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      免疫療法和改良疫苗的制作方法

      文檔序號:3549981閱讀:625來源:國知局
      專利名稱:免疫療法和改良疫苗的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及免疫療法組合物和方法,以及改良的保護性和治療性疫苗,還涉及用于預(yù)防性和/或治療性誘導(dǎo)抗抗原免疫應(yīng)答的改進方法。
      背景技術(shù)
      疫苗可用于免疫個體以抵抗靶抗原,例如病原性抗原或與類疾病中涉及的細胞相關(guān)抗原。與參與人類疾病細胞相關(guān)的抗原包括癌相關(guān)性腫瘤抗原和參與自身免疫疾病的細胞相關(guān)抗原。
      各種免疫接種策略總的目標都是誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng),這樣的應(yīng)答賦予被免疫者對某給定病原的終身保護。為達此目的的一個主要難題是,由某一種病原及其引起的保護作用的相互關(guān)系會因感染性因子的變化而變化。所以,一個臨床上更有效的疫苗應(yīng)該誘導(dǎo)對其靶病原產(chǎn)生特異性更強的免疫應(yīng)答。根據(jù)已知的保護作用與特定病原的相互關(guān)系需要設(shè)計將免疫接種策略一直“聚焦”于特定的病原。
      在設(shè)計上述疫苗的過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),能在接種個體的細胞內(nèi)產(chǎn)生靶抗原的疫苗是能有效誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)細胞免疫的疫苗。具體地說,減毒活疫苗、采用非致病性載體和DNA疫苗的重組疫苗都能在被接種個體的細胞內(nèi)產(chǎn)生抗原,由此誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細胞免疫。另一方面,只包含蛋白質(zhì)的亞單位疫苗和死的或滅活的疫苗,誘導(dǎo)的只是體液應(yīng)答反應(yīng),卻不能誘導(dǎo)良好的細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。
      為了治療病原感染、癌癥或自身免疫病,常常需要細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)來提供抵抗病原感染的保護力和有效的免疫介導(dǎo)治療。所以,較好的是能夠在免疫接種個體的細胞內(nèi)產(chǎn)生靶抗原的疫苗,例如減毒活疫苗、采用無致病性載體和DNA疫苗的重組疫苗。
      核酸免疫是一種新的接種技術(shù),它將編碼某特定免疫原的DNA構(gòu)建物遞送給宿主。DNA疫苗除了能夠同時誘導(dǎo)抗原特異性細胞和體液免疫應(yīng)答之外,它還可能通過免疫學(xué)上重要分子的共同傳遞而操縱所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
      雖然上述疫苗通過預(yù)防性或治療性免疫接種個體常能有效地抵抗病原感染或人體疾病,但仍然需要改進的疫苗,仍然需要產(chǎn)生增強的免疫應(yīng)答的組合物和方法。
      發(fā)明概述本發(fā)明涉及基因構(gòu)建物,它包含編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的調(diào)節(jié)蛋白可給予正在接受預(yù)防性或治療性接種或治療性免疫調(diào)節(jié)療法的個體。這些免疫調(diào)節(jié)蛋白包括人體蛋白IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和一種新的分子BL-1。
      本發(fā)明涉及的基因構(gòu)建物包括編碼IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18或BL-1的核苷酸序列;或者編碼IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18或BL-1中不少于兩個的核苷酸序列。本發(fā)明希望,基因構(gòu)建物能夠包含同一核苷酸序列的多份拷貝。
      本發(fā)明涉及個體免疫接種的方法,即通過給予個體疫苗組合物導(dǎo)入免疫原并聯(lián)合導(dǎo)入基因構(gòu)建物,該基因構(gòu)建物包括編碼一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白,從而可得到增強的和/或更理想的免疫應(yīng)答的核苷酸序列。而且本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)個體免疫應(yīng)答的方法,即給予包含一個或多個免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼核苷酸序列的基因構(gòu)建物。對于免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)可以是疫苗接種程序中的一個步驟其中將疫苗組合物和促進一種免疫應(yīng)答形式的免疫調(diào)節(jié)蛋白共同給予患者,然后將疫苗組合物和促進另一種免疫應(yīng)答形式的免疫調(diào)節(jié)蛋白共同給予患者進行加強免疫,由此將患者的免疫應(yīng)答由主要為Th1轉(zhuǎn)變成Th2,或由Th2轉(zhuǎn)變?yōu)門h1。
      疫苗組合物最好是直接導(dǎo)入體內(nèi)的質(zhì)粒。類似地,包含一個或多個免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼核苷酸序列的基因構(gòu)建物也最好是質(zhì)粒。
      本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒,它包含編碼人IL-12蛋白質(zhì)的核苷酸序列,該序列與在真核細胞中表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,還包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列,該序列與在真核細胞中表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在某些較好的實施方式中,所述的免疫原性靶抗原是病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞連接的抗原。在某些實施方案中,該質(zhì)粒包含一段編碼單鏈人IL-12蛋白質(zhì)的核苷酸序列,該序列與在真核細胞中表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。單鏈IL-12蛋白是一種單體(single)蛋白,它由單一的編碼序列編碼,而且包括一個連接兩亞基的接頭。接頭具有足夠的大小和柔韌性,足以使得此單體蛋白能夠折疊成原來功能性二亞基所顯示的生物活性構(gòu)象。
      本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)個體內(nèi)針對某抗原的免疫應(yīng)答的方法,它包括給予個體某種質(zhì)粒的步驟,所述質(zhì)粒包含編碼人IL-12蛋白質(zhì)的核苷酸序列,該序列與在該個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,還包含編碼靶抗原的核苷酸序列,該序列與在該個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在某些較好的實施方式中,靶抗原是病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞連接的抗原。在較好的實施方案中,誘導(dǎo)的針對靶抗原的免疫應(yīng)答為治療感染、疾病、紊亂和某些病癥(與抗抗原免疫反應(yīng)所針對的蛋白有關(guān))提供了效果,和/或,誘導(dǎo)產(chǎn)生針對病原或某些細胞的保護性免疫反應(yīng),這些細胞所含的蛋白與抗抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有交叉反應(yīng)。在有些實施方案中,人IL-12蛋白質(zhì)是一種單鏈IL-12蛋白。
      本發(fā)明涉及一種組合物,它包含多個質(zhì)粒,它們集合了編碼人IL-12兩亞基和靶抗原的核苷酸序列,各編碼序列分別與基因表達必需的調(diào)控元件操作性連接。在某些實施方案中,組合物包含兩種質(zhì)粒第一種質(zhì)粒包含編碼IL-12蛋白的核苷酸序列,它與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接;第二種質(zhì)粒包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列,它與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在某些實施方案中,一個質(zhì)粒包含編碼免疫原性靶抗原和人IL-12一個亞基的核苷酸序列,而第二個質(zhì)粒則包含編碼IL-12另一亞基的核苷酸序列。在某些實施方案中,提供3種不同的質(zhì)粒其一包含編碼免疫原性靶蛋白的核苷酸序列,其二包含編碼人IL-12的p35亞基的核苷酸序列,另一則包含編碼人IL-12的p40亞基的核苷酸序列。在有些實施方案中,該組合物包含兩種質(zhì)粒,第一質(zhì)粒包含編碼單鏈IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,第二質(zhì)粒包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列,該序列也與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。
      本發(fā)明涉及在個體內(nèi)誘導(dǎo)針對某抗原的免疫應(yīng)答的方法,它包括給予個體組合物的步驟,此組合物含有多個質(zhì)粒,這些質(zhì)粒集合了編碼人IL-12兩亞基和靶抗原的核苷酸序列,各編碼序列均與基因表達必需調(diào)控元件操作性連接。在某些實施方案中,兩種或三種上述質(zhì)粒共同包含編碼人IL-12兩亞基和免疫原性靶蛋白的核苷酸序列,編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在較好的實施方案中,由靶抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。本發(fā)明涉及免疫接種個體以抵抗病原、癌癥或自身免疫病的方法。在較好的實施方案中,靶抗原是病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。在有些實施方案中,人IL-12是單鏈IL-12蛋白。
      本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒,它所含的核苷酸序列編碼人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5h IL-10蛋白中一個或多個,所述核苷酸序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,還包含編碼靶抗原的核苷酸序列,該序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在某些較好的實施方案中,免疫源性靶抗原是一種病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。在某些較好的實施例中,免疫原性靶抗原是病原性抗原、癌相關(guān)抗源或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗源。
      本發(fā)明涉及在個體內(nèi)誘導(dǎo)針對某抗源的免疫應(yīng)答的方法,它包括給予個體一種質(zhì)粒的步驟,該質(zhì)粒所含核苷酸序列編碼人GM-CSF、IL-12、INF-α、INF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中的一個或多個,此核酸序列與在個體細胞中表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。它還包括給予個體編碼靶抗源的核苷酸序列,該序列與在個體一細胞中表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在某些較佳實例中,該靶抗原是病原性抗原,癌相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞連接的抗原。在較好的實施方案中,所誘導(dǎo)的針對靶抗原的免疫應(yīng)答為感染、疾病、紊亂和某些病癥(與抗抗原免疫反應(yīng)所針對的蛋白有關(guān))提供了治療效果,和/或,誘導(dǎo)產(chǎn)生了針對病原或某些細胞的保護性免疫應(yīng)答,這些細胞所含的蛋白與所產(chǎn)生的針對靶抗原的免疫應(yīng)答有交叉反應(yīng)。
      本發(fā)明涉及一種組合物,它包含多個質(zhì)粒,其中包括兩種質(zhì)粒第一種質(zhì)粒包含的核苷酸序列編碼人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個,這些序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,第二質(zhì)粒包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列,該序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在有些實施方案中該組合物包含三種質(zhì)粒,其中的第三質(zhì)粒包含編碼GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在有些實施方案中,該組合物包含4種質(zhì)粒,其中第3質(zhì)粒包含編碼人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與真核細胞表達所必須的調(diào)控元件操作性連接;以及第4質(zhì)粒包含編碼GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。
      本發(fā)明涉及在個體內(nèi)誘導(dǎo)針對某抗原的免疫應(yīng)答的方法,它包括給予個體一種組合物,該組合物中包含多個質(zhì)粒,其中包括兩種質(zhì)粒第一種質(zhì)粒包含編碼人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與基因表達所必需的調(diào)控元件操作性連接;第二種質(zhì)粒包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列,該序列與表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在較好的實施方案中,由靶抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。本發(fā)明涉及免疫接種個體以抵抗病原、癌癥或自身免疫病的方法。在較好的實施方案中,靶抗原是病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。在有些實施方案中,所述方法包括給予某種組合物,該組合物包含3種質(zhì)粒,其中的第三質(zhì)粒包含編碼人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在有些實施方案中,所述方法包括給予某種組合物,該組合物包含4種質(zhì)粒,其中第三種質(zhì)粒包含編碼人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與真核細胞表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,以及第四種質(zhì)粒,它包含編碼人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種改良的重組疫苗載體,它包含編碼人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,還包含編碼靶抗原的核苷酸序列,該序列也與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在有些實施方案中,人IL-2蛋白的編碼基因編碼單鏈蛋白形式的IL-2。在較好的實施方案中,靶抗原是病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。
      本發(fā)明涉及一種免疫接種個體以抵抗病原、癌癥或自身免疫病的方法,它包括給予個體一種重組載體的步驟,該載體編碼人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,還包含編碼靶抗原的核苷酸序列,該序列也與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,其中的靶抗原是病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。
      本發(fā)明涉及改良的減毒活疫苗,它包含編碼人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種免疫接種個體以抵抗病原、癌癥或自身免疫病的方法,它包括給予個體減毒疫苗的步驟,該疫苗包含編碼人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在所述個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒,它包含編碼人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一對質(zhì)粒,其中一個質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p35亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,另一質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p40亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒,它含有編碼單鏈人IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,其中單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,它的p35亞基和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,被表達時,此單鏈蛋白能夠形成具有生物活性的IL-12分子。
      本發(fā)明涉及一種藥物組合物,它包含一種質(zhì)粒和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑,該質(zhì)粒含有編碼人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種藥物組合物,它包含一對質(zhì)粒和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑,一個質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p35亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,另一質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p40亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種藥物組合物,它包含一種質(zhì)粒和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑,此質(zhì)粒含有編碼單鏈人IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,其中單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,它的p35亞基和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,被表達時,此單鏈蛋白能夠形成具有生物活性的IL-12分子。
      本發(fā)明涉及治療患有過敏反應(yīng)、病原感染、癌癥或自身免疫病個體的治療方法,包括給予患者一種質(zhì)粒的步驟,該質(zhì)粒含有編碼IL-12蛋白的核苷酸序列,而此序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及治療患有過敏反應(yīng)、病原感染、癌癥或自身免疫病個體的治療方法,包括給予患者一對質(zhì)粒的步驟,其中一個質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p35亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,另一質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p40亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉治療患有過敏反應(yīng)、病原感染、癌癥或自身免疫病個體的治療方法,包括給予患者一種質(zhì)粒的步驟,該質(zhì)粒含有編碼單鏈人IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,所述的單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,它的p35亞基和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,被表達時,此單鏈蛋白能夠形成具有生物活性的IL-12分子。
      本發(fā)明涉及加強或推動個體內(nèi)免疫應(yīng)答向Th1型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變的方法,它包括給予個體一種質(zhì)粒的步驟,該質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白質(zhì)的核苷酸序列,該序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種加強個體內(nèi)TH1型免疫應(yīng)答或推動個體內(nèi)的免疫應(yīng)答向TH1型轉(zhuǎn)變的方法,它包括給予個體一對質(zhì)粒的步驟,其中一個質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p35亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,另一質(zhì)粒含有編碼人IL-12蛋白p40亞基的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種加強個體內(nèi)TH1型免疫應(yīng)答或推動個體內(nèi)的免疫應(yīng)答向TH1型轉(zhuǎn)變的方法,它包括給予個體一種質(zhì)粒的步驟,該質(zhì)粒含有編碼單鏈人IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,其中單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,它的p35亞基和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,被表達時,此單鏈蛋白能夠形成具有生物活性的IL-12分子。
      本發(fā)明涉及一種重組載體,它包含編碼人IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種重組載體,它包含編碼單鏈人IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,其中單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,其p35和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,在表達時,此單鏈蛋白能夠形成生物活性IL-12分子。
      本發(fā)明涉及一種藥物組合物,它包含一種重組載體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑,所述重組載體含有編碼人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一個或多個的核苷酸序列,這些序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種藥物組合物,它包含一種重組載體和藥學(xué)上可接受的運載體或稀釋劑,所述重組載體含有編碼單鏈人IL-12蛋白的一條核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,其中單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,其p35和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,在表達時,此單鏈蛋白能夠形成生物活性IL-12分子。
      本發(fā)明涉及治療患有過敏反應(yīng)、病原感染、癌癥或自身免疫病個體的治療方法,包括給予患者一種重組載體的步驟,所述的重組載體含有編碼人IL-12蛋白的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接。
      本發(fā)明涉及治療患有過敏反應(yīng)、病原感染、癌癥或自身免疫病個體的治療方法,包括給予患者一種重組載體的步驟,所述的重組載體含有編碼單鏈人IL-12蛋白的一條核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,其中單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,它的p35亞基和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,被表達時,此單鏈蛋白能夠形成具有生物活性的IL-12分子。
