(kuò)增方法)直接從臨床樣品或微生物培養(yǎng)物完成擴(kuò)增。其中將包括完成(i)通用細(xì)菌檢測(cè)、(ii)種特異性和屬性異性細(xì)菌和/或真菌檢測(cè)與鑒定，以及(iii)抗生素抗性基因檢測(cè)所需的成分。
可在試管中或有多個(gè)孔的微量滴定板中進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)。為在平板中檢測(cè)，小孔內(nèi)應(yīng)含有特異擴(kuò)增引物和對(duì)照DNA，并且應(yīng)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的自動(dòng)化。直接從臨床標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)的試劑盒中將包括用于通用細(xì)菌檢測(cè)的試劑及擴(kuò)增引物。直接檢驗(yàn)細(xì)菌或真菌培養(yǎng)物的試劑盒及直接檢驗(yàn)任何類(lèi)型臨床標(biāo)本的試劑盒中，將包括進(jìn)行種特異性和屬特異性細(xì)菌和/或真菌檢測(cè)與鑒定，以及同時(shí)進(jìn)行抗生素抗性基因檢測(cè)所需的成分。
試劑盒將適用于如實(shí)施例16中所述基于雜交的診斷試劑盒所檢測(cè)的各種類(lèi)型標(biāo)本。
實(shí)施例18應(yīng)明確的是，使用如本發(fā)明所述的探針和擴(kuò)增引物進(jìn)行細(xì)菌和/或真菌檢測(cè)與鑒定不只限于應(yīng)用在臨床微生物學(xué)方面。事實(shí)上，我們覺(jué)得其他一些方面也可得益于這一新技術(shù)。例如，這些試驗(yàn)可在工業(yè)上用于食品、水、空氣、醫(yī)藥產(chǎn)品及需要進(jìn)行微生物學(xué)監(jiān)控的其他產(chǎn)品的質(zhì)量控制中。這些試驗(yàn)也可用于檢測(cè)與鑒定人以外的其他生物體(例如其他靈長(zhǎng)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、植物、哺乳動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、家畜等)的生物學(xué)樣品中的細(xì)菌或真菌。這些診斷工具對(duì)于包括臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)研究在內(nèi)的研究工作也是很有用的。
雖然上文已詳細(xì)描述了本發(fā)明，但顯然可以在不背離本發(fā)明精神的前提下對(duì)本發(fā)明作出各種改動(dòng)，而這些改動(dòng)仍將包括在如待批權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
表1在美國(guó)引起各種人類(lèi)感染的鼻粘膜病原體的分配(％)1病原體 UTI2SSI3BSI4肺炎 CSF5大腸桿菌27 9 54 2金黃色葡萄球菌 2 2117 21 2表皮葡萄球菌2 6 20 0 1糞腸球菌16 12920 0屎腸球菌1 1000 0銅綠假單胞菌12 9 318 0肺炎克雷伯氏菌 7 3 49 0奇異變形菌 5 3 12 0肺炎鏈球菌 0 0 31 18B組鏈球菌 1 1 21 6其他鏈球菌 3 5 21 3流感嗜血菌 0 0 06 45腦膜炎奈瑟氏球菌0 0 00 14單核細(xì)胞增生利斯特氏菌 0 0 00 3其他腸球菌 1 1 00 0其他葡萄球菌2813 20白假絲酵母 9 3 55 0其他假絲酵母213 10腸球菌屬種57 4 122不動(dòng)桿菌屬種 11 2 4 2檸檬酸桿菌屬種21 1 1 0粘質(zhì)沙雷氏菌 11 1 3 1其他克雷伯氏菌11 1 2 1其他 06 4 5 01.數(shù)據(jù)是由美國(guó)鼻粘膜感染監(jiān)測(cè)中心(NNIS)從80家醫(yī)院記錄的(Emori和Gaynes，1993，臨床微生物學(xué)綜述，6428-442)。
2.尿路感染3.手術(shù)部位感染4.血流感染5.腦脊髓液表2在魁北克(1995)、加拿大(1992)、英國(guó)(1969-1988)和美國(guó)(1990-1992)血流感染病原體的分配(％)英國(guó)3美國(guó)4生物體魁北克1加拿大2從社區(qū)獲得的 從醫(yī)院獲得的 從醫(yī)院獲得的大腸桿菌 15.6 53.824.8 20.3 5.0表皮葡萄球菌 25.8 NI60.5 7.2 31.0及其他CoNS5金黃色葡萄球菌 9.6 NI 9.7 19.4 16.0肺炎葡萄球菌 6.3 NI 22.5 2.2 NR7糞腸球菌 3.0 NI 1.0 4.2 NR屎腸球菌 2.6 NI 0.2 0.5 NR腸球菌屬種 NRNI NR NR9.0流感嗜血桿菌 1.5 NR 3.4 0.4 NR銅綠假單胞菌 1.5 8.2 1.0 8.2 3.0肺炎克雷伯氏菌 3.0 11.23.0 9.2 4.0奇異變形菌 NR3.9 2.8 5.3 1.0釀膿鏈球菌 NR NI 1.90.9NR腸球菌屬種 4.15.50.52.34.0假絲酵母屬種 8.5NI NR 1.08.0其他 18.5 17.4828.7 18.9 19.01. 5個(gè)月期間內(nèi)(1995年5月至10月)在Laval大學(xué)中心醫(yī)院(Centre Hospitalier de I’Universit′e Laval(CHUL))收集的270個(gè)分離物得出的數(shù)據(jù)。
2.從加拿大10所醫(yī)院得到的代表941個(gè)革蘭氏陰性菌分離物的數(shù)據(jù)。(Chamberland等，1992，臨床感染疾病，15615-628)。
3.20年來(lái)(1969-1998)對(duì)大約4000個(gè)分離物的研究數(shù)據(jù)(Eykyn等，1990，J.Antimicrob Chemother.，Suppl.C，2541-58)。
4.國(guó)家鼻粘膜感染監(jiān)測(cè)中心(NNIS)從80家醫(yī)院記錄的數(shù)據(jù)(Emori和Gaynes，1993，臨床微生物學(xué)綜述，6428-442)。
5.凝固酶陰性葡萄球菌。
6.NI未包括在內(nèi)。該研究只包括革蘭氏陰性菌。
7.NR未報(bào)導(dǎo)這些種或?qū)俑腥镜陌l(fā)生率。
8.在這種情況下，17.4代表其他革蘭氏陰性菌種。
表3在CHUL的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的陽(yáng)性和陰性臨床樣品的百分分配(1994年2月-1995年1月)臨床標(biāo)本和/或位置 被試樣品數(shù)(％) 陽(yáng)性標(biāo)本的百分率 陰性標(biāo)本的百分率尿 17,981(54.5)19.4 80.6血培養(yǎng)物/骨髓 10,010(30.4)6.9 93.1痰 1,266(3.8) 68.4 31.6淺表膿汁 1,136(3.5) 72.3 27.7腦脊液 553(1.7)1.0 99.0滑液 523(1.6)2.7 97.3呼吸道 502(1.5) 56.6 43.4深部膿汁473(1.4) 56.8 43.2耳部289(0.9) 47.1 52.9胸膜和心包液132(0.4) 1.0 99.0腹膜液 101(0.3) 28.6 71.4總計(jì) 32,966(100.0) 20.0 80.0表4 用于試驗(yàn)PCR引物和DNA探針之特異性的革蘭氏陰性細(xì)菌種(90種)(接下頁(yè))被試的參 被試的參細(xì)菌菌種細(xì)菌菌種考菌株數(shù) 考菌株數(shù)鮑氏不動(dòng)桿菌1 苯丙酮酸莫拉氏菌 1魯氏不動(dòng)桿菌3 摩氏摩根氏菌 1李氏放線桿菌1 動(dòng)物奈瑟氏球菌 1糞產(chǎn)堿菌1 狗奈瑟氏球菌 1Alcaligenes odorans 1 豚鼠奈瑟氏球菌 1木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種1 灰色奈瑟氏球菌 1吉氏擬桿菌 1 兔奈瑟氏球菌 1脆弱擬桿菌 1 長(zhǎng)奈瑟氏球菌長(zhǎng)亞種 1卵形假桿菌 1 長(zhǎng)奈瑟氏球菌解糖亞種 1多形擬桿菌 1 淺黃奈瑟氏球菌 1Neisseria flavescens普通擬桿菌 1Branham 1支氣管炎博德特氏菌 1 淋病奈瑟氏球菌 18副百日咳博德特氏菌 1 乳糖奈瑟氏球菌 1百日咳博德特氏菌2 腦膜炎奈瑟氏球菌 4洋蔥伯克霍爾德氏菌 1 粘液奈瑟氏球菌 2無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌 1 多糖奈瑟氏球菌 1Citrobacter diversus2干燥奈瑟氏球菌 3subsp.koseri弗氏檸檬酸桿菌1微黃奈瑟氏球菌 3食酸叢毛單胞菌1Neisseria weaveri 1產(chǎn)氣腸桿菌1人蒼白桿菌 1成團(tuán)腸桿菌1產(chǎn)氣巴斯德氏菌 1陰溝腸桿菌1多殺巴斯德氏菌 1大腸桿菌 9產(chǎn)黑素普雷沃氏菌 1弗格森埃希氏菌1奇異變形菌 3赫氏埃希氏菌 1普通變形菌 1傷口埃希氏菌 1產(chǎn)堿普羅威登斯菌 1腦膜膿毒性黃桿菌 1雷氏普羅威登斯菌 1產(chǎn)吲哚黃桿菌 1拉氏普羅威登斯菌 1氣味黃桿菌1斯氏普羅威登斯菌 1壞死梭桿菌2銅綠假單胞菌 14陰道加德納氏菌1熒光假單胞菌 2溶血嗜血菌1施氏假單胞菌 1流感嗜血菌12 利桑那沙門(mén)氏菌 1副溶血嗜血菌 1豬霍亂沙門(mén)氏菌 1副流感嗜血菌 2雞沙門(mén)氏菌 1蜂房哈夫尼菌 1鼠傷寒沙門(mén)氏菌 3Kingella indologenes1液化沙雷氏菌 1subsp.suttonella金氏金氏菌1粘質(zhì)沙雷氏菌 1解鳥(niǎo)氨酸克雷伯氏菌1Shewanella putida 1產(chǎn)酸克雷伯氏菌1鮑氏志賀氏菌 1肺炎克雷伯氏菌8痢疾志賀氏菌 1亞特蘭大莫拉氏菌 1弗氏志賀氏菌 1粘膜炎莫拉氏菌5索氏志賀氏菌 1腔隙莫拉氏菌 1嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌 1奧斯陸莫拉氏菌 1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌1a.大多數(shù)參考菌株得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。其他參考菌株得自(i)魁北克州公眾實(shí)驗(yàn)室(LSPQ)，(ii)病病控制與預(yù)防中心(CDC)和(iii)國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC)。
表5用于試驗(yàn)PCR引物和DNA探針之特異性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌種(97種)(接下頁(yè))被試參考被試參考細(xì)菌菌種菌株數(shù)目 細(xì)菌菌種 菌株數(shù)目Abiotrophia adiacens1 克氏微球菌 1Abiotrophia defectiva 1 藤黃微球菌 1衣氏放線菌 1 里拉微球菌 1產(chǎn)氣莢膜梭菌1 玫瑰色微球菌 1擁擠棒桿菌 1 變異微球菌 1水生棒桿菌 1 黑色消化球菌 1牛棒桿菌1 厭氧消化鏈球菌 1Corynebacterium cervicis1 不解糖消化鏈球菌 1白喉棒桿菌 6 金黃色葡萄球菌 10微黃棒桿菌 1 耳葡萄球菌 1Corynebacterium genitalium 6 頭狀葡萄球菌解脲亞種 1杰氏棒桿菌 1 科氏葡萄球菌 1庫(kù)氏棒桿菌 1 表皮葡萄球菌 2馬氏棒桿菌 1 溶血葡萄球菌 2極小棒桿菌 1 人葡萄球菌 2類(lèi)真菌棒桿菌1 路鄧葡萄球菌 1假白喉棒桿菌 1腐生葡萄球菌 3Corynebacterium 6施氏葡萄球菌 1pseudogenitalium牛腎盂炎棒桿菌1松鼠葡萄球菌 1紋帶棒桿菌1模仿葡萄球菌 1潰瘍棒桿菌1沃氏葡萄球菌 1解脲棒桿菌1木糖葡萄球菌 1干燥棒桿菌1無(wú)乳鏈球菌6鳥(niǎo)腸球菌 1咽峽炎鏈球菌 2鉛黃腸球菌1牛鏈球菌 2盲腸腸球菌1Streptococcus 1constellatus殊異腸球菌1嵴鏈球菌 1耐久腸球菌1停乳鏈球菌1糞腸球菌 6馬鏈球菌 1屎腸球菌 3格氏鏈球菌1黃色腸球菌1C組鏈球菌 1鶉雞腸球菌3D組鏈球菌 1海氏腸球菌1E組鏈球菌 1蒙氏腸球菌1F組鏈球菌 1類(lèi)鳥(niǎo)腸球菌1G組鏈球菌 1棉子糖腸球菌 1中間鏈球菌1解糖腸球菌1緩癥鏈球菌2孤立腸球菌1變異鏈球菌1遲緩真桿菌1口腔鏈球菌1溶血孿生球菌 1副血鏈球菌1麻疹孿生球菌 1肺炎鏈球菌6嗜酸乳桿菌1釀膿鏈球菌3無(wú)害利斯特氏菌1唾液鏈球菌2伊氏利斯特氏菌 1 血鏈球菌 2格氏利斯特氏菌 1 表兄鏈球菌1單核細(xì)胞增生利斯特氏菌 3 豬鏈球菌 1默氏利斯特氏菌 1 乳房鏈球菌1斯氏利斯特氏菌 1 前庭鏈球菌1威氏利斯特氏菌 1a.大多數(shù)參考菌株得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。其他參考菌株得自(i)魁北克州公眾實(shí)驗(yàn)室(LSPQ)，(ii)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)和(iii)國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC)。
表6用來(lái)測(cè)試PCR引物和DNA探針特異性的真菌種類(lèi)(12)真菌種類(lèi) 測(cè)試的參考菌株數(shù)a白假絲酵母 12Candida glabrata 1季也蒙假絲酵母 1乳酒假絲酵母 3克魯斯假絲酵母 2葡萄牙假絲酵母 1近平滑假絲酵母 2熱帶假絲酵母 3紅酵母 1小紅酵母 1深紅酵母 1釀酒酵母 1a.大多數(shù)參考菌株得自(i)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和(ii)Laboratoire de Sante Publique du Quebec(LSPQ)。
表7開(kāi)發(fā)用于數(shù)種臨床重要的細(xì)菌或真菌病原體的PCR試驗(yàn)(接下頁(yè))引物對(duì)a擴(kuò)增片段大小 DNA擴(kuò)增來(lái)源于生物體 普遍適用性bSEQ ID NO(bp) 培養(yǎng)物c標(biāo)本d屎腸球菌 1-2216 79/80 + +單核細(xì)胞增生利斯特氏菌3-4130 164/168e+ +腦膜炎奈瑟氏球菌 5-6177 258/258+ +腐生葡萄球菌 7-8149 245/260+ NT無(wú)乳鏈球菌9-10 154 29/29 + +白假絲酵母11-12 149 88/88 + NT腸球菌屬種(11種)f13-14 112 87/87 + NT奈瑟氏球菌屬種(12種)f15-16 103 321/321+ +葡萄球菌屬種(14種)17-18 192 13/14 + NT19-20 221 13/14 + NT鏈球菌屬種(22種)f21-22 153 210/214g+ +通用檢測(cè)h(95種)i23-24 309 104/116i+ +a.PCR試驗(yàn)中的所有引物都是特異的，因?yàn)橛帽?、5和6中所列感興趣菌種外的細(xì)菌和真菌種類(lèi)的DNA未觀察到擴(kuò)增。
b.使用參考菌株及得自世界各地代表各個(gè)靶種或?qū)賰?nèi)多樣性的菌株測(cè)試普遍適用性。
c.對(duì)于所有引物對(duì)來(lái)說(shuō)，直接從標(biāo)準(zhǔn)化微生物懸液(Ma cFarland)或菌落完成的PCR擴(kuò)增都是特異的和普遍適用的。
d.直接從血液培養(yǎng)物、尿標(biāo)本或腦脊液進(jìn)行PCR試驗(yàn)。NT代表未試驗(yàn)。
e.未檢測(cè)到的四種單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株不是臨床分離物。這些菌株是從食物中分離的，并且與人類(lèi)感染無(wú)關(guān)。
f.所試驗(yàn)的細(xì)菌菌種包括各菌屬的所有那些臨床相關(guān)菌種(表4和5)。除了并不擴(kuò)增松鼠葡萄球菌的葡萄球菌屬特異性試驗(yàn)外，所有這些菌種均可由其各自的屬特異性PCR法得到有效地?cái)U(kuò)增。
g.鏈球菌屬特異性PCR檢測(cè)法不擴(kuò)增變異鏈球菌9個(gè)菌株中的3個(gè)，和唾液鏈球菌3個(gè)菌種中的一個(gè)。
h.為通用細(xì)菌檢測(cè)所選擇的引物并不擴(kuò)增非細(xì)菌來(lái)源的DNA，包括人和其他類(lèi)型的真核基因組DNA。
i.為進(jìn)行通用擴(kuò)增所試驗(yàn)的95種細(xì)菌種類(lèi)代表表4和5中所列出的臨床上最重要的細(xì)菌菌種。未被擴(kuò)增的12個(gè)菌株是棒桿菌屬(11種)和寡養(yǎng)單胞菌屬(1種)的有代表性的菌株。
表8 各種種特異性、屬特異性和通用擴(kuò)增試驗(yàn)的靶基因微生物基因 所編碼的蛋白質(zhì)白假絲酵母tuf翻譯延伸因子EF-Tu屎腸球菌 ddlD-丙氨酸D-丙氨酸連接酶單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA 肌動(dòng)蛋白組裝誘導(dǎo)蛋白質(zhì)腦膜炎奈瑟氏球菌 omp外膜蛋白無(wú)乳鏈球菌cAMP cAMP因子腐生葡萄球菌 未知 未知腸球菌屬種tuf翻譯延伸因子EF-Tu奈瑟氏球菌屬種asdASA-脫氫酶葡萄球菌屬種 tuf翻譯延伸因子EF-Tu鏈球菌屬種recA RecA蛋白質(zhì)通用檢測(cè) tuf翻譯延伸因子EF-Tu表9為診斷目的而選擇的抗生素抗性基因SEQ ID No基因抗生素 細(xì)菌a所選擇的引物 原始片段blaoxa49-50 110 β-內(nèi)酰胺 腸桿菌科，假單胞菌科blaZ 51-52 111 β-內(nèi)酰胺 腸球菌屬種aac6′-IIa 61-64 112 氨基糖苷 假單胞菌科
