專利名稱：冷凍干燥的穩(wěn)定的單克隆或多克隆抗體藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冷凍干燥的單克隆抗體或多克隆抗體藥物制劑，該制劑含有糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑作為穩(wěn)定劑。另外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)這些穩(wěn)定的冷凍干燥物冷凍干燥物的方法，以及糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑在含有抗體的治療或診斷試劑中作為穩(wěn)定劑的應(yīng)用。
生產(chǎn)用于治療及診斷目的的免疫球蛋白，特別是單克隆抗體和多克隆抗體，目前，有非常重要的意義，并且將越來越重要。
長時(shí)間以來，已經(jīng)知道抗體能用作藥物試劑，并且有廣泛應(yīng)用。因此，例如，抗體已經(jīng)成功地用于破傷風(fēng)預(yù)防、對(duì)抗病原微生物或中和它們的毒素，抗體還成功的用于治療蛇毒中毒。
如果已認(rèn)識(shí)了與疾病機(jī)理有關(guān)的抗原，許多感染和一些抗體治療的腫瘤指征就是這種情況，就可以利用抗體的特異性進(jìn)行治療。
在臨床和臨床前研究中，目前抗體用于降低膽固醇水平，影響血管緊張素-腎素系統(tǒng)以及用于自身免疫疾病例如狼瘡、自身免疫腦炎、多發(fā)性硬化重癥、多關(guān)節(jié)炎和自身免疫重癥肌無力。
抗體的另外一個(gè)治療意義是它們?cè)趯?duì)抗低分子物質(zhì)引起的中毒中的應(yīng)用，例如抗地高辛抗體的Fab片斷用于治療地高辛或強(qiáng)心甙類如洋地黃毒甙和G毒毛旋花甙引起的中毒。并且，在診斷領(lǐng)域，抗體還用來識(shí)另、純化和確定蛋白質(zhì)的含量。
70年代后期和80年代，基因工程。徹底改變了細(xì)胞培養(yǎng)物中單克隆抗體的形成，極大地改進(jìn)了抗體的制備。
為了完成這些不同的用途，有必要制備能穩(wěn)定儲(chǔ)存的單克隆抗體和多克隆抗體藥物制劑。已經(jīng)有許多關(guān)于液體制劑或特異性抗體的冷凍干燥物的出版物。例如EPO 280 358、EP 0 170 983、WO 89/11298、EP 0352 500和JP 63088197中記載了抗體的液體制劑。
根據(jù)EP 0 280 358，把葡聚糖加入到抗體溶液中，穩(wěn)定化該抗體以對(duì)抗某些激素，通過這種方式可使其在9個(gè)月以上時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。根據(jù)EPO 170 983，在加熱時(shí)，加入水解的卵白蛋白以穩(wěn)定受熱易分解的單克隆抗體，結(jié)果該抗體在45℃儲(chǔ)存7天后仍然可以使用。多羥基醇(如甘油、肌醇、聚乙烯基醇)或糖(如蔗糖和葡萄糖)或糖醇類(如山梨糖醇、甘露糖醇)公開在JP63088197中作為其它的液體制劑穩(wěn)定劑。WO89/11298公開了在含有氯化鈉的磷酸鹽緩沖液中麥芽糖用作另一種液相穩(wěn)定單克隆抗體的方法。EP0352500描述聚乙二醇4000和3-丙醇酸內(nèi)酯用于單克隆抗體的液相穩(wěn)定。
然而，通常來說，由于儲(chǔ)存穩(wěn)定性的原因，液體制劑并不是最理想辦法，因?yàn)樵跍囟壬叩那闆r下，當(dāng)運(yùn)輸通過不同氣候地區(qū)或者未按正常方法儲(chǔ)存，(如冷卻鏈中斷)在貯存期間蛋白質(zhì)或其聚合物可能會(huì)沉淀，因此該溶液可能蛋白質(zhì)含量降低并且可能產(chǎn)生混蟲。因此，在上面所述情況下，不能保證該溶液的應(yīng)用不出問題。
與上面相反，對(duì)于冷凍干燥物制劑，水的除去使降解產(chǎn)物(如通過脫酰胺和水解)和聚集物的形成減少。殘余水(結(jié)合水)的量與穩(wěn)定性相關(guān)特別是在糖存在時(shí)。(Hsu等，Dev.Biol.Stand.1991，74255-267；Pikal等，Dev.Biol.Stand.1991，7421-27)。
已有文獻(xiàn)中記載了含特殊抗體作為活性物質(zhì)的冷凍干燥物制劑，但對(duì)于穩(wěn)定化問題，并沒有給出統(tǒng)一的解決方法。在WO93/00807中記載了由低溫保護(hù)劑(如聚乙二醇)和一種能與蛋白質(zhì)形成氫鍵的化合物組成的雙組份系統(tǒng)來穩(wěn)定生物物質(zhì)如人體蛋白質(zhì)、生長激素、白介素、干擾素、酶以及單克隆和多克隆抗體。然而，這些制劑的缺點(diǎn)在于加入高分子化合物如聚乙二醇，會(huì)導(dǎo)致其在體內(nèi)聚集，若不能生物降解，具有潛在的毒副作用。而且，眾所周知，取決于其分子量，聚合物可以作為抗原。
根據(jù)JP60146833，加入白蛋白(人、馬或牛白蛋白)，冷凍時(shí)不穩(wěn)定的單克隆抗體的冷凍干燥物可以保持穩(wěn)定一年時(shí)間。在EP0303088還記載了人血清白蛋白(HSA)與糖(如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)結(jié)合用來穩(wěn)定治療綠膿桿菌感染的單克隆抗體。
