專利名稱：胞內(nèi)抗凍多肽和核酸的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用本發(fā)明是1996年1月31日申請的USSN 60/010,920的部分續(xù)展申請。
背景技術(shù)：
細(xì)胞生物體的存活依賴于水的物理性質(zhì)。液態(tài)水的冰點(diǎn)決定了大多數(shù)細(xì)胞存活的下限，因?yàn)樾纬杀鶗?dǎo)致細(xì)胞脫水和滲透性遭破壞。生活在零度以下環(huán)境中的生物體有特殊的適應(yīng)性，這使得生物體能夠存活。例如，生活在北極和南極的冰冷海水中的魚有各種不同的抗凍多肽大分子存在于它們血液的血清之中。這些抗凍多肽是由相對分子量(Mr)約為2500-34,000的糖蛋白(抗凍糖蛋白，簡稱為“AFGP”)和Mr約為3,300-12,000的抗凍多肽(AFP)構(gòu)成的混合物。Ananthanarayanan在(1989)Life Chemistry Reports 7:1-32中對AFP和AFGP進(jìn)行了綜述。還可參見DeVries(1983)Annu.Rev.Physiol.45:245-260；Davies等人，(1990)FASEB J.4:2460-2468和Warren等人的美國專利No.5,118,792。
目前，從一種冷水魚中已鑒別出三種不同類型的AFP，參見Davies等人(1990)FASEB J.4:2460-2468、和Griffith與Ewart等人，(1995)Bioteca Adv.13(3):375-402，以及這兩篇文章中引用的文獻(xiàn)。Ⅰ型AFP是在多種右目鰈魚和杜父魚中發(fā)現(xiàn)的富含丙氨酸、α-螺旋的多肽。Ⅱ型AFP是在海鴉(sea raven)、胡瓜魚和鯡魚中發(fā)現(xiàn)的，它富含半胱氨酸。Ⅲ型AFP是在多種綿鳚科(Zoarcoid)(包括綿鳚和狼魚(wolfish))中發(fā)現(xiàn)的球蛋白。在南極魚類的3個科和極地鱈魚中發(fā)現(xiàn)的AFGP，主要有三肽重復(fù)片段(Ala-Ala-Thr)構(gòu)成，并且在蘇氨酸殘基上連有二糖。
盡管不同的AFP和AFGP在結(jié)構(gòu)上是截然不同的，但是它們都具有通過結(jié)合于冰表面而抑制冰晶生長的能力。目前，已經(jīng)從血清中分離出AFP和AFGP，而且根據(jù)從肝臟克隆而得的cDNA推導(dǎo)出它們DNA序列。目前為止所有描述的蛋白質(zhì)都以含有信號肽的大前體多肽形式合成，這表明多肽有分泌作用。
在冬鰈魚Pleuronectus americanus肝臟中的AFP(肝臟型AFP)已經(jīng)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、基因構(gòu)成、基因表達(dá)和調(diào)控方面進(jìn)行了廣泛的研究。冬鰈魚基因組中含有多個拷貝的肝臟型或血清型AFP基因，其中大多數(shù)以規(guī)則的串聯(lián)重復(fù)形式排列(Scott等人(1985)美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)82:2613-2617)。
發(fā)明概述此處公開和描述了一類新的AFP。這類新的AFP被稱為“皮膚型”AFP，它有多種不同于所有以前描述過的AFP的特性，其中包括該AFP是不分泌的，就是說該皮膚型AFP是胞內(nèi)的。基因組Southern分析顯示，與肝臟型AFP基因相似，皮膚型AFP有多個拷貝(在冬鰈魚中有30-40個拷貝)。早先描述的肝臟型AFP基因在肝臟中特異性表達(dá)而且在腸中有一些表達(dá)，而皮膚型AFP基因在所有被檢測的組織中都有表達(dá)(包括肝臟)，并且在外部組織(即皮膚、鱗、鰭和鰓)中很豐富，這表明皮膚型AFP在這些外部組織中起保護(hù)作用。
在一類優(yōu)選實(shí)例中，本發(fā)明提供了分離的皮膚型胞內(nèi)抗凍多肽(AFP)。在該例子中，AFP具有N端的MDAP序列(SEQ ID No.1)和內(nèi)部的AATAAAAKAAA序列(SEQ ID No.2)。更佳地，N端序列是MDAPA序列(SEQ ID No.9)。AFP不含有信號肽序列(即多肽沒有pre序列)。AFP具有誘導(dǎo)水溶液如H2O的冰點(diǎn)發(fā)生濃度依賴型下降的物理能力。
在一些優(yōu)選實(shí)施例中，皮膚型AFP含有序列MDAPAX1AAAATAAAAKAAAEATX2AAAAX2AAAX3T(SEQ ID No.3)；其中X1選自R、K和A；X2選自K和A；以及X3選自A、D和一個鍵。
特別優(yōu)選的多肽具有約3400的Mr，但是Mr可以大幅變動，例如因?yàn)槎鄠€皮膚型抗凍多肽結(jié)構(gòu)域被連成一個多肽，或者因?yàn)槔缭诘鞍踪|(zhì)的羧基端添加了非功能的氨基酸。典型地，皮膚型AFP的Mr約為2500-13000，更佳地約為3000-6000，最佳地約為3200-4000。典型地，皮膚型AFP的長度約為30-100個氨基酸，更常見的是約35-55個氨基酸，更通常約為35-45個氨基酸。然而，在此處提供了長度超過常見的35-45個氨基酸的具體實(shí)施例。皮膚型AFP的例子包括sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3。