ermA 91-92113大環(huán)內(nèi)脂葡萄球菌屬種ermB 93-94114大環(huán)內(nèi)脂葡萄球菌屬種ermC 95-96115大環(huán)內(nèi)脂葡萄球菌屬種vanB 71-74116萬(wàn)古霉素腸球菌屬種vanC 75-76117萬(wàn)古霉素腸球菌屬種aad(6′) 173-174 - 鏈霉素 腸球菌屬種a特定抗生素抗性基因發(fā)生率較高的細(xì)菌。不排除這些抗生素抗性基因在其他細(xì)菌中的存在。
表10 我們共同待批美國(guó)(N.S.08/52684)和PCT(PCT/CA/95/00528)專(zhuān)利申請(qǐng)中用來(lái)選擇PCR引物對(duì)的抗生素抗性基因基因選擇的引物的SEQ ID NO抗生素 細(xì)菌ablatem37-40β-內(nèi)酰胺腸桿菌科假單胞菌科嗜血菌屬種奈瑟氏球菌屬種blarob45-48β-內(nèi)酰胺嗜血菌屬種巴斯德氏菌屬種blashv41-44β-內(nèi)酰胺克雷伯氏菌屬種及其他腸桿菌科aadB 53-54氨基糖苷 腸桿菌科aacC1 55-56 假單胞菌科aacC2 57-58aacC3 59-60aacA4 65-66mecA 97-98β-內(nèi)酰胺葡萄球菌屬種vanA 67-70萬(wàn)古霉素 腸球菌屬種satA 81-82大環(huán)內(nèi)酯 腸球菌屬種aac(6′)-aph(2″) 83-86氨基糖苷 腸球菌屬種葡萄球菌屬種vat87-88大環(huán)內(nèi)酯葡萄球菌屬種vga89-90大環(huán)內(nèi)酯葡萄球菌屬種msrA 77-80紅霉素 葡萄球菌屬種int99-102 β-內(nèi)酰胺 腸桿菌科屬種三甲氧芐二氨嘧啶sul103-106 氨基糖苷假單胞菌科防腐劑氯霉素a特定抗生素抗性基因發(fā)生率高的細(xì)菌。不排除這些抗生素抗性基因在其他細(xì)菌中的存在。
表11葡萄球菌屬種中平板擴(kuò)散和抗生素抗性基因的PCR擴(kuò)增間的相互關(guān)系平板反應(yīng)(Kirby-Bauer)b抗生素表型 PCR抗性株中等株敏感株青霉素 blaZ + 165 0 0- 0 0 31OxacillinmecA + 5111 4- 2 0 128慶大霉素 aac(6′)aph(2″ + 2418 6)- 0 0 148紅霉素 ermA + 150 0ermB + 0 0 0ermC + 430 0msrA + 4 0 0- 0 1 136
a.所研究的葡萄球菌菌株包括金黃色葡萄球菌(82個(gè)菌株)、表皮葡萄球菌(83個(gè)菌株)、人葡萄球菌(2個(gè)菌株)、頭狀葡萄球菌(3個(gè)菌株)、溶血葡萄球菌(9個(gè)菌株)、模仿葡萄球菌(12個(gè)菌株)和沃氏葡萄球菌(54個(gè)菌株)，共196個(gè)菌株。
b.按照國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的Kirby-Bauer方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。
表12腸球菌屬種中平板擴(kuò)散與抗生素抗性基因的PCR擴(kuò)增之間的相互關(guān)系平板擴(kuò)散(Kirby-Bauer)b抗生素表型 PCR抗性株 敏感株氨芐青霉素 blaZ + 02- 130慶大霉素aac(6′)aph(2″) + 51 1- 338鏈霉素 aad(6′) + 26 15- 627萬(wàn)古霉素 vanA + 36 0vanB + 26 0- 040a 所研究的腸球菌菌株包括糞腸球菌(33個(gè)菌株)和屎腸球菌(69個(gè)菌株)，共102個(gè)菌株。b 按照國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的Kirby-Bauer方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。
表13序列表中tuf序列的來(lái)源(接下頁(yè))SEQ ID NO 細(xì)菌或真菌菌種 來(lái)源118 Abiotrophia adiacens 本專(zhuān)利119 Abotrophia defectiva 本專(zhuān)利120 白假絲酵母 本專(zhuān)利121 Candida glabrata 本專(zhuān)利
122 克魯斯假絲酵母 本專(zhuān)利123 近平滑假絲酵母 本專(zhuān)利124 熱帶假絲酵母 本專(zhuān)利125 擁擠棒桿菌 本專(zhuān)利126 白喉棒桿菌 本專(zhuān)利127 Corynebacterium genitalium 本專(zhuān)利128 杰氏棒桿菌 本專(zhuān)利129 假結(jié)核棒桿菌 本專(zhuān)利130 紋帶棒桿菌 本專(zhuān)利131 鳥(niǎo)腸球菌 本專(zhuān)利132 糞腸球菌 本專(zhuān)利133 屎腸球菌 本專(zhuān)利134 鶉雞腸球菌 本專(zhuān)利135 陰道加德納氏菌 本專(zhuān)利136 無(wú)害利斯特氏菌 本專(zhuān)利137 伊氏利斯特氏菌 本專(zhuān)利138 單核細(xì)胞增生利斯特氏菌 本專(zhuān)利139 斯氏利斯特氏菌 本專(zhuān)利140 金黃色葡萄球菌 本專(zhuān)利141 表皮葡萄球菌 本專(zhuān)利142 腐生葡萄球菌 本專(zhuān)利143 模仿葡萄球菌 本專(zhuān)利144 無(wú)乳鏈球菌 本專(zhuān)利145 肺炎鏈球菌 本專(zhuān)利146 唾液鏈球菌 本專(zhuān)利147 根癌土壤桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)148 枯草芽孢桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)149 脆弱擬桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)150 布氏疏螺旋體 數(shù)據(jù)庫(kù)
151 擴(kuò)展短桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)152 洋蔥伯克霍爾德氏菌 數(shù)據(jù)庫(kù)153 砂眼衣原體 數(shù)據(jù)庫(kù)154 大腸桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)155 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)156 鐵色黃桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)157 流感嗜血菌 數(shù)據(jù)庫(kù)158 幽門(mén)螺桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)159 藤黃微球菌 數(shù)據(jù)庫(kù)160 結(jié)核分枝桿菌 數(shù)據(jù)庫(kù)161 生殖道枝原體 數(shù)據(jù)庫(kù)162 淋病奈瑟氏球菌 數(shù)據(jù)庫(kù)163 普氏立克次氏體 數(shù)據(jù)庫(kù)164 鼠傷寒沙門(mén)氏菌 數(shù)據(jù)庫(kù)165 Shewanella putida 數(shù)據(jù)庫(kù)166 橙色標(biāo)樁菌 數(shù)據(jù)庫(kù)167 釀膿鏈球菌 數(shù)據(jù)庫(kù)168 Thiobacillus cuprinus 數(shù)據(jù)庫(kù)169 蒼白密螺旋體 數(shù)據(jù)庫(kù)170 解脲尿枝原體 數(shù)據(jù)庫(kù)171 產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌 數(shù)據(jù)庫(kù)附錄I從tuf序列中選擇通用擴(kuò)增引物的策略(下接第49頁(yè)至第51頁(yè))SEQ ID491 517...776 802NOAbiotrophiaCAACTGTAAC TGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT AATGCCTGGT GATAACGTAA118adiacensAbiotrophiaCTACCGTTAC CGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT TATGCCAGGC GACAACGTAC119defectiva根癌土壤桿菌 CGACTGTTAC CGGCGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT TATGCCTGGC GACAACGTCA147枯草芽胞桿菌 CAACTGTTAC AGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT TATGCCTGGA GATAACACTG148脆弱擬桿菌 CAGTTGTAAC AGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT AATGCCGGGT GATAACGTAA149布氏疏螺旋體 CTACTGTTAC TGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT TATGCCTGGT GATAATGTTG150擴(kuò)展短桿菌 CGACTGTCAC CGCTATCGAG ATGTTCC...AGATGGT CATGCCCGGC GACACCACCG151洋蔥伯克霍爾 CGACCTGCAC GGGCGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT CATGCCGGGC GACAACGTGT152德氏菌砂眼衣原體 CGATTGTTAC TGGGGTTGAA ATGTTCA...AGATGGT CATGCCTGGG GATAACGTTG153白喉棒桿菌 CCACCGTTAC CGGTATCGAG ATGTTCC...AGATGGT CATGCCTGGC GACAACGTCG126Corynebacterium CCACCGTTAC CTCCATCGAG ATGTTCA...AGATGGT TATGCCGGGC GACAACGTTG127genitalium杰氏棒桿菌 CCACCGTTAC CTCCATCGAG ATGTTCA...AGATGGT TATGCCGGGC GACAACGTTG128糞腸球菌 CAACYGTTAC AGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT AATGCCTGGT GATAACGTTG132屎腸球菌 CAACAGTTAC TGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT CATGCCCGGT GACAACGT..133大腸桿菌 CTACCTGTAC TGGCGTTGAA ATGTTCC...AGATGGT AATGCCGGGC GACAACATCA154產(chǎn)琥珀酸絲狀 ACGTCATCAC CGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT TACTCCGGGT GACACGGTCA155桿菌銹色黃桿菌 CTACCGTTAC AGGTGTTGAG ATGTTCC...AAATGGT TATGCCTGGT GATAACACCA156陰道加德納氏菌 CCACCGTCAC CTCTATCGAG ACCTTCC...AAATGGT TCAGCCAGGC GATCACGCAA135流感嗜血菌 CTACTGTAAC GGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT AATGCCAGGC GATAACATCA157幽門(mén)螺桿菌 CGACTGTAAC CGGTGTAGAA ATGTTTA...AAATGGT TATGCCTGGC GATAATGTGA158單核細(xì)胞增生利 TAGTAGTAAC TGGAGTAGAA ATGTTCC...AAATGGT AAYGCCTGGT GATAACATTG138斯特氏菌藤黃微球菌 CCACTGTCAC CGGCATCGAG ATGTTCC...AGATGGT CATGCCCGGC GACAACACCG159結(jié)核分枝桿菌 CCACCGTCAC CGGTGTGGAG ATGTTCC...AGATGGT GATGCCCGGT GACAACACCA160生殖道枝原體CAGTTGTTAC TGGAATTGAA ATGTTCA...AAATGGT TCTACCTGGT GATAATGCTT161淋病奈瑟氏球菌 CCACCTGTAC CGGCGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT AATGCCGGGT GAGAACGTAA162普氏立克次氏體 CGACTTGTAC AGGTGTAGAA ATGTTCA...AGATGGT TATGCCTGGA GATAATGCTA163鼠傷寒沙門(mén)氏菌 CTACCTGTAC TGGCGTTGAA ATGTTCC...AGATGGT AATGCCGGGC GACAACATCA164Shewanella CAACGTGTAC TGGTGTAGAA ATGTTCC...AGATGGT AATGCCAGGC GATAACATCA165putida橙色標(biāo)樁菌 CGGTCATCAC GGGGGTGGAG ATGTTCC...AGATGGT GATGCCGGGA GACAACATCG166金黃色葡萄球菌 CAACTGTTAC AGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT AATGCCTGGT GATAACGTTG140表皮葡萄球菌CAACTGTTAC TGGTGTAGAA ATGTTCC...AAATGGT TATGCCTGGC GACAACGTTG141無(wú)乳鏈球菌 CAGTTGTTAC TGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT TATGCCTGGT GATAACGTTA144肺炎鏈球菌 CAGTTGTTAC TGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT AATGCCTGGT GATAACGTGA145釀膿鏈球菌 CTGTTGTTAC TGGTGTTGAA ATGTTCC...AAATGGT TATGCCTGGT GATAACGTGA167ThiobacillusCCACCTGCAC CGGCGTGGAA ATGTTCA...AAATGGT CATGCCCGGC GATAATGTGA168cuprinus蒼白密螺旋體CAGTGGTTAC TGGCATTGAG ATGTTTA...ACATGGT GAAGCCGGGG GATAACACCA169解脲尿枝原體 CTGTTGTTAC AGGAATTGAA ATGTTTA...ATTTGGT TATGCCAGGT GATGACGTTG170產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌 CAACCGTAAC TGGCGTTGAG ATGTTCC...AGATGGT TATGCCTGGT GACAACGTTA171白假絲酵母 GTGTTACCAC TGAAGTCAAR TCCGTTG...AGRAATT GGAAGAAAAT CCAAAATTCG120粟酒裂殖酵母 GTGTCACTAC CGAAGTCAAG TCTGTTG...AGAAGAT TGAGGAGTCC CCTAAGTTTG人 TGACAGGCAT TGAGATGTTC CACAAGA...AGAAGGAGCTTGCCATG CCCGGGGAGG選出的序列aACIKKIAC IGGIGTIGAR ATGTT ATGGT IATGCCIGGI GAIAAYRT選出的通用 SEQ ID NO23 SEQ ID NO24b引物序列aACIKKIAC IGGIGTIGAR ATGTT AYRTT ITCICCIGGC ATIACCAT序列編號(hào)涉及大腸桿菌tuf基因片段。下劃線的核苷酸與選定的序列相同或與之匹配。a “I”代表次黃苷，它是可與四種核苷酸A、C、T、G中任何一種結(jié)合的核苷酸類(lèi)似物?！癒”、“R”、“Y”指示發(fā)生簡(jiǎn)并的核苷酸位置?！癒”代表T或G，“R”代表A或G，“Y”代表C或T。b 該序列是上述tuf序列的反向互補(bǔ)序列。