專利名稱：重組噬菌體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療細(xì)菌感染，特別是如幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)感染的粘膜性細(xì)菌感染的噬菌體。
噬菌體和抗生素抗性抗生素抗性是醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)上日益嚴(yán)重的全球性問題。因而迫切需要有其它方法來消除細(xì)菌而避免發(fā)生這種抗性問題。
細(xì)菌噬菌體或噬菌體是一種特異性感染細(xì)菌的病毒。噬菌體首先與其宿主細(xì)菌結(jié)合并將編碼不同噬菌體蛋白的基因轉(zhuǎn)入到宿主中。噬菌體利用宿主細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、氨基酸合成系統(tǒng)等以及由宿主產(chǎn)生的能量完成自身的復(fù)制(Maloy等編，微生物遺傳學(xué)，(Microbial genetics),Jones and Bartlett出版社，1994)。
大多數(shù)噬菌體裂解宿主，或者通過其它機(jī)制來破壞特定的菌株。本發(fā)明基于這樣的認(rèn)識噬菌體的遺傳修飾，尤其是絲狀噬菌體的遺傳修飾，提供了一種構(gòu)建新型的細(xì)菌專一性噬菌體用于消除如幽門螺旋桿菌等特定細(xì)菌的方法，此方法有望克服抗生素抗性的相關(guān)問題。
絲狀噬菌體具有頭發(fā)狀F菌毛的大腸桿菌(E.coli)是諸如M13、fd和fl等絲狀噬菌體的宿主。這些Ff(絲狀，F(xiàn)菌毛)噬菌體在序列和行為上十分相近(Rashed & Oberer(1986)，微生物學(xué)綜述(Microbiologicalreviews),50,401～427；Kornberg & Baker:DNA復(fù)制，557-570,W.H.Freeman and Co.，紐約，1992)。Ff噬菌體作為細(xì)菌病毒的一種，本身并不引起裂解性感染，但可以使被感染的宿主細(xì)胞產(chǎn)生并將噬菌體顆粒不通過裂解途徑分泌出去。
噬菌體M13的單鏈基因組編碼10種不同的蛋白。噬菌體DNA由一層蛋白質(zhì)外殼包被，該外殼由大約2700個基因8蛋白質(zhì)(g8p)組成?；畹腗13噬菌體在其頂端也表達(dá)5個43kDa的基因3蛋白質(zhì)(g3p)，該蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)使噬菌體粘附到大腸桿菌的菌毛上。該基因3蛋白質(zhì)通過多肽鏈C端部分固定于病毒外殼上，多肽鏈的N-端球狀區(qū)域是暴露的，調(diào)節(jié)噬菌體附著在宿主的F菌毛頂部。通過電子顯微鏡，可以看到附著到宿主上的粘附復(fù)合物的結(jié)構(gòu)就象樹干上的突結(jié)。在感染的過程中，g3p和g8p兩個蛋白的先導(dǎo)序列引導(dǎo)著這些噬菌體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到細(xì)菌的內(nèi)膜中。
Ff噬菌體作為克隆載體應(yīng)用很廣，因為它對被包裝的DNA片段的長度沒有限制，并且作為單鏈DNA也便于純化。噬菌粒是一種包含M13(單鏈)和質(zhì)粒(雙鏈)的復(fù)制起點的載體。噬菌?？梢韵筚|(zhì)粒一樣復(fù)制，也可在輔助噬菌體如M13K07的幫助下以重組M13噬菌體的形式被包裝(Veria & Messing(1987)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymol.),153,3-11)。
重組抗體的生產(chǎn)抗體分子包含有不連續(xù)的片段，它們可以用蛋白酶切開或由重組技術(shù)生產(chǎn)。其中的一個片段是Fv(可變區(qū))，僅由抗體的VL和VH區(qū)域組成。在美國專利4,946,778中描述了一種人工設(shè)計的單鏈Fv(ScFv)，即重組的Fv片段，其中的兩個可變區(qū)用中性接頭人為連接后以單鏈多肽的形式表達(dá)。
