專利名稱：負調(diào)節(jié)抗性c3轉(zhuǎn)化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的能夠形成對負調(diào)節(jié)有抗性的C3轉(zhuǎn)化酶的修飾蛋白質(zhì)，編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列以及這些蛋白質(zhì)作為治療劑的用途，特別是在用于減少補體途徑蛋白質(zhì)水平或者在特異性位點上靶向補體攻擊(C3b沉積)上的用途。
補體系統(tǒng)在人類和其它脊椎動物的免疫應答中起作用，并且在效應功能諸如細胞吞噬、細胞溶解以及細胞反射增進方面是十分重要的，它引起局部炎癥反應[15]。這些性質(zhì)對于除去侵入病原體(如細菌)是合乎需要的，但是當觸發(fā)宿主組織(例如在后局部出血再灌注傷害[3])或者異治療物質(zhì)(例如異種抑制的超急性排斥[7])時不受歡迎的。通過利用補體抑制蛋白質(zhì)以試圖廢除這些不受歡迎的性質(zhì)的蛋白質(zhì)，其正常的功能在于抑制補體活化[10,18]。
補體系統(tǒng)包含細胞表面的蛋白質(zhì)(受體和調(diào)節(jié)物)以及液相(血漿和其它胞外環(huán)境)的蛋白質(zhì)。用于產(chǎn)生應答關(guān)鍵的步驟是將C3的蛋白水解轉(zhuǎn)化成為片段C3b和C3a。C3a是過敏毒素，它如同C5a一樣吸引肥大細胞到攻擊位點，導致組胺的局部釋放、血管舒張和其它炎癥反應。新生的C3b在它產(chǎn)生的位點周圍具有表面結(jié)合能力。于是這種C3b集中在由溶細胞補體組分(C5-C9)產(chǎn)生的攻擊上。
例如，表面結(jié)合C3b和它的降解產(chǎn)物也作為C3受體介導吞噬作用的配體而起作用[15]。補體活化有兩條明顯的途徑，它們?nèi)紝е翪3轉(zhuǎn)化成為C3b和隨后的應答。通常通過抗體與抗原的復合體觸發(fā)典型的途徑，該途徑引起牽涉蛋白質(zhì)Clq、Clr、Cls、C2以及C4的酶級聯(lián)。可選擇的途徑取決于牽涉C3自身和所需因子B和D的活化環(huán)。
C3轉(zhuǎn)化為C3b(或者C3i)產(chǎn)生可以與因子B結(jié)合的產(chǎn)物，并且給出C3bB(或者C3iB)。這些復合體通過因子D起作用而產(chǎn)生C3bBb，該C3bBb是能夠從C3b切除更多C3的C3轉(zhuǎn)化酶，這將導致更多的C3bBb和更多的C3轉(zhuǎn)化。在特定環(huán)境下，C3bBb復合物通過與正調(diào)節(jié)物備解素(P)締合而是穩(wěn)定的。然而，通常將這種正反饋環(huán)由調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(顯著地因子H和因子I)限制為一種緩慢的反轉(zhuǎn)。
因子H(和結(jié)構(gòu)上相關(guān)細胞結(jié)合分子)(ⅰ)從C3b取代B和Bb，以及(ⅱ)充當因子I的輔因子，它通過抑制與因子B的任何重組切開C3b成為iC3b由此形成更多C3的轉(zhuǎn)化酶。該途徑用于擴增在表面上存在的C3b的世代，如許多細菌細胞壁，它們結(jié)合新生C3b，并且通過因子H和I抑制它的調(diào)節(jié)。也能夠?qū)⑿律鶦3b固定到內(nèi)源性細胞上。因此，通過膜結(jié)合調(diào)節(jié)物(如MCP、DAF和CR1)附加地保護通常暴露于補體的內(nèi)源性細胞表面，該調(diào)節(jié)物與因子H表現(xiàn)出一種類似的方式。
具有一些稀有的天然存在的條件，其中不能產(chǎn)生正常的液相調(diào)節(jié)并且自發(fā)的C3轉(zhuǎn)化最終導致從循環(huán)中C3的全身性衰竭-(ⅰ)因子H或I的遺傳失調(diào)[13],(ⅱ)抗體的存在(腎因子)結(jié)合C3bBb，并且抑制解離[4]，以及(ⅲ)在眼鏡蛇毒液中與一種蛋白質(zhì)相聯(lián)系，稱之為眼鏡蛇毒毒因子(CVF)，它與因子B結(jié)合，并且形成C3轉(zhuǎn)化酶，該酶不合有C3b，并且不受到因子H和I的影響[14]。在缺少特異性活化的情況下，這表明補體負調(diào)節(jié)的正常生理重要性。
也具有發(fā)生特異性活化的環(huán)境，但是不需要，特別是當它針對宿主組織(例如通過局部缺血或外科破壞的組織)時，或者針對為了治療目的有意提供的異物(如異種移植物、人工器官或者透析膜)時。補體活化導致不合要求的侵襲并且進一步破壞，那么在這些情況下它對抑制或者抑制活化和應答將是有益的。
抑制補體介導損傷的現(xiàn)有方法已將負調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(CR1、MCP、DAF以及因子H和I)的運用作為目標以抑制補體活化。補體如同因子I、一樣的抑制劑，因子H和膜結(jié)合蛋白質(zhì)CR1、DAF、MCD的可溶性衍生物確實抑制可選擇途徑的液相擴增環(huán)。因此，利用這些分子的意圖是在生理情況下減少補體介導的損傷，特別是CR1(看起來是最有效的)[10,18]。
因子H以高濃度(典型地0.3-0.5mg/ml[15])內(nèi)源地存在血漿中，因此即使提高抑制劑的水平確實阻抑液相反應，那么它們的潛力很弱，于是在體內(nèi)應施用大量的純化蛋白質(zhì)(例如可能超過可溶性CR1的5mg/Kg體量)。此外，通過表面已經(jīng)抑制因子H的影響來活化可選擇的途徑。當沒有必要伴隨減少其它抑制劑的活性時，相同的因子表明它們不可能完全或者普遍有效。
眼鏡蛇毒液因子(CVF)具有產(chǎn)生一種穩(wěn)定C3轉(zhuǎn)化酶的性質(zhì)，實驗上該性質(zhì)在動物體內(nèi)中以及在其它樣品的體外(例如人類血漿)可以用來減少補體。CVF是有效的(例如40μg/Kg可以破壞小鼠的補體活性[16])。然而在人類治療上利用它卻是不合適的。
首先，從眼鏡蛇毒液中獲得以便處理(一個獲得的困難來源和并且是危險的)，因此必須細心地從毒液神經(jīng)毒素進行純化。顯然獲得供給也是困難的。這個問題不能通過克隆和表達來自體內(nèi)的基因容易地克服，因為具有后翻譯修飾發(fā)生在蛇中(特異性蛋白水解加工)，這在體外產(chǎn)生可能是困難的(或者不可能的)。此外，要求這種加工的酶和消化條件是當前未知的。其次，蛋白質(zhì)(對于人類)是外源的，因此是免疫的。這排除它的重復治療的利用，正如要求將患者進行去補體許多周(例如使得可以異種移植存活)。
雖然CVF與人類C3具有一些結(jié)構(gòu)和功能的同源性[17]，但是在這兩方面都具有主要的區(qū)別(例如鏈結(jié)構(gòu)，生物合成位點，補體調(diào)節(jié)物的非靈敏性，穩(wěn)定C3轉(zhuǎn)化酶的形成)。它不是來自已知的C3的眼鏡蛇等同物，它已進行克隆與測序，并且它在總體結(jié)構(gòu)和功能上比CVF更加類似人類C3[8]。
CVF是一種來自人類的大的進化距離的動物毒液特異性產(chǎn)物。因此利用基因操作將這種蛋白質(zhì)修飾為在人類中可以用于非免疫原性的產(chǎn)物是不可以實施的。
現(xiàn)在我們已設(shè)計一種可供選擇的策略，該策略依賴于旁支生理調(diào)節(jié)；同時代替抑制補體活化，它導致超活化系統(tǒng)。這具有兩項應用。首先，直到耗盡一個或多個組分時它在體內(nèi)可以用于激活補體，導致喪失對任何隨后攻擊產(chǎn)生局部應答的能力(如異種移植)。其次，可以將非調(diào)節(jié)超活化故意地局限為一個特定的靶(例如病毒或者病毒感染的細胞)以增加那種靶對補體介導破壞性應答的靈敏度。
這里所使用的術(shù)語“補體活化調(diào)節(jié)物”包括所有抑制C3轉(zhuǎn)化擴增的蛋白質(zhì)，并且不是指由于方法所限制的那些蛋白質(zhì)，其基因位于RCA的基因座上。然而它不包括諸如備解素一類的“正調(diào)節(jié)物”。將“C3轉(zhuǎn)化”定義為進入C3b和C3a的C3蛋白水解轉(zhuǎn)化，除非另外提到的，并且將“C3轉(zhuǎn)化酶”(或者簡化為“轉(zhuǎn)化酶”)定義為一種催化這種反應的酶(典型地兩個或者更多個蛋白質(zhì)組分的復合物；例如C3bBb、C3iBb、CVFBb或C4b2a)。
這樣，在第一個方面本發(fā)明提供了修飾(以便該蛋白質(zhì)能夠形成負調(diào)節(jié)抗性C3轉(zhuǎn)化酶)的天然補體途徑蛋白質(zhì)。
“天然的”意味著天然產(chǎn)生的，也就是說天然可以獲得的。這樣，該定義包括如上文所定義的任何已修飾的天然產(chǎn)生的補體途徑蛋白質(zhì)。它不被限定在物種特異性蛋白質(zhì)。換句話說，例如一種修飾的人類蛋白質(zhì)在其它哺乳動物中可以用作負調(diào)節(jié)抗性C3轉(zhuǎn)化酶。典型地，將利用來自相同物種的修飾的補體途徑蛋白質(zhì)。
C3 DNA編碼序列的修飾(例如利用定點誘變)可以產(chǎn)生不同抗補體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的C3的變體，而保持正功能特性(通過C3酶對C3b的切割)和結(jié)構(gòu)完整性特征(正確鏈結(jié)構(gòu)，以及硫酯鍵的存在)。在這里所描述的本發(fā)明涉及天然補體蛋白質(zhì)的基因修飾型，例如人類C3，它的C3b片段獲得抗生理補體調(diào)節(jié)的性質(zhì)。由于這種抗性，在生理環(huán)境(例如在體內(nèi))下這些分子可以產(chǎn)生對應的C3轉(zhuǎn)化酶的穩(wěn)定形式，該酶產(chǎn)生C3向C3b以及后者的降解產(chǎn)物的擴增轉(zhuǎn)化。
在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種修飾的人類C3蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對因子I切割有抗性。
這可以通過在蛋白水解位點上修飾蛋白質(zhì)殘基完成。
本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案涉及一種修飾的人類C3蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)是通過用其它氨基酸取代Arg-1303、Arg-1320之一或兩者修飾的。其它氨基酸可以是酪氨酸、胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或甘氨酸。優(yōu)選地，用谷氨酸或者甘氨酸取代Arg-1303(不太優(yōu)選地用谷氨酰胺)。優(yōu)選地，用谷氨酰胺取代Arg-1320。
本發(fā)明產(chǎn)生合適的修飾的蛋白質(zhì)的其它策略包括ⅰ)對因子H和相關(guān)蛋白質(zhì)(例如MCP、DAF、CR1)的抑制活性的降低的敏感性。例如，在人類中，C3殘基767-776和1209-1271已經(jīng)牽涉到因子H結(jié)合中[20,24]，也與這些蛋白質(zhì)活性相聯(lián)系的一個或多個這些殘基或其它殘基的取代可能降低一個或多個這些調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合。
ⅱ)解離C3bBb的降低的速率。引入的突變可以加強C3b和Bb之間的相互作用。這將導致在酶的自發(fā)分解上的還原作用，以及在從C3b取代Bb中減小因子H(和相關(guān)調(diào)節(jié)物)的效能。
這些突變對于減少C3bBb的自發(fā)的和因子H-介導的分解作用速率是必需的。即使在缺少因子H的情況下，在備解素的存在下，37℃下液相C3bBb復合物具有僅僅約10min的半衰期[6]。
ⅲ)將人類C3殘基752-761牽涉結(jié)合的因子B。在C3中它是高度保守區(qū)域，并且在C4中發(fā)現(xiàn)密切相關(guān)的序列。由于C4結(jié)合因子B同系物C2，在C3與C4之間這個區(qū)域的強相似性，在C3中與它的高度保守性一起，進一步支持它在C3中作為因子B結(jié)合位點。于是，在這個區(qū)域的改變可能影響C3bBb的B親和性和穩(wěn)定性。
ⅳ)對補體活化的其它調(diào)節(jié)物的抗性，如CR1、DAF和MCP也是必需的。這些調(diào)節(jié)物活性方式全部類似于因子H，因此沒有必要要求附加誘變。同樣地，一些致病有機體表達它們自己補體活化的抑制劑，它經(jīng)常在結(jié)構(gòu)上和功能上與因子H具有同源性(例如牛痘病毒分泌肽[])。這些分子使侵入物免受免疫應答，并且能夠用對這些防御具有抗性的目標C3轉(zhuǎn)化酶攻擊它們，這將是有利的。
ⅴ)通過備解素提高C3轉(zhuǎn)化酶的穩(wěn)定性的突變。備解素的活性在于穩(wěn)定C3bBb復合物，抑制自發(fā)的和因子H-介導的解離。這種穩(wěn)定在液相中是無效的，但是一旦它在合適的激活表面上已經(jīng)開始，它似乎在擴增該過程中更重要[5]。提高它的活性(通過提高它的親和性)在液相中可能打破平衡，以及由此促進自發(fā)的C3轉(zhuǎn)化。這與上述的其它修飾結(jié)合起來是特另有用的。
ⅵ)抑制C3bBb具有C5轉(zhuǎn)化酶活性的突變。當用于減少來自循環(huán)的活性C3時，一種不受歡迎的副反應可能產(chǎn)生大量過敏性肽。這些最有效的是C5a，它是通過一些C3轉(zhuǎn)化酶切開C5而得。這個反應有可能取決于C3b的另一個分子的轉(zhuǎn)化酶的親和性[11]，并且它可能通過抑制C3的突變以除去這種相互作用。
ⅶ)C3轉(zhuǎn)化酶的改善的活性。C3bBb C3轉(zhuǎn)化酶的活性位點位于Bb位置。C3b組分可能對于利用Bb的一種活性構(gòu)象和/或結(jié)合以及調(diào)整與Bb反應的底物起作用。這一點是未知的，但是不論哪一種情況下，在C3中可能通過突變提高轉(zhuǎn)化酶的活性范圍。
ⅷ)以功能形式表達。野生型C3要求它在結(jié)合新的C3轉(zhuǎn)化酶復合物之前可以轉(zhuǎn)化成C3b。當用于體內(nèi)時，要求轉(zhuǎn)化成C3b(或者C3i)將延遲改善的C3活性。因此，以可能的立即轉(zhuǎn)化酶形式或者以預形成的轉(zhuǎn)化酶形式施用該蛋白質(zhì)是有利的。因此，對于產(chǎn)生來自體外的功能性C3b-樣藥劑是有利的。這在體外可以完成(例如通過蛋白質(zhì)水解)。
ⅸ)修飾成天然蛋白質(zhì)，該修飾引入新的切割位點以便保持因子B結(jié)合所要求的肽區(qū)域，但是可以特別除去因子H結(jié)合所專門要求的那些。例如，可以引入位點以便將修飾的C3的C3b能夠進一步切割成仍然結(jié)合因子B但是對因子H和I的滅活更敏感的形式。
ⅹ)在其它區(qū)域的修飾可以影響所說的C3b與因子B和/或因子H的相互作用。
本發(fā)明基于通過促進C3轉(zhuǎn)化成缺失C3翻轉(zhuǎn)傳統(tǒng)的方法，同時由此使系統(tǒng)喪失能力。本發(fā)明一項附加的應用是在一個特定的位點促進C3轉(zhuǎn)化的潛力，以及由此恢復攻擊特異性靶的補體依賴的效應子機制。