在EP0413188中，人血清白蛋白(與糖和氨基酸結(jié)合)亦是穩(wěn)定單克隆抗體的物質(zhì)。在JP01075433中，人血清白蛋白、甘露糖醇和聚乙二醇的混合物用來穩(wěn)定冷凍干燥物中一種人類的單克隆抗體。WO84/00890中記載了另一個(gè)利用大分子物質(zhì)如聚乙二醇和保護(hù)性蛋白質(zhì)如人血清白蛋白的例子，用來穩(wěn)定冷凍干燥期間的γ-球蛋白。
Hagiwaga等在WO93/01835中描述了通過與在含有氯化鈉和磷酸鹽緩沖液的溶液中的甘露糖醇和甘氨酸共同冷凍干燥，來穩(wěn)定人單克隆抗體。通過冷凍、冷凍干燥和再生可獲得穩(wěn)定的制劑。
Draber等人(免疫學(xué)方法雜志1995，18137-43)，通過在4℃單獨(dú)加入海藻糖以及其與聚乙二醇8000，可從鼠中得到穩(wěn)定的單克隆IgM抗體制劑。然而，該抗體在50℃時(shí)只能穩(wěn)定14天。單獨(dú)應(yīng)用其它的單糖或雙糖如蔗糖、麥芽糖、乳糖或半乳糖，則不可能穩(wěn)定這些抗體。
在WO89/11297中，記載了用糖(麥芽糖)和酸性范圍的緩沖液(乙酸鹽緩沖液)把來源于小鼠的單克隆抗體轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的冷凍干燥物。其缺點(diǎn)在于緩沖原限在酸性范圍。
在WO92/15 331中，用聚合明膠作為冷凍干燥物的冷凍保護(hù)劑和穩(wěn)定劑。同時(shí)可以用明膠與羧酸(如檸檬酸)或其鹽，以及與伯、仲或叔醇或者pH范圍內(nèi)6.8-8.1的氨基酸，這樣也可達(dá)到穩(wěn)定化的目的。
在所有上面提到的一系列出版物中，所提到的藥物添加劑或輔料物質(zhì)作為穩(wěn)定劑，從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)看是不能接受的。因此，聚合物(如PEG或明膠)和蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)由于其來源及其理化性質(zhì)是存在一定危險(xiǎn)性的，并且能引發(fā)過敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致過敏性休克。人或動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)以及來源于細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)還可帶來病毒污染的危險(xiǎn)性。而其它難以分析監(jiān)測的類蛋白質(zhì)污染物可能由于它們的性質(zhì)能夠引起人體免疫學(xué)反應(yīng)。
如果不發(fā)生生物降解，聚合物如聚乙二醇(PEG)或明膠的加入會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)聚集，引起潛在的毒性副作用。
取決于分子量，聚合物也可以有抗原性質(zhì)。由于在生產(chǎn)過程中催化劑的使用或者單體及其它聚合體片斷的存在，也很難保證該聚合體的純度。在給藥的藥物劑型中，尤其是在能皮下給藥的藥物劑型中，如果能有另外的穩(wěn)定化方法，應(yīng)該避免應(yīng)用聚合物。
相反地，單獨(dú)用糖而沒有其它添加劑，當(dāng)冷凍干燥抗體時(shí)，不能保證足夠的保護(hù)作用。
因此，本發(fā)明的目的是提供穩(wěn)定的單克隆或多克隆抗體藥物制劑，該制劑基本上不含有前面所述的聚合物或蛋白質(zhì)藥物輔料物質(zhì)。這特別能應(yīng)用于那些在冷凍和解凍期間或者在多次冷凍和解凍期間不穩(wěn)定的抗體。
令人驚奇的發(fā)現(xiàn)如果含有糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑作為添加劑，可以得到穩(wěn)定的單克隆或多克隆抗體的藥物冷凍干燥物。其中的冷凍干燥物優(yōu)選組成是a)抗體，b)糖或氨基糖，c)氨基酸，d)用于調(diào)整pH值的緩沖液和e)表面活性劑。其中，只含有一種或者兩種不同的氨基酸是特別優(yōu)選的。
這些制劑生理上非常耐受，具有相對(duì)簡單的組合物，并且能精確給藥。另外它們是穩(wěn)定的，即經(jīng)過多次冷凍和解凍過程，及長期儲(chǔ)存時(shí)，沒有顯示出有能檢測到的降解產(chǎn)品或者蛋白聚集物。
該冷凍干燥物能在冷藏溫度(4-12℃)貯存而無穩(wěn)定性問題，或甚至在室溫(18-23℃)下，貯存至少3個(gè)月，優(yōu)選至少6個(gè)月、尤其優(yōu)選至少1-2年的時(shí)間。而且，它們還能在較高溫度(例如高至30℃)下保持穩(wěn)定。顯示儲(chǔ)存穩(wěn)定性所依據(jù)的事實(shí)為，例如在所述儲(chǔ)存期間，在有注射用水或等滲溶液的容器中再生冷凍干燥物時(shí)，只能檢測出非常少量的顆粒。特別地，在所述容器中，大于10μm的顆粒不到6000粒，和/或大于25μm的顆粒不到600粒。這樣制備的溶液能夠在直至約5天，優(yōu)選3天的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。