附錄II從tuf序列中選擇對(duì)腸球菌屬特異的擴(kuò)增引物的策略(下接第53頁(yè)至第54頁(yè))314348 401435SEQID NO枯草芽胞桿菌CGCGACACTG AAAAACCATT CATGATGCCA GTTGA...CGCGG ACAAGTTAAA GTCGGTGACG AAGTTGAAAT148脆弱擬桿菌 CGCGATGTTG ATAAACCTTT CTTGATGCCG GTAGA...ACTGG TGTTATCCAT GTAGGTGATG AAATCGAAAT149洋蔥伯克霍爾CGTGCAGTTG ACGGCGCGTT CCTGATGCCG GTGGA...CGCGG CATCGTGAAG GTCGGCGAAG AAATCGAAAT152德氏菌砂眼衣原體 AGAGAAATTG ACAAGCCTTT CTTAATGCCT ATTGA...CGTGG AATTGTTAAA GTTTCCGATA AAGTTCAGTT153白喉棒桿菌 CGTGAGACCG ACAAGCCATT CCTCATGCCT ATCGA...CGTGG CTCCCTGAAG GTCAACGAGG ACGTCGAGAT126鳥(niǎo)腸球菌CGTGATACTG ACAAACCATT CATGATGCCA GTCGA...CGTGG ACAAGTTCGC GTTGGTGACG AAGTTGAAAT131糞腸球菌CGTGATACTG ACAAACCATT CATGATGCCA GTCGA...CGTGG TGAAGTTCGC GTTGGTGACG AAGTTGAAAT132屎腸球菌CGTGACAACG ACAAACCATT CATGATGCCA GTTGA...CGTGG ACAAGTTCGC GTTGGTGACG AAGTTGAAGT133鶉雞腸球菌 CGTGATACTG ACAAACCATT CATGATGCCA GTCGA...CGTGG ACAAGTTCGC GTTGGTGATG AAGTAGAAAT134大腸桿菌CGTGCGATTG ACAAGCCGTT CCTGCTGCCG ATCGA...CGCGG TATCATCAAA GTTGGTGAAG AAGTTGAAAT154陰道加德納氏菌 CACGATCTTG ACAAGCCATT CTTGATGCCA ATCGA...CGTGG TAAGCTCCCA ATCAACACCC CAGTTGAGAT135流感嗜血菌 CGTGCGATTG ACCAACCGTT CCTTCTTCCA ATCGA...CGAGG TATTATCCGT ACAGGTGATG AAGTAGAAAT157幽門(mén)螺桿菌 AGAGACACTG AAAAAACTTT CTTGATGCCG GTTGA...AGAGG CGTGGTGAAA GTAGGCGATG AAGTGGAAAT158單核細(xì)胞增生利 CGTGATACTG ACAAACCATT CATGATGCCA GTTGA...CGTGG ACAAGTTAAA GTTGGTGACG AAGTAGAAGT138斯特氏菌藤黃微球菌 CGCGACAAGG ACAAGCCGTT CCTGATGCCG ATCGA...CGCGG CACCCTGAAG ATCAACTCCG AGGTCGAGAT159結(jié)核分枝桿菌CGCGAGACCG ACAAGCCGTT CCTGATGCCG GTCGA...CGCGG CGTGATCAAC GTGAACGAGG AAGTTGAGAT160生殖道枝原體CGTGAAGTAG ATAAACCTTT CTTATTAGCA ATTGA...AGAGG TGAACTCAAA GTAGGTCAAG AAGTTGAAAT161淋病奈瑟氏球菌 CGTGCCGTGG ACAAACCATT CCTGCTGCCT ATCGA...CGAGG TATCATCCAC GTTGGTGACG AGATTGAAAT162鼠傷寒沙門(mén)氏菌 CGTGCGATTG ACAAGCCGTT CCTGCTGCCG ATCGA...CGCGG TATCATCAAA GTGGGCGAAG AAGTTGAAAT164Shewanella CGTGACATCG ATAAGCCGTT CCTACTGCCA ATCGA...CGTGG TATTGTACGC GTAGGCGACG AAGTTGAAAT165putida金黃色葡萄球菌 CGTGATTCTG ACAAACCATT CATGATGCCA GTTGA...CGTGG TCAAATCAAA GTTGGTGAAG AAGTTGAAAT140表皮葡萄球菌CGTGATTCTG ACAAACCATT CATGATGCCA GTTGA...CGTGG TCAAATCAAA GTWGGTGAAG AAGTTGAAAT141腐生葡萄球菌CGTGATTCTG ACAAACCATT CATGATGCCA GTTGA...CGTGG TCAAATCAAA GTCGGTGAAG AAATCGARAT142無(wú)乳鏈球菌CGTGATACTG ACAAACCTTT ACTTCTTCCA GTTGA...CGTGG TACTGTTCGT GTCAACGACG AAGTTGAAAT 144肺炎鏈球菌CGTGACACTG ACAAACCATT GCTTCTTCCA GTCGA...CGTGG TATCGTTAAA GTCAACGACG AAATCGAAAT 145釀膿鏈球菌CGCGACACTG ACAAACCATT GCTTCTTCCA GTCGA...CGTGG TACTGTTCGT GTCAACGACG AAATCGAAAT 167解脲尿枝原體 CGTAGTACTG ACAAACCATT CTTATTAGCA ATTGA...CGTGG TGTATTAAAA GTTAATGATG AGGTTGAAAT 170選出的序列 TACTG ACAAACCATT CATGATG GTTCGC GTTGGTGACG AAGTT選出的屬特異 SEQ ID NO13SEQ ID NO14a性引物序列TACTG ACAAACCATT CATGATG AACTTC GTCACCAACG CGAAC序列編號(hào)指的是糞腸球菌tuf基因片段。下劃線的核苷酸與選定的序列相同或與之匹配。
a該序列是上述tuf序列的反向互補(bǔ)序列。
注上述引物也擴(kuò)增Abiotrophia屬各種的tuf序列；最近已通過(guò)16S rRNA分析證明了此屬與腸球菌屬有關(guān)。附錄III從tuf序列中選擇葡萄球菌特異的擴(kuò)增引物的策略(下接第56頁(yè)至第57頁(yè))385 420.....579 611 SEQ IDNO枯草芽胞桿菌 TGGCCGTGTA GAACGCGGAC AAGTTAAAGT CGG.....TTG CTAAACCAGG TACAATCACT CCACACAGCA 148脆弱擬桿菌 AGGTCGTATC GAAACTGGTG TTATCCATGT AGG.....TTT GTAAACCGGG TCAGATTAAA CCTCACTCTA 149洋蔥伯克霍爾 GGGTCGTGTC GAGCGCGGCA TCGTGAAGGT CGG.....TGG CGAAGCCGGG TTCGATCACG CCGCACACGC 152德氏菌砂眼衣原體 TGGACGTATT GAGCGTGGAA TTGTTAAAGT TTC.....TTT GCTTGCCAAA CAGTGTTAAA CCTCATACAC 153白喉棒桿菌 CGGCCGTGTT GAGCGTGGCT CCCTGAAGGT CAA.....TTG TTAAGCCAGG CGCTTACACC CCTCACACCG 126糞腸球菌 AGGACGTGTT GAACGTGGTG AAGTTCGCGT TGG.....TAG CTAAACGAGC TACAATCACT CCACACACAA 132屎腸球菌 AGGTCGTGTT GAACGTGGAC AAGTTCGCGT TGG.....TAG CTAAACCAGG TACAATCACA CCTCRTACAA 133大腸桿菌 CGGTCGTGTA GAACGCGGTA TCATCAAAGT TGG.....TGG CTAAGCCGGG CACCATCAAG CCGCACACCA 154陰道加德納氏菌 CGGTCGTGTT GAGCGTGGTA AGCTCCCAAT CAA.....TGG CTGCTCCAGG TTCTGTGACT CCACACACCA 135流感嗜血菌 AGGTCGTGTA GAACGAGGTA TTATCCGTAC AGG.....TAG CGAAACCAGG TTCAATCACA CCACACACTG 157幽門(mén)螺桿菌 AGGTAGGATT GAAAGAGGCG TGGTGAAAGT AGG.....TAT GCAAACCAGG TTCTATCACT CCGCACAAGA 158單核細(xì)胞增生利 TGGACGTGTT GAACGTGGAC AAGTTAAAGT TGG.....TAG CTAAACCAGG TTCGATTACT CCACACACTA 138斯特氏菌藤黃微球菌 CGGTCGCGCC GAGCGCGGCA CCCTGAAGAT CAA.....TGG TGGAGCCGGG CTCCATCACC CCGCACACCA 159結(jié)核分枝桿菌CGGACGTGTG GAGCGCGGCG TGATCAACGT GAA.....TCA CCAAGCCCGG CACCACCACG CCGCACACCG 160生殖道枝原體AGGAAGAGTT GAAAGAGGTG AACTCAAAGT AGG.....TAG CAAAACCAGG CTCTATTAAA CCGCACAAGA 161淋病奈瑟氏球菌 CGGCCGTGTA GAGCGAGGTA TCATCCACGT TGG.....TGG CCAAACGGGG TACTATCACT CCTCACACCA 162鼠傷寒沙門(mén)氏菌 CGGTCGTGTA GAGCGCGGTA TCATCAAAGT GGG.....TGG CTAAGCCGGG CACCATCAAG CCGCACACCA 164Shewanella AGGTCGTGTT GAGCGTGGTA TTGTACGCGT AGG.....TAG CGAAGCCAGG TTCAATCAAC CCACACACTA 165putida金黃色葡萄球菌 AGGCCGTGTT GAACGTGGTC AAATCAAAGT TGG.....TAG CTGCTCCTGG TTCAATTACA CCACATACTG 140表皮葡萄球菌AGGCCGTGTT GAACGTGGTC AAATCAAAGT WGG.....TAG CTGCTCCTGG TTCTATTACA CCACACACAA 141腐生葡萄球菌AGGCCGTGTT GAACGTGGTC AAATCAAAGT CGG.....TAG CTGCTCCTGG TACTATCACA CCACATACAA 142模仿葡萄球菌AGGCCGTGTT GAACGTGGTC AAATCAAAGT CGG.....TAG CAGCTCCTGG CTCTATTACT CCACACACAA 143無(wú)乳鏈球菌 AGGACGTATC GACCGTGGTA CTGTTCGTGT CAA.....TTG CTAAACCAGG TTCAATCAAC CCACACACTA 144肺炎鏈球菌 AGGACGTATC GACCGTGGTA TCGTTAAAGT CAA.....TCG CTAAACCAGG TTCAATCAAC CCACACACTA 145解脲尿枝原體 TGGACGTGTT GAACGTGGTG TATTAAAAGT TAA.....TTG TAAAACCAGG ATCAATTAAA CCTCACCGTA 170CCGTGTT GAACGTGGTC AAATCAAAGCTCCTGG YWCWATYACA CCACAYA選出的序列aSEQ ID NO17 SEQ ID NO18b選出的屬特異CCGTGTT GAACGTGGTC AAATCAAATRTGTGGT GTRATWGWRC CAGGAGC性引物序列a序列編號(hào)指的是金黃色葡萄球菌tuf基因片段。下劃線的核苷酸與選定的序列相同或與之匹配。a “R”、“W”、“Y”指示發(fā)生簡(jiǎn)并的核苷酸位置?！癛”代表A或G， “W”代表A或T，“Y”代表C或T。b 該序列是上述tuf序列的反向互補(bǔ)序列。附錄IV從tuf序列中選擇白假絲酵母特異的擴(kuò)增引物的策略(下接第59頁(yè)至第60頁(yè))5890 181 213 SEQ ID NO白假絲酵母 CGTCAAGAAG GTTGGTTACA ACCCAAAGAC TGT...CAA ATCCGGTAAA GTTACTGGTA AGACCTTGTT120Candida CATCAAGAAG GTCGGTTACA ACCCAAAGAC TGT...CAA GGCTGGTGTC GTCAAGGGTA AGAYCTTGTT121glabrata克魯斯假絲酵母 CATCAAGAAG GTTGGTTACA ACCCAAAGAC TGT...CAA GGCAGGTGTT GTTAAGGGTA AGACCTTATT122近平滑假絲酵母 CGTCAAGAAG GTTGGTTACA ACCCTAAAGC TGT...TAA AGCTGGTAAG GTTACCGGTA AGACCTTGTT123熱帶假絲酵母CGTCAAGAAG GTTGGTTACA ACCCTAAGGC TGT...CAA GGCTGGTAAG GTTACCGGTA AGACTTTGTT124粟酒裂殖酵母CATCAAGAAG GTCGGTTTCA ACCCCAAGAC CGT...CAA GGCTGGTGTC GTCAAGGGTA AGACTCTTTT人 GGAGATCCGG GAGCTGCTCA CCGAGTTTGG CTA...GTT AGGCCTGAAG TCTGTGCAGA AGCTACTGGA砂眼衣原體 GGAGCTGCGC GAGCTGCTCA GCAAGTACGG CTT...CAA ATG....... ..TATTCTGG AGCTGATGAA153白喉棒桿菌 GGAGATCCRT GAGCTGCTCG CTGAGCAGGA TTA...GAA GTGGACCCAG TCCATCATCG ACCTCATGCA126糞腸球菌GGAAGTTCGT GACTTATTAT CAGAATACGA TTT...... ...TGAAGAA AAAATCTTAG AATTAATGGC132大腸桿菌GGAAGTTCGT GAACTTCTGT CTCAGTACGA CTT...... ..GGGAAGCG AAAATCCTGG AACTGGCTGG154銹色黃桿菌CGAGGTTCGC GAAGAACTGA CTAAACGCGG TTT...... ..GGGTTAAA GAAATTGAAA ACCTGATGGA156陰道加德納氏菌AGAGGTCCGT GACCTCCTCG AAGAAAACGG CTT...CAA GTGGGTAGAG ACCGTCAAGG AACTCATGAA135流感嗜血菌GGAAGTTCGT GAACTTCTAT CTCAATATGA CTT...... ..GGGAAGAA AAAATCCTTG AGTTAGCAAA157單核細(xì)胞增生利GGAAATTCGT GATCTATTAA CTGAATATGA ATT...... ..GGGAAGCT AAAATTGACG AGTTAATGGA138斯特氏菌藤黃微球菌GGAAGTCCGT GAGTTGCTGG CTGCCCAGGA ATT...CAA GTGGGTCGAG TCTGTCACAC AGTTGATGGA159淋病奈瑟氏球菌GGAAATCCGC GACCTGCTGT CCAGCTACGA CTT...... ..ACGAAGAA AAAATCTTCG AACTGGCTAC162鼠傷寒沙門(mén)氏菌GGAAGTTCGC GAACTGCTGT CTCAGTACGA CTT...... ..GGGAAGCG AAAATCATCG AACTGGCTGG164金黃色葡萄球菌GGAAGTTCGT GACTTATTAA GCGAATATGA CTT...... ...CGAAGAA AAAATCTTAG AATTAATGGA140肺炎鏈球菌GGAAATCCGT GACCTATTGT CAGAATACGA CTT...... ...CGAAGAC ATCGTTATGG AATTGATGAA145蒼白密螺旋體 AGAGGTGCGT GATGCGCTTG CTGGATATGG GTT...GGA GGATGCAGCT TGTATTGAGG AACTGCTTGC169選出的序列 CAAGAAG GTTGGTTACA ACCCAAAGA ATCCGGTAAA GTTACTGGTA AGACCT選出的種特異 SEQ ID NO11 SEQ ID NO12a性引物序列 CAAGAAG GTTGGTTACA ACCCAAAGA AGGTCTTACC AGTAACTTTAC CGGAT序列編號(hào)指的是白假絲酵母tuf基因片段。下劃線的核苷酸與選定的序列相同或與之匹配。a 該序列是上述tuf序列的反向互補(bǔ)序列。附錄V從recA序列中選擇鏈球菌屬特異的擴(kuò)增引物的策略(下接第62頁(yè)至第63頁(yè))415449...540574 SEQID NOBordetellaCTCGAGATCA CCGACGCGCT GGTGCGCTCG GGCTC...GGCCC GCCTGATGAG CCAGGCGCTG CGCAAGCTGApertussisBurkholderia CTCGAAATCA CCGATGCGCT GGTGCGCTCG GGCTC...GGCCC GCCTGATGTC GCAGGCGCTG CGCAAGCTGAcepacia彎曲空腸桿菌 TTAGAAATTG TAGAAACTAT AGCAAGAAGT GGCGC...AGCAA GACTTATGTC TCAAGCTCTA AGAAAACTTAChlamydia TTGAGTATTG CAGAGCTCTT AGCGCGTTCT GGAGC...AGCTC GCATGATGTC GCAGGCTCTA CGCAAATTAAtrachomatis產(chǎn)氣莢膜梭菌 TTAGAAATAA CAGAAGCTTT AGTTAGATCA GGAGC...AGCTA GATTAATGTC ACAAGCCTTA AGAAAGTTAA假結(jié)核棒桿菌 CTGGAGATTG CAGATATGCT TGTTCGCTCT GGAGC...AGCGC GTTTGATGAG TCAGGCGCTG CGTAAGATGA成團(tuán)腸桿菌CTGGAAATCT GTGATGCGCT GACCCGTTCA GGCGC...AGCTC GTATGATGAG CCAGGCGATG CGTAAGCTTG屎腸球菌 TTAGAGATTG CCGATGCCTT AGTTTCAAGT GGTGC...AGCTC GACTAATGTC TCAAGCACTA CGTAAATTAT大腸桿菌 CTGGAAATCT GTGACGCCCT GGCGCGTTCT GGCGC...GGCAC GTATGATGAG CCAGGCGATG CGTAAGCTGG流感嗜血菌 GCGAACAGAA GAATAGAATT TTAATGCATT ACCGC...GACCT GTGAGTTTAC GCAAAGCTTG AGACATTAAA幽門(mén)螺桿菌 TTAGAAATTT TAGAAACGAT CACCAGAAGC GGAGG...AGCAA GGCTTATGAG CCATGCGTTA AGAAAAATCA乳酸乳球菌 CTTCAAATTG CTGAAAAATT GATTACTTCT GGAGC...AGCAC GTATGATGTC ACAAGCCATG CGTAAACTTG侵肺軍團(tuán)菌 CTGGAAATTA CTGATATGCT GGTGCGTTCT GCAGC...GGCAA GATTGATGTC GCAAGCCCTG CGTAAATTGA生殖道枝原體 TTTGCTCTTA TCGAATCATT AATTAAAACA AACAA...TGCAA GAATGATGTC AAAAGGTTTG CGAAGAATAC淋病奈瑟氏球菌 TTGGAAATCT GCGACACGCT CGTCCGTTCG GGCGG...GGCGC GCCTGATGAG TCAGGCTTTG CGCAAACTGA奇異變形菌 CTGGAAATTT GTGATGCATT ATCTCGCTCT GGTGC...CGCAC GTATGATGAG CCAAGCTATG CGTAAACTAG銅綠假單胞菌 CTGGAAATCA CCGACATGCT GGTGCGCTCC AACGC...GGCAC GCCTGATGTC CCAGGCGCTG CGCAAGATCA粘質(zhì)沙雷氏菌 CTGGAAATCT GTGATGCGCT GACCCGCTCC GGCGC...GGCGC GCATGATGAG CCAGGCGATG CGTAAGCTGG弗氏志賀氏菌 CTGGAAATCT GTGACGCCCT GGCGCGTTCT GGCGC...GGCAC GTATGATGAG CCAGGCGATG CGTAAGCTGG金黃色葡萄球菌 CTTGAAATCG CCGAAGCATT TGTTAGAAGT GGTGC...AGCTC GTTTAATGTC ACAAGCGTTA CGTAAACTTT格氏鏈球菌 TTAGAAATTG CAGGAAAATT GATTGACTCT GGGGC........ .......... .......... .......... 32變異鏈球菌 CTTGAAATTG CAGGGAAATT GATTGATTCT GGCGC...AGCAC GCATGATGAG TCAAGCGATG CGTAAATTAT 33肺炎鏈球菌 CTTGAGATTG CGGGAAAATT GATTGACTCA GGTGC...GGCTC GTATGATGAG CCAGGCCATG CGTAAACTTG 34釀膿鏈球菌 CTTGAAATTG CAGGTAAATT GATTGATTCT GGTGC...AGCAC GTATGATGAG TCAGGCCATG CGTAAATTAT 35唾液鏈球菌 CTCGAAATTG CAGGTAAGCT GATTGACTCT GGTGC...AGCGC GTATGATGAG TCAAGCCATG CGTAAACTTT 36霍亂弧菌 CTGGAAATTT GTGATGCACT GGCTCGCTCT GGTGC...AGCGC GTATGTTGTC GCAAGCAATG CGTAAACTGA鼠疫耶爾森氏菌 CTGGAAATTT GTGATGCGCT GACTCGCTCT GGTGC...CGCGC GTATGATGAG CCAGGCTATG CGTAAGCTGG選出的序列aGAAATTG GAGGIAAATT GATTGA ATGATGAG TCAIGCCATG CGTAA選出的屬特異 SEQ ID NO21 SEQ ID NO22b性引物序列aGAAATTG CAGGIAAATT GATTGA TTACGCAT GGCITGACTC ATCAT序列編號(hào)指的是肺炎鏈球菌recA序列。下劃線的核苷酸與選定的序列相同或與之匹配。a “I”代表次黃苷，它是可與四種核苷酸A、C、T、G中任何一種結(jié)合的核苷酸類(lèi)似物。b該序列是上述recA序列的反向互補(bǔ)序列。附錄VI用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍適用性引物SEQ ID NO核苷酸序列 原始DNA片段SEQ ID NO 核苷酸位置細(xì)菌種類(lèi)屎腸球菌1 5′-TGC TTT AGC AAC AGC CTA TCA G26a273-2942b5′-TAA ACT TCT TCC GGC ACT TCG 26a468-488細(xì)菌種類(lèi)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌3 5′-TGC GGC TAT AAA TGA AGA GGC 27a339-3594b5′-ATC CGA TGA TGC TAT GGC TTT 27a448-468細(xì)菌種類(lèi)腦膜炎奈瑟氏球菌5 5′-CCA GCG GTA TTG TTT GGT GGT 28a56-766b5′-CAG GCG GCC TTT AAT AAT TTC 28a212-232細(xì)菌種類(lèi)腐生葡萄球菌7 5′-AGA TCG AAT TCC ACA TGA AGG TTA TTA TGA 29c290-3198b5′-TCG CTT CTC CCT CAA CAA TCA AAC TAT CCT 29c409-438細(xì)菌種類(lèi)無(wú)乳鏈球菌9 5′-TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA 30a59-8110b5′-GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT 30a190-212真菌種類(lèi)白假絲酵母11 5′-CAA GAA GGT TGG TTA CAA CCC AAA GA 120c61-8612b5′-AGG TCT TAC CAG TAA CTT TAC CGG AT 120c184-209a 得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。b 這些序列得自序列表中給出的原始片段的序列的相反DNA鏈。c 由我們的研究小組確定的序列。附錄VI用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍適用性引物SEQ ID NO 核苷酸序列 原始DNA片段SEQ ID NO核苷酸位置細(xì)菌屬腸球菌屬13 5′-TAC TGA CAA ACC ATT CAT GAT G 131-134a，b319-340c14d5′-AAC TTC GTC ACC AAC GCG AAC131-134a，b410-430c細(xì)菌屬奈瑟氏球菌屬15 5′-CTG GCG CGG TAT GGT CGG TT 31e21-40f16d5′-GCC GAC GTT GGA AGT GGT AAA G 31e102-123f細(xì)菌屬葡萄球菌屬17 5′-CCG TGT TGA ACG TGG TCA AAT CAA A 140-143a，b391-415g18d5′-TRT GTG GTG TRA TWG WRC CAG GAG C 140-143a，b584-608g19 5′-ACA ACG TGG WCA AGT WTT AGC WGC T 140-143a，b562-583g20d5′-ACC ATT TCW GTA CCT TCT GGT AAG T 140-143a，b729-753g細(xì)菌屬鏈球菌屬21 5′-GAA ATT GCA GGIAAA TTG ATT GA 32-36e418-440h22d5′-TTA CGC ATG GCI TGA CTC ATC AT 32-36e547-569h通用引物23 5′-ACI KKI ACI GGI GTI GAR ARG TT 118-146a，b493-515i147-171a，e24d5′-AYR TTI TCI CCI GGC ATI ACC AT 118-146a，b778-800i147-171a，ea 將這些序列進(jìn)行對(duì)比以衍生相應(yīng)的引物。b 由我們的研究小組確定的序列。c 核苷酸位置指的是糞腸球菌tuf基因片段(SEQ ID NO132)。d 這些序列得自序列表中給出的原始片段的序列的相反DNA鏈。e 得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。f 核苷酸位置指的是腦膜炎奈瑟氏球菌asd基因片段(SEQ ID NO31)。g 核苷酸位置指的是金黃色葡萄球菌tuf基因片段(SEQ ID NO140)。h 核苷酸位置指的是肺炎鏈球菌recA基因(SEQ ID NO34)。i 核苷酸位置指的是大腸桿菌tuf基因片段(SEQ ID NO154)。附錄VI用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍適用性引物SEQ ID NO核苷酸序列 原始DNA片段SEQ ID NO 核苷酸位置抗生素抗性基因blatem37 5′-CTA TGT GGC GCG GTA TTA TC - -38 5′-CGC AGT GTT ATC ACT CAT GG - -39 5′-CTG AAT GAA GCC ATA CCA AA - -40 5′-ATC AGC AAT AAA CCA GCC AG - -抗生素抗性基因blashv41 5′-TTA CCA TGA GCG ATA ACA GC - -42 5′-CTC ATT CAG TTC CGT TTC CC - -43 5′-CAG CTG CTG CAG TGG ATG GT - -44 5′-CGC TCT GCT TTG TTA TTC GG - -抗生素抗性基因blarob45 5′-TAC GCC AAC ATC GTG GAA AG - -46 5′-TTG AAT TTG GCT TCT TCG GT - -47 5′-GGG ATA CAG AAA CGG GAC AT - -48 5′-TAA ATC TTT TTC AGG CAG CG - -抗生素抗性基因blaoxa49 5′-GAT GGT TTG AAG GGT TTA TTA TAA G 110a686-71050b5′-AAT TTA GTG TGT TTA GAA TGG TGA T 110a802-826抗生素抗性基因blaZ51 5′-ACT TCA ACA CCT GCT GCT TTC 111a511-53152b5′-TGA CCA CTT TTA TCA GCA ACC 111a663-683抗生素抗性基因aadB53 5′-GGC AAT AGT TGA AAT GCT CG--54 5′-CAG CTG TTA CAA CGG ACT GG--抗生素抗性基因aacC155 5′-TCT ATG ATC TCG CAG TCT CC--56 5′-ATC GTC ACC GTA ATC TGC TT--a 得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。b 這些序列得自序列表中給出的原始片段的序列的相反DNA鏈。附錄VI用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍適用性引物SEQ ID NO核苷酸序列 原始DNA片段SEQ ID NO 核苷酸位置抗生素抗性基因aacC257 5′-CAT TCT CGA TTG CTT TGC TA - -58 5′-CCG AAA TGC TTC TCA AGA TA - -抗生素抗性基因aacC359 5 ′-CTG GAT TAT GGC TAC GGA GT - -60 5′-AGC AGT GTG ATG GTA TCC AG - -抗生素抗性基因aac6’-IIa61 5′-GAC TCT TGA TGA AGT GCT GG 112a123-14262b5′-CTG GTC TAT TCC TCG CAC TC 112a284-30363 5′-TAT GAG AAG GCA GGA TTC GT 112a445-46464b5′-GCT TTC TCT CGA AGG CTT GT 112a522-541抗生素抗性基因aacA465 5′-GAG TTG CTG TTC AAT GAT CC - -66 5′-GTG TTT GAA CCA TGT ACA CG - -抗生素抗性基因aad(6’)173 5′-TCT TTA GCA GAA CAG GAT GAA - -174 5′-GAA TAA TTC ATA TCC TCC G - -抗生素抗性基因vanA67 5′-TGT AGA GGT CTA GCC CGT GT - -68 5′-ACG GGG ATA ACG ACT GTA TG - -69 5′-ATA AAG ATG ATA GGC CGG TG - -70 5′-TGC TGT CAT ATT GTC TTG CC - -抗生素抗性基因vanB71 5′-ATT ATC TTC GGC GGT TGC TC 116a22-4172b5′-GAC TAT CGG CTT CCC ATT CC 116a171-19073 5′-CGA TAG AAG CAG CAG GAC AA 116a575-59474b5′-CTG ATG GAT GCG GAA GAT AC 116a713-732a 得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。b 這些序列得自序列表中給出的原始片段的序列的相反DNA鏈。附錄VI用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍適用性引物SEQ ID NO 核苷酸序列 原始DNA片段SEQ ID NO 核苷酸位置抗生素抗性基因vanC75 5′-GCC TTA TGT ATG AAC AAA TGG117a373-39376b5′-GTG ACT TTW GTG ATC CCT TTT GA 117a541-563抗生素抗性基因msrA77 5′-TCC AAT CAT TGC ACA AAA TC - -78 5′-AAT TCC CTC TAT TTG GTG GT - -79 5′-TCC CAA GCC AGT AAA GCT AA - -80 5′-TGG TTT TTC AAC TTC TTC CA - -抗生素抗性基因satA81 5′-TCA TAG AAT GGA TGG CTC AA - -82 5′-AGC TAC TAT TGC ACC ATC CC - -抗生素抗性基因aac(6’)-aph(2”)83 5′-CAA TAA GGG CAT ACC AAA AAT C - -84 5′-CCT TAA CAT TTG TGG CAT TAT C - -85 5′-TTG GGA AGA TGA AGT TTT TAG A - -86 5′-CCT TTA CTC CAA TAA TTT GGC T - -抗生素抗性基因vat87 5′-TTT CAT CTA TTC AGG ATG GG - -88 5′-GGA GCA ACA TTC TTT GTG AC - -抗生素抗性基因vga89 5′-TGT GCC TGA AGA AGG TAT TG - -90 5′-CGT GTT ACT TCA CCA CCA CT - -抗生素抗性基因ermA91 5′-TAT CTT ATC GTT GAG AAG GGA TT 113a370-39292b5′-CTA CAC TTG GCT TAG GAT GAA A 113a487-508a 得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。b 這些序列得自序列表中給出的原始片段的序列的相反DNA鏈。附錄VI用于DNA擴(kuò)增的特異性和普遍適用性引物SEQ ID NO核苷酸序列 原始DNA片段SEQ ID NO 核苷酸位置抗生素抗性基因ermB93 5′-CTA TCT GAT TGT TGA AGA AGG ATT 114a366-38994b5′-GTT TAC TCT TGG TTT AGG ATG AAA 114a484-507抗生素抗性基因ermC95 5′-CTT GTT GAT CAC GAT AAT TTC C115a214-23596b5′-ATC TTT TAG CAA ACC CGT ATT C 115a382-403抗生素抗性基因mecA97 5′-AAC AGG TGA ATT ATT AGC ACT TGT AAG --98 5′-ATT GCT GTT AAT ATT TTT TGA GTT GAA --抗生素抗性基因int99 5′-GTG ATC GAA ATC CAG ATC C --100 5′-ATC CTC GGT TTT CTG GAA G --101 5′-CTG GTC ATA CAT GTG ATG G --102 5′-GAT GTT ACC CGA GAG CTT G --抗生素抗性基因sul103 5′-TTA AGC GTG CAT AAT AAG CC--104 5′-TTG CGA TTA CTT CGC CAA CT--105 5′-TTT ACT AAG CTT GCC CCT TC--106 5′-AAA AGG CAG CAA TTA TGA GC--a 得自數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。b 這些序列得自序列表中給出的原始片段的序列的相反DNA鏈。
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)INFECTIO DIAGNOSTIC(I.D.I.)INC.
(B)街道2050，BOELEVARD RENE LEVESQUE OUEST，4EETAGE(C)城市STE-FOY(D)州QUEBEC(E)國(guó)家加拿大(F)郵政編碼G1V 2K8(G)電話(418)681-4343(H)傳真(418)681-5254(A)名稱(chēng)BERGERON，MICHEL G.
(B)街道2069 RUE BRULARD(C)城市SILLERY(D)州QUEBEC(E)國(guó)家加拿大(F)郵政編碼G1T 1G2(A)名稱(chēng)PICARD，F(xiàn)RANCOIS J.
(B)街道1245，RUE DE LA SAPINIERE(C)城市CAP-ROUGE(D)州QUEBEC(E)國(guó)家加拿大(F)郵政編碼G1Y 1A1(A)名稱(chēng)OUELLETTE，MARC(B)街道1035 DE PLOERMEL(C)城市SILLERY
(D)州QUEBEC(E)國(guó)家加拿大(F)郵政編碼G1S 3S1(A)名稱(chēng)ROY，PAUL H.