本發(fā)明優(yōu)選的皮膚型AFP可任意地通過檢測多肽的二級結(jié)構(gòu)而加以評估。在一類實(shí)施例中，用圓二色性測定，本發(fā)明多肽約有55-75％α螺旋、更典型地約有60-70％α螺旋，通常約有65％α螺旋。本發(fā)明的某些多肽也可以不符合該標(biāo)準(zhǔn)，例如，當(dāng)多肽是含有與皮膚型AFP無關(guān)的序列的融合蛋白時。含有皮膚型AFP亞序列(subsequence)的融合蛋白是本發(fā)明的一個特征。優(yōu)選的融合蛋白含有皮膚型AFP亞序列和來自GST、匙孔血藍(lán)蛋白和其他常見融合多肽結(jié)構(gòu)域的亞序列。
本發(fā)明的皮膚型AFP可任意地用它們的免疫學(xué)特性來限定。優(yōu)選的AFP結(jié)合多克隆抗體，該多克隆抗體是針對任一(或全部)sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3多肽而產(chǎn)生。優(yōu)選的多肽也可結(jié)合于針對任一(或全部)sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3多肽而產(chǎn)生多克隆抗體，其中多克隆抗血清是用肝臟型多肽如HPLC 6或HPLC 8進(jìn)行扣除的(subtrated)。
分離的多肽可任意地以純化的凍干粉末、水溶液(如含有水、例如以及生理濃度的鹽)存在，或存在于重組細(xì)胞、植物、動物、細(xì)菌、原核細(xì)胞、細(xì)胞提取物等中。多肽可任意地存在于食物如冰淇淋和冷凍酸乳中。
分離的皮膚型抗凍多肽宜由一編碼核酸(RNA或DNA)編碼，該編碼核酸在高度嚴(yán)緊洗滌條件的Northern或Southern印跡分析中雜交于選自下組的皮膚型抗凍核酸sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3。一種高度嚴(yán)緊洗滌條件例子是0.015M NaCl,72℃。較佳地，在同樣的高度嚴(yán)緊洗滌條件下，皮膚型抗凍多肽基本上并不與肝臟型AFP編碼核酸(例如編碼HPLC6的核酸，如pkenc 17，參見圖7)發(fā)生雜交。如果與結(jié)合于完全互補(bǔ)皮膚型AFP相比時Southern或Northern印跡分析的信號與噪音之比被減低75％或更甚，那么肝臟型AFP核酸基本上不與皮膚型核酸雜交。例如，如果具有相同比活性的放射標(biāo)記的肝臟型探針和放射標(biāo)記的皮膚型探針被用于推測相同的Southern印跡，而且放射自顯影顯示，在高度嚴(yán)緊洗滌之后肝臟特異性探針信號低于皮膚特異性探針信號強(qiáng)度的25％，那么被檢測的核酸就是皮膚型核酸。
在另一類例子中，本發(fā)明提供了編碼皮膚型AFP的核酸如表達(dá)載體。該表達(dá)載體編碼的AFP通常與本文上述的分所得多肽具有相同的特性。
在一個優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體編碼第一皮膚型胞內(nèi)抗凍核酸，該第一核酸在0.015M氯化鈉，72℃的高度嚴(yán)緊洗滌條件的Southern或Northern印跡分析中雜交于選自下組的第二皮膚型抗凍核酸sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8，其中第一核酸在相同洗滌條件下基本上不雜交于Pkenc 17核酸，而且該第一核酸編碼具有本文上述性能的皮膚型抗凍多肽。例如，表達(dá)載體可編碼一核酸，該核酸編碼的多肽是選自與下組相對應(yīng)的多肽sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8。
在另一類實(shí)施例中，本發(fā)明提供了重組細(xì)胞，該細(xì)胞含有編碼具有本文上述性能的皮膚型抗凍多肽的皮膚型抗凍核酸。細(xì)胞通常表達(dá)皮膚型AFP，但是在某些例子中，如在克隆過程中所用的細(xì)胞中，細(xì)胞并不表達(dá)AFP。表達(dá)多肽的細(xì)胞是耐冷的，這意味著它們能比不表達(dá)AFP的類似細(xì)胞更耐較低的溫度，并且能夠更輕易在冰冷下存活。細(xì)胞可任意地為真核細(xì)胞如植物、真菌或動物細(xì)胞，還可任意地為原核細(xì)胞如細(xì)菌，或任意地為古細(xì)菌細(xì)胞。
在一類例子中，本發(fā)明提供了降低水性組合物冰點(diǎn)的方法，它通過向水性組合物中添加皮膚型AFP。本發(fā)明優(yōu)選的皮膚型AFP以濃度依賴型方式降低水溶液的冰點(diǎn)，例如通過測定熱滯后效應(yīng)所顯示的那樣。水性組合物可以是溶液，如水-鹽份構(gòu)成的溶液、細(xì)胞的胞內(nèi)區(qū)室、食物如軟包裝的“冰凍”酸乳或冰淇淋。
