專利名稱：生理活性物質(zhì)ei-2128-1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由屬于青霉屬的微生物生產(chǎn)的新的白細(xì)胞介素-1β生產(chǎn)抑制物質(zhì)。所述化合物有抗菌活性和白細(xì)胞介素-1生產(chǎn)抑制活性，并可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、骨關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)疏松癥、結(jié)節(jié)性動脈周炎、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性腎炎、活動性慢性肝炎、敗血癥、內(nèi)毒素性休克、動脈粥樣硬化、感染性疾病的發(fā)熱、彌漫性硬皮病等。
白細(xì)胞介素-1(下文稱為IL-1)是一種分子量為17.5kDa的蛋白質(zhì)，它是由體內(nèi)的各種細(xì)胞如巨嗜細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮膚角質(zhì)化細(xì)胞、肝星形細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、腦星形神經(jīng)膠質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生產(chǎn)的。IL-1包括等電點(diǎn)(pI)為5的α形式和等電點(diǎn)為7的β形式。目前，已知α形式和β形式有相同的活性。
已知IL-1有各種生物學(xué)活性。即，IL-1作為增強(qiáng)淋巴細(xì)胞多分化的因子和增加B細(xì)胞增殖和抗體生產(chǎn)的輔助因子。此外，認(rèn)為IL-1作用于丘腦下部溫度中心的花生四烯酸的級聯(lián)反應(yīng)以增加前列腺素E2的合成，由此引起發(fā)熱。另外，表明患敗血癥或節(jié)段性回腸炎的患者血清和患關(guān)節(jié)性風(fēng)濕病患者的腔靜脈關(guān)節(jié)突點(diǎn)中，IL-1的活性顯著增加。這表明IL-1參與了這些疾病的發(fā)病和發(fā)展。因此認(rèn)為抑制IL-1的生產(chǎn)可有效地緩解因IL-1而引起的癥狀。
具有IL-1生產(chǎn)抑制活性的已知化合物的實(shí)例是合成的化合物如萘衍生物(日本公開未審查專利申請59743/92)，3-芳基異噻唑衍生物(日本公開未審查專利申請74121/92)，和zingerol衍生物(日本公開未審查專利申請202127/92)。
已經(jīng)有對aranorosin[抗生素雜志，41，1780-1784(1988)日本公開未審查專利申請157386/91]和aranorosinol A和aranorosinol B[抗生素雜志，45，1592-1598(1992)]的報道。但是這些化合物的結(jié)構(gòu)與式(I)所代表的化合物的結(jié)構(gòu)不同，而且沒有有關(guān)任何這些化合物抑制IL-1生產(chǎn)的報道。
本發(fā)明涉及具有IL-1生產(chǎn)抑制活性的由式(I)代表的化合物
下文將式(I)代表的化合物稱為EI-2128-1。
下面列出EI-2128-1的物理化學(xué)特性。
所述數(shù)據(jù)是由下列儀器得到的。
熔點(diǎn)Yanagimoto，微量熔點(diǎn)儀質(zhì)譜JEOL LTD.，JMS HX/HX110A質(zhì)譜儀UV吸收光譜Shimadzu Corporation，UV-2200紫外線分光光度計IR譜JEOL LTD.，JIR-RFX3001紅外分光光度計NMR譜JEOL LTD.，α400核磁共振旋光率Nippon Bunko Kogyo Co.，Ltd.，DIP-370數(shù)字旋光計EI-2128-1的物理化學(xué)特性該物質(zhì)的顏色和形態(tài)白色粉末熔點(diǎn)70-71℃旋光率[α]D27＝13.9°(c＝0.17，CHCl3)元素分析實(shí)測C，63.16；H，8.44；N，3.29％按C23H35NO6·H2O計算的C，62.85；H，8.48；N，3.19％質(zhì)譜HRFAB-MS實(shí)測422.2538[M+H]+