(B)街道28，RUE CHARLES GARNIER(C)城市LORETTEVILLE(D)州QUEBEC(E)國(guó)家加拿大(F)郵政編碼G2A 3S1(ii)發(fā)明名稱(chēng)快速檢測(cè)和鑒定臨床樣品中常見(jiàn)細(xì)菌和真菌病原體及相關(guān)抗生素抗性基因，以進(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷的種特異性、屬特異性和通用DNA探針及擴(kuò)增引物(iii)序列數(shù)174(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(vi)在先申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/743,637(B)申請(qǐng)日1996年11月4日(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物屎腸球菌(xi)序列描述SEQ ID NO1TGCTTTAGCA ACAGCCTATC AG 22(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物屎腸球菌(xi)序列描述SEQ ID NO2TAAACTTCTT CCGGCACTTC G21(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO3TGCGGCTATA AATGAAGAGG C 21(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO4ATCCGATGAT GCTATGGCTT T 21(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物腦膜炎奈瑟氏球菌(xi)序列描述SEQ ID NO5CCAGCGGTAT TGTTTGGTGG T 21(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物腦膜炎奈瑟氏球菌(xi)序列描述SEQ ID NO6CAGGCGGCCT TTAATAATTT C21(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物腐生葡萄球菌(xi)序列描述SEQ ID NO7AGATCGAATT CCACATGAAG GTTATTATGA 30(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物腐生葡萄球菌(xi)序列描述SEQ ID NO8TCGCTTCTCC CTCAACAATC AAACTATCCT 30(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物無(wú)乳鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO9TTTCACCAGC TGTATTAGAA GTA23(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物無(wú)乳鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO10GTTCCCTGAA CATTATCTTT GAT23(2)關(guān)于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物白假絲酵母(xi)序列描述SEQ ID NO11CAAGAAGGTT GGTTACAACC CAAAGA26(2)關(guān)于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物白假絲酵母(xi)序列描述SEQ ID NO12AGGTCTTACC AGTAACTTTA CCGGAT 26(2)關(guān)于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO13TACTGACAAA CCATTCATGA TG 22(2)關(guān)于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14AACTTCGTCA CCAACGCGAA C 21(2)關(guān)于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15CTGGCGCGGT ATGGTCGGTT20(2)關(guān)于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16GCCGACGTTG GAAGTGGTAA AG 22(2)關(guān)于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO17CCGTGTTGAA CGTGGTCAAA TCAAA25(2)關(guān)于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO18TRTGTGGTGT RATWGWRCCA GGAGC 25(2)關(guān)于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO19ACAACGTGGW CAAGTWTTAG CWGCT 25(2)關(guān)于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO20ACCATTTCWG TACCTTCTGG TAAGT 25(2)關(guān)于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO21GAAATTGCAG GNAAATTGAT TGA23(2)關(guān)于SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO22TTACGCATGG CNTGACTCAT CAT23(2)關(guān)于SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置3(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置6(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置9(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置15(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO23ACNKKNACNG GNGTNGARAT GTT 23(2)關(guān)于SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置6(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置9
(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置18(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO24AYRTTNTCNC CNGGCATNAC CAT23(2)關(guān)于SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO25TCGCTTCTCC 10(2)關(guān)于SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度600個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物屎腸球菌(xi)序列描述SEQ ID NO26TTCTTAGAGA CATTGAATAT GCCTTATGTC GGCGCAGGCG TATTGACCAG TGCATGTGCC 60ATGGATAAAA TCATGACCAA GTATATTTTA CAAGCTGCTG GTGTGCCGCA AGTTCCTTAT120GTACCAGTAC TTAAGAATCA ATGGAAAGAA AATCCTAAAA AAGTATTTGA TCAATGTGAA180GGTTCTTTGC TTTATCCGAT GTTTGTCAAA CCTGCGAATA TGGGTTCTAG TGTCGGCATT240ACAAAGGCAG AAAACCGAGA AGAGCTGCAA AATGCTTTAG CAACAGCCTA TCAGTATGAT300TCTCGAGCAA TCGTTGAACA AGGAATTGAA GCGCGCGAAA TCGAAGTTGC TGTATTAGGA360AATGAAGATG TTCGGACGAC TTTGCCTGGC GAAGTCGTAA AAGACGTAGC ATTCTATGAT420TATGAAGCCA AATATATCAA TAATAAAATC GAAATGCAGA TTCCAGCCGA AGTGCCGGAA480GAAGTTTATC AAAAAGCGCA AGAGTACGCG AAGTTAGCTT ACACGATGTT AGGTGGAAGC540GGATTGAGCC GGTGCGATTT CTTTTTGACA AATAAAAATG AATTATTCCT GAATGAATTA600(2)關(guān)于SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1920個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO27GTGGGATTAA ACAGATTTAT GCGTGCGATG ATGGTGGTTT TCATTACTGC CAATTGCATT 60ACGATTAACC CCGACATAAT ATTTGCAGCG ACAGATAGCG AAGATTCTAG TCTAAACACA120GATGAATGGG AAGAAGAAAA AACAGAAGAG CAACCAAGCG AGGTAAATAC GGGACCAAGA180TACGAAACTG CACGTGAAGT AAGTTCACGT GATATTAAAG AACTAGAAAA ATCGAATAAA240GTGAGAAATA CGAACAAAGC AGACCTAATA GCAATGTTGA AAGAAAAAGC AGAAAAAGGT300CCAAATATCA ATAATAACAA CAGTGAACAA ACTGAGAATG CGGCTATAAA TGAAGAGGCT360TCAGGAGCCG ACCGACCAGC TATACAAGTG GAGCGTCGTC ATCCAGGATT GCCATCGGAT 420AGCGCAGCGG AAATTAAAAA AAGAAGGAAA GCCATAGCAT CATCGGATAG TGAGCTTGAA 480AGCCTTACTT ATCCGGATAA ACCAACAAAA GTAAATAAGA AAAAAGTGGC GAAAGAGTCA 540GTTGCGGATG CTTCTGAAAG TGACTTAGAT TCTAGCATGC AGTCAGCAGA TGAGTCTTCA 600CCACAACCTT TAAAAGCAAA CCAACAACCA TTTTTCCCTA AAGTATTTAA AAAAATAAAA 660GATGCGGGGA AATGGGTACG TGATAAAATC GACGAAAATC CTGAAGTAAA GAAAGCGATT 720GTTGATAAAA GTGCAGGGTT AATTGACCAA TTATTAACCA AAAAGAAAAG TGAAGAGGTA 780AATGCTTCGG ACTTCCCGCC ACCACCTACG GATGAAGAGT TAAGACTTGC TTTGCCAGAG 840ACACCAATGC TTCTTGGTTT TAATGCTCCT GCTACATCAG AACCGAGCTC ATTCGAATTT 900CCACCACCAC CTACGGATGA AGAGTTAAGA CTTGCTTTGC CAGAGACGCC AATGCTTCTT 960GGTTTTAATG CTCCTGCTAC ATCGGAACCG AGCTCGTTCG AATTTCCACC GCCTCCAACA 1020GAAGATGAAC TAGAAATCAT CCGGGAAACA GCATCCTCGC TAGATTCTAG TTTTACAAGA 1080GGGGATTTAG CTAGTTTGAG AAATGCTATT AATCGCCATA GTCAAAATTT CTCTGATTTC 1140CCACCAATCC CAACAGAAGA AGAGTTGAAC GGGAGAGGCG GTAGACCAAC ATCTGAAGAA 1200TTTAGTTCGC TGAATAGTGG TGATTTTACA GATGACGAAA ACAGCGAGAC AACAGAAGAA 1260GAAATTGATC GCCTAGCTGA TTTAAGAGAT AGAGGAACAG GAAAACACTC AAGAAATGCG 1320GGTTTTTTAC CATTAAATCC GTTTGCTAGC AGCCCGGTTC CTTCGTTAAG TCCAAAGGTA 1380TCGAAAATAA GCGACCGGGC TCTGATAAGT GACATAACTA AAAAAACGCC ATTTAAGAAT 1440CCATCACAGC CATTAAATGT GTTTAATAAA AAAACTACAA CGAAAACAGT GACTAAAAAA 1500CCAACCCCTG TAAAGACCGC ACCAAAGCTA GCAGAACTTC CTGCCACAAA ACCACAAGAA 1560ACCGTACTTA GGGAAAATAA AACACCCTTT ATAGAAAAAC AAGCAGAAAC AAACAAGCAG 1620TCAATTAATA TGCCGAGCCT ACCAGTAATC CAAAAAGAAG CTACAGAGAG CGATAAAGAG 1680GAAATGAAAC CACAAACCGA GGAAAAAATG GTAGAGGAAA GCGAATCAGC TAATAACGCA 1740AACGGAAAAA ATCGTTCTGC TGGCATTGAA GAAGGAAAAC TAATTGCTAA AAGTGCAGAA 1800GACGAAAAAG CGAAGGAAGA ACCAGGGAAC CATACGACGT TAATTCTTGC AATGTTAGCT 1860ATTGGCGTGT TCTCTTTAGG GGCGTTTATC AAAATTATTC AATTAAGAAA AAATAATTAA 1920(2)關(guān)于SEQ ID NO28的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度415個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物腦膜炎奈瑟氏球菌(xi)序列描述SEQ ID NO28TACCGGTACG CTAAATATTG GTGATGTATT GGATATTATG ATTTGGGAAG CGCCGCCAGC 60GGTATTGTTT GGTGGTGGCC TTTCTTCGAT GGGCTCGGGT AGTGCGCAAC AAACCAAGTT120GCCGGAGCAA CTGGTGACGG CACGTGGTAC GGTTTCTGTG CCGTTTGTTG GCGATATTTC180GGTGGTCGGT AAAACGCCTG GTCAGGTTCA GGAAATTATT AAAGGCCGCC TGAAAAAAAT240GGCCAATCAG CCGCAAGTGA TGGTGCGCTT GGTGCAGAAT AATGCGGCAA ATGTATCGGT300GATTCGCGCA GGCAATAGTG TGCGTATGCC GTTGACGGCA GCCGGTGAGC GTGTGTTGGA360TGCGGTGGCT GCGGTAGGTG GTTCAACGGC AAATGTGCAG GATACGAATG TGCAG 415(2)關(guān)于SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度438個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物腐生葡萄球菌(xi)序列描述SEQ ID NO29TCGCTTCTCC AGAAGAAATT TTAGAAACAT ATCTAGAAAA TCCCAAATTA GATAAACCGT 60TTATATTATG TGAATACGCA CATGCAATGG GAAATTCACC AGGAGATCTT AATGCATATC120AAACATTAAT TGAAAAATAT GATAGTTTTA TTGGCGGTTT TGTTTGGGAA TGGTGTGATC180ATAGCATTCA GGTTGGGATA AAGGAAGGTA AACCAATTTT TAGATATGGT GGAGATTTTG240GTGAGGCCTT ACATGACGGT AATTTTTGTG TTGATGGTAT TGTTTCGCCA GATCGAATTC300CACATGAAGG TTATTATGAG TTTAAACATG AACATAGACC TTTGAGATTG GTTAACGAAG360AGGATTATCG GTTTACATTG AAGAATCAAT TTGATTTTAC AAATGCGGAG GATAGTTTGA420TTGTTGAGGG AGAAGCGA 438(2)關(guān)于SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度768個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物無(wú)乳鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO30ATGAACGTTA CACATATGAT GTATCTATCT GGAACTCTAG TGGCTGGTGC ATTGTTATTT 60TCACCAGCTG TATTAGAAGT ACATGCTGAT CAAGTGACAA CTCCACAAGT GGTAAATCAT120GTAAATAGTA ATAATCAAGC CCAGCAAATG GCTCAAAAGC TTGATCAAGA TAGCATTCAG180TTGAGAAATA TCAAAGATAA TGTTCAGGGA ACAGATTATG AAAAACCGGT TAATGAGGCT240ATTACTAGCG TGGAAAAATT AAAGACTTCA TTGCGTGCCA ACCCTGAGAC AGTTTATGAT300TTGAATTCTA TTGGTAGTCG TGTAGAAGCC TTAACAGATG TGATTGAAGC AATCACTTTT360TCAACTCAAC ATTTAACAAA TAAGGTTAGT CAAGCAAATA TTGATATGGG ATTTGGGATA420ACTAAGCTAG TTATTCGCAT TTTAGATCCA TTTGCTTCAG TTGATTCAAT TAAAGCTCAA480GTTAACGATG TAAAGGCATT AGAACAAAAA GTTTTAACTT ATCCTGATTT AAAACCAACT540GATAGAGCTA CCATCTATAC AAAATCAAAA CTTGATAAGG AAATCTGGAA TACACGCTTT600ACTAGAGATA AAAAAGTACT TAACGTCAAA GAATTTAAAG TTTACAATAC TTTAAATAAA660GCAATCACAC ATGCTGTTGG AGTTCAGTTG AATCCAAATG TTACGGTACA ACAAGTTGAT720CAAGAGATTG TAACATTACA AGCAGCACTT CAAACAGCAT TAAAATAA 768(2)關(guān)于SEQ ID NO31的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度421個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物腦膜炎奈瑟氏球菌(xi)序列描述SEQ ID NO31ATGAAAGTAG GTTTCGTCGG CTGGCGCGGT ATGGTCGGTT CGGTTTTGAT GCAGCGTATG 60AAAGAAGAAA ACGACTTCGC CCACATTCCC GAAGCGTTTT TCTTTACCAC TTCCAACGTC120GGCGGCGCAC GCCCTGATTT CGGTCAGGCG GCTAAAACAT TATTGGACGC GAACAACGTT180GCCGAGCTGG CAAAAATGGA CATCATCGTT ACCTGCCAAG GCGGCGACTA CACCAAATCC240GTCTTCCAAG CCCTGCGCGA CAGCGGCTGG AACGGCTACT GGATTGACGC GGCATCCTCG300CTGCGTATGA AAGACGACGC GATTATCGTC CTCGACCCCG TCAACCGCAA CGTCATCGAC360AACGGCCTCA AAAACGGCGT GAAAAACTAC ATCGGCGGCA ACTGTACCGT TTCCCTGATG420C421(2)關(guān)于SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度213個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物格氏鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO32TTCATAGACG CTGAGCACGC TTTGGATCCA TCTTACGCGG CTGCTCTAGG TGTAAATATT 60GATGAGCTGT TGCTATCTCA ACCAGATTCT GGTGAGCAAG GTTTAGAAAT TGCAGGAAAA120TTGATTGACT CTGGGGCAGT TGATTTAGTT GTCATCGACT CTGTTGCAGC TCTTGTACCA180CGTGCGGAAA TCGATGGAGA TATCGGTGAT AGC 213(2)關(guān)于SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度692個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物變異鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO33GGGCCGGAAT CTTCTGGTAA GACAACTGTC GCTCTTCATG CTGCTGCTCA GGCGCAAAAA 60GATGGCGGTA TTGCCGCTTT CATTGATGCA GAACATGCCC TTGATCCAGC CTATGCTGCT120GCTCTTGGCG TTAATATTGA TGAGCTTTTG CTTTCACAAC CAGATTCAGG AGAACAGGGT180CTTGAAATTG CAGGGAAATT GATTGATTCT GGCGCTGTTG ATTTAGTTGT TGTTGACTCA240GTGGCAGCTT TAGTACCACG TGCGGAGATT GACGGAGATA TTGGTAATAG TCATGTTGGC300TTACAAGCAC GCATGATGAG TCAAGCGATG CGTAAATTAT CAGCTTCAAT CAATAAAACA360AAAACCATTG CTATTTTTAT TAATCAATTG CGGGAAAAAG TTGGTATTAT GTTTGGTAAT420CCAGAAACAA CCCCTGGCGG GCGTGCCTTG AAGTTTTATT CTTCTGTGCG TCTTGATGTC480CGCGGCAATA CTCAAATTAA AGGAACCGGG GAACAAAAAG ACAGCAATAT TGGTAAAGAG540ACCAAAATTA AAGTTGTTAA AAATAAAGTT GCTCCACCAT TTAAGGAAGC TTTTGTAGAA600ATTATATATG GTGAAGGCAT TTCTCGTACA GGTGAATTAG TTAAGATTGC CAGTGATTTG660GGAATTATCC AAAAAGCTGG AGCTTGGTAC TC 692(2)關(guān)于SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1204個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物肺炎鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO34ATGGCGAAAA AACCAAAAAA ATTAGAAGAA ATTTCAAAAA AATTTGGGGC AGAACGTGAA60AAGGCCTTGA ATGACGCTCT TAAATTGATT GAGAAAGACT TTGGTAAAGG ATCAATCATG 120CGTTTGGGTG AACGTGCGGA GCAAAAGGTG CAAGTGATGA