專利名稱：在芽孢桿菌細胞的枯草菌脂肽突變體中生產(chǎn)多肽的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在一種芽孢桿菌細胞突變體中生產(chǎn)多肽的方法，獲取芽孢桿菌細胞突變體的方法及芽孢桿菌細胞突變體。
相關(guān)技術(shù)的說明枯草菌脂肽是一種環(huán)脂肽，具很好的表面活性劑性質(zhì)。該物質(zhì)主要由好多種芽孢桿菌在生長穩(wěn)定期產(chǎn)生(Carswell等，1994，應(yīng)用微生物學和生物技術(shù)41281-285；Lin等，1994，應(yīng)用和環(huán)境微生物學6031-38；Morikawa等，1992，發(fā)酵和生物工程雜志74255-261；Arima等，1968，生物化學生物物理研究交流31488-494)。該脂肽含七個氨基酸，L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu，其與3-羥基-13-甲基-十四酸通過一個酰胺鍵(脂肪酸的羧基與谷氨酸的氨基之間)和一個酯鍵(末端亮氨酸的羧基與脂肪酸的羥基之間)相連接。已經(jīng)知道脂鏈長為13，14和15個碳原子的同源系列(Hosono和Suzuki，1983，抗生素雜志36667-673；Razafindralambo等，1993，層析雜志63981-85)，以及在第七或第四位氨基酸不同的分別叫做[Val7]-，[Ile7]-和[Ala4]-枯草菌脂肽的同種型(Peypoux等，1994，歐洲生化雜志22489-96；Baugmart等，1991，生物化學生物物理研究交流177998-1005)。
據(jù)報道，由srf操縱子編碼的一種多酶復合物負責枯草菌脂肽的通過所謂的硫模板機制的非核糖體生物合成。該操縱子含有至少四個基因srfA，srfB，srfC和srfD。這四個基因以前分別叫做srfAA，srfAB，srfAC和srfAD。srfA，srfB和srfC編碼枯草菌脂肽的合成酶亞單位，每個亞單位均包含有1個或多個氨基酸激活結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ诩せ羁莶菥牡牡孜锇被嵋援a(chǎn)生枯草菌脂肽是必需的(van Sinderen等，1993，分子微生物學8833-841；Nakano和Zuber，1989，細菌學雜志8821-831Cosmina等，1993，分子微生物學8821-831)。該多酶復合物組合成七個大的結(jié)構(gòu)域，它們?nèi)杭谌齻€分開的蛋白質(zhì)上(Menkhaus等，1993，生物化學雜志 2687678-7684；Gulli等，Biochimica et Biophysica Acta 120519-28)。該七個結(jié)構(gòu)域負責激活并結(jié)合枯草菌脂肽的七個氨基酸。根據(jù)硫模板機制，特定氨基酸的腺苷化和結(jié)合發(fā)生在相應(yīng)的氨基酸激活區(qū)，這一過程需輔因子4-磷酸泛酰巰基乙胺。隨后的反式硫脂化反應(yīng)逐步延長肽鏈，序列順序由諸多酶亞單位的空間排列所決定。目前尚不清楚脂肪酸部分是何時及怎樣連接到肽鏈上的，也不清楚酯鍵是怎樣形成，進而使得分子變成環(huán)形的。而且，基因sfp也被認為參與枯草菌脂肽的表達(分泌)(Nakano等，1992，分子普通遺傳學232313-323)。
芽孢桿菌是已經(jīng)良好建立的、用于生產(chǎn)天然和重組蛋白質(zhì)的宿主細胞系統(tǒng)。但是，具有所期望的蛋白質(zhì)表達和分泌增多特性的芽孢桿菌宿主并不一定就具備成功發(fā)酵所期待的特性。特別是，由于伴隨著生物量的增加，泡沫會相應(yīng)增加，因而發(fā)酵可能并非最好。起泡增加限制了發(fā)酵的生產(chǎn)力。
因而本發(fā)明的一個目的就是提供改進的芽孢桿菌宿主，其既具有表達商業(yè)量蛋白質(zhì)的能力，又有如意的發(fā)酵特性，諸如生長較快長和起泡較少，因而增強了發(fā)酵生產(chǎn)力。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括(a)在有利于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌細胞的突變體，其中，(i)該突變體包括兩種核酸序列，其中第一種核酸序列編碼多肽，第二種核酸序列包含負責枯草菌脂肽或其同種型的生物合成或分泌的至少一個基因的修飾，(ii)在同等條件下培養(yǎng)時，該突變體生產(chǎn)的枯草菌脂肽或其同種型比芽孢桿菌細胞低；和(b)從培養(yǎng)液中分離多肽。
本發(fā)明也涉及芽孢桿菌細胞的突變體及生產(chǎn)芽孢桿菌細胞突變體的方法。
附圖簡述

圖1表示pShv2的限制酶切圖譜。
圖2表示pSJ3200的限制酶切圖譜。
圖3表示pSJ2662的限制酶切圖譜。
圖4表示pSJ2882-MCS中amyQ啟動子-amyM基因融合體的構(gòu)建。
圖5表示pPL2419的限制酶切圖譜。
圖6表示pCAsub2的限制酶切圖譜。
圖7表示pBAN-NOV的限制酶切圖譜。
圖8表示pPL2541-tet的限制酶切圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括(a)在有利于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌細胞的突變體，其中，(i)該突變體涉及負責枯草菌脂肽或其同種型的生物合成或分泌的至少一個基因發(fā)生修飾(如破壞)的芽孢桿菌細胞，(ii)在同等條件下培養(yǎng)時，該突變體生產(chǎn)的枯草菌脂肽或其同種型比芽孢桿菌細胞少；和(b)從培養(yǎng)液中分離多肽。
術(shù)語“枯草菌脂肽”此處定義為一種環(huán)形脂肽，其中氨基酸序列L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu與鏈長為13至15個碳原子的直鏈或支鏈b-羥基脂肪酸相連。術(shù)語“同種型”此處定義為枯草菌脂肽的變體，其內(nèi)一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基所替換，例如[Val7]-，[Ile7]-和[Ala4]-枯草菌脂肽。
本發(fā)明方法中，芽孢桿菌細胞可以是野生型芽孢桿菌細胞或其突變體。本發(fā)明實施方案中可用的芽孢桿菌細胞包括但不局限于嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，短芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，堅強芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，短小芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的細胞。在優(yōu)選的實施方案中，該芽孢桿菌細胞是解淀粉芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在更優(yōu)選的實施方案中，該芽孢桿菌細胞是枯草芽孢桿菌ATCC 6051或6051A，或者枯草芽孢桿菌NCFB736(原來叫NCDO736)。
可以運用本領(lǐng)域熟知的插入或缺失方法，通過減少或消除負責枯草菌脂肽或其同種型生物合成或分泌的一個或多個基因，構(gòu)建成芽孢桿菌細胞突變體。例如，向其中一個基因中插入含有與該基因同源之核酸片段的整合質(zhì)粒，使這一同源區(qū)域產(chǎn)生重復，并將載體DNA插入到重復區(qū)之間，這樣，可以破壞該基因。如果插入的載體DNA將基因啟動子和編碼區(qū)隔開或者打斷了編碼區(qū)，導致產(chǎn)生非功能性基因產(chǎn)物，則能夠消除基因表達。另外，也可對負責枯草菌脂肽或其同種型的生物合成或分泌的一個或多個基因表達有利或必需的一個或多個控制序列(如啟動子)進行修飾?；蛘?，基因表達的減少或消除也可通過基因轉(zhuǎn)變方法(參看，如Iglesias和Trautner，1983，分子普通遺傳學18973-76)或通過基因置換方法。在后一方法中，將該基因的突變形式引入到不復制的或溫度敏感的質(zhì)粒中，該質(zhì)粒連有選擇標記。在不讓質(zhì)粒復制的條件下，通過對標記的選擇即可完成對質(zhì)粒整合的選擇。通過檢查菌落中選擇標記的喪失和突變基因的獲得即可對產(chǎn)生基因置換的第二次重組進行選擇(參看，如Perego，1993，A.L.Sonneshein，J.A.，Hoch和R.Losick編寫，枯草芽孢桿菌和其它革蘭氏陽性細菌，42章，美國微生物學學會，Washington，D.C.，1993)。再有，減小或消除負責枯草菌脂肽生物合成或分泌的一個或多個基因的表達還可運用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法通過隨機誘變來實現(xiàn)，這些方法包括，但不局限于轉(zhuǎn)座和化學誘變。
也可以構(gòu)建芽孢桿菌細胞突變體，以生產(chǎn)枯草菌脂肽的變體或同種型。變體或同種型與從天然來源中分離的該肽之間的區(qū)別在于變體不起泡，或具有減低的表面活性劑特點。對負責枯草菌脂肽生物合成的一個或多個基因的核酸序列的修飾可以通過本領(lǐng)域熟知的方法來實現(xiàn)，例如，替換結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)以構(gòu)建編碼氨基酸特異性有所改變的肽合成酶的雜合基因，并產(chǎn)生具修飾過的氨基酸序列的肽(參看，如Stachelhaus等，1995，科學26960-72)。在本發(fā)明中更進一步地，氨基酸的替換可以產(chǎn)生枯草菌脂肽陰性表型，如用丙氨酸替換絲氨酸(D’Souza等，1993，細菌學雜志，1753502-3510；Vollenbroich等，1993，F(xiàn)EBS Letter325220-224；Stachelhaus等，1995，同前)?？梢曰谪撠熆莶菥纳锖铣傻闹T基因的核酸序列，通過引入會產(chǎn)生不同氨基酸序列而非天然枯草菌脂肽分子氨基酸序列的核苷酸替換而構(gòu)建類似的核酸序列。核酸替換的一般闡述參看如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達和純化295-107。
本領(lǐng)域技術(shù)人員均顯然知道，這種替換可以發(fā)生在對分子功能很重要的區(qū)域內(nèi)或區(qū)域外。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法可以確認那些對該肽的表面活性劑性質(zhì)很重要的氨基酸殘基，這種方法例如是定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參看，如Cunningham和Wells，1989，科學2441081-1085)。在后一技術(shù)中，在該分子的每一個殘基處引入突變，檢測所得突變分子的表面活性劑活性，以確認對該分子的活性很重要的氨基酸殘基。
在本發(fā)明所述的方法中，可對芽孢桿菌細胞內(nèi)負責枯草菌脂肽或其同種型生物合成或分泌的任何基因進行修飾。例如，修飾的基因可以是srf操縱子中的任何基因，如srfA，srfB，srfC和srfD。或者，可以修飾基因sfp。