按C23H35NO6·H2O計算的422.2542分子式C23H35NO6UV吸收譜λmax(CH3OH)；220nm(sh)IR吸收譜νmax(KBr)；3390，1668，1539，984，930cm-1NMR譜δppm(峰裂數(shù)，偶合常數(shù)，積分高度)1H-NMR(CDCl3，400MHz)6.74(dd，8.3，15.4Hz，1H)，6.09(d，8.1Hz，1H)，5.77(d，15.4Hz，1H)，5.64(d，4.6Hz，1H)，4.75(m，2H)，3.69(dd，3.7，3.9Hz，1H)，3.57(dd，3.7，3.9Hz，1H)，3.46(dd，2.7，3.9Hz，lH)，3.42(dd，2.7，3.9Hz，1H)，2.63(dd，8.8，13.1Hz，1H)，2.40(m，1H)，2.05(dd，10.5，13.1Hz，1H)，1.39(m，1H)，1.37(m，1H)，1.30(m，2H)，1.25(m，7H)，1.12(m，1H)，1.08(m，1H)，1.03(d，6.8Hz，3H)，0.88(t，6.8Hz，3H)，0.84(d，6.6Hz，3H)13C-NMR(CDCl3，100MHz)198.3(s)，166.2(s)，151.9(d)，121.1(d)，96.6(d)，79.1(s)，64.3(d)，62.9(d)，55.9(d)，55.6(d)，52.0(d)，43.9(t)，37.4(t)，36.0(t)，34.2(d)，31.9(t)，30.4(d)，29.7(t)，26.8(t)，22.7(t)，20.5(q)，19.5(q)，14.1(q)溶解度易溶于甲醇，乙腈和氯仿顏色反應(yīng)碘試驗和硫酸試驗呈陽性薄層色譜Rf值；0.71
顯色劑；氯仿-甲醇(85∶15)薄層；HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60 F254(Merck &
Co.，Inc.)展開；室溫，上行法，20-40分鐘檢測；用碘發(fā)色下面用試驗實(shí)施例描述EI-2128-1的活性。試驗實(shí)施例1對IL-1生產(chǎn)的抑制活性用下列方法檢測本發(fā)明化合物EI-2128-1對由人單核細(xì)胞衍生的THP-1細(xì)胞(ATCC No.TIB 202)生產(chǎn)的IL-1β的抑制活性。用ELISA法確定IL-1β的量。
將THP-1細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/毫升的濃度懸浮在含10％滅活的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd)中。將細(xì)胞懸浮液以1毫升/孔的量加入到24孔平板的孔中。將佛波醇12-肉豆蔻酯13-乙酸酯(PMA，終濃度30nM)加到孔中，然后于37℃，在5％CO2保溫箱中保溫65小時，以使細(xì)胞分化成巨嗜細(xì)胞。
然后，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基緩慢洗滌平板以除去未粘附到孔上的細(xì)胞，將殘余物在含脂多糖(LPS，終濃度25ug/毫升)和試驗化合物(終濃度0.05-50g/毫升)的無血清RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時。
培養(yǎng)完成后，用IL-1β檢測試劑盒(Amersham Corp.)確定釋放到培養(yǎng)上清液中的IL-1β量。
按照下列公式計算IL-1生產(chǎn)抑制率以得到IC50(50％的抑制濃度)。
IL-1生產(chǎn)抑制率(％)＝(A-B)/(A-C)×100A只加LPS時生產(chǎn)的IL-1量B加入LPS和試驗化合物時生產(chǎn)的IL-1量C不加入LPS時生產(chǎn)的IL-1量EI-2128-1對LPS刺激產(chǎn)生的THP-1細(xì)胞生產(chǎn)的IL-1的50％抑制濃度為0.1uM。
試驗實(shí)施例2對不同細(xì)菌的抗菌活性用含3克/升Bacto-胰胨(Difco Laboratories Inc.)，3克/升肉提取物，1克/升酵母提取物，1克/升葡萄糖和16克/升瓊脂的培養(yǎng)基(pH7.0)，通過瓊脂稀釋法，確定EI-2128-1對不同細(xì)菌生長的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果列于表1。
表1
下面描述生產(chǎn)EI-2128-1的方法通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于青霉屬并具有EI-2128-1生產(chǎn)能力的微生物，使EI-2128-1在培養(yǎng)基中積累，然后從培養(yǎng)基中回收EI-2128-1，就可得到EI-2128-1。