由于挑選的添加劑組合，而得到防凍保護(hù)制劑的事實(shí)是特別有利的。因此，特別地，這樣使抗體能在低至-45℃時(shí)冷凍干燥而不損害其穩(wěn)定性。并且，根據(jù)本發(fā)明，含有組合添加劑的冷凍干燥物長時(shí)間甚至在較高溫度下，儲(chǔ)存期間也能保持穩(wěn)定。尤其與傳統(tǒng)制劑相比，在水中再生后，沒有顆粒形成，即溶液基本上不混濁。
本發(fā)明制劑還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是基本上不含蛋白樣或者聚合的輔料物質(zhì)，從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)看應(yīng)用這些物質(zhì)是可能存在問題的。由于現(xiàn)在可以通過溶解冷凍干燥物制備pH值約5-8、優(yōu)選pH值6.0-7.4(血液中pH值7.2-7.4)的含有抗體的液體治療或診斷試劑，它們具有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是耐受性良好并且給藥時(shí)基本上不疼痛。總之這對(duì)于皮下給藥是重要的，因?yàn)榕c靜脈給藥相比，皮下給藥更容易產(chǎn)生不耐受性。
在通常生產(chǎn)的本發(fā)明制劑中，抗體的臨床相對(duì)濃度范圍是例如達(dá)到20mg/ml，優(yōu)選達(dá)到10mg/ml，優(yōu)選的濃度范圍是高于0.01mg/ml的濃度范圍，特別是高于0.05和0.1mg/ml的濃度范圍。特別地，應(yīng)用0.05-10mg/ml或者0.1-5mg/ml的濃度范圍，例如用約5、8或10mg/ml。皮下或靜脈注射時(shí)，所用溶液的注射體積小于2ml，優(yōu)選約1ml。皮下給藥時(shí)，優(yōu)選小注射體積，因?yàn)檫@樣對(duì)皮下組織只有輕度機(jī)械刺激。這些溶液基本上還適合直接作為灌注溶液的添加劑或者作為灌注溶液。如果用作灌注溶液的添加劑，則抗體的濃度較高如達(dá)到10mg/ml。然后把這些濃縮的抗體溶液加入到通常的灌注溶液中，這樣在將要給藥的灌注溶液中，抗體的濃度在治療相關(guān)的范圍內(nèi)。這個(gè)范圍通常是0.001-0.5mg/ml。
簡單的藥物給藥形式可以是備用的灌注溶液或注射液或者是冷凍干燥物。如果藥物制劑以冷凍干燥物的形式應(yīng)用，則單劑量容器，例如容量10ml的玻璃安瓿，含有抗體的量為0.1-500mg，優(yōu)選10-100mg，這取決抗體各自相關(guān)的治療劑量。該冷凍干燥物任選地含有傳統(tǒng)的藥物輔料物質(zhì)。該冷凍干燥物以適量的再生溶液溶解，然后或能直接用作注射液或者用作灌注液的添加劑。如果用作灌注液的添加劑，該冷凍干燥物通常以約10ml的再生溶液溶解，然后加入到250ml生理鹽水(0.9％的氯化鈉)中。所得到的灌注液然后通常在約30分鐘內(nèi)給藥至病人。
根據(jù)本發(fā)明，所用的糖可以是單糖、雙糖或三糖。葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖和山梨糖可以作為供考慮的單糖。蔗糖、乳糖、麥芽糖或海藻糖可作為雙糖考慮。優(yōu)選用棉子糖作為三糖。根據(jù)本發(fā)明，蔗糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖或海藻糖是特別優(yōu)選的。也可應(yīng)用立體異構(gòu)體雙糖纖維素二糖、龍膽二糖或異麥芽糖來代替麥芽糖。
通常提到和應(yīng)用這些單糖是指氨基糖，即以氨基(-NH2、-NHR、-NR2)或者酰化氨基(-NH-CO-R)代替羥基。根據(jù)本發(fā)明，尤其優(yōu)選的是葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、半乳糖胺和神經(jīng)氨酸。糖含量或氨基糖含量為，例如，每個(gè)給藥形式達(dá)到2000mg，優(yōu)選達(dá)到1000mg，尤其優(yōu)選達(dá)到800mg或500mg。大于10、50或100mg含量可考慮為糖含量的下限。優(yōu)選范圍是200-1000mg，尤其是400-800mg。所述的每單個(gè)形式給藥量是指以冷凍干燥物出售的每個(gè)給藥形式。優(yōu)選把這樣的冷凍干燥物裝入10ml的注射瓶中。當(dāng)用10ml再生溶液把冷凍干燥物溶解后，就得到了可以直接給藥的液體給藥形式。這些注射液中的糖含量可達(dá)到200mg/ml，優(yōu)選達(dá)到100mg/ml，取決于所用糖的上面所述的量。
根據(jù)本發(fā)明，所用的氨基酸可以是堿性氨基酸如精氨酸、賴氨酸、組氨酸和鳥氨酸等，優(yōu)選使用氨基酸的形式是其無機(jī)鹽形式(優(yōu)選以磷酸鹽形式，即氨基酸的磷酸鹽)。如果應(yīng)用游離氨基酸，通過加入合適的生理耐受的緩沖物質(zhì)如無機(jī)酸，特別是磷酸、磺酸、乙酸、甲酸或其鹽，調(diào)節(jié)到所需要的pH值。在這種情況下，應(yīng)用磷酸鹽具有的特別優(yōu)點(diǎn)是可得到特別穩(wěn)定的冷凍干燥物。當(dāng)制劑中基本上不含有機(jī)酸如蘋果酸、酒石酸、枸櫞酸、琥珀酸和富馬酸等時(shí)，或者它們相應(yīng)的陰離子(蘋果酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽等)不存在時(shí)，證明是有利的。