Mc Cafferty及其合作者(Mc Cafferty(1990)，自然(Nature),348,552-554；Winter & Milstein(1991)，自然，349,293頁)發(fā)展了一種重組抗體的生產(chǎn)技術(shù)。該技術(shù)依靠噬菌體展示系統(tǒng)，通過將VL(可變區(qū)輕鏈)和VH(可變區(qū)重鏈)基因克隆到噬菌體載體，從而使抗體片段以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面。通過這種方式可以篩選到具有特定專一性和親和力的抗體。有人建議將在原核體系中分離和制造的抗體稱為“大腸桿菌克隆”抗體(Chiswell & McCafferty(1992)，生物技術(shù)趨勢，(Trends in Biotechnology)10,80-84)。
噬菌粒pCANTAB5是可購買到的，用于將抗體可變區(qū)基因克隆到M13基因3的先導(dǎo)序列和主體之間。該g3p先導(dǎo)序列將所產(chǎn)生的融合蛋白引導(dǎo)至大腸桿菌的內(nèi)膜或周質(zhì)中，再由g3p的主要結(jié)構(gòu)域?qū)⑷诤系鞍赘街窖b配的噬菌體頂部。抗體-g3p基因的表達(dá)由噬菌粒上可誘導(dǎo)的lac啟動子控制。
幽門螺旋桿菌感染普遍認(rèn)為，已知病例中84％的胃潰瘍和95％的十二指腸潰瘍主要是由于幽門螺旋桿菌感染造成的(Kuipers,E.L.，等(1995)營養(yǎng)藥物治療雜志(Aliment.Pharmacol.Ther.)9,(增刊2),59-69)。幽門螺旋桿菌生長于胃壁上，并由胃壁粘膜層保護(hù)避開胃中的酸性環(huán)境，同時其代謝過程自身也能分泌氨以中和酸。
傳統(tǒng)的抗生素治療對幽門螺旋桿菌幾乎無效。這可能是因為ⅰ)對于不直接暴露在血液循環(huán)中的微生物抗生素很難接近，ⅱ)許多口服藥在胃中快速通過，或者在胃中的酸性條件下降解。
本發(fā)明的目的在于提供一種新的治療方法，該方法可消除細(xì)菌，尤其是消除造成粘膜性細(xì)菌感染如幽門螺旋桿菌的感染。特別是提供了經(jīng)過遺傳修飾的能專一性結(jié)合到另外的細(xì)菌宿主上的絲狀噬菌體用于治療過程。
基于重組噬菌體的治療粘膜性細(xì)菌感染的方法優(yōu)于傳統(tǒng)的抗生素治療，這是因為·它可消除具有傳統(tǒng)抗生素抗性的細(xì)菌；·重組噬菌體對特定細(xì)菌種類有高的專一性；·噬菌體的繁殖有自限性；·在由于幽門螺旋桿菌引起的感染中，可通過幽門螺旋桿菌的活動將噬菌體擴(kuò)散到胃粘膜各處。
在本說明書和實施例中，“常規(guī)方法”或“常規(guī)操作”一詞應(yīng)理解為一般實驗室操作中的方法和操作，如Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T.,(1989)，分子克隆實驗室操作手冊(第2版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)一書中所述。
第一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的修飾過的噬菌體，該噬菌體表面存在的重組蛋白包含ⅰ)由噬菌體表面蛋白衍生而來的組分1；ⅱ)包含一種提供細(xì)菌抗原結(jié)合位點的抗體可變區(qū)序列的組分2，該組份2使得前述噬菌體能結(jié)合到引起前述感染中涉及的細(xì)菌上并抑制其生長。
前述修飾過的噬菌體可以是一種修飾過的絲狀噬菌體，如經(jīng)過修飾的M13噬菌體。
前述細(xì)菌感染可以是一種粘膜性細(xì)菌感染，如幽門螺旋桿菌感染。然而，本發(fā)明并不局限于能殺死幽門螺旋桿菌的噬菌體，而是包括經(jīng)過改性的能用于殺死廣泛范圍細(xì)菌的噬菌體。這是因為基于本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備專一作用于任何一種細(xì)菌的本發(fā)明噬菌體。本發(fā)明的噬菌體適用于治療任何與外界接觸的粘膜細(xì)菌感染。這樣的粘膜上皮組織的例子包括鼻、肺、胃腸道、膀胱和陰道的粘膜。