更進一步，本發(fā)明中可以修飾負責將脂肪酸部分連接到該肽上，或負責形成酯鍵以生成環(huán)形分子的基因，以得到不具有起泡特性的芽孢桿菌突變體細胞。
再更進一步，本發(fā)明中，芽孢桿菌細胞的突變體還可以含可能對多肽的生產(chǎn)，回收或應(yīng)用有害的其它基因的缺失或插入。例如，在優(yōu)選的實施方案中，該芽孢桿菌細胞可以是蛋白質(zhì)酶缺失的細胞。在另一優(yōu)選的實施方案中，該芽孢桿菌細胞不產(chǎn)生芽孢，如由于spoIIAC的缺失。也可缺失對多肽的生產(chǎn)、回收或應(yīng)用有害的其它基因，如amyE基因。
本發(fā)明所述方法中，本發(fā)明的突變體在有利于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)時，具有不起泡或減低起泡的特性。本發(fā)明的芽孢桿菌細胞突變體生產(chǎn)的枯草菌脂肽的量可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來確定(參看，如Ohno等，1995，生物技術(shù)和生物工程學47209-214和Grossman等，1993，細菌學雜志1756203-6211)。在同等生產(chǎn)條件下，優(yōu)選突變體細胞比相應(yīng)的親本芽孢桿菌細胞的枯草菌脂肽產(chǎn)量至少低約25％，更優(yōu)選至少低約50％，還要更優(yōu)選至少低約75％，最優(yōu)選至少低約95％。在同等生產(chǎn)條件下，比起相應(yīng)的親本芽孢桿菌細胞，優(yōu)選突變體細胞的多肽產(chǎn)量至少多約25％，更優(yōu)選至少多約50％，還要更優(yōu)選至少多約75％，最優(yōu)選至少多約95％。
運用本領(lǐng)域熟知的方法，在適合多肽生產(chǎn)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以在適合多肽表達或/和分離的條件下，在合適的培養(yǎng)基中，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的少量或大量發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵，分批發(fā)酵，補料分批發(fā)酵，或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)是在含有碳源，氮源和無機鹽的合適培養(yǎng)基中，通過本領(lǐng)域熟知的方法進行的。合適培養(yǎng)基可購自商業(yè)供應(yīng)商，也可根據(jù)已發(fā)表的組合物配制(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。分泌的多肽可直接從培養(yǎng)基中回收。
運用本領(lǐng)域熟知的專門檢測多肽的方法可檢測到多肽。這些檢測方法可包括運用特異的抗體，形成酶產(chǎn)物，酶底物的消失，或SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。例如，可用酶測定來確定多肽活性。許多酶的酶活性測定方法為本領(lǐng)域所熟知。
產(chǎn)生的多肽可用本領(lǐng)域熟知的方法來分離。如，可用常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中分離多肽，這些方法包括但不局限于離心，過濾，提取，噴霧射干燥，蒸發(fā)，或沉淀。運用各種層析方法可對分離得到的多肽進一步純化，如離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析等。
可用本領(lǐng)域熟知的許多方法純化多肽，這些方法包括但不局限于層析方法(如離子交換層析，親和層析，疏水層析，層析聚焦，和大小排阻層析)，電泳方法(如制備性等電聚焦(IEF))，差異溶解性(如硫酸銨沉淀)，或者提取(參看，如《蛋白質(zhì)純化》，J.-C.Janson和LarsRyden編著，VCH Publishers，紐約，1989)。
所述多肽可以是任何多肽。此外，該多肽可以是芽孢桿菌細胞的天然或異源多肽。術(shù)語“多肽”在這里并不是指特定長度的編碼產(chǎn)物，因而包含肽，寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語“多肽”也包括組合在一起形成編碼產(chǎn)物的兩種或多種多肽。術(shù)語“多肽”也包括雜合多肽，其包含得自至少兩種不同多肽的部分或全部多肽序列的組合，所述至少兩種不同多肽中的一種或多種可能是芽孢桿菌細胞的異源多肽。多肽還包括前述多肽和雜合多肽的天然等位基因變體或工程化變體。
優(yōu)選地，該多肽是激素，激素變體，酶，受體或其部分，抗體或其部分，或報道分子。在更優(yōu)選的實施方案中，該多肽是氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂解酶，異構(gòu)酶，或連接酶。在更優(yōu)選的實施方案中，該多肽是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，過氧化氫酶，纖維素酶，殼多糖酶，角質(zhì)化酶，環(huán)狀糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，脫氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂酶，甘露糖苷酶，齒斑葡聚糖酶(mutanase)，氧化酶，果膠分解酶，過氧化物酶，肌醇六磷酸酶，多酚氧化酶，蛋白質(zhì)水解酶，核糖核酸酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase)或木聚糖酶。
在本發(fā)明方法中，所述芽孢桿菌細胞突變體可以是重組細胞，其中包含編碼異源多肽的核酸序列，該細胞可有利地用于多肽的重組生產(chǎn)中。優(yōu)選向細胞中轉(zhuǎn)入包含有編碼該異源多肽之核酸序列的載體，然后整合該載體到染色體中?！稗D(zhuǎn)化”意指向宿主細胞中引入含有第二種核酸序列的載體，使得該載體作為染色體的整合體或能自我復制的染色體外載體而維持。整合通常被認為更有利，因為這種情況下，該核酸序列更有可能在細胞內(nèi)穩(wěn)定維持。通過同源重組，非同源重組或轉(zhuǎn)座，載體整合到染色體中。
編碼異源多肽的核酸序列可得自原核，真核或其它來源，如古細菌。本發(fā)明中，就一指定來源所用的術(shù)語“得自”是指該多肽是由該來源產(chǎn)生的，或由已插入了來自該來源的基因的細胞產(chǎn)生的。
在本發(fā)明方法中，芽孢桿菌細胞突變體也可用于芽孢桿菌細胞天然多肽的重組生產(chǎn)中。天然多肽可通過以下方法重組生產(chǎn)，如將編碼該多肽的基因置于不同的啟動子控制下，以增加該多肽的表達，利用信號序列使目的天然多肽輸出到細胞外，及增加編碼芽孢桿菌正常生產(chǎn)之多肽的基因的拷貝數(shù)。在術(shù)語“異源多肽”的適用范圍內(nèi)，本發(fā)明也包括同源多肽的重組生產(chǎn)，其中這種表達涉及非該芽孢桿菌天然的遺傳因子的使用，或已被加工而以宿主細胞中非常見方式發(fā)揮作用的天然元件的使用。
用于分離或克隆編碼異源多肽的核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，包括自基因組DNA中的分離，自cDNA中的制備，或其組合。從這種基因組DNA中克隆核酸序列可運用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來完成。參看，如Innis等，1990，PCR方案方法和應(yīng)用指導手冊，AcademicPress，New York?？寺》椒梢陨婕鞍ň幋a多肽的核酸序列的所需核酸片段的切割和分離，將該片段插入到載體分子中，和將該重組載體摻入到芽孢桿菌細胞內(nèi)，其中該核酸序列的多拷貝或克隆將得到復制。該核酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成的，合成的，或其任意組合。
本發(fā)明所述的方法中，異源多肽也可包括融合多肽，其中另一多肽與所述多肽或其片段在N-末端或C-末端相融合。可通過將編碼一種多肽的核酸序列(或其部分)與編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)融合而產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，包括連接編碼諸多肽的編碼序列，以使它們讀框一致，并且融合多肽的表達受相同啟動子或終止子所控制。
“核酸構(gòu)建體”在此處定義為一種單鏈或雙鏈的核酸分子，它分離自天然存在的基因，或已被修飾而含有幾個核酸片段，這些片段以天然并不存在的方式組合和合并在一起。當核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明編碼序列表達所需的所有控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”可能與術(shù)語表達盒同義。這兒定義的“編碼序列”是指置于前述控制序列的控制下能轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為本發(fā)明多肽的序列。編碼序列的邊界一般由5’-端的翻譯起始密碼子ATG和3’-端的翻譯終止密碼子所確定。編碼序列可以包括但不局限于DNA，cDNA和重組核酸序列。
分離得到的編碼多肽的核酸序列可用多種方法來加工，以使其表達多肽。根據(jù)表達載體的不同，在將核酸序列插入到載體內(nèi)之前對其進行操作可能會是期望的或必要的。運用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
包括編碼多肽之核酸序列的核酸構(gòu)建體可有效地與一個或多個控制序列連接，所述控制序列能在與其相容的條件下指導編碼序列在芽孢桿菌細胞突變體中的表達。
在此定義的術(shù)語“控制序列”包括對核酸序列中編碼序列的表達必需或有利的所有組分。每個控制序列都可以是編碼多肽之核酸序列的天然或外源序列。這些控制序列包括但不局限于前導序列，啟動子，信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度控制序列包括啟動子，轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。控制序列中還可加入接頭，以引入特定限制酶切位點，便于控制序列與編碼多肽之核酸序列的編碼區(qū)間的連接。
控制序列可以是合適的啟動子序列，即可被芽孢桿菌細胞識別以表達所述核酸序列的一種核酸序列。啟動子序列含有轉(zhuǎn)錄控制序列，可介導多肽表達。啟動子可以是在所選芽孢桿菌細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任一核酸序列，可以得自編碼與芽孢桿菌細胞同源或異源的細胞內(nèi)或細胞外多肽的基因。能指導本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄(特別是在芽孢桿菌細胞內(nèi))的合適啟動子的例子是來源于以下的啟動子大腸桿菌lac操縱子，天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢桿菌左聚蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)，嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美國國家科學院學報753727-3731)，及tac啟動子(DeBoer等，1983，美國國家科學院學報8021-25)。更多的啟動區(qū)在下面文章中有描述“來源于重組細菌的有用蛋白質(zhì)”，科學美國人，1980，24274-94；和Sambrook等，1989，出處同前。