GCTCAGGTTC TTTAGCTCTT 180GACATTGCCC TTGGCTCAGG TGGTTATCCT AAGGGACGTA TCATCGAAAT CTATGGCCCA 240GAGTCATCTG GTAAGACAAC GGTTGCCCTT CATGCAGTTG CACAAGCGCA AAAAGAAGGT 300GGGATTGCTG CCTTTATCGA TGCGGAACAT GCCCTTGATC CAGCTTATGC TGCGGCCCTT 360GGTGTCAATA TTGACGAATT GCTCTTGTCT CAACCAGACT CAGGAGAGCA AGGTCTTGAG 420ATTGCGGGAA AATTGATTGA CTCAGGTGCA GTTGATCTTG TCGTAGTCGA CTCAGTTGCT 480GCCCTTGTTC CTCGTGCGGA AATTGATGGA GATATCGGAG ATAGCCATGT TGGTTTGCAG 540GCTCGTATGA TGAGCCAGGC CATGCGTAAA CTTGGCGCCT CTATCAATAA AACCAAAACA 600ATTGCCATTT TTATCAACCA ATTGCGTGAA AAAGTTGGAG TGATGTTTGG AAATCCAGAA 660ACAACACCGG GCGGACGTGC TTTGAAATTC TATGCTTCAG TCCGCTTGGA TGTTCGTGGT 720AATACACAAA TTAAGGGAAC TGGTGATCAA AAAGAAACCA ATGTCGGTAA AGAAACTAAG 780ATTAAGGTTG TAAAAAATAA GGTAGCTCCA CCGTTTAAGG AAGCCGTAGT TGAAATTATG 840TACGGAGAAG GAATTTCTAA GACTGGTGAG CTTTTGAAGA TTGCAAGCGA TTTGGATATT 900ATCAAAAAAG CAGGGGCTTG GTATTCTTAC AAAGATGAAA AAATTGGGCA AGGTTCTGAG 960AATGCTAAGA AATACTTGGC AGAGCACCCA GAAATCTTTG ATGAAATTGA TAAGCAAGTC 1020CGTTCTAAAT TTGGCTTGAT TGATGGAGAA GAAGTTTCAG AACAAGATAC TGAAAACAAA 1080AAAGATGAGC CAAAGAAAGA AGAAGCAGTG AATGAAGAAG TTCCGCTTGA CTTAGGCGAT 1140GAACTTGAAA TCGAAATTGA AGAATAAGCT GTTAAAGCAG TGGAGAAATC CGCTACTTTT 1200TCGA 1204(2)關(guān)于SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度981個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物 釀膿鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO35ATGCGTTCAG GAAGTCTAGC TCTTGATATT GCTTGGATAG CTGGTGGTTA TCCTAAAGGA60CGTATCATCG AAATCTATGG TCCAGAGTCT TCCGGTAAAA CGACTGTGGC TTTACATGCT 120GTAGCACAAG CTCAAAAAGA AGGTGGAATC GCAGCCTTTA TCGATGCCGA GCATGCGCTT 180GATCCAGCTT ATGCTGCTGC GCTTGGGGTT AATATTGATG AACTTCTCTT GTCTCAACCA 240GATTCTGGAG AACAAGGACT TGAAATTGCA GGTAAATTGA TTGATTCTGG TGCGGTTGAC 300CTGGTTGTTG TCGATTCAGT AGCAGCTTTA GTGCCACGTG CTGAAATTGA TGGTGATATT 360GGCGATAGCC ATGTCGGATT GCAAGCACGT ATGATGAGTC AGGCCATGCG TAAATTATCA 420GCTTCTATTA ATAAAACAAA AACTATCGCA ATCTTTATCA ACCAATTGCG TGAAAAAGTT 480GGTGTGATGT TTGGAAATCC TGAAACAACA CCAGGTGGTC GAGCTTTGAA ATTCTATGCT 540TCTGTTCGGC TGGATGTGCG TGGAAACAAC CAAATTAAAG GAACTGGTGA CCAAAAGATA 600GCCAGCATTG GTAAGGAGAC CAAAATCAAG GTTGTTAAAA ACAAGGTCGC TCCGCCATTT 660AAGGTAGCAG AAGTTGAAAT CATGTATGGG GAAGGTATTT CTCGTACAGG GGAGCTTGTG 720AAAATTGCTT CTGATTTGGA CATTATCCAA AAAGCAGGTG CTTGGTTCTC TTATAATGGT 780GAGAAGATTG GCCAAGGTTC TGAAAATGCT AAGCGTTATT TGGCCGATCA TCCACAATTG 840TTTGATGAAA TCGACCGTAA AGTACGTGTT AAATTTGGTT TGCTTGAAGA AAGCGAAGAA 900GAATCTGCTA TGGCAGTAGC ATCAGAAGAA ACCGATGATC TTGCTTTAGA TTTAGATAAT 960GGTATTGAAA TTGAAGATTA A 981(2)關(guān)于SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度312個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物唾液鏈球菌(xi)序列描述SEQ ID NO36GCGTATGCAC GAGCTCTAGG TGTTAATATC GATGAGCTTC TTTTGTCGCA GCCTGATTCT 60GGTGAGCAAG GTCTCGAAAT TGCAGGTAAG CTGATTGACT CTGGTGCAGT GGATTTAGTT120GTTGTTGACT CAGTTGCGGC CTTCGTACCA CGTGCAGAAA TTGATGGAGA TAGTGGTGAC180AGTCATGTAG GACTTCAAGC GCGTATGATG AGTCAAGCCA TGCGTAAACT TTCTGCATCT240ATTAATAAAA CAAAAACGAT TGCTATCTTT ATTAACCAGT TGCGTGAAAA AGTTGGTATC300ATGTTTGGTA AC312(2)關(guān)于SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO37CTATGTGGCG CGGTATTATC20(2)關(guān)于SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO38CGCAGTGTTA TCACTCATGG20(2)關(guān)于SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO39CTGAATGAAG CCATACCAAA20(2)關(guān)于SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO40ATCAGCAATA AACCAGCCAG 20(2)關(guān)于SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO41TTACCATGAG CGATAACAGC20(2)關(guān)于SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO42CTCATTCAGT TCCGTTTCCC 20(2)關(guān)于SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO43CAGCTGCTGC AGTGGATGGT 20(2)關(guān)于SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO44CGCTCTGCTT TGTTATTCGG20(2)關(guān)于SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO45TACGCCAACA TCGTGGAAAG 20(2)關(guān)于SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO46TTGAATTTGG CTTCTTCGGT20(2)關(guān)于SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO47GGGATACAGA AACGGGACAT 20(2)關(guān)于SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO48TAAATCTTTT TCAGGCAGCG20(2)關(guān)于SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO49GATGGTTTGA AGGGTTTATT ATAAG 25(2)關(guān)于SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO50AATTTAGTGT GTTTAGAATG GTGAT 25(2)關(guān)于SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO51ACTTCAACAC CTGCTGCTTT C 21(2)關(guān)于SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO52TGACCACTTT TATCAGCAAC C 21(2)關(guān)于SEQ ID NO53的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO53GGCAATAGTT GAAATGCTCG 20(2)關(guān)于SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO54CAGCTGTTAC AACGGACTGG20(2)關(guān)于SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO55TCTATGATCT CGCAGTCTCC20(2)關(guān)于SEQ ID 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NO74的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO74CTGATGGATG CGGAAGATAC 20(2)關(guān)于SEQ ID NO75的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO75GCCTTATGTA TGAACAAATG G 21(2)關(guān)于SEQ ID NO76的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO76GTGACTTTWG TGATCCCTTT TGA 23(2)關(guān)于SEQ ID NO77的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO77TCCAATCATT GCACAAAATC 20(2)關(guān)于SEQ ID NO78的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO78AATTCCCTCT ATTTGGTGGT 20(2)關(guān)于SEQ ID NO79的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO79TCCCAAGCCA GTAAAGCTAA 20(2)關(guān)于SEQ ID NO80的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO80TGGTTTTTCA ACTTCTTCCA 20(2)關(guān)于SEQ ID NO81的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO81TCATAGAATG GATGGCTCAA20(2)關(guān)于SEQ ID NO82的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO82AGCTACTATT GCACCATCCC 20(2)關(guān)于SEQ ID NO83的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO83CAATAAGGGC ATACCAAAAA TC 22(2)關(guān)于SEQ ID NO84的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO84CCTTAACATT TGTGGCATTA TC 22(2)關(guān)于SEQ ID NO85的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO85TTGGGAAGAT GAAGTTTTTA GA 22(2)關(guān)于SEQ ID 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(B)位置9(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置15(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置18(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置21(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO107AAYATGATNA CNGGNGCNGC NCARATGGA29(2)關(guān)于SEQ ID NO108的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置3(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置6(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置9(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO108CCNACNGTNC KNCCRCCYTC RCG 23(2)關(guān)于SEQ ID NO109的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置6(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置15(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置18(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO109CARYTNATHG TNGCNGTNAA YAARATGGA 29(2)關(guān)于SEQ ID NO110的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度831個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO110ATGAAAAACA CAATACATAT CAACTTCGCT ATTTTTTTAA TAATTGCAAA TATTATCTAC 60AGCAGCGCCA GTGCATCAAC AGATATCTCT ACTGTTGCAT CTCCATTATT 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NO112的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度555個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO112ATGTCCGCGA GCACCCCCCC CATAACTCTT CGCCTCATGA CCGAGCGCGA CCTGCCGATG 60CTCCATGACT GGCTCAACCG GCCGCACATC GTTGAGTGGT GGGGTGGCGA CGAAGAGCGA120CCGACTCTTG ATGAAGTGCT GGAACACTAC CTGCCCAGAG CGATGGCGGA AGAGTCCGTA180ACACCGTACA TCGCAATGCT GGGCGAGGAA CCGATCGGCT ATGCTCAGTC GTACGTCGCG240CTCGGAAGCG GTGATGGCTG GTGGGAAGAT GAAACTGATC CAGGAGTGCG AGGAATAGAC300CAGTCTCTGG CTGACCCGAC ACAGTTGAAC AAAGGCCTAG GAACAAGGCT TGTCCGCGCT360CTCGTTGAAC TACTGTTCTC GGACCCCACC GTGACGAAGA TTCAGACCGA CCCGACTCCG420AACAACCATC GAGCCATACG CTGCTATGAG AAGGCAGGAT TCGTGCGGGA GAAGATCATC480ACCACGCCTG ACGGGCCGGC GGTTTACATG GTTCAAACAC GACAAGCCTT CGAGAGAAAG540CGCGGTGTTG CCTAA 555(2)關(guān)于SEQ ID NO113的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度732個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO113ATGAACCAGA AAAACCCTAA AGACACGCAA AATTTTATTA CTTCTAAAAA GCATGTAAAA 60GAAATATTGA ATCACACGAA 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(A)長(zhǎng)度1029個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO116ATGAATAAAA TAAAAGTCGC AATTATCTTC GGCGGTTGCT CGGAGGAACA TGATGTGTCG 60GTAAAATCCG CAATAGAAAT TGCTGCGAAC ATTAATACTG AAAAATTCGA TCCGCACTAC120ATCGGAATTA CAAAAAACGG CGTATGGAAG CTATGCAAGA AGCCATGTAC GGAATGGGAA180GCCGATAGTC TCCCCGCCAT ATTCTCCCCG GATAGGAAAA CGCATGGTCT GCTTGTCATG240AAAGAAAGAG AATACGAAAC TCGGCGTATT GACGTGGCTT TCCCGGTTTT GCATGGCAAA300TGCGGGGAGG ATGGTGCGAT ACAGGGTCTG TTTGAATTGT CTGGTATCCC CTATGTAGGC360TGCGATATTC AAAGCTCCGC AGCTTGCATG GACAAATCAC TGGCCTACAT TCTTACAAAA420AATGCGGGCA TCGCCGTCCC CGAATTTCAA ATGATTGAAA AAGGTGACAA ACCGGAGGCG480AGGACGCTTA CCTACCCTGT CTTTGTGAAG CCGGCACGGT CAGGTTCGTC CTTTGGCGTA540ACCAAAGTAA ACAGTACGGA AGAACTAAAC GCTGCGATAG AAGCAGCAGG ACAATATGAT600GGAAAAATCT TAATTGAGCA AGCGATTTCG GGCTGTGAGG TCGGCTGCGC GGTCATGGGA660AACGAGGATG ATTTGATTGT CGGCGAAGTG GATCAAATCC GGTTGAGCCA CGGTATCTTC720CGCATCCATC AGGAAAACGA GCCGGAAAAA GGCTCAGAGA ATGCGATGAT TATCGTTCCA780GCAGACATTC CGGTCGAGGA ACGAAATCGG GTGCAAGAAA CGGCAAAGAA AGTATATCGG840GTGCTTGGAT GCAGAGGGCT TGCTCGTGTT GATCTTTTTT TGCAGGAGGA TGGCGGCATC900GTTCTAAACG AGGTCAATAC CCTGCCCGGT TTTACATCGT ACAGCCGCTA TCCACGCATG960GCGGCTGCCG CAGGAATCAC GCTTCCCGCA CTAATTGACA GCCTGATTAC ATTGGCGATA 1020GAGAGGTGA 1029(2)關(guān)于SEQ ID NO117的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1031個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO117ATGAAAAAAA TTGCCGTTTT ATTTGGAGGG AATTCTCCAG AATACTCAGT GTCACTAACC 60TCAGCAGCAA GTGTGATCCA AGCTATTGAC CCGCTGAAAT ATGAAGTAAT GACCATTGGC 120ATCGCACCAA CAATGGATTG GTATTGGTAT CAAGGAAACC TCGCGAATGT TCGCAATGAT 180ACTTGGCTAG AAGATCACAA AAACTGTCAC CAGCTGACTT TTTCTAGCCA AGGATTTATA 240TTAGGAGAAA AACGAATCGT CCCTGATGTC CTCTTTCCAG TCTTGCATGG GAAGTATGGC 300GAGGATGGCT GTATCCAAGG ACTGCTTGAA CTAATGAACC TGCCTTATGT TGGTTGCCAT 360GTCGCTGCCT CCGCATTATG TATGAACAAA TGGCTCTTGC ATCAACTTGC TGATACCATG 420GGAATCGCTA GTGCTCCCAC TTTGCTTTTA TCCCGCTATG AAAACGATCC TGCCACAATC 480GATCGTTTTA TTCAAGACCA TGGATTCCCG ATCTTTATCA AGCCGAATGA AGCCGGTTCT 540TCAAAAGGGA TCACAAAAGT AACTGACAAA ACAGCGCTCC AATCTGCATT AACGACTGCT 600TTTGCTTACG GTTCTACTGT GTTGATCCAA AAGGCGATAG CGGGTATTGA AATTGGCTGC 660GGCATCTTAG GAAATGAGCA ATTGACGATT GGTGCTTGTG ATGCGATTTC TCTTGTCGAC 720GGTTTTTTTG ATTTTGAAGA GAAATACCAA TTAATCAGCG CCACGATCAC TGTCCCAGCA 780CCATTGCCTC TCGCGCTTGA ATCACAGATC AAGGAGCAGG CACAGCTGCT TTATCGAAAC 840TTGGGATTGA CGGGTCTGGC TCGAATCGAT TTTTTCGTCA CCAATCAAGG AGCGATTTAT 900TTAAACGAAA TCAACACCAT GCCGGGATTT ACTGGGCACT CCCGCTACCC AGCTATGATG 960GCGGAAGTCG GGTTATCCTA CGAAATATTA GTAGAGCAAT TGATTGCACT GGCAGAGGAG1020GACAAACGAT G 1031(2)關(guān)于SEQ ID NO118的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度809個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源