      本發(fā)明涉及一種加強個體內(nèi)Th1型免疫應(yīng)答或推動免疫應(yīng)答向Th1型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變的方法,它包括給予個體一種重組載體的步驟,該重組載體含有編碼人IL-12蛋白質(zhì)的核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。
      本發(fā)明涉及一種加強個體內(nèi)TH1型免疫應(yīng)答或推動個體內(nèi)的免疫應(yīng)答向TH1型轉(zhuǎn)變的方法,它包括給予個體一種重組載體的步驟,所述的重組載體含有編碼單鏈人IL-12蛋白的一條核苷酸序列,該序列與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控序列操作性連接,其中所述的單鏈人IL-12蛋白是一種單體蛋白,它的p35亞基和p40亞基通過一接頭序列彼此連接,被表達時,單鏈蛋白能夠形成具有生物活性的IL-12分子。
      本發(fā)明提供組合物,它們含有編碼一種或多種人前炎性細胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β),Th1細胞因子(IL-12、IL-15和IL-18),和Th2細胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)蛋白的核酸序列,以此作為主要成份,還涉及用該組合物來推動或引導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法,即給予個體上述核酸分子。本發(fā)明涉及加強抗原特異性體液應(yīng)答的方法,即同時給予IL-5或IL-8和疫苗,此疫苗引入了DNA疫苗構(gòu)建物那樣的靶免疫原。本發(fā)明涉及加強抗原特異性T輔助細胞增殖的方法,即同時給予IL-2、IL-5、IL-10、IL-18、TNF-α或TNF-β和疫苗,此疫苗引入了DNA疫苗構(gòu)建物那樣的靶免疫原。本發(fā)明還涉及加強細胞毒性應(yīng)答的方法,即同時給予TNF-α或IL-5基因和疫苗,此疫苗引入DNA疫苗構(gòu)建物那樣的靶免疫原。
      本發(fā)明提供了組合物,它們包含編碼人GM-CSF的核酸分子,本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法,即給予或同時給予編碼GM-CSF的基因構(gòu)建物。本發(fā)明涉及通過同時注射GM-CSF基因和DNA疫苗構(gòu)建物增強抗原特異性抗體應(yīng)答和T輔助細胞增殖反應(yīng)的方法。
      本發(fā)明涉及基本純的BL-1及其免疫調(diào)節(jié)片段。
      本發(fā)明涉及分離的核酸分子,它們編碼BL1及其免疫調(diào)節(jié)片段。
      本發(fā)明涉及核酸探針和引物,它們特異性地針對編碼BL1或其免疫調(diào)節(jié)片段的核酸分子。
      本發(fā)明涉及寡核苷酸分子,它們由BL1編碼核苷酸序列的特異性部分的互補核苷酸序列構(gòu)成。
      本發(fā)明涉及包含編碼BL1或其免疫調(diào)節(jié)片段的核酸分子的載體。
      本發(fā)明涉及重組表達載體,它們包含編碼BL1或其免疫調(diào)節(jié)片段的核酸序列。
      本發(fā)明涉及包含重組表達載體的宿主細胞,所述的載體包含編碼BL1或其免疫調(diào)節(jié)片段的核酸序列。本發(fā)明涉及基因治療用載體,它包含編碼BL1或其免疫調(diào)節(jié)片段的核酸分子。
      本發(fā)明涉及分離的抗體,該抗體結(jié)合BL1上的特異性表位。
      本發(fā)明涉及制造BL1及其免疫調(diào)節(jié)片段的方法。
      本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)個體免疫應(yīng)答的方法,包括給予個體BL1蛋白或其免疫調(diào)節(jié)片段,或含有編碼BL1蛋白或其免疫調(diào)節(jié)片段的核苷酸序列的載體。根據(jù)本發(fā)明,含有BL1密碼序列的載體足以調(diào)節(jié)此免疫應(yīng)答。
      本發(fā)明涉及加強和引導(dǎo)個體免疫應(yīng)答的方法,包括給予個體用于傳遞免疫原和BL1蛋白或其免疫調(diào)節(jié)片段的一種疫苗組合物,或給予含有編碼BL1蛋白或其免疫調(diào)節(jié)片段的核苷酸序列的載體。根據(jù)本發(fā)明,含有BL1密碼序列的載體足以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
      附圖簡述

      圖1A和1B顯示的是實施例4得出的數(shù)據(jù)。在圖1A中,在首日肌內(nèi)注射50μg各個cDNA表達盒。免疫后第14天,收集所有接受免疫動物的脾臟并稱重。給陰性對照動物免疫。只注射Gag/Pol和只注射IL-12的小鼠的脾臟與未免疫的對照小鼠的脾臟重量相似(約100mg)。但是,注射Gag/Pol+IL-12的小鼠的脾臟其重量幾乎是對照小鼠脾臟的三倍。相反,Gag/Pol+GM-CSD免疫小鼠的脾臟不增大。在圖1B中,從各脾臟制備并純化白細胞。與它們的脾臟重量差異直接對應(yīng),Gag/Pol+IL-12免疫脾臟的細胞數(shù)量超過對照脾臟的三倍以上。Gag/Pol+GM-CSF免疫小鼠脾臟的淋巴細胞數(shù)與對照脾臟的淋巴細胞數(shù)相比沒有明顯增加。
      圖2中,在首日肌內(nèi)注射50μg各個cDNA表達盒。免疫后第14天,收獲脾臟并攝影。脾臟的外觀大小與其重量直接對應(yīng),接種了免疫原+IL-12的脾臟明顯大于未接種的對照脾臟。組別(-)未接種;IL-12接種的;空載體+IL-12接種的;Gag/Pol+IL-12接種的。
      圖3中,同時給予IL-12兩鏈中的一條。各質(zhì)粒分別使用50μg。p35和p40亞基以及Gag/Pol都是脾臟增大所必需的。
      圖4中,在首日肌內(nèi)注射50μg各個cDNA表達盒。收集免疫小鼠的抗血清,通過ELISA分析抗HIV-1抗原的特異性抗體反應(yīng)。顯示的是第28天采集的樣品的ELISA結(jié)果。當稀釋度為1∶100時,空載體+GM-CSF免疫組的抗血清表現(xiàn)出抗HIV-1 gp120蛋白的抗體反應(yīng),該反應(yīng)強于僅用空載體免疫的組。另一方面,在同樣時間后,用空載體+IL-12免疫的組表現(xiàn)出明顯較弱的體液應(yīng)答。
      圖5中,T輔助細胞的激活和增殖在誘導(dǎo)體液免疫(通過抗原激活的B細胞的擴增)反應(yīng)中起著重要作用,同時在誘導(dǎo)細胞免疫(通過CD8+細胞毒性T細胞的擴增)反應(yīng)中起著重要作用。首日肌內(nèi)注射50μg各個cDNA表達盒。收集脾臟細胞,測試T細胞的增殖。在測試板的各孔中加入20μg/ml的重組p55蛋白,用于刺激T細胞增殖。10μg/ml凝集素PHA被用作多克隆刺激物陽性對照。刺激指數(shù)為特定蛋白刺激的細胞的放射活性水平除以介質(zhì)中細胞的測得水平。PHA刺激的對照的刺激指數(shù)是58.8。
      圖6中,首日肌內(nèi)注射50μg各個cDNA表達盒。收獲脾臟,制備細胞,用這些細胞進行沒有體外刺激的CTL試驗。對照組只用IL-12基因盒免疫,結(jié)果靶細胞特異性溶解不超過背景水平。此外,只用Gag/Pol免疫,在50∶1的效∶靶比時觀察到了低水平(3%)的特異性溶解。相反,同時給予Gag/Pol+IL-12的樣品,在50∶1的效∶靶此時可看到62%的特異性裂解,當效∶靶比為12.5∶1時,經(jīng)滴定為9%。用Gag/Pol+GM-CSF質(zhì)粒免疫接種,結(jié)果無可測水平的CTL活性。用非相關(guān)性抗原表達牛痘苗制備的靶細胞,進行同樣的CTL試驗,結(jié)果沒有任何明顯的CTL反應(yīng)。
      圖7中,首日肌內(nèi)注射50μg各cDNA表達盒。收獲脾臟,制備細胞,用這些細胞進行沒有體外刺激的CTL試驗。在50∶1的效∶靶比時,只用空載體免疫和用空載體+GM-CSF免疫的動物組有低水平的特異性CTL,分別為4%和1%。另一方面,用空載體+IL-12免疫的組,發(fā)現(xiàn)其CTL活性顯著增強,達59%。用非相關(guān)性抗原表達牛痘苗制備的靶細胞,進行同樣的CTL試驗,結(jié)果沒有任何明顯的CTL反應(yīng)。
      圖8A、8B和8C顯示本發(fā)明所用的質(zhì)粒。圖8A顯示的質(zhì)粒包含IL-12單鏈蛋白的編碼序列。圖8B和圖8C顯示的質(zhì)粒各自分別含有兩亞基的編碼序列。
      圖9顯示表3。
      圖10中,各種細胞因子基因被克隆到表達質(zhì)粒中,處于CMV啟動子的控制下,并體外轉(zhuǎn)染到RD細胞內(nèi)。各種細胞因子的表達用免疫沉淀法或細胞因子ELISA來證實。
      圖11A和11B顯示檢測I類MHC限制的CTL試驗的結(jié)果。如圖11A所示,第一次DNA和pCEnv共同注射(各50μg)后2周,以同樣的劑量對小鼠(4個1組)進行加強免疫。又過1周,采集接種小鼠的脾臟,分離其淋巴細胞,用靶細胞檢測CTL反應(yīng),此靶細胞是用空載體-特定肽(RIHIGPGRAFYTTKN)制備的,據(jù)報道,該特定肽在balb/c小鼠中是I類MHC限制性的。如圖11B所示,第一次DNA和pCGag/pol共同注射(各50μg)后2周,以同樣的劑量對小鼠(4個1組)進行加強免疫。又過1周,采集免疫小鼠的脾臟,分離出淋巴細胞,測試CTL反應(yīng)。通過補體溶解去除CD8+T細胞進行CTL試驗。在CD8+T細胞存在下(上圖)和去除CD8+T細胞后(下圖)制備效應(yīng)細胞。以上實驗重復(fù)兩次,結(jié)果類似。
      圖12顯示評價直接抗原特異性CTL實驗的結(jié)果(沒有體外效應(yīng)細胞刺激)。第一次DNA和pCEnv共同注射(各50μg)后2周,以同樣的劑量對小鼠(4個1組)進行加強免疫。又過1周,采集免疫小鼠的脾臟,分離出淋巴細胞,用特異性(vMN462)和非特異性(vSC8)牛痘苗感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。以上實驗重復(fù)進行,結(jié)果類似。
      圖13概括了共同給予各種細胞因子對抗體(Y軸),T輔助細胞(X軸)和細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng)(Z軸)的作用。各種細胞因子根據(jù)其對三種免疫反應(yīng)模式的作用,繪制在3維坐標上。
      圖14顯示BL1的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
      圖15顯示BL1連接到PCR3真核表達載體內(nèi)的過程,和pBBKan載體。
      圖16顯示ELISA試驗的結(jié)果。該試驗比較了同時給予和沒有同時給予BL1時,針對HIV抗原Nef的抗HIV抗原反應(yīng)。
      圖17A、17B、17C和17D顯示試驗結(jié)果,該試驗比較了同時給予和沒有同時給予BL1時,針對HIV抗原Gag/Pol的抗HIV抗原免疫反應(yīng)。
      本發(fā)明的詳細說明本文所用術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)蛋白”指人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5和IL-10之一,和新的BL-1分子。
      本文所用術(shù)語“IL-12基因構(gòu)建物”指如下質(zhì)粒包含編碼人IL-12蛋白一個或兩個亞基和/或免疫原性靶蛋白的編碼序列,這些編碼序列與在真核細胞內(nèi)表達所需的調(diào)控元件操作性連接。DNA表達調(diào)控元件包括啟動子和聚腺苷酸化信號。此外,Kozak區(qū)等其它元件也可以包含在此基因構(gòu)建物中。起始信號和終止信號是必需的調(diào)控元件,它們常被認為屬于編碼序列。本發(fā)明基因構(gòu)建物的編碼序列包括功能性起始信號和終止信號。
      本文所用術(shù)語“所需的IL-12蛋白”指人IL-12的一個或兩個亞基,其中包括單鏈IL-12蛋白,在這種蛋白中兩亞基由一條編碼序列編碼,并表達為由一接頭序列連接兩個亞基的單鏈蛋白。
      本文所用術(shù)語“所需的蛋白”指由疫苗的編碼序列編碼的免疫原性靶蛋白,所述疫苗包含編碼免疫原性靶蛋白的核酸分子。
      本文所用術(shù)語“單鏈蛋白”和“單鏈IL-12蛋白”指如下單鏈蛋白,其中IL-12的p35亞基和p40亞基通過一段氨基酸接頭互相連接,該接頭足夠長而且足夠柔韌,允許該單鏈蛋白的兩亞基部分相互作用,形成生物活性復(fù)合體構(gòu)象,即IL-12。單鏈IL-12的功能與p35和p40組成的IL-12基本相同。本發(fā)明包括在使用IL-12的所有場合使用單鏈IL-12。此單鏈蛋白是由一條核苷酸序列編碼的。
      白細胞介素-12(IL-12)是一種異二聚體細胞因子,主要由巨噬細胞和B細胞產(chǎn)生。IL-12由稱為p35和p40的兩個不同亞基構(gòu)成,(Podlaski,F(xiàn).J.等,(1991)Arch.Biochem.Biophys.294(1)230-237,本文將其納作為參考)。
      不同的免疫應(yīng)答涉及不同的T細胞群。具體地說,有兩種不同類型的T細胞,I型T輔助細胞(Th1)和2型T細胞(Th2),它們彼此的區(qū)別在于產(chǎn)生的細胞因子。發(fā)現(xiàn)IL-12在Th1免疫應(yīng)答中起著重要作用,主要是誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1相關(guān)性干擾素-γ(IFN-γ)。它通過誘導(dǎo)和釋放包括IFN-γ在內(nèi)的多種細胞因子來激活天然殺傷細胞(NK)和T細胞。
      本發(fā)明的若干方面涉及將編碼人IL-12蛋白的核酸分子用作免疫調(diào)節(jié)劑。編碼人IL-12蛋白的核酸分子可以作為主要活性成份來傳遞,即作為基因治療、或作為疫苗組合物的一部分或結(jié)合于其中,例如包含編碼免疫原性靶蛋白核酸分子的疫苗。
      有關(guān)作為主要成份的編碼人IL-12蛋白的核酸分子的用途,本發(fā)明提供了推動免疫應(yīng)答向Th1免疫應(yīng)答發(fā)展或加強該應(yīng)答的組合物和方法,即給予個體編碼人IL-12蛋白的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的某些方面內(nèi)容,過敏疾病、病原感染、癌癥或自身免疫病患者可以通過給予如下核酸分子來治療,此核酸分子包含編碼人IL-12的核苷酸序列,該序列與在患者細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。此核酸分子被細胞攝入,編碼人IL-12的核苷酸序列得以表達。如此由細胞產(chǎn)生的人IL-12具有生物活性,而且其活性誘導(dǎo)和/或加強了患者產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。在某些較好的實施方式中,編碼人IL-12蛋白的核酸分子是質(zhì)粒。
      本發(fā)明包括編碼粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸分子的應(yīng)用,GM-CSF是一種造血生長因子,它刺激中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞和嗜酸性細胞集落的形成。它還誘導(dǎo)紅細胞系和巨核細胞祖細胞的增殖和分化。GM-CSF還提高中性粒細胞、嗜酸性細胞和巨噬細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性,但是據(jù)報道它在體內(nèi)對CTL應(yīng)答的產(chǎn)生無直接作用。本發(fā)明提供了推動免疫應(yīng)答的組合物和方法,即給予個體編碼GM-CSF的核苷酸序列的基因構(gòu)建物。此核酸分子被細胞攝入,編碼GM-CSF的核苷酸序列由此被細胞表達和產(chǎn)生。產(chǎn)生的GM-CSF具有生物活性,這種活性誘導(dǎo)和/或加強了個體的免疫反應(yīng)。在某些較好的實施方案中,編碼GM-CSF的核酸分子是質(zhì)粒。
      本發(fā)明包括作為主要成份的編碼人前炎性細胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)、Th1細胞因子(IL-2,IL-15和IL-18)和Th2細胞因子(IL-4,IL-5和IL-10)蛋白的核酸分子的用途。本發(fā)明提供了推動免疫應(yīng)答方向或加強免疫應(yīng)答的組合物和方法,即給予個體編碼人前炎性細胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)、Th1細胞因子(IL-2,IL-15和IL-18)和Th2細胞因子(IL-4,IL-5和IL-10)的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的部分內(nèi)容,患者接受給予包含以下核苷酸序列的核酸分子的治療,這些核苷酸序列編碼人前炎性細胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)、Th1細胞因子(IL-2,IL-15和IL-18)和Th2細胞因子(IL-4,IL-5和IL-10),所述核苷酸序列與在患者細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。這些核酸分子被細胞攝入,編碼上述蛋白的核苷酸序列得以表達如此由細胞產(chǎn)生的人蛋白質(zhì)具有生物活性,這種活性誘導(dǎo)和/或加強了個體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。在一些較好的實施方案中,所述的核酸分子是質(zhì)粒。
      有關(guān)作為編碼免疫原性靶蛋白的核酸分子的一部分或與之連接的編碼人IL-12蛋白的核酸分子的用途,即作為疫苗組成誘導(dǎo)抗免疫原性蛋白的免疫反應(yīng),編碼人IL-12蛋白的核酸分子可以是疫苗的成份之一,所述疫苗包括編碼免疫原性靶蛋白的核酸分子,可以是包括免疫原性靶抗原的疫苗的成份之一,或者是單獨的組合物,該組合物與含有編碼免疫原性靶蛋白的核酸分子的疫苗或包括免疫原性靶的疫苗同時給予。在一些較好的實施方案中,編碼人IL-12蛋白的核酸分子是質(zhì)粒,疫苗是包含編碼免疫原性靶蛋白質(zhì)粒的DNA疫苗。在一些較好的實施方案中,所述的DNA疫苗包含編碼免疫原性靶蛋白和人IL-12蛋白的質(zhì)粒。
      IL-12可參見1990年5月17日公開的PCT申請WO90/05147,本文將其納為參考。Wolf,S.F.等,1991,J.Immnol.146(9)3074-3081,本文將其納為參考,揭示了編碼IL-12的cDNA的核苷酸序列,和IL-12蛋白的預(yù)定氨基酸序列。天然人IL-12蛋白由p35和p40兩亞基構(gòu)成。這兩個亞基形成具有生物活性的異二聚復(fù)合體。
      根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案,編碼IL-12兩亞基的核苷酸序列可位于一個質(zhì)粒、非質(zhì)粒核酸分子或病毒或細菌基因組上,其中編碼兩亞基的核苷酸序列處于各自成套調(diào)控元件的控制之下。在一些較好的實施方案中,IL-12兩亞基的編碼序列位于一個質(zhì)粒上;各編碼序列與各自的成套調(diào)控元件操作性連接。在有些實施方案中,某免疫原性靶蛋白的編碼序列與調(diào)控元件操作性連接,與兩亞基的編碼序列位于同一質(zhì)粒上。在有些實施方案中,某免疫原性靶蛋白的編碼序列與調(diào)控元件操作性連接,位于分開的另一質(zhì)粒上,即不在含兩亞基編碼序列的質(zhì)粒上,這兩種質(zhì)粒都傳遞給同一患者。
      根據(jù)本發(fā)明的部分實施方案,編碼p35亞基的核苷酸序列位于第一質(zhì)粒上,編碼p40亞基的核苷酸序列位于第二質(zhì)粒上,兩質(zhì)粒同時注射入患者的同一部位。在有些實施方案中,與調(diào)控元件操作性連接的免疫原性靶蛋白的編碼序列與p35亞基的編碼序列位于同一質(zhì)粒上。在有些實施方案中,與調(diào)控元件操作性連接的免疫原性靶蛋白的編碼序列與p40亞基的編碼序列位于同一質(zhì)粒上。在有些實施方案中,某免疫原性靶蛋白的編碼序列與調(diào)控元件操作性連接,位于分開的另一質(zhì)粒上,即不在含兩亞基編碼序列的質(zhì)粒上,這三種質(zhì)粒同時給予同一患者。
      IL-12蛋白及其編碼核苷酸序列可以被修飾,使得兩亞基由一條核苷酸序列編碼,并表達為單鏈(融合)蛋白質(zhì)分子。根據(jù)本發(fā)明,提供了一段接頭氨基酸序列,它主要連接兩亞基,但是其柔韌性足以使得單鏈蛋白的不同部分可復(fù)合形成具有生物活性的蛋白質(zhì)。圖8A顯示了一例單鏈蛋白,其中單鏈蛋白的編碼序列處于人巨細胞病毒啟動子的調(diào)控下。此單鏈蛋白的編碼序列從5’至3’包括p35亞基的編碼序列,接頭的編碼序列和p40亞基的編碼序列,它們作為一條編碼序列。在考慮的另一種安排中,單鏈蛋白的編碼序列包括p40亞基的編碼序列,接頭的編碼序列和p35亞基的編碼序列,它們作為一條編碼序列。接頭必須具有足夠的長度和韌性,可使單體蛋白的兩個部分相對排布成為具有生物活性的復(fù)合體。
      根據(jù)本發(fā)明的部分實施方案,將編碼單鏈IL-12蛋白(兩亞基由接頭連接成單體蛋白)的核苷酸序列摻入質(zhì)粒、非質(zhì)粒核酸分子或病毒或細菌基因組內(nèi),并與在真核細胞內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接。在較好的實施方案中,編碼單鏈IL-12蛋白(兩亞基由接頭連接成單體蛋白)的核苷酸序列摻入一個質(zhì)粒中。在有些實施方案中,免疫原性靶抗原的編碼序列與調(diào)控元件操作性連接,與單鏈IL-12蛋白的編碼序列位于同一質(zhì)粒上。在有些實施例中,免疫原性靶抗原的編碼序列與調(diào)控元件操作性連接,位于分開的另一質(zhì)粒上,即不在含有單鏈蛋白編碼序列的質(zhì)粒上,這兩種質(zhì)粒都給予同一患者。
      根據(jù)本發(fā)明的部分內(nèi)容,涉及疫苗接種(尤其是DNA疫苗)的改進方法和組合物,其中編碼免疫原性靶蛋白的DNA被給予患者,該DNA被攝入患者體內(nèi)并表達,產(chǎn)生針對該免疫原的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容,編碼各種免疫調(diào)節(jié)蛋白的DNA被同時傳遞給患者,該DNA的表達產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)蛋白,該蛋白調(diào)控免疫應(yīng)答的程度和方向,以誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答,使得免疫接種經(jīng)改進后與因各種疾病而異的保護作用的關(guān)系更密切。
      已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在經(jīng)接種個體表達靶抗原的細胞內(nèi)同時產(chǎn)生IL-12蛋白出人意料地增強了針對靶抗原的免疫應(yīng)答。通過提供可表達形式的編碼IL-12蛋白的核苷酸序列,能在接種個體的細胞內(nèi)表達靶抗原而起作用的疫苗,例如DNA疫苗、重組載體疫苗和減毒疫苗,得到了改進。
      在產(chǎn)生抗原的細胞內(nèi)同時產(chǎn)生IL-12加強了針對抗原的細胞免疫力。所以,本發(fā)明提供了一種改進疫苗,即提供一段編碼IL-12的核苷酸序列,該序列與在接種者內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接,該序列作為諸如DNA疫苗、無毒重組載體疫苗和減毒活疫苗的組成部分。
      本發(fā)明通過同時傳遞編碼GM-CSF的基因構(gòu)建物誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)了免疫應(yīng)答。將GM-CSF基因與DNA疫苗構(gòu)建物共同注射,加強了抗原特異性抗體應(yīng)答和T輔助細胞增殖反應(yīng)。
      本發(fā)明通過同時傳遞編碼前炎性細胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β),Th1細胞因子(IL-2、IL-15和IL-18),和Th2細胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)的基因構(gòu)建物誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)了免疫應(yīng)答。
      本發(fā)明的某些部分通過同時傳遞IL-5或IL-18顯著加強了抗原特異性體液免疫應(yīng)答。
      本發(fā)明的某些部分通過同時傳遞IL-2、IL-15、IL-10、IL-18、TNF-α或TNF-β加強了抗原特異性T輔助細胞的增殖。
      本發(fā)明的某些部分通過同時傳遞TNF-α或IL-15基因加強了細胞毒性反應(yīng)。
      所以,當T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答是首要的應(yīng)答,而體液反應(yīng)不需要甚至是不利時,則宜將IL-12基因作為免疫調(diào)節(jié)者與特異性DNA免疫原同時遞送。另一方面,為了構(gòu)建例如針對胞外細菌的疫苗,可以同時注射以IL-4、IL-5或IL-10基因。而且,當CD4+T輔助細胞和抗體在保護作用中都起著更為重要的作用時,可以同時遞送GM-CSF和IL-12。最后,當三種免疫應(yīng)答都很重要時,可以同時注射TNF-α,以綜合加強抗體、T輔助細胞和CTL應(yīng)答。
      人IL-1α的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Telford等,(1986)Nucl.Acids.Res.149955-9963,F(xiàn)urutani等,(1985)Nucl.Acids.Res.143167-3179,March等,(1985)Nature 315641-647和登錄號Swissprot PO1583,本文將其納為參考。
      人IL-2的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Holbrook等(1984),Proc.Natl.Acad.Sci.USA811634-1638,F(xiàn)ujita等(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA807437-7441,F(xiàn)use等(1984),Nucl.Acids.Res.129323-9331,Taniguchi等(1983),Nature 302305-310,Maede等(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.1151040-1047,Devos等(1983)Nucl.Acids.Res.114307-4323和登錄號Swissprot PO1585,本文將其納為參考。