控制序列也可以是一段合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即可被芽孢桿菌細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列有效地連接到編碼多肽的核酸序列的3’末端。在所選芽孢桿菌細胞中有功能的任何終止子均可用于本發(fā)明中。
控制序列也可以是一段合適的前導序列，即mRNA中對芽孢桿菌細胞翻譯很重要的非翻譯區(qū)。前導序列有效地連接到編碼多肽的核酸序列的5’末端。在所選芽孢桿菌細胞中有功能的任何前導序列均可用于本發(fā)明中。
控制序列也可以是一段信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基端相連接的氨基酸序列，能指導表達多肽進入細胞的分泌途徑。信號肽編碼區(qū)可以是本發(fā)明多肽的天然區(qū)域，也可來源于外源。核酸序列編碼序列的5’末端自身可含有一段信號肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)與編碼分泌多肽的編碼區(qū)部分翻譯讀框一致地天然相連?；蛘?，編碼序列的5’末端自身可含有異源于編碼分泌多肽之編碼序列部分的信號肽編碼區(qū)。編碼序列正常不含有信號肽編碼區(qū)時可能需要外源信號肽編碼區(qū)?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可簡單地替換掉天然的信號肽編碼區(qū)，目的在于與編碼序列通常相關(guān)的天然信號肽編碼區(qū)相比，能更加增強多肽的分泌。信號肽編碼區(qū)可得自芽孢桿菌的淀粉酶或蛋白酶基因。但是，任何能夠指導表達多肽進入所選芽孢桿菌細胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。
在芽孢桿菌細胞中有效的信號肽編碼區(qū)是來源于以下基因的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌NCIB 11837的麥芽糖源淀粉酶基因，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因，地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因，地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因，嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)，和枯草芽孢桿菌prsA基因。更多的信號肽描述可見Simonen和Palva，1993，微生物學評論57109-137。
本發(fā)明所述方法中，包含核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達載體可用于多肽的重組生產(chǎn)。上面所述的各種核酸序列和控制序列可結(jié)合使用以生產(chǎn)重組表達載體，該載體可含一個或多個方便的限制酶切位點，使得可以在這些位點插入或替換編碼多肽的核酸序列。或者，可將核酸序列或含該序列的核酸構(gòu)建體插入到合適的表達載體中而表達該核酸序列。構(gòu)建表達載體時，將編碼序列置于載體中，使編碼序列有效地與用于表達和分泌(可能的話)的合適控制序列相連接。
重組表達載體可以是能方便地進行重組DNA操作和使核酸序列表達的任何載體。載體的選擇通常取決于載體與將導入載體的芽孢桿菌細胞間的相容性。載體可以是線形或閉環(huán)質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，也就是能作為染色體外實體存在、其復制不依賴于染色體復制的載體，如質(zhì)粒，染色體外元件，微型染色體，或人工染色體。載體可含有任何確保自我復制的成分?；蛘?，載體可以是當引入芽孢桿菌細胞時能整合到基因組中，并與其整合入的染色體一同復制的載體。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，也可以是合在一起含有要引入到芽孢桿菌細胞基因組內(nèi)的完整DNA兩個或多個載體或質(zhì)粒，或者是轉(zhuǎn)座子。
當引入到芽孢桿菌細胞時，載體可能會整合到芽孢桿菌細胞基因組中。為了進行整合，載體可能會依賴于編碼多肽的核酸序列或載體的其它元件，以使載體通過同源重組穩(wěn)定地整合到基因組中?；蛘撸d體可能含有額外的核酸序列，以指導其通過同源重組整合到芽孢桿菌細胞的基因組中。額外的核酸序列使得載體能在染色體的準確位置處整合到芽孢桿菌細胞基因組中。為提高在準確位置整合的可能性，整合成分優(yōu)選應(yīng)含足夠數(shù)目的核酸，如100至1500bp，優(yōu)選是400至1500bp，最優(yōu)選是800至1500bp，并且與相應(yīng)的目標序列高度同源，以增加同源重組的概率。整合成分可以是與芽孢桿菌細胞基因組中目標序列同源的任何序列。此外，整合成分可以是編碼或不編碼的核酸序列。
為了進行自主復制，載體還可以包括一個復制起點，以使載體能在研究的芽孢桿菌細胞中自主復制。細菌復制起點的例子是能在大腸桿菌內(nèi)復制的質(zhì)粒pBR322，pUC19，pACYC177和pACYC184的復制起點，和能在芽孢桿菌內(nèi)復制的pUB110，pE194，pTA1060和pAMβ1的復制起點。復制起點可以含能使其功能在芽孢桿菌細胞內(nèi)成為溫度敏感型的突變(參看，如Ehrlich，1978，美國國家科學院學報751433)。
超過一個拷貝的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列可以被插入到芽孢桿菌細胞中，以增加該核酸序列的表達。穩(wěn)定地擴增核酸序列可以通過運用本領(lǐng)域熟知的方法將該序列至少一個額外的拷貝整合到芽孢桿菌細胞基因組內(nèi)和選擇轉(zhuǎn)化體來達到達到擴增基因組DNA序列的一個方便方法在WO94/14968中有闡述。
載體優(yōu)選含有一個或多個可選擇性標記，以便方便地選擇轉(zhuǎn)化細胞?？蛇x擇性標記是一個基因，其產(chǎn)物具有殺生物劑抗性，重金屬抗性，為營養(yǎng)缺陷體提供原養(yǎng)型，等等。細菌可選擇性標記的例子是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性，如青霉素抗性，卡那霉素抗性，紅霉素抗性，氯霉素抗性，或四環(huán)素抗性的標記。此外，可以運用共轉(zhuǎn)化來達到選擇目的，如像在WO91/09129中闡述的一樣，其中可選擇性標記位于另一分開的載體上。
前面所述的連接各個成分以構(gòu)建本發(fā)明重組表達載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參看，如Sambrook等，1989，同前)。
芽孢桿菌細胞的轉(zhuǎn)化可通過多種方法進行，例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，如Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學168111-115)，利用感受態(tài)細胞(參見，如Young和Spizizin，1961，細菌學雜志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學雜志56209-221)，電穿孔(參見，如Shigekawa和Dower，1988，生物技術(shù)6742-751)，或者接合(參見，如Shigekawa和Thorne，1987，細菌學雜志1695271-5278)。
本發(fā)明由下面的實施例中更進一步闡述，但這些實施例不應(yīng)被解釋成是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例所有引物和寡聚物均在應(yīng)用生物系統(tǒng)模型394合成儀(AppliedBiosystems Inc.Foster City，C.A.)，根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明所合成。實施例1枯草芽孢桿菌供體菌株BW154的構(gòu)建這里所述枯草芽孢桿菌宿主菌株A164(ATCC6051A)和1630(NCFB736)中均有數(shù)個基因(spoIIAC，aprE，nprE，amyE，和srfC)被缺失。為了完成這個任務(wù)，利用pLS20介導的接合系統(tǒng)(Koehler和Thorn，1987，見前)，向這些菌株中導入了含有這些基因的缺失形式的質(zhì)粒。簡要地說，這個系統(tǒng)包括一個含有大質(zhì)粒pLS20的枯草芽孢桿菌“供體”菌株。pLS20編碼將pLS20遷移至枯草芽孢桿菌受體菌株所必需的功能。此外，已知質(zhì)粒諸如pUB110和pBC16也可由這個接合系統(tǒng)(在pLS20存在下)進行遷移。這些質(zhì)粒含有順式作用區(qū)(oriT)和編碼作用于oriT位點并推動這些質(zhì)粒向受體菌株轉(zhuǎn)移的反式作用功能的基因(orf-beta)。如果供體菌株含有pLS20以及pUB110和pBC16二者中的任一種，則僅含有oriT的質(zhì)粒也能被遷移(這時，orf-beta功能由反式提供)。
有效的供體菌株必須含有質(zhì)粒pLS20或其衍生質(zhì)粒如pXO503(Koehler和Thorne，1987，見前)。此外，也希望在接合完成之后有反篩選供體菌株的方法。已經(jīng)發(fā)展了一種非?！案蓛簟?無背景)且易于實施的反篩選方案。這涉及在供體菌株的dal基因(編碼細胞壁合成所需的D-丙氨酸消旋酶)中導入缺失以及將接合實驗后所得細胞混合物涂板于丙氨酸缺失的固體培養(yǎng)基上而對供體菌株進行篩選(枯草芽孢桿菌dal-菌株只能在添加了外源丙氨酸的培養(yǎng)基中才能生長)。
為了缺失上面所提到的基因，必須將含有這些基因的缺失形式的pE194復制子(紅霉素抗性)(Gryczan等，1982，《細菌學雜志》152722-735)和oriT序列轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌A164和A1630菌株中。合適的供體菌株應(yīng)有以下特征1)dal基因已缺失(為了進行反篩選)，和2)它還必須含有質(zhì)粒pLS20(此時pXO503不適用，因為pE194復制子必須通過紅霉素篩選保持，而pXO503已賦予對紅霉素的抗性)，以及pUB110或pBC16以反式提供orf-beta功能。有關(guān)枯草芽孢桿菌BW154如何構(gòu)建成為供體菌株的敘述如下。(A)在枯草芽孢桿菌中導入dal缺失突變，得到枯草芽孢桿菌BW96。