作為本發(fā)明EI-2128-1的生產(chǎn)菌株，可以使用屬于青霉屬并有EI-2128-1生產(chǎn)能力的任何菌株。另外，在本發(fā)明中還可使用用各種人工誘變方法如UV照射、X射線照射和用誘變劑處理或通過自發(fā)突變而得到的所述菌株的突變體，只要它們有生產(chǎn)EI-2128-1的能力。適宜菌株的典型實(shí)例是青霉屬E-2128菌株。
下面描述青霉屬E-2128菌株的真菌學(xué)特性。1 肉眼觀察當(dāng)25℃在麥芽糖提取物瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)該菌株時，在培養(yǎng)的第7天，菌落直徑為40-46mm，在第14天為約60mm。在第14天，菌落的顏色為暗藍(lán)綠色，略帶淺灰，在邊緣為白色到淡藍(lán)色；背面為淡黃白色，在邊緣和中心為乳白色。
當(dāng)25℃在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)該菌株時，在培養(yǎng)的第7天，菌落直徑為約45mm，在第14天為約70-75mm。在第14天，菌落的顏色為灰橄欖色，背面為暗紅棕色。
該菌株的生長溫度范圍為6-38.5℃，最佳生長溫度為約22℃。使其生長的pH范圍為3-12，最佳生長pH為7左右。2 在麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，光學(xué)顯微鏡下觀察該菌株菌絲分生，光滑，無色到淡黃棕色，分支良好。分生孢子是monoematous，光滑，無色到淡黃棕色；它們?yōu)?.8-3.5μm寬，有時可長達(dá)約160μm。青霉菌的形狀和大小無規(guī)則，但它們中的許多是二輪生不對稱青霉群。在青霉菌的頂部形成3到4個梗基。?；切ㄐ位蜷L方形，長6.5-13.5μm，寬為1.5-3.5μm。在?；捻敳啃纬?到6個瓶梗，瓶梗是球頂長頸瓶形或瓶狀，長為5.5-9.5μm，最寬的部分為2-3μm，在頂部寬約1.2μm。分生孢子的個體發(fā)生方式是成腸細(xì)胞樣的，分生孢子以鏈狀排列從瓶梗的頂部開始形成。phialoconidium是單細(xì)胞型，光滑的，球形或亞球形，直徑為2.5-4.3μm；無色到淺棕色，但量很多時呈橄欖色。在該菌株中，只觀察到前述漸變(anamorph)，而未觀察到遠(yuǎn)距離刺激變形(telemorph)。
按照The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture第2版，Cramer，Vaduz J.A.von Arx(1974))以上述真菌學(xué)特性為基礎(chǔ)進(jìn)行分類學(xué)研究，結(jié)果將該菌株分在青霉屬。本發(fā)明人將該菌株命名為青霉屬E-2128菌株，并已于1996年3月27日將其保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本)，保藏號為FERM BP-5488。
為了培養(yǎng)在本發(fā)明中所用的EI-2128-1生產(chǎn)菌株，通?？墒褂糜糜谂囵B(yǎng)絲狀真菌的常規(guī)方法。就培養(yǎng)基而言，可使用合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基，只要它含有可以為所述菌株所吸收的碳源、氮源、無機(jī)物等。
碳源的實(shí)例包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、stabilose、淀粉、糊精、甘露糖、麥芽糖和糖漿；無機(jī)酸如檸檬酸、蘋果酸、乙酸和延胡索酸；醇如甲醇和乙醇；烴如甲烷、乙烷、丙烷和正鏈烷烴；氨基酸如谷氨酸和甘油。
氮源的實(shí)例包括銨鹽如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨和磷酸銨，氨基酸如天冬氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和丙氨酸，脲，胨，肉提取物，酵母提取物，干酵母，玉米漿，大豆粉，棉籽餅，大豆酪蛋白，酪氨酸和Pharmamedia。
無機(jī)物的實(shí)例包括磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鈷、硫酸鋅、泛酸鈣、鉬酸銨、硫酸鉀鋁、碳酸鎢、碳酸鈣、氯化鈷和氯化鈉。
如果需要，還可將促進(jìn)細(xì)胞生長或EI-2128-1生產(chǎn)的物質(zhì)加到培養(yǎng)基中。如果所用的菌株需要特殊物質(zhì)，則也可將所述物質(zhì)加到培養(yǎng)基中。