      人IL-4的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Arai等(1989),J.Immunol.142274-282,Otsuka等(1987),Nucl.Acids.Res.15333-344,Yokota等(1986),Proc.Natl.Acad.Sci.USA835894-5898,Noma等(1984),Nature319640-646,Lee等(1986),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832061-2063和登錄號Swissprot 05112(鼠IL-4的登錄號是Swissprot 07750),本文將其納為參考。
      人IL-5的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Campbell等(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846629-6633,Tanabe等(1987),J.Biol.Chem.26216580-16584,Campbell等(1988),Eur.J.BioChem.171345-352,Azuma等(1986),Nucl.Acids.Res.149149-9158,Yokota等(1986),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847388-7392和登錄號Swissprot PO5113,本文將其納為參考。
      人IL-10的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Viera等(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881172-1176和登錄號Swissprot P22301。
      人IL-15的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Grabstein等(1994),Science264965-968和登錄號Swissprot U03099,本文將其納為參考。
      人IL-18的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Ushio等(1996)J.Immunol.1564274-4279和登錄號Swissprot D49950,本文將其納為參考。
      人TNF-α的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Pennica(1984)Nature312724-729和登錄號Swissprot PO1375,本文將其納為參考。
      人TNF-β的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的,可參見Gray(1984)Nature312721-724和登錄號Swissprot PO1374,本文將其納為參考。
      有關(guān)DNA疫苗可參見美國專利5,593,972,美國專利5,589,466,PCT/US90/01515,PCT/US93/02338,PCT/US93/048131和PCT/US94/00899,以及各專利和已頒布專利申請所引用的優(yōu)先權(quán)申請,這些都被本文納為參考。除了以上專利申請中所述的傳遞方法之外,其它傳遞DAN的方法可參見美國專利4,945,050和5,036,006,,本文將其納為參考。
      本發(fā)明的一個改進涉及到除了產(chǎn)生由DNA疫苗核酸序列編碼的靶抗原之外,還含有同時產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因材料。
      本發(fā)明涉及將遺傳物質(zhì)引入個體細胞的方法,以誘導(dǎo)針對該遺傳物質(zhì)所編碼的蛋白或肽的免疫應(yīng)答反應(yīng)。所述方法包括給予所述個體組織單一核酸分子或組合物,所述的單一核酸分子包含編碼靶蛋白的核苷酸序列和編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的組合物包括兩種核酸分子,一種包含編碼靶蛋白的核苷酸序列,另一種包含編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。提供的核酸分子可以是質(zhì)粒DNA、重組載體核酸分子或減毒疫苗內(nèi)的遺傳物質(zhì)部分。
      根據(jù)本發(fā)明,所提供的是給予個體預(yù)防性和/或治療性免疫接種的組合物和方法,以抵抗某種病原或異常的疾病相關(guān)細胞。遺傳物質(zhì)編碼的靶蛋白,是與靶向的病原或細胞上的某免疫原性蛋白至少具有一個相同表位的肽或蛋白質(zhì),而且,遺傳物質(zhì)還編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白。遺傳物質(zhì)由個體的細胞表達,并作為免疫原性靶引發(fā)針對它的免疫應(yīng)答。所引發(fā)的免疫應(yīng)答與靶向的病原或細胞反應(yīng),而且具有廣泛的免疫基礎(chǔ)不僅引發(fā)體液免疫,而且引發(fā)細胞免疫應(yīng)答的輸入輸出枝。本發(fā)明的方法可用于賦予預(yù)防性或治療性免疫力。所以,免疫方法包括保護個體免受病原攻擊或避免特殊細胞出現(xiàn)或增殖的方法,以及包括治療病原感染、超增殖性疾病或自身免疫病患者的方法。
      本文所用術(shù)語“靶蛋白”指由本發(fā)明基因構(gòu)建物編碼的肽和蛋白質(zhì),它們起著引起免疫應(yīng)答的靶蛋白作用?!鞍械鞍住敝改軌蛞l(fā)針對它的免疫反應(yīng)的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白,它與免疫反應(yīng)所針對的病原或不良類型細胞(例如癌細胞或與自身免疫病有關(guān)的細胞)的蛋白至少具有一個相同表位。針對靶蛋白的免疫反應(yīng)將為個體提供保護和治療以抵御與靶蛋白有關(guān)的特定感染或疾病。靶蛋白不一定與所需免疫反應(yīng)所針對的蛋白完全相同。但是,靶蛋白必須能夠誘導(dǎo)與所需免疫應(yīng)答所針對的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答。
      本發(fā)明可用于引發(fā)針對某靶蛋白(即與病原體或個體自身的“異常”細胞特異性相關(guān)的蛋白)的廣泛免疫應(yīng)答。本發(fā)明可用于免疫個體以抵抗病原性物質(zhì)和生物,由此,針對某病原蛋白的免疫應(yīng)答提供了抵抗該病原的保護性免疫力。本發(fā)明可用于抵抗超增殖性疾病和紊亂(例如癌癥),即引發(fā)針對與超增殖細胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明可用于抵抗自身免疫病和紊亂,即引發(fā)針對與參與自身免疫狀態(tài)的細胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答。
      根據(jù)本發(fā)明,編碼靶蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白的DNA或RNA被引入個體的組織細胞中,并表達,由此產(chǎn)生靶蛋白。編碼靶蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白的DNA或RNA序列與在個體的細胞內(nèi)表達所必須的調(diào)控元件相連接。DNA表達所需的調(diào)控元件包括啟動子和聚腺苷酸化信號。此外,此基因構(gòu)建物中還可包含諸如Kozak區(qū)之類的其它元件。
      本文所用術(shù)語“可表達形式”,指這樣的基因構(gòu)建物,它包含與靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼序列操作性連接的必需的調(diào)控元件,從而能夠在個體的細胞內(nèi)表達編碼序列。
      本文所用術(shù)語“有一個相同的表位”指某些蛋白質(zhì)含有與另一蛋白的表位至少一個完全相同或基本相似的表位。
      本文所用術(shù)語“基本相似表位”在此表示所述表位所具有的結(jié)構(gòu)與某蛋白的某表位不完全相同,但是能夠引發(fā)與該蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的細胞或體液免疫反應(yīng)。
      基因構(gòu)建物包含一段核苷酸序列,它編碼靶蛋白和/或免疫調(diào)節(jié)蛋白,該序列與基因表達所需的調(diào)控元件操作性連接。根據(jù)本發(fā)明,還提供基因構(gòu)建物的組合,即其中之一包含可表達形式的編碼靶蛋白的核苷酸序列,另一構(gòu)建物則包含可表達形式的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。將包含基因構(gòu)建物組合的DNA或RNA分子引入活細胞,使DNA或RNA得以表達,并產(chǎn)生靶蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)果產(chǎn)生針對靶蛋白的加強免疫應(yīng)答。
      當遺傳構(gòu)建物被細胞攝取時,它們留在細胞內(nèi)作為功能性的染色體外分子,和/或整合到細胞的染色體DNA中??梢詫NA以質(zhì)粒形式作為單獨的遺傳物質(zhì)引入細胞?;蛘撸蓪⒛軌蚺c染色體整合的線性DNA引入細胞。在將DNA引入細胞時,可以加入促進DNA整合到染色體中的反應(yīng)試劑。也可以在DNA分子內(nèi)包含促進整合的DNA序列?;蛘?,可以將RNA引入細胞。也可以考慮提供一種線性小染色體,它具有著絲粒、端粒和復(fù)制起始位點?;驑?gòu)建物可以作為遺傳物質(zhì)部分留存在生活于細胞內(nèi)的減毒活微生物或重組微生物載體內(nèi)?;驑?gòu)建物可以是重組病毒疫苗的基因組部分,此時,遺傳物質(zhì)或者整合到細胞染色體內(nèi),或者留存在染色體外。
      遺傳構(gòu)建物包括核酸分子基因表達所必需的調(diào)控元件。這些元件包括啟動子、起始密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號。此外,為了表達編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因,常需要加強子。這些元件必須與編碼所需蛋白的序列操作性連接,而且這些調(diào)控元件必須在所給予的個體內(nèi)有效。
      起始密碼子和終止密碼子一般認為應(yīng)包含在編碼所需蛋白的核苷酸序列內(nèi)。但是,這些元件在給予基因構(gòu)建物的個體內(nèi)應(yīng)是有功能的。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列在同一讀碼框內(nèi)。
      所用的啟動子和聚腺苷酸化信號在個體的細胞內(nèi)必須是有功能的。
      可用于實施本發(fā)明,尤其是用于產(chǎn)生人用基因疫苗的啟動子實例包括但不限于猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)的啟動子如HIV長末端重復(fù)啟動子、Moloney病毒啟動子、ALV啟動子、巨噬細胞病毒(CMV)的啟動子例如CMV中早期啟動子、EB病毒的啟動子、羅絲肉瘤病毒(RSV)的啟動子和例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸、人金屬硫蛋白等人基因的啟動子。
      可用于實施本發(fā)明,尤其是用于生產(chǎn)人用基因疫苗的聚腺苷酸化信號的實例包括但不限于SV40聚腺苷酸化信號和LTR聚腺苷酸化信號。需指出的是,本發(fā)明使用的是位于pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen,San Diego CA)內(nèi)的SV40聚腺苷酸化信號,文中稱為SV40聚腺苷酸化信號。
      除了DNA表達必需的調(diào)控元件外,DNA分子內(nèi)可以包含其它元件。這些其它元件包括加強子。加強子可以選自但不限于人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和諸如CMV、RSV和EBV等病毒的加強子。
      為了使構(gòu)建物保留在染色體外和在細胞內(nèi)產(chǎn)生構(gòu)建物的多份拷貝,可以提供具有哺乳動物復(fù)制起始位點的遺傳構(gòu)建物。Invitrogen(San Diego CA)的質(zhì)粒pCEP4和pREP4含有EB病毒復(fù)制起始位點和編碼核抗原EBNA-1的區(qū)域,它們產(chǎn)生高拷貝游離復(fù)制產(chǎn)物而不整合。
      在有關(guān)免疫接種應(yīng)用的較好實施方案中,被傳遞的核酸分子包括編碼靶蛋白、IL-12蛋白和進一步加強抗靶蛋白免疫應(yīng)答的其它蛋白的基因的核苷酸序列。例如編碼細胞因子和淋巴因子的基因,所述的因子例如α干擾素、γ干擾素、血小板生長因子(PDGF)、G-CSF、GM-CSF、TNF、上皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2。在有些實施方案中,用于免疫接種組合物的遺傳構(gòu)建物中宜包含GM-CSF的基因。
      如果出于某種理由需要消滅接受該遺傳構(gòu)建物的細胞,可以加入作為細胞解離靶子的其它元件。可以在遺傳構(gòu)建物中包含可表達形式的皰疹胸腺嘧啶激酶(tk)基因。可以給予個體藥物gangcyclovir,該藥將選擇性地殺滅所有產(chǎn)生tk的細胞,由此提供了選擇性破壞具有遺傳構(gòu)建物的細胞的方法。
      為了盡可能擴大蛋白質(zhì)的生產(chǎn),可以選擇調(diào)控序列使得它們適合于在給予構(gòu)建物的細胞內(nèi)表達基因。而且,可以選用在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄效率最高的密碼子。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠制造在細胞內(nèi)具有功能的DNA構(gòu)建物。
      兩類骨架的實例包括一類用于雙質(zhì)粒系統(tǒng),一類用于單質(zhì)粒系統(tǒng)。在雙質(zhì)粒系統(tǒng)內(nèi),一個質(zhì)粒具有可表達形式的靶蛋白編碼序列,另一質(zhì)粒具有可表達形式的IL-12編碼序列。在單質(zhì)粒系統(tǒng)內(nèi),同一質(zhì)粒同時包含了可表達形式的靶蛋白編碼序列和IL-12編碼序列。
      本發(fā)明方法的步驟包括將核酸分子給予個體的組織。在某些較好的實施方案中,核酸分子的給藥途徑是肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、通過氣霧途徑給予肺組織或通過局部使用或灌洗給予粘膜組織,所述粘膜組織選擇陰道、直腸、尿道口腔頰部和舌下。
      在有些實施方案中,核酸分子與促進劑(facilitator)一起傳遞給細胞。促進劑又稱多核苷酸功能加強子或基因疫苗促進劑。有關(guān)促進劑可參見1993年1月26日提交的美國專利申請08/008,342,1993年3月11日提交的美國專利申請08/029,336,1997年1月14日提交的美國專利5,593,972和1994年1月26日提交的國際專利申請PCT/US94/00899,以上均被本文納為參考。此外,促進劑還可參見1995年9月28日提交的PCT/US95/12502和1995年3月30日提交的PCT/US95/04071,以上均被本文納為參考。與核酸分子聯(lián)用的促進劑可以與核酸分子混合給予,或者在給予核酸分子的同時、之前或之后分開給予。此外,具有轉(zhuǎn)染劑和/或復(fù)制劑和/或促炎劑作用的其它物質(zhì),和可以在有或沒有促進劑存在下同時給予的其它物質(zhì)包括生長因子、細胞因子和淋巴因子,例如α干擾素、γ干擾素、血小板生長因子(PDGF)、G-CSF、GM-CSF、TNF、上皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和B7.2,以及成纖維細胞生長因子,免疫刺激性復(fù)合物(ISCOMS)之類表面活性劑,弗氏不完全佐劑,LPS同類物(包括單磷酸脂A),胞壁酰肽,醌同類物和諸如角鯊烯和角鯊烯之類的泡囊,和透明質(zhì)酸。
      在較好的實施方案中,本發(fā)明遺傳構(gòu)建物與選自以下組別的促進劑配制在一起或聯(lián)用苯甲酸酯、脒、氨甲酸乙酯及其鹽酸鹽,例如局部麻醉劑家族的那些。
      部分優(yōu)選實施方案中的促進劑可以是具有以下結(jié)構(gòu)之一的化合物Ar-R1-O-R2-R3或Ar-N-R1-R2-R3或R4-N-R5-R6或R4-O-R1-N-R7其中,Ar是苯、對氨基苯、間氨基苯、鄰氨基苯、取代苯、取代對氨基苯、取代間氨基苯、取代鄰氨基苯,氨基苯化合物中的氨基可以是氨基、C1-C5烷基胺、C1-C5、C1-C5二烷基胺,取代化合物中的取代基可以是鹵素、C1-C5烷基和C1-C5烷氧基;R1是C=O;R2是C1-C10烷基,包括支鏈烷基;R3是氫原子、胺、C1-C5烷基胺、C1-C5、C1-C5二烷基胺;R2可能與R3形成一個環(huán)烷基,一個C1-C10烷基取代的環(huán)烷基,環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán));R4是Ar、R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基,環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán));R5是C=NH;
      R6是Ar、R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基,環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán));R7是Ar、R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基,環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán));酯的實例包括苯甲酸酯,例如哌羅卡因、美普卡因和異布卡因;對氨基苯甲酸酯,包括普魯卡因、丁卡因、丁胺卡因、丙氧卡因和氯普魯卡因;間氨基苯甲酸酯,例如美布他明和primacaine;和對乙氧基苯甲酸酯,例如對乙氧卡因。苯胺的實例包括利多卡因、依替卡因、甲哌卡因、布吡卡因、吡咯卡因和丙胺卡因。此類化合物的其它實例包括辛可卡因、苯佐卡因、達克羅寧、普莫卡因、丙美卡因、布它卡因、奧布卡因、卡波卡因、甲基布吡卡因、Butasin picrate、非那卡因、Diothan、Luccaine、Intracaine、Nupercaine、美布卡因、匹多卡因、珍尼柳酯和植物源二環(huán)化合物,例如可卡因、肉桂??煽ㄒ?、吐昔林和cocaethlene,以及所有以上化合物與鹽酸的復(fù)合物。
      在優(yōu)選實施方案中,促進劑是布吡卡因。布吡卡因與甲哌卡因的區(qū)別在于以N-丁基取代了甲哌卡因的N-甲基?;衔镌贜位可能具有C1-C10?;衔锟梢喳u素取代,例如普魯卡因和氯普魯卡因。較好的是苯胺。
      促進劑在基因構(gòu)建物之前、同時或之后給予。可以將促進劑與遺傳構(gòu)建物配制在同一組合物中。
      布吡卡因-鹽酸的化學(xué)名稱是2-哌啶甲酰胺(2-piperidinecarboxamide),1-丁基-N-(2,6-二甲基苯)-一鹽酸,一水合物,其市場來源廣泛,包括AstraPharmaceutical Product Inc.(Westboro,MA)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(New York,NY),Eastman Kodak(Rochester,NY),被用于制藥。市售的布吡卡因有時與羥苯甲酸甲酯和腎上腺素配制在一起,有時則不。以上所述的制劑均可使用。購來用于制藥的濃度為0.25%,0.5%和0.75%,這些可用于本發(fā)明。如需要可以制成引發(fā)所需效果的其它濃度,尤其是0.05%至1.0%之間的濃度。根據(jù)本發(fā)明,給予約250g至10mg布吡卡因。在有些實施方案中,給予250g至7.5mg。在有些實施方案中,給予0.05mg至5.0mg。在有些實施方案中,給予0.5mg至3.0mg。在有些實施方案中,給予5至50g。例如,在有些實施方案中,在給予疫苗之前、同時或之后,在同一部位給予配制在同一等滲藥用載體內(nèi)的50μl至2ml,較好的是50μl至1500μl,更好的是約1ml布吡卡因-鹽酸的0.25-0.50%溶液和0.1羥苯甲酸甲酯。在有些實施方案中,在給予疫苗之前、同時或之后,在同一部位給予配制在等滲藥用載體內(nèi)的50μl至2ml,較好的是50μl至1500μl,更好的是約1ml布吡卡因-鹽酸的0.25-0.50%溶液??梢越o予布吡卡因和任何其它作用類似的化合物,尤其是相關(guān)的局部麻醉劑家族中的那些化合物,其濃度應(yīng)能夠有效促進細胞攝入遺傳構(gòu)建物。
      在本發(fā)明的有些實施方案中,在給予遺傳構(gòu)建物之前,個體先接受促進劑注射。例如,在給予遺傳構(gòu)建物之前約1周至10天時間,先給個體注射促進劑。在有些實施方案中,在給予遺傳構(gòu)建物約1至5天前,有時是24小時之前和之后給個體注射促進劑。或者,只要被使用,促進劑可以在給予遺傳構(gòu)建物的同時、幾分鐘前或之后給予。所以,可將促進劑與遺傳構(gòu)建物合并在一個藥物組合物中。
      在有些實施方案中,給予遺傳構(gòu)建物而不給予促進劑,即使用不含促進劑的制劑,所用的給藥方法為不將遺傳構(gòu)建物與促進劑聯(lián)用。
      本發(fā)明中傳遞給細胞的核酸分子可以作為蛋白質(zhì)的遺傳模板,所述蛋白用作預(yù)防性和/或治療性免疫接種劑。在較好的實施方案中,核酸分子包含在動物細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯所述蛋白編碼區(qū)必需的調(diào)控序列。
      本發(fā)明可用于免疫接種個體以抵抗病原,例如病毒、原核生物和病原性真核生物,例如單細胞病原生物和多細胞寄生物。本發(fā)明特別適用于免疫接種個體以抵抗感染細胞的病原和無包被(not encapculated)病原,例如病毒、淋病、李司忒菌屬和志賀菌屬等原核生物。此外,本發(fā)明還可用于免疫接種個體以抵抗病原體,這些病原體在其生命周期內(nèi)有一階段是胞內(nèi)病原。本文所用術(shù)語“胞內(nèi)病原體”指這樣的病毒或病原生物,其繁殖或生命周期中至少部分存在于宿主細胞內(nèi),并由此產(chǎn)生或?qū)е庐a(chǎn)生病原蛋白。表1列出了根據(jù)本發(fā)明可制備針對性疫苗的某些病毒科和屬。在疫苗中可使用這樣的DNA構(gòu)建物,它們所含DNA序列編碼的多肽具有至少一個表位與表中病原抗原上的表位相同或基本相似。而且,本發(fā)明還可用于免疫個體以抵抗其它病原體,包括原核和真核的原蟲病原,以及多細胞寄生物,例如表2所列的那些。
      為了生產(chǎn)提供抗病原感染保護作用的基因疫苗,必需在基因構(gòu)建物中包括編碼免疫原性蛋白(作為靶蛋白)的基因編碼序列,所述的蛋白能夠引起針對它的保護性免疫應(yīng)答。不論病原是胞內(nèi)感染(對此,本發(fā)明尤其適用)還是胞外感染,不可能所有的病原性抗原都引發(fā)保護性應(yīng)答。因為DNA和RNA都較小,而且較容易生產(chǎn),本發(fā)明還提供了多價病原性抗原免疫接種的額外優(yōu)點。用于基因疫苗的基因構(gòu)建物可以包括編碼多種病原性抗原的基因物質(zhì)。例如,可將數(shù)個病毒基因包括在一個構(gòu)建物中,由此提供了多種靶標。
      表1和表2列出了部分病原性因子或生物的名單,可以制備針對它們的基因疫苗以保護個體避免被它們所感染。在某些優(yōu)選實施方案中,免疫個體抵抗病原的方法針對的是HIV、HTLV或HBV。
      本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了一種給予基礎(chǔ)廣泛的保護性免疫應(yīng)答來抵抗以超增殖性疾病為特征的超增殖性細胞的方法,還涉及治療超增殖性疾病患者的方法。術(shù)語“超增殖性疾病”指以細胞的超增殖為特征的疾病或紊亂。超增殖性疾病的例子包括各種形式的癌癥和牛皮癬。
      已經(jīng)發(fā)現(xiàn),將包含編碼免疫原性“超增殖細胞”相關(guān)蛋白核苷酸序列的基因構(gòu)建物引入個體細胞,結(jié)果在個體的受免疫細胞內(nèi)生成了這些蛋白。術(shù)語“超增殖性蛋白”指與超增殖性疾病相關(guān)的蛋白。為了用于抗超增殖性疾病免疫接種,需給予個體包含編碼超增殖性疾病相關(guān)蛋白核苷酸序列的基因構(gòu)建物。
      為了使超增殖相關(guān)蛋白成為有效的靶免疫原,該蛋白必需只在超增殖細胞內(nèi)產(chǎn)生,或在超增殖細胞內(nèi)的產(chǎn)生水平高于正常細胞。靶抗原包括這樣的蛋白、其片段和肽,至少包含一個上述蛋白中的表位。有時,超增殖相關(guān)蛋白是編碼某蛋白的基團發(fā)生突變的產(chǎn)物。突變基因編碼的蛋白與正常蛋白幾乎相同,僅因細微的氨基酸序列差異產(chǎn)生了一個正常蛋白上沒有的表位。這樣的靶蛋白包括由諸如myb,myc,fyn之類致癌基因和轉(zhuǎn)位基因bcr/abl,ras,src,p53,neu,trk編碼的蛋白和EGRF。除了作為靶抗原的癌基因產(chǎn)物之外,用于抗癌治療和保護性治療的靶蛋白還包括B細胞淋巴瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)和T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區(qū),它們在一些實施例中也用作靶抗原來治療自身免疫病。還可以使用其它腫瘤相關(guān)蛋白作為靶蛋白,例如在腫瘤細胞內(nèi)含量很高的蛋白,包括單克隆抗體17-1A識別的蛋白和葉酸結(jié)合蛋白。
      雖然本發(fā)明可用于免疫個體以抵抗一種或多種形式的癌癥,本發(fā)明尤其適用于對個體進行預(yù)防性免疫接種,所述個體具有發(fā)展成某種癌癥的傾向或曾經(jīng)患有癌癥因而懷疑復(fù)發(fā)。遺傳學(xué)和基因技術(shù)以及流行病學(xué)的發(fā)展使得確定個體發(fā)生癌癥的可能性和進行這方面的風險評估成為可能。采用遺傳篩選和/或家族健康史,有可能預(yù)測某個體發(fā)生數(shù)種癌癥中任何一種的可能性。