首先，選擇bac-1基因內(nèi)有突變的枯草芽孢桿菌菌株(該基因突變使得菌株失去了合成二肽抗生素桿菌溶素的能力)，因為前面已述，在接合過程中，野生型枯草芽孢桿菌細胞會殺死其他種芽孢桿菌，而bac-1-細胞中這種潛在的殺傷力則大大降低。因此，所有供體菌株均是在bac-1背景下構(gòu)建的。
構(gòu)建合適供體菌株的第一步為缺失背景為bac-1的枯草芽孢桿菌菌株1A758(Bacillus Stock Center，哥倫比亞，俄亥俄州)中dal基因的部分。體外構(gòu)建了能夠替換細菌染色體上野生型dal基因的dal基因缺失形式。利用PCR擴增得到dal基因的5’和3’部分，引物1和2用來擴增該基因的5’部分(核苷酸19-419，ATG密碼子的A是+1位)，引物3和4用來擴增該基因的3’部分(核苷酸618-1037)。引物15’-GAGCTCACAGAGATACGTGGGC-3’(SEQ ID NO1)引物25’-GGATCCACACCAAGTCTGTTCAT-3’(SEQ IDNO2)(劃線部分為BamHI位點)引物35’-GGATCCGCTGGACTCCGGCTG-3’(SEQ ID NO3)(劃線部分為BamHI位點)引物45’-AAGCTTATCTCATCCATGGAAA-3’(SEQ ID NO4)(劃線部分為HindIII位點)擴增反應(yīng)(100μl)含有以下組分200ng枯草芽孢桿菌168染色體DNA，每一引物濃度均為0.5μM，dATP、dCTP、dGTP、dTTP濃度各為200μM，1×Taq聚合酶緩沖液，以及1U Taq DNA聚合酶。依照Pitcher等，1989，應(yīng)用微生物學通訊8151-156所述方法得到枯草芽孢桿菌168的染色體DNA。反應(yīng)條件如下95℃ 3分鐘，然后再進行30個循環(huán)，每個循環(huán)程序為95℃ 1分鐘、50℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘，最后為72℃ 5分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)生產(chǎn)商的操作指示，利用TA克隆試劑盒(Invitrogen，圣地亞哥，加州)將5’和3’PCR產(chǎn)物克隆至pCRII載體中。鑒定出含有dal基因5’端一半且由PCR引物導入的BamHI位點與pCRII載體多接頭的BamHI位點相鄰的pCRII克隆(另一方向的克隆中BamHI位點間相距要遠得多)。然后用BamHI和HindIII消化含有dal基因3’端一半的pCRII克隆，再將該dal基因片段克隆至前述含有dal基因5’端一半的pCRII克隆的BamHI-HindIII位點，這樣所產(chǎn)生的pCRII載體含有中部缺失了約200bp的dal基因，在該基因的5’末端有一NotI位點(pCRII多接頭的部分)，3’末端為HindIII位點。
為了將該dal缺失導入細菌染色體，將該缺失基因克隆至枯草芽孢桿菌溫度敏感型復制子pE194(Gryczan等，1982，見前)中。然后經(jīng)兩步將該缺失dal基因?qū)肴旧w中首先通過同源重組將此質(zhì)粒整合到染色體dal位點，接著再除去質(zhì)粒(還是通過同源重組)，使得dal基因的缺失形式仍保留在細菌染色體上。這可通過下列步驟完成將該缺失dal基因片段(如上述)克隆至溫度敏感型質(zhì)粒pSK+/pE194的NotI-HindIII位點(實質(zhì)上是用dalΔ片段替代pSK+載體序列)。質(zhì)粒pSK+/pE194的構(gòu)建方法如下用XbaI酶切消化BluescriptSK+(Stratagene，La Jolla，CA)和pE 194，然后用小牛腸堿性磷酸酶處理pSK+載體，再將兩質(zhì)粒連接起來。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，轉(zhuǎn)化體在含氨芐青霉素(100μg/ml)和X-gal的LB培養(yǎng)基上進行篩選。從數(shù)個“白色”菌落中純化出質(zhì)粒，利用限制酶切消化并隨后凝膠電泳鑒定出含有pE194和pSK+的嵌合體。用HindIII和NotI消化該質(zhì)粒。然后凝膠純化含有pE194復制子的片段，并將其連至同樣經(jīng)凝膠純化的dalΔ基因片段(HindIII-NotI)上。連接產(chǎn)物被用來轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌bac-1菌株1A758(Bacillus Stock Center，哥倫Columbus，OH)，并在含紅霉素(5mg/ml)的胰蛋白胨血瓊脂堿(TBAB)平板中選擇轉(zhuǎn)化體，在許可溫度34℃下進行培養(yǎng)。從5個紅霉素抗性轉(zhuǎn)化體中純化出質(zhì)粒，并經(jīng)限制酶切消化/凝膠電泳分析。鑒定出對應(yīng)于含有dal缺失片段的pE194的質(zhì)粒。帶有這個質(zhì)粒的菌株隨后被用來通過同源重組向染色體中導入dal缺失。
為了獲得首次交換(dal缺失質(zhì)粒整合到染色體上的dal基因內(nèi))，將轉(zhuǎn)化菌株在含有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的TBAB平板上劃線，在非許可溫度45℃下生長過夜。取一大菌落再次于相同條件下進行劃線，得到染色體上的dal基因內(nèi)整合有溫度敏感型質(zhì)粒的細胞的均一群體。在非許可溫度下，由于質(zhì)粒不能復制，因此只有在染色體上含有該質(zhì)粒的細胞才能在紅霉素平板上生長。為了獲得第二次交換事件(導致質(zhì)粒從染色體上切出，只留下dal基因的缺失形式)，將一環(huán)細胞轉(zhuǎn)移至20ml含D-丙氨酸(0.1mg/ml)的Luria培養(yǎng)液中，在許可溫度34℃下進行無選擇生長至對數(shù)后期，以使得復制起點保持功能，并發(fā)生第二次交換事件。細胞再轉(zhuǎn)移四次(每次轉(zhuǎn)移稀釋100倍)，以使得質(zhì)粒從染色體上切除并從群體中分離出來。最后，細胞在34℃下涂板于添加有D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板上以生長出單菌落，并將菌落印跡轉(zhuǎn)移至無D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板上和有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的TBAB平板上，以便對dal-和erms菌落計數(shù)。50個菌落中有2個具有這種表型。將所得菌株命名為枯草芽孢桿菌BW96，這是一種bac-1，dal-菌株。(B)將pLS20和pBC16導入枯草芽孢桿菌bac-1、dal缺失菌株，得到接合有效供體菌株枯草芽孢桿菌BW154。
選擇一種供體菌株，用于向枯草芽孢桿菌BW96中導入pLS20和pBC16質(zhì)粒，該供體菌株應(yīng)具有以下特征本身為紅霉素敏感型的含有pLS20和pBC16的枯草芽孢桿菌菌株(為了提供對抗供體菌株的反篩選)。一種含有pLS20和pBC16的dal缺失枯草芽孢桿菌菌株被選為合適的供體菌株，其構(gòu)建如下用pHV1248(Petit等，1990，《細菌學雜志》1726736-6740)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DN1686(美國專利號4,920,048)，使得細胞獲得紅霉素抗性。通過與枯草芽孢桿菌(natto)3335UM8(Koehlr和Thorne，1987，見前)的接合轉(zhuǎn)移，接合元件pLS20和質(zhì)粒pBC16一起被轉(zhuǎn)移至枯草芽孢桿菌DN1686(pHV1248)菌株中。篩選得到的轉(zhuǎn)接合子為含有dal缺失突變的四環(huán)素和紅霉素抗性菌落。根據(jù)帶有pLS20的菌落通過接合轉(zhuǎn)移pBC16至其它枯草芽孢桿菌菌株的能力對它們進行評分。最后，通過提高培養(yǎng)溫度至50℃，使得接合菌株丟掉pHV1248，從而得到供體菌株含有pLS20和pBC16的枯草芽孢桿菌DN1686。
為了將這些質(zhì)粒導入枯草芽孢桿菌BW96中，必須執(zhí)行恰當?shù)姆春Y選，因此，用賦與紅霉素抗性的溫度敏感型質(zhì)粒pSK+/pE194轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BW96，其隨后可通過生長于非允永許溫度下而除去。根據(jù)以下程序，將pLS20和pBC16從含有pLS20和pBC16的枯草芽孢桿菌DN1686中遷移至枯草芽孢桿菌BW96(帶有pSK+/pE194)中。每種類型細胞各取一接種環(huán)的量，混合涂在添加了D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上，33℃下溫育5小時。從平板上刮取細胞，轉(zhuǎn)移至1ml LB培養(yǎng)基中。將多種稀釋度的細胞鋪在添加了四環(huán)素(10μg/ml)，紅霉素(5μg/ml)和D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上，34℃生長，以篩選獲得了pBC16以及許多情況下也獲得了pLS20的受體細胞。為了檢測pLS20是否也存在于任一轉(zhuǎn)接合子中，測試了十個菌落轉(zhuǎn)移pBC16至枯草芽孢桿菌PL1801中的能力?？莶菅挎邨U菌PL1801為缺失了apr和npr基因的枯草芽孢桿菌168(芽孢桿菌儲藏中心，哥倫布，OH)。然而，也可用枯草芽孢桿菌168。能夠遷移pBC16的供體一定也含有pLS20。一旦鑒定出能有效接合的菌株(含有pLS20及pBC16和pSK+/pE194的bac-1，dal-枯草芽孢桿菌)，通過在添加了四環(huán)素(5μg/ml)和D-丙氨酸(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中于45℃過夜增殖細胞，在33℃鋪板于添加了D-丙氨酸(50μg/ml)的TBAB平板上以獲得單菌落，并鑒定出紅霉素敏感型菌落，即可從該菌株中除去pSK+/pE194質(zhì)粒。該程序產(chǎn)生枯草芽孢桿菌BW154，即含有pLS20和pBC16的bac-1，dal-枯草芽孢桿菌。
表1簡要總結(jié)了各芽孢桿菌菌株和質(zhì)粒。
表1芽孢桿菌菌株和質(zhì)?？莶菅挎邨U菌菌株枯草芽孢桿菌(納豆) pLS20DN1686 dal-DN1280 dal-MT101DN1280(pXO503)1A758168 bac-1(芽孢桿菌儲藏中心，哥倫布，Ohio)BW96 1A758 dalΔBW97 1A758 dalΔ∷cat(pXO503)BW99 1A758 dalΔ(pPL2541-tet)BW1001A758 dalΔ(pX0503)，(pXL2541-tet)PL1801 aprΔ，nprΔ質(zhì)粒pBC16 Mob+，TcrpE194 溫度敏感型pLS20 Tra+pXO503 Tra+，MLSr(＝pLS20∷Tn917)pPL2541-tetMob+，Tcr(pE194 ts ori)pCAsub2Mob+，Cmr，Apr，(pE194-ts ori)pSK+/pE194Emr，Apr，溫度敏感型pShv2 Tra+，Emr，Cmr，溫度敏感型pHV1248Emr，溫度敏感型Tra+表示該質(zhì)粒賦與攜有它的任一枯草芽孢桿菌菌株進行接合的能力，也就是說，該質(zhì)粒編碼將一接合型質(zhì)粒從供體細胞轉(zhuǎn)移至受體細胞所需的全部功能。