在20-40℃，中性pH左右，通過振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)等完成培養(yǎng)。通常，培養(yǎng)3到7天，在培養(yǎng)物中積累的EI-2128-1量達(dá)到最大，之后結(jié)束培養(yǎng)。
就從培養(yǎng)物中分離EI-2128-1而言，可以用從培養(yǎng)物中分離微生物代謝產(chǎn)物所常用的方法。
即，用溶劑如丙酮或甲醇提取微生物細(xì)胞，通過過濾或離心除去微生物細(xì)胞，用吸附樹脂、硅膠、硅烷化過的硅膠、反相硅膠、鋁、纖維素、硅藻土、硅酸鎂、凝膠過濾介質(zhì)、離子交換樹脂等，通過柱色譜使活性物質(zhì)解吸附，用適宜的溶劑分離等步驟就可分離出EI-2128-1。
在上述分離和純化步驟中，通過硅凝膠薄層色譜，然后用碘顏色顯色或在253.6nm的紫外線照射可示蹤EI-2128-1。
本發(fā)明的實(shí)施例如下。完成本發(fā)明的最佳方式實(shí)施例1用青霉屬E-2128菌株作為接種菌株，將一環(huán)的菌株接種到10毫升第一培養(yǎng)基(pH6.5)中，該培養(yǎng)基含有分別在3個50毫升試驗試管(培養(yǎng)基總量30毫升)中的100克/升葡萄糖，30克/升磨碎的馬鈴薯(SnowBrand Milk Products Co.，Ltd.)和5克/升粉末狀酵母提取物S(NipponSeiyaku Co.Ltd.)。25℃振蕩4天完成培養(yǎng)。
將所得的第一培養(yǎng)物(30毫升)以5毫升的量接種到4個300毫升Erlenmeyer燒瓶中，每個燒瓶均含有50毫升的第二培養(yǎng)基(培養(yǎng)基總量200毫升)。第二培養(yǎng)基的組成與第一培養(yǎng)基的相同。25℃振蕩2天完成培養(yǎng)。
將所得的第二培養(yǎng)物(200毫升)以5毫升的量接種到4個300毫升Erlenmeyer燒瓶中，每個燒瓶均含有50毫升的主發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基總量2升)。主發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下10克/升葡萄糖，10克/升可溶性淀粉(MS#3600，Japan Maize Products Co.，Ltd.)，10克/升玉米淀粉(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，5克/升玉米漿，5克/升Pharmamedia，5克/升Ebios，和2克/升碳酸鈣(pH6.0)。25℃振蕩6天完成培養(yǎng)。
過濾所得的培養(yǎng)物(2升)以得到微生物細(xì)胞。向所述細(xì)胞中邊攪拌邊加入2升甲醇，然后過濾。用8升水稀釋所得的細(xì)胞提取物(2升)，然后通過Diaion HP-20柱(400毫升，Mitsubishi Chemical Corporation)。用1.6升50％甲醇洗滌該柱后，用1.6升甲醇完成洗脫。合并含EI-2128-1的餾分，用等量水稀釋。使所述餾分稀釋物通過ODS柱(直徑3cm；長度50cm，ODS-AQ-S50，YMC)，然后用75％甲醇洗脫。合并含EI-2128-1的餾分，減壓濃縮至干，然后溶解在20毫升甲醇中。使2毫升的所得溶液通過HPLC柱(D-ODS-5-B S-5 120A，YMC)。用80％甲醇，以20毫升/分鐘的流速洗脫，然后合并含EI-2128-1的餾分。用HPLC重復(fù)該純化步驟，然后合并含EI-2128-1的餾分，減壓濃縮至干，得到107毫克EI-2128-1。
在上述步驟中，通過硅凝膠薄層色譜，然后用碘顯色或在253.6nm的紫外線照射可示蹤EI-2128-1。
本發(fā)明提供了具有IL-1生產(chǎn)抑制活性的生理活性物質(zhì)EI-2128-1。
權(quán)利要求
1 由式(I)代表的生理活性物質(zhì)EI-2128-全文摘要
本發(fā)明涉及一種由式(Ⅰ)表示的新化合物EI－2128－1,該化合物具有IL－1生產(chǎn)抑制活性。
文檔編號C07D493/20GK1188511SQ97190302
公開日1998年7月22日 申請日期1997年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月2日
發(fā)明者田中健穗, 小泉文人, 我妻勉, 近藤英正, 齋藤裕, 安藤勝彥, 松田讓 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社