因此，當將修飾蛋白質(zhì)施用到包含補體活化調(diào)節(jié)物的生理培養(yǎng)基(例如血液)中時，最終效應將提高C3轉(zhuǎn)化量。于是，這種活性可以用來耗盡天然C3的那種培養(yǎng)基，或者用于在所要求的靶上將C3轉(zhuǎn)化局限化。
C3類似物的C3b-片段具有抗因子I(例如實施例1所描述的衍生物)活性，該因子結(jié)合因子B，然后由因子D切開，并且最終解離為失活形式。在缺少通過因子I滅活的情況下，修飾的C3b將能夠重復結(jié)合B的新分子，同時由此促進它的失活。因此，本發(fā)明所描述的修飾的其它潛在應用將是通過消耗因子B的活性對可選擇途徑進行滅活。類似方法也可以用來修飾C4以促進對C2的消耗，并且由此喪失補體活化典型途徑的能力。
本發(fā)明包括以C3bBb酶類似的方式所利用的任何其它蛋白酶，不論補體活化的調(diào)節(jié)物存在與否，該C3bBb酶導致C3切割為C3b。
本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA序列以及包含這樣的DNA序列的DNA構(gòu)建體。
“DNA序列”包括所有其它核酸序列，該序列借助于遺傳密碼的簡并性，也編碼所給定的氨基酸序列，或者該序列實質(zhì)上與這條序列是同源的。于是，這些序列也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
“實質(zhì)上同源的”核酸序列也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在核酸水平或氨基酸水平上可以估計“實質(zhì)上同源性”。在核酸水平上，具有實質(zhì)同源性的序列可以認為是在嚴格條件下(例如在大約0.9M的鹽溶液中在35到65℃下)雜交到本發(fā)明的核酸序列上的那些。如果許多組成型氨基酸顯示同源性，那么在氨基酸水平，某種蛋白質(zhì)序列可以認為與其它蛋白質(zhì)序列具有實質(zhì)上同源的。以增加的優(yōu)選順序，至少55％、60％、70％、80％、90％、95％或者甚至99％的氨基酸可以是同源的。
如上文所討論的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用來完成局限化的補體活化作用。確保這點的一種方式是將蛋白質(zhì)綴合到在所要求的靶上結(jié)合的部分上。于是，在其它方面本發(fā)明提供包含本發(fā)明的連接到特異性結(jié)合部分上的蛋白質(zhì)的綴合物，所說的部分例如特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的一個實例是抗體或者其抗原結(jié)合片段。
施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)以便得到一種所需的治療效果。因此最后本發(fā)明也提供了a)用于治療的本發(fā)明的蛋白質(zhì)；b)在藥物制造上本發(fā)明的蛋白質(zhì)或綴合物的用途，該藥物用于減少補體途徑蛋白質(zhì)水平，并且特別是用于預防異物的排斥作用；
c)包含一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或綴合物和一種或多種藥學上可接受的載體和/或賦形劑的藥物制劑；以及d)在哺乳動物中減少補體途徑蛋白質(zhì)的方法，該方法包括向哺乳動物施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，以藥物制劑的形式施用。
藥物制劑可以以每劑量包含預定量活性成分的單位劑量形式存在。這樣單位可以作為最小量包含，例如，1mg活性成分，以及優(yōu)選地2-3mg。這樣的單位劑量可能包含的上限將取決于許多因素，如處理條件、施用途徑和患者年齡、體重和狀況以及經(jīng)濟條件。作為實施例，單位劑量形式可以包含多達10mg或者甚至100mg活性成分。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于體內(nèi)使補體系統(tǒng)喪失能力。理想環(huán)境可以包括下列(a)為預防對移植的補體介導的破壞或損傷，特別是對異種移植(從不同物種動物所移植的材料)，以及尤其是相異的異種移植(其中在供體與受體物種是不相關(guān)的)。在這種狀態(tài)中，在操作之前將受體進行去補體，并且保持這一狀態(tài)直到移植完成或者被更相容的器官代替。
在移植前幾天內(nèi)進行起始處理。排斥作用驟退時要求附加的去補體。通過利用抗組胺劑可以完成該處理以便控制普通的炎癥反應(例如血管舒張)，該炎癥反應可能導致產(chǎn)生C3a和/或C5a。
去補體在利用人工器官或組織(例如人工腎透析膜)中也可能是有益的，該去補體激活補體系統(tǒng)(如上文所描述的)可以以失活形式、功能性C3形式或者初步加工的活性C3轉(zhuǎn)化酶(如C3bBb)形式給出所說的蛋白質(zhì)。這些可以依靠活性轉(zhuǎn)化酶通過任何途徑施用，該活性轉(zhuǎn)化酶將遇到循環(huán)的C3(例如靜脈內(nèi)，皮下組織等等)。
另一個可選擇的將是來自體外的處理，例如，通過基質(zhì)產(chǎn)生的活性轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)運到循環(huán)系統(tǒng)?？赡茉诜祷鼗颊呷パa體的血液(或者血漿)之前，這對允許除去(例如通過透析)過敏性肽(C3a和C5a)和其它低分子量炎癥介質(zhì)來說是有利的。
(b)為抑制主要由手術(shù)導致的補體介導的損傷。因為已經(jīng)減少補體依賴的免疫發(fā)病，因此，將患者如上進行去補體，優(yōu)選地在操作之前，并且將其保持在這種狀態(tài)下直到脫離附加的內(nèi)傷危險為止。
(C)為減少由非外科傷害導致的補體介導的損傷。在這些情況下，必須在初始傷害后完成去補體化，但是另外施用的制劑與方法可能與上述的那些類似。當恢復包括通過循環(huán)系統(tǒng)局部缺血的組織進行消腫時(例如心肌的、局部缺血的、凍傷的、燒傷的等等)，這可能是特別有用的。
(d)為減少由抗體-抗原導致的補體介導的損傷。補體介導的防御應答在自身免疫疾病中是特別不受歡迎的，它可能包括腎小球性炎癥、溶血性貧血、重癥肌無力、Ⅰ型糖尿病、風濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化。在疾病嚴重期間，喪失能力的補體系統(tǒng)能減輕病情，例如在風濕性關(guān)節(jié)炎中通過局部施用給關(guān)節(jié)。
(e)為使特異性致病靶對補體介導免疫機制更敏感。在這種方法中，目的不在于利用超活性C3轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)生C3的全身性耗竭，但是代替局部利用轉(zhuǎn)化酶向一個所要求的目標集中C3轉(zhuǎn)化。該目標可能是致病有機體，如細菌、病毒或者其它寄生蟲，或者有害宿主細胞或組織，如腫瘤細胞或者病毒感染的細胞。將C3轉(zhuǎn)化酶通過局部施用(例如定向注射，有可能在介質(zhì)中阻礙它分散到一般的循環(huán)系統(tǒng)中)或者通過與目標部分(例如抗體)結(jié)合局限到該靶上。于是，修飾蛋白質(zhì)可以通過蛋白質(zhì)的化學交聯(lián)或者通過加入DNA編碼序列并且表達(和純化)融合蛋白質(zhì)(例如，在IgG下，將重鏈或輕鏈連接到C3并將與C3進行共表達，或者將兩條鏈結(jié)合成一條完全的融合多肽)，或者通過將特異性編碼的序列(例如“亮氨酸拉鏈”-樣結(jié)構(gòu)域)摻入到兩個融合配偶體的DNA(例如修飾的C3和特異性抗體)連接到特異性免疫球蛋白上以便當共同混合時，表達的產(chǎn)物自我締合以形成穩(wěn)定的綴合物。然后將融合蛋白質(zhì)進行局部或者全身施用。
脂質(zhì)體(在脂質(zhì)體表面或內(nèi)部修飾的蛋白質(zhì)在表面產(chǎn)生抗體)和/或病毒顆粒(例如設(shè)計的以在它們表面上表達蛋白質(zhì))的脂質(zhì)體也可以用于抗體和修飾蛋白質(zhì)的共分送。本策略可以在疾病的任何階段直接地、單獨地以及與其它治療結(jié)合起來進行利用。它可以特別適合于在對腫瘤的外科切除之后，除去任何留在循環(huán)系統(tǒng)中的癌細胞。也可能利用來自體內(nèi)的抗體修飾蛋白質(zhì)綴合物除去致病的組織。例如，殺死從骨髓提取的白血病細胞，然后將余下的健康細胞歸還給患者。
將不與MHC型受體匹配的可選擇的淋巴細胞在移植之前從骨髓中除去。同時，將修飾蛋白質(zhì)與抗原連接，并且將這種結(jié)合在體內(nèi)或來自體內(nèi)用于侵襲不受歡迎的反應的淋巴細胞(例如與移植體或自身的組織)。
將同樣的技術(shù)應用于處理其它物種，利用人類修飾的衍生物，或者為那種物種特制的類似物。
本發(fā)明每方面優(yōu)選的特性已進行了必要的描述。
現(xiàn)在將通過下列實施例來描述本發(fā)明，但這些實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。在實施例涉及的附圖中

圖1顯示如在PC3中編碼的人類C3的預測的蛋白質(zhì)序列；(使用標準單字母氨基酸代碼)圖2顯示在PC3中的cDNA序列；(使用標準單字母有義鏈的脫氧核酸代碼，5′-3′書寫)。
圖3顯示本發(fā)明修飾蛋白質(zhì)。
圖4顯示各種突變對人類C3影響，該突變在這些位點上通過因子I-介導的切割取代Arg1303或Arg1320。N.B.
1．[35S]-生物合成標記樣品。
2．在正常離子強度下完成的反應。
3．用抗-C3免疫沉淀。
4．在還原條件下的SDS-PAGE。
5．放射自顯影。
圖5顯示摻入Arg1303-＞Gln1300突變成為由因子I和H的滅活的人類C3的提高的抗性。
圖6顯示在氨基酸殘基752-754和758-760上所突變的C3轉(zhuǎn)化酶的切割分析。
這是從7.5％聚丙烯酰SDS-PAGE凝膠顯影的蛋白質(zhì)印跡的照片(還原條件)，在用電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上后，用綿羊抗人類C3抗體進行探針分析，以及用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗綿羊免疫球蛋白抗體和記錄在X-射線膠卷上的增強化學發(fā)光(來自Amersham,U.K.的方法和檢測試劑)進行展開。如實施例4描述完成切割反應和檢測，參考如圖3所顯示的結(jié)果。結(jié)果泳道1-4野生型C3(在COS細胞中所表達的)泳道5-8突變體C3(改變?yōu)镚ly-Ser-Gly的殘基752-754和也改變?yōu)镚ly-Ser-Gly的殘基758-760)(在COS細胞中所表達的)泳道1,5沒有添加泳道2,6:+CVFBb泳道3,7:+因子H+I泳道4,8:+CVFBb+因子H+I箭頭所表明的區(qū)帶是A:C3α-鏈B:C3α′-鏈C:C3β鏈D:C3α′-鏈的68kDa切割產(chǎn)物E:IgG重鏈圖7顯示由因子D在C3(C3i)野生型和突變體存在下對放射性標記因子B的切割的分析。
顯示SEE-PAGE凝膠的放射自顯影圖的照片。所有樣品包含因子D和125I-標記因子B，并且在37℃下溫育3小時。
在編號的泳道中的樣品也包括1．僅有緩沖液2．1/125野生型C33．1/25野生型C34．1/5野生型C35．1/25突變體C3(殘基1427Gln、1431Asp和1433Gln)6．1/5突變體C37．沒有稀釋的突變體C3
箭頭所表明的帶是A．未切割的125I-標記因子B(93kDa)B．60kDa切割產(chǎn)物(“Bb”)C．33kDa切割產(chǎn)物(“Ba”)圖8顯示說明形成C3I與IgG之間的綴合物的SDS-PAGE研究。這是在非還原條件下進行4％丙烯酰胺SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色。編號的泳道含有樣品1．PDP-IgG2．C3i3．PDP-IgG+C3i反應混合物用箭頭表明的是A．可能是C3i-IgG綴合物(350 kDa)B．C3i(200kDa)C．IgG(150kDa)圖9顯示綴合物將綿羊紅細胞的C3轉(zhuǎn)化酶活性作為目標。(如方法所描述的，本圖顯示在用通過洗滌的C3i-IgG綴合物、PDP-IgG或C3I稀釋液包被，用備解素和因子B和D產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶，最后利用在CFD/EDTA中的NGPS溶胞作用進行顯影后％裂解的綿羊紅細胞。只有綴合物產(chǎn)生溶胞作用，并且這種溶胞作用是劑量依賴性的。)圖10和11顯示DV-1AM突變體C3的切割性質(zhì)(參見實施例12-14)。
就圖10來說，如實施例4所描述的，將包含表達的野生型(A)和DV-1AM突變體(B)C3的COS細胞上清液利用1)-；2)CVFBb；3)10μg/ml因子I和50μg/ml因子H；或者4)CVFBb加10μg/ml因子I和50μg/ml因子H進行處理、免疫沉淀、通過SDS-PAGE的分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纖維素膜上進行電印跡。在這種情況下，利用大鼠單克隆抗體、克隆-3和克隆-9組合進行展開，將其與C3的C3dg區(qū)域和它的斷裂產(chǎn)物(Lachmann,P.J.等，免疫學雜志41:503(1980))通過與辣根過氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白質(zhì)(來自Sigma)反應并且利用ECL試劑和Amersham供給的方法進行檢測。
就圖11來說，如實施例4所描述的，將包含表達的DV-1B突變體(A)、野生型(B)和DV-6突變體(C)C3的COS細胞上清液利用1)-；2)10μg/ml因子I和50μg/ml因子H；3)CVFBb；4)CVFBb+10μg/ml因子I和2μg/ml因子H；5)CVFBb+10μg/ml因子I和10μg/ml因子H；6)CVFBb+10μg/ml因子I和50μg/ml因子H進行處理、免疫沉淀、通過SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)、在硝酸纖維素膜上進行電印跡以及利用多克隆綿羊抗-C3抗體進行檢測。
圖12顯示從讀框變換突變導致的C3相關(guān)產(chǎn)物的分析。將這種產(chǎn)物稱作HDV-3X。將HDV-3X的結(jié)果與DV-3的結(jié)果相比較，如同HDV-3X一樣包括突變T1031G、E1032N、Q1033H、E1035N和K1036I，但是不同于HDV-3X在C-末端不進行修飾。