可用本發(fā)明的噬菌體治療的其它細(xì)菌感染的例子有·由大腸桿菌，腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)，變形菌(Proteus spp)或綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的尿道感染；·由Clamycda引起的陰道感染；·由鏈球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，流感嗜血菌(Haemophilus influence)，肺炎球菌(Pneumococcus)或肺炎支原體(Mycoplasma pneumonic)引起的鼻，toncillar，肺部感染；·由沙門氏菌(Salmonella)，志賀氏菌(Shigella)耶爾森氏菌(Yersinia)，腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)，大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)，螺旋桿菌(Helicobacter)，霍亂弧菌(Vibriocholera)或大腸桿菌(E.coli)引起的胃腸道感染。
上面提到的重組蛋白的組分1可以優(yōu)選由負(fù)責(zé)未經(jīng)修飾的該噬菌體吸附到細(xì)菌菌毛的蛋白質(zhì)派生出來，如M13噬菌體中的g3p蛋白。
前述重組蛋白的組分2可以包含一個重組的單鏈Fv(ScFv)多肽。因此，前述重組蛋白可以是一個g3p-ScFv融合蛋白。
本發(fā)明的噬菌體的優(yōu)選形式是一種用于治療或預(yù)防幽門螺旋桿菌的噬菌體。其中前述重組多肽的抗體可變區(qū)序列是選自雜交瘤細(xì)胞系5F8(ECACC No.95121524)，2H6(ECACC No.95121526)和5D8(ECACC No.95121527)單克隆抗體的單抗可變區(qū)序列。因而，本發(fā)明中的噬菌體可以是一種經(jīng)過修飾的M13噬菌體，命名為B8，以編號NCIMB40779保藏在NCIMB，或者是它的一種保留有結(jié)合和感染幽門螺旋桿菌能力的衍生株。
具有預(yù)期特性的噬菌體可由下述任一方法獲得(a)篩選天然存在的噬菌體，或是從包含表達(dá)多種抗體片段的噬菌體文庫中篩選。噬菌體文庫可以從免疫細(xì)胞或大量的個體中獲得。由于巨大的遺傳多樣性，該噬菌體文庫應(yīng)當(dāng)包括預(yù)期的特定的噬菌體，這些噬菌體可針對個體先前接觸過的多種細(xì)菌。
(b)對現(xiàn)存的噬菌體進(jìn)行誘變。所有有生命的機(jī)體包括噬菌體均會產(chǎn)生突變。突變的頻率可通過化學(xué)方法或者短波電磁輻照等方法加以提高。
(c)通過遺傳修飾噬菌體結(jié)合區(qū)域中一個或多個氨基酸，或者改變其糖或脂的組成，從而改善天然或重組噬菌體的預(yù)期特性。這一方案在實驗部分中有更進(jìn)一步的描述。本發(fā)明的噬菌體可由下述方法生產(chǎn)該方法包括(a)分離一種針對某細(xì)菌的抗體；(b)分離編碼該抗體可變區(qū)重鏈和輕鏈的DNA；(c)將該DNA引入噬菌體DNA，使該抗體區(qū)域在噬菌體表面表達(dá)。
另外一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該組合物包含本發(fā)明的噬菌體和與之混合的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的噬菌體適當(dāng)?shù)慕o藥方法的例子包括·用于鼻、肺部的噴劑；
·用于治療胃腸道粘膜時用奧美拉唑預(yù)治療后再用碳酸氫鹽緩沖液懸浮的噬菌體治療；·用于胃膜和陰道粘膜的粘膜附著凝膠混合物(如纖維素基凝膠，聚卡波非，泊洛沙姆等)；·用于膀胱的碳酸氫鹽緩沖液。
服用的噬菌體數(shù)量可由技術(shù)人員決定。依照感染的類型，噬菌體的給藥數(shù)量范圍從104到1010個。