在另一類例子中，本發(fā)明提供了特異性地結(jié)合于皮膚型抗凍多肽的抗體。優(yōu)選的抗體對皮膚型AFP是特異的，但是并不結(jié)合于肝臟型AFP。
本發(fā)明還提供了皮膚特異性基因和啟動子。目前已發(fā)現(xiàn)，基因11-3和F2的基因組序列含有相關(guān)啟動子，該啟動子可優(yōu)先指導(dǎo)相關(guān)的皮膚型核酸在冬鰈魚皮膚中表達(dá)。這些基因還指導(dǎo)在鰈魚其他組織中低水平地表達(dá)，而且在其他生物體尤其是其他魚類中也是有活性的。11-3和F2基因序列占據(jù)了11-3和F2基因編碼序列的1000個堿基之內(nèi)，它含有啟動子元件，這些啟動子元件指導(dǎo)在例如冬鰈魚皮膚中的表達(dá)。優(yōu)選的啟動子包括類似于這些基因編碼區(qū)域側(cè)翼的5′和/或3′核酸，并且還可任選地含有這些基因的內(nèi)含子區(qū)域和編碼區(qū)域。類似序列在嚴(yán)緊雜交條件下結(jié)合于這些核酸。優(yōu)選的啟動子元件包括核酸亞序列GAATAAAT,CATCAGGACT CAAACACTTTTCACTGTCGA CCACTCAG,CTGCAAAA和AATAAAA,它們在11A-3和F2啟動子中是完全保守的(分別參見F2和11-3的序列SEQ ID No.32和33)。含有所有這些元件的啟動子是皮膚型啟動子，即使啟動子核酸在嚴(yán)緊條件下并不與11-3或F2啟動子雜交。
附圖簡述

圖1是鰈魚AFP的反相HPLC圖。(A)血清AFP；(B)皮膚AFP。來自血清(A)和皮膚刮削物(B)的，經(jīng)Sephadex G75純化的抗凍組份在Bondclone 10 C18柱(2.1×30厘米)上，用流速為4.5毫升/分鐘的20-40％7腈、0.1％三氟乙酸梯度進(jìn)行分級。
圖2是代表性的Ⅰ型抗凍多肽的氨基酸序列比較圖。HPLC-6是冬鰈魚的主要的肝臟型AFP。sAFPⅠ是冬鰈魚的代表性的皮膚型AFP。還可參見SEQ ID No.14-30。
圖3顯示了從鰈魚血清和皮膚中分離出的AFP的抗凍活性與濃度依賴性圖。AFP是主要血清AFP(HPLC-6)和皮膚AFP,sAFP2和sAFP3。
圖4顯示了鰈魚皮膚型AFP的氨基酸序列。氨基酸序列是用cDNA和基因組克隆推導(dǎo)出的。氨基酸序列還可用氨基酸測序方法直接從AFP測得。
圖5顯示了“假基因”F2和皮膚AFP cDNA克隆S3(編碼sAFP2的核酸)的序列比較結(jié)果。相同的核苷酸在S3中用橫線表示。兩個序列編碼的相同多肽示于核酸序列上方。兩個主要的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(如圖6用引物延伸法進(jìn)行確定)用“^”表示。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前的序列用小寫字母表示。內(nèi)含子位置用箭頭表示。推定的TFIID結(jié)合位點(diǎn)aataat、用于引物延伸的寡核苷酸以及聚腺苷酸化位點(diǎn)AATAAA用下劃線標(biāo)出。還可參見SEQ ID No.17和SEQ ID No.32。
圖6顯示了F2的DNA序列。還可參見Davies和Gauthier(1992)(同上)的文獻(xiàn)。轉(zhuǎn)錄序列用大寫字母表示，而5′側(cè)翼序列和內(nèi)含子用小寫字母表示。起始密碼子ATG和終止密碼子TAA被標(biāo)出。TFIID結(jié)合基序(aataaat)、oct-1結(jié)合位點(diǎn)(ctgcaaaa)和聚腺苷酸化位點(diǎn)AATAAA用下劃線標(biāo)出。還可參見SEQ ID No.32。
圖7是探針Pkenc 17的DNA序列(SEQ ID No.33)。
圖8是11-3的DNA序列(還可參見Davies和Gauthier(1992)(同上)的文獻(xiàn))(SEQ IDNo.33)。轉(zhuǎn)錄序列用大寫字母表示，而5′側(cè)翼序列和內(nèi)含子用小寫字母表示。起始密碼子ATG和終止密碼子TAA被標(biāo)出。TFIID結(jié)合基序(aataaat)、oct-1結(jié)合位點(diǎn)(ctgcaaaa)和聚腺苷酸化位點(diǎn)AATAAA用下劃線標(biāo)出。
圖9是sAFP2核酸(SEQ ID No.17)的限制性圖譜。
圖10顯示了對應(yīng)于sAFP1(S4)-sAFP5(S2)(SEQ ID No.15-24)的核酸序列。起始密碼子和終止密碼子被標(biāo)出。
圖11顯示了對應(yīng)于sAFP6(L4)-sAFP8(S6)(SEQ ID No.25-30)的核酸序列。起始密碼子和終止密碼子被標(biāo)出。
圖12的圖A-C顯示了在不同溫度下肝臟特異性和皮膚特異性AFP的CD譜。
圖13顯示了肝臟特異性和皮膚特異性AFP的熱變性圖。
圖14顯示了不同的合成的皮膚AFP的肽序列。
圖15顯示了合成的和天然的AFP的活性。