如實施例4所描述的，將包含表達的DV-3(A)和HDV-3X突變體(B)C3的COS細胞上清液利用1)-；2)CVFBb+10μg/ml因子I；3)CVFBb+10μg/ml因子I+1μg/ml因子H；或者4)CVFBb加10μg/ml因子H進行處理、免疫沉淀、通過SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纖維素膜上進行電印跡。在這種情況下，利用大鼠單克隆抗體、克隆-3和克隆-9組合進行展開，其與C3的C3dg區(qū)域和它的斷裂產(chǎn)物(Lachmann,P.J.等，免疫學雜志41:503(1980))反應，接著與辣根過氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白質(zhì)(來自Sigma)反應并且利用ECL試劑和Amersham供給的方法進行檢測。
圖13是就實驗來說，其中COS細胞上清液包含表達的E1QZ(A)、E1Q2QG3(B)和E1Q2E3(C)突變體C3，如實施例4所描述的，將上清液利用1)CVFBb+10μg/ml因子I；2)CVFBb+10μg/ml因子I+50μg/ml因子H；3)CVFBb+10μg/ml因子I+25μg/ml sCR1進行處理(37℃,2.5hr)、免疫沉淀、通過SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纖維素膜上進行電印跡。在這種情況下，如實施例12所描述的，利用大鼠單克隆抗體、克隆-3和克隆-9組合進行展開，接著與辣根過氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白(來自Sigma)反應，并且用ECL試劑和Amersham供給的方法進行檢測。
圖14是就實驗來說，其中COS細胞上清液包含表達的NC3(A)、FT-1(B)、FT-2(C)、FT-3(D)、PT-4(E)和FT-5(F)突變體C3，如實施例4所描述的，將上清液利用1)-；2)CVFBb+10μg/ml因子I+50μg/ml因子H進行處理(37℃,2.75hr)、免疫沉淀、通過SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纖維素膜上進行電印跡。在這種情況下，如實施例12所描述的，利用大鼠單克隆抗體、克隆-3和克隆-9組合進行展開，接著與辣根過氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白(來自Sigma)反應并且利用ECL試劑和Amersham供給的方法進行檢測。
圖15是就實驗來說，其中COS細胞上清液包含表達的NC3(A)、FR-1(B)、FR-2(C)、FR-3(D)、FR-4(E)和FT-2(F)突變體C3，如實施例4所描述的，將上清液利用1)-；2)CVFBb+10μg/ml因子I+50μg/ml因子H進行處理(37℃,2.5hr)、免疫沉淀、通過SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纖維素膜上進行電印跡。在這種情況下，如實施例12所描述的，利用大鼠單克隆抗體、克隆-3和克隆-9組合進行展開，接著與辣根過氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白(來自Sigma)反應，并且利用ECL試劑和Amersham供給的方法進行檢測。
為了便于參考，將涉及能夠充分作為負調(diào)節(jié)抗性C3轉(zhuǎn)化酶的特定蛋白質(zhì)的權(quán)利要求和實施例以及此后提供的表的關(guān)系提供如下表A
下列的標準方法和定義適用于所有實施例提到的所有補體組分都來源于人類，除非特別規(guī)定，對于所有蛋白質(zhì)及它們的衍生片段都使用標準術(shù)語。另外，術(shù)語“C3i”意指涉及到任何沒有完整的硫酯鍵，但是在α鏈上保持C3a多肽C3的任何分子形式。
如圖2所顯示的，利用EMBL核苷酸數(shù)據(jù)庫(參考文獻[2]來源的)的數(shù)據(jù)，將人類C3 cDNA和編碼序列進行編號。所顯示的序列是我們的構(gòu)建體(“PC3”)的序列，在參考文獻[2]中報道它缺乏5′非翻譯區(qū)的頭11個核苷酸，因而將第一個堿基標為12。公認的起始密碼子核苷酸編號是61-63,β-鏈的氨基末端絲氨酸殘基的密碼子核苷酸編號是127-129，并且α-鏈的氨基末端絲氨酸殘基的密碼子核苷酸編號是2074-2076。
如圖1所顯示的，按照前體序列將蛋白質(zhì)序列進行編號，這在附錄1中是DNA序列的一種預測翻譯(人們預料，氨基酸1-22包含在生物合成期間除去的信號序列，并且在將前體切開成α-和β-鏈時，將氨基酸668-671切除)。
下列縮寫具有下列意義CVF眼鏡蛇毒因子；ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測定；E.coli，大腸桿菌；Kb，千個堿基；HSV-1，單純皰疹病毒1型；PBS，磷酸緩沖鹽溶液。COS-1是來自猴腎細胞的細胞系。下列是限制性內(nèi)切酶-AflⅡ、DraⅠ、DraⅢ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、NaeⅠ、NheⅠ、XbaⅠ。標準方法在參考文獻[21]中可以找到標準分子生物程序的方法，如質(zhì)粒分離、瓊脂糖凝膠電泳以及DNA接合。利用由“美國生物化學制品”供給的測序酶版本2.0試劑盒對DNA雙鏈進行測序。利用由親活純化的多克隆綿羊抗人類C3預包被的塑料平板通過ELISA分析測量C3表達，將培養(yǎng)上清液的樣品添加到該C3中。用C3的單克隆大鼠抗體檢測結(jié)合的C3，例如堿性磷酸酶以及顯色底物，對硝基苯磷酸。以純化人類質(zhì)粒C3校準。
在參考文獻[28]中可以找到補體蛋白質(zhì)和CVF純化分析方法以及親和性純化的抗-C3抗體的制備方法。從Sigma化學有限公司也可以購買等效試劑。C3 cDNA編碼序列我們的C3 cDNA編碼序列由兩條隨機提供的人肝cDNA文庫分離的片段構(gòu)建而得，載體pGEM4(Promega)攜帶該cDNA文庫。在人類C3編碼序列中，將對應于已知片段的5個寡聚脫氧核苷酸用T4聚核苷酸激酶和[γ-32P]ATP進行放射性標記，并且將它用來探測來自瓊脂糖平板的文庫的濾膜轉(zhuǎn)移。分離兩個包含大約4kb插入物的克隆。對特異性寡聚脫氧核苷酸探針限制性內(nèi)切核酸酶進行消化、雜交以及部分序列分析，顯示這些中的一個(“A13”)包括5.1kb信號的5′-末端，而另一個(“B44”)延伸至3′-末端。
因此，這些大約3kb重疊的插入物包括一個唯一的EcoRⅠ限制酶位點。用EcoRⅠ和NheⅠ切除A13的5′不完全部分，并且用由EcoRⅠ和XbaⅠ消化從B44分離的完全片段予以代替。在與T4 DNA連接酶連接以產(chǎn)生包含5.1 kb的編碼全C3前體蛋白質(zhì)的DNA的載體(“PGC3”)之前，將兩條片段通過低熔點瓊脂糖凝膠電泳進行純化。
對于C3編碼區(qū)而言，連接子序列5′包含兩個潛在的假翻譯ATG的起始位點。因此，如實施例1所描述的方法，利用寡聚脫氧核苷酸PL-ATC-3(tagggagaccggaagcttgccctctccctctgtccctctg t)通過隔離質(zhì)粒誘變可以將其除去，該PL-ATC-3不用改變C3編碼序列可以缺失大約50個連接子/結(jié)合體DNA。這種突變載體(7.7kb)包含5.1kb的C3 cDNA序列+2.6kb來自PGEM4載體(Promega)的序列，該突變載體稱作PC3。
將PGC3質(zhì)粒的C3編碼區(qū)進行完全測序，并且揭示出與以前所公開的人類C3(“S”等位基因)cDNA序列僅有四點區(qū)別[2](ⅰ)改變C2481→G以及C2805→T不改變編碼；(ⅱ)T1001→C編碼以前所描述的HAV 4-1-(亮氨酸314→脯氨酸)多形形式[20]；以及(ⅲ)G2716→A編碼結(jié)氨酸→異亮氨酸，這在人類C3中以前還沒有報道過，雖然Ile在小鼠和大鼠中這個位置上已發(fā)現(xiàn)。
我們的序列具有一條完全信號序列，它包括起始和終止密碼子，因此，它可以編碼功能性C3。
在COS-1細胞(利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺和pcDNA3(Invitrogen))的培養(yǎng)物上清液中，多達1.7μg/ml水平表達的野生型C3通過ELISA已經(jīng)進行檢測。通過僅用pcDNA3載體轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生不可檢測的C3。進而，采用免疫沉淀法、SDS-PAGE和免疫印跡法進行切割反應，通過該切割反應分析顯示(ⅰ)將初級翻譯產(chǎn)物正確地加工成成熟雙-鏈形式；(ⅱ)這種產(chǎn)物，如同天然C3一樣，可以由C3轉(zhuǎn)化酶(CVFBb)切割成C3b；以及(ⅲ)象天然的C3，所表達的蛋白質(zhì)由因子H+I不可切開，但是由C3轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化成為C3b后變得可以切開。這證實可以將我們的開始質(zhì)粒翻譯成為功能性C3。C3編碼序列的構(gòu)建與表達的另一種描述參見參考文獻[25]。
實施例1在兩個因子I的切割位點(氨基酸位置1303和1320)具有轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺殘基(以抑制由因子I對C3b片段的切割)的精氨酸殘基的C3的產(chǎn)生。a)誘變所利用的誘變寡聚脫氧核苷酸是QRI1(caactgcccagccaaagctccaagatcacc)、QRI2(gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag)和AFL4149(taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac)以及對應的反義寡聚脫氧核苷酸-QRIln(ggtgatcttggagctttggctgggcagttg)、QRI2n(cttggtctcttctgattgcaggaggctggc)和AFL4149n(gttttatcgtgaccttaaggtcgaatttatta)。
在C3前體序列中氨基酸殘基1303的因子I切割位點上，QRI1和QRIln指定谷氨酰胺取代精氨酸(在cDNA序列中把通過將G39968C3969改變?yōu)锳A)，以及QRI2和QRI2n在氨基酸殘基1320的因子I切割位點實現(xiàn)相同的取代(通過將核苷酸G4019改變?yōu)锳)。
在cDNA序列中的位置4149上，AFL4149和AFL4149n引入限制性內(nèi)切核酸酶AflⅡ的切割位點(通過將C4149改變?yōu)門)而不改變所編碼的氨基酸序列。將這兩個引物用作標記，使得以由AflⅡ切割DNA產(chǎn)物為基礎(chǔ)確定成功的誘變。
利用間隙質(zhì)粒方法實現(xiàn)誘變。通過在0.25μg/ml尿苷存在下大腸桿菌菌株C5236的生長來制備一批在尿苷代替胸苷中富集的PGC3(“UPGC3”)。將這種質(zhì)粒用SmaⅠ消化，并且將7.2kb產(chǎn)物通過(“US1”)瓊脂糖凝膠純化以除去C3序列的0.5kb片段(殘基1463-1947)。通過DraⅢ+NaeⅠ消化PGC3，并且通過兩次瓊脂糖凝膠電泳純化5.1kb片段來制備間隙質(zhì)粒的其它組分(“DN2”)。在50μ1H2O中將200ngDN2用大約500ng US1混合，并且將它加熱100℃，并且在添加20μl至25μl的2XT7緩沖液(100mM Tris/HCl/pH7.4/14mM MgCl2,100mM NaCl,2mM二硫蘇糖醇，以及每種1mM的dATP、dCTT、dTTP和dGTP)+10nmol每種5′-磷酸化誘變引物(一個反應使用QRI1、QRI2+AFL4149，另一個反應使用QRIln、QRI2n+AFL4149n)之前慢慢地冷卻到50℃以下。將混合物重新加熱到70℃保持5min，并且慢慢地冷卻到20℃(在30-60min期間)。在0℃，添加10個單位的T7 DNA聚合酶+80個單位的T4 DNA連接酶。首先將混合物(總量50μl)在0℃溫育5min，然后在室溫下溫育5min，并且最后在37℃下溫育3小時。按照按照制造商的說明書，將1μl每種混合物用來轉(zhuǎn)化100μl超感受態(tài)X L1大腸桿菌(Stratagene)篩選AflⅠ切割的氨芐青霉素抗性菌落，并且將成功的突變體在100ml分離和測序(利用測序引物C3pa-3876,cttcatggtgttccaagcct,C3 cDNA的配對核苷酸3876-3895)質(zhì)粒的培養(yǎng)物中培育以確定在因子I切割位點的突變的特征。
對于“間隙質(zhì)?！闭T變的另一個方案參見參考文獻[26,27]。
b)突變體DNA轉(zhuǎn)移到真核表達載體中通過用HindⅢ和NaeⅠ的雙重消化除去來自突變體質(zhì)粒的C3編碼片段。也包括DraⅠ以便除去殘余質(zhì)粒。C3編碼序列是由瓊脂糖凝膠純化的，并且將它結(jié)合到pcDNA3載體(Invitrogen)中，已經(jīng)用HindⅢ和EcoRⅤ酶將它線性化以及用牛小腸磷酸化酶去磷酸化。將連接混合物用于轉(zhuǎn)化超感受態(tài)XL1大腸桿菌，然后平板接種到包含氨芐青霉素的培養(yǎng)平板上。
將氨芐青霉素抗性菌落的隨機選擇(三或四個)在2-3ml培養(yǎng)物和小規(guī)模分離的質(zhì)粒DNA中進行培育。通過用限制內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ和AflⅡ消化質(zhì)粒DNA來確定包含正確插入的質(zhì)粒。對應的菌落生長在100ml培養(yǎng)物上并且通過標準方法純化該質(zhì)粒。這些突變體最初從PGC3構(gòu)建而得，于是編碼區(qū)保持兩個ATG的5′。因此，用EcoRⅠ的HindⅢ將這區(qū)域(加3kb編碼序列的C3的5′)除去，并且通過切出的PC3相同的片段的連接將其代替。由標準方法制備這些重構(gòu)建的載體，并且用于COS細胞的感染。c)野生型和突變體C3的表達按照制造商的說明書，利用lipofectamine(GIBCO)由轉(zhuǎn)化到COS-1細胞的質(zhì)粒短暫地表達突變體和野生型C3。典型地，利用9μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑用2-4μl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染標準6孔培養(yǎng)平板的每孔1-1.5X105個細胞。檢驗C3分泌的上清液，并且轉(zhuǎn)染3-6天后獲得每ml上清液0.3-1.7μg典型產(chǎn)量。結(jié)果a)突變體的生長按照已經(jīng)摻入的誘變寡聚脫氧核苷酸命名的下列突變體迄今已得到分離-(ⅰ)3種具有QRI1和QRI2加AFL4149的突變體C3M-26、C3M-58和C3M-61的突變體；(ⅱ)1種具有QRI1和QRIZ但是沒有AFL4149的突變體C3M-8的突變體；以及(ⅲ)1種具有QRI2和AFL4149但是沒有QRI1:C3M-51的突變體(用于實施例3)。
b)證實功能性作用是因為在因子I切割位點特異性引入的突變在每個突變體所突變的區(qū)域周圍，測序已經(jīng)確認不存在于178-350堿基上的其它改變。通過用于誘變的整個“間隙”(堿基2463-5067)，已經(jīng)分析一個由這種方法產(chǎn)生的突變體(C3M-51)的序列(參見實施例3)，并且發(fā)現(xiàn)與野生型序列的其它差異。