還有一方面，本發(fā)明提供了一種治療哺乳動物細(xì)菌感染的方法，此方法包括服用本發(fā)明的噬菌體或藥物組合物。所述細(xì)菌感染可以是象幽門螺旋桿菌感染那樣的粘膜性細(xì)菌感染。本發(fā)明同樣包括本發(fā)明的噬菌體用于制備一種用于治療或預(yù)防粘膜性細(xì)菌感染如幽門螺旋桿菌感染的藥物中的用途。
本發(fā)明的又一方面是選自5F8(ECACC No.95121524),2H6(ECACC No.95121526)和5D8(ECACC No.95121527)的雜交瘤，以及選自上述雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的單克隆抗體。雜交瘤技術(shù)是一種已知的先有技術(shù)。首先將免疫過的動物產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞系，再從中挑選能產(chǎn)生期望的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
實施例1生產(chǎn)針對幽門螺旋桿菌的單克隆抗體1.1抗原的制備幽門螺旋桿菌17874,25,66,253和1139(來源于Astra Hassle，瑞典)用下面的培養(yǎng)條件培養(yǎng)哥倫比亞瓊脂中加入8.5％馬血，10％馬血清，1％isovitalex，微需氧環(huán)境下與Anaerocult C一起37℃培養(yǎng)。
幽門螺旋桿菌表面蛋白的制備按照MaJ-Y等(1994)(斯堪的納維亞胃腸學(xué)雜志(Scand.J.Gastroenterol.)29,961-965頁)中方法進(jìn)行。簡言之，總量為4克的5種幽門螺旋桿菌在100毫升0.2摩爾/升甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.2)中室溫下培養(yǎng)15分鐘。再用1M氫氧化鈉中和。4℃下10,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，丟棄沉淀，上清液對蒸餾水4℃下透析過夜，用作“幽門螺旋桿菌抗原制劑”或“幽門螺旋桿菌表面蛋白”。
1.2．生產(chǎn)單克隆抗體免疫過程基本按照斯堪的納維亞生理學(xué)報(Acta Physiol.Scand.),144,369-378頁中Cabero,J.L等人敘述的方法進(jìn)行。簡言之，4℃下2mg/ml幽門螺旋桿菌表面蛋白與等體積弗氏完全佐劑一起乳化。兩只雌性DBA/1鼠的后足墊分別注射抗原乳劑，每只劑量為50μl。11天后取腘淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞(sp2系)在50％(w/w)聚乙二醇4000介導(dǎo)下融合。細(xì)胞融合懸液分別接種到5個微孔板中，用含有10％胎牛血清并加入50μg/ml慶大霉素的DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.3.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)免疫板用50μl含有指定抗原(10μg/ml)的0.05M Na2CO3/NaHCO3緩沖液(pH9.8)包被，4℃孵育過夜。然后37℃下用含有0.05％吐溫20的PBS(PBS-T)封閉未被結(jié)合的位點一小時。再加入一抗37℃培育1小時。用綿羊抗鼠IgG過氧化物酶偶聯(lián)物作為二抗。結(jié)合的過氧化物酶用0.04％(w/v)OPD和14mM過氧化氫在0.1M檸檬酸/0.2MNaHPO4pH5的條件下檢測。加入2M H2SO4終止反應(yīng)，492nm下檢測。每次培育后均用PBS-T洗三次。
1.4初篩用ELISA方法篩選融合的淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，其中有45株雜交瘤克隆為幽門螺旋桿菌表面蛋白質(zhì)陽性。通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)其中的8株明顯可使瓊脂平板上的幽門螺旋桿菌染色。命名為2H6(ECACCNo.95121526)、5D8(ECACC No.95121527)和5F8(ECACC No.95121524)的雜交瘤克隆與幽門螺旋桿菌的反應(yīng)較其它菌株更強，故選作進(jìn)一步研究。