定義盡管任何與本文描述相類似或等價的方法和材料都可用于實(shí)施或測試本發(fā)明，但是在此描述優(yōu)選的方法和材料。出于本發(fā)明目的，在下面定義以下術(shù)語。
術(shù)語“抗體”指基本上由一個或多個免疫球蛋白基因或其片段所編碼的多肽。已認(rèn)識的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分成κ或λ。重鏈被分成γ、μ、α、δ和ε，它們反過來又分別規(guī)定了免疫球蛋白的種類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
代表性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包括四聚體(tetramer)。每個四聚體由兩個相同的多肽鏈對構(gòu)成，每個配對具有一個“輕鏈”(約25KD)和一個“重鏈”(約50-70KD)。每個鏈的N-端界定了約100-110或更多氨基酸構(gòu)成的可變區(qū)，該可變區(qū)主要負(fù)責(zé)抗原識別。術(shù)語可變的輕鏈(VL)和可變的重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體可以是例如完整的免疫球蛋白，也可以是用不同肽酶消化而產(chǎn)生的眾多已充分定性的片段。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)中二硫鍵下方切斷抗體，從而產(chǎn)生F(ab)2′，它是Fab的二聚體(Fab本身是通過二硫鍵連于VH-CH1的輕鏈)。F(ab)2′可以在溫和條件下被還原以打斷絞鏈區(qū)的二硫鍵，從而將F(ab)2′二聚體轉(zhuǎn)變成Fab′單體。Fab′基本上是帶有部分絞鏈區(qū)的Fab(對于其他抗體片段的更詳細(xì)描述，可參見Fundamental Immunology,3版,W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993)，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)。盡管各種不同抗體片段是用完整抗體的消化進(jìn)行限定的，但是技術(shù)人員會理解，這些Fab′片段還可用化學(xué)方法或用重組DNA技術(shù)從頭合成。因此，如本文所用，術(shù)語抗體還包括通過修飾完整抗體而產(chǎn)生的抗體片段，以及用重組DNA技術(shù)從頭合成的抗體片段。
術(shù)語“分離的”或“生物純的”指物質(zhì)基本上或大體上不含有在其天然存在環(huán)境中通常伴隨它的組份。分離的物質(zhì)可任選地含有在天然環(huán)境中不伴隨該物質(zhì)的物質(zhì)。例如，“分離的”天然存在于魚皮膚中的AFP可任選地含有異源的細(xì)胞組份、食物等。
術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除另外說明，它包括以類似于天然存在核酸的方式，雜交于核酸的天然核苷酸的類似物。除非另外說明，具體的核酸序列包括其互補(bǔ)序列。核酸“編碼”另一核酸，是指另一核酸與指定的核酸相同，或者與指定的核酸互補(bǔ)。
術(shù)語“可操作地連于”指在核酸表達(dá)控制序列(如啟動子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列)和另一核酸序列之間存在功能上的連接，其中表達(dá)控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于另一核酸序列的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
“表達(dá)載體”包括含有某一核酸的重組表達(dá)盒，該核酸編碼能被細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯的多肽。“重組表達(dá)盒”是一種用重組方式或合成方式產(chǎn)生的核酸構(gòu)建物，它具有一系列特定的核酸元件，這些元件使得某一核酸可以在靶細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體可以部分來自質(zhì)粒、病毒、或核酸片段。通常，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分包括待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動子。在某些例子中，表達(dá)盒還含有復(fù)制起點(diǎn)和/或染色體整合元件。“啟動子”是一列核酸控制序列，它指導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)錄。如本文所用，啟動子包括靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的必要的核酸序列，如在聚合酶Ⅱ型啟動子情況下就是TATA元件。啟動子還包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻抑元件，它們可以位于遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多達(dá)數(shù)千堿基對處。“組成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件以及細(xì)胞發(fā)育和分化階段下都活躍的啟動子?！罢T導(dǎo)型”啟動子會對胞外刺激作出反應(yīng)。