此外，來自所有突變體的總共2922個堿基的各自的測序還沒有揭示任何能夠由合成酶介導的錯誤造成的單點突變。所有表達的突變體都顯示雙鏈結(jié)構(gòu)和由代表天然C3特征的C3轉(zhuǎn)化酶的切割?？傊m然沒有將它們完全進行重新測序，但是所利用的突變體不可能包含有任何不需要的改變。實施例2．在一個因子I切割位點(氨基酸位置1303)上具有轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺殘基的精氨酸殘基的C3的產(chǎn)生。
僅僅除了誘變寡聚脫氧核苷酸AFL4149+QRI1或AFL4149n+QRIln(即沒有QRI2或QRI2n)之外，將實施例1的方法用于誘變。結(jié)論a)獲得的突變體2種具有QRI1和AFL4149但是沒有QRI2的突變體被分離-C3M-I23,27。如實施例1的描述，表達突變體C3M-I23。
這種蛋白質(zhì)通過CVFBb是可切開的。C3b-樣產(chǎn)物(與野生型相比)對位置1303由因子I和H的切割更具有抗性，但是在位置1320上仍然能夠切開。因此，這種C3b衍生物對因子I具有部分抗性。
實施例3．在一個因子I切割位點(氨基酸位置1320)上具有轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺殘基的精氨酸殘基的C3的產(chǎn)生。
僅僅除了誘變寡聚脫氧核苷酸AFL4149+QRI2或AFL4149n+QRI2n(即沒有QRI1或QRI1n)之外，將實施例1的方法用于誘變。結(jié)論a)獲得的突變體3種具有QRI2和AFL4149但是沒有QRI1的突變體被分離-C3M-51,C3M-Q2,C3M-Q13。如實施例1所述，表達突變體C3M-51。
這種蛋白質(zhì)通過CVFBb是可切開的。C3b-樣產(chǎn)物(與野生型相比)在位置1320上不易由因子I和H切割，但是在位置1303上仍然能夠切開。因此，這種C3b衍生物對因子I具有部分抗性。實施例4．突變的功能性作用分析。
將來自轉(zhuǎn)染的COS細胞的上清液(100-400μl)在37℃下溫育2h。將COS細胞用pcDNA3進行轉(zhuǎn)染，pcDNA3攜帶插入物-1)沒有突變的C3序列；2)突變體C3M-I23(編碼Arg1303→Gln)；3)突變體C3M-26(編碼Arg1303→Gln,Arg1320→Gln)；以及4)突變體C3M-51(編碼Arg1320→Gln)。
將200μl培養(yǎng)物上清液(轉(zhuǎn)染3天之后)用2mM苯甲基磺酰氟預處理，然后在37℃下溫育2h，如下A)沒有添加；B)預形成的C3轉(zhuǎn)化酶，CVFBb(從200μl包含6.6μgCVF、100μg因子B和1.4μg因子D中取出的10μl，在370C在包含10mM MgCl2的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中37℃下預溫育15min)；C)因子H(5μg)和I(1μg)；以及D)CVFBb+因子H和I。
然后，通過在室溫下添加0.6μg親活性純化的綿羊抗人類C3免疫球蛋白將這些進行免疫沉淀，并且在1小時之后添加20μl 5％的洗滌的福爾馬林固定的Group C Streptococcus sp細胞(蛋白質(zhì)G)(Sigma)的懸浮液。在1％SDS/2％2-巰基乙醇中進行(90-100℃,5min)之前，在室溫下45min之后，在PBS,5mM NaN3中將微粒洗滌一次，并且在20mMTris/HCl、137mM NaCl、0.1％吐溫20(v/v)(pH7.6)中洗滌一次。通過SDS-DAGE分離這些洗脫液，將其在硝酸纖維素膜上進行電印跡，并且通過采用辣根過氧化酶偶聯(lián)的驢抗綿羊免疫球蛋白(Sigma)，利用親活純化的綿羊抗人類C3免疫球蛋白的探查來檢測C3區(qū)帶，以及利用由Amersham提供的“增強的發(fā)光化學”底物進行檢測。顯示了對X-射線膠卷暴光2分鐘的照片。標記的箭頭表明可見的C3-產(chǎn)生的區(qū)帶，并且個體樣品(1-4,A-D)是剛剛所描述的那些。存在于所有樣品中的約50 kDa的顯著的區(qū)帶(在46與68kDa之間的區(qū)帶)是用于免疫沉淀的IgG的重鏈，并且通過辣根過氧化酶偶聯(lián)的驢抗綿羊免疫球蛋白進行檢測。結(jié)果(參見圖3)1．所有未處理的樣品(1-A、2-A、3-A、4-A)包含C3的α鏈和β鏈的正確遷移的區(qū)帶，這表明將所有突變體進行表達，以及正確地將其進行后翻譯加工。在這些樣品中存在的43或46kDa區(qū)帶表明在培養(yǎng)基中存在一些因子H+因子I-樣活性。在3天生物合成期間，C3的自發(fā)水解產(chǎn)生由這種活性切開的C3i。在未突變的C3中，產(chǎn)生43kDa和75kDa的區(qū)帶(該75kDa區(qū)帶是不可見的，因為(ⅰ)它被75kDaβ鏈掩藏，以及(ⅱ)用于對蛋白質(zhì)印跡進行顯影的抗體對這部分C3的α鏈具有非常小的活性通過用大鼠單克隆抗體(“克隆-3”)重新探測隨后確定它的存在，該抗體對這區(qū)域具有特異性)。添加因子H和I(不添加CVFBb)(1-C、2-C、3-C、4-C)沒有切開余下的C3，表明這代表活性C3(完整的硫酯)。
2．(1)通過CVFBb切開未處理的C3，并且將C3b產(chǎn)物在l-B中或在1-D中添加因子H和I進一步用內(nèi)源性酶切開。43kDa的區(qū)帶表明在Arg1320的切割，以及68kDa的區(qū)帶表明在Arg1303的切割(在更長暴光中可以見到)。
3．突變體C3M-I23(Arg1303→Gln)由CVFBb是可切開的，并且產(chǎn)物對內(nèi)源性因子H和I-樣活性(2-B)相對地具有抗性，具有明顯量持續(xù)的α′鏈(C3b)，但是添加額外的因子H和I(2-D)時，它仍然可以切開。43kDa的產(chǎn)物表明在Arg1320上的切割(在71kDa上的模糊條帶表示α′鏈的其它片段，它在更長時間的暴光下是可見的)，但是沒有68kDa區(qū)帶存在，這顯示這個突變體在突變的Gln1303上對切割具有抗性。
4．突變體C3M-26(Arg1303→Gln,Arg1320→Gln)由CVFBb是可切開的，并且C3b-樣產(chǎn)物(α′)對內(nèi)源性因子H和I-樣活性(3-B)具有抗性。與未突變的C3(1)和其它突變體(2和4)相比較，它對附加因子H和I(3-D)也十分具有抗性。有少量的kDa產(chǎn)物表明在突變的Gln1303上的一些切割(伴隨68kDa的片段在更長暴光后也是可以見到的)。有極少甚至沒有可見的43kDa在Gln1320上對應任何切割。
因此，在位置1303的Arg→Gln突變比在位置1320的突變在抑制由因子I的切割方面效果較差。(這種緩慢的殘余切割也可以在突變體C3M-I23(Arg1303→Gln)中產(chǎn)生，但是46kDa的中間體通過在未突變的Arg1320上進一步切割有可能迅速加工成43kDa)。
5．突變體C3M-51(Arg1320→Gln)由CVFBb是可切開的，并且產(chǎn)物對內(nèi)源性因子H和I-樣活性(4-B)以及附加因子H和I(4-D)的切割具有抗性。46kDa的產(chǎn)物(和模糊的68kDa的區(qū)帶)表明Arg1320的切割。然而，缺乏43kDa的區(qū)帶表明在突變的Gln1320上是不能切開的。實施例5．在位置1303上各種氨基酸取代的比較1．概論以前實施例描述了arg1303和arg1320向谷氨酰胺殘基的突變。兩種突變賦予在那些位置上對由因子I切割的抗性。然而，在arg1303上有小的但可檢測的切割程度。因此，在這個位置上產(chǎn)生和檢驗一些其它氨基酸的取代。當殘基1303是Arg＞Tyr＞[Cys或Trp]＞Gln＞[Glu或Gly]時，切割以降低的效力順序出現(xiàn)。這些結(jié)果是意外的，因為(ⅰ)所有已知天然產(chǎn)生的人類因子I-介導的切割產(chǎn)生精氨酸殘基的C端，于是我們推定，該酶需要精氨酸；以及(ⅱ)如果切割發(fā)生在其它殘基上，人們預料它們將不得不靜電上類似于arg，即一種堿性殘基(lys或his)，(例如胰蛋白酶有選擇地切開arg、lys或his的C端)，因此人們不能預言酪氨酸取代的切割。
因此，為了產(chǎn)生對因子I的滅活有抗性的C3的衍生物，用甘氨酸或谷氨酸取代arg1303是優(yōu)選的。2．方法2.1誘變所利用的簡并誘變引物是caactgcccagc(gt)(ag)(cg)agctccaagatcacc(括弧中的字母表明在那個位置的堿基混合物)。突變體通過間隔質(zhì)粒方法(如以前的實施例所描述的)或者通過“大引物方法”(V.Picard等，核酸研究22:2587-91,(1994))進行構(gòu)建，其中上游引物是caccaggaactaaatctagatgtgtccctc，并且下游引物是gttttatagtgaccttaaggtcgaatttatta。所有突變都在模板上完成，其中已經(jīng)將C3-編碼的DNA進行突變以便氨基酸殘基1320是谷氨酰胺，在位置4149上已經(jīng)引入了AflⅡ的限制酶切位點(如以前實施例所描述的)并且通過DNA測序來確定。2.2表達如以前實施例所描述的，將突變體利用pcDNA3載體在COS細胞中進行表達，在無血清培養(yǎng)基中用[35S]甲硫氨酸進行標記。2.3測定將上清液用CVFBb(在包含鎂的緩沖液中通過CVF與因子B和D因子反應形成的)和H和I因子處理，接著以抗-C3的免疫沉淀，并且在還原條件(如以前實施例所描述的)下用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳完成分離。將凝膠固定，用Amersham的“擴增”試劑處理，干燥并且對放射自顯影膠卷進行暴光，獲得圖中所顯示的結(jié)果。3．結(jié)果在位置1303(位點1)的因子I-介導的切割(在位置1320(位點2)(在這里已經(jīng)突變成谷氨酰胺)沒有切割)產(chǎn)生46和68kDa的區(qū)帶?？梢钥闯觯懈畎l(fā)生的秩序arg(R)＞tyr(Y)＞cys(C)和trp(W)＞gln(Q)＞gly(G)和glu(E)。將野生型(在這兩個位置的精氨酸)在這兩個位置切開，產(chǎn)生(在凝膠中太小不能見到)43和68kDa的片段。4．附4顯示結(jié)果。上述泳道各自表明在位點1(位置1303)和位點2(位置1320)的殘基。實施例6．在arg130突變成gln后對因子I和H滅活的提高的抗性的說明1．概論以前實施例顯示arg1303或arg1320向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化使那個位點形成對由因子I引起的切割的抗性。兩個位點的突變使在任何一個位點上形成對切割具有抗性的分子。在這里，我們進一步顯示對于由因子I和H引起的功能滅活而言，與野生型相比僅有arg1303向gln的突變(沒有arg1320的改變)導致更大的抗性。2．方法2.1表達arg1303→gln突變的制備如以前的實施例所描述的。用磷酸鈣方法將其轉(zhuǎn)染進CHO(來源于中國倉鼠卵巢細胞的一種普通的實驗室細胞)中并基于G418抗性(由Sigma提供的“遺傳霉素”)選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。收集培養(yǎng)物上清液，并且通過硫酸鈉沉淀(10-20％(w/v)組分)以及在Q-瓊脂糖和單-Q瓊脂糖凝膠上通過離子交換層析部分純化所表達的C3(A.W.Dodds方法酶學223:46(1993))。
2.2測定將綿羊紅細胞涂上一層S016單克隆抗體(RA Harrison和PJ Lachmann實驗免疫學手冊第四版39章(1986))，然后將4.4ml 5％(v/v)的懸浮液用約10μg C2、24μgC4和1μgCl(純化的人類組分)在37℃下在CFD中溫育10min(R A Harrison和P J Lachman同上)。然后用0.25ml包含半純化的突變體或野生型C3和EDTA(終濃度12.5 mM)的溶液將0.8ml這種溫合物溫育105min。然后在CFD中洗滌這些細胞，并且所用的CFD包含0.1％(w/v)的明膠(CFD-凝膠)。將與[125I]-標記的克隆4單克隆抗-C3抗體結(jié)合的放射配體用來確認類似量的野生型或突變體C3b被沉淀。
對于測定來說，將40μl 5％的細胞懸浮液在250μl CFD-凝膠中稀釋，并且將50μl的等份試樣在37℃下用50μl包含因子I和H的稀釋液的CFD-凝膠(終濃度為100、10、1、0μg/ml)溫育30min。然后添加0.9ml的CFD，通過離心使細胞形成小球，并且洗滌兩次以上(每次用1mlCFD)。然后，細胞在100μl包含100μg/ml因子B、100μg/ml備解素、1μg/ml因子D和0.3mM NiCl2的CFD-凝膠中進行懸浮。在37℃下10分鐘之后，添加0.9ml包含10mM EDTA和2％(v/v)正常的豚鼠血清的CFD。在37℃下另外30分鐘之后，通過離心使未溶胞的細胞形成小球，并且通過在412nm處測量上清液的吸光度來確定溶胞作用程度。從在水中溶胞作用的細胞等份試樣確定等同于100％溶胞作用的吸光度，因而可以計算百分溶胞作用。
這種分析測定沉淀的C3b形成功能性C3bBbP轉(zhuǎn)化酶的能力。向iC3b的轉(zhuǎn)化在血清/EDTA中抑制轉(zhuǎn)化酶的形成和爾后的溶胞作用。3．結(jié)果圖中顯示的結(jié)果表明當與野生型相比時，要求超過因子I和因子H十倍以除去arg1303→Gln突變體的溶血活性。因此，這種突變對于產(chǎn)生C3的衍生物是有利的，其C3b產(chǎn)物對由因子H和I的滅活具有抗性。該作用可能是由于在位置1303對切割具有更大的抗性(當將arg突變成gln時)，或者當切割首先發(fā)生在位置1303時，在位置1320對切割具有更大的抗性。4．附5顯示了結(jié)果。x-軸表明因子H和I的濃度。Q1表示arg1303→Gln突變，如方法所描述的檢測％溶胞作用。討論在這里描述的關(guān)于修飾的變體，人類C3的重要特性如下-(ⅰ)該分子具有一種功能性C3b-樣衍生物，因為它可以結(jié)合功能性活性人類因子B，于是它能夠由人類因子D切開以形成能夠切開人類C3的酶。
(ⅱ)衍生物的氨基酸序列與來自人類的C3比與來自其它物種的C3(其序列目前是已知的)或者是目前已知的任何其它蛋白質(zhì)序列具有更大的同源性。在野生型但不在修飾的衍生物中顯示的C3的結(jié)構(gòu)特性，包括下列-(a)在圖2和1分別給出用于在這里描述的本發(fā)明實施例的人類C3的變體的DNA編碼序列和翻譯的蛋白質(zhì)序列。這種蛋白質(zhì)序列在剛才的兩個氨基酸(實施例給出了細節(jié))上與公開的序列[2]不同。我們假定，更多變體與C3功能相適應，盡管在種群中大多數(shù)將不存在。
(b)初級翻譯產(chǎn)物通過蛋白水解加工成兩條二硫鏈的鏈，α(殘基672-1663)和β(殘基23-667)，以及切除的信號序列(殘基1-22)。
(c)成熟蛋白質(zhì)在殘基Cys1010與Gln1013之間包含一個硫酯鍵。
(d)C3轉(zhuǎn)化酶切開C3以除去C3a(殘基672-748)。通過硫酯鍵的斷裂進行這種反應。