優(yōu)選的氨基酸是精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。另外還可應(yīng)用酸性氨基酸如谷氨酸和天門冬氨酸，或者中性氨基酸如異亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸，或者芳香氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。根據(jù)本發(fā)明，水制劑中氨基酸含量可達(dá)到100mg/ml，優(yōu)選達(dá)到50mg/ml或達(dá)到30mg/ml.其下限可能是例如1、5或10mg/ml以上的濃度。優(yōu)選的濃度范圍，例如，為3-30mg/ml或10-25mg/ml。
如果相應(yīng)的給藥形式是以冷凍干燥物出售，這些冷凍干燥物優(yōu)選在注射瓶(如體積10ml)中使用。這樣的單個(gè)給藥形式含有氨基酸的量可達(dá)到1000mg，優(yōu)選達(dá)到500mg或達(dá)到300mg。
可考慮的表面活性劑是通常用于藥物制劑中的所有表面活性劑，優(yōu)選聚山梨醇酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物例如吐溫。0.05-0.5mg/ml，優(yōu)選0.1mg/ml的低含量表面活性劑足以穩(wěn)定所述抗體。在上面提到的單個(gè)給藥形式中，對(duì)于裝入10ml注射瓶中的冷凍干燥物，表面活性劑的量是0.5-5mg。
通過上述添加劑達(dá)到抗體的穩(wěn)定化，原則上涉及所有已知的單克隆和多克隆抗體以及它們的Fab片斷。優(yōu)選使用人源化抗體和改性抗體(參見例如US5,624,821；EPO 592 106；PCT/EP96/00098)。這些抗體的分子量是每個(gè)單體單位50-200k Da，特別是分子量約80-150 kDa。根據(jù)本發(fā)明，尤其可以穩(wěn)定的抗體有抗乙肝病毒抗體(參見WO94/11495)、抗AIDS病毒抗體、抗巨細(xì)胞病毒抗體、抗腦膜腦炎病毒抗體(FSME)、抗風(fēng)疹病毒抗體、抗麻疹病毒抗體、抗狂犬病病原體抗體、抗綠膿桿菌抗體、抗水痘帶狀皰疹病毒抗體、抗破傷風(fēng)病原體抗體、抗van Willebrandt因子抗體(參見WO 96/17078)、抗NGFR(神經(jīng)生長因子受體K)抗體、抗PDGFR(血小板衍生的生長因子受體Shulman，Sauer，Jackman，Chang，Landolfi，生物化學(xué)雜志1997，272(28)17400-4)抗體、抗selectin抗體、特別是抗E-selectin抗體、抗L-selectin抗體(參見Takashi等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1990，872244-2248；WO 94/12215)或者抗P-selectin抗體；抗integrins抗體或抗白喉病原體抗體?？贵w濃度可優(yōu)選達(dá)到8mg/ml。優(yōu)選例如0.05-2mg/ml。在單個(gè)給藥形式中，例如在10ml注射瓶中的冷凍干燥物中，抗體的量可達(dá)到100mg，優(yōu)選80mg、50mg、20mg或10mg。用10ml體積再生冷凍干燥物之后，抗體的濃度范圍是1-10mg/ml，優(yōu)選5-8mg/ml。
除了含有所述添加劑，糖，氨基酸和表面活性劑外，本發(fā)明冷凍干燥物還可含有生理上耐受的輔料物質(zhì)，選自酸、堿、緩沖試劑或等滲試劑以調(diào)整pH值至5-8，優(yōu)選6.0-7.4。制劑的緩沖容量調(diào)整到，當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)再生溶液如注射用水溶解該冷凍干燥物時(shí)，該緩沖劑濃度范圍是10-20mmol/l，優(yōu)選約15mmol/l。
加入不同輔料物質(zhì)或者抗體的順序基本與生產(chǎn)過程無關(guān)，由本領(lǐng)域技術(shù)人員判斷。加入堿例如堿金屬氫氧化物、堿土金屬氫氧化物或者氨水以調(diào)整溶液至所述的pH值。優(yōu)選氫氧化鈉用于此目的。原則上可通過加入堿溶液能夠調(diào)整所需要的pH值。在這種意義上，通常用強(qiáng)堿的弱酸鹽是適合的，這樣的鹽如乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉和碳酸鈉。如果輔料物質(zhì)的藥物溶液的pH值偏堿，可通過酸滴定來調(diào)整pH直至達(dá)到所需要的pH值范圍?？梢钥紤]的酸為生理上耐受的無機(jī)酸或有機(jī)酸例如鹽酸、磷酸、乙酸、檸檬酸或者通常具有酸性pH值的物質(zhì)的溶液。在這個(gè)意義上，優(yōu)選的物質(zhì)是強(qiáng)酸弱堿鹽如磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉。優(yōu)選用磷酸或氫氧化鈉水溶液調(diào)整該溶液的pH值。