術(shù)語“重組”與細(xì)胞一起使用時，指細(xì)胞復(fù)制或表達(dá)相對該細(xì)胞而言外源的核酸、或者表達(dá)該核酸編碼的肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可表達(dá)在天然形式(即非重組的)細(xì)胞中原不存在的基因。重組細(xì)胞還可表達(dá)在天然形式細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因，其中該基因被用人工手段再次引入細(xì)胞，例如在異源啟動子控制之下。
術(shù)語“異源”與核酸一起使用時，指核酸含有兩個或多個在自然界并不以相同關(guān)系存在的亞序列。例如，核酸通常用重組方式產(chǎn)生，其中來自不相關(guān)基因的兩個或多個序列被排列在一起從而形成具有新功能的核酸。例如，在一個例子中，核酸具有來自一個基因的啟動子，該啟動子被用于指導(dǎo)來自另一基因的編碼序列的表達(dá)。
術(shù)語“亞序列”在具體核酸或多肽序列的上下文中是指，與具體核酸或多肽相等或較小的核酸或多肽區(qū)域。某些本發(fā)明多肽可任選地含有來自一種以上多肽的多個結(jié)構(gòu)域。例如，含有皮膚型AFP亞序列的融合蛋白是本發(fā)明的特征之一。優(yōu)選的融合蛋白含有皮膚型AFP亞序列(通常為給定皮膚型AFP的至少30％，常常至少50％，經(jīng)常至少70％，較佳地至少約80％，偶爾至少90％，最佳地100％)和來自常用的融合分子(用于增加免疫原性或協(xié)助融合分子的純化)的亞序列。
“嚴(yán)緊條件”和“嚴(yán)緊雜交洗滌條件”在核酸雜交試驗(yàn)如Southern和Northern雜交試驗(yàn)中是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。對核酸雜交的全面指導(dǎo)可參見Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization With Nucleic Acid Probes第一部分第二章“overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,New York。通常，高嚴(yán)緊雜交和洗滌條件被選定為，比特定序列在所限定的離子強(qiáng)度和pH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)約50％靶序列與完全匹配的探針發(fā)生雜交的溫度。非常嚴(yán)緊的條件可以選定為等于具體探針的Tm。在Southern或Northern印跡分析的濾膜上，含100個以上互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸進(jìn)行雜交的嚴(yán)緊雜交條件一個例子是42℃含1毫克肝素的50％甲醛溶液，并且雜交過夜。高度嚴(yán)緊的洗滌條件是在72℃，用0.5M氯化鈉洗滌約15分鐘。嚴(yán)緊洗滌條件是在65℃用0.2×SSC洗滌15分鐘(對于SSC緩沖液的描述，可參見Sambrook，同上)。通常，在高度嚴(yán)緊洗滌之前，先進(jìn)行低嚴(yán)緊洗滌以去除背景探針信號。對于例如超過100個核苷酸的雙鏈體的中度嚴(yán)緊洗滌是用45℃的1×SSC洗滌15分鐘。對于例如超過100個核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)緊洗滌是用40℃的4-6×SSC洗滌15分鐘。通常，在具體雜交分析中信號與噪音比值是不相關(guān)探針的2倍或更高時，就表示檢測到特異性的雜交。在嚴(yán)緊條件下不相互雜交的核酸仍然是基本相同的，如果它們編碼的多肽是基本相同的話。例如最大限度地利用遺傳密碼所允許的密碼子簡并性時，就會出現(xiàn)這種情況。