(A)生物Abiotrophia adiacens(xi)序列描述SEQ ID NO118TGGTGCTATC TTAGTAGTAT CTGCAGCTGA TGGTCCAATG CCTCAAACAC GTGAACACAT60CTTATTATCA CGTCAAGTAG GTGTTCCTTA CATCGTTGTA TTCTTAAACA AAGTTGACAT 120GGTTGACGAT GAAGAATTAT TAGAATTAGT AGAAATGGAA GTTCGTGACT TATTATCAGA 180ATACGATTTC CCAGGCGATG ACACTCCAGT TGTTGCAGGT TCTGCTTTAC GCGCTTTAGA 240AGGCGACGCT TCATACRAAG AAAAAATCTT AGAATTAATG GCTGCTGTTG ACGAATACAT 300TCCAACTCCA GAACGYGACG TTGACAAACC ATTCATGATG CCAGTTGAAG ACGTGTTCTC 360AATCACAGGT CGTGGTACTG TTGCTACAGG TCGTGTTGAA CGTGGACAAG TTCGTGTTGG 420TGACGAAGTT GAAATCGTTG GTATTTCAGA AGAAACTTCA AAAACAACTG TAACTGGTGT 480TGAAATGTTC CGTAAATTGT TAGACTACGC TGAAGCAGGG GATAACATTG GTACATTATT 540ACGTGGTGTT ACACGTGACA ACATCGAACG TGGACAAGTT CTTGCTAAAC CAGGAACAAT 600CACTCCACAT ACTAAATTCA AAGCTGAAGT TTACGTATTA ACTAAAGAAG AAGGTGGACG 660TCATACTCCA TTCTTCTCTA ACTACCGTCC TCAATTCTAC TTCCGTACAA CAGACATCAC 720TGGTGTTTGT GTGTTACCAG AAGGCGTTGA AATGGTAATG CCTGGTGATA ACGTAACTAT 780GGAAGTTGAA TTAATTCACC CAGTAGCGA 809(2)關(guān)于SEQ ID NO119的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度817個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物Abiotrophia defectiva(xi)序列描述SEQ ID NO119CGGCGCGATC CTCGTTGTAT CTGCTGCTGA CGGCCCAATG CCACAAACTC GTGAACACAT 60CCTCTTGTCT CGTCAAGTTG GTGTTCCTTA CATCGTAGTA TTCTTGAACA AAGTTGACAT 120GGTTGACGAC GAAGAATTGC TCGAATTAGT TGAAATGGAA GTTCGTGACC TCTTGTCTGA 180ATACGACTTC CCAGGCGACG ACACTCCAGT TATCGCTGGT TCAGCTTTGA AAGCTTTAGA 240AGGCGACGCT AACTACGAAG CTAAAGTTTT AGAATTGATG GAACAAGTTG ATGCTTACAT 300TCCAGAACCA GAACGTGACA CTGACAAGCC ATTCATGATG CCAGTCGAAG ACGTATTCTC 360TATCACTGGT CGTGGTACTG TTGCAACTGG TCGTGTTGAA CGTGGTCAAG TTCGCGTTGG 420TGACGAAGTT GAAATCGTTG GTATCGAAGA AGAAACTTCT AAGACTACCG TTACCGGTGT 480TGAAATGTTC CGTAAGTTAT TGGATTACGC TGAAGCTGGG GACAACGTTG GTACCTTGTT 540ACGTGGTGTA ACTCGTGACC AAATCCAACG TGGTCAAGTA TTATCTAAAC CAGGTTCAAT 600CACTCCGYAC ACTAAGTTCG AAGCTGAAGT GTACGTATTG TCTAAAGAAG AAGGTGGTCG 660TCACACTCCA TTCTTCTCTA ACTACCGTCC ACAATTCTAC TTCCGTACAA CTGACGTAAC 720TGGTGTTGTT ACTTTACCAG AAGGTACTGA AATGGTTATG CCAGGCGACA ACGTACAAAT 780GGTTGTTGAA TTGATCCACC CAATCGCGAT CGAAGAA 817(2)關(guān)于SEQ ID NO120的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度754個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物白假絲酵母(xi)序列描述SEQ ID NO120CTCTGTCAAA TGGGACAAAA ACAGATTTGA AGAAATCATC AAGGAAACCT CCAACTTCGT60CAAGAAGGTT GGTTACAACC CAAAGACTGT TCCATTCGTT CCAATCTCTG GTTGGAATGG 120TGACAACWTG ATTGAASCAT CCACCAACTG TCCATGGTAC AAGGGTTGGG AAAAGGAAAC 180CAAATCCGGT AAAGTTACTG GTAAGACCTT GTTAGAAGCT ATTGACGCTA TTGAACCACC 240AACCAGACCA ACCGACAAAC CATTGAGATT GCCATTRCAA GATGTTTACA AGATCGGTGG 300TATTGGTACT GTGCCAGTCG GTAGAGTTGA AACTGGTATC ATCAAAGCCG GTATGGTWGT 360TACTTTCGCC CCAGCTGGTG TTACCACTGA AGTCAARTCC GTTGAAATGC ATCACGAACA 420ATTGGCTGAA GGTGTTCCAG GTGACAATGT TRGTTTCAAC GTTAAGAACR TTTCCGTTAA 480AGAAATTAGA AGAGGTAACG TTTGTGGTGA CTCCAAGAAC GATCCACCAA AGGGTTGTGA 540CTCTTTCAAT GCCCAAGTCA TTGTTTTGAA CCATCCAGGT CAAATCTCTG CTGGTTACTC 600TCCAGTCTTG GATTGTCACR CTGCCCACAT TGCTTGTAAA 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(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物杰氏棒桿菌(xi)序列描述SEQ ID NO128CGGCGCCATC CTGGTTGTTG CCGCAACCGA TGGCCCGATG CCGCAGACCC GCGAGCACGT 60TCTGCTGGCY CGCCAGGTTG GCGTTCCGTA CATCCTGGTT GCACTGAACA AGTGTGACAT120GGTTGACGAT GAGGAGCTGC TGGAGCTCGT CGAGATGGAG GTCCGCGAGC TGCTGGCTGA180GCAGGACTTC GACGAGGAAG CTCCGGTTGT TCACATCTCC GCACTGAAGG CCCTGGAGGG240CGACGAGAAG TGGGCTAACC AGATTCTCGA GCTGATGCAG GCTTGCGACG AGTCTATCCC300GGATCCGGAG CGCGAGACCG ACAAGCCGTT CCTGATGCCG GTTGWGGACA TCTTCACCAT360TACCGGTCGC GGTACCGTTG TTACCGGCCG TGTTGAGCGT GGCATCCTGA ACCTGAACGA420CGAGGTTGAG ATCCTGGGTA TCCGCGAGAA GTCCCAGAAG ACCACCGTTA CCTCCATCGA480GATGTTCAAC AAGCTGCTGG ACACCGCAGA GGCTGGCRAC AACGCTGCAC TGCTGCTGCG540TGGTCTGAAG CGCGAGGACG TTGAGCGTGG CCAGATCATC GCTAAGCCGG GCGAGTACAC600CCCGCACACC GAGTTCGAGG GCTCCGTCTA CGTTCTGTCC AAGGACGAGG GCGGCCGCCA660CACCCCGTTC TTCGACAACT ACCGTCCGCA GTTCTACTTC CGCACCACCG ACGTTACCGG720TGTTGTGAAG CTGCCTGAGG GCACCGAGAT GGTTATGCCG GGCGACAACG TYGACATGTC780CGTCACCCTG ATCCAGCCGG 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ACTATTTCTG GGCGTGGTAC CGTTGTCACG 420GGGCGCATCG AATGTGGGGT AATTAGTCTG AATGAAGAGG TCGAGATCGT CGGGATTAAG 480CCCACTAAGA AAACAGTGGT TACTGGCATT GAGATGTTTA ATAAGTTGCT TGATCAGGGA 540ATTGCAGGTG ATAACGTGGG GCTGCTTTTG CGCGGGGTGG ATAAAAAAGA GGTTGAGCGC 600GGTCAGGTGC TTTCTAAGCC CGGTTCTATT AAGCCACACA CCAAGTTTGA GGCGCAGATC 660TACGTGCTCT CTAAGGAAGA GGGTGGCCGT CACAGTCCTT TTTTTCAAGG TTATCGTCCG 720CAGTTTTATT TTAGAACTAC TGACATTACC GGTACGATTT CTCTTCCTGA AGGGGTAGAC 780ATGGTGAAGC CGGGGGATAA CACCAAGATT ATAGGTGAGC TCATCCACCC GATAGCTATG 840GACAAGGGTC TGAAGCTTGC GATTCGTGAA GGGGGGCGCA CTATTGCTTC TGGT894(2)關(guān)于SEQ ID NO170的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度891個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物解脲尿支原體(xi)序列描述SEQ ID NO170AATATGATTA CAGGGGCAGC ACAAATGGAT GGAGCAATTT TAGTTATTGC TGCATCTGAT 60GGGGTTATGG CTCAAACTAA AGAACATATT TTATTAGCAC GTCAAGTTGG TGTTCCAAAA 120ATCGTTGTTT TCTTAAACAA ATGTGATTTC ATGACAGATC CAGATATGCA AGATCTTGTT 180GAAATGGAAG TTCGTGAATT ATTATCTAAA TATGGATTTG ATGGCGATAA CACACCAGTT 240ATTCGTGGTT CAGGTCTTAA GGCTTTAGAA GGAGATCCAG TTTGAGAAGC AAAAATTGAT 300GAATTAATGG ACGCAGTTGA TTCATGAATT CCATTACCAG AACGTAGTAC TGACAAACCA 360TTCTTATTAG CAATTGAAGA TGTATTCACA ATTTCAGGAC GTGGTACAGT AGTAACTGGA 420CGTGTTGAAC GTGGTGTATT AAAAGTTAAT GATGAGGTTG AAATTGTTGG TCTAAAAGAC 480ACTCAAAAAAC TGTTGTTAC AGGAATTGAA ATGTTTAGAA AATCATTAGA TCAAGCTGAA 540GCTGGTGATA ATGCTGGTAT TTTATTACGT GGTATTAAAA AAGAAGATGT TGAACGTGGT 600CAAGTACTTG TAAAACCAGG ATCAATTAAA CCTCACCGTA CTTTTACTGC TAAAGTTTAT 660ATTCTTAAAA AAGAAGAAGG TGGACGTCAT ACACCTATTG TTTCAGGATA CCGTCCACAA 720TTCTATTTTA GAACAACAGA TGTAACAGGT GCTATTTCAT TACCTGCTGG TGTTGATTTG 780GTTATGCCAG GTGATGACGT TGAAATGACT GTAGAATTAA TTGCTCCAGT TGCGATTGAA 840GATGGATCTA AATTCTCAAT CCGTGAAGGT GGTAAAACTG TAGGTCATGG T 891(2)關(guān)于SEQ ID NO171的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度909個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)來(lái)源(A)生物產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO171AACATGATTA CAGGTGCTGC TCAAATGGAT GGCGCGATTC TTGTTGTTTC TGCGGCGGAT 60GGCCCCATGC CCCAAACTAG GGAGCACATT CTTCTTTCTC GACAAGTAGG CGTTCCTTAC120ATCGTGGTTT TCTTGAACAA AGAAGATATG GTTGATGACG CTGAGCTTCT TGAGCTTGTT180GAAATGGAAG TTAGAGAACT TCTTAGCAAC TACGACTTCC CTGGAGATGA CACTCCTATC240GTTGCAGGTT CCGCTCTTAA AGCTCTTGAA GAGGCTAACG ACCAGGAAAA TGTTGGCGAG300TGGGGCGAGA AAGTATTGAA GCTTATGGCT GAGGTTGACC GATATATTCC TACGCCTGAG360CGAGATGTGG ATAAGCCTTT CCTTATGCCT GTTGAAGACG TATTCTCCAT CGCGGGTCGT420GGAACCGTTG TGACAGGAAG AATTGAAAGA GGCGTGGTTA AAGTCGGTGA CGAAGTAGAA480ATCGTTGGTA TCCGAAACAC ACAAAAAACA ACCGTAACTG GCGTTGAGAT GTTCCGAAAA540GAGCTCGACA AGGGTGAGGC GGGTGACAAC GTTGGTGTTC TTTTGAGAGG CACCAAGAAA600GAAGATGTTG AGAGAGGTAT GGTTCTTTGT AAAATAGGTT CTATCACTCC TCACACTAAC660TTTGAAGGTG AAGTTTACGT TCTTTCCAAA GAGGAAGGCG GACGACACAC TCCATTCTTC720AATGGATACC GACCTCAGTT CTATGTTAGA ACTACAGACG TTACCGGTTC TATCTCTCTT780CCTGAGGGCG TAGAGATGGT TATGCCTGGT GACAACGTTA AGATCAATGT TGAGCTTATC840GCTCCTGTAG CCCTCGAAGA GGGAACACGA TTCGCGATCC GTGAAGGTGG TCGAACCGTT900GGTGCGGGT909(2)關(guān)于SEQ ID NO172的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置6(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置12(D)其它信息注“n＝次黃苷”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置18(D)其它信息注“n＝次黃苷”(xi)序列描述SEQ ID NO172TARTCNGTRA ANGCYTCNAC RCACAT26(2)關(guān)于SEQ ID NO173的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO173TCTTTAGCAG AACAGGATGA A 21(2)關(guān)于SEQ ID NO174的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO174GAATAATTCC ATATCCTCCG 20
權(quán)利要求
1.使用特異性、普遍適用并靈敏的探針和/或擴(kuò)增引物從懷疑含有下述細(xì)菌和/或真菌核酸的任何樣品中確定下列來(lái)源的核酸的存在和/或量的方法-選自下列組中的抗生素抗性基因blatem、blashv、blarob、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aac6′-IIa、aacA4、aad(6′)、vanA、vanB、vanC、msrA、satA、aac(6′)-aph(2″)、vat、vga、ermA、ermB、ermC、mecA、int和sul，以及-選自下列組中的特定細(xì)菌和真菌菌種屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬、奈瑟氏球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和假絲酵母屬，其中所述每一種核酸或其變體或其部分包含可與所述探針或引物雜交的選定靶區(qū)域；所述方法包括下列步驟在雜交或擴(kuò)增的相同條件下使所述樣品與所述探針或引物接觸，并檢測(cè)已雜交的探針或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和/或量，以作為所述特定細(xì)菌和/或真菌菌種或?qū)?，同時(shí)還有所述細(xì)菌抗生素抗性基因的存在和/或量的指征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中還使用特異的、普遍適用并靈敏的探針和/或引物以同時(shí)確定任何細(xì)菌或真菌的核酸的存在和/或量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其為直接對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行。
4.權(quán)利要求1的方法，其是直接對(duì)由細(xì)菌和/或真菌培養(yǎng)物或懸液組成的試驗(yàn)樣品進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸均是在相同的雜交或擴(kuò)增條件下進(jìn)行檢測(cè)的。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸是用選自下列組中的方法擴(kuò)增的a)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，b)連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，c)基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)d)自身維持的序列復(fù)制(3SR)，e)鏈置換擴(kuò)增(SDA)，f)分支DNA信號(hào)擴(kuò)增(bDNA)，g)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，h)循環(huán)探針技術(shù)(CPT)，i)嵌套PCR，和j)多重PCR。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述核酸是用PCR法擴(kuò)增的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中PCR方法在同樣擴(kuò)增條件下，以每擴(kuò)增循環(huán)為45-55℃30秒鐘的退火步驟和95℃1秒鐘的變性步驟，而沒(méi)有特別用于延伸步驟的任何時(shí)間的程序進(jìn)行，在1小時(shí)內(nèi)完成對(duì)所述核酸存在情況的檢測(cè)。
9.直接從試驗(yàn)樣品或從細(xì)菌和/或真菌培養(yǎng)物檢測(cè)、鑒定和/或定量測(cè)定選自下列一組中的微生物的方法屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬種、奈瑟氏球菌屬種、葡萄球菌屬種、鏈球菌種和假絲酵母屬種，該方法包括以下步驟a)使所述樣品或從該樣品中分離的所述微生物的基本均質(zhì)的群體的微生物DNA沉積并固定在惰性載體上或留在溶液中，或者將所述樣品或所述從該樣品分離的基本均質(zhì)的微生物群體接種在惰性載體上，并在原位裂解該接種樣品或分離微生物，以釋放微生物DNA，所述微生物DNA基本上制成單鏈形式；b)在所述探針的核酸能夠選擇性地與所述微生物DNA雜交的條件下，使所述單鏈DNA與探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，其中所述探針至少包括一種單鏈核酸，該單鏈核酸的核苷酸序列選自SEQ IDNO26、27、28、29、30、120、131至134、31、140至143、32至36、120至124，其互補(bǔ)序列、其至少有12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分及其變體，并可特異地和普遍適用地相應(yīng)與屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腐生葡萄球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬種、奈瑟氏球菌屬種、葡萄球菌屬種、鏈球菌屬種和假絲酵母屬種的菌株或典型代表一起退火；以及c)檢測(cè)所述惰性載體上或所述溶液中所述雜交復(fù)合物的存在作為所述試驗(yàn)樣品中所述微生物的存在和/或量之指征。
10.檢測(cè)試驗(yàn)樣品中選自屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬種、奈瑟氏球菌屬種、葡萄球菌屬種、鏈球菌屬種和假絲酵母屬種的微生物的存在和/或量的方法，該方法包括以下步驟a)用含有至少一對(duì)長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物的水溶液處理所述樣品，所述引物之一能夠與含有靶序列的所述微生物DNA的兩條互補(bǔ)鏈之一選擇性地雜交，并且所述引物的另一個(gè)能夠與所述鏈的另一條雜交，從而形成含有作為模板的靶序列的延伸產(chǎn)物，所述至少一對(duì)引物是針對(duì)所述微生物而相應(yīng)選自SEQ ID NO26、27、28、29、30、120、131至134、31、140至143、32至36、120至124中的核苷酸序列，其互補(bǔ)序列及其變體；b)合成各個(gè)所述引物的延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物含有靶序列，并在有所述靶序列時(shí)將其擴(kuò)增到可檢測(cè)的水平c)檢測(cè)所述試驗(yàn)樣品中所述擴(kuò)增靶序列的存在和/或量作為所述微生物的存在和/或量的指征。
11.權(quán)利要求10的方法，其中適用于檢測(cè)屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬種、奈瑟氏球菌屬種、葡萄球菌屬種和鏈球菌屬種的所述引物對(duì)分別由SEQ ID NO1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12、13和14，15和16、17至20、21和22限定。
12.直接從試驗(yàn)樣品或細(xì)菌培養(yǎng)物中檢測(cè)任何細(xì)菌的存在和/或量的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品或分離自該樣品中的基本均質(zhì)的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性載體上或者留在溶液中，或者將所述樣品或分離自該樣品的所述基本均質(zhì)的細(xì)菌群體接種在惰性載體上，并原位裂解所述接種樣品或分離的細(xì)菌以釋放細(xì)菌DNA，所述細(xì)菌DNA基本上制成單鏈形式；b)在探針的核酸能夠選擇性地與所述細(xì)菌DNA雜交的條件下，使所述單鏈DNA與所述探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，其中所述探針包括至少一種單鏈核酸，該單鏈核酸的核苷酸序列選自SEQ IDNO118、119、125至171，與之互補(bǔ)的序列、其長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的部分及其變體，并且能與任何細(xì)菌種類(lèi)的菌株或典型樣品特異并普遍適用地退火；和c)檢測(cè)所述惰性載體上或所述溶液中所述雜交復(fù)合物的存在作為所述試驗(yàn)樣品中任何細(xì)菌的存在和/或量之指征。