Mob+表示質(zhì)?？杀缓蠺ra+質(zhì)粒(pLS20或pXO503)的菌株通過接合進行轉(zhuǎn)移。該質(zhì)粒必須含有順式作用序列和編碼反式作用蛋白的基因(例如在pBC16中分別為oriT和orf-beta)，或僅有oriT序列(例如pPL254-tet，這時細胞中還必須存在反式提供orf-beta功能的質(zhì)粒，如pBC16)。實施例2枯草芽孢桿菌A164(ATCC 6051A)中spoIIAC基因的缺失利用重疊延伸剪切(SOE)技術(shù)(Horton等，1989，《基因》7761-68)，生成spoIIAC基因的缺失形式，該基因編碼sigmaF，使得細胞通過孢子形成II期。利用Pitcher等(1989，出處同前)的方法獲得枯草芽孢桿菌A164(ATCC6051A)的染色體DNA。合成下面列出的引物5和6，以用于PCR擴增枯草芽孢桿菌A164的染色體DNA上從spoIIAC基因ATG起始密碼子上游205個核苷酸至ATG起點下游209個核苷酸的區(qū)域。上游引物的下劃線核苷酸為添加的HindIII位點。下游引物的下劃線核苷酸與ATG翻譯起始密碼子下游507至524位堿基互補。合成引物7和8，以用于PCR擴增ATG翻譯起始密碼子下游從507位延伸至884位核苷酸的序列區(qū)。引物7的下劃線區(qū)與用于擴增上游片段的引物6的3’端部分完全互補。引物55’-AAGCTTAGGCATTACAGATC-3’(SEQ ID NO5)引物65’-CGGATCTCCGTCATTTTCCAGCCCGATGCAGCC-3’(SEQ ID NO6)引物75’-GGCTGCATCGGGCTGGAAAATGACGGAGATCCG-3’(SEQ ID NO7)引物85’-GATCACATCTTTCGGTGG-3’(SEQ ID NO8)在各自的PCR擴增中使用這兩套引物來分別擴增spoIIAC基因的上游和下游片段。擴增反應(yīng)體系(25μl)含有以下組分200ng枯草芽孢桿菌A164染色體DNA，每條引物0.5μM，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP各為200μM，1×Taq DNA聚合酶緩沖液，以及0.625U的TaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件如下96℃3分鐘，然后依次按96℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分鐘為一個循環(huán)進行30個循環(huán)，最后再72℃3分鐘以確保擴增片段末端加上腺嘌呤(Invitrogene，圣地亞哥，加州)。目標產(chǎn)物的擴增經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳加以確證。
然后在含上述每種擴增反應(yīng)產(chǎn)物各2.5μl，而除了只加有引物5和8外其它反應(yīng)條件同上的新的PCR反應(yīng)體系中完成擴增，得到長為1089個核苷酸的“剪切”片段，代表內(nèi)部缺少298個核苷酸的spoIIAC基因。利用Invitrogen TA克隆試劑盒，按照生產(chǎn)商的操作指示，將該片段克隆至pCRII載體中，作為HindIII-EcoRI片段切出，再克隆至用HindIII/EcoRI消化過的pShv2中。pShv2是一個穿梭載體，通過將含有pUB110 oriT的pBCSK+(Stratagene，La Jolla，加州)XbaI酶切片段與pE194(圖1)XbaI酶切片段連接，再連入來自pUB110的經(jīng)PCR擴增出的含有SstI相容性末端的oriT片段而構(gòu)建成。通過pLS20介導的接合(Battisti等，1985，細菌學雜志162543-550)，oriT片段使得該質(zhì)粒遷移至枯草芽孢桿菌A164中。pShv2-ΔspoIIAC被轉(zhuǎn)入供體菌株枯草芽孢桿菌BW154(實施例1)。枯草芽孢桿菌BW154(pShv2-ΔspoIIAC)被用作供體菌株，向枯草芽孢桿菌A164中導入該帶有缺失基因的穿梭載體。
通過轉(zhuǎn)有pShv2-ΔspoIIAC的枯草芽孢桿菌BW154與枯草芽孢桿菌A164的接合，篩選紅霉素抗性轉(zhuǎn)接合子，并于45℃培養(yǎng)，可實現(xiàn)缺失基因與完整染色體基因間的交換。在45℃下，pE194復制子沒有活性，細胞只能通過含有缺失基因的質(zhì)粒在spoIIAC位點的Campbell整合才能保持紅霉素抗性。通過在34℃，即允許pE194復制子行使功能的溫度下，在無抗生素選擇的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株兩輪，完成第二次重組，導致載體DNA脫落(loopout)，并且缺失基因替代了完整spoIIAC基因。根據(jù)以下標準選擇出已經(jīng)發(fā)生基因替代的菌落1)穿梭載體pShv2編碼的紅霉素(erm)抗性缺失，2)在孢子形成培養(yǎng)基上菌落不透明度降低，表明不能產(chǎn)生孢子，和3)用引物5和8經(jīng)PCR擴增可獲得一條791個核苷酸的片段而不是該基因未缺失形式的1089個核苷酸。實施例3枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIAC中nprE基因的缺失根據(jù)實施例2所述方法制備出枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIAC染色體DNA作為模板，利用下述引物9和10，PCR擴增出中性蛋白酶(nprE)基因的上游部分序列(GTG起始密碼子下游第40-610位核苷酸)。利用下列引物11和12，經(jīng)PCR擴增出nprE基因的下游部分(核苷酸1040-1560)。引物10和11設(shè)計成在兩片段中有15個堿基對重疊(下劃線部分)。擴增反應(yīng)體系(25μl)含有實施例2所述的相同組分，并在相同條件下完成。引物95’-CGTTTATGAGTTTATCAATC-3’(SEQ ID NO9)引物105’-AGACTTCCCAGTTTGCAGGT-3’(SEQ ID NO10)引物115’-CAAACTGGGAAGTCTCGACGGTTCATTCTTCTCTC-3’(SEQ ID NO11)引物125’-TCCAACAGCATTCCAGGCTG-3’(SEQ ID NO12)參照生產(chǎn)商的操作指示，對所擴增的上游和下游片段用QiaexII試劑盒(Qiagen，Chatsworth，加州)進行凝膠純化。在含每種純化片段各約20ng的新的PCR混合物(100μl)中進行反應(yīng)。以下條件用來進行SOE反應(yīng)按實施例2的條件，先不加引物進行第1-3個循環(huán)，產(chǎn)生“剪接”片段，再在加入引物9和12的條件下進行第4-30個循環(huán)。所擴增的SOE片段被克隆進pCRII載體，并進行限制性酶切分析確證。該片段隨后作為BamHI-XhoI片段克隆進pShv2。這個質(zhì)粒，pShv2-ΔnprE被轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌BW154中，得到可用于接合的合適供體菌株。該質(zhì)粒隨后被遷移至枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIAC中。利用實施例2所述的溫度變換方法，將ΔnprE基因引入枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIAC的染色體上。將erms菌落涂在加有1％脫脂奶粉的TBAB瓊脂平板上，37℃生長過夜，從而對nprE-表型評分。(nprE-菌株的清亮帶顯著減弱。)利用引物9和12進行染色體DNA的PCR分析，證實有430個堿基對被刪除。實施例4枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIACΔnprE中aprE基因的缺失利用SOE方法產(chǎn)生出枯草芽孢桿菌中編碼堿性枯草溶素(subtillisin)蛋白酶的aprE基因的缺失形式。根據(jù)實施例2所述方法，利用下列引物13和14，從枯草芽孢桿菌A164染色體DNA上PCR擴增出aprE基因的上游部分序列，得到從翻譯起始密碼子上游189個核苷酸至起始點下游328個核苷酸的一個片段。引物13中帶下劃線的核苷酸為添加的EcoRI位點。引物14中帶下劃線的核苷酸處添加有SalI位點，并為下游PCR片段提供互補性。選用引物15和16，經(jīng)PCR擴增出aprE基因的下游部分序列，得到從aprE翻譯起始密碼子下游789位核苷酸至1306位核苷酸的一個片段。引物14和引物15中帶下劃線的區(qū)域為上游片段與下游片段間提供互補。引物16的下劃線核苷酸添加了HindIII位點。擴增反應(yīng)體系(25μl)含有如實施例2所述的相同組分，并在相同條件下執(zhí)行。引物135’-GCGAATTCTACCTAAATAGAGATAAAATC-3’(SEQ ID NO13)引物145’-GTTTACCGCACCTACGTCGACCCTGTGTAGCCTTGA-3’(SEQ ID NO14)引物155’-TCAAGGCTACACAGGGTCGACGTAGGTGCGGTAAAC-3’(SEQ ID NO15)引物165’-GCAAGCTTGACAGAGAACAGAGAAGCCAG-3’(SEQ ID NO16)參照生產(chǎn)商的操作指示，利用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Chatsworth，加州)純化出擴增得到的上游和下游片段。然后利用引物13和16將兩種純化片段剪接在一起。除了染色體DNA用上游和下游PCR產(chǎn)物各2μl替代外，擴增反應(yīng)體系(50μl)含有與前述相同的組分。反應(yīng)先在96℃3分鐘溫育1個循環(huán)(無dNTPs和Taq聚合酶)，然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)程序為96℃1分鐘再72℃1分鐘。這樣產(chǎn)生了aprE中缺失編碼區(qū)460個核苷酸的缺失形式。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離，克隆至pCRII中，以EcoRI-HindIII片段切出，再克隆至經(jīng)EcoRI/HindIII消化的pShv2載體中，得到pShv2-ΔaprE。該質(zhì)粒被導入以上所述的供體菌株中，用于接合轉(zhuǎn)移至枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIACΔnprE中。
根據(jù)以上所述spoIIAC和nprE的缺失方法，用缺失基因替換aprE基因。利用紅霉素敏感型以及在加有1％脫脂奶粉上層的TBAB瓊脂平板上清亮帶的減弱，選擇出aprE基因已被缺失的菌落。AprE的缺失經(jīng)PCR確證。
枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE在這里被稱為枯草芽孢桿菌A164Δ3。實施例5枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE中amyE基因的缺失利用SOE方法產(chǎn)生編碼枯草芽孢桿菌α-淀粉酶的amyE基因的缺失形式。利用下列引物17和18從枯草芽孢桿菌A164染色體DNA中擴增出amyE的上游部分序列，得到從amyE翻譯起始密碼子上游421位核苷酸延伸至amyE編碼區(qū)第77位核苷酸的DNA片段，并在上游末端加有SalI位點，在下游末端加有SfiI和NotI位點。選用引物19和20，經(jīng)PCR擴增出amyE基因的下游部分序列，得到從amyE編碼區(qū)第445位核苷酸至953位核苷酸的片段，并在上游末端加有SfiI和NotI位點，在下游末端加有HindIII位點。限制性酶切位點用下劃線標出。擴增反應(yīng)體系(25μl)含有與實施例2所述的相同組分，并在相同條件下執(zhí)行。
利用引物17和20通過PCR將兩條片段剪接起來。除了其中染色體DNA被換成上游和下游PCR產(chǎn)物各2μl外，擴增反應(yīng)體系(25μl)含有與前述相同的組分。反應(yīng)先在96℃3分鐘溫育1個循環(huán)(無dNTPs和Taq聚合酶)，然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)程序為96℃1分鐘再72℃1分鐘。該反應(yīng)通過兩片段在互補區(qū)的重疊(SfiI和NotI位點)將這兩片段融合，得到缺少編碼區(qū)367個核苷酸、并在amyE的兩部分序列之間導入了SfiI和NotI位點的amyE片段。根據(jù)標準方法進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分離出反應(yīng)產(chǎn)物。參照生產(chǎn)商的操作指示，將該片段克隆至pCRII中，產(chǎn)生pCRII-ΔamyE。引物175’-CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3’(SEQ ID NO17)(劃線處為SalI位點)引物185’-CGCGGCCGCAGGCCCTTAAGGCCAGAACCAAATGAA-3’(SEQ ID NO18)(劃線處為NotI和SfiI位點)引物195’TGGCCTTAAGGGCCTGCGGCCGCGATTTCCAATG-3’(SEQ ID NO19)(劃線處為SgiI和NotI位點)引物205’-GAAGCTTCTTCATCATCATTGGCATACG-3’(SEQ ID NO20)(劃線處為HindIII位點)用NotI消化pShv2，用Klenow片段和dNTP補平粘性末端，并重新連接該質(zhì)粒，得到pShv2.1。該步驟破壞了pShv2的NotI位點。從pCRII-ΔamyE上以SalI-HindIII形式切下缺失型amyE片段，克隆至用SalI和HindIII雙消化的pShv2.1中，得到pShv2.1-ΔamyE。將該質(zhì)粒導入枯草芽孢桿菌BW154，以便接合轉(zhuǎn)移至枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprE中。
根據(jù)以上就spoIIAC，nprE和aprE所述的方法，用缺失基因替代amyE基因。利用紅霉素敏感性以及失去在加有天青色淀粉頂層的平板上產(chǎn)生清亮帶的能力，選擇出已經(jīng)發(fā)生基因替代的菌落。通過利用引物17和20對染色體DNA進行該缺失基因的PCR擴增，證實amyE基因的缺失。實施例6缺失枯草芽孢桿菌A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE中的srfC基因，得到枯草芽孢桿菌A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC合成下列引物21-24，用于缺失枯草菌脂肽操縱子的srfC基因。引物21與srfC基因中已存在的HindIII位點(下劃線)有重疊，與引物22相配合，可以PCR擴增出從srfC翻譯起始點下游410位核苷酸至848位核苷酸的DNA片段。引物22的下劃線部分與ATG起始密碼子下游第1709-1725位核苷酸互補。用引物23和24用PCR擴增出srfC翻譯起始點下游1709至2212位核苷酸的區(qū)域。引物23的下劃線部分與ATG密碼子下游835-848位核苷酸互補。擴增反應(yīng)體系(25μl)含有與實施例2所述相同的組分，并在相同條件下執(zhí)行。引物215’-AAGCTTTGAATGGGTGTGG-3’(SEQ ID NO21)引物225’-CCGCTTGTTCTTTCATCCCCTGAAACAACTGTACCG-3’(SEQ ID NO22)引物235’-CAGTTGTTTCAGGGGATGAAAGAACAAGCGGCTG-3’(SEQ ID NO23)引物245’-CTGACATGAGGCACTGAC-3’(SEQ ID NO24)利用Qiagen PCR離心柱(Qiagen，Chatsworth，加州)，從PCR產(chǎn)物中除去引物和其它污染物。經(jīng)PCR產(chǎn)生的兩個片段間的互補性使得可通過SOE完成剪接。除前3個循環(huán)是在加入引物之前進行的，以延伸重疊區(qū)外，其它PCR條件與以上所述相同，加入“外端引物”—引物21和24，將PCR產(chǎn)物(每種2μl或大約50ng)剪接到一起。經(jīng)SOE反應(yīng)得到缺失srfC基因內(nèi)部859個核苷酸的長為955個核苷酸的片段。srfC基因被缺失的部分負責向枯草菌脂肽分子添加第七個氨基酸(即亮氨酸)，它的缺失進一步引起基因的移碼突變，導致肽在類似硫酯酶活性位點的區(qū)域之前終止，而推測該區(qū)域參與SrfC蛋白的枯草菌脂肽釋放(Cosmina等，1993，見前)。
根據(jù)以上就spoIIAC，nprE，aprE和amyE述及的缺失方法，用缺失基因替代srfC基因。利用紅霉素敏感性特征以及失去在血瓊脂平板上產(chǎn)生清亮帶的能力(Grossman等，1993，細菌學雜志1756203-6211)，以及在加有50ml含有10％蔗糖，4％大豆粉，0.42％無水Na2HPO4和0.5％CaCO3并添加5μg/ml氯霉素的PS-1培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，37℃，250rpm培養(yǎng)4天，缺少泡沫的產(chǎn)生，來選擇已經(jīng)發(fā)生基因替代的菌落。利用引物21和24，從染色體DNA中PCR擴增缺失基因，確證srfC基因已發(fā)生缺失。
枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC在這里被稱為枯草芽孢桿菌A164Δ5。實施例7枯草芽孢桿菌A1630ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC的構(gòu)建根據(jù)實施例1-6就枯草芽孢桿菌A164ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC(枯草芽孢桿菌A164Δ5)所述的相同程序，利用為枯草芽孢桿菌A164缺失所構(gòu)建的諸缺失質(zhì)粒，從枯草芽孢桿菌A1630(NCFB736，舊稱NCDO736)構(gòu)建出枯草芽孢桿菌A1630ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC。
枯草芽孢桿菌A1630ΔspoIIACΔnprEΔaprEΔamyEΔsrfC在這里被稱為枯草芽孢桿菌A1630Δ5。實施例8構(gòu)建用于將amyQ啟動子-amyM轉(zhuǎn)錄盒整合至枯草芽孢桿菌A164菌株中的載體在緊接著編碼解淀粉芽孢桿菌淀粉酶(BANTM，Novo NordiskA/S，Bagsverd，丹麥)的amyQ基因的啟動子下游導入NOVAMYLTM(amyM)基因和其天然核糖體結(jié)合位點，構(gòu)建成轉(zhuǎn)錄融合體。利用下列引物25和26，在與實施例2所述相同的條件下，PCR擴增出amyQ基因啟動子(BANTM啟動子)，并克隆在pCRII載體上，測序確證無擴增錯誤，然后連至已用SfiI和SstI雙切的大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體pHP13-ampMCS的多克隆位點中。引物255’-TTTGGCCTTAAGGGCCTGCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAG-3’(下劃線部分分別為SfiI和ClaI位點)(SEQ ID NO25)引物265’TTTGAGCTCCATTTTCTTATACAAATTATATTTTACATATCAG-3’(下劃線部分為SstI位點)(SEQ ID NO26)用AatII酶切pUC19，Klenow片段和脫氧核糖核苷酸補平后再用HindIII酶切，構(gòu)建出pHP13(Haima等，1987，《分子和普通遺傳學》209335-342)的變體pHP13-ampMCS。用Qiaex試劑盒(Qiagen，Thousand Oaks，加州)凝膠純化較大的2.2kb片段。pHP13經(jīng)HpaI(在紅霉素抗性基因內(nèi)切開)酶切，補平，再用HindIII酶切。然后將來自pHP13的3.0Kb較大片段與含有pUC9復制起點和氨芐青霉素抗性基因的2.1Kb pUC9片段相連接。最后，在50mM NaCl，10mM Tris pH7.5和1mM EDTA中，使下列兩種寡核苷酸27和28各100pmol沸煮5分鐘，然后在2小時期間緩慢冷至室溫，從而進行退火，得到新的多克隆位點(MCS)，并用其替代pUC9的多克隆位點。寡聚體275’-AGCTAGGCCTTAAGGGCCCGGGACGTCGAGCTCAAGCTTGCGGCCGCCATGGTCGACG-3’(SEQ ID NO27)寡聚體285’-AATTCGTCGACCATGGCGGCCGCAAGCTTGAGCTCGACGTCCCGGGCCCTTAAGGCC-3’(SEQ ID NO28)由于用于PCR擴增BANTM(amyQ)啟動子的引物導入了SfiI和SstI位點，為了構(gòu)建轉(zhuǎn)錄融合體，必須在NOVAMYLTM(amyM)開放閱讀框上游導入Sst I位點。因此，設(shè)計含有SstI接頭的5′PCR引物(下列引物27)，使其與NOVAMYLTM(amyM)核糖體結(jié)合位點上游4個核苷酸可以退火。這個PCR引物的位置緊鄰一潛在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的下游，因此在擴增步驟中會將其略去。在實施例2所述條件下，以200ng pSJ3200(圖2)作模板DNA，利用與PvuII位點重疊的PCR引物(下列引物28)和含有SstI位點的引物組合，擴增出編碼NOVAMYLTMN-末端327個核苷酸的片段。引物295’-CTGAGCTCTACGAAAGGAGACACACATGC-3’(劃線為SstI位點)(SEQ ID NO29)引物305’-ACGCCCAGCTGTTTAAGATAAG-3’(劃線為PvuII位點)(SEQ ID NO30)將NOVAMYLTM基因作為PstI-BglII片段克隆至含有較大多克隆位點的pUB110衍生質(zhì)粒pSJ2662(圖3)中，構(gòu)建出pSJ3200質(zhì)粒(圖2)。