為了生產(chǎn)耐受性良好的胃腸外給藥形式，如果抗體的滲透性質(zhì)和用于穩(wěn)定的添加劑還未能使藥物達(dá)到等滲性，加入等滲輔料物質(zhì)是有用的。尤其是應(yīng)用非離子強(qiáng)耐受的輔料物質(zhì)。然而，對(duì)于鹽如氯化鈉，只能小量加入，特別是在最終用于給藥的注射液或灌流液中，應(yīng)該不超過30mmol/l的值。
另外，藥物制劑還可含有其它通常的輔料物質(zhì)或添加劑?？梢约尤肟寡趸瘎├绻入赘孰幕蛘呖箟难岬任镔|(zhì)。
為了生產(chǎn)冷凍干燥物，首先生產(chǎn)含有抗體的藥物水溶液。優(yōu)選制備含有氯化鈉的緩沖的抗體溶液。該抗體溶液與含有添加劑糖、氨基酸和表面活性劑的水溶液混合，同時(shí)用酸或堿調(diào)節(jié)pH至5-8。加入適量磷酸或磷酸鹽和氯化鈉，以使溶液達(dá)到先前確定的濃度。然后，過濾除菌，冷凍干燥以這種方式制備的溶液。
本發(fā)明還使含有對(duì)冷凍敏感抗體的不穩(wěn)定水溶液通過冷凍干燥的方式轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的制劑，并且該穩(wěn)定制劑在高溫下亦不變質(zhì)而保持穩(wěn)定。
根據(jù)本發(fā)明，該冷凍干燥物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于除了冷凍期間避免抗體損傷之外，即使在50℃下長期儲(chǔ)存，該冷凍干燥物的抗體含量不減少，并且沒有聚集物形成或不發(fā)生絮凝。因此，抗體的含量和純度，是穩(wěn)定的。用注射用水再生冷凍干燥物之后，低濁度值顯示顆粒物的形成被避免。
下面以應(yīng)用的實(shí)施例為基礎(chǔ)，更詳細(xì)的闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1-10顯示根據(jù)本發(fā)明，關(guān)于抗體穩(wěn)定性，用何種方式配方、制備和檢測該冷凍干燥物。
在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，不用輔料物質(zhì)，或者單用蔗糖，或者用甘露糖醇代替糖組份，或者單用氨基酸組份，或者只用糖或氨基酸組份而沒有表面活性劑，這樣的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明組合的添加劑的選擇是得到穩(wěn)定制劑所必須的。單獨(dú)用蔗糖、單獨(dú)用氨基酸或者用這兩種組份而沒有表面活性劑則得到不穩(wěn)定的制劑。
本發(fā)明制劑對(duì)冷凍不敏感，因此有可能完全不用被認(rèn)為有毒的聚合物或蛋白質(zhì)例如聚乙二醇、明膠和血清白蛋白。對(duì)于表面活性劑，只用相對(duì)少量生理上非常耐受的表面活性劑。
在下列應(yīng)用的實(shí)施例中，所用的抗HBV抗體是從鼠細(xì)胞得到的重組人單克隆抗體(MAB)。其分子量約147kDa，并針對(duì)乙肝病毒的乙肝表面抗原(HBSAg)。該單克隆抗體識(shí)別HBsAg中的α-決定簇，后者在幾乎所有的病毒變種中保持不變。例如該抗體能用于下列醫(yī)學(xué)指征從前沒有令人滿意治療方法的慢性肝炎的治療；對(duì)HBSAg陽性肝移植病人的被動(dòng)免疫預(yù)防治療。在中歐和北歐以及美國，高達(dá)2％的人群是乙肝病毒攜帶者，在南歐，高達(dá)3％；遠(yuǎn)東地區(qū)約10-15％。該慢性感染的結(jié)果是發(fā)展成肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)性增加100倍，40％的病毒攜帶者是因?yàn)樵摳腥径劳觥?br> 在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選使用的抗體是抗L-selectin抗體、抗NGF受體抗體或抗PDGF受體抗體。
實(shí)施例1顯示在pH＝5、pH＝6.5和pH＝8時(shí)，經(jīng)冷凍和解凍后，含有磷酸鹽緩沖液和氯化鈉的抗乙肝病毒單克隆抗體(MAB HBV；INN名Tuvirumab)水溶液的性質(zhì)。它表明冷凍和解凍破壞單克隆抗體。
實(shí)施例2顯示在該冷凍干燥物中抗體濃度為2mg/ml，即2mg時(shí)，蔗糖、麥芽糖或氨基糖(N-甲基葡萄糖胺或半乳糖胺)及精氨酸磷酸鹽和吐溫20穩(wěn)定本發(fā)明制劑的可能性。
除了抗體濃度為8mg/ml外，實(shí)施例2a所應(yīng)用的配方與實(shí)施例2相同。從實(shí)施例2和實(shí)施例2a可以看出所述輔料物質(zhì)的組合不但避免抗體在冷凍期間的損害，而且能夠增加其長期儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。
實(shí)施例3顯示本發(fā)明制劑中氨基酸和表面活性劑的必要性。應(yīng)用單獨(dú)組份蔗糖導(dǎo)致不穩(wěn)定的冷凍干燥物。
實(shí)施例4描述氨基酸組份的變化。結(jié)果證明精氨酸或鳥氨酸形式的堿性氨基酸變化以及用中性氨基酸如亮氨酸或者酸性氨基酸如天門冬氨酸代替上述堿性氨基酸得到能穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑。