實施例2生產(chǎn)針對幽門螺旋桿菌的重組噬菌體M132.1材料mRNA快速制備純化試劑盒，鼠ScFv試劑盒，表達(dá)試劑盒，檢測試劑盒，SfiⅠ,NotⅠ,T4DNA連接酶和綿羊抗M13抗體購自發(fā)馬西亞生物技術(shù)公司(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)。dNTP混合物，10×PCR反應(yīng)緩沖液和Ampli Taq DNA聚合酶購自Perkin Elmer公司。Bacto酵母提取物，Bacto蛋白胨，Bacto瓊脂購自Difco實驗室(Detroit，密執(zhí)安，美國)。哥倫比亞瓊脂板和布氏肉湯由林雪平大學(xué)微生物系提供(Linkoping，瑞典)。Anaerocult C由默克公司(Merck德國)提供。SlowfadeTM防衰試劑盒由分子探針公司(Molecular ProbesInc.美國)提供。
2.2．噬菌體抗體文庫的構(gòu)建重組噬菌體抗體系統(tǒng)試劑盒(發(fā)馬西亞生物技術(shù)公司)用于表達(dá)以融合蛋白形式展示在噬菌體表面的抗體片段。
使用mRNA快速制備純化試劑盒(發(fā)馬西亞生物技術(shù)公司)從雜交瘤細(xì)胞系(2H6,5D8和5F8)中用寡聚(dT)-纖維素介質(zhì)的親和層析法分離和純化總mRNA。
用鼠ScFv試劑盒完成下列步驟·用試劑盒提供的反轉(zhuǎn)錄酶和引物混合物從雜交瘤mRNA中合成第一鏈cDNA；·用不同的引物(VH和VL鏈引物，由試劑盒提供)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增編碼單抗中可變區(qū)輕鏈和重鏈的cDNA。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析VH和VL鏈得到了正確大小的VH(340bp)和VL(325bp)的單帶。
·1％瓊脂糖凝膠分離并純化擴(kuò)增所得的VH和VL鏈并用試劑盒提供的DNA接頭片段裝配到單鏈Fv(ScFv)基因中。接頭片段的結(jié)構(gòu)使其一頭與重鏈的3＇端退火，另一端則與輕鏈的5＇端雜交。電泳后可看到正確大小的ScFv基因(750bp)單帶。
·用一系列寡核苷酸引物(試劑盒提供)擴(kuò)增組裝好的抗體ScFv DNA片段，引入NotⅠ和SfiⅠ限制性位點。用離心柱層析(試劑盒提供)除去接頭、dNTP和TaqDNA聚合酶。ScFv片段用NotⅠ和SfiⅠ切割后產(chǎn)生用于連接到載體pCANTAB5上的粘性末端。
下述步驟用表達(dá)試劑盒完成·將ScFv片段連接到事先用NotⅠ和SfiⅠ切割產(chǎn)生粘性末端的噬菌粒載體pCANTAB5(試劑盒提供)。用T4DNA將插入片段與相應(yīng)的噬菌粒連接。于是將ScFv片段以正確的方向插入，鄰近M13基因3并與之在同一讀框中，從而可以表達(dá)ScFv-g3p融合基因。
·用大腸桿菌TG1(試劑盒提供)制備感受態(tài)細(xì)胞，用包含有l(wèi)ac啟動子和氨芐青霉素抗性標(biāo)記的重組噬菌粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。在含有葡萄糖和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，得到3.2×104個ScFv菌落。氨芐抗性菌落在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)以做為文庫原種。
·氨芐抗性細(xì)胞由輔助噬菌體M13K07感染(試劑盒提供)。該噬菌體包含有卡那霉素抗性標(biāo)記且能在含有卡那霉素和氨芐青霉素的葡萄糖缺乏培養(yǎng)基中生長。在沒有葡萄糖的條件下，噬菌粒中的乳糖啟動子不再受到抑制。于是產(chǎn)生了在外殼上帶有重組抗體片段的噬菌體顆粒并釋放到胞外。