(e)在因子H的存在下，因子H在殘基Arg1303與Ser1304以及Arg1320與Ser1321之間切開C3b。對天然C3分子的修飾由Gln取代Arg1303
這種修飾是由因子I在C3b切割的一個位點上進行的。這種作用將減少在這一位置上由因子I切割的速率。選擇向谷氨酰胺的改變以便奪取精氨酸的陽電荷，這很有可能對因子I的絲氨酸蛋白酶活性來說是重要的，并且保持親水特性和類似的側(cè)鏈大小，將減少對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的任何破壞。支持這種推定的證據(jù)是不抑制加工到雙鏈結(jié)構(gòu)中的突變，硫酯的形成或者由C3轉(zhuǎn)化酶對C3的切割。如實施例5所顯示的，Arg1303向另一個氨基酸的突變可以達到類似的或甚至更大的效果。
也可以通過使Ser1304(切割位點的其它方面)或者與酶-底物相互作用相關(guān)的其它殘基發(fā)生突變以減少這種切割。由Gln取代Arg1320這種修飾是由因子I在C3b切割的其它位點上進行的。這種作用將大幅度地減少(實際上是取消)在這一位置上由因子I切割的速率。以上述的相同的標準進行向谷氨酰胺的改變，并且這種突變也抑制雙鏈結(jié)構(gòu)的加工，硫酯的形成或由C3轉(zhuǎn)化酶對C3的切割。再者，向其它氨基酸的突變也可以達到相同的效果，如與酶-底物相互作用相關(guān)的Ser1321或其它殘基的突變。
當組合兩種突變時，Arg1303-Gln和Arg1320-Gln抑制與C3b相互作用，因此，保護使之免受滅活因而保持它形成部分活性C3bBb轉(zhuǎn)化酶的能力。也可利用其它取消切割反應的突變(包括突變組合)(例如Arg1303Glu或者Arg1303 Gly可用于與Arg1320 Gln組合)。實施例7．減少C3b/C3I與因子H相互作用的各種突變7.1概論其它實驗室已獲得以合成肽效應(Ganu,V.S.和Muller-Eberhard,H.J.,1985，補體2:27；Becherer,J.D.等，1992，生物化學31:1787-1794)或者以限制性的誘變(Taniguchi-Sidle,A.和Isenman,D.E.,1994免疫學雜志153:5285-5302)為基礎(chǔ)的證據(jù)，說明在C3轉(zhuǎn)錄物初級結(jié)構(gòu)的殘基752-761(參見圖1)可能與因子H的相互作用有關(guān)。然而，其它公開的證據(jù)表明，僅僅只有殘基767-776與H的相互作用有關(guān)。因而殘基752-761對于與因子B相互作用來說是重要的(Fishelson,1991，分子免疫學28:545-552)。我們推測，這區(qū)域更廣泛的突變可能減少因子H的親和性。因此它對為了生成C3衍生物來說是必需的，該衍生物對因子H具有抗性，進而我們猜測突變重要的殘基可能是脯氨酸的殘基(谷氨酸和天冬氨酸)，并且將它們變成不太可能介導強相互作用的中性殘基是滿足需要的。在本實施例中，我們將殘基752-754由Asp-Glu-Asp變成Gly-Ser-Gly，并且將殘基758-760由Glu-Glu-Asn變成Gly-Ser-Gly。顯示的產(chǎn)物減少對因子H敏感一致的切割特征。這證明可以將C3修飾以減少因子H的結(jié)合。由此減少對因子H和I的敏感性。這些修飾對于產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶來說是必需的，所說的轉(zhuǎn)化酶在生理條件下是穩(wěn)定的。7.2方法誘變、表達和分析的方法在以前的實施例中已經(jīng)描述過，合成的誘變寡聚核苷酸具有序列agtaacctgggttcgggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc。7.3結(jié)果圖6顯示切割反應的結(jié)果，它們表明1．添加CVFB6到野生型C3中將導致α鏈的損耗(泳道2)，因為形成的C3b在培養(yǎng)物懸浮液中對低濃度的因子I和H敏感。在表達和隨后的溫育期內(nèi)形成的C3i將以同樣的方式斷裂形成iC3i。因此分別添加外源因子I和H(泳道3和4)與泳道1和2沒有什么不同。因為培養(yǎng)基自身包含充足的對完全切割起作用的因子H和I活性。
2．相反，以CVFBb處理突變體C3(泳道6)不導致α鏈的消失。相對于C3b，這里有一些α′鏈的生成，但是也有一些或全部殘余物，這表明α鏈的持久性不只是由CVFBb的切割失敗的結(jié)果。因此，在泳道2中，余下的未切割的α鏈可能代表C3i，它通過因子H和I的內(nèi)源活性還沒有切開，雖然如果突變體需要對CVFBb的部分抗性，也可能某些代表天然的C3。添加高濃度的外源因子H和I(泳道7和8)確實產(chǎn)生α鏈和α′鏈的缺失，這表明(ⅰ)突變體對這些因子不完全具有抗性，以及(ⅱ)在泳道2中由CVFBb未切開的α鏈明顯地來自C3i(由CVFBb而不由因子H和I切開的)而不是天然C3(由因子H和I而不由CVFBb切開的)。即使在泳道8中，仍然并非切開所有的α鏈，這有可能是由于對因子H和I的抗性。
因此，殘基752-754以及殘基758-760的突變可以產(chǎn)生C3分子，該分子一直由C3轉(zhuǎn)化酶切開，但是對因子H和I的活性部分地具有抗性。鑒于其它公開的數(shù)據(jù)，這最有可能是因為該突變已經(jīng)修飾與因子H相互作用相關(guān)的區(qū)域，因而導致減少對因子H的親和性。實施例8．在C3中可以突變以修飾C3i與因子B的相互作用的位點8.1概論以前的實施例已經(jīng)顯示突變?yōu)镃3可以調(diào)節(jié)與因子H和I的相互作用。為了在C3中揭示可能與因子B相互作用的其它位點，我們比較來自不同的物種C3分子的已知序列，以及比較C4可供使用的序列和其它同源的蛋白質(zhì)。我們已確定與人C3的殘基1427-1433對應的區(qū)域，該區(qū)域可能牽涉到C3和C4特異性功能，這可能包括與因子B(或它的同系物，C2，在C4的情況下)相互作用，但不是必需的，因為其它潛在功能包括硫酯的形成，轉(zhuǎn)化成C3b(或者C4b形式)，與轉(zhuǎn)化酶活性中與底物C3和/或C5相互作用，以及與因子I和它的輔因子相互作用。因此發(fā)現(xiàn)在其它同源蛋白質(zhì)中，在這種人類C5情況下，將選擇的殘基突變成對應的殘基(以序列對比為基礎(chǔ))。于是，殘基1427由Arg變成Gln，殘基1431從Lys變成Asp，殘基1433從Glu變成Gln。形成的突變體對由C3轉(zhuǎn)化酶(CVFBb)的切割敏感，C3b產(chǎn)物可由因子H和I切開。然而，這一突變體不支持因子B向Bb加Ba的轉(zhuǎn)變，其依賴于因子B對C3i(或者C3b)的結(jié)合。因此，我們證明，這一區(qū)域的突變已縮小與因子B的相互作用。雖然這對于產(chǎn)生超活性C3轉(zhuǎn)化酶來說是不必需的，但它提供了C3這個區(qū)域的其它修飾也將改變與因子B的相互作用，并且某些將可能增加親和性。因此，這樣的突變也可以增加雙分子轉(zhuǎn)化酶C3bBb(或C3iBb)的穩(wěn)定性與活性。8.2方法表1另一面所顯示的序列對比說明為什么我們認為這個區(qū)域是誘變的候選者。我們猜測特定殘基的特征在C3和C4上是高度保守的，但是在其它蛋白質(zhì)中明顯地不同。選擇殘基1427、1431和1432，因為它們所改變的性質(zhì)可能是與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的基團的指示。在人類C5中使所說的改變成為對應的殘基，因為它們顯示出十分不同的靜電性質(zhì)，但是本文一些其它保守殘基可以表明一種類似的局部結(jié)構(gòu)。
表1對于人類C3殘基1427-1435區(qū)域的C3和相關(guān)分子的序列對比殘基(人類)蛋白質(zhì) 物種 1427 1428 1429 1430 1431 1432 1433 1434 1435C3 人 RYISKYELD小鼠RYISKYEMN大鼠RYISKYEMD豚鼠RYISKYELD兔 RYISKYELN眼鏡蛇 RYISKFEID爪蟾KYISKYEVN鮭魚RYIEKFEMDC4 人 RYVSHFETE小鼠RYVSHFETDSlp小鼠RYVSHFETDC3/C4樣 八目鰻 NYIVQYEIR七鰓鰻 KYISNYEITC5 人 QLFTDYQIK小鼠QLLTDYQIKA2M人 PTVKMLERS小鼠PSVKRLQDQ大鼠PTVKMLERSPZP人 PTVKMLERS鼠球蛋白小鼠PTVKKLERLA1M大鼠PSVKKLQDQA1M倉鼠PTVKKLERSA1I3 大鼠PTVKKLERL
C3切割反應的誘變、表達以及分析的方法如以上實施例(實施例1-4)所描述的。將誘變寡核苷酸用下列序列合成tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa 。因子B的轉(zhuǎn)化分析如實施例所描述的，通過在克隆-3-瓊脂糖層析柱上的親和性純化從COS細胞培養(yǎng)基中純化表達的產(chǎn)物。這種方法將導致硫酯斷裂形式(C3I)的相當大的轉(zhuǎn)化。用相同的方法分離野生型C3。將野生型C3的稀釋液(1/5、1/25和1/125)與突變體C3一起進行SDS-PAGE凝膠電泳(還原條件)并且進行銀染，這表明該突變體以濃度稍微少于1/25但多于1/125的野生型稀釋液存在。將相同的稀釋液用于因子B的轉(zhuǎn)化分析。將5μl這種C3稀釋液用25μl包含5μg/ml因子D和約1.6μg/ml125I標記的因子B(約1000-2000dpm/μl)CFD-G在37℃下溫育3h。然后用于凝膠的放射自顯影，通過SDS-PAGE(還原條件)分析樣品。其結(jié)果在圖7中顯示。8.3結(jié)果如圖7所顯示的，在1/125的野生型C3(C3 i)的稀釋液中產(chǎn)生因子B的明顯切割。相對地，當突變體C3存在(即使不溶)時，沒有觀察到任何明顯的切割，它的濃度可能比野生型的1/125樣品更高。
因此，這種突變體看來似乎具有削弱支持因子B的切割能力，很有可能因為它減弱對因子B的結(jié)合親和性。因此，可以將C3的這個區(qū)域突變以調(diào)節(jié)C3i(或者C3b)與因子B之間的相互作用，并且也可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶(C3iBb或C3bBb)的穩(wěn)定性。實施例9表達突變體C3分子的純化9.1概論本實施例將闡明怎樣從表達培養(yǎng)基(如轉(zhuǎn)化的真核細胞的培養(yǎng)基)中分離出突變體C3分子。通過樣品親和純化，將獲得對于功能檢測和如實施例10所述的方法接合抗體來說充足濃度的C3分子。雖然相當大部分的內(nèi)硫酯的水解伴隨從抗體的洗脫，但是C3i產(chǎn)物一直是產(chǎn)生活性C3轉(zhuǎn)化酶以及產(chǎn)生C3I抗體綴合物的合適前體。這種方法作為部分體內(nèi)利用所需的制備可能是有用的。9.2方法在克隆-3-瓊脂糖上進行親和純化克隆-3是小鼠單克隆抗體，它對C3和它的衍生物具有特異性，并且包括C3b和C3i(Lachmann,P.J等，1980，免疫學雜志41:503-515)。其它C3的單克隆抗體是可利用的，并且在某些情況下，它已經(jīng)成功地用于從低質(zhì)量的人血漿中分離出C3(Dodds,A.w.,1993，方法酶學223:46-61)，因此它也可能用于分離來自體外所表達的分子。將IgG碎粒用溴化氰偶聯(lián)到瓊脂糖CL-4B上(可以在Harrison和Lachamann,1986，實驗免疫學手冊，第四版，Ed.s Weir,Herzenberg,Blackwell和Herzenberg；Blackwell，牛津大學出版社中找到)。將培養(yǎng)物上清液直接通過這一樹脂柱(再循環(huán)的)或者用25％(W/V)Na2SO4沉淀首先濃縮，重新溶解以及在PBS,5mMNaN3中透析進行。然后用(Ⅰ)PBS,5mMNaN3和(ⅱ)包含1MNaCl的PBS連續(xù)地沖洗層析柱，用50mM硼酸鈉緩沖液(PH10.5)洗脫結(jié)合的C3，并且立即收集0.9ml的組分到0.1ml 1MTris/HCl(PH7)中進行中和。然后將該物質(zhì)對PBS,5mMNaN3進行透析。制備攜帶“His-尾”的C3“His-尾”是一列組氨酸殘基，它顯示對具有鎳離子的層析柱的親和性。這種方法已經(jīng)用來幫助分離表達的蛋白質(zhì)。我們認為這對于分離表達的突變體C3分子上有用的，于是我們已經(jīng)用于在碳末端插入6個組氨酸殘基的尾以產(chǎn)生編碼C3的質(zhì)粒(碳末端直接到殘基1663)。選擇這種his-尾的定位是為了使對新生C3的合成、折疊、加工和二硫鍵的形成的影響減少到最小。殘基1661是與早期在序列中的殘基的二硫鍵有關(guān)的殘基(可能是Cys 1537；Dolmer,K.和Sottrup-Jensen,L.,1993,FEBS-Lett315:85-90)，因此，它看起來使在這種結(jié)構(gòu)特征之外的插入是慎重的，利用如實施例1所使用的“缺口質(zhì)?！狈椒?，利用用序列tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacac合成的寡聚核苷酸引入突變。
通過DNA測序進行正確序列的摻入?，F(xiàn)在將這條DNA序列轉(zhuǎn)移到表達載體中。轉(zhuǎn)化真核細胞后，可能通過具有鎳離子的柱的親和性或者通過任何其它對“His-尾”具有特異親和性的基質(zhì)分離表達的C3。9.3結(jié)論在克隆-3-瓊脂糖上已經(jīng)純化出大量突變體C3，該突變體C3包含如實施例1和2在CHO細胞中表達的那些。該產(chǎn)物保持了通過因子B的切割能力。將同樣的方法用于分離如實施例B2所述的在COS細胞中表達的突變體。SDS-PAGE凝膠的銀染指出分離的產(chǎn)物不是100％純的，但是有時出現(xiàn)高于或者等于50％純的。這來自通常含有在10％(V/V)胎牛血清中的少于10μg/mlC3其它細胞蛋白的起始物質(zhì)。另外，在分離期間不降解C3，并且內(nèi)源性因子H和I活性看起來已經(jīng)被除去。