在實(shí)施例5中，在不同pH值(pH5，pH6.5和pH8)下比較了含有蔗糖、精氨酸和吐溫20以及磷酸鹽緩沖液和氯化鈉的制劑的冷凍干燥。得到的數(shù)據(jù)表明在這些pH范圍內(nèi)，冷凍干燥不損害穩(wěn)定性。
在實(shí)施例6中，若用典型的表面活性類化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物(商品名Pluronic)代替所述表面活性劑吐溫20，也產(chǎn)生足夠穩(wěn)定的本發(fā)明制劑。
實(shí)施例7顯示含有甘露糖醇作為代替蔗糖、麥芽糖或氨基糖(見實(shí)施例2)的組份時(shí)，其制劑是不穩(wěn)定的。
實(shí)施例8表明如果在配方中不用糖或表面活性劑，該制劑是不穩(wěn)定的。
在實(shí)施例9中，盡管在應(yīng)用糖(如蔗糖)和氨基酸組合而沒有表面活性劑存在下，關(guān)于含量和聚集物的參數(shù)也得到良好結(jié)果，然而，與含有糖、氨基酸和表面活性劑的本發(fā)明制劑相比，濁度大大增加。
實(shí)施例10表明應(yīng)用糖、氨基酸和表面活性劑的組合物，還可以穩(wěn)定其它單克隆抗體。例如，抗L-selectin抗體，在冷凍干燥物中7mg的濃度是穩(wěn)定的。進(jìn)行冷凍干燥從1ml水溶液開始。
確定穩(wěn)定性的研究方法在確定的避光儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存該冷凍干燥制劑，然后進(jìn)行分析。應(yīng)用下列測試方法進(jìn)行分析。
OD280280nm處的光密度。蛋白質(zhì)含量的光度測定，由于側(cè)鏈的發(fā)色團(tuán)如色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸殘基，而產(chǎn)生紫外吸收。95-105％。
SE-HPLC尺寸排阻高效色譜法確定聚集物。規(guī)格最大2％。
濁度測量再生冷凍干燥物后，在合適的濁度光度計(jì)中測量未稀釋的抗體溶液。規(guī)格最大6個(gè)濁度單位。
實(shí)施例1制備如上所述含有磷酸鹽緩沖液和氯化鈉的抗乙肝病毒單克隆抗體的水儲(chǔ)備溶液，對(duì)其進(jìn)行檢測。單克隆抗體的濃度約15mg/ml。
表1a表明在-20℃時(shí)，不同的pH值下，單克隆抗體溶液在冷凍時(shí)不穩(wěn)定性，經(jīng)過4周后，蛋白質(zhì)含量減少至92.1％、94.2％和94.0％。在25℃儲(chǔ)存時(shí)也觀察到蛋白質(zhì)含量的減少。在冰箱中4-8℃的儲(chǔ)存條件下，該抗體能保持足夠穩(wěn)定9個(gè)月時(shí)間。
表1b-1d表示在-20℃、4-8℃和25℃時(shí)，pH為5、6.5和8時(shí)制備的單克隆抗體溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。這也表明只有在4-8℃溫度下的儲(chǔ)存是可以接受的。
表1a活性物質(zhì)溶液中抗體含量的變化(10mM磷酸鹽緩沖液，30mM氯化鈉、注射用水)
注所有數(shù)據(jù)是百分比數(shù)據(jù)。通過在280nm處測量的吸收來確定蛋白質(zhì)量(OD280)表1b)抗體活性物質(zhì)溶液的聚集物形成和濁度值，pH＝5
n.n.＝未檢測出。表1c)抗體活性物質(zhì)溶液的聚集物形成和濁度值，pH＝6.5
表1d)抗體活性物質(zhì)溶液的聚集物形成和濁度值，pH＝8時(shí)
聚集物用SE-HPLC以％表示，濁度用濁度光度計(jì)以濁度單位表示。
實(shí)施例2如實(shí)施例1中的抗乙肝病毒單克隆抗體溶液，將其加入到含有磷酸精氨酸鹽緩沖液和吐溫20作為表面活性劑的下列糖或氨基糖的水溶液中蔗糖(配方1)、麥芽糖(配方2)和N-甲基葡萄糖胺(配方3)。配方如實(shí)施例2a所示。MAB的最終濃度是2mg/ml。用磷酸調(diào)整pH值到6.5之后，過濾消毒該溶液(0.22μm膜過濾器)，裝入到消毒后并去熱的玻璃注射瓶(水解類I)(填裝體積1ml)，然后冷凍干燥。注射瓶冷凍干燥之后，用氮?dú)獬錃?，在冷凍干燥室中用塞子機(jī)械密封，然后裝上凸緣。
裝上凸緣的注射瓶在不同溫度下避光保存4-13周。然后，用所述檢測方法來檢測該冷凍干燥物的穩(wěn)定性。
表2a在25℃下儲(chǔ)存
表2b在50℃下儲(chǔ)存
注I用OD280測量，以％表示的蛋白質(zhì)含量II用SE-HPLC測的以％表示的聚集物III以濁度單位表示的再生溶液的濁度(無量綱數(shù)據(jù))n.n.未檢測出(所有下列表中采用同一方式表示)
實(shí)施例2a在實(shí)施例2a中，用8mg/m1抗體制備實(shí)施例2中的配方1(＝配方1a)。結(jié)果證明高達(dá)8mg/ml濃度的抗體在該配方中足夠穩(wěn)定配方1和1a的組成配方1配方1aMAB HBV 2.0mg8.0mg磷酸鹽緩沖液 15mM 15nM氯化鈉30mM 30mM蔗糖 68.0mg 58.0mg精氨酸10.0mg 10.0mg磷酸調(diào)至pH6.5 調(diào)至pH6.5吐溫200.1mg0.1mg注射用水 加至1ml 加至1.0ml表3a25℃下，配方1和配方1a的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