      相類似的,那些已經(jīng)患上了癌癥的個體和接受治療去除癌癥的或處于緩解期的個體尤其易于復(fù)發(fā)。作為治療方法的組成部分,為了戰(zhàn)勝復(fù)發(fā),可以針對已確診的癌癥對個體進行免疫接種。這樣,一旦得知某個體曾患有某種癌癥并有復(fù)發(fā)的危險,他們可以經(jīng)免疫接種使得免疫系統(tǒng)作好準備以抵抗任何將出現(xiàn)的癌癥。
      本發(fā)明提供了一種治療超增殖性疾病患者的方法。在這種方法中,引入基因構(gòu)建物起著免疫治療的作用,即引導(dǎo)和促進個體的免疫系統(tǒng)抵抗產(chǎn)生靶蛋白的超增殖細胞。
      本發(fā)明提供了治療自身免疫病患者的方法,即提供基礎(chǔ)廣泛的保護性免疫應(yīng)答,抵抗與自身免疫相關(guān)的靶抗原,它包括細胞受體和產(chǎn)生針對“自身”的(self-derected)抗體的細胞。
      T細胞介導(dǎo)的自身免疫病包括類風濕關(guān)節(jié)炎(RA),多發(fā)性硬化癥(MS),Sjogren綜合征,肉樣瘤病,胰島素依賴性糖尿病(IDDM),自身免疫甲狀腺炎,反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎,僵硬性脊椎炎,硬皮病,多肌炎,皮肌炎,牛皮癬,脈管炎,韋格納氏肉芽腫病,節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎。上述疾病的特征均在于T細胞受體結(jié)合內(nèi)源性抗原,由此引發(fā)與自身免疫病有關(guān)的炎性級聯(lián)反應(yīng)。針對T細胞可變區(qū)的免疫接種將引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答,消滅那些T細胞。
      就RA而言,已經(jīng)特性描述了數(shù)種參與該疾病的T細胞受體(TCR)的特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-3,Vβ-14,Vβ-17和Vα-17。這樣,用編碼至少一個以上蛋白的DNA構(gòu)建物免疫接種,將引發(fā)針對參與RA的T細胞的免疫應(yīng)答。參見Howell,M.D.等,1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810921-10925;Paliard,X.等,1991 Science 253,325-329;Williams.W.C.等1992.J.Clin.Invest.90326-333;以上均被本文納為參考。
      就MS而言,已經(jīng)特性描述了數(shù)種參與該疾病TCR的特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-7和Vα-10。這樣,用編碼至少一個以上蛋白的DNA構(gòu)建物免疫接種,將引發(fā)針對參與MS的T細胞的免疫應(yīng)答。參見Wucherpfennig,K.W.等,1990 Science2481016-1019;Oksenberg,J.R.等,1990 Nature 345344-346;以上均被本文納為參考。
      就硬皮病而言,已經(jīng)特性描述了數(shù)種參與該疾病TCR的特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-6,Vβ-8,Vβ-14和Vα-16,Vα-3C,Vα-7,Vα-14,Vα-15,Vα-16,Vα-28和Vα-12。這樣,用編碼至少一個以上蛋白的DNA構(gòu)建物免疫接種,將引發(fā)針對參與硬皮病的T細胞的免疫應(yīng)答。
      為了治療T細胞介導(dǎo)的自身免疫病患者,尤其是TCR可變區(qū)尚待特性分析的疾病患者,可以進行滑液活檢??梢蕴崛『蠺細胞的樣品,用標準技術(shù)鑒定其TCR的可變區(qū)。利用以上信息就可以制備基因疫苗。
      B細胞介導(dǎo)的自身免疫病包括狼瘡(SLE),格雷夫斯病,重癥肌無力,自身免疫溶血性貧血,自身免疫血小板減少癥,哮喘,冷球蛋白血癥原發(fā)性膽管硬化和惡性貧血。上述疾病的特征均在于抗體結(jié)合內(nèi)源抗原,并引發(fā)與自身免疫病相關(guān)的炎性級聯(lián)反應(yīng)。用針對這些抗體的可變區(qū)疫苗免疫將引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答,由此消滅產(chǎn)生這些抗體的B細胞。
      為了治療B細胞介導(dǎo)的自身免疫病患者,必需鑒定出參與自身免疫活性的那些抗體的可變區(qū)??梢赃M行活檢,獲取炎癥部位的抗體樣品。用標準技術(shù)鑒定這些抗體的可變區(qū)。利用這一信息就可以制備出基因疫苗。
      以SLE為例,某抗原被認為是DNA。這樣,可以對接受抗SLE免疫的患者的血清篩選抗DAN抗體,然后制備出包括編碼血清中抗DNA抗體可變區(qū)的DNA構(gòu)建物的疫苗。
      TCR和抗體的可變區(qū)的一般結(jié)構(gòu)特征是眾所周知的。一般可用已知技術(shù)來找到編碼特定TCR或抗體的DNA序列,所述技術(shù)可參見Kabat等,1987,Sequenceof Proteins of Immunological Interest U.S.Department of Health and Human Services,Bethesda MD,本文將其納為參考。此外,克隆抗體的功能性可變區(qū)的常用方法可參見Chaudhary,V.K.等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871066,本文將其納為參考。
      除利用可表達形式的免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼序列來改進基因疫苗外,本發(fā)明還涉及改進的減毒活疫苗和利用重組載體傳遞編碼抗原的外源基因的改良疫苗。減毒活疫苗和利用重組載體傳遞外源抗原的疫苗的實例可參見美國專利4,722,848;5,017,487;5,077,044;5,110,587;5,112,749;5,174,993;5,223,424;5,225,336;5,240,703;5,242,829;5,294,441;5,294,548;5,310,668;5,387,744;5,389,368;5,424,065;5,451,499;5,453,364;5,462,734;5,470,734和5,482,713,以上均被本文納為參考。本發(fā)明提供的基因構(gòu)建物包括編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述序列與可在受接種者體內(nèi)發(fā)揮功能以有效表達的調(diào)控序列操作性連接。將基因構(gòu)建物摻入減毒活疫苗和重組疫苗中,產(chǎn)生本發(fā)明所述的改進疫苗。
      本發(fā)明提供了一種免疫接種個體的改良方法,它包括將基因構(gòu)建物作為疫苗組合物的組成部分傳遞給個體的細胞,所述的疫苗組合物包括DNA疫苗,減毒活疫苗和重組疫苗。基因構(gòu)建物包括編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白并與可在受免疫者體內(nèi)發(fā)揮功能引發(fā)表達的調(diào)控序列操作性連接。改良的疫苗可產(chǎn)生加強的細胞免疫反應(yīng)。
      在本發(fā)明的部分內(nèi)容中,編碼人免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸分子是作為治療基因傳遞的,即不同時給予靶免疫原或編碼免疫原性靶蛋白的核酸分子。這種基因療法由于推動免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白的功能而引起。
      作為治療基因而傳遞的基因構(gòu)建物是編碼人IL-12的核酸分子,這樣的基因構(gòu)建物以質(zhì)粒為佳。也可考慮其它基于核酸的載體,例如重組病毒、重組微生物和線性核酸分子,這些對于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來說都是熟知的。用來給予個體,將攝入個體組織并表達的質(zhì)粒是眾所周知的??紤]到的重組載體包括重組牛痘病毒載體,重組腺病毒載體和重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體??紤]到的重組微生物包括重組BCG載體和重組沙門菌載體??蓪⒕€性核酸分子和質(zhì)粒DNA分子包裹在微球體和脂質(zhì)體內(nèi)。
      在某些優(yōu)選實施方案中,編碼人免疫調(diào)節(jié)蛋白的質(zhì)粒是如前所述的基因構(gòu)建物。從本質(zhì)上說,可以將同樣的組合物和方法用于基因治療,(所述的基因編碼人免疫調(diào)節(jié)蛋白),如同包含編碼人免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因構(gòu)建物的基團免疫組合物和方法所述的那樣,其區(qū)別在于基因治療組合物不包括免疫靶蛋白的編碼序列。本發(fā)明公開的內(nèi)容旨在參照上述基因構(gòu)建物說明編碼人免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因治療。將用上述基因構(gòu)建物來說明基因治療,所述構(gòu)建物包括編碼人免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,該序列與在個體內(nèi)表達所必需的調(diào)控元件操作性連接??蓪⑦@樣的構(gòu)建物給予個體來改變和/或推動免疫應(yīng)答。
      例如,可以傳遞IL-12來治療過敏、癌癥、自身免疫病或感染患者。編碼IL-12的基因構(gòu)建物與或不與促進劑一起給予。在某些實施方案中,該基因構(gòu)建物是與一種或多種前述促進劑聯(lián)用的。在部分實施方案中,此基因構(gòu)建物單獨傳遞,不含任何促進劑。在某些優(yōu)選實施方案中,編碼IL-12的基因不與任何促進劑在一起。在部分實施方案中,此基因構(gòu)建物是利用無針注射器給予的。在某些實施方案中,編碼IL-12的基因是利用微粒來傳遞的。部分實施方案中,編碼IL-12的基因在傳遞時無任何固體粒子。
      本發(fā)明所述的藥物組合物,即基因疫苗或基因治療組合物,包含1ng至1000μg的DNA。在某些優(yōu)選實施方案中,該組合物包含10ng至約800μg的DNA。在某些優(yōu)選實施方案中,該組合物包含0.1至500μg的DNA。在部分優(yōu)選實施方案中,該組合物包含1至350μg的DNA。在某些優(yōu)選實施方案中,該組合物包含25至250μg的DAN。在某些優(yōu)選實施方案中,該組合物包含約100μg的DNA。
      本發(fā)明藥物組合物是根據(jù)給藥方式來配制的。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可方便地配制出包含基因構(gòu)建物的藥物組合物。如果選用肌內(nèi)注射來給藥,宜使用等滲制劑。一般說來,用于調(diào)節(jié)滲透壓的添加劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。有時,以使用磷酸鹽緩沖液之類的等滲溶液為宜。穩(wěn)定劑有明膠和白蛋白。在某些實施方案中,制劑中加有血管收縮藥。本發(fā)明藥物制品無菌而且無熱原。
      本發(fā)明方法可用于人和獸。所以,本發(fā)明涉及給哺乳動物、鳥類和魚類的基因免疫。本發(fā)明方法特別適用于包括人、牛、綿羊、豬、馬、狗和貓在內(nèi)的哺乳動物。
      本發(fā)明揭示了一種新的免疫調(diào)節(jié)劑,人BL1。其DNA序列和預(yù)計的氨基酸序列見圖14。該蛋白及其片段與將免疫原引入個體的疫苗組合物同時使用時能加強免疫應(yīng)答。術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)性片段”指BL1的片段,它比圖14中的全長序列短,但保留了全長化合物的免疫調(diào)節(jié)活性。根據(jù)本發(fā)明,BL1基因序列的傳遞將產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。在某些實例中,雖然沒有測得蛋白質(zhì)的表達,但是免疫應(yīng)答仍然受到共傳遞的影響,這表明傳遞BL1 DNA是調(diào)節(jié)和引導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟。如前所述,本發(fā)明公開內(nèi)容旨在揭示BL1 DNA在不考慮蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)性組合物和方法中的用途。因此,本發(fā)明公開內(nèi)容涉及采用BL1 DNA和包含它的載體作為免疫調(diào)節(jié)劑,和在免疫調(diào)節(jié)組合物中作為主要活性藥物或作為與免疫原或編碼免疫原的DNA聯(lián)用的輔劑,用于操縱和引導(dǎo)免疫應(yīng)答。
      BL1 DNA編碼的蛋白可以分離和純化;可以產(chǎn)生結(jié)合該蛋白抗體的雜交瘤;編碼該蛋白的cDNA先被分離、測序、摻入到包括表達載體的載體中,這些載體被引入宿主細胞然后重組表達蛋白。將編碼免疫原的載體與上述載體共給予將加強抗該免疫原的免疫應(yīng)答。
      BL1的發(fā)現(xiàn)為設(shè)計和應(yīng)用加強、推動和引導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗方案提供了手段。
      分離編碼BL1的cDNA可用作起始材料來構(gòu)建能夠產(chǎn)生BL1或其免疫調(diào)節(jié)性片段的重組表達載體。將該cDNA導(dǎo)入到包括表達載體的載體內(nèi),將載體引入宿主細胞,然后重組表達該蛋白。可將核酸分子或其片段用作探針來檢測BL1編碼序列的存在。這類探針特異性地與BL1編碼序列雜交。術(shù)語“特異性BL1序列”在此指BL1特有的序列。所含核苷酸序列與編碼BL1的cDNA特異性片段互補的核酸分子可用作反義分子和引物來分別抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄和擴增遺傳序列。
      BL1由圖14中的cDNA編碼,并具有圖14中的預(yù)定氨基酸序列。BL1編碼序列可常規(guī)合成,BL1蛋白可用重組DNA方法來生產(chǎn)或用標準蛋白質(zhì)合成技術(shù)來合成。
      采用標準技術(shù)和容易得到的起始材料,可以制備出編碼BL1的核酸分子。本發(fā)明涉及包含編碼BL1核苷酸序列的分離的核酸分子。本發(fā)明涉及包含編碼圖14中氨基酸序列或其免疫調(diào)節(jié)性片段的核苷酸序列的分離的核酸分子。在部分實施方案中,該核酸分子由編碼BL1的核苷酸序列構(gòu)成。在部分實施方案中,該核酸分子包含圖14編碼序列的核苷酸序列。在某些實施方案中,該核酸分子由圖14中的核苷酸序列構(gòu)成。本發(fā)明的分離核酸分子可用于制備構(gòu)建物和重組表達載體。
      BL1的特異性探針或引物具有至少16個核苷酸,以至少24個為宜。這些探針或引物通過標準雜交技術(shù)用于篩選cDNA文庫。
      編碼BL1的cDNA可用來設(shè)計PCR引物,用于擴增核酸序列。PCR技術(shù)為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所常用,它在診斷方面的應(yīng)用是眾所周知而且得到了認可的。實施PCR技術(shù)的方法參見“PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplication”,Innis,M.A.等編輯,Academic Press Inc.,San Diego,CA(1990),本文將其納為參考。PCR技術(shù)的應(yīng)用參見“聚合酶鏈反應(yīng)”Erlich,H.A.等編輯,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(1989),本文將其納為參考。
      有些簡單的規(guī)則有助于設(shè)計出有效的引物。典型的引物長18-28個核苷酸,g+c組成占50%至60%。最好,整個引物都與它必需與之雜交的序列互補。較好的是,引物產(chǎn)生100至200堿基對的PCR產(chǎn)物。但是,有可能產(chǎn)生50堿基對至10kd或更長的產(chǎn)物。
      PCR技術(shù)能夠迅速產(chǎn)生核酸序列的多份拷貝,它是通過提供與一個核酸分子中的序列雜交的5’端和3’端引物,并提供游離核苷酸和酶,該酶用游離核苷酸填入與兩引物之間核苷酸序列互補的堿基,由此產(chǎn)生DNA的互補鏈。該酶將填充引物毗鄰的互補序列。如果5’端和3’端的引物都與核酸分子同一片段互補鏈上的核苷酸序列雜交,結(jié)果是特定雙鏈產(chǎn)物的指數(shù)擴增。如果只有一條引物與核酸分子雜交,線性擴增將產(chǎn)生不同長度的單鏈產(chǎn)物。
      本發(fā)明涉及包含編碼BL1核苷酸序列的載體或重組表達載體,BL1具有圖14的氨基酸序列。術(shù)語“重組表達載體”在此指這樣的質(zhì)粒、噬菌體、病毒顆?;蚱渌d體,它們含有被引入合適的宿主后引導(dǎo)BL1編碼序列表達所必需的遺傳元件。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可用標準技術(shù)和容易得到的起始材料將編碼BL1的核酸分子插入表達載體中,該編碼序列與必需的調(diào)控序列操作性連接。表達載體是眾所周知而且容易購得的。表達載體的實例包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒載體和其它核酸分子或含有可用于轉(zhuǎn)化宿主細胞和促進編碼序列表達的媒質(zhì)的核酸分子。在部分實施方案中,該重組表達載體包含圖14中的核苷酸序列。本發(fā)明的重組表達載體最好是質(zhì)粒。
      本發(fā)明涉及包含重組表達載體的宿主細胞,所述載體包括編碼BL1的核苷酸序列。在部分實施方案中,宿主細胞包含一重組表達載體,該載體包含圖14的核苷酸序列。用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)重組表達系統(tǒng)的宿主細胞是眾所周知而且容易購得的。這些宿主細胞的實例包括諸如大腸桿菌之類的細菌細胞,以S.cerevisiae為例的酵母細胞,以S.frugiperda為例的昆蟲細胞,以中國倉鼠卵巢細胞(CHO)為例的非人哺乳動物組織培養(yǎng)細胞,和以Hela細胞為例的人組織培養(yǎng)細胞。
      在部分實施方案中,本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠利用熟知的技術(shù)將DAN分子插入市售的用于常用表達系統(tǒng)的表達載體中。例如市售質(zhì)粒pSE420(Invitrogen,San Diego,CA)可用來在大腸桿菌中生產(chǎn)BL1。市售質(zhì)粒pYES2(Invitrogen,SanDiego,CA)可用來在S.cerevisiae酵母菌株中的生產(chǎn)。市售MAXBACTM全桿狀病毒表達系統(tǒng)可用來在昆蟲細胞內(nèi)的生產(chǎn)。市售質(zhì)粒pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen.San Diego.CA)可用于在哺乳動物細胞,如中國倉鼠卵巢細胞中的生產(chǎn)。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可利用這些市售表達載體和系統(tǒng)或其它,利用常規(guī)技術(shù)和容易購得的起始材料來生產(chǎn)hVIP。(參見,例如Sambrook等,Molecular Cloning aLaboratory Mannual,第二版,Cold Spring Harbor Press(1989),本文將其納為參考)。這樣,所需的蛋白即可以在原核系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)也可以在真核系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn),產(chǎn)生多種加工形式的蛋白質(zhì)。
      本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可利用其它市售表達載體或系統(tǒng),或利用已知方法和容易購得的起始材料來生產(chǎn)載體。適用于多種宿主,包含必需的調(diào)控序列(例如啟動子和聚腺苷酸化信號,最好還有加強子)的表達系統(tǒng)很容易得到,而且是本領(lǐng)域已知的。參見Sambrook等,Molecular Cloning a Laboratory Mannual,第二版,ColdSpring Harbor Press(1989)。
      包含編碼BL1的DNA的表達載體被用于轉(zhuǎn)化相容性宿主,然后培養(yǎng)該宿主,并將其保持在可發(fā)生外源DNA表達的條件下。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知,通過裂解細胞或從培養(yǎng)液中由培養(yǎng)物回收如此生產(chǎn)出的本發(fā)明的蛋白。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可用熟知的技術(shù)來分離上述表達系統(tǒng)產(chǎn)生的BL1。利用上述特異性結(jié)合BL1的抗體從天然來源中純化BL1的方法也可同樣用于純化重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的BL1。
      基因構(gòu)建物的實例包括與啟動子操作性連接的BL1編碼序列,所述啟動子如前所述在人體內(nèi)具有功能,或在構(gòu)建物將轉(zhuǎn)染的細胞系內(nèi)具有功能。組成型啟動子實例包括巨細胞病毒或SV40的啟動子。誘導(dǎo)型啟動子實例包括小鼠乳腺白血病病毒或金屬蛋白啟動子。
      除了用重組技術(shù)生產(chǎn)BL1外,還可用自動化肽合成儀來生產(chǎn)BL1。該技術(shù)為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟知,并可用于生產(chǎn)具有取代的衍生物,這種取代是DNA編碼蛋白生產(chǎn)中無法提供的。
      編碼BL1的核酸分子可利用多種傳遞成分中的任意一種來傳遞,例如直接給予質(zhì)粒,重組病毒表達載體或其它合適的傳遞手段,從而影響它們向個體或相容性宿主細胞內(nèi)的引入和在其中的表達。一般說來,病毒載體可以是DNA病毒,例如重組腺病毒和重組牛痘病毒,或RNA病毒,例如重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。其它重組載體包括能夠感染細胞并表達重組基因的原核生物。除了重組載體之外,也可考慮使用其它傳遞成分,例如包埋在脂質(zhì)體中、運鐵蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和其它受體介導(dǎo)的方法。本發(fā)明旨在包括上述其它形式的表達載體和其它合適的傳遞手段,它們具有同等的作用,而且已經(jīng)陸續(xù)為本領(lǐng)域所知道。
      本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物,它們具有包含編碼BL1核苷酸序列的重組表達載體。用于生產(chǎn)重組蛋白的非人轉(zhuǎn)基因動物,所需的表達載體以及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法,這些都是已經(jīng)熟知的。一般說來,轉(zhuǎn)基因動物包含重組表達載體,載體中含有編碼BL1核苷酸序列,它與一個哺乳動物細胞特異性啟動子操作性連接,因而使得編碼序列只在哺乳動物細胞內(nèi)表達,并可從動物的乳汁中回收由此表達的重組蛋白。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員根據(jù)以下參考文獻采用標準技術(shù)即可生產(chǎn)出生產(chǎn)BL1的轉(zhuǎn)基因動物,所述文獻有1989年10月10日授權(quán)于Wagner的美國專利4,873,191和1988年4月12日授權(quán)于Leder的美國專利4,736,866,以上均由本文納為參考。較適合的動物是山羊、綿羊或嚙齒類動物(具體地說是大鼠和小鼠)。
      可以將BL1蛋白或用于其生產(chǎn)的表達載體配制成藥物組合物。
      本發(fā)明的藥物組合物包括與核酸分子聯(lián)合的傳遞組份,還包含藥學(xué)上可接受的載體或媒介,例如鹽水。任何能夠成功傳遞核酸的介質(zhì)均可使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解,可用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的介質(zhì)是多種多樣的。合適的藥學(xué)上可接受的運載體可參見Remington’s Pharmaceutical Sciences,A.Osol,這是本領(lǐng)域的一本標準參考書,本文在此納為參考。本發(fā)明的藥物組合物可以通過各種方式來給予,只要能夠使得活性藥物到達靶細胞。由于口服時,肽易被消化,為獲得良好的吸收,一般使用腸胃外給藥,例如靜脈、皮下、透皮、肌內(nèi)。靜脈輸注可以借助于輸液泵來進行??梢詫⒈景l(fā)明的藥物組合物配制成乳液?;蛘撸梢耘渲瞥蓺忪F劑以適合鼻內(nèi)用或吸入。有時,也可能需要局部使用。
      給藥劑量隨以下因素而不同藥物動力學(xué)特征;給藥方式和途徑;接受者的年齡、健康和體重;癥狀的性質(zhì)和程度;聯(lián)用療法的種類;治療頻度。通常,肽劑量為每50kg體重1至3000mg以每50kg體重10至1000mg為宜;以每50kg體重25至800mg更好。一般,每人每日分1到6次給予8至800mg,或利用緩釋劑型,可有效達到所需的效果。局部使用的制劑包括透皮貼、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴液、栓劑、噴霧劑、液化劑和粉末??赡鼙匦杌蛘咭擞贸R?guī)藥學(xué)載體、水溶液、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等??诜M合物包括粉末或藥丸、以水或非水介質(zhì)配成的懸浮液或溶液、膠囊、小藥囊或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散輔助劑或粘合劑也許需要。用于腸胃外、靜脈、鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥的組合物可包含無菌水溶液(其中含有緩沖劑)、稀釋劑和其它合適的添加劑,以無菌和無熱原為佳。根據(jù)本發(fā)明,適用于靜脈給藥的藥物組合物是無菌且無熱原的。