利用“His-尾”純化牽涉從鎳離子的層析柱中更溫和的洗脫條件。例如，利用EDTA。因此，這種對C3的方法的應用在不破裂內(nèi)硫酯鍵下使得可以分離。實施例10.C3i與抗體的綴合和用于靶向針對特定細胞的C3轉(zhuǎn)化酶活性10.1概論本發(fā)明的一個方面是由突變體C3分子產(chǎn)生的穩(wěn)定C3轉(zhuǎn)化酶將導致C3轉(zhuǎn)化，如果將它局限在特定的目標位點內(nèi)，它將促進那個目標的補體依賴的侵染。作為應答目標有利的方法將突變體C3分子(如C3i或C3b的衍生物)連接到所需目標的特異性抗體上。在本實驗中，我們闡明一種形成這樣的綴合物的實施方法，它對于突變體C3i或者C3b分子來說是可以運用的，并且可以用于從表達系統(tǒng)親和性純化的物質(zhì)，即使C3的硫酯在這種工藝中已經(jīng)被阻斷。通過將C3i偶聯(lián)到特異結(jié)合綿羊紅細胞的抗體上，我們進一步顯示綴合物將C3i固定在紅細胞表面以便可形成的轉(zhuǎn)化酶(C3iBbp)起始這些細胞的降解。當其它補體組成以正常豚鼠血清形成應用時(EDTA中以阻止C3轉(zhuǎn)化酶從頭形成)。因此，對抗體的綴合作用可以用于把C3i分子作為目標以起始特定細胞型補體依賴性攻擊。本實施例利用來自人血漿的野生型C3i，它在體外形成C3轉(zhuǎn)化酶。在體外，通過因子H和I降低野生型C3i和C3b。因此，突變體C3在生理上是有利的，它按照本專利的方案構(gòu)建成對因子H和I具有抗性，因而形成穩(wěn)定的C3轉(zhuǎn)化酶。10.2方法所用的抗體是從多克隆兔抗綿羊紅細胞抗血清分離的IgG組分。將1.1mg用75nmol SPDP在綴合緩沖液(20mMKH2PO4,60mMNa2HPO4,0.12MNaCl,pH7.5)中室溫下溫育2小時。在瓊脂糖-6層析柱(Pharmacia)上通過凝膠過濾純化PDP-IgG(在磷酸緩沖液中，PH7.4，包含0.5MNaCl)將用二硫蘇糖醇還原的樣品用于估計每個IgG分子偶聯(lián)的4PDP基團。用0.1MPH7.2的甲胺處理純化的C3制備C3i。通過在綴合緩沖液中透析所采用的凝膠過濾除去過量的甲胺。在1.26ml接合緩沖液中用1.7nmolPDP-IgG混合18nmol的C3i，并且在室溫下溫育一天(4℃下溫育1.5天)。圖8顯示接合反應混合物的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠，它顯示了不存在于PDP-IgG的物種的外觀。在包含0.5MNaCl的磷酸緩沖液(PH7.4)中，在瓊脂糖-6-層析柱上通過凝膠過濾將這種物種進行部分純化，然后對PBS透析。在層析中用球狀分子量標準通過校準可以估計出C3的分子量在300-400之間，然后進行洗脫。從考馬斯染色的SDS-PAGE染色的凝膠(非還原條件)估計出綴合物、游離抗體和非偶聯(lián)C3的濃度。雙向SDS-PAGE(第一相非還原的、第二相還原的)揭示在IgG和C3i之間于1∶1綴合物可比較的模式。(ⅱ)C3-抗體綴合物可以用于靶向抗特定細胞的轉(zhuǎn)化酶活性的說明將20μl綴合物的稀釋液(0(無綴合物)、1/100、1/50、1/10)用100μl大約1％(V/V)綿羊紅細胞(用CFD預沖洗)在37℃下溫育1小時。用等量的POP-PAGE(無C3)和僅有C3進行平行溫育。然后將細胞用CFD沖洗4次并且用CFD-G重懸浮成100μl。將50μl重懸浮液用150μl進行溶解，接著添加800μl包含10mMEDTA和2％(V/V)NGPS的CFD。將另50μl綴合物包被的細胞用50μl包含190μg/ml因子B、因子D、20μg/ml備解素和0.6mM NiCl2的CFD-G在37℃下溫育15min，接著用900μl包含10mM EDTA和2％(v/v)NGPS的CFD進行溶胞。在37℃下，30min之后，通過離心(2000Xg，約min)沉淀出細胞，并且在412nm處測量上清液的吸光度。利用H2O-處理的樣品作為100％溶胞，并且空白對照緩沖液中沒有細胞，如圖9所顯示的，計算出％溶胞。該綴合物產(chǎn)生劑量依賴性溶胞，因而在缺乏任何處理的條件下，觀察不到PDP-IgG和僅有C3i產(chǎn)生的任何顯著溶胞作用。10.3結(jié)果總結(jié)所利用的方法已成功地證明將C3i偶聯(lián)到IgG上，如下顯示的1．在圖8中SDS-PAGE顯示適合的1∶1的C3:IgG綴合物的大小(約350 kDa)的鍵的形成。
2．二維SES-PAGE(第一維非還原的，第二維還原的)表明這一物種包含IgG和C3i。
3．這一物種在凝膠過濾上的洗脫特征再次與約350kDa的分子相一致。
4．綴合物顯示不由PDP-IgG或C3i顯示的溶血活性(圖9)。
溶血分析(圖9)進一步說明1．特異性抗綿羊紅細胞抗體將C3i局限到靶細胞(綿羊紅細胞)膜上，抑制它由沖洗而被除去(與自由的C3i相對比)。
2．綴合物保持C3i活性，因此它通過與備解素和因子B和D反應仍然能夠形成C3轉(zhuǎn)化酶。
3．這種轉(zhuǎn)化酶可以起始靶的補體依賴性攻擊，在這種情況下通過激活溶胞作用途徑(C5-9)以溶解紅細胞。來自其它實驗室的附加數(shù)據(jù)顯示可以將眼鏡蛇毒因子連接到抗體上，并且這些綴合物可以將一種特定細胞型的補體活性作為目標(Vogel,1988,Targeted.Diaon.Ther.,1:191-224；Muller,B.和Muller-Ruchholtz,W.,1987,Leuk.Res.11:461-468；Park,C.J.,White,V.F.和Falk,R.J.,1986，補體3:223-235；Petrella,E.C.等，1987，免疫學方法雜志104:159-172)。如本發(fā)明中所概述的，這些數(shù)據(jù)支持C3修飾以便它能夠形成穩(wěn)定的C3轉(zhuǎn)化酶，如眼鏡蛇毒毒因子一樣，能夠用于靶向補體介導反應。實施例11．在正常的人血清中突變體C3分子誘導因子B轉(zhuǎn)化的說明11.1概論這里描述的本發(fā)明的一個主要目的是來自生物液的補體活性的消耗缺失。本發(fā)明描述用于制造C3分子的方法，該分子對因子H和I的負調(diào)節(jié)具有抗性。在這種情況下它們將結(jié)合因子B，并且產(chǎn)生活性C3轉(zhuǎn)化酶。通過用于實施例6的溶血分析證實這些轉(zhuǎn)化酶的活性。因此需要消耗C3轉(zhuǎn)化酶。如果轉(zhuǎn)化酶不穩(wěn)定，它將不用C3進行分離。然而，這將結(jié)合新鮮因子B，并且轉(zhuǎn)化為Bb和Ba。這樣，突變體C3將促進因子B的消耗，這將導致最終喪失可選擇途徑的能力，并且它不能擴增標準途徑的能力。如果形成穩(wěn)定的C3轉(zhuǎn)化酶，將減少因子B的轉(zhuǎn)化，但是將增加C的消耗。因此，兩種情況可以是所需的。在本實施例中，我們證實修飾的突變體C3分子使它們對因子I具有抗性，但是沒有任何修飾去修飾轉(zhuǎn)化酶的穩(wěn)定性，在人血清中促進因子B的加速轉(zhuǎn)化。相反，野生型C3不引起任何重要的轉(zhuǎn)化，可能因為通過因子H和I迅速降解為野生型C3i。11.2方法突變體的制備如下將Q1R2 Arg1303轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln(實施例2)將Q1Q2 Arg1303轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln，將正Arg1320轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln(實施例1)將E1Q2 Arg1303轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu，將正Arg1320轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln(實施例5)這些突變體都將在CHO細胞中表達，然后用Na2SO4沉淀進行純化，其后采用如實施例B3所描述的在克隆-3-瓊脂糖凝膠上進行親和性純化。同樣地分離野生型C3(R1R2)。通過帶有銀染的SDS-PAGE,Q1的濃度在野生型的1/5到1/25之間，而E1Q2的濃度大約是野生型的1/5，并且E1Q2的濃度在野生型的1/25到1/125之間。所有制劑可能包含大多數(shù)不完整的硫酯分子(C3i)。
將10μl這些C3制劑用10μl的20％(v/v)正常人血清溶液在包含1mMMgCl2和大約300ng125I-標記的因子B(大約2-300,000dpm)的PBS中在37℃下溫育1小時。然后通過SDS-PAGE分析5μl(還原條件)。將干燥凝膠經(jīng)過放射自顯影說明與完整因子B和它的切割產(chǎn)物對應的區(qū)帶位置。然后經(jīng)過切除和計算以便精確地確定出切割程度。減去在只有緩沖液中獲得的值作為背景(不僅包含背景切割，而且包含在放射性配體制劑中的降解產(chǎn)物和其它雜物)。11.3結(jié)果因子B切割的形成的程度顯示如下1/25野生型1.49％1/5野生型 2.74％Q1R2 6.19％Q1Q2 7.41％E1Q2 6.42％因此，所有的因子I抗性突變體比等量的野生型C3(C3i)都產(chǎn)生更高水平的因子B切割。更大劑量或者更長時間的溫育，將導致可選擇途徑的完全失效。
用于上述實施例的縮寫包括CFD，補體固定稀釋劑(Harrison和Lachmann,1986，實驗免疫手冊，第四版，Ed.s Weir,Herzenberg,Blackwell和Herzenberg,Blackwell，牛津大學所定義的)；CFD-G，包含0.1％(w/v)明膠的CFD；P9S，磷酸緩沖鹽溶液；NGPS，正常豚鼠血清；SDS-PAGE,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；SPDP,N-琥珀酰亞胺-3-[2-吡啶二硫代]-丙酸酯。實施例12．殘基992-1000的突變1．概論其它實驗室已獲得以合成肽(Ganu,V.S.和Muller-Eberhard,H.J.,1985，補體2:27；Becherer,J.D.等，1992，生物化學31:1787-1794；Fishelson,Z.,1991，分子免疫學28:545-552；Lambris,J.D.,Ganu,V.S.,Hirani,S.和Muller-Eberhard,1988，生物化學雜志263:12147-12150)作用為基礎(chǔ)的證據(jù)，說明在人類C3b中的各種殘基，該殘基可能與因子H的相互作用有關(guān)。我們已利用不同序列比較的方法來預測與C3-特異性功能有關(guān)的殘基。已進行的定點誘變表明大多數(shù)這些突變對因子H的功能敏感性具有極少甚至沒有影響。然而，一些突變確實對因子H減少了敏感性。這些突變在分子的部分上進行，這些部分以前沒有確定為與因子H相互作用或調(diào)節(jié)它的結(jié)合。因此，這些定義的殘基誘變可以用來產(chǎn)生C3突變體衍生物，該衍生物在生理環(huán)境之內(nèi)部分或者完全對因子H抑制作用具有抗性，并且將形成復合物C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb等)，該酶同樣地通過因子H對失活具有抗性。
因子H與其它補體抑制蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上具有同源性，該蛋白質(zhì)包括CR1、MCP和DAF。鑒于這種明顯的進化關(guān)系以及結(jié)合的互相競爭，很有可能它們在與因子H結(jié)構(gòu)類似的方式下與C3b相互作用(Farries等，1990，補體炎癥7:30-41)。因此，所描述的敏感性的突變也可能對于調(diào)節(jié)與這些其它蛋白質(zhì)相互作用來說是有用的，該突變調(diào)節(jié)對因子H，尤其是為了逃避它們補體的負調(diào)節(jié)活性。它們也可能發(fā)現(xiàn)應用于在因子B中與SCR結(jié)構(gòu)域(和在C2中與結(jié)合C4b相關(guān)的同源結(jié)構(gòu)域)相互作用的修飾。C4和C5對應的區(qū)域的突變對于在Clr和Cls(C4)、C4b-結(jié)合蛋白質(zhì)(C4b)以及C6和C7(C5b)中修飾它們與SCR結(jié)構(gòu)域的相互作用也可能是有用的。2．方法2.1尋找與C3-特異性功能有關(guān)的殘基。
通過對人類C3與所有同源蛋白質(zhì)的序列對比得出這些預測，該蛋白質(zhì)的序列通過公開的數(shù)據(jù)庫是可供使用的。這些包括在小鼠、大鼠、豚鼠、野兔、眼鏡蛇、非洲爪蟾、小雞和鱒魚中的功能性等同分子、人類和小鼠C4、人類和小鼠C5、來自七鰓鰻和八目鰻類魚的C3-樣蛋白質(zhì)、眼鏡蛇毒液因子(CVF)以及人類α-2-巨球蛋白和它的同源物。然后進行有利于殘基的尋找，該殘基在不同C3s中是保守的，但是在同源性(顯著地C5和CVF)方面沒有明顯的不同，它們?nèi)狈Ω信d趣的C3-特異性功能。將某些突變?yōu)樵贑5或CVF中編碼對應的殘基(在COS細胞中表達)，在CVFBb和因子H和I存在下檢驗為切割所分泌的產(chǎn)物。所有方法是在標準方法與實施例1中所描述的方法。總結(jié)的結(jié)果在表Ⅱ中顯示。2.2突變體DV-1AM的構(gòu)建和分析以與其它突變體的相同方法制造這種突變體，利用如V.Picard等描述的“大引物方法”(V.Picard等，1994，核酸22:2587-2591)。誘變引物具有編碼突變體E992S、D993A、D996S、A997Q、E998S和R999G的序列ccagatgacaagtgctgccgtcagccagtcagggctgaagcacc。上游引物具有序列tgtcatcgtgccgctaaaga(與脫氧核苷酸2754-2773對應)，以及下游引物具有序列g(shù)ttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta(與脫氧核苷酸互補4130-4165，在位置4149具有引入對于限制酶AflⅡ的切割位點)。通過切割都具有AflⅡ和EcoRⅠ的片段(在位置2997切割)純化所需的產(chǎn)物以及利用T4 DNA連接酶共同連接，將突變的DNA片段連接在載體上，該載體在位置4149包含C3的編碼序列，也具有AflⅡ的引入位點。從轉(zhuǎn)化的細菌克隆分離質(zhì)粒DNA，并且通過DNA測序確定真正的突變體。在這一點上人們發(fā)現(xiàn)將DNA序列另外突變編碼突變體L1000M。將形成的表達載體轉(zhuǎn)化到COS細胞中，以及如前文所述分析切割反應的分泌表達產(chǎn)物。3．突變體DV-1AM的性質(zhì)圖10顯示DV-1AM突變表達產(chǎn)物的分析。注意的是(ⅰ)利用C3的C3dg區(qū)域的單克隆抗體對蛋白質(zhì)印跡進行顯影以檢測前體、α、α′、77和68kDa的片段，但是沒有檢測β、43或46kDa的片段。
(ⅱ)所有區(qū)帶的DV-LAM產(chǎn)物(泳道B1-4)不明顯地出現(xiàn)在等同野生型區(qū)帶(泳道Al-4)下。在遷移率方面的改變是突變造成的結(jié)果。