表3a50℃下，配方1和配方1a穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
注I用OD280測量，以％表示的蛋白質(zhì)含量
II用SE-HPLC測的以％表示的聚集物III以濁度單位表示的再生溶液的濁度(無量綱數(shù)據(jù))實(shí)施例3配方1和4的對(duì)比。配方4只含有蔗糖作為組份，不含精氨酸磷酸鹽和吐溫20。配方4不穩(wěn)定。
配方1 配方4MAB HBV 2.0mg 2.0mg磷酸鹽緩沖液15mM 15mM氯化鈉 30mM 30mM蔗糖68.0mg68.0mg精氨酸 10.0mg--磷酸或氫氧化鈉 調(diào)至pH6.5 調(diào)至pH6.5吐溫20 0.1mg --注射用水 加至1ml加至1.0ml表4a 25℃溫度下儲(chǔ)存
<p>表4b50℃溫度下儲(chǔ)存
注I用OD280測量，以％表示的蛋白質(zhì)含量II用SE-HPLC測的以％表示的聚集物III以濁度單位表示的再生溶液的濁度(無量綱數(shù)據(jù))實(shí)施例4制劑中氨基酸組份的變化。含堿性、酸性和中性氨基酸的制劑是穩(wěn)定的配方組成MAB HBV 2.0mg磷酸鹽緩沖液15mM氯化鈉 30mM蔗糖35-70mg氨基酸 可變動(dòng)磷酸或氫氧化鈉 調(diào)至pH6.5吐溫20 0.1mg注射用水加至1.0ml表5氨基酸配方1精氨酸(堿性)配方5鳥氨酸(堿性)配方6亮氨酸(中性)配方7天門冬氨酸(酸性)用磷酸或者氫氧化物溶液調(diào)整pH值。表6a-d配方1、5、6、7儲(chǔ)存4周和13周后的檢查結(jié)果a)表6a配方1(精氨酸)
b)表6b 配方5(鳥氨酸)
c)表6c配方6(亮氨酸)
d)表6d配方7(天冬氨酸
實(shí)施例5實(shí)施例5含有不同pH值下的配方1，如實(shí)施例2所述制備冷凍干燥物，在冷凍干燥之前用85％磷酸調(diào)整輔料物質(zhì)溶液和產(chǎn)品溶液的pH值。
配方MAB HBV 2.0mg磷酸鹽緩沖液 15mM氯化鈉 30mM蔗糖 68mg精氨酸 10mg磷酸 調(diào)至pH5；6.5；8吐溫20 0.1mg注射用水 加至1.0ml制備表7所示pH值下的冷凍干燥物。
注射瓶裝上凸緣后，在確定溫度條件下避光儲(chǔ)存。經(jīng)儲(chǔ)存4周和13周后，分析樣品(蛋白質(zhì)含量以％表示OD280，聚合物以％表示SE-HPLC，濁度)。該配方在所有pH值下是穩(wěn)定的。
表7pH配方8 5配方9(同1)6.5配方108表8a25℃下儲(chǔ)存
表8b50℃下儲(chǔ)存
注I用OD280測量，以％表示的蛋白質(zhì)含量II用SE-HPLC測的以％表示的聚集物III以濁度單位表示的再生溶液的濁度(無量綱數(shù)據(jù))實(shí)施例6用Pluronic F68代替吐溫20作為表面活性劑，如上所述，制備下面的配方。
通過與其它實(shí)施例類似的方式，進(jìn)行儲(chǔ)存和穩(wěn)定性的檢測。
配方11MAB HBV 2.0mg磷酸鹽緩沖液15mM氯化鈉 30mM蔗糖48.0mg精氨酸 10.0mg磷酸調(diào)至pH6.5Pluronic F680.1mg注射用水加至1.0ml選擇配方1作為對(duì)照，除了用吐溫20代替Pluric F68外，配方1與配方11完全相同。這兩種制劑都是穩(wěn)定的。
表9含有Pluronic作為表面活性劑和含有吐溫20作為表面活性劑的配方穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
實(shí)施例7該實(shí)施例所描述的配方12基本上相當(dāng)于配方1，但是用甘露糖醇代替蔗糖作為組份。可以看出該甘露糖醇配方是不穩(wěn)定的。
配方12MAB HBV 2.0mg磷酸鹽緩沖液15mM氯化鈉 30mM甘露糖醇25.0mg精氨酸 10.0mg磷酸調(diào)至pH6.5吐溫20 0.1mg注射用水加至1.0ml表10含有甘露糖醇配方(配方12)和蔗糖配方(配方1)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
實(shí)施例8對(duì)于糖、氨基酸和表面活性劑組合的必要性，通過含有所有所列組份的配方1和由抗體、磷酸鹽緩沖液、氯化鈉和精氨酸磷酸鹽組成的配方13進(jìn)行比較證明。當(dāng)不含糖和表面活性劑時(shí)，聚集物形成可能性增加并且濁度值變大。
配方13MAB HBV 2.0mg磷酸鹽緩沖液15mM氯化鈉 30mM精氨酸 35.0mg磷酸調(diào)至pH6.5注射用水加至1.0ml表11配方13(沒有蔗糖和吐溫20，只有精氨酸磷酸鹽作為組份)和配方1的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
實(shí)施例9當(dāng)不含表面活性劑(吐溫20)而只有蔗糖和精氨酸時(shí)，雖然得到了穩(wěn)定的制劑，但濁度值增加(配方14)。配方14MAB HBV 2.0mg磷酸鹽緩沖液15mM氯化鈉 30mM蔗糖68.0mg精氨酸 10.0mg磷酸調(diào)至pH6.5注射用水加至1.0ml表12配方14和配方1的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