·噬菌體展示的抗體通過與抗原的結(jié)合來挑選出其中可與幽門螺旋桿菌結(jié)合的抗體。一個培養(yǎng)瓶用5ml幽門螺旋桿菌表面蛋白(15μg/ml,50mM碳酸鈉緩沖液，pH9.6)包被過夜。用PBS洗三次，含有10ml 1％BSA(w/v)的PBS的培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)1小時。PBS洗滌三次后將培養(yǎng)瓶在噬菌體上清液中(含有噬菌體的培養(yǎng)基)培養(yǎng)2小時。用含有0.1％(w/v)吐溫20的PBS洗滌20次，再用PBS洗滌20次。結(jié)合的噬菌體顆粒通過加入1毫升100mM三乙胺輕搖10分鐘，立即用0.5ml 1M的TrisHCl pH7.4中和來洗脫。
用洗脫的噬菌體感染培養(yǎng)在SOBAG瓊脂上處于對數(shù)生長期的大腸桿菌TG1。SOBAG瓊脂包括2％Bacto-蛋白胨，0.5％Bacto-酵母提取物，0.05％NaCl,0.01MMgCl2,0.01％葡萄糖和0.01％氨芐青霉素。這些菌落再次用M13K07噬菌體挑選、轉(zhuǎn)化，生長和復(fù)原一次。
第一輪篩選后的100個菌落，其中微孔板中再生的菌落中6％的菌落用酶聯(lián)免疫吸附測定法鑒定為對幽門螺桿菌抗原制劑陽性。第三次篩選微孔板中的菌落中有95％的噬菌體抗體能與幽門螺旋桿菌抗原反應(yīng)。
在用幽門螺旋桿菌抗原制劑作為抗原的噬菌體ELISA測定中，重組噬菌體B8的滴度比輔助噬菌體(野生噬菌體)要高10倍。選擇噬菌體B8(NCIMB No.40779)作進(jìn)一步分析。
實施例3ELISA使用檢測試劑盒以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測和鑒別噬菌體展示的重組抗體。
用20μl幽門螺旋桿菌抗體(10μg/ml,50mM Na2CO3/NaHCO3pH9.6)包被96孔板，4℃下培養(yǎng)過夜。用含有0.05％吐溫20的PBS溶液(PBS-T)洗滌孔板三次，再用含有1％BSA的300μl PBS37℃下封閉1小時。用等體積的1％BSA/PBS稀釋重組噬菌體抗體，室溫下培養(yǎng)20分鐘。洗滌后，加入5×1010個噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(200μl/孔)，37℃培養(yǎng)2小時。用PBS-T洗滌孔板三次，再加入用1％BSA/PBS液稀釋1∶5000倍后的HRP/Anti M13偶聯(lián)物(由試劑盒提供)，37℃培養(yǎng)1小時。用PBS-T洗滌孔板三次，加入2＇2＇-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽和過氧化氫作為過氧化物酶的底物，室溫下培養(yǎng)30分鐘。使用計算機(jī)化酶聯(lián)免疫吸附測定讀數(shù)儀405nm下測定吸光值。卵清蛋白(10μg/ml，溶于PBS)作為對照抗體。輔助噬菌體作為對照噬菌體。結(jié)果證實，重組噬菌體B8可特異性地與幽門螺旋桿菌表面抗原結(jié)合。
實施例4免疫雜交用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(10μg蛋白/孔)分離幽門螺旋桿菌抗原制劑的蛋白，將其用微型電泳轉(zhuǎn)膜儀(伯樂公司，BioRad,Richmond，加州，美國)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含有10％BSA,0.1％吐溫-20的PBS封閉硝酸纖維素膜，室溫下輕搖1小時。加入噬菌體B8(1011個轉(zhuǎn)化單位/毫升)與硝酸纖維素膜一起4℃下輕搖培養(yǎng)過夜。用不加入一抗的過程作為陰性對照。用含有0.1％吐溫20的PBS洗滌后，將硝酸纖維素膜與HRP/Anti-M13偶聯(lián)物(用封閉液1∶5000稀釋)一起輕搖1小時。用ECL檢測試劑盒(Amersham,UK)檢測結(jié)合。