(ⅲ)用CVFBb切割野生型C3將由C3b產(chǎn)生一些α′鏈，但是更大量的68kDa片段通過內(nèi)源性因子H和I活性(泳道A3)將導致切割C3b為iC3b。添加外源性H和I將完成C3b轉(zhuǎn)化為iC3b(泳道A4)。相反，通過CVFBb切割DV-1AM產(chǎn)物將產(chǎn)生更大量的α′鏈和僅僅小量的68 kDa的片段(泳道B3)。然后，添加外源性H和I將這種C3b轉(zhuǎn)化為iC3b(泳道B4)。因此，雖然通過高濃度的外源添加的H和I對切割的敏感性不完全表明抗性，但是突變體C3b對內(nèi)源性和外源性H和I比野生型更具有抗性。4．結(jié)論DV-lAM突變產(chǎn)生對因子I的因子H-依賴的切割的抗性。該機理不能確定，雖然因為修飾的殘基(一級結(jié)構(gòu))離因子I的切割位點遠，但是很有可能它與因子H的相互作用將受到削弱。在這種情況下，突變也將賦予對其它的因子H的抑制活性的抗性，也就是說-(Ⅰ)與結(jié)合C3b(或C3i)的因子B競爭，以及(ⅱ)加速C3bBb與C3bBbP轉(zhuǎn)化酶的解離。DV-1AM突變具有直接或者間接地與因子H保持親和性相關(guān)的修飾殘基。相同殘基的許多不同的突變將可能具有類似的作用，并且僅僅在這里修飾的一些殘基的突變以及其它具有一級結(jié)構(gòu)片段的殘基也可能實現(xiàn)這樣的作用。實施例13．殘基1001-1005的突變1．概論如上述實施例所描述的，也將殘基1001、1002和1005確定為對C3-特異性功能來說十分重要的候選者。突變證實那些殘基的修飾可以用來賦予對因子H的抗性。2．方法2.1突變體DV-1B的構(gòu)建和分析所利用的方法如前面實施例所描述的，除了誘導引物具有編碼突變體K1001N、H1002I和V10059的序列aacggctgaacatattaattcataccccctcgggc外。分離的質(zhì)粒DNA的序列分析證實已經(jīng)引入正確的突變。沒有檢測到其它突變。3．突變體DV-1B的性質(zhì)圖11顯示由DV-1B突變所表達的產(chǎn)物的分析。注意的是(ⅰ)利用C3的多克隆抗體對蛋白質(zhì)印跡進行顯影以強烈地檢測前體、α、α′、β、43和46kDa的片段，但是僅僅微弱地檢測77和68kDa的片段。注意不能將α和α′進行轉(zhuǎn)化以及100％的效率檢測，于是這些區(qū)帶的強度比所預料的更少并且對存在的實際量缺乏指導。
(ⅱ)用CVFBb切割野生型C3將從C3b產(chǎn)生少量的α′鏈，但是由于68kDa片段通過內(nèi)源性因子H和I活性(泳道B3)將C3b切割為iC3b，更大的量將丟失。雖然少量的46 kDa的中間體是可見的，但是這通常作為43 kDa片段出現(xiàn)。添加2μg/ml外源性H與因子I將導致進一步標記的切割和10-50μg/ml外源H(泳道B5,B6)完成C3b轉(zhuǎn)化成不充分切開(沒有α′和46kDa的區(qū)帶)的iC3b。由CVFBb切割DV-1B產(chǎn)物也將產(chǎn)生少量的α鏈(泳道A3；存在C3的總量更少，并且α與α′區(qū)帶同時帶十分微弱)。明顯地，在缺少因子H和I的情況下所產(chǎn)生的43kDa鏈的總量比在野生型中更少，并且46kDa的中間體片段的出現(xiàn)更多，這表明是更無效的切割。當46kDa的中間體仍然明顯時，添加外源H和I(泳道A4-6)將實現(xiàn)這種C3b轉(zhuǎn)化成iC3b，但是發(fā)現(xiàn)43kDa的產(chǎn)物提高了劑量依賴達到50μg/ml(泳道A6)。因此，雖然通過高濃度的外源添加的H和I對切割的敏感性不完全表明抗性，但是突變體C3b對內(nèi)源性和外源性H和I比野生型更具有抗性。4．結(jié)論DV-lB突變產(chǎn)生對因子I的因子H-依賴性切割的抗性。該機理不能確定，雖然因為修飾的殘基(一級結(jié)構(gòu))離因子I的切割位點很遠，但是很有可能它與因子H的相互作用將受到削弱。在這種情況下，突變也將賦予對其它的因子H的抑制活性的抗性，也就是說-(ⅰ)與結(jié)合C3b(或C3i)的因子B競爭，以及(ⅱ)加速C3bBb與C3bBbP轉(zhuǎn)化酶的解離。DV-1B突變具有直接或者間接地與因子H保持親和性相關(guān)的修飾殘基。相同殘基的許多不同的突變將可能具有類似的作用，并且僅僅在這里修飾的一些殘基的突變以及其它具有一級結(jié)構(gòu)片段的殘基也可能實現(xiàn)這樣的作用。實施例14．殘基1152-1155的突變1．概論如上述實施例所描述的，也將殘基1152、1153和1155確定為對C3-特異性功能來說十分重要的候補者。突變證實這些殘基的修飾可以用來賦予對因子H的抗性。2．方法2.1突變體DV-6的構(gòu)建和分析所利用的方法如前面實施例所描述的，除了誘導引物具有編碼突變體Q1152R、E1153K和K1155F的序列atctcgctgcgcaaggctttcgatatttgcgag外。分離的質(zhì)粒DNA的序列分析證實已經(jīng)引入正確的突變。沒有檢測到其它突變。3．突變體DV-1B的性質(zhì)圖11顯示由DV-6突變所表達的產(chǎn)物的分析。注意的是(ⅰ)如上述實施例所描述的，利用C3的多克隆抗體對蛋白質(zhì)印跡進行顯影以強烈地檢測前體、α、α′、β、43和46kDa的片段，但是僅僅微弱地檢測77和68kDa的片段。注意不能將α和α′進行轉(zhuǎn)化以及100％的效率檢測，于是這些區(qū)帶的強度比所預料的更少并且對存在的實際量缺乏指導。
(ⅱ)用CVFBb切割野生型C3將從C3b產(chǎn)生少量的α′鏈，但是由于68kDa片段通過內(nèi)源性因子H和I活性(泳道B3)將C3b切割為iC3b，更大的量將丟失。雖然少量的46 kDa的中間體是可見的，但是它通常作為43 kDa片段出現(xiàn)。添加2μg/ml外源性H與因子I將導致進一步標記的切割和10-50μg/ml外源H(泳道B5,B6)完成C3b轉(zhuǎn)化成不充分切開(沒有α′和46kDa的區(qū)帶)的iC3b。由CVFBb切割DV-6產(chǎn)物也將產(chǎn)生少量的α鏈(泳道C3)。明顯地，在缺少因子H和I的情況下所產(chǎn)生的43kDa鏈的總量比在野生型中更少，并且46kDa的中間體片段的出現(xiàn)更多，這表明是更無效的切割。當46kDa的中間體仍然明顯時，添加外源H和I(泳道C4-6)將實現(xiàn)這種C3b轉(zhuǎn)化成iC3b，然而，通過10μg/ml的H將除去野生型的46kDa的中間體(泳道B5)，這表明完全切割，這種物種仍然在這一濃度下保持H的突變體，并且完全切割僅僅利用50μg/ml的H時才明顯。因此，雖然通過高濃度的外源添加的H和I對切割的敏感性不完全表明抗性，但是突變體C3b對內(nèi)源性和外源性H和I比野生型更具有抗性。4．結(jié)論DV-6突變產(chǎn)生對因子I的因子H-依賴性切割的抗性。該機理不能確定，雖然因為修飾的殘基(一級結(jié)構(gòu))離因子I的切割位點很遠，但是很有可能它與因子H的相互作用將受到削弱。在這種情況下，突變也將賦予對其它的因子H的抑制活性的抗性，也就是說-(ⅰ)與結(jié)合C3b(或C3i)的因子B競爭，以及(ⅱ)加速C3bBb與C3bBbP轉(zhuǎn)化酶的解離。DV-6突變具有直接或者間接地與因子H保持親和性相關(guān)的修飾殘基。相同殘基的許多不同的突變將可能具有類似的作用，并且僅僅在這里修飾的一些殘基的突變以及其它具有一級結(jié)構(gòu)片段的殘基也可能實現(xiàn)這樣的作用。
實施例15．殘基1546-1663的改變1．概論不同于以前的實施例(12-14)，殘基1546-1663的修飾不是以考慮在C3和相關(guān)蛋白質(zhì)之間的序列比較為基礎(chǔ)。代替偶然產(chǎn)生所描述的修飾，一種非故意核苷酸缺失的結(jié)果將導致在C端殘基翻譯中移碼。形成的產(chǎn)物顯示對因子I的因子H-依賴性切割非常大的抗性。因此，通過設(shè)計所產(chǎn)生的類似的修飾很有可能對于賦予因子H和/或因子I調(diào)節(jié)活性的抗性來說是有用的。2．方法將一個NC3的載體等效物(但是攜帶3151g、3152g、3154a、3156c、3159c、3163a、3165t、3167t、3168t的附加突變)翻譯成氨基酸改變T1031G、E1032N、Q1033H、E1035N和R1036I，將其用限制性酶PvuⅠ(切開載體序列)和BsrGⅠ(在核苷酸4692上切開)消化，并且通過瓊脂糖凝膠電泳分離6.1 kb區(qū)帶。將另一個NC3的載體等效物同樣地用PvuⅠ和BsrGⅠ和分離的4.4 kb片段進行消化，但是為了在C-末端編碼氨基酸HHHHHH的插入物，它在核苷酸5049后攜帶catcatcatcatcatcat的插入物。將這兩條DNA片段結(jié)合在一起，并且分離一個完全的質(zhì)粒。DNA測序發(fā)現(xiàn)單核苷酸(4696或4697)已經(jīng)丟失。所預料的序列在讀框中不能翻譯氨基酸1546-1663的序列。直到達到終止密碼子時，將讀出正常框的48個殘基。
將產(chǎn)物“HDV-3X”在COS細胞中表達，并且如前面的實施例所描述的進行檢驗。3．突變體HDV-3X的性質(zhì)圖12顯示HDV-3X突變表達產(chǎn)物的分析。注意的是(ⅰ)利用C3的C3dg區(qū)域的單克隆抗體對蛋白質(zhì)印跡進行顯影以檢測前體、α、α′、77和68kDa的片段，但是不檢測β、43或46kDa的片段。
(ⅱ)將HDV-3X與突變體DV-3(如沒有附加C-末端修飾的等同產(chǎn)物)相比較。HDV-3X顯示一條更小的α鏈，但是正常大小的68 kDa和77kDa的產(chǎn)物與在C-末端的平截相一致。
(ⅲ)在因子I存在下利用CVFBb的DV-3 C3的切割將從C3b產(chǎn)生一些α鏈，但是更大量的68kDa片段將導致C3b依賴性內(nèi)源性因子H切割成iC3b(泳道A2)。外源H的添加完成C3b轉(zhuǎn)化為iC3b(泳道A3-5)。實際上，僅僅用1μg/ml因子H完成轉(zhuǎn)化(泳道A3)。相反，由CVFBb切割HDV-3X產(chǎn)物將產(chǎn)生更大量的α鏈和僅僅少量的68 kDa片段(泳道B2)。在這種C3b轉(zhuǎn)化為iC3b中，添加外源H是無效的(泳道B3-5)。即使用25μg/ml的H，僅僅輕微的68kDa和77kDa產(chǎn)物的形成也是可檢測的(泳道A5)。因此，HDV-3X C3b比野生型對內(nèi)源性H和I具有更多的抗性。更高量的因子H部分地克服抗性，這個事實表明可以大大地減少因子H的親和性。4．結(jié)論HDV-3X修飾產(chǎn)生對因子I的因子H-依賴性切割的抗性。該機理不能確定，雖然因為修飾的殘基(一級結(jié)構(gòu))離因子I的切割位點遠，但是很有可能它與因子H的相互作用將受到削弱。在這種情況下，突變也將賦予對其它的因子H的抑制活性的抗性，也就是說-(Ⅰ)與結(jié)合C3b(或C3i)的因子B競爭，以及(ⅱ)加速C3bBb與C3bBbP轉(zhuǎn)化酶的解離。DV-lAM突變具有直接或者間接地與因子H保持親和性相關(guān)的修飾殘基。相同殘基的許多不同的缺失或突變將可能具有類似的作用，并且僅僅在這里修飾的一些殘基的缺失或突變以及其它具有一級結(jié)構(gòu)片段的殘基也可能實現(xiàn)這樣的作用。
通過設(shè)計不產(chǎn)生HDV-3X修飾。但是，選擇這種和相關(guān)修飾的方法很有可能是特異性定點誘變的方法，包括前面的實施例所描述的那些方法。實施例16．修飾殘基954和955以抑制在這一位點上因子I介導的切割1．概論在以前的P1殘基(1303和1320)預誘變在前兩個位點提供由因子I切割的抗性(實施例1-6)。不知道在這兩個位點上切割的抑制是否也將在對C3c從C3dg釋放起作用的第三位點上抑制切割。這第三種切割通常依賴CR1(一種設(shè)計成可溶性形式的膜結(jié)合受體，sCRl)作為輔因子，它相對較慢，并且以前僅僅在iC3b(或者iC3i)(即在位點1和2切割之后)而沒有在C3i或者C3b上觀察到。為了檢驗這一點，利用E1Q2突變體(如實施例11所描述的)，它在位點1和2上具有對切割的高抗性。如果這一突變體在位點3對切割仍然敏感，那么將表明在生理液中將這一位點突變以抑制分子的降解，這將是滿足需要的。然而，這將與文獻中報道的關(guān)于是否只在954-955鍵發(fā)生切割(Davis,A.E.3d.Harrison,R.A.和Lachmann,P.J.,1984，免疫學雜志132:1960-6)，或者是否也可以在其它位置發(fā)生切割相沖突，如959-960(Harrison,RA.等，1996，分子免疫學，Suppl.1,59，摘要235；Ekdahl,K.N.,Nilsson,U.R.和Nilsson,B.,1990，免疫學雜志144:4269-74)。最初，我們將殘基954由精氨酸向谷氨酸突變以生產(chǎn)E1Q2E3，因為(ⅰ)這從上文的公開看出是一種切割位點的P1殘基，以及(ⅱ)從實施例的位點1，其中突變成谷氨酸將賦予比其它取代更高的切割抗性。此外，其它哺乳動物物種(小鼠、大鼠、豚鼠、兔)的C3在與954和955相同的殘基上具有谷氨酰胺和甘氨酸代替人類C3的精氨酸與谷氨酸(例如Mavroidis,M.,Sunyer,J.O.和Lambris,J.D.,1995，免疫學雜志154:2164-2174)。這些數(shù)據(jù)表明這一位點(954-955)在其它物種中不能充分地切開，并且表明其它位點(如959-960)可能更重要(Harrison,RA.，等，1996，分子免疫學33,Suppl.1,59，摘要235)。因此，arg954向Gln以及Glu955向Gly的等同的突變使得人類C3成為EIQ2QG3突變體。2．方法除了E1Q2E3突變體的誘變引物具有編碼突變R954E的序列g(shù)aacgcctgggcgaagaaggagtgcag，以及E1Q2QG3突變體的誘變引物具有編碼突變R954Q和E955G的序列aacgcctgggccaaggaggagtgcagaa外，利用如前面的實施例所描述的用于突變體構(gòu)建的方法。將產(chǎn)物連接到包含編碼E1Q2(E1303、Q1320，如實施例5和11所描述的)的突變的構(gòu)建體中，分離質(zhì)粒DNA的序列分析確認已引入正確的突變。沒有檢測到其它突變。將形成的表達載體轉(zhuǎn)染進COS細胞中，并且如以前描述的，分析分泌的表達產(chǎn)物的切割反應。3．E1Q2、E1Q2E3和E1Q2G3突變體的因子I-介導的切割圖13顯示所表達的產(chǎn)物的分析。注意的是(ⅰ)將蛋白質(zhì)印跡用單克隆抗體對C3的C3dg區(qū)域進行顯影，該蛋白質(zhì)印跡用于檢測前體、α、α′、77和68kDa片段，但不能檢測β、43或46kDa片段。此外，檢測出在位點3的切割的86kDa產(chǎn)物，沒有檢測在位點1或者2的切割。
(ⅱ)該圖顯示在sCR1的存在下通過E1Q2的因子I-介導的切割確實形成86 kDa產(chǎn)物(泳道A3)，但是當H因子是輔因子時不能形成(泳道A2)。
(ⅲ)在E1Q2E3(C)或者E1Q2QG3(B)突變體中不形成86kDa產(chǎn)物，即使sCRl(C3和B3)存在。4．結(jié)論(ⅰ)當已阻斷位點1和2的切割時，在位點3可能仍然產(chǎn)生因子I-介導的切割。因此，當用于生理環(huán)境時在位點3的切割的附加阻斷對于抑制任何突變體產(chǎn)物的降解是必需的，另外，這種產(chǎn)物僅僅在位點1和2具有抗性。
(ⅱ)位點3的切割可以通過殘基954向Glu突變，以及通過954和955向Gln和Gly突變進行阻斷。因此，殘基954和/或955的其它突變也可能賦予位點切割抗性。