      就腸胃外給藥而言,本發(fā)明的肽可以配制成溶液、懸浮液、乳液或冷凍干燥粉末,并與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體結(jié)合。這類媒介例如水、鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水相媒介,例如固定的油。媒介或凍干粉末中可含有維持滲透壓的添加劑(例如氯化鈉、甘露醇)和維持化學(xué)穩(wěn)定性的添加劑(例如緩沖劑和保存劑)。制劑用常規(guī)技術(shù)滅菌。例如,如下制備注射用腸胃外組合物將1.5%(重量)活性成份溶解在0.9%氯化鈉溶液中。
      本發(fā)明藥物組合物可以通過各種方法給予,只要該方法能夠使活性藥物到達動物體內(nèi)藥物的作用部位。本發(fā)明藥物組合物可經(jīng)許多途徑給藥,這取決于所需的治療是局部性的還是全身性的,還取決于需要治療的部位。給藥途徑可以是局部(包括眼用、陰道用、直腸用、鼻用、透皮),口服或腸胃外。腸胃外包括靜脈滴注、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射、肺給藥(例如吸入或吹入),或者鞘內(nèi)或者腦室內(nèi)給藥。
      產(chǎn)生結(jié)合BL1抗體的雜交瘤,此抗體本身被用于分離和純化BL1以及包含它的蛋白質(zhì)復(fù)合物。此外,抗體是BL1活性的特異性抑制劑。采用已知技術(shù)和容易購得的起始材料,可將特異性結(jié)合hVIP的抗體用來從天然來源中純化該蛋白質(zhì)。這類抗體在用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白時還可用來從產(chǎn)物中純化該蛋白質(zhì)。
      本文所用術(shù)語“抗體”指完整的全抗體、其Fab片段和F(ab)2片段。完整的全抗體包括鼠單克隆抗體之類的單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。結(jié)合某表位的抗體可用于以常規(guī)技術(shù)(例如親和性層析,即抗體不與其它蛋白發(fā)生交叉反應(yīng))從天然來源或重組表達系統(tǒng)中分離和純化蛋白質(zhì)。這類抗體可以用來檢測樣品中有否所述的蛋白質(zhì),并確定細胞是否表達蛋白質(zhì)。
      抗體的生產(chǎn)方法,完整全抗體、其Fab片段和F(ab)2片段的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),以及編碼這些分子的基因序列的組成都是熟知的,可參見Harlow,E.和D.Lane(1988)ANTBODIESA Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY,本文將其納為參考。簡而言之,給小鼠注射BL1或其免疫原性片段。取出小鼠的脾臟,分離脾細胞,與無限繁殖小鼠細胞融合。培養(yǎng)該雜交細胞或雜交瘤,挑選出分泌抗體的細胞。分析抗體,如果發(fā)現(xiàn)它特異性地結(jié)合BL1,則對產(chǎn)生該抗體的雜交瘤進行培養(yǎng)以連續(xù)生產(chǎn)提供抗體。
      以下實施例包括了本發(fā)明內(nèi)容的代表性實施例。這些實施例并不是為了限定本發(fā)明的范圍,而是為了進行說明。此外,本發(fā)明的許多內(nèi)容可用以下實施例來概括。但是,以上說明并不是要限定本發(fā)明的范圍,而是將本發(fā)明的許多內(nèi)容說清楚。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員很容易理解本發(fā)明其它方面和實施方案。
      實施例實施例1以下列出了可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建物。載體pBade.puro用作起始材料來產(chǎn)生后面列出的多種構(gòu)建物,它最早是由Morgenster,J.P和H.Land構(gòu)建和報道的,參見1990,Nucl.Acids Res.18(12)3587-3596,本文將其納為參考。pBade.puro質(zhì)粒尤其適合用來在哺乳動物細胞內(nèi)表達外源基因。將需要表達的DNA序列插入克隆位點,處于Moloney鼠白血病病毒(Mo MuLV)的長末端重復(fù)序列(LTR)啟動子調(diào)控之下。該質(zhì)粒含有抗嘌呤霉素選擇標記。
      質(zhì)粒pBa.Vα3-IL-12含有2.7kb EcoRI基因組片段,該片段編碼T細胞受體Vα3結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含L、V和J片段,它們被克隆入pBabe.puro的EcoRI位點,該質(zhì)粒還含有IL-12編碼序列,該序列與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接。T細胞受體衍生的靶蛋白用于免疫接種以抵抗和治療T細胞介導(dǎo)的自身免疫病和clonotypic T細胞淋巴瘤和白血病。
      質(zhì)粒pBa.gagpol-vpr-IL-12包含克隆入pBabe.puro中的gag/pol和vif基因。缺失vpr基因。該質(zhì)粒含有這些HIV病毒基因,它們編碼HIV靶蛋白,還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列,該質(zhì)粒可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。HIV DNA序列公開在Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549中,本文將其納為參考。該序列可向GenbankNoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pM160含有2.3kb的PCR片段,該片段編碼HIV-I/3B包膜蛋白,和rev/tat基因,它們都被克隆在pMAMneoBlue中。而nef區(qū)缺失。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,和與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列,該質(zhì)??捎糜诿庖呓臃N以抵抗和治療HIV感染和AIDS。HIV-1/3B的DNA序列公開在Fisher,A.,1985 Nature 316262中,本文將其納為參考。該序列可向Genbank NoK03455獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.VL-IL-12含有PCR片段,該片段編碼抗DNA抗體的VL區(qū),克隆在pBabe.puro的XbaI和EcoRI位點上,還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該抗體衍生的靶蛋白是靶蛋白的一個實例,可用于免疫接種以抵抗和治療B細胞介導(dǎo)的自身免疫病和clonotypic B細胞淋巴瘤和白血病??寺】贵w上功能性可變區(qū)的通用方法可參見Chaudhary,V.K.等,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA871066,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pOspA.B-IL-12含有編碼博氏疏螺旋體Borrelia burgdorferi引起萊姆(Lym)病的螺旋體的OspA和OspB抗原的編碼區(qū),克隆在pBabe.puro的BamHI和Sall位點上,該質(zhì)粒還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。參見Williams,W.V.等,1992 DNA and Cell.Biol.11(3)207,本文將其納為參考。該質(zhì)粒含有這些病原基因,它們編碼靶蛋白,可用于免疫接種抵抗萊姆病。
      質(zhì)粒pBa.Rb-G-IL-12含有PCR產(chǎn)生的片段,它編碼狂犬病毒G蛋白,該片段克隆在pBabe.puro的BamHI位點上,該質(zhì)粒還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。含有編碼狂犬G蛋白的該病原基因的質(zhì)粒可用于免疫接種以抵抗狂犬病。其DNA序列公開在Genebank NoM32751中,本文將其納為參考。還可參見;Anilionis A.等,1981 Nature 294275,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.HPV-L1包含PCR產(chǎn)生的片段,編碼人乳頭瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)的L1衣殼蛋白,克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位點,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)??捎糜诿庖呓臃N以抵抗HPV感染和由它引起的癌癥。其DNA序列公開在Genebank NoM15781中,本文將其納為參考。另可參見Howley,P.,1990Fields Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第58章,1625;Shah,K.和P.Howley,1990 Fields Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第59章,以上均被本文納為參考。
      質(zhì)粒pBa.HPV-L2-IL-12含有PCR產(chǎn)生的片段,這些片段編碼人乳頭瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)的L2衣殼蛋白,克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位點上,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)??捎糜诿庖呓臃N以抵抗HPV感染和由它引起的癌癥。其DNA序列公開在Genebank NoM15781中,本文將其納為參考。另可參見Howley,P.,1990 Fields Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第58章,1625;Shah,K.和P.Howley,1990 Fields Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第59章,以上均被本文納為參考。
      質(zhì)粒pBa.MNp7-IL-12包含PCR產(chǎn)生的片段,它編碼HIV MN gag(核心蛋白)序列的編碼區(qū),克隆在pBabe.puro的BamHI位點上,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genebank NoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pGA732-2-IL-12含有GA733-2腫瘤表面抗原,從結(jié)腸癌細胞系SW948克隆到pCDM8載體內(nèi)(Seed,B.和A.Aruffo,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA843365,本文將其納為參考)的BstXI位點上,另含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該腫瘤相關(guān)性靶蛋白代表了可用于免疫接種以抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾病的靶蛋白。GA733-2抗原是抗結(jié)腸癌的有用靶抗原。有關(guān)GA733-2抗原的報道參見Szala,S.等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA873542-3546,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pT4-pMV7-IL-12含有編碼人CD4受體的cDNA,克隆在pMV7載體的EcoRI位點上,另含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。CD4靶蛋白可用于免疫接種以抵抗和治療T細胞淋巴瘤。質(zhì)粒pT4-pMV7可向AIDS Repository,Catalog No.158獲取。
      質(zhì)粒pDJGA733-IL-12含有GA733腫瘤表面抗原,克隆在pBabe.puro的BamHI位點上,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該腫瘤相關(guān)性靶蛋白代表了用于免疫接種以抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾病的靶蛋白。GA733抗原是抗結(jié)腸癌的有用靶抗原。
      質(zhì)粒pBa.RAS-IL-12含有Ras編碼區(qū),它先從pZIPneoRAS中亞克隆并克隆到pBabe.puro的BamHI位點上,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該Ras靶蛋白代表了細胞質(zhì)信號分子??寺as的方法參見Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577,本文將其納為參考。Ras編碼質(zhì)粒可用于免疫接種以抵抗和治療癌癥之類的超增殖性疾??;尤其是,Ras相關(guān)性癌癥,例如膀胱、肌肉、肺、腦和骨的癌癥。
      質(zhì)粒pBa.MNp55-IL-12含有PCR產(chǎn)生的片段,它編碼p55編碼區(qū),其中包括HIV MN gag前體(核心蛋白)序列,克隆在pBabe.puro的BamHI位點上,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.1992,AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genebank NoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.MNp24-IL-12含有PCR從pMN-SF1模板上產(chǎn)生的片段,編碼p24編碼區(qū),其中包括HIV MN gag全編碼區(qū),克隆在pBabe.puro的BamHI位點和EcoRI位點,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992,AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genebank NoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.MNp17-IL-12含有PCR產(chǎn)生的片段,它編碼p17編碼區(qū),其中包括HIV MN gag(核心蛋白)序列,克隆在pBabe.puro的BamHI位點和EcoRI位點,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992,AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genebank NoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.SIVenv-IL-12含有一段2.71kb的PCR產(chǎn)生的片段,是從pBR322中含SIV239的構(gòu)建物擴增得到的,克隆在pBabe.puro的BamHI位點和EcoRI位點,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)??上駻IDS Research and Reference Reagent Program獲取,目錄號為No.210。
      質(zhì)粒pcTSP/ATK.env-IL-12含有編碼完全HTLV包膜編碼區(qū)的PCR產(chǎn)生的片段,這些編碼區(qū)來自HTLV-1/TSP和ATK分離株,亞克隆在pcDNA1/neo載體中,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。質(zhì)粒pcTSP/ATK.env報道于1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA853599,本文將其納為參考。HTLV env靶蛋白可用于免疫接種以抵抗和治療HTLV感染和T細胞淋巴瘤。
      質(zhì)粒pBa.MNgp160-IL-12含有一段2.8kb的PCR產(chǎn)物片段,是由pSP72中含MNenv的構(gòu)建物擴增得到的,克隆在pBabe.puro的BamHI位點和EcoRI位上點,另外還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。此序列可向Genebank No.M17449獲取,本文將其納為參考。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。
      質(zhì)粒pC.MNp55-IL-12含有一段1.4kb的PCR產(chǎn)生的片段,是由MN分離株的gag結(jié)構(gòu)域擴增得到的,克隆在pCEP4載體內(nèi)。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因和與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。該質(zhì)??捎糜诿庖呓臃N以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。序列可向Genebank No.M17449獲取,本文將其納為參考。序列可向Genebank No.M17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pC.Neu-IL-12含有一段3.8kb的DNA片段,該片段含有切割自LTR-2/erbB-2構(gòu)建物并亞克隆到pCEP4載體的人neu癌基因編碼區(qū),另含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。pC.Neu質(zhì)粒由DiFiore在1987,Science 237178中進行了報道,本文將其納為參考。neu癌基因靶蛋白代表了可用作免疫接種以抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾病(尤其是結(jié)腸、乳房、肺和腦部的癌)的靶蛋白的生長因子受體。
      質(zhì)粒pC.RAS-IL-12含有一段1.4kb的DNA片段,該片段所含的ras癌基因編碼片段首先從pZIPneoRAS中亞克隆到pCEP4的BamHI位點上,另含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。pC.RAS質(zhì)粒的報道參見Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577,本文將其納為參考。該ras靶蛋白代表了細胞質(zhì)信號分子。Ras編碼質(zhì)??捎糜诿庖呓臃N以抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾??;尤其是與ras相關(guān)的癌癥,例如膀胱、肌肉、肺、腦和骨部位的癌。
      質(zhì)粒pNLpuro-IL-12含有HIV gag/pol和SV40-puro插入物。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,還含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。它可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。實施例2質(zhì)粒pCSIL-12含有與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列操作性連接的IL-12編碼序列。實施例3本發(fā)明某些實施例中的組合物可以通過將質(zhì)粒pCSIL-12與以下質(zhì)粒中任何一種組合來制備。
      質(zhì)粒pBa.Vα3是一個7.8kb的質(zhì)粒,含有一段2.7kb的EcoRI基因組片段,它編碼T細胞受體包含L、V和J節(jié)段的Vα3結(jié)構(gòu)域,克隆在pBabe.puro的EcoRI位點。T細胞受體衍生的靶蛋白可用于免疫接種以抵抗和治療T細胞介導(dǎo)的自身免疫病和clonotypic T細胞淋巴瘤和白血病。
      質(zhì)粒pBa.gagpol-vpr是一個9.88kb的質(zhì)粒,含有HIV/MN的gag/pol和vif基因,克隆在pBabe.puro內(nèi)。缺失vpr基因。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。HIV DNA序列公開在Reiz.M.S.,1992,AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。序列可向Genebank No.M17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pM160是一個11.0kb的質(zhì)粒,含有2.3kb的編碼HIV-I/3B包膜蛋白和rev/tat基因的PCR片段,克隆在pMAMneoBlue中。缺失nef基因。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV和AIDS。HIV-1/3B的DNA序列公開在Fisher,A.,1995 Nature 316262中,本文將其納為參考。序列可向Genebank No.K03455獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.VL是一個5.4kb的質(zhì)粒,含有編碼抗DNA抗體的VL區(qū)的PCR片段,克隆在pBabe.puro的XbaI和EcoRI位點上??贵w衍生的靶蛋白代表了可用于免疫接種以抵抗和治療B細胞介導(dǎo)的自身免疫病和clonotypic B細胞淋巴瘤和白血病的靶蛋白??寺】贵w的功能性可變區(qū)的通用方法可參見Chaudhary,V.K.等,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA871066,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pOspA.B是一個6.84kb的質(zhì)粒,含有編碼博氏疏螺旋體(引起萊姆病的螺旋體)的OspA和OspB抗原的編碼區(qū),克隆在pBabe.puro的BamHI和SalI位點上。Williams,W.V.等,1992,DNA和Cell.Biol.11(3)207,本文將其納為參考。該質(zhì)粒包含編碼靶蛋白的病原基因,可用于免疫接種抵抗萊姆病。
      質(zhì)粒pBa.Rb-G是一個7.10kb的質(zhì)粒,含有編碼狂犬病毒G蛋白的PCR產(chǎn)物片段,克隆在pBabe.puro的BamHI位點上。含有編碼狂犬G蛋白病原基因的該質(zhì)粒,可用于免疫接種抵抗狂犬病。該DNA序列公開在Genebank No.M32751中,本文將其納為參考。還可參見Anilionis,A.等,1981,Nature 294275,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.HPV-L1是一個6.80kb的質(zhì)粒,含有編碼人乳頭瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)的L1衣殼蛋白的PCR片段,克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位點上。該質(zhì)??捎糜诿庖呓臃N以抵抗HPV感染和由其引起的癌癥。此DNA序列公開在Genebank No.M15781中,本文將其納為參考。還可參見Howley,P.,1990,F(xiàn)eilds Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第58章1625和Shah,K.和P.Howley,1990,F(xiàn)eilds Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第59章,均被本文納為參考。
      質(zhì)粒Ba.HPV-L2是一個6.80bk的質(zhì)粒,含有編碼人乳頭瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)L2衣殼蛋白的PCR片段,克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位點上。該質(zhì)??捎糜诿庖呓臃N以抵抗HPV感染和由它引起的癌癥。此DNA序列公開在Genebank No.M15781中,本文將其納為參考。還可參見Howley,P.,1990,F(xiàn)eilds Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第58章1625和Shah,K.和P.Howley,1990,F(xiàn)eilds Virology,Vol.2,Channock,R.M等編輯,第59章,均被本文納為參考。