硝酸纖維素膜用氨基黑染色，顯示主帶分別對應(yīng)64KDa,36KDa,31KDa和27KDa的蛋白。收集的單克隆抗體(2H6,5D8和5F8，用于構(gòu)建重組噬菌體的雜交瘤)可與32KDa和64KDa的條帶反應(yīng)。將噬菌體抗體B8用上述方法免疫雜交也有相似的染色結(jié)果。結(jié)果表明，對應(yīng)于幽門螺旋桿菌特異性單克隆抗體的可變區(qū)重鏈和輕鏈的基因已在噬菌體上正確表達(dá)。
實施例5重組噬菌體對細(xì)菌的作用效果下列實驗中，均用含有5％胎牛血清的布氏肉湯在10％CO2和5％O2的培養(yǎng)條件下37℃培養(yǎng)細(xì)菌。
當(dāng)20μl細(xì)菌貯存液與10ml肉湯混合后實驗開始。用PBS稀釋培養(yǎng)基后等量地涂布在瓊脂平板上，在一定時間后檢定每毫升中菌落形成單位(CFU)。37℃下培養(yǎng)兩天后計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。
5.1時間依賴效應(yīng)通過統(tǒng)計三天中有或無噬菌體時的CFU，研究重組噬菌體B8對幽門螺旋桿菌17874生長的時間依賴效應(yīng)(見表1)。開始時每10毫升培養(yǎng)基中加入106個噬菌體(加噬菌體)。對照菌株中不加入噬菌體(無噬菌體)。
三天后，沒有噬菌體加入的菌株中菌落數(shù)增加了5個數(shù)量級。在有噬菌體的培養(yǎng)基中，一天后菌落數(shù)下降了1個數(shù)量級，肉湯培養(yǎng)基外觀從混濁變得不太混濁。
5.2．對不同菌株的作用效果幽門螺旋桿菌17874,1139和244和金黃色葡萄球菌ATCC29213以及大腸桿菌TG1分別加入或不加入噬菌體(106個每10ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時。分析0時間和24小時的菌落形成單位(見表2)。三種幽門螺旋桿菌的菌落形成單位均被重組噬菌體降低，但是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌不受影響。幽門螺旋桿菌17874也不受作為對照的輔助噬菌體M13K07的影響。
5.3．對幽門螺旋桿菌的作用效果第二次實驗(見表3)中，幽門螺旋桿菌17874,1139,253,25和66與鏈球菌(Raf M87)一起進(jìn)行測試。在沒有噬菌體時，所有受試菌株的菌落形成單位在24小時培養(yǎng)過程中都增加。然而，在存在重組噬菌體(開始時106個噬菌體加至10ml培養(yǎng)基)的培養(yǎng)液中，幽門螺旋桿菌17874,1139和25的菌落形成單位減少而菌株253和66的生長速率與對照相比明顯降低。因此，所有受試的幽門螺旋桿菌均可受到噬菌體的作用。
實施例6幽門螺旋桿菌的免疫熒光染色用PEG沉淀法濃縮噬菌體抗體B8。用培養(yǎng)基上的幽門螺旋桿菌(17874)進(jìn)行免疫熒光染色。
用下列貯備試劑進(jìn)行免疫熒光染色試劑A用1％BSA/PBS1∶1稀釋的1012個轉(zhuǎn)化單位/毫升的噬菌體抗體。
試劑B用1％BSA/PBS稀釋的綿羊抗M13抗體。
試劑C用1％BSA/PBS 1∶100稀釋的抗綿羊抗體異硫氰酸熒光素偶聯(lián)物(抗綿羊IgFITC)；試劑D1mg(w/v)的鏈霉蛋白酶溶于PBS。
培養(yǎng)三天后，幽門螺旋桿菌(5個不同菌株)，金黃色葡萄球菌(ATCC29213)和鏈球菌(Raf M87)分別用含有1％BSA的PBS懸浮。分別滴加每種懸浮液20μl到載玻片上。干燥后用中性甲醛液固定2分鐘。水洗載玻片6次后室溫下晾干。與對照相比，用試劑D簡單處理后可增加檢測的信噪比。載玻片依次在30μl的試劑A,B和C中處理30分鐘，兩次處理之間均用PBS洗。晾干載玻片后在加蓋玻片之前滴一滴Slow FadeTM。所有培養(yǎng)均在室溫下進(jìn)行。不加一抗的步驟作為陰性對照。
結(jié)果表明，幽門螺旋桿菌可被噬菌體抗體染色。這與培養(yǎng)實驗中菌落形成單位的結(jié)果是十分一致的。因此，噬菌體B8的生物學(xué)作用的前提條件是細(xì)菌表面表達(dá)了特異性的抗原。
生物材料的保藏下列雜交瘤已于1995年12月15日按照布達(dá)佩斯條約在歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)(Salisbury,Wiltshire，英國)進(jìn)行了保藏。