(ⅲ)所顯示的突變不允許在第三位點(如959-960)切割的其它推定的位置切割，盡管這些位點沒有突變。這將表明954-955是唯一重要的切割位點，或者其它切割要求在954-955進行預切割，或者這些殘基的突變在任何情況下通過不同的機理(如構(gòu)象扭變)在其它位置抑制切割。在任何情況下，954和/或955的突變是抑制C3b或C3i-樣產(chǎn)物的降解的有效手段。實施例17．修飾C3羧基端區(qū)以抑制因子I的切割1．概論實施例15提供證據(jù)表明，殘基1546-1663的突變或者缺失賦予對因子I切割的抗性。本實施例進一步提供更小的規(guī)模的也賦予這種抗性的突變體，該突變體不進行各種突變。2．方法除誘變引物具有表Ⅲ顯示的編碼所表示的突變的序列外，利用如前面實施例所描述的用于突變體構(gòu)建所使用的方法。分離質(zhì)粒DNA的序列分析已證實引入正確的突變。沒有檢測其它突變。將形成的表達載體轉(zhuǎn)染進COS細胞中，并且如上所述分析分泌表達產(chǎn)物的切割反應。3．各種突變體對因子I切割的抗性圖14和15顯示因子I和H對這些突變體進行切割分析的結(jié)果。注意將用單克隆抗體對C3的C3dg區(qū)域的蛋白質(zhì)印跡進行顯影以檢測前體、α、α′、77和68kDa片段，但不檢測β、43和46kDa片段。圖14顯示由因子切割的野生型(NC3,A)、FT-4(E)和FT-5(F)產(chǎn)物，如通過77kDa和/或78kDa區(qū)帶的出現(xiàn)和α鏈的消失所表明的。相反，沒有切開FT-1和FT-2。
圖15顯示當FT-2產(chǎn)物再次切開時，將切開野生型(NC3,A)、FR-1(B)、FR-2(C)、FR-3(D)和FR-4(E)產(chǎn)物。4．結(jié)論(ⅰ)即使FT-2小的截短也足以賦予對因子I切割的抗性。因此，該抗性可以通過一些或所有殘基1636-1663的缺失而獲得。FT-1顯示的抗性支持這一結(jié)論，這包括殘基1636-1663的缺失，以及附加的殘基1591-1635的缺失/修飾。
(ⅱ)由于因子I-介導的切割需要殘基1636-1663，所以這些殘基的許多其它修飾很可能產(chǎn)生抗性。
(ⅲ)并非所有的這些殘基的修飾都賦予抗性。低效的修飾包括由FT-5、FR-1、FR-2、FR-3和FR-4所定義的那些，以及由FT-3和FT-4所定義的修飾(修飾除1636-1663殘基外的殘基)。
(ⅳ)這些數(shù)據(jù)意味著切割所需的在1636-1663之內(nèi)的殘基是沒有由FT-5、FR-1、FR-2、FR-3和FR-4所修飾的那些殘基。因此，1649-1660中的一些可能是關(guān)鍵性的。
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權(quán)利要求
1．一種天然補體途徑蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)被修飾得能夠形成負調(diào)節(jié)抗性C3轉(zhuǎn)化酶。
2．如權(quán)利要求1所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是一種修飾的人類蛋白質(zhì)。
3．如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)比天然蛋白質(zhì)對因子I的切割具有更強的抗性。
4．如權(quán)利要求1到3之任一所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是一種修飾的C3蛋白質(zhì)。
5．如權(quán)利要求4所要求的蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)是通過用其它氨基酸取代Arg-1303,Arg-1320之一或兩者修飾的。
6．如權(quán)利要求5所要求的蛋白質(zhì)，其中Arg-1303,Arg-1320或者兩者由谷氨酰胺，酪氨酸，胱氨酸，色氨酸，谷氨酸或甘氨酸取代。
7．如權(quán)利要求6所要求的蛋白質(zhì)，其中Arg-1320由谷氨酰胺取代。
8．如權(quán)利要求6或7所要求的蛋白質(zhì)，其中Arg-1303由谷氨酸，甘氨酸和谷氨酰胺取代。
9．按照前面權(quán)利要求之任一的蛋白質(zhì)，相對于天然人類C3而言，該蛋白質(zhì)具有對因子H和/或因子I的降低的敏感性，相對于天然人類C3而言，所說的蛋白質(zhì)在天然人類C3的相應于氨基殘基752-754和/或殘基758-780的區(qū)域中具有一個或多個氨基酸改變。
10．按照權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)，其中所說的一個或多個氨基酸改變是從酸性氨基酸殘基向中性氨基酸殘基改變。
11．按照權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其中所說的氨基酸殘基改變是從Asp-Glu-Asp向Gly-Ser-Gly改變。
12．按照前面權(quán)利要求之任一的蛋白質(zhì)，相對于天然人類C3而言，該蛋白質(zhì)在天然人類C3的相應于殘基1427,1431和/或1433的氨基酸殘基上具有氨基酸改變。
13．按照前面權(quán)利要求之任一的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含一個或多個與人類C3氨基酸殘基992-1005(EDAVDAERLKHLIV)相關(guān)的突變，其使得C3b和C3i產(chǎn)物或者它們衍生的C3轉(zhuǎn)化酶對因子H的補體抑制活性有抗性。
14．按照權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)包含一個或多個與人類C3氨基酸殘基992(E),993(D),996(D),997(A),998(E),999(R),1000(L),1001(K),1002(H),1005(V)相關(guān)的突變。
15．按照權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)包含突變E992S、D993A、D996S、A997Q、E998S、R999G、L1000M、K1001N、H1002I和V1005H的一個或多個。
16．按照前面權(quán)利要求之任一的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含一個或多個與人類C3氨基酸殘基1152-1155(QEAK)相關(guān)的突變，其使得C3b和C3i產(chǎn)物或者它們衍生的C3轉(zhuǎn)化酶對因子H的補體抑制活性有抗性。
17．按照權(quán)利要求16的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含一個或多個與C3的氨基酸殘基1152(Q)、1153(E)和1155(K)相關(guān)的突變。
18．按照權(quán)利要求17的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含突變Q1152R、E1153K和K1155F的一個或多個。
19．按照權(quán)利要求13到18之任一的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對CR1、MCP和/或DAF的補體抑制活性有抗性。
20．按照前面權(quán)利要求之任一的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有與天然人類C3的氨基酸1546-1663相關(guān)的一個或多個氨基酸缺失、取代或者插入；其中所說的蛋白質(zhì)相對于天然人類C3而言，具有對因子H和/或因子I的降低的敏感性。
21．按照權(quán)利要求20的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含與天然人類C3氨基酸1546-1663相關(guān)的一個或多個氨基酸缺失。
22．按照權(quán)利要求20或21的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含相應于天然人類C3的氨基酸1546-1663所有氨基酸的缺失。
23．按照權(quán)利要求20的蛋白質(zhì)，相對于天然人類C3而言，該蛋白質(zhì)在與天然人類C3的氨基酸殘基1546-1663對應的區(qū)域包含一個或多個不同的氨基酸。
24．按照權(quán)利要求23的蛋白質(zhì)，其中在與天然人類C3的氨基酸殘基1546-1663對應的區(qū)域上的氨基酸在編碼所說的天然人類C3的DNA上可以產(chǎn)生移碼突變。
25．按照權(quán)利要求20到24之任一的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有與天然人類C3氨基酸1636-1663相關(guān)的一個或多個氨基酸缺失、取代或者插入；其中所說的蛋白質(zhì)相對于天然人類C3而言，具有對因子H和/或因子I的降低的敏感性。
26．按照權(quán)利要求25的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含與天然人類C3的氨基酸1636-1663相關(guān)的一個或多個氨基酸缺失。
27．按照權(quán)利要求25或26的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含與天然C3的氨基酸1636-1663對應的所有氨基酸的缺失。
28．按照權(quán)利要求25的蛋白質(zhì)，相對于天然人類C3而言，該蛋白質(zhì)在與天然人類C3氨基酸殘基1636-1663對應的區(qū)域包含一個或多個不同的氨基酸。
29．按照權(quán)利要求25的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含一個或多個與天然人類C3的氨基酸1636-1663相關(guān)的氨基酸缺失、取代或者插入；其中所說的蛋白質(zhì)相對于天然人類C3而言，具有對因子H和/或因子I的降低的敏感性。
30．按照前面權(quán)利要求之任一的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有與天然人類C3的氨基酸殘基954和/或955相關(guān)的一個或多個氨基酸缺失、取代或者插入，并且具有對輔因子(例如CR1或者因子H)依賴性H因子I-介導的在這一位置的切割的降低的敏感性。
31．按照權(quán)利要求30的蛋白質(zhì)，其中對應人類C3的殘基954位置上的氨基酸殘基不同于人類C3的殘基954，該蛋白質(zhì)具有對輔因子(例如CR1或者因子H)依賴性H因子I-介導的在所說位置的切割的降低的敏感性。
32．按照權(quán)利要求31的蛋白質(zhì)，其中所說的氨基酸殘基是谷氨酸，并且其具有對輔因子(例如CR1或者因子H)依賴性H因子I-介導的在所說位置的切割的降低的敏感性。
33．按照權(quán)利要求30的蛋白質(zhì)，其中在對應人類C3殘基954和殘基955的位置上的氨基酸殘基分另是谷氨酰胺和甘氨酸，該蛋白質(zhì)具有對輔因子(例如CR1或者因子H)依賴性H因子I-介導的在所說位置的切割的降低的敏感性。
34．按照權(quán)利要求30的蛋白質(zhì)，其中在對應人類C3殘基955位置上的氨基酸殘基不同于人類C3的殘基955，該蛋白質(zhì)具有對輔因子(例如CR1或者因子H)依賴性H因子I-介導的在所說位置的切割的降低的敏感性。
35．一種按照前面權(quán)利要求之任一的蛋白質(zhì)的片段或變體，所說的片段或變體具有C3轉(zhuǎn)化酶活性，并且也對因子H、因子I、CR1、MCP和/或DAF的補體抑制活性有抗性。
36．一種DNA序列，該序列編碼如權(quán)利要求1到34之任一所要求的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求35所要求的片段或變體。
37．一種DNA構(gòu)建體(例如載體)，該構(gòu)建體包含權(quán)利要求36所限定的DNA序列。
38．一種用于治療的如權(quán)利要求1到34之任一所限定的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求35所要求的片段或變體。
39．一種綴合物，該綴合物包含與特異性結(jié)合部分連接的如權(quán)利要求1到34之任一所要求的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求35所要求的片段或變體。
40．如權(quán)利要求39所要求的綴合物，其中所說的特異性結(jié)合部分是特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。
41．如權(quán)利要求39所要求的綴合物，其中所說的特異性結(jié)合部分是抗體或者其抗原結(jié)合片段。
42．如權(quán)利要求1到34之任一所限定的蛋白質(zhì)或者如權(quán)利要求35所限定的片段或變體或者如權(quán)利要求39到41之任一所限定的綴合物在制造用于減少補體途徑蛋白質(zhì)水平之藥物上的用途。
43．如權(quán)利要求42所要求的用途，其中所說的藥物用于預防異物排斥。
44．如權(quán)利要求42所要求的用途，其中所說的藥物用于在特定位點上定位和/或擴增內(nèi)源性補體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變和沉積。
45．一種藥物制劑，該制劑包含如權(quán)利要求1到34之任一所限定的一種或多種蛋白質(zhì)，或者如權(quán)利要求35所限定的一種片段或變體，或者如權(quán)利要求39所限定的一種綴合物和一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。
46．如權(quán)利要求45所要求的藥物制劑，該制劑用于減少補體途徑蛋白質(zhì)水平。
47．如權(quán)利要求45所要求的藥物制劑，該制劑用于預防異物排斥。
48．如權(quán)利要求45所要求的藥物制劑，該制劑用于在特定位點上定位和/或擴增補體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化和沉積。
49．一種在哺乳動物中減少補體途徑蛋白質(zhì)的方法，該方法包含對哺乳動物施用如權(quán)利要求1到34之任一所限定的蛋白質(zhì)，或者權(quán)利要求35所限定的片段或變體，或者權(quán)利要求39到41之任一所限定的綴合物。
50．如權(quán)利要求49所要求的方法，其中施用權(quán)利要求45所限定的藥物制劑。
全文摘要
描述了天然補體途徑蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)被修飾得能夠形成負調(diào)節(jié)抗性C3轉(zhuǎn)化酶,所說的修飾的蛋白質(zhì)優(yōu)選的是一種修飾的人類C3蛋白質(zhì)。也提供了編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列以及DNA構(gòu)建體。也描述了包含這些蛋白質(zhì)和特異性結(jié)合部分的綴合體,例如抗體。同樣也描述了這些蛋白質(zhì)和/或綴合體在治療中的用途。
文檔編號C07K16/40GK1214733SQ97193318
公開日1999年4月21日 申請日期1997年3月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月7日
發(fā)明者T·C·法里斯, R·A·哈里森 申請人:艾姆特蘭有限公司