      質(zhì)粒pBa.MNP7是一個5.24kb的質(zhì)粒,含有包括HIV MN gag(核心蛋白)序列的p7編碼區(qū)的PCR片段,克隆在pBabe.puro的BamHI位點上。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genbank NoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pGA733-2是一個6.3kb的質(zhì)粒,含有GA-733-2腫瘤表面抗原,從結(jié)腸癌細胞系SW948中克隆到pCDM8載體(參見Seed B.和A.Aruffo,1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA843365,本文將其納為參考)的BstXI位點上。該腫瘤相關(guān)性靶蛋白代表了用于免疫接種以抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾病的靶蛋白。GA733-2抗原是有用的抗結(jié)腸癌靶抗原。GA733抗原的報道參見Szala.S等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873542-3546,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pT4-pMN7是一個11.15kb的質(zhì)粒,含有編碼人CD4受體的cDNA,克隆在pMV7載體的EcoRI位點上。CD4靶蛋白可用于免疫接種以抵抗和治療T細胞淋巴瘤。質(zhì)粒pT4-pMN7可向AIDS Repository獲取,目錄號No.158。
      質(zhì)粒pDJGA733是一個5.1kb的質(zhì)粒,含有GA733腫瘤表面抗原,克隆在pBabe.puro的BamHI位點。該腫瘤相關(guān)性蛋白代表了用于免疫接種以抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾病的靶蛋白。GA733抗原是有用的抗結(jié)腸癌靶抗原。
      質(zhì)粒pBa.RAS是一個6.8kb的質(zhì)粒,含有Ras編碼區(qū),首先從pZIPneoRAS中亞克隆并克隆到pBabe.puro的BamHI位點上。該ras靶蛋白代表了細胞質(zhì)信號分子??寺as的方法可參見Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577,本文將其納為參考。ras編碼質(zhì)粒可用于免疫接種以抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾??;尤其是與ras有關(guān)的膀胱、肌肉、肺、腦和骨的癌癥。
      質(zhì)粒pBa.MNp55是一個6.38kb的質(zhì)粒,含有編碼p55編碼區(qū)的PCR片段,該編碼區(qū)包括HIVNM gag前體(核心蛋白)序列,克隆在pBabe.puro的BamHI位點上。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genbank NoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.MNp24是一個5.78kb的質(zhì)粒,它含有PCR從pMN-SF-1模板上產(chǎn)生的片段,編碼p24編碼區(qū),其中包括HIV MNgeg全編碼區(qū),克隆在pBabe·puro的BamHI和EcoRI位點上。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDA。Reiz,M.S.,1992 AIDS ResHumanRetro.81549,納入本文作參考。序列可向Genebark No17449獲取,也納入本文作參考。
      質(zhì)粒pBa.MNp17是一個5.5kb的質(zhì)粒,含有一段編碼包括HIV gag(核心蛋白)序列在內(nèi)的p17編碼區(qū)的PCR片段,克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位點。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種以抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genbank NoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pBa.SIVenv是一個7.8kb的質(zhì)粒,含有一段從pBR32內(nèi)含SIV239的構(gòu)建物擴增得到的2.71PCR片段,克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位點上。該質(zhì)??上駻IDS Research and Reference Reagent Program獲取;目錄號210。
      質(zhì)粒pcTSP/ATK.env是一個8.92kb的質(zhì)粒,含有的一段編碼完整的HTLV-1/TSP和ATK分離株的HTLV包膜編碼區(qū)的PCR片段,亞克隆在pcDNA1/neo載體中。有關(guān)質(zhì)粒pcTSP/ATK.env的報道參見1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA853599,本文將其納為參考。HTLV env靶蛋白可用于免疫接種以抵抗和治療HTLV感染和T細胞淋巴瘤。
      質(zhì)粒pBa.MNgp160是一個7.9kb的質(zhì)粒,含有一段從pSP72中含MNenv的構(gòu)建物擴增得到的2.8kb PCR片段,克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位點。Reiz,M.S.,1992 AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向Genbank NoM17449獲取,本文將其納為參考。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種抵抗和治療HIV感染和AIDS。
      質(zhì)粒pC.MNp55是一個11.8kb的質(zhì)粒,含有一段從MN分離株gag區(qū)擴增得到的1.4kb PCR片段,克隆在pCEP4載體內(nèi)。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種抵抗和治療HIV感染和AIDS。Reiz,M.S.,1992AIDS Res.Human Retro.81549,本文將其納為參考。該序列可向GenbankNoM17449獲取,本文將其納為參考。
      質(zhì)粒pC.Neu是一個14.2kb的質(zhì)粒,含有一段包含人neu癌基因編碼區(qū)的3.8kb DNA片段,該編碼區(qū)切割自LTR-2/erbB-2構(gòu)建物,亞克隆在pCEP4載體內(nèi)。有關(guān)pC.Neu質(zhì)粒的報道參見DiFiore 1987 Science237178,本文將其納為參考。neu癌基因靶蛋白代表了一種生長因子受體,它們可用作靶蛋白來免疫接種抵抗和治療癌癥之類的超增殖性疾??;尤其是結(jié)腸、乳房、肺和腦部的癌癥。
      質(zhì)粒pC.RAS是一個11.7kb的質(zhì)粒,含有一段包含ras癌基因編碼區(qū)的1.4kbDNA片段,該編碼區(qū)先從pZIPneoRAS中亞克隆到pCEP4載體的BamHI位點。有關(guān)質(zhì)粒pC.RAS的報道參見Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577,本文將其納為參考。ras靶蛋白代表了細胞質(zhì)信號分子。編碼ras的質(zhì)粒可用于免疫接種抵抗和治療癌癥之類超增殖性疾病,尤其是膀胱癌、肌肉癌、腦癌和骨癌等與ras相關(guān)的癌癥。
      質(zhì)粒pNLpuro是一個15kb的質(zhì)粒,含有HIV gag/pol和SV40-puro插入片段。該質(zhì)粒含有編碼HIV靶蛋白的這些HIV病毒基因,可用于免疫接種抵抗和治療HIV感染和AIDS。實施例4為了改進疫苗,特異性地引導(dǎo)免疫應(yīng)答可能是十分重要的。據(jù)報道,在包括傳染病、自身免疫病和過敏在內(nèi)的多種疾病類型中,免疫反應(yīng)的類型(Th1還是Th2)是十分重要的。為了誘導(dǎo)抗HIV感染的強而穩(wěn)定的細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答,在免疫時聯(lián)用免疫佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑(例如細胞因子)可加強細胞免疫應(yīng)答,并引導(dǎo)抗原依賴性免疫應(yīng)答由Th2型向Th1型轉(zhuǎn)變。
      為了基因改進體內(nèi)的免疫應(yīng)答,將人細胞因子基因(IL-12或GM-CSF基因)與HIV構(gòu)建物一同傳遞。對因這些基因與HIV-1DNA疫苗共同傳遞而引起的免疫應(yīng)答進行了檢查,并對細胞免疫的誘導(dǎo)(尤其是抗病毒的CTL應(yīng)答)進行了研究。
      分別將IL-12和GM-CSF基因克隆到表達載體內(nèi),處于CMV啟動子調(diào)控下。然后該基因質(zhì)粒表達盒和HIV-1的DNA疫苗盒(參見前文,或美國專利申請08/642,045,申請于1996年5月6日,本文將其納為參考)一起注射到小鼠體內(nèi)。對這些基因佐劑盒共同免疫接種在抗原特異性免疫應(yīng)答強度方面的免疫學(xué)效果進行了分析。見到與IL-12共傳遞降低了體液應(yīng)答,同時,與IL-12共接種中度加強了體液應(yīng)答。用IL-12或GM-CSF共接種都發(fā)現(xiàn)了抗原特異性T輔助細胞增殖的增加。重要的是,用直接CTL試驗觀察到IL-12基因共同給予誘導(dǎo)了顯著的CTL。相反,在同樣的研究中,采用GM-CSF基因,幾乎沒有觀察到對CTL誘導(dǎo)的任何效果。這些結(jié)果證明使用DNA疫苗產(chǎn)生了特異性免疫應(yīng)答。這些結(jié)果還顯示該方法在以分子特異性方式闡明基本免疫功能方面的用途。材料和方法小鼠6至8周齡的Balb/c雌小鼠購自Harlan Sprague Dawley,Inc.(indianapolis,Indiana)。這些小鼠被關(guān)在溫控,光控(light-cycled)室內(nèi)。根據(jù)National Institute ofHealth和University of Pennsylvania的指導(dǎo)原則看護它們。試劑制備DNA疫苗制劑pCMN160、pCGN160、pCGag/Pol。將IL-12和GM-CSF基因克隆和插入到帶有CMV啟動子的表達載體內(nèi)。重組牛痘苗(vMN462,vVK1,VVgag和vSC8)得自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。DNA接種使用改進的DNA接種法,它能夠運用質(zhì)粒在體內(nèi)傳遞基因而提高體內(nèi)的蛋白質(zhì)表達水平。具體地說,在Balb/c小鼠股四頭肌中用27號針頭注射0.25%的布吡卡因-HCl(Sigma,St.Louis)溶液100μl。2天后,在同一注射部位注射50μg所研究的DNA構(gòu)建物(以磷酸鹽緩沖液配成溶液)。各種基因表達盒的共同給予包括在注射前將所選的質(zhì)粒混合。FACS分析細胞(1×105)用FACS緩沖液(含1%BSA和0.1%疊氮鈉的PBS)洗滌3次,在飽和條件下,與FITC和/或PE交聯(lián)mAbs一起冰上孵育30分鐘。用FACS緩沖液洗滌3次后,用FACScan(Becton Dickinson)分析細胞。ELISA如現(xiàn)有技術(shù)所述,以0.1M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.5)將gp120或gp41(Intracel Corp.Cambridge,MA)配成2μg/ml溶液,加入微滴孔中吸附4℃放置過夜。用PBS-0.05%吐溫-20洗滌測試板,用3%BSA的PBS溶液和0.05%吐溫-20于37℃封閉1小時,然后與制造商建議的HRP-交聯(lián)山羊抗小鼠IgG或IgA(Sigma,St.Louis,MO)稀釋液一起孵育。用TM緩沖液(Sigma)洗滌和沖洗(develope)測試板。在Dynatech MR5000測試板讀數(shù)儀上讀取450nm處的OD值。T細胞增殖試驗收獲小鼠的脾臟,從中制備淋巴細胞。將分離的細胞懸液重懸至1×106細胞/毫升。在96孔平底板的每孔中加入100μl的等份,內(nèi)含1×105細胞。各孔加入10μl濃度為20μg/ml的蛋白質(zhì),一式三份。這些細胞在5%CO2中37℃培養(yǎng)3天。每孔中加入1μCi氚化胸腺嘧啶,細胞37℃培養(yǎng)12至18小時。收獲測試板,在β測試板讀數(shù)儀(Wallac,Turku,F(xiàn)inland)上測定摻入的氚化胸腺嘧啶的量。為了確保細胞健康,10μg/ml PHA被用作多克隆刺激劑陽性對照。細胞毒性T淋巴細胞試驗進行一次5小時的鉻51釋放CTL試驗。從脾臟收獲淋巴細胞,去除紅細胞,并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌數(shù)次,制備成效應(yīng)細胞。用3×106個p815細胞37℃感染16小時,制備牛痘苗感染的靶細胞。靶細胞用100μCi/ml的Na251CrO4進行90分鐘的標記,并用于培養(yǎng)刺激脾細胞37℃4至6小時。進行CTL測試,效應(yīng)細胞∶靶細胞(E∶T)之比從50∶1至12.5∶1。收獲上清液,在LKB Clini Gammaγ-計數(shù)儀上計數(shù)。用以下公式計算特異性裂解的百分比100×{實驗釋放-自發(fā)釋放}÷{最大釋放-自發(fā)釋放}最大釋放是在含1% Triton X-100的培養(yǎng)基中裂解靶細胞而測定的。如果“自發(fā)釋放”計數(shù)超過“最大釋放”的20%,則該試驗視為無效。結(jié)果小鼠脾臟的表型共同接種之后,各試驗組小鼠的脾臟看起來不相同。所以,對收集的所有接種小鼠的脾臟進行稱重和目測。圖1A顯示了這些動物脾臟的重量。盡管注射單一制劑的對照小鼠與非接種對照小鼠的脾臟重量相近(約100mg),注射了Gag/Pol+IL-12基因的小鼠,其脾臟的重量是對照脾臟的3倍。另一方面,用Gag/Pol+GM-CSF接種的小鼠,其脾臟沒有增大。需要指出的是,單用Gag/Pol或單用IL-12接種的小鼠,都沒有造成脾臟的明顯增大。只有當共同注射抗原和IL-12基因盒時,才造成脾腫大,提示這是兩種基因產(chǎn)物的組合效果。而且,如圖1B所示,來自Gag/Pol+IL-12脾臟的淋巴細胞數(shù)量是對照脾臟的3倍。同樣,與對照脾臟細胞數(shù)相比,Gag/Pol和IL-12免疫的小鼠脾臟在淋巴細胞數(shù)量上都沒有明顯的增加。代表性脾臟的照片見圖2。與各自的重量相對應(yīng),抗原+IL-12脾臟比其它脾臟大數(shù)倍。根據(jù)現(xiàn)有報道,IL-12的p35鏈在許多類型細胞中都有組成型表達。所以,可能只有一條p40鏈和DNA免疫原造成了這一效果。為了檢測這一點,將IL-12異二聚體基因(p35和p40)之一分別與Gag/Pol共同給予。如圖3所示,兩者都沒有引起脾臟腫大。以上數(shù)據(jù)表明,將IL-12的p35和p40基因一起與DNA疫苗共同注射,引起脾臟腫大和相應(yīng)的脾細胞數(shù)量增加。以上數(shù)據(jù)支持以下觀點,這些質(zhì)粒在體內(nèi)進入了同一個細胞,協(xié)調(diào)了所有三種組成p35鏈、p40鏈和獨特抗原的轉(zhuǎn)錄,從而誘導(dǎo)了所見的生物學(xué)變化。FACS分析為了進一步對腫大脾臟的細胞組成進行特征分析而進行了FACS分析。如表3顯示,用針對CD3的抗體和針對B220、CD4和CD8的抗體進行脾細胞雙染色的FACS。根據(jù)結(jié)果顯示,與非免疫對照脾臟中的B細胞百分比(25.43%)相比,包膜+IL-12或Gag/Pol+IL-12構(gòu)建物免疫接種組的B220陽性B細胞百分比略為下降(分別為17.46%和21.62%)。此外,與非免疫對照脾臟中的百分比(13.69%)相比,包膜+IL-12或Gag/Pol+IL-12構(gòu)建物免疫組的CD8+T細胞百分比略為升高(分別為21.72%和16.88%)。體液應(yīng)答收集免疫小鼠的抗血清,用ELISA分析抗HIV-1抗原的特異性抗體反應(yīng)。圖4顯示的是免疫接種后第28天所收集樣品的ELISA結(jié)果。當稀釋度為1∶100時,pCEnv+pCGM-CSF免疫組的抗血清顯示出的抗HIV-1 gp120蛋白的抗體反應(yīng)比單用pCEnv免疫的組大。另一方面,經(jīng)過同樣長的時間,pCEnv+pCIL-12免疫組的體液反應(yīng)明顯較小。在重復(fù)實驗中,IL-12普遍抑制特異性抗體反應(yīng)達10-20%,而GM-CSF則表現(xiàn)出正作用。這樣的體液應(yīng)答可能與FACS分析所確定的脾細胞中B細胞數(shù)量所見的變化有關(guān)。T細胞增殖T輔助淋巴細胞的激活和增殖在通過擴展抗原激活的B細胞誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和通過擴展CD8+細胞毒性T淋巴細胞誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答中起著重要作用。DNA免疫后2周,收集免疫小鼠的脾臟,分離出淋巴細胞。然后如前所述測試這些細胞的T細胞增殖。圖5顯示用編碼HIV-1 gag/pol(pCGag/Pol)的DNA疫苗免疫的小鼠和用pCGag/Pol和IL-12或GM-CSF共同免疫的小鼠的增殖試驗結(jié)果。重組p55蛋白和20μg/ml凝集素PHA被用作多克隆刺激劑陽性對照。如所顯示,幼稚小鼠脾臟對照組有低背景水平的增殖反應(yīng),稀釋度為1∶2時的刺激指數(shù)為1.2,單用pCGag/Pol免疫組可觀察到中等水平的增殖反應(yīng),稀釋度1∶2時的刺激指數(shù)為9.2。用pCGag/Pol和IL-12基因共同免疫的組和用pCGag/Pol和GM-CFS共同免疫的組,可觀察到增殖反應(yīng)的急遽增大,刺激指數(shù)分別為17.1和15.6。沒有體外刺激的CTL試驗為了進一步研究細胞活性的增強而進行了直接CTL試驗。如前所述免疫小鼠,收集脾臟細胞,但是不對脾細胞進行體外刺激誘導(dǎo)進行CTL試驗。在收獲脾臟的當天進行該試驗,測定特異性痘苗感染和非特異性痘苗感染靶細胞的鉻釋放。pCGag+IL-12免疫的脾細胞觀察到特異性CTL活性顯著增加(圖6)。單用IL-12基因盒免疫的對照組結(jié)果靶細胞特異性溶解不超過背景水平。此外,單用Gag/Pol免疫50∶1效∶靶比,可觀察到低水平的特異性溶解(3%)。相反,Gag/Pol+IL-12共同給予的標本在效∶靶比為50∶1時,特異性裂解為62%,而在12.5∶1時,滴度為9%。另一方面,用Gag/Pol質(zhì)粒和GM-CSF質(zhì)粒免疫結(jié)果沒有可測得的CTL活性。從用HIV-1包膜構(gòu)建物和細胞因子基因共同免疫的小鼠也可觀察到相似的結(jié)果(圖7)。單用包膜和用包膜+GM-CSF免疫的組只有低水平的特異性CTL,分別為4%和1%。另一方面,包膜+IL-12免疫組的CTL活性顯著增強,溶解率達59%。在Gag/Pol和包膜共同免疫組中(圖6和圖7),對用非相關(guān)抗原表達痘苗制備的靶細胞進行同樣的CTL試驗,結(jié)果沒有明顯的CTL溶解。所以,抗原和IL-12DNA共同免疫引起的CTL活性顯著加強并不是由NK活性引起的,因為以上結(jié)果是抗原特異性的。討論據(jù)報道,用不同的治療靶標和傳遞技術(shù),體內(nèi)接種DNA疫苗都產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。
      許多疫苗的重要特征可能在于誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫力。例如,在自然感染過程中,抗HIV-1的CTL反應(yīng)出現(xiàn)相當早,而且暫時性地呈現(xiàn)與病毒定居點的建立相關(guān)聯(lián)性。CTL T細胞在尋靶和摧毀病毒感染細胞而清除病毒中起著重要作用。通過推進特異性CTL反應(yīng)來引導(dǎo)抗病毒蛋白的免疫反應(yīng)將使得誘導(dǎo)針對病毒內(nèi)多種靶抗原的更加廣譜的免疫應(yīng)答成為可能。比起AIDS患者,在健康的受感染患者中更易測得抗病毒的CTL活性,而且據(jù)報道,特異性CTL隨著病程的進展而降低,這清楚地將CTL反應(yīng)與較好的臨床狀態(tài)聯(lián)系了起來。在這方面,一種具有高特異性CTL應(yīng)答和低抗體應(yīng)答的南美獼猴能夠受到保護免受嵌合性SIV/HIV(SHIV)的攻擊,而具有低CTL和高抗體應(yīng)答的猴雖能控制病毒的復(fù)制,但是不能受到完全保護。特異性CTL反應(yīng)似乎對維持HIV-1感染在無癥狀階段有所貢獻。所以,通過DNA免疫接種誘導(dǎo)強烈的體內(nèi)HIV-1特異性CTL應(yīng)答可能在最終保護宿主避免HIV感染的發(fā)展中起重要作用。
      將HIV-1的DNA疫苗通過與作為基因佐劑的IL-12和GM-CSF共同傳遞能夠增強免疫應(yīng)答,尤其是CTL應(yīng)答,對此進行了研究。將IL-12基因和GM-CSF基因克隆到表達載體內(nèi),和HIV-1的DNA疫苗盒一起注射給小鼠。編碼IL-12的質(zhì)粒與HIV-1的DNA疫苗共同免疫接種,引起抗原特異性CTL應(yīng)答的顯著增強。與GM-CSF的共傳遞表現(xiàn)為增強體液免疫,而與IL-12的共傳遞則抑制體液反應(yīng)約20%。
      將細胞因子基因佐劑與HIV-1的DNA疫苗共傳遞具有許多顯著的免疫效應(yīng)。首先,注射DNA疫苗和IL-12基因的小鼠其脾臟的大小和重量幾乎是對照脾臟的3倍。此外,這些脾臟中的白細胞是對照脾臟中白細胞數(shù)量的2倍以上。以上結(jié)果與以前的發(fā)現(xiàn)相一致,即小鼠體內(nèi)給予重組IL-12引起脾腫大。Car等發(fā)現(xiàn),在野生型小鼠中,注射IL-12引起脾臟重量增加5倍。以上IL-12在野生型小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生的變化與IFN-γ血清水平的顯著增高有關(guān)。但是,在IFN-γ受體缺陷型小鼠中,給予IL-12也誘導(dǎo)產(chǎn)生類似質(zhì)量的脾腫大(達正常大小的2倍)。這些早期研究都報道注射IL-12蛋白引起脾臟腫大。體內(nèi)傳遞少量IL-12基因誘導(dǎo)的脾腫大程度與已發(fā)表的用重組IL-12蛋白作的研究相當。據(jù)報道,給小鼠體內(nèi)注射重組IL-12可能對接受注射的小鼠有一定程度的毒性作用,例如體重減輕甚至死亡。重要的是注意到,共同給予IL-12基因誘導(dǎo)了脾臟腫大,但是接受注射的小鼠沒有任何可見的不良變化。這提示,和質(zhì)粒接種造成的自然加工持續(xù)性低水平傳遞可能在臨床上是有利的。本發(fā)明在此展示了一種用于誘導(dǎo)明顯的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答但是沒有毒性作用的DNA傳遞方法。
      除了誘導(dǎo)脾臟腫大之外,通過IL-12與DNA疫苗的共同給予可以操縱從Th2到Th1的特異性免疫應(yīng)答。在這方面,DNA疫苗與IL-12的共同傳遞降低特異性抗體反應(yīng),而與GM-CSF的共傳遞則加強特異性抗體反應(yīng)。以上結(jié)果與先前所報道的IL-12在引導(dǎo)免疫應(yīng)答由Th2型向Th1型轉(zhuǎn)變中是關(guān)鍵細胞因子相一致。這些抗體的結(jié)果也與脾細胞的FACS數(shù)據(jù)相符,在所述數(shù)據(jù)中,用免疫原(HIV-1包膜或Gag/Pol)和IL-12基因免疫的小鼠其B220+B細胞百分數(shù)減少。此外,與細胞因子共傳遞可觀察到對T細胞明顯的抗原特異性刺激作用。抗原特異性增殖是CD4輔助T細胞誘導(dǎo)的良好指證,這看來是兩種細胞因子具有的特性。
      為了進一步闡明對DNA共免疫的T細胞應(yīng)答而進行了不對收獲的脾細胞進行體外刺激的直接CTL試驗。CTL應(yīng)答的加強是證明能夠?qū)NA免疫引起的免疫應(yīng)答從由Th2轉(zhuǎn)向Th1的重要證據(jù)。用DNA疫苗與IL-12共同免疫的動物組觀察到特異性CTL應(yīng)答的明顯增強??傊?,體內(nèi)共同給予編碼免疫原的基因和引起Th1型免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細胞因子IL-12的基因,經(jīng)T細胞增殖和CTL試驗測定,表現(xiàn)出加強的細胞免疫應(yīng)答。
      共同傳遞免疫學(xué)上重要的分子的基因來幫助引導(dǎo)和操縱免疫應(yīng)答的類型和方向(例如引導(dǎo)反應(yīng)由Th2型轉(zhuǎn)化為Th1型)可用來在臨床上引發(fā)更有效的免疫應(yīng)答。IL-12基因與DNA免疫原的共同給予中等程度地抑制了體液應(yīng)答,而極大地加強了CTL應(yīng)答。此外,還誘導(dǎo)了脾臟腫大,這是給予小鼠體內(nèi)重組IL-12蛋白的特征。所以,本發(fā)明表明,體內(nèi)傳遞DNA既可用于生產(chǎn)新一代更有效的疫苗又可作為對免疫功能機理進行分子解析的分析工具。實施例5為了進一步體內(nèi)引導(dǎo)免疫應(yīng)答,對廣譜細胞因子基因和HIV-1 DNA免疫原性構(gòu)建物共傳遞對免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用進行了研究。選擇與細胞因子基因共傳遞是因為細胞因子在免疫作用中起著重要的調(diào)節(jié)和信號作用。雖然除免疫系統(tǒng)細胞以外的許多細胞可產(chǎn)生和釋放細胞因子,但淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子因其在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細胞的作用而具有特殊的意義。例如,IL-1、IFN-γ和IL-12的存在將Th0前體細胞激活成為Th1炎性T細胞。另一方面,IL-4、IL-5或IL-10的釋放使得Th0前體細胞轉(zhuǎn)變成武裝的Th2輔助細胞。此外,前炎性細胞因子IL-1、IFN-α和IFN-β在誘發(fā)炎性反應(yīng)中起著積極作用。
      對前炎性細胞因子(IL-1α、TNF-α和IFN-β)、Th1細胞因子(IL-2、IL-15和IL-18)和Th2細胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)共同傳遞的作用進行了研究。具體地說,這些前炎性細胞因子、Th1和Th2細胞因子的基因被分別克隆到表達載體中,處于巨細胞病毒(CMV)啟動子調(diào)控之下。然后將這樣的基因質(zhì)粒表達盒與HIV-1D DNA疫苗盒如前文所述一起注射小鼠體內(nèi)。分析了這些基因佐劑盒共注射對抗原特異性免疫應(yīng)答的方向和強度產(chǎn)生的免疫學(xué)作用。
      將細胞因子基因與DNA免疫原基因盒共注射能夠調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應(yīng)答。更廣泛地說,這種將作為媒介的具有免疫學(xué)重要意義的基因共同傳遞的策略能夠產(chǎn)生新一代的DNA疫苗,增強了它們在臨床效率和應(yīng)用上的潛能。