2H6(ECACC No.95121526)5D8(ECACC No.95121527)5F8(ECACC No.95121524)重組噬菌體B8已于1995年12月20日按照布達(dá)佩斯條約在國家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏中心(NCIMB)(阿伯丁，蘇格蘭)進(jìn)行了保藏。編號為NCIMB 40779。
表1
表2
表權(quán)利要求
1．一種用于治療或預(yù)防細(xì)菌感染的修飾過的噬菌體，該噬菌體表面存在著包含下述成分的重組蛋白(ⅰ)由噬菌體表面蛋白衍生而來的組分1；(ⅱ)包含一種提供細(xì)菌抗原結(jié)合位點的抗體可變區(qū)序列的組分2，該組分2使得所述噬菌體能結(jié)合到引起前述感染中涉及的細(xì)菌上并抑制其生長。
2．一種如權(quán)利要求1中要求的噬菌體，其用于治療或預(yù)防粘膜性細(xì)菌感染。
3．一種如權(quán)利要求2中要求的噬菌體，其用于治療或預(yù)防幽門螺旋桿菌感染。
4．一種如權(quán)利要求1到3中任一項要求的噬菌體，它是一種修飾過的絲狀噬菌體。
5．一種如權(quán)利要求1到4中任一項要求的噬菌體，它是一種修飾過的M13噬菌體。
6．一種如權(quán)利要求1到5中任一項要求的噬菌體，該噬菌體中所述重組蛋白中的組分1是來源于未經(jīng)修飾的噬菌體中負(fù)責(zé)與細(xì)菌菌毛吸附的蛋白質(zhì)。
7．一種如權(quán)利要求1到6中任一項要求的噬菌體，其中所述重組蛋白質(zhì)中組分2包含有ScFv多肽。
8．一種如權(quán)利要求1到7中任一項要求的噬菌體，它是一種修飾過的M13噬菌體，其中所述重組蛋白的組分1是由g3p蛋白衍生而來。
9．一種如權(quán)利要求8中要求的噬菌體，其中所述重組蛋白是一個g3p-ScFv融合蛋白。
10.一種如權(quán)利要求1到9中任一項要求的噬菌體，其用于治療或預(yù)防幽門螺旋桿菌感染，其中所述重組多肽中抗體可變區(qū)序列是選自雜交瘤細(xì)胞系5F8(ECACC No.9512524),2H6(ECACC No.95121526)和5D8(ECACC No.95121527)的單克隆抗體的單抗可變區(qū)序列。
11．權(quán)利要求10中要求的噬菌體，它是一種稱為B8的修飾過的M13噬菌體，保藏在NCIMB，保藏號為NCIMB 40779，或者其保留了結(jié)合和感染幽門螺旋桿菌能力的衍生株。
12．一種藥物組合物，其包括前述任一項權(quán)利要求中所要求的噬菌體和與之混合的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
13．一種治療哺乳動物細(xì)菌感染的方法，包括服用如前述權(quán)利要求任一項的噬菌體或藥物組合物。
14．權(quán)利要求1到11中任一項要求中的噬菌體在制備用于粘膜性細(xì)菌感染的藥物中的用途。
15．選自5F8(ECACC No.95121524),2H6(No.95121526)和5D8(ECACC No.95121527)的雜交瘤。
16．一種選自權(quán)利要求15的雜交瘤中所產(chǎn)生的單克隆抗體的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防細(xì)菌感染特別是諸如幽門螺旋桿菌感染的粘膜性細(xì)菌感染的噬菌體。特別地,它涉及用于上述目的的經(jīng)過修飾的絲狀噬菌體,如M13噬菌體。該噬菌體的表面包含有重組蛋白,其包含(i)由噬菌體表面蛋白衍生而來的組分1;(ii)包含有提供細(xì)菌抗原結(jié)合位點的抗體可變區(qū)序列的組分2,該組分2使前述噬菌體能結(jié)合到引起前述感染中涉及的細(xì)菌上并抑制其生長。
文檔編號C07K19/00GK1210558SQ9719211
公開日1999年3月10日 申請日期1997年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月6日
發(fā)明者S·馬德 申請人:法金公司