13.檢測(cè)試驗(yàn)樣品中任何細(xì)菌的存在和/或量的方法，該方法包括以下步驟a)用含有至少一對(duì)長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物的水溶液處理所述樣品，所述引物之一能夠與含有靶序列的任何細(xì)菌DNA的兩條互補(bǔ)鏈之一選擇性地雜交，并且所述引物的另一個(gè)能夠與所述鏈的另一條雜交，從而形成含有作為模板之靶序列的延伸產(chǎn)物，所述至少一對(duì)引物選自SEQ ID NO118、119、125至171內(nèi)的核苷酸序列、其互補(bǔ)序列和其變體b)合成各個(gè)所述引物的延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物含有靶序列，并在有所述靶序列時(shí)將其擴(kuò)增至可檢測(cè)水平；而且c)檢測(cè)所述已擴(kuò)增的靶序列的存在和/或量，作為所述樣品中任何細(xì)菌的存在和/或量的指征。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述引物對(duì)限定于SEQ ID NO 23和24中。
15.直接從試驗(yàn)樣品或細(xì)菌培養(yǎng)物中得到任何細(xì)菌的tuf序列的方法，其包括以下步驟a)用含有一對(duì)引物的水溶液處理所述樣品，所述引物具有從選自SEQ ID NO107和108、其至少有12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分、其互補(bǔ)序列及其變體的核苷酸序列中選出的序列，并且所述引物之一能夠與含有靶序列的所述細(xì)菌tuf基因的兩條互補(bǔ)鏈之一選擇性地雜交，而所述引物的另一個(gè)能夠與所述鏈的另一條雜交，從而形成含有作為模板之靶序列的延伸產(chǎn)物；b)合成各個(gè)所述引物的延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物含有靶序列，并在有所述靶序列時(shí)將其擴(kuò)增到可檢測(cè)水平，和c)檢測(cè)所述擴(kuò)增的靶序列的存在和/或量，以及d)使用任何DNA測(cè)序方法確定所述擴(kuò)增的靶序列的核苷酸序列。
16.直接從試驗(yàn)樣品或真菌培養(yǎng)物中檢測(cè)任何真菌的存在和/或量的方法，該方法包括以下步驟a)將樣品或分離自該樣品的基本均質(zhì)的真菌群體的真菌DNA沉積和固定在惰性載體上或者留在溶液中，或者將所述樣品或分離自該樣品的所述基本均質(zhì)的真菌群體接種在惰性載體上，并原位裂解所述接種樣品或分離的真菌以釋放真菌DNA，所述真菌DNA基本上制成單鏈形式；b)在探針的核酸能夠選擇性地與所述真菌DNA雜交的條件下，使所述單鏈DNA與所述探針接觸，從而形成雜交復(fù)合物，其中所述探針包含至少一種單鏈核苷酸序列，該核苷酸序列選自SEQ ID NO120至124，與之互補(bǔ)的序列、其長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的部分及其變體，并且能與任何真菌的菌株或代表特異并普遍地退火；和c)檢測(cè)所述惰性載體上或所述溶液中所述雜交復(fù)合物的存在作為所述試驗(yàn)樣品中任何真菌的存在和/或量之指征。
17.檢測(cè)試驗(yàn)樣品中任何真菌的存在和/或量的方法，該方法包括以下步驟a)用含有至少一對(duì)長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物的水溶液處理所述樣品，所述引物之一能夠與含有靶序列的任何真菌DNA的兩條互補(bǔ)鏈之一選擇性地雜交，并且所述引物的另一個(gè)能夠與所述鏈的另一條雜交，從而形成含有作為模板之靶序列的延伸產(chǎn)物，所述至少一對(duì)引物是從選自SEQ ID NO120至124內(nèi)、其互補(bǔ)序列和其變體的核苷酸序列中選出的；b)合成各個(gè)所述引物的延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物含有靶序列，并在有所述靶序列時(shí)將其擴(kuò)增至可檢測(cè)水平；和c)檢測(cè)所述擴(kuò)增之靶序列的存在和/或量作為所述樣品中任何真菌的存在和/或量的指征。
18.直接從試驗(yàn)樣品或真菌培養(yǎng)物中得到任何真菌的tuf序列的方法，其包括以下步驟a)用含有一對(duì)引物的水溶液處理所述樣品，所述引物具有從選自SEQ ID NO109和172、其至少有12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分、其互補(bǔ)序列及其變體的一種核苷酸序列中選出的序列，并且所述引物之一能夠與含有靶序列的所述真菌tuf基因的兩條互補(bǔ)鏈之一選擇性地雜交，而所述引物的另一個(gè)能夠與所述鏈的另一條雜交，從而形成含有作為模板之靶序列的延伸產(chǎn)物；b)合成各個(gè)所述引物的延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物含有靶序列，并在有所述靶序列時(shí)將其擴(kuò)增到可檢測(cè)水平，和c)檢測(cè)所述擴(kuò)增的靶序的存在和/或量，以及d)使用任何DNA測(cè)序方法確定所述擴(kuò)增的靶序列的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求1限定的方法，其包括直接從試驗(yàn)樣品或細(xì)菌培養(yǎng)物估計(jì)由選自blaoxa、blaZ、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、vanB、vanC的細(xì)菌抗生素抗性基因介導(dǎo)的細(xì)菌抗性的存在，該方法包括以下步驟a)將樣品或分離自該樣品中的基本均質(zhì)的細(xì)菌群體的細(xì)菌DNA沉積和固定在惰性載體上或者留在溶液中，或者將所述樣品或分離自該樣品的所述基本均質(zhì)的細(xì)菌群體接種在惰性載體上，并原位裂解所述接種樣品或分離的細(xì)菌以釋放細(xì)菌DNA，所述細(xì)菌DNA基本上制成單鏈形式；b)使所述單鏈DNA與探針接觸，所述探針包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO110、111、112、113、114、115、116、117、其互補(bǔ)序列及變體的長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸序列，它能夠與所述相應(yīng)細(xì)菌抗生素抗性基因特異雜交；并且c)檢測(cè)雜交復(fù)合物的存在，作為由所述細(xì)菌抗生素抗性基因之一介導(dǎo)的細(xì)菌抗性的指征。
20.權(quán)利要求1限定的方法，其包括直接從試驗(yàn)樣品或細(xì)菌培養(yǎng)物內(nèi)評(píng)估選自blaoxa、blaZ、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、vanB、vanC的細(xì)菌抗生素抗性基因介導(dǎo)的細(xì)菌抗性的存在情況，該方法包括以下步驟a)用含有至少1對(duì)長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的引物的水溶液處理所述樣品，所述引物之一能夠與含有靶序列之所述細(xì)菌抗生素抗性基因的兩條互補(bǔ)鏈之一選擇性地雜交，而所述引物的另一個(gè)能夠與所述鏈的另一條雜交，從而形成含有作為模板之靶序列的延伸產(chǎn)物，針對(duì)所述細(xì)菌抗生素抗性基因，所述至少1對(duì)引物是從SEQ ID NO110、111、112、113、114、115、116、117，其互補(bǔ)序列及其變體的核苷酸序列內(nèi)選出的；b)合成各個(gè)所述引物的延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物含有靶序列，并在有所述靶序列時(shí)將其擴(kuò)增至可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)所述擴(kuò)增的靶序列的存在和/或量，作為由所述細(xì)菌抗生素抗性基因之一介導(dǎo)的細(xì)菌抗性之指征。
21.權(quán)利要求1限定的方法，其包括直接從試驗(yàn)樣品或細(xì)菌培養(yǎng)物估計(jì)選自blatcm、blashv、blarob、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aac6′-IIa、aacA4、aad(6′)、vanA、vanB、vanC、msrA、satA、aac(6′)-aph(2″)、vat、vga、ermA、ermB、ermC、mecA、int和sul的細(xì)菌抗性基因的存在，該方法包括以下步驟a)用含有至少1對(duì)具有選自SEQ ID NO37至40、41至44、45至48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61至64、65和66、173和174、67至70、71至74、75和76、77至80、81和82、83至86、87和88、89和90、91和92、93和94、95和96、97和98、99至102、103至106、其長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的部分、其互補(bǔ)序列、其變體及其混合物之序列的引物的水溶液處理所述樣品，所述引物對(duì)之一能夠與含有靶序列的相應(yīng)細(xì)菌抗生素抗性基因的兩條互補(bǔ)鏈之一選擇性地雜交，而所述引物對(duì)的另一個(gè)能夠與所述鏈的另一條雜交，從而形成含有作為模板之靶序列的延伸產(chǎn)物；b)合成各個(gè)所述引物的延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物含有靶序列，并在有所述靶序列時(shí)將其擴(kuò)增到可檢測(cè)的水平；以及c)檢測(cè)所述擴(kuò)增的靶序列的存在和/或量，作為由所述細(xì)菌抗生素抗性基因之一介導(dǎo)的細(xì)菌抗性之指征。
22.具有SEQ ID NO26至36、110至117之一的核苷酸序列、其部分、其互補(bǔ)序列及其變體的一種核酸，當(dāng)其以單鏈形式存在時(shí)可作為探針或作為引物普遍適用地并特異地與靶細(xì)菌或真菌DNA雜交。
23.具有SEQ ID NO1至25、37至109和172至174之一的核苷酸序列、其部分、其互補(bǔ)序列及其變體的一種寡核苷酸，它可作為探針或作為引物普遍適用地并特異地與靶細(xì)菌或真菌DNA雜交。
24.含有如權(quán)利要求22中限定的核酸的重組質(zhì)粒。
25.已被權(quán)利要求24的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的重組體宿主。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的重組體宿主，其中所述宿主是大腸桿菌。
27.檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬種、奈瑟氏球菌屬種、葡萄球菌屬種、鏈球菌屬種和假絲酵母屬種的微生物種和/或?qū)僦魏谓M合的核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO26至36、120至124、131至134、140至143、其互補(bǔ)序列及其變體的長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的探針的任何適當(dāng)組合。
28.檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬種、奈瑟氏球菌屬種、葡萄球菌屬種、鏈球菌屬種和假絲酵母屬種的微生物種和/或?qū)僦魏谓M合的核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO26至36，120至124，131至134，140至143，其互補(bǔ)序列及其變體的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的引物的任何適當(dāng)組合。
29.檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬種、奈瑟氏球菌屬種、葡萄球菌屬種和鏈球菌屬種的微生物種和/或?qū)僦魏谓M合的核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO1至22、其長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的部分、其互補(bǔ)序列及其變體的引物的任何適當(dāng)組合。
30.檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自blaoxa、blaZ、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、vanC的細(xì)菌抗性基因的任何組合之核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO110至117、其互補(bǔ)序列及其變體的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的探針的任何適當(dāng)組合。
31.檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自blaoxa、blaZ、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、vanC的細(xì)菌抗性基因的任何組合之核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO110至117、其互補(bǔ)序列及其變體的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的引物的任何適當(dāng)組合。
32.檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自blatem、blashv、blarob、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aacA4、aac6′-IIa、aad(6′)、ermA、ermB、ermC、mecA、vanA、vanB、vanC、satA、aac(6′)-aph(2″)、vat、vga、msrA、int和sul的細(xì)菌抗性基因的任何組合之核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO370至106、173和174的引物，其具有至少為12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分，其互補(bǔ)序列及其變體的任何適當(dāng)組合。
33.檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌的核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO118至171，其互補(bǔ)序列及其變體的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的探針的任何組合。
34.檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌的核酸的診斷試劑盒，其包括選自SEQ ID NO118至171，其互補(bǔ)序列及其變體的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的引物的任何組合。
35.檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌的核酸的診斷試劑盒，其包括具有從SEQ ID NO23和24限定的核苷酸序列，其長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的部分，其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選擇出的序列的引物對(duì)。
36.如權(quán)利要求27中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從SEQID NO118至171的核苷酸序列，其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選擇的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的探針的任何組合，用以同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌之核酸。
37.如權(quán)利要求28中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從SEQID NO118至171的核苷酸序列，其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選出的長(zhǎng)度至少12個(gè)核苷酸的引物的任何適當(dāng)組合，用以同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌之核酸。
38.如權(quán)利要求29中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從SEQID NO23和24限定的核苷酸序列，其具有至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分，其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選擇的序列的引物對(duì)，用以同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌的核酸。
39.如權(quán)利要求27中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從SEQID NO110至117的核苷酸序列、其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選擇的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的探針的任何組合，用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自blaoxa、blaZ、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、vanB、vanC的任何細(xì)菌抗生素抗性基因的核酸。
40.如權(quán)利要求28中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從SEQID NO110至117的核苷酸序列、其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選擇的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的引物的任何適當(dāng)組合，用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自blaoxa、blaZ、aac6′-IIa、ermA、ermB、ermC、vanB、vanC的任何細(xì)菌抗生素抗性基因的核酸。
41.如權(quán)利要求30中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從SEQID NO37至106、173和174的核苷酸序列、其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選擇的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的引物的任何適當(dāng)組合，用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定選自blatem、blashv、blarob、blaoxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aacA4、aac6′-IIa、aad(6′)、ermA、ermB、ermC、mecA、vanA、vanB、vanC、satA、aac(6′)-aph(2″)、vat、vga、msrA、int和sul的任何細(xì)菌抗生素抗性基因的核酸。
42.如權(quán)利要求29中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從選自SEQ ID NO118至171，其互補(bǔ)序列及其變體的核苷酸序列內(nèi)選擇出的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的探針的任何組合，以同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌之核酸。
43.如權(quán)利要求31中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從選自SEQ ID NO118至171，其互補(bǔ)序列及其變體的核苷酸序列內(nèi)選擇出的長(zhǎng)度至少為12個(gè)核苷酸的引物的任何組合，以同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌之核酸。
44.如權(quán)利要求32中限定的的診斷試劑盒，其包括具有從選自SEQ ID NO23和24、其具有至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的部分、其互補(bǔ)序列及其變體的核苷酸序列內(nèi)選出的序列的一對(duì)引物，以用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌的核酸。
45.如權(quán)利要求39中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從選自SEQ ID NO118至171、其互補(bǔ)序列及其變體的核苷酸序列中選出的長(zhǎng)度至少12個(gè)核苷酸的探針的任何組合，以用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌的核酸。
46.如權(quán)利要求40中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括從選自SEQ ID NO118至171、其互補(bǔ)序列及其變體的核苷酸序列中選出的長(zhǎng)度至少12個(gè)核苷酸的引物的任何適當(dāng)組合，以用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌和/或真菌的核酸。
47.如權(quán)利要求41中限定的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括具有從選自SEQ ID NO23和24的核苷酸序列、其長(zhǎng)度至少有12個(gè)核苷酸的部分、其互補(bǔ)序列及其變體內(nèi)選出的序列的一對(duì)引物，以用于同時(shí)檢測(cè)和/或定量測(cè)定任何細(xì)菌的核酸。
全文摘要
公開(kāi)了基于DNA的、利用擴(kuò)增引物或探針檢測(cè)、鑒定和定量測(cè)定測(cè)試樣品中下述來(lái)源的DNA的方法:(i)任何細(xì)菌,(ii)無(wú)乳鏈球菌、腐生葡萄球菌、屎腸球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌和白假絲酵母,為(iii)鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、奈瑟氏球菌和假絲酵母各屬的任何種類(lèi)。也公開(kāi)了基于DNA的、利用擴(kuò)增引物或探針檢測(cè)、鑒定和定量測(cè)定測(cè)試樣品中選自下述的抗生素抗性基因的方法:bla
文檔編號(hào)C07K14/245GK1248295SQ97180194
公開(kāi)日2000年3月22日 申請(qǐng)日期1997年11月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月4日
發(fā)明者M·G·伯吉羅恩, F·J·皮卡德, M·奧萊特, P·H·羅伊 申請(qǐng)人:感染診斷(I.D.I)公司