      材料和方法DNA質(zhì)粒采用標準技術(shù)和容易購得的起始材料制備表達HIV-1包膜蛋白和gag/pol蛋白的DNA疫苗構(gòu)建物pCEnv和pCGag/Pol。用標準技術(shù)和容易得到的起始材料將人IL-1α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-15、TNF-α、TNF-β和小鼠的IL-4和IL-18的基因克隆到pCDNA3表達載體(Invitrogen,Inc.,San Diego,CA)中。據(jù)報道,人IL-1α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-15、TNF-α和TNF-β在小鼠細胞內(nèi)具有活性。使用Qiagen Maxi Prep試劑盒(Qiagen,Santa Clara,CA)在細菌內(nèi)生產(chǎn)質(zhì)粒DNA并純化。試劑和細胞系人橫紋肌肉瘤(RD)和小鼠肥大細胞瘤p815細胞系獲自ATCC(Rockville,MD)。表達HIV-1包膜、gag/pol和半乳糖苷酶的的重組疫苗vMN462、vVK1和vSC8獲自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTKN)是用標準技術(shù)和容易得到的起始材料合成的。重組Pr55或gp120蛋白得自Quality Biological(Gaithersburg,MD)。重組p24蛋白購自Intracell(Cambridge,MA)。針對IL-1α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-15、TNF-α和TNF-β的抗體得自R&amp;D Systems(Minneapolis,MN)。細胞因子構(gòu)建物的表達在轉(zhuǎn)染入RD細胞后,采用免疫沉淀法或細胞因子ELISA來證實細胞因子構(gòu)建物的表達。細胞經(jīng)PBS洗滌兩次,在無血清、無甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM中餓養(yǎng)一小時,然后用200μCi/ml(1,200Ci/mmole)的35S蛋白標記混合物(NEN/DuPont)標記。在0-5ml的RIPA緩沖液(50mM Tris HCl pH7.6;150mMNaCl;0.2%Triton X-100;0.2%脫氧膽酸;0.1%SDK和1mM PMSF)中冰上裂解標記細胞,然后15000rpm離心10分鐘進行澄清。澄清后的裂解液與相關(guān)抗體(R&amp;D Systems)冰上孵育90分鐘。抗原抗體復(fù)合物加入A蛋白瓊脂糖凝膠,40℃振搖混合90分鐘。用含有高濃度鹽和BSA的緩沖液充分洗滌后將蛋白質(zhì)沉淀重懸在50μl 1X樣品緩沖液中,100℃加熱3至5分鐘。取一份蛋白質(zhì)樣品進行SDS 12%-PAGE。為了進行熒光自顯影,將凝膠浸泡在含10%甘油的1M水楊酸鈉中15分鐘,干燥,用Kodak X-omat-AR膠片進行放射性自顯影。收集轉(zhuǎn)染的RD細胞的上清液,用細胞因子ELISA試劑盒(Pharmingen,San Diego,CA和R&amp;DSystem)測試表達。小鼠DNA接種在6至8周齡balb/c小鼠(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,IN)的股四頭肌部位注射50μg各種感興趣的DNA構(gòu)建物,這些構(gòu)建物配制在磷酸鹽緩沖液(PBS)和0.25%布吡卡因-HCl(Sigma,St.Louis,MO)中。各種基因表達盒的共同給予包括將所選的各種質(zhì)粒混合,然后注射,每次100μg。ELISAp24或gp120蛋白以0.1碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.5)中稀釋成2μg/ml,取50μl4℃過夜吸附到微滴板的孔上。測試板用PBS-0.05%吐溫-20洗滌兩次,在37℃用3%BSA 0.05%吐溫-20的PBS溶液封閉1小時。用0.05%吐溫-20稀釋小鼠抗血清,并37℃孵育1小時,然后與HRP-交聯(lián)山羊抗小鼠IgG(Sigma,St.Louis,MO)一起孵育。用3’3’5’5’TMB(Sigma)緩沖液洗滌和沖洗。在Dynatech MR5000測試板讀數(shù)儀上讀取測試板在450nm處的光密度值。T輔助細胞增殖試驗從脾臟收獲淋巴細胞,去除紅細胞并用新鮮培養(yǎng)液介質(zhì)洗滌數(shù)次制備效應(yīng)細胞。將分離細胞重懸成5×106細胞/毫升。取含5×105細胞的100μl等份立即加入96孔平底微滴板的各孔內(nèi)。在測試孔中加入重組Pr55或gp120蛋白,最終濃度分別為5μg/ml和1μg/ml,一式三份。這些細胞在5%CO2中37℃培養(yǎng)3天。在各孔中加入1μCi氚化胸腺嘧啶,細胞37℃培養(yǎng)12至18小時。收獲測試板,在β測試板讀數(shù)儀(Wallac,Turku,F(xiàn)inland)上測定摻入的氚化胸腺嘧啶量。用以下公式計算刺激指數(shù)刺激指數(shù)(SI)=(試驗值/自發(fā)值)自發(fā)值的測試孔內(nèi)包括作為非相關(guān)蛋白對照的10%胎牛血清。此外,用pCEnv或?qū)φ彰庖叩膭游镆话銓r55蛋白的SI為1。相類似,pCGag/pol或?qū)φ找话銓p120蛋白的SI為1。為了確保細胞健康,將PHA或con A(Sigma)用作多克隆刺激物陽性對照。PHA或con A對照樣品的SI為20至40。細胞毒性T細胞試驗用痘苗感染的靶細胞或肽處理過的靶細胞進行5小時的51鉻釋放CTL試驗。分別進行了體外有效應(yīng)物刺激和無效應(yīng)物刺激的該試驗。在體外刺激的試驗中,用相關(guān)的痘苗(包膜的vMN462和gag/pol的vVK1)感染的細胞刺激效應(yīng)細胞,并用0.1%戊二醛或1M的包膜特異性肽(RIHIGPGRAFYTTKN),將5×106細胞/毫升在CTL培養(yǎng)基中固定4至5天。CTL培養(yǎng)基由1∶1的Iscove改進的Dulbecco培養(yǎng)基(Gibco-BRL,Grand Island,NY)和Hanks平衡鹽溶液(Gibco-BRL)(含有10%胎牛血清(Gibco-BRL)和10%不含Con A(Becton Dickinson Labware,Bedford,MA)的RAT-T-STIM)組成。在37℃以10至20的感染復(fù)數(shù)(MOI)對3×106個p815細胞進行5至12小時的感染,由此制備痘苗感染的靶細胞。將p815細胞與1μM濃度的肽一起孵育制備肽處理的靶細胞。進行標準鉻釋放試驗,即用100μCi/mlNa251CrO4對靶細胞進行60至120分鐘的標記,將該細胞與受刺激效應(yīng)脾細胞一起37℃培養(yǎng)4至6小時。測定CTL溶解,效應(yīng)細胞∶靶細胞(E∶T)之比從50∶1至12.5∶1。收獲上清液,在LKB CliniGammaγ計數(shù)儀上計數(shù)。用以下公式測定特異性溶解百分比100×{試驗釋放量-自發(fā)釋放量}÷{最大釋放量-自發(fā)釋放量}最大釋放量是以含1%Triton X-100的培養(yǎng)液溶解靶細胞而測定的。如果“自發(fā)釋放”超過“最大釋放”的20%,則該試驗視為無效。CD8+T細胞的補體溶解用抗CD8單克隆抗體(Pharmingen,San Diego,CA)處理,然后與兔補體(Sigma)一起37℃孵育45分鐘,將CD8+T細胞從脾細胞中除去。
      結(jié)果細胞因子基因盒的表達將細胞因子基因分別克隆到pCDNA3質(zhì)粒表達載體內(nèi)(圖10)。通過對整個插入片段(在5’末端和3’末端)的序列分析來確認這些細胞因子表達盒。此外,將這些細胞因子體外轉(zhuǎn)染到RD細胞內(nèi),根據(jù)前文的材料與方法部分所述,通過使用相關(guān)抗體的免疫沉淀或通過細胞因子ELISA來證實這些構(gòu)建物的表達。細胞因子基因共同注射后的體液免疫應(yīng)答收集用pCGag/po1免疫的小鼠的抗血清,用ELISA分析抗HIV-1抗原的特異性抗體應(yīng)答。
      在這些實驗中,在當天和第14天,肌肉注射共同給予50μg的各種DNA。注射前,和注射后28天,小鼠(每組4只)放血,收集血清。作連續(xù)稀釋1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600和1∶3200。ELISA的背景光密度低于0.015。重復(fù)這些實驗結(jié)果相似。如數(shù)據(jù)所顯示的,用抗p24 gag蛋白的ELISA測定了接種組的抗體的終點效價,還用抗gp120包膜蛋白的ELISA測定了接種組的抗體終點效價。以下數(shù)據(jù)是在DNA免疫后第28天收集的血清中產(chǎn)生的gag/pol-特異性抗體效價抗p24抗體效價單用pCGag/pol 400pCGag/pol+IL-1α 1600pCGag/pol+TNF-α 1600pCGag/pol+TNF-β 1600pCGag/pol+IL-23200pCGag/pol+IL-15 800pCGag/pol+IL-18 3200pCGag/pol+IL-43200pCGag/pol+IL-53200pCGag/pol+IL-10 1600與IL-2、IL-4、IL-5和IL-18共注射的組具有最高的終點效價水平。與單用pCGag/pol免疫的組相比,與IL-1α、TNF-α、TNF-β和IL-10共注射顯著加強了體液免疫應(yīng)答。用pCEnv免疫的組中,也觀察到了類似的結(jié)果。
      抗gp120抗體效價單用pCEnv 200pCEnv+IL-1α800pCEnv+TNF-α800pCEnv+TNF-β400pCEnv+IL-2 800pCEnv+IL-1 5400pCEnv+IL-1 8800pCEnv+IL-4 1600pCEnv+IL-5 1600pCEnv+IL-101600同樣,與IL-4、IL-5和IL-10共注射的組的血清見有最高的終點效價水平。T輔助細胞的產(chǎn)生T輔助淋巴細胞的激活和增殖在誘導(dǎo)通過B細胞產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和通過CD8+毒性T細胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答中起著重要作用。小鼠接受了兩種DNA免疫(均為50μg),間隔2周。在加強免疫注射后的第一周,將小鼠殺死,收獲脾臟,分離淋巴細胞,測試T輔助細胞的增殖。前炎性細胞因子共注射用共注射pCEnv或pCGag/pol和前炎性細胞因子IL-1α、TNF-α和TNF-β小鼠的脾臟進行增殖試驗。共注射前炎性細胞因子IL-12、TNF-α和TNF-β后,評價T輔助細胞的增殖反應(yīng),該實驗方法如下所述。在第一次pCEnv DNA(均為50μg)免疫后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)進行加強免疫。在又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗重組gp120蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。在第一次pCGag/pol和DNA(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)進行加強免疫。在又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗Pr55蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。得出以下數(shù)據(jù)
      抗原特異性T細胞增殖反應(yīng)gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCEnv 2.2 1.3pCEnv+IL-1α2.3 0.1pCEnv+TNF-α6.1 2.7pCEnv+TNF-β3.1 1.8對照 0.5 0.2gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCGag/pol 2.4 0.8pCGag/pol+IL-1α2.8 1.4pCGag/pol+TNF-α12.42.2pCGag/pol+TNF-β4.0 1.9對照 0.6 0.8以上數(shù)據(jù)顯示,在對照組中有背景水平的增殖作用,在單用pCEnv或單用pCGag/pol免疫的組中有中等水平的增殖反應(yīng)。即使與pCEnv或pCGag/pol共同注射了IL-1α的組,也沒有引起T輔助細胞增殖反應(yīng)的增加,但是pCEnv+TNF-β共注射的組導(dǎo)致T輔助細胞增殖反應(yīng)的明顯增強,當gp120蛋白濃度為5μg/ml時刺激指數(shù)為3.1。與此相似,當Pr55蛋白濃度為5μg/ml時,共注射pCGag/pol+TNF-β產(chǎn)生4.0的刺激指數(shù)。pCEnv+TNF-α和pCGag/pol+TNF-α共注射觀察到甚至更高的T輔助細胞增殖水平,刺激指數(shù)分別為6.1和12.4(蛋白質(zhì)濃度均為5μg/ml)。Th1細胞因子共注射對共傳遞Th1細胞因子IL-2、IL-15和IL-18進行了研究。pCEnv+IL-18和pCGag/pol+IL-18共注射組的刺激指數(shù)分別為4.4和10.0(蛋白濃度各為5μg/ml)。給小鼠共注射IFN-γ誘導(dǎo)性Th1細胞因子IL-12和IL-18后評價T輔助細胞的增殖反應(yīng),該實驗方法如下。在第一次pCEnv和DNA(均為50μg)免疫后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗重組gp120蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。在第一次pCGag/pol和DNA(均為50μg)免疫后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗Pr55蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。得出以下數(shù)據(jù)gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCEnv 2.21.3pCEnv+IL-184.40.8pCEnv+IL-127.83.8對照 0.50.2gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCGag/pol 2.40.8pCGag/pol+IL-1810.0 2.1pCGag/pol+IL-1212.0 3.8對照 0.60.8此外,pCEnv+IL-2和pCGag/pol+IL-2共注射的刺激指數(shù)分別為6.0和12.0(蛋白質(zhì)濃度均為5μg/ml)。但是,共傳遞IL-15引起較為緩和的T輔助細胞增殖反應(yīng)增強。給小鼠共注射IL-2受體依賴性Th1細胞因子IL-2和IL-15,然后評價T輔助細胞的增殖反應(yīng),該實驗方法如下。在第一次pCEnv和DNA(均為50μg)免疫后兩周,以相同的劑量給小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗重組gp120蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。在第一次pCGag/pol和DNA(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量給小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗Pr55蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。得出以下數(shù)據(jù)
      gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCEnv 2.21.3pCEnv+IL-2 6.02.1pCEnv+IL-152.32.0對照 0.50.2gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCGag/pol 2.40.8pCGag/pol+IL-2 12.0 2.5pCGag/pol+IL-152.60.6對照 0.60.8Th2細胞因子共注射除對前炎性細胞因子和Th1細胞因子共注射進行檢測之外,還研究了Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-10與pCEnv和pCGag/pol共傳遞的效果。與單用pCEnv或pCGag/pol免疫的組相比,與IL-4或IL-5共注射的兩組都表現(xiàn)出中等程度的T輔助細胞增殖反應(yīng)加強。共注射以Th2細胞因子IL-5和IL-10后評價T輔助細胞增殖反應(yīng),此實驗方法如下。在第一次pCEnv和DNA(均為50μg)免疫后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗重組gp120蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。在第一次pCGag/pol和DNA(均為50μg)免疫后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,進行抗Pr55蛋白(最終濃度為5和1μg/ml)的測試。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。得出以下數(shù)據(jù)gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCEnv 2.2 1.3pCEnv+IL-4 3.8 2.9pCEnv+IL-5 2.4 1.8pCEnv+IL-104.5 2.3對照 0.5 0.2
      gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml單用pCGag/pol2.40.8pCGag/pol+IL-4 5.03.1pCGag/pol+IL-5 3.12.4pCGag/pol+IL-10 8.02.4對照 0.60.8共注射IL-10對T輔助細胞增殖的加強更明顯,其刺激指數(shù)分別為4.5和8.0(蛋白質(zhì)濃度均為5μg/ml)。細胞毒性T淋巴細胞的產(chǎn)生為了進一步研究細胞免疫作用的加強而進行了細胞毒性T淋巴細胞(CTL)試驗,使用的是用pCEnv和pCGag/pol免疫的小鼠的脾細胞。小鼠接受兩次DNA免疫(每次50μg),間隔為2周。在加強免疫后一周,將小鼠處死取出脾臟,分離淋巴細胞,測試CTL反應(yīng)。分別進行了兩種試驗,即先刺激和不刺激效應(yīng)淋巴細胞,然后測試特異性和非特異性痘苗感染或肽處理靶細胞的鉻釋放。為了計算靶細胞的特異性溶解率,將特異性靶細胞(感染了vMN462或vVK1)溶解百分比減去非特異性靶細胞(感染了vSC8)溶解百分率。效應(yīng)細胞體外刺激的CTL反應(yīng)為了評價細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng),在共注射各種細胞因子后得出以下數(shù)據(jù)抗原特異性CTL反應(yīng)50∶1 25∶112.5∶1pCEnv 10%4% 3%pCEnv+IL-1α 14%10% 6%pCEnv+TNF-α 30%23% 18%pCEnv+TNF-β 20%16% 13%pCEnv+IL-2 22%16% 4%pCEnv+IL-15 46%28% 10%pCEnv+IL-12 35%24% 19%pCEnv+IL-18 22%16% 13%pCEnv+IL-4 4% 4% 7%pCEnv+IL-5 13%11% 9%pCEnv+IL-10 13%8% 3%對照3% 2.0% 3%50∶1 25∶112.5∶1pCGag/pol 12%11% 7%pCGag/pol+IL-1α 16%8% 1%pCGag/pol+TNF-α 29%20% 7%pCGag/pol+TNF-β 12%13% 3%pCGag/pol+IL-2 14%11% 10%pCGag/po1+IL-15 30%21% 7%pCGag/pol+IL-12 38%24% 15%pCGag/pol+IL-18 19%15% 4%pCGag/pol+IL-4 2% 2% 2%pCGag/pol+IL-5 0% 3% 2%pCGag/pol+IL-10 6% 6% 0%對照3.3% 2.8% 4.5%共注射前炎性細胞因子IL-1α、TNF-α和TNF-β后評價細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng),在此實驗中,在第一次DNA與pCGag/pol(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,用特異性痘苗(vVK1)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。在第一次pCEnv和DNA(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,用特異性痘苗(vNM462)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。
      共注射IFN-γ誘導(dǎo)的Th1細胞因子IL-12和IL-18后評價細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng),在此實驗中,在第一次DNA與pCGag/pol(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,用特異性痘苗(vVK1)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。在第一次pCEnv和DNA(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,用特異性痘苗(vNM462)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。
      共注射IL-2受體依賴性Th1細胞因子IL-2和IL-15后評價細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng),在此實驗中,在第一次DNA與pCGag/pol(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,用特異性痘苗(vVK1)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。在第一次pCEnv和DNA(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離出淋巴細胞,用特異性痘苗(vNM462)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。
      共注射以Th2細胞因子IL-5和IL-10后評價細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng),在此實驗中,在第一次DNA與pCGag/pol(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,用特異性痘苗(vVK1)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。在第一次pCEnv和DNA(均為50μg)共注射后兩周,以相同的劑量對小鼠(每組4只)加強免疫。又一周后,采集免疫小鼠脾臟,分離淋巴細胞,用特異性痘苗(vNM462)和非特異性痘苗(vSC8)感染的靶細胞測試CTL反應(yīng)。這些實驗重復(fù)了2次,結(jié)果類似。共注射前炎性細胞因子將pCEnv或pCGag/pol與前炎性細胞因子IL-1α、TNF-α和TNF-β共同注射小鼠,得到CTL試驗結(jié)果的數(shù)據(jù),從對照動物觀察特異性殺傷的到背景水平,單用pCEnv免疫的動物表現(xiàn)出低水平的CTL反應(yīng)。用pCEnv+IL-1α或pCEnv+TNF-β共注射,對CTL活性有中等程度的提高。另一方面,用pCEnv+TNF-α共注射后,可觀察到對表達HIV包膜痘苗(vNM462)感染的靶細胞的特異性殺傷有更明顯的加強。當效靶比(E∶T)為50∶1時,共注射pCEnv+TNF-α后,特異性靶細胞溶解率超過30%。與此類似,小鼠用pCGag/pol+TNF-α免疫后,對表達HIV-1gag/pol痘苗(vVK1)感染的靶細胞的抗原特異性CTL溶解顯著加強(當E∶T為50∶1時的裂解率為29%),而用pCGag/pol+IL-1α或pCGag/pol+TNF-β共注射只導(dǎo)致CTL反應(yīng)的輕度增加。Th1細胞因子共注射研究了Th1細胞因子和DNA疫苗共同傳遞的效果。
      獲得單用pCEnv免疫和共注射了Th1細胞因子IL-12和IL-18小鼠的CTL試驗結(jié)果。與共給予IL-12不同,共注射IL-18對CTL反應(yīng)的增強更緩和。共給予IL-2也引起CTL反應(yīng)的中等程度加強。另一方面,用pCEnv+IL-15共免疫后,觀察到了CTL反應(yīng)更顯著的加強,特異性溶解率為46%。相類似的,經(jīng)pCGag/pol++IL-15共注射的小鼠抗原特異性CTL溶解也顯著加強(30%)。Th2細胞因子共注射在研究前炎性細胞因子和Th1細胞因子共傳遞的效果之外,還研究了共注射Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-10對CTL反應(yīng)水平的作用。雖然與這些細胞因子的共注射加強了T輔助細胞增殖反應(yīng),但將IL-4、IL-5或IL-10與pCEnv或pCGag/pol共注射并不導(dǎo)致CTL反應(yīng)的任何特異性加強作用。測定CTL反應(yīng)中的I類MHC限制作用為了確定共注射TNF-α和IL-15引起的CTL反應(yīng)增強是否緣于CD8+I類MHC限制性刺激,用HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTNK)進行CTL試驗,該肽已被證明是balb/c小鼠I類MHC限制性CTL的一個獨特表位。小鼠接受兩次各為50μg的DNA構(gòu)建物免疫,間隔2周,在第二次免疫后1周,收獲脾臟。用包膜特異性肽體外刺激脾細胞后進行CTL試驗。與IL-15和TNF-α共注射后,見到CTL反應(yīng)都顯著加強,E∶T為50∶1時的特異性殺傷分別為25%和32%(圖11)。在通過補體溶解從效應(yīng)細胞群中去除CD8+T細胞后,測定CTL活性證實了這一觀察。用50μg的各質(zhì)粒免疫小鼠兩次,間隔時間同上。進行CTL試驗,一組如前所述處理效應(yīng)細胞,另一組去除CD8+T細胞。如圖11B所示,去除CD8+T細胞抑制了共注射IL-15和TNF-α后抗原特異性CTL的加強。以上結(jié)果顯示,細胞毒活性的加強是抗原特異性的,I類MHC限制性的和CD8+T細胞依賴性的。直接CTL反應(yīng)(不體外刺激效應(yīng)細胞)對共注射IL-15和TNF-α誘導(dǎo)的直接CTL反應(yīng)水平進行了研究,因為從這兩個共給予組觀察到了恒定的高水平CTL反應(yīng)(進行了體外刺激)。在分離脾細胞的當天進行鉻釋放試驗。與共注射IL-12所見的直接CTL不同,pCEnv與TNF-α或IL-15共注射后沒觀察到誘導(dǎo)直接CTL活性(圖12)。