術(shù)語“相同”用于兩個核酸或多肽序列時，指對于給定的比較窗口按最大對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行排列時，在兩個序列中的殘基是相同的。當(dāng)對蛋白質(zhì)或多肽使用序列相同百分比時，應(yīng)了解，不相同的殘基部分通常是保守性的氨基酸替換，即氨基酸殘基被另一具有類似化學(xué)性質(zhì)(如電荷和疏水性)的氨基酸殘基所替換，因而并不改變分子的功能特性。當(dāng)序列差別在于保守性替換時，應(yīng)對序列相同百分比進(jìn)行向上調(diào)整，以便因替換的保守性而進(jìn)行修正。進(jìn)行這種調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守性替換作為部分錯配進(jìn)行評分而不是作為完全錯配進(jìn)行評分，從而提高序列相同百分比。因此，例如當(dāng)相同氨基酸的評分為1而非保守替換的評分為0時，保守性替換的評分就介于0和1之間。保守性替換的評分可根據(jù)例如Meyers和Miller的算法(Computer Applic.Biol.Sci.,4:11-17(1988))，例如由程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)執(zhí)行。
對序列進(jìn)行排列從而加以比較的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。為了加以比較，序列的最佳排列可用下列方法進(jìn)行Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443的同源性排列算法；Pearson和Lipman(1989)美國科學(xué)院院報85:2444的相似形搜索法；由計算機(jī)執(zhí)行這些算法[其中包括，但并不限于PC/GENE程序(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中的CLUSTAL、GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575 Science Dr.,Madison,Wisconsin,USA)].CLUSTAL程序在下列文獻(xiàn)中有充分描述Higgins和Sharp(1988)Gene,73:237-244；Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-153；Corpet等人(1988)《核酸研究》(Nucleic Acids Research)16,10881-90；Huang等人，(1992)Computer Applications in the Biosciences 8,155-65；以及Pearson等人，(1994)Methods in Molecular Biology 24,307-31。排列也可以用目測和手工排列法進(jìn)行。
某一具體核酸序列的“保守性修飾變異形式”指那些編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當(dāng)核酸并不編碼氨基酸序列時指基本相同的序列。因?yàn)檫z傳密碼的簡并性，所以有眾多功能上相同的核酸可編碼給定的多肽。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸這一氨基酸。因此，在每個由某一密碼子限定為丙氨酸的位置上，密碼子可以被改為所述的任一密碼子而不會改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，它是“保守性修飾變異形式”的一種。此處所述的每個編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸的每種可能的沉默變異形式。技術(shù)人員會知曉，在核酸中的每個密碼子(除了AUG，通常它是甲硫氨酸的唯一密碼子)可被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的每種“沉默變異形式”的核酸是隱含在每個描述的序列中的。此外，技術(shù)人員知道，導(dǎo)致編碼序列中一個氨基酸或少量氨基酸被改變、添加或缺失的各種取代、缺失或添加形式都是“保守性修飾形式”，其中這種改變導(dǎo)致某一氨基酸被另一個化學(xué)上類似的氨基酸所替換。提供功能類似氨基酸的保守性取代表是本領(lǐng)域中眾所周知的。下列6個組別中，每個組別都包含了可相互進(jìn)行保守性取代的氨基酸。
1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
還可參見，Creighton(1984)Proteins W.H.Freeman and Company。
“皮膚型AFP”是在例如冬鰈魚中發(fā)現(xiàn)的，密切相關(guān)的一族抗凍蛋白。皮膚型AFP是富含丙氨酸的多肽，它通常在N端含有MDAP基序(或更佳地MDAPA基序)，而且通常含有內(nèi)部的AATAAAAKAAA序列，盡管這些序列的某些保守性取代形式如本文上面所述也在構(gòu)思之中。皮膚型AFP具有共同的可被抗體識別的表位，并且具有共同的抑制冰晶形成的能力，從而可以降低水溶液的冰點(diǎn)。