實(shí)施例10下表顯示了配方15的組份。所用抗體為抗-L-selectin抗體。表13a中關(guān)于檢測穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)表明所用的配方具有足夠的穩(wěn)定性。配方15的組成配方15抗L-selectin抗體7.0mg磷酸鹽緩沖液15mM氯化鈉 30mM蔗糖68.0mg精氨酸 10.0mg磷酸調(diào)至pH6.5吐溫20 0.1mg注射用水加至1.0ml表13a 配方15在25℃下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
注I用OD280測量，以％表示的蛋白質(zhì)含量II用SE-HPLC測的以％表示的聚集物III 以濁度單位表示的再生溶液的濁度(無量綱數(shù)據(jù))實(shí)施例11抗L-NGER(抗L-神經(jīng)增長因子受體)抗體的穩(wěn)定性配方16制備下列配方(類似于配方1)的冷凍干燥物配方16抗L-NGFR抗體0.25mg磷酸鹽緩沖液15mM蔗糖75mg精氨酸 10mg磷酸調(diào)至pH6.5吐溫20 0.1mg注射用水加至1.0ml通過與制備MAB-HBV和抗L-selectin冷凍干燥物類似的方法，制備得到抗L-NGFR的冷凍干燥物。
pH＝5-8的含添加劑糖、氨基酸和表面活性劑的水溶液，與抗L-NGFR的磷酸鹽緩沖液混合。使加入磷酸鹽的量達(dá)到前面所述的濃度。然后過濾消毒，通過此方式制備的溶液進(jìn)行冷凍干燥。經(jīng)冷凍干燥后，得到理想的冷凍干燥餅?？筁-NGFR抗體保持穩(wěn)定。用注射用水再生該冷凍干燥物后，得到澄清溶液。
權(quán)利要求
1.穩(wěn)定的冷凍干燥的單克隆抗體或多克隆抗體藥物制劑，包括糖或氨基糖，氨基酸和表面活性劑。
2.權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，制劑基本不含聚乙二醇和/或蛋白樣藥物輔料物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2所述的制劑，其基本組成是a)單克隆抗體或多克隆抗體，b)糖或氨基糖，c)氨基酸，d)作為緩沖物質(zhì)的無機(jī)酸，和e)表面活性劑。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，糖是單糖、雙糖或三糖，優(yōu)選蔗糖、麥芽糖、海藻糖或棉子糖。
5.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，氨基糖是葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、半乳糖胺或神經(jīng)氨酸。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，氨基酸是堿性、酸性或中性氨基酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸或天門冬氨酸。
7.權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，表面活性劑是吐溫(Polysorbat)或者聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物。
8.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，該制劑含有生理上可耐受的輔料物質(zhì)，選自酸、堿、緩沖劑和/或等滲劑。
9.單克隆抗體或多克隆抗體的水性藥物制劑，可通過重新溶解權(quán)利要求1-8所述的冷凍干燥物獲得。
10.權(quán)利要求9所述的水性藥物制劑，其特征在于，溶液的pH值為5-8，優(yōu)選6-7.4。
11.制備如權(quán)利要求1-8所述冷凍干燥的藥物制劑的方法，其特征在于，制備含有單克隆抗體或多克隆抗體作為活性物質(zhì)，含有糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑作為添加劑，以及含有任選的其它藥物輔料物質(zhì)的水制劑，然后冷凍干燥該溶液。
12.由下列物質(zhì)組成的輔料物質(zhì)組合的應(yīng)用a)糖或氨基糖，b)氨基酸和c)表面活性劑；這些輔料物質(zhì)的組合用于制備含有抗體的穩(wěn)定的治療或診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及單克隆或多克隆抗體的冷凍干燥藥物制劑,該制劑含有糖或氨基糖、氨基酸或表面活性劑作為穩(wěn)定劑。另外,本發(fā)明還涉及制備該穩(wěn)定的冷凍干燥物的方法,以及糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑組合后用于穩(wěn)定含抗體的治療或診斷試劑的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1244805SQ97181416
公開日2000年2月16日 申請(qǐng)日期1997年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月19日
發(fā)明者G·卡爾梅耶, G·溫特爾, C·克勒森, H·伍格 申請(qǐng)人:羅赫診斷器材股份有限公司