      討論任何免疫接種策略的總目標都是用最少的免疫接種誘導(dǎo)強烈而持久的病原特異性免疫應(yīng)答。但是,一種病原與保護作用之間的關(guān)系可能隨病因的變化而變化,而且,可以通過引導(dǎo)免疫應(yīng)答來達到結(jié)局的改善。例如,認為高水平的特異性抗體應(yīng)答對避免乙型肝炎病毒感染的保護作用十分重要,而避免淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染的保護作用則主要是由T細胞介導(dǎo)應(yīng)答來介導(dǎo)的??梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)所誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方向和強度來改進DNA疫苗策略的設(shè)計,以使保護作用與靶病原之間的關(guān)系更為相宜。
      作為一種新的免疫接種方法,核酸免疫已在多種動物模型中被證明,能在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答??刂泼庖邞?yīng)答的方向和強度的策略,可以生產(chǎn)出臨床上更有效的疫苗。更好的控制由疫苗或免疫治療產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的特定類型和方向可以通過與細胞因子和共刺激性分子之類免疫學(xué)上有重要意義的分子的基因共同傳遞來實現(xiàn)。
      作為免疫網(wǎng)絡(luò)的引發(fā)者和調(diào)節(jié)者,細胞因子在免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)中起著重要作用。根據(jù)它們在免疫系統(tǒng)的獨特功能,這些細胞因子可以進一步分為前炎性細胞因子、Th1細胞因子和Th2細胞因子。前炎性細胞因子IL-1、TNF-α和TNF-β作為宿主對損傷和感染反應(yīng)的起動者起著重要的作用。IL-1通過誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生IL-2和上調(diào)IL-2R間接激活T細胞。IL-1還通過誘導(dǎo)B細胞的分化、生長和IgG合成來影響B(tài)細胞。至少存在兩種形式的IL-1,分別稱為IL-1α和IL-1β,它們表現(xiàn)出相似的活性。TNF-α和TNF-β是密切相關(guān)的蛋白(氨基酸殘基同源性約為30%),它們結(jié)合相同的細胞表面受體。TNF-α是由活化的巨噬細胞、單核細胞和嗜中性細胞、活化的淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生的,而TNF-β則是由淋巴細胞產(chǎn)生的。TNF-α和TNF-β還牽涉到革蘭陰性菌感染引起的敗血性休克和類風濕關(guān)節(jié)炎。而且,TNF-α被認為在調(diào)節(jié)其它前炎性細胞因子中起著關(guān)鍵作用。
      Th1細胞因子調(diào)節(jié)細胞或T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。IFN-γ、即原型Th1細胞因子是由Th1、CD8+和NK細胞產(chǎn)生的,而且已被證明具有抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用,例如上調(diào)I類和II類MHC抗原。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),一種新的細胞因子,IFN-γ誘導(dǎo)性因子(IGIF)或IL-8,在受刺激PBMC中抑制IL-10產(chǎn)生的同時增加IFN-γ的產(chǎn)生。在人外周血單個核細胞(PBMC)中,IL-18還加強天然殺傷(NK)細胞的活性,這一點與其結(jié)構(gòu)上無關(guān)細胞因子IL-12類似。IL-2主要是由外部刺激而激活的T細胞產(chǎn)生的;它對于抗原特異性T細胞的增殖的克隆擴展至關(guān)重要。IL-2通過與3條鏈(α、β和γc)構(gòu)成的一受體系統(tǒng)的相互反應(yīng)在T細胞的活化中起關(guān)鍵作用。IL-15,一種新鑒定的IL-12同系物,是一種多效細胞因子,具有與IL-2類似的T細胞刺激活性。
      Th2細胞因子調(diào)節(jié)體液或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。IL-5是一種二聚體細胞因子,控制B細胞分化成為產(chǎn)生抗體的漿細胞。已經(jīng)證明,IL-5誘導(dǎo)鼠或人B細胞產(chǎn)生抗原特異性的IgA。此外,IL-5還促進嗜伊紅性粒細胞的生長和增殖。雖然最初顯示IL-10是由Th2 T細胞集落產(chǎn)生的,但它也由B細胞和單核細胞產(chǎn)生。作為原型Th2細胞因子,IL-10已被證明能抑制促分裂原活化的單核細胞產(chǎn)生IL-1α、IL-16、IL-18和TNF-α之類細胞因子,而且抑制IFN-γ的巨噬細胞激活作用。據(jù)報道,IL-10可能在HIV-1感染中起作用;與非感染個體的PBMC相比,無癥狀HIV陽性個體的PBMC中IL-10 mRNA水平上調(diào),而且IL-10水平提高。此外,已證明,IL-10降低了體外人巨噬細胞中病毒復(fù)制。
      研制了前炎性、Th1和Th2細胞因子的表達盒,分析它們在DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起體內(nèi)調(diào)節(jié)物作用的能力。將細胞因子基因與DNA免疫原構(gòu)建物一起肌內(nèi)注射傳遞到小鼠體內(nèi),分析它們對所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方向和強度的作用。與IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-18共注射,觀察到抗體反應(yīng)的顯著加強。與TNF-α、TNF-β、IL-12、IL-10和IL-18共注射,引起T輔助細胞增殖反應(yīng)的顯著加強,而與IL-5和IL-15的共注射則引起較緩和的T輔助細胞增殖反應(yīng)加強。而且,在所有的共注射組合中,只有TNF-α與IL-15共注射引起類似于IL-12共注射的CTL水平加強(特異性溶解率高于30%)。與僅用DNA免疫原免疫的動物組相比,與TNF-β、IL-12和IL-18共注射引起較緩和的CTL反應(yīng)增強。如同與IL-12或CD86共注射所見,與TNF-α和IL-15共注射所見的CTL反應(yīng)增強受到I類MHC和CD8+T細胞的限制。
      IL-18據(jù)稱具有與IL-12相似的活性。例如,IL-18增強了人外周血單個核細胞(PBMC)培養(yǎng)中自然殺傷(NK)細胞的活性,這一點與其結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的細胞因子IL-12相似。IL-18還增強伴刀豆球蛋白A(Con A)刺激的PBMC產(chǎn)生IFN-γ,同時抑制IL-10的產(chǎn)生。還觀察到,IL-18通過IL-12非依賴性途徑誘導(dǎo)IFN-γ。雖然與IL-12共傳遞顯著加強了T細胞介導(dǎo)應(yīng)答水平同時中等程度降低體液應(yīng)答,但是與IL-18的共給予卻沒有見到類似的作用。相反,IL-18共給予顯著提高抗體效價。此外,與IL-12共傳遞顯著加強CTL不同,IL-18共注射不誘導(dǎo)類似水平的CTL加強。IL-18的免疫調(diào)節(jié)特性似乎與IL-10的相似。
      除了IL-12和IL-18共給予的體內(nèi)作用有差異之外,與IL-2共注射和與IL-15共注射也導(dǎo)致免疫應(yīng)答的方向和強度有所不同。IL-2和IL-15曾報道具有類似的生物活性,包括具有相同的IL-2受體γ鏈和相同的T細胞刺激信號機制。與IL-2共給予導(dǎo)致顯著增強抗體應(yīng)答和T輔助細胞增殖反應(yīng),而IL-15共注射則導(dǎo)致顯著加強CTL反應(yīng)。這種差異也許可以用IL-15的多效性來解釋。例如,IL-15曾報道在類風濕關(guān)節(jié)炎中通過激活滑液T細胞而顯著誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生。另一方面,IL-2誘導(dǎo)的TNF-α水平卻低得多。以上體內(nèi)數(shù)據(jù)提示,這兩種分子以不同方式參與激活信號機制。
      Th2細胞因子可用于改進Th2免疫應(yīng)答,而不影響T細胞介導(dǎo)應(yīng)答的水平。IL-4、IL-5和IL-10據(jù)稱是強Th2細胞因子。IL-4、IL-5和IL-10共傳遞引起抗體應(yīng)答水平和T輔助細胞增殖反應(yīng)水平的顯著提高。另一方面,CTL反應(yīng)的水平?jīng)]有提高。以上結(jié)果顯示,利用IL-4、IL-5和IL-10共給予可以人為改造Th2型應(yīng)答。
      一個重要發(fā)現(xiàn)是TNF-α和IL-15的多功能免疫調(diào)節(jié)劑作用。
      研究了多種免疫學(xué)上具有重要意義的細胞因子對DNA接種誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的作用。如圖13所概括的,通過共給予細胞因子基因,可以人為誘導(dǎo)獨特類型的免疫應(yīng)答。這種細胞因子基因佐劑系統(tǒng)強調(diào)在新的水平上調(diào)控特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo),以使得免疫過程產(chǎn)生的保護作用隨疾病不同而具有更適宜的關(guān)系。這種對疫苗和免疫治療的精確調(diào)控是前所未有的。結(jié)果,控制免疫應(yīng)答的方向和程度將有利于各種各樣的免疫策略。例如,在以T細胞介導(dǎo)應(yīng)答為主,而體液應(yīng)答不需要甚至有害的情況下,可以選用IL-12基因作為免疫調(diào)節(jié)劑與特異性DNA免疫原共傳遞。相反,為了建靶向?qū)Π饧毦囊呙?,可共注射以例如IL-4、IL-5或IL-10基因。而且,如果CD4+T輔助細胞和抗體在保護作用中都起重要作用,可共傳遞GM-CSF和IL-2。最后,如果這三種類型的免疫應(yīng)答都是關(guān)鍵性的,可共注射TNF-α,綜合加強抗體、T輔助細胞和CTL應(yīng)答。實施例6通過PCR反應(yīng),利用合適的限制性酶,將圖14的插入片段BL1克隆和連接到PCR3真核表達載體即載體pBBKan(如圖15)內(nèi)。將BL1構(gòu)建物與不同的HIV-1抗原共同給予,測定其在小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用。圖16和17A、B、C和D中的結(jié)果表明,BL1內(nèi)的DNA片段在與HIV-1抗原共免疫時加強了免疫應(yīng)答。所觀察到的是在脾臟腫大和抗體與CTL應(yīng)答加強方面的不同效果。
      表1小RNA病毒科鼻病毒屬(醫(yī)用)造成50%的普通感冒。
      Etheroviruses(醫(yī)用)包括脊髓灰質(zhì)炎病毒,柯薩奇病毒,???ECHO)病毒,人腸道病毒例如甲肝病毒。
      Apthoviruses(獸醫(yī)用)這些是足口腔病毒。
      靶抗原VP1,VP2,VP3,VP4,VPGCalcivirus科Norwalk組病毒屬(醫(yī)用)這些病毒是流行性胃腸炎的重要致病因子。披膜病毒科α病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)其實例包括Senilis病毒、RossRiver病毒和東方和西方馬腦炎病毒。
      呼腸孤病毒屬(醫(yī)用)風疹病毒。黃病毒科例如(醫(yī)用)登革熱病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦膜炎病毒和虱傳腦炎病毒。丙肝病毒(醫(yī)用)這些病毒不屬于任何科,但被認為或者是披膜病毒或者是黃病毒。大部分類似于披膜病毒科。冠狀病毒科(醫(yī)用和獸醫(yī)用)傳染性支氣管炎病毒(禽)豬可傳遞胃腸炎病毒(豬)豬血凝腦脊髓炎病毒(豬)貓傳染性腹膜炎病毒(貓)貓小腸冠狀病毒(貓)狗冠狀病毒(狗)人呼吸道冠狀病毒引起約40%普通感冒。EX.224E,0C43。注意冠狀病毒可能引起非甲、非乙和非丙肝的肝炎。
      靶抗原E1-又稱M蛋白或基質(zhì)蛋白E2-又稱S蛋白或刺突蛋白E3-又稱HE或血細胞凝集elterose糖蛋白(并不存在于所有的冠狀病毒中)N-核衣殼彈狀病毒科Vesiliovirus屬狂犬病病毒(醫(yī)用和獸醫(yī)用)狂犬病靶抗原G蛋白,N蛋白線狀病毒科(醫(yī)用)出血熱病毒,例如Marburg病毒和Ebola病毒副粘病毒科副粘病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)腮腺炎病毒,新城疫病病毒(重要的雞致病原)麻疹病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)麻疹病毒、狗瘟熱肺病毒(醫(yī)用或獸醫(yī)用)呼吸道合胞病毒正粘液病毒科(醫(yī)用)流感病毒環(huán)蛇屬病毒科(Bungavirus)環(huán)蛇病毒屬(醫(yī)用)加利福尼亞腦炎,LA Crosse白蛉熱病毒屬(醫(yī)用)Rift峽谷熱漢坦病毒屬Puremala是一種hemahagin熱病毒內(nèi)羅畢病毒屬(獸醫(yī)用)內(nèi)羅畢綿羊病還有許多未歸類的環(huán)蛇屬病毒屬沙粒病毒科(醫(yī)用)LCM,拉沙熱病毒呼腸孤病毒科呼腸孤病毒屬可能是一種人病原輪狀病毒兒童急性胃腸道炎環(huán)狀病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)科羅拉多虱傳熱病毒、Lebombo(人)、馬腦炎病毒、藍舌病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒科致癌病毒亞科(獸醫(yī)用和醫(yī)用)貓白血病病毒、HTLVI和HTLVII慢病毒亞科(醫(yī)用和獸醫(yī)用)HIV,貓免疫缺陷病毒、馬傳染病病毒、貧血病毒泡沫病毒亞科乳多空病毒科多瘤病毒亞科(醫(yī)用)BKU和JCU病毒乳頭瘤病毒亞科(醫(yī)用)與癌癥或乳頭瘤的惡性發(fā)展有關(guān)的許多種病毒腺病毒(醫(yī)用)EX AD7,ARD.,O.B.-引起呼吸道疾病部分腺病毒,例如275,引起腸炎細小病毒科(獸醫(yī)用)貓細小病毒引起貓腸炎貓腸炎病毒狗細小病毒豬細小病毒皰疹病毒科α皰疹病毒亞科單純皰疹病毒屬(醫(yī)用)HSVI,HSVII水痘病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)假狂犬病-水痘-帶狀皰疹病毒β皰疹病毒亞科巨細胞病毒屬(醫(yī)用)HCMV,Muromegalovirusγ皰疹病毒亞科淋巴隱病毒屬(醫(yī)用)EBV-(Burkitts淋巴細胞),Rhadinovirus痘病毒科帶狀痘病毒亞科(醫(yī)用-獸醫(yī)用)天花病毒屬牛痘屬副痘病毒屬-(獸醫(yī)用)山羊痘病毒屬-獸醫(yī)用兔痘病毒屬豬痘病毒屬Entemopoxviridue亞科肝DNA病毒科乙型肝炎病毒未分類的δ肝炎病毒表2細菌病原革蘭陽性病原球菌包括肺炎球菌;葡萄球菌;和鏈球菌。
      革蘭陰性病原球菌包括腦膜炎球菌和淋球菌。
      病原性革蘭陰性腸道桿菌包括腸桿菌;假單孢菌,不動桿菌和eikenilla;類鼻疽;沙門菌;志賀菌;嗜血桿菌;軟下疳;布魯桿菌?。煌晾鸁?;巴斯德菌;鏈桿菌屬;念珠菌和螺菌屬;產(chǎn)單核細胞李斯特菌;豬紅斑單毒絲菌;白喉桿菌;霍亂桿菌;炭疽桿菌;杜諾凡菌;和巴爾通氏體。
      病原性厭氧菌包括破傷風桿菌;肉毒菌和其它羧菌;結(jié)核菌;麻風桿菌和其它分枝桿菌。病原性螺旋體病包括梅毒;密螺旋體??;;雅司疹;品它病和地方流行性梅毒;和鉤端螺旋體病。由較高級病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括放線菌病;諾卡菌?。浑[球菌病,酵母菌病,組織胞漿菌病和球孢子菌?。荒钪榫?,曲霉病,和毛霉菌?。绘咦咏z菌病,巴西芽生菌病,petriellidosis,球擬酵母菌屬,足分枝菌病和著色芽生菌?。缓推つw真菌病。
      立克次體感染包括立克次體的和立克次體病。
      支原體和衣原體感染的病例包括支原體肺炎;性病性淋巴肉芽腫;鸚鵡熱;和產(chǎn)期衣原體感染。真核細胞病原由致病性原蟲和蠕蟲引起的感染包括阿米巴??;瘧疾;利什曼??;錐蟲??;弓形體?。环闻葑酉x?。宦⊥?;巴貝蟲?。毁Z第鞭毛蟲?。恍x?。获R來絲蟲??;血吸蟲?。痪€蟲;吸蟲;和絳蟲感染。
      權(quán)利要求
      1.一種質(zhì)粒,包含的核苷酸序列編碼a)免疫調(diào)節(jié)蛋白,選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1,該序列與調(diào)控元件操作性連接;和b)編碼免疫原的核苷酸序列。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒,其中所述的免疫原是與調(diào)控元件操作性連接的靶蛋白,所述的靶蛋白是病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒,其中所述的免疫原是HIV-1抗原。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒,其中所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白是單鏈IL-12。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒,它包含與調(diào)控元件操作性連接的編碼多種免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的核苷酸序列,所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1,其中各核苷酸序列編碼一個免疫調(diào)節(jié)蛋白。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒,它包含多份編碼所述免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。
      7.一種藥物組合物,它包含權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
      8.一種免疫接種個體抵抗病原的方法,它包括給予所述個體權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
      9.一種組合物,它包含一種或多種質(zhì)粒,包括第一質(zhì)粒,它包含與調(diào)控元件操作性連接的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1,和第二質(zhì)粒,它包含編碼免疫原的核苷酸序列。
      10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物,所述的第二質(zhì)粒編碼的免疫原選自病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。
      11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物,其中所述的免疫原是HIV-1抗原。
      12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物,其中所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)是單鏈IL-12。
      13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物,其中所述的第一質(zhì)粒包含與調(diào)控元件操作性連接的編碼多種某免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
      14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物,它還包含第三質(zhì)粒,所述的第三質(zhì)粒包含與調(diào)控元件操作性連接的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
      15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物,其中所述的第一質(zhì)粒包含多份編碼所述免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。
      16.一種藥物組合物,它包含權(quán)利要求9所述的組合物。
      17.一種免疫接種個體抵抗病原的方法,包括給予所述個體權(quán)利要求9所述的組合物。
      18.一種重組疫苗,它包含與調(diào)控元件操作性連接的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,這些免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1,該重組疫苗還包含編碼免疫原的核苷酸序列。
      19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組疫苗,其中所述的免疫原選自病原性抗原、癌相關(guān)抗原或與自身免疫病相關(guān)細胞連接的抗原。
      20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組疫苗,其中所述的疫苗是重組的牛痘疫苗。
      21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組疫苗,其中所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白是單鏈IL-12。
      22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組疫苗,其中所述的免疫原是病原性抗原。
      23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組疫苗,它還包含分別與調(diào)控元件操作性連接的編碼多份一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
      24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組疫苗,它包含編碼所述免疫調(diào)節(jié)蛋白的多份核苷酸序列。
      25.一種免疫接種個體抵抗病原的方法,包括給予所述個體權(quán)利要求18所述的重組疫苗。
      26.一種減毒活病原,它包括與調(diào)控元件操作性連接的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
      27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的減毒活病原,包括與調(diào)控元件操作性連接的編碼多份免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列,所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1,其中所述各序列分別編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白。
      28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的活性減毒病原,它包含多份編碼所述免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。
      29.一種免疫接種個體抵抗病原的方法,包括給予所述個體權(quán)利要求26所述的減毒活病原。
      30.一種質(zhì)粒,它包含編碼單鏈IL-12的核苷酸序列。
      31.一種基本純的BL-1蛋白,具有圖14的氨基酸序列,或其免疫調(diào)節(jié)片段。
      32.一種重組表達載體,它包含編碼權(quán)利要求21所述蛋白的核苷酸序列。
      33.根據(jù)權(quán)利要求22所述的重組表達載體,它包含圖14中的核苷酸序列。
      34.一種分離的抗體,它結(jié)合權(quán)利要求21所述蛋白上的表位。
      35.根據(jù)權(quán)利要求24所述的抗體,該所述的抗體是單克隆抗體。
      36.一種藥物組合物,它包含權(quán)利要求22所述的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體。
      全文摘要
      本發(fā)明揭示了改進型的疫苗,它包含與調(diào)控元件操作性連接的核苷酸序列,所述序列編碼的是IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和/或BL-1。改進型疫苗包括DNA疫苗、用于傳遞外源抗原的重組疫苗和減毒活疫苗。本發(fā)明還揭示了免疫接種個體的方法。還揭示了藥物組合物,該組合物包含編碼一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸分子,所述的調(diào)節(jié)蛋白選自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α,TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。本發(fā)明還揭示了一種免疫調(diào)節(jié)蛋白,BL-1,和編碼BL-1的核酸分子。還揭示了制造和使用BL-1的方法。
      文檔編號C07K14/54GK1242045SQ9718089
      公開日2000年1月19日 申請日期1997年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月23日
      發(fā)明者J·J·基姆, 王賓, J·D·博耶, D·B·韋納, V·阿亞沃 申請人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會
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