皮膚型啟動子是在冬鰈魚皮膚中指導(dǎo)核酸表達(dá)的啟動子。該啟動子通常還可在除皮膚之外的其他組織中指導(dǎo)該核酸的低水平表達(dá)。該啟動子在除冬鰈魚之外的生物體也是有活性的，尤其是在與鰈魚相關(guān)的各種魚類中。啟動子還可任選地是異源的啟動子，即啟動子可被任選地用于指導(dǎo)與皮膚型AFP無關(guān)的核酸的表達(dá)，例如需要在皮膚中高水平地表達(dá)核酸時。啟動子還可任選地用作AFP基因的一部分，其中啟動子通常與AFP編碼序列處于天然存在的關(guān)系。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，分離出一類新“皮膚型”AFP及其相應(yīng)的核酸。皮膚型AFP基因在被檢測的冬鰈魚所有組織中都普遍地表達(dá)，其中在諸如皮膚、鱗、鰭和鰓等外部組織中表達(dá)水平高。在結(jié)構(gòu)上，皮膚型AFP缺乏pre和pro序列(前序列和原序列)，這表明多肽在防凍中是在胞內(nèi)發(fā)揮作用。從冬鰈魚Pleuronectes americanus的皮膚中，通過凝膠過濾和反相高效液相色譜法分離出不同的抗凍多肽。同時，從皮膚cDNA庫中分離出幾個cDNA克隆。蛋白質(zhì)和DNA序列分析都表明，鰈魚皮膚中含有數(shù)種不同的但同源的、富含丙氨酸的AFP，它們被稱為皮膚型AFP。
在早先研究的產(chǎn)生AFP的魚類中，AFP是在肝臟中合成的，并分泌入血液循環(huán)。這些肝臟型AFP通過降低血漿冷凍溫度而起作用，從而防止魚在布滿冰的海水中被凍結(jié)。本發(fā)明中皮膚型AFP基因編碼沒有信號肽的多肽，這表明它們作為胞內(nèi)蛋白發(fā)揮作用。血漿AFP的HPLC圖譜(圖1A)分析揭示，在循環(huán)系統(tǒng)中并不存在皮膚型AFP，這進(jìn)一步說明了皮膚型AFP的胞內(nèi)角色。
通過提供屏障以防止冰晶通過皮膚或形成冰晶，細(xì)胞質(zhì)AFP起著重要的抗凍作用。Valerio等人(1992)J.Exp.Biol.164:135-151發(fā)現(xiàn)，從冬鰈魚上取下的皮是重要的防止冰晶生長的屏障?，F(xiàn)在明白了，這種保護(hù)現(xiàn)象是由于本文的皮膚型AFP。在外部組織中高水平的皮膚型AFP信使RNA(約為皮膚總mRNA的20％)反映了，高濃度的AFP能夠有效地防止細(xì)胞被凍結(jié)。在許多內(nèi)部組織中，其表達(dá)是較低的，但是也很顯著，約為皮膚中水平的1-10％。這些組織可能早已通過肝臟中形成的AFP在血漿中循環(huán)而受到保護(hù)。低水平的胞內(nèi)AFP可能在這些組織中還有其他生理作用。
皮膚AFP的活性通常在魚AFP活性范圍內(nèi)(Kao等人(1986)Can.J.Zool.64:578-582)。然而，它們并不象冬鰈魚的血清AFP的活性那么高(圖3)。皮膚AFP缺少數(shù)個殘基，而已知這些殘基在血清AFP中對抗凍活性有貢獻(xiàn)(Wen等人(1992)BioPhys.J.63:1659-1662)。大多數(shù)皮膚AFP有Thr殘基作為潛在的冰晶作用位點(diǎn)，其中它們的螺旋重復(fù)片段通常是-Thr-X7-(而不是肝臟型AFP中的-Thr-X2-Asn/Asp-X5-)。在鰈魚血清HPLC-6的晶體結(jié)構(gòu)中鑒別出特異的冰結(jié)合基序是由Thr/Asp或Thr/Asn/Leu構(gòu)成的(Sicheri等人(1995)Nature 375:427-431)，這進(jìn)一步說明了皮膚型Thr AFP序列的功能含義。單個蘇氨酸殘基是不完整的基序，它與冰的結(jié)合弱于肝臟型AFP的結(jié)合位點(diǎn)-Thr-X2-Asn/Asp-X5-。
很清楚，肝臟型和皮膚型AFP基因?qū)儆诙嗷蚣易濉４蠖鄶?shù)(如果不是全部的話)肝臟基因是串聯(lián)重復(fù)的，并以規(guī)則的間距隔開(Scott等人(1985)美國科學(xué)院院報82:2613-2617)。皮膚型AFP基因(3040個拷貝)也是連鎖的。在冬鰈魚基因組中有約70-80個拷貝的AFP基因，其中包括肝臟型和皮膚型AFP。肝臟型AFP基因主要在肝臟中表達(dá)并且在腸中以低得多的程度進(jìn)行表達(dá)。與此相符合，在皮膚cDNA庫中沒有克隆到肝臟型AFP cDNA克隆。與之相反，皮膚AFP基因是普遍表達(dá)的。因?yàn)橛?0-40個拷貝的皮膚AFP基因，因此這些皮膚型基因中的某些基因可能在某些組織中是特異性表達(dá)的。在冬鰈魚中發(fā)現(xiàn)非肝臟型AFP基因暗示，在其他產(chǎn)生AFP的物種(尤其那些產(chǎn)生不同類型AFP的物種)的AFP基因家族中，存在結(jié)構(gòu)和組織特異性不同的變異形式。例如，與冬鰈魚相同，在合成Ⅲ型AFP的美洲大綿鳚(Maerozoarces americanus)中，具有AFP多基因家族(Hew等人，1988)并且主要在肝臟中表達(dá)AFP mRNA，但是在許多非肝臟組織中也有表達(dá)。
本發(fā)明首次報道了在同一物種中存在兩種截然不同的AFP，并且首次報道了皮膚型AFP基因和多肽。