為了重新構(gòu)建amyM基因，將經(jīng)PCR擴增得到的327個核苷酸的片段作為SstI-PvuII片段切出，并與下游2.2Kb PvuII-SstI片段(編碼amyM的后半部分)一起以3-片段連接的方式連入用SstI切開的pUC118中。然后將重新構(gòu)建的amyM基因作為SstI片段切出，克隆于pSJ2882-MCS中所含的amyQ啟動子下游。圖4總結(jié)了這些克隆步驟。pSJ2882-MCS來自pHP13(Haima等，1987，分子普通遺傳學209335-342)，但含有兩端為SifI-Not I的多克隆位點，還具有含來自pUB110的oriT區(qū)的0.5Kb SstI片段。后一片段使得可通過pLS-20介導的接合而將質(zhì)粒遷移至枯草芽孢桿菌A164中(Battisti等，1985，細菌學雜志162543-550)。
將連接反應(yīng)物直接轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌PL1801spoIIE中。根據(jù)生長在含有5μg/ml氯霉素的天青色淀粉平板上出現(xiàn)或缺少帶暈圈的菌落，來確認pSJ2882-MCS中amyM開放閱讀框相對于amyQ啟動子的合適方向。
為了構(gòu)建整合載體pCAsub2，用BclI和BglII消化切下pPL2419(圖5)的新霉素抗性基因，并代之以pMI 1101上含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因的BamHI片段(Young man等，1984，質(zhì)粒121-9)，得到質(zhì)粒pPL2419-cat。(BamHI粘性末端與BclI和BglII粘性末端相容)。然后，通過在50mM NaCl，10mM Tris pH7.5，1mM EDTA中混合下列兩種寡核苷酸(SEQ ID NO31和SEQ ID NO32)，每種各100pmol，沸煮5分鐘，再經(jīng)超過2小時的時間緩慢冷卻至室溫，而將這兩種寡核苷酸退火，得到含有SfiI和NotI位點的新多克隆位點，用來替代pPL2419-cat的多克隆位點(MCS)。
(下劃線表示HindIII和KpnI相容位點，下劃雙線表示SfiI和NotI位點)(SEQ ID NO31)5’-CTGCAGCGGCCGCGGATCCGATATCGGGCCCTTAAGGCCA-3’(SEQ ID NO32)將已退火的寡核苷酸(2μl)連至經(jīng)HindIII和KpnI切開的pPL2419-cat(0.2μg)中，得到p2419MCS5-cat。然后，利用枯草芽孢桿菌菌株A164Δ5染色體DNA(如實施例2所述制得)作模板，含有NotI和KpnI(Asp718)接頭的下述引物(SEQ ID NO33和SEQ ID NO34)，如實施例2所述，PCR擴增amyE(GenBank Locus BSAMYL，接受號V00101，J01547)的942至1751位核苷酸，并插入經(jīng)NotI和Asp718消化的p2419MCS5中，得到整合載體pCAsub2(圖6)，CAsub是指氯霉素抗性，淀粉酶同系物，用于枯草芽孢桿菌類宿主。5’-GCGGCCGCGATTTCCAATGAG-3’(劃線部分表示設(shè)計的NotI位點)(SEQ ID NO33)5’-GGTACCTGCATTTGCCAGCAC-3’(劃線部分表示設(shè)計的Asp718I位點)(SEQ ID NO34)該載體獨自整合至枯草芽孢桿菌168中，涂板于天青色淀粉頂層平板上，示出淀粉酶活性已完全喪失。
將amyQ啟動子-amyM構(gòu)建物作為SfiI-NotI盒從pSJ2882-MCS中切出，克隆至用同樣的酶切開的pCAcub2中，得到完全整合載體pBAN-NOV(圖7)。實施例9構(gòu)建枯草芽孢桿菌供體菌株BW100構(gòu)建能夠保持和遷移基于pE194的“奴隸型”整合質(zhì)粒，如實施例8中所述的pCAsub2(賦予氯霉素抗性并含有oriT)的合適供體菌株。這種供體菌株應(yīng)有以下特征bac-1-，dal-缺失，含有pLS20或pX0503和基于pE194的“輔助”質(zhì)粒(含有oriT和orf-beta，以遷移“輔助”和“奴隸型”質(zhì)粒，還含有repF，以反式提供repF蛋白，從而使得“奴隸型”質(zhì)粒能夠復制并作為質(zhì)粒復制子保持下去)(WO91/09129)。該菌株構(gòu)建如下將可提供針對供體菌株的反篩選的輔助質(zhì)粒pPL2541-tet(圖8)轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌BW96中，得到枯草芽孢桿菌BW99。接下來，利用枯草芽孢桿菌BW97作為供體菌株，通過接合將質(zhì)粒pXO503導入枯草芽孢桿菌BW99中?？莶菅挎邨U菌BW97構(gòu)建如下首先，將pXO503質(zhì)粒從枯草芽孢桿菌MT101供體菌株中遷移至bac-1菌株枯草芽孢桿菌1A758中，在加有紅霉素(5μg/ml)的TBAB平板上選擇出轉(zhuǎn)接合子(dal-供體菌株不能生長，因為培養(yǎng)基中不含D-丙氨酸)。這樣得到了帶有pXO503質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌bac-1-菌株。枯草芽孢桿菌MT101來自枯草芽孢桿菌DN1280，后者是含有dal基因缺失的枯草芽孢桿菌168的衍生菌株(Diderichsen，《芽孢桿菌分子遺傳學和生物技術(shù)應(yīng)用手冊》，A.T.Ganesan和J.A.Hoch主編，學術(shù)出版社有限公司，紐約，1986)。
接下來，將實施例8中所述的兩端為BamHI位點的cat基因盒(賦予氯霉素抗性)插入pCRII-dalΔ質(zhì)粒的BamHI位點。該質(zhì)粒用ScaI線性化，并轉(zhuǎn)入含有接合質(zhì)粒pXO503的bac-1菌株中，在加有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和氯霉素(5μg/ml)的TBAB平板上進行氯霉素抗性(經(jīng)由雙交換同源重組)篩選，得到bac-1，dalΔ∷cat接合有效供體菌株-枯草芽孢桿菌BW97。最后，枯草芽孢桿菌BW97與含有pPL2541-tet的枯草芽孢桿菌BW99接合，在加有D-丙氨酸(0.1mg/ml)，四環(huán)素(10μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的TBAB平板上篩選出轉(zhuǎn)接合子，得到供體菌株枯草芽孢桿菌BW100一種含有pXO503和輔助質(zhì)粒pPL2541-tet的bac-1-，dal-缺失的枯草芽孢桿菌。實施例10枯草芽孢桿菌A164菌株中amyQ啟動子-amyM盒的整合與擴增將實施例9所述含有位于pBAN-NOV中的amyQ啟動子-amyM盒以及輔助質(zhì)粒pPL2541-tet的枯草芽孢桿菌BW100供體菌株通過pLS20介導的接合(Battisti等，1985，出處同前)與枯草芽孢桿菌A164Δ3和枯草芽孢桿菌A164Δ5菌株進行接合。
在含有添加了5μg/ml氯霉素的10ml LB培養(yǎng)液的125ml搖瓶中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌A164Δ3和Δ5轉(zhuǎn)接合子連續(xù)兩代，然后在45℃涂板，以阻斷pPL254-tet輔助質(zhì)粒的復制，并篩選出在amyE位點上具有整合質(zhì)粒整合的克隆。整合子隨后涂板于含濃度按15，30，45，60，和80μg/ml逐漸增高的氯霉素的培養(yǎng)基上，以選擇出含抗氯霉素基因的amyQ啟動子-amyM盒得到擴增的克隆。實施例11搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了amyQ啟動子-amyM盒的枯草芽孢桿菌A164菌株在含有50ml PS-1培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)含有染色體整合拷貝的amyQ啟動子-amyM盒或只含有整合載體的枯草芽孢桿菌A164Δ3和枯草芽孢桿菌A164Δ5約4天。
培養(yǎng)大約50和100小時后，取培養(yǎng)物上清液制樣；用終濃度為2mM的PMSF進行處理，凍存。為了估計NOVAMYLTM的表達，將上清液與等體積的2×Laemmli上樣緩沖液混勻，立即沸煮，并上樣于購自商家(NOVEX，圣地亞哥，加州)的14％或8-16％丙烯酰胺Tris-甘氨酸凝膠上，進行電泳。也將已知量的NOVAMYLTM標準樣品上樣于同一凝膠上，用來估計產(chǎn)生的NOVAMYLTM的量。有些情況下，利用麥芽三糖作底物來確定NOVAMYLTM的滴度。具體地說，取酶的樣品與麥芽三糖在pH5.0，37℃時共溫育30分鐘。然后將pH調(diào)至大約11以終止反應(yīng)。在標準條件下，用葡萄糖脫氫酶和NADH在340nm進行檢測，可確定由麥芽三糖降解的葡萄糖和麥芽糖所產(chǎn)生的葡萄糖的量。已知量的NOVAMYLTM標準(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麥)用作對照。
結(jié)果顯示，培養(yǎng)2天后，srfC未缺失菌株產(chǎn)生8厘米高的泡沫，而缺失了srfC的菌株只產(chǎn)生0.5厘米高的泡沫。在血瓊脂平板上生長時，srfC缺失菌株不產(chǎn)生溶血，這證實了該菌株不產(chǎn)生枯草菌脂肽。這些結(jié)果進一步表明，兩種菌株產(chǎn)生NOVAMYLTM的量相似，但srfC缺失菌株與未缺失菌株相比，前者產(chǎn)生的泡沫顯著減少。實施例12枯草芽孢桿菌A164菌株的發(fā)酵在含有1.5升由典型碳源和氮源，礦物質(zhì)鹽，微量元素以及至少3ml/L抗起泡劑(Sigma混合型289，Sigma Chemical Company，圣·路易斯，MO)組成的培養(yǎng)基的3升發(fā)酵罐中，分別培養(yǎng)只整合/擴增了奴隸型質(zhì)粒pCAsub2的枯草芽孢桿菌A164Δ3和枯草芽孢桿菌A164Δ5。培養(yǎng)物中以每分鐘1.5升的速率通氣，并用兩個標準渦輪以1000至1500rpm的轉(zhuǎn)速攪動。發(fā)酵溫度保持在37℃至39℃。
通過測定由起泡作用帶出發(fā)酵罐的液體體積來定量估計起泡量。按與實施例11所述相同的方法測定NOVAMYLTM活性。
結(jié)果表明，發(fā)酵5小時內(nèi)，枯草芽孢桿菌A164Δ3開始產(chǎn)生泡沫，泡沫充滿發(fā)酵罐上部的1.5升空間，并開始通過排氣管溢出至收集瓶中。在10至20小時內(nèi)，由于泡沫的溢出，使得發(fā)酵罐里的液體體積通常損失700至900ml。這個階段過后，系統(tǒng)穩(wěn)定下來，但發(fā)酵罐中只剩下初體積的45％至60％，這使得該菌株不適合用于大規(guī)模生產(chǎn)中。對枯草芽孢桿菌A164Δ5進行的類似發(fā)酵，由于在至少50小時的發(fā)酵時間內(nèi)不產(chǎn)生泡沫，因此不喪失任何體積。每毫升發(fā)酵液中兩種菌株產(chǎn)生的NOVAMYLTM的量相似。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk Biotech，Inc.
(B)街道1445 Drew Avenue(C)城市Davis，California(D)國家美國(E)郵編(ZIP)95616-4880(F)電話(916)757-8100(G)傳真(916)758-0317(ii)發(fā)明名稱在芽孢桿菌細胞突變體中生產(chǎn)多肽的方法(iii)序列數(shù)目34(iv)聯(lián)系地址(A)地址Novo Nordisk of North Americ(B)街道405 Lexington Avenue-64th Fl.
(C)城市New York(D)州NY(E)國家美國(F)郵編(ZIP)10174(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)當前申請信息(A)申請?zhí)?B)申請日1997年6月12日(C)分類號(vii)代理人/代理機構(gòu)信息
(A)姓名Lambiris，Elias J(B)登記號33,728(C)參考/文檔號5111.204-WO(viii)聯(lián)系信息(A)電話212-878-9652(B)電傳212-878-9655(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGCTCACAG AGATACGTGG GC 22(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO2GGATCCACAC CAAGTCTGTT CAT 23(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO3O GGATCCGCTG GACTCCGGCT G 21(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO4AAGCTTATCT CATCCATGGA AA 22(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO5AAGCTTAGGC ATTACAGATC 20(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO6CGGATCTCCG TCATTTTCCA GCCCGATGCA GCC33(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO7GGCTGCATCG GGCTGGAAAA TGACGGAGAT CCG 33(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO8GATCACATCT TTCGGTGG 18(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO9CGTTTATGAG TTTATCAATC 20(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO10AGACTTCCCA GTTTGCAGGT 20(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO11CAAACTGGGA AGTCTCGACG GTTCATTCTT CTCTC35(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO12TCCAACAGCA TTCCAGGCTG 20(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征
(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO13GCGAATTCTA CCTAAATAGA GATAAAATC 29(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO14GTTTACCGCA CCTACGTCGA CCCTGTGTAG CCTTGA 36(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO15TCAAGGCTAC ACAGGGTCGA CGTAGGTGCG GTAAAC 36(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO16GCAAGCTTGA CAGAGAACAG AGAAGCCAG29(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO17CGTCGACGCC TTTGCGGTAG TGGTGCTT 28(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO18CGCGGCCGCA GGCCCTTAAG GCCAGAACCA AATGAA36(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO19TGGCCTTAAG GGCCTGCGGC CGCGATTTCC AATG 34(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO20GAAGCTTCTT CATCATCATT GGCATACG 28(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO21AAGCTTTGAA TGGGTGTGG 19(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO22CCGCTTGTTC TTTCATCCCC TGAAACAACT GTACCG 36(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO23CAGTTGTTTC AGGGGATGAA AGAACAAGCG GCTG 34(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO24CTGACATGAG GCACTGAC 18(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO25TTTGGCCTTA AGGGCCTGCA ATCGATTGTT TGAGAAAAGA AG42(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO26TTTGAGCTCC ATTTTCTTAT ACAAATTATA TTTTACATAT CAG 43(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長度58個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO27AGCTAGGCCT TAAGGGCCCG GGACGTCGAG CTCAAGCTTG CGGCCGCCAT GGTCGACG 58(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長度57個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO28AATTCGTCGA CCATGGCGGC CGCAAGCTTG AGCTCGACGT CCCGGGCCCT TAAGGCC 57(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO29CTGAGCTCTA CGAAAGGAGA CACACATGC 29(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO30ACGCCCAGCT GTTTAAGATA AG 22(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO31AGCTTGGCCT TAAGGGCCCG ATATCGGATC CGCGGCCGCT GCAGGTAC 48(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO32CTGCAGCGGC CGCGGATCCG ATATCGGGCC CTTAAGGCCA 40(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO33GCGGCCGCGA TTTCCAATGA G 21(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO34GGTACCTGCA TTTGCCAGCA C 2權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)在有利于該多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌細胞的突變細胞，其中，(i)該突變細胞包含第一種核酸序列和第二種核酸序列，所述第一種核酸序列編碼所述多肽，所述第二種核酸序列中含有負責枯草菌脂肽或其同種型生產(chǎn)的、選自srfA、srfB、srfC、srfD和sfp基因中的至少一種基因的修飾，(ii)在相同條件下培養(yǎng)時，與芽孢桿菌細胞相比，該突變細胞產(chǎn)生的枯草菌脂肽或其同種型要少，并且(iii)該多肽是芽孢桿菌細胞的異源多肽；和(b)從培養(yǎng)基中分離多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述芽孢桿菌細胞是嗜堿芽孢桿菌細胞，解淀粉芽孢桿菌細胞，短芽孢桿菌細胞，環(huán)狀芽孢桿菌細胞，凝結(jié)芽孢桿菌細胞，堅強芽孢桿菌細胞，燦爛芽孢桿菌細胞，遲緩芽孢桿菌細胞，地衣芽孢桿菌細胞，巨大芽孢桿菌細胞細胞，短小芽孢桿菌細胞，嗜熱脂肪芽孢桿菌細胞，枯草芽孢桿菌細胞，或蘇云金芽孢桿菌細胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中，所述芽孢桿菌細胞是枯草芽孢桿菌細胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中，所述枯草芽孢桿菌細胞是枯草芽孢桿菌ATCC 6051或枯草芽孢桿菌ATCC 6051A。
5.權(quán)利要求3的方法，其中，所述枯草芽孢桿菌細胞是枯草芽孢桿菌NCFB 736。
6.權(quán)利要求1的方法，其中，所述基因是srf操縱子基因。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，所述基因是srfA。
8.權(quán)利要求6的方法，其中，所述基因是srfB。
9.權(quán)利要求6的方法，其中，所述基因是srfC。
10.權(quán)利要求6的方法，其中，所述基因是srfD。
11.權(quán)利要求1的方法，其中，所述基因是sfp。
12.權(quán)利要求1的方法，其中，在同等條件下培養(yǎng)時，所述突變細胞比芽孢桿菌細胞生產(chǎn)的枯草菌脂肽或其同種型至少少約25％。
13.權(quán)利要求1的方法，其中，所述修飾導致產(chǎn)生枯草菌脂肽或其同種型的不起泡變體。
14.權(quán)利要求1的方法，其中，所述多肽是芽孢桿菌細胞的異源多肽。
15.權(quán)利要求1的方法，其中，所述突變還包含編碼蛋白酶的一或多個基因的修飾。
16.權(quán)利要求15的方法，其中，所述基因是nprE和/或aprE。
17.權(quán)利要求1的方法，其中，所述突變還包括對spoIIAC和/或amyE基因的修飾。
18.一種相應(yīng)親本芽孢桿菌細胞的突變體，其包含第一種核酸序列和第二種核酸序列，所述第一種核酸序列編碼異源多肽，所述第二種核酸序列中含有負責枯草菌脂肽或其同種型生物合成或分泌的至少一種基因的修飾，其中，在相同條件下培養(yǎng)時，與芽孢桿菌細胞相比，該突變體產(chǎn)生的枯草菌脂肽或其同種型要少。
19.一種芽孢桿菌細胞的突變體，其包含至少兩個拷貝的第一種核酸序列和第二種核酸序列，所述第一種核酸序列編碼天然多肽，所述第二種核酸序列中含有負責枯草菌脂肽或其同種型生物合成或分泌的至少一種基因的修飾，其中，在相同條件下培養(yǎng)時，與芽孢桿菌細胞相比，該突變體產(chǎn)生的枯草菌脂肽或其同種型要少。
20.獲得權(quán)利要求19的突變體的方法，包括(a)向芽孢桿菌細胞內(nèi)引入含負責枯草菌脂肽或其同種型生物合成或分泌之至少一個基因的修飾的第一種核酸序列，以及編碼芽孢桿菌細胞異源多肽的第二種核酸序列；和(b)鑒定出步驟(a)中包含所述核酸序列的突變體。
21.獲得權(quán)利要求19的突變體的方法，包括(a)向芽孢桿菌細胞內(nèi)引入含負責枯草菌脂肽或其同種型生物合成或分泌之至少一個基因的修飾的第一種核酸序列，以及編碼該芽孢桿菌細胞天然多肽的第二種核酸序列；和(b)鑒定出步驟(a)中包含所述核酸序列的突變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽的生產(chǎn)方法,該方法包括:(a)在有利于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌細胞的突變體,其中,該突變體(i)包含兩種核酸序列,其中第一種核酸序列編碼所述多肽,第二種核酸序列包含負責枯草菌脂肽或其同種型生物合成或分泌的至少一種基因的修飾,(ii)在同等條件下培養(yǎng)時,與芽孢桿菌細胞相比,該突變體產(chǎn)生的枯草菌脂肽或其同種型要少;和(b)從培養(yǎng)基中分離多肽。本發(fā)明也涉及芽孢桿菌細胞的突變體及產(chǎn)生突變體的方法。
文檔編號C07K14/32GK1240482SQ97180644
公開日2000年1月5日 申請日期1997年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月18日
發(fā)明者A·斯洛馬, D·斯特恩比格, L·F·阿達斯, S·布朗 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司