制備AFP核酸和多肽在本文中描述了數(shù)種編碼皮膚型AFP多肽的特定的核酸。這些核酸可以用標(biāo)準(zhǔn)的重組和合成技術(shù)制備。給出了本發(fā)明的核酸后，技術(shù)人員能夠構(gòu)建出大量不同的、含有功能上相同的核酸(比如編碼相同多肽的核酸)的克隆。用于實(shí)現(xiàn)這些目的的克隆方法，以及用于驗(yàn)證核酸序列的測序方法都是本領(lǐng)域中眾所周知的。適合的克隆和測序技術(shù)的例子以及足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行多種克隆操作的說明，可以在下列文獻(xiàn)中找到Berger和Kimmel,Guideto Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymologyvolume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2版)Vol.1-3；和Current Protocols inMolecular Biology,F.M.Ausubel等人編，Current Protocols(它是Greene PublishingAssociates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.的合資企業(yè))，(1994年增補(bǔ)版)(Ausubel)。來自生物試劑和試驗(yàn)設(shè)備制造商的產(chǎn)品信息，也提供了已知生物方法的有用信息。這樣的制造商包括SIGMA化學(xué)公司(Saint Louis,MO)、R&D systems(Minneapolis,MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway,NJ)、CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI)、Glen Research,Inc.、GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersberg,MD)、FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)、Invitrogen(SanDiego,CA)和Applied Biosystems(Foster City,CA)以及技術(shù)人員已知的其他眾多商業(yè)來源。
本發(fā)明的核酸組合物，無論是RNA、cDNA、基因組DNA還是各種組合的雜交形式，都是從生物來源分離出的或是在體外合成的。本發(fā)明的核酸存在于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，存在于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本純凈的形式存在。
體外擴(kuò)增技術(shù)是已知的，它們適用于擴(kuò)增用作分子探針的序列，或者產(chǎn)生用于隨后亞克隆過程的核酸片段。在下列文獻(xiàn)中可找到足以指導(dǎo)技術(shù)人員實(shí)施這種體外擴(kuò)增方法的技術(shù)例子，其中包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、Q β-復(fù)制酶擴(kuò)增以及其他RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(如NASBA):Berger,Sambrook等人(1989)Molecular Cloning-A LaboratoryManual(2版)Vol.1-3；和Ausubel及Mullis等人(1987)美國專利No.4,683,202；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis等人編輯)Academic Press Inc.San Diego,CA(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3,81-94；Kwoh等人(1989)美國科學(xué)院院報86,1173；Guatelli等人(1990)美國科學(xué)院院報87；1874；Lomell等人(1989)J.Clin.Chem.35,1826；Landegren等人(1988)Science 241,1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8,291-294；Wu和Wallace,(1989)Gene 4,560；Barringer等人(1990)Gene 89,117；以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology 13:563-564?？寺◇w外擴(kuò)增核酸的改良方法描述于Wallace等人的美國專利No.5,426,039中。
用作探針(例如用于體外AFP核酸擴(kuò)增法)，或者用作檢測AFP核酸時核酸探針的寡核苷酸，通常是用化學(xué)方法，按Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Lett.22(20):1859-1862所描述的固相亞磷酰胺三酯法進(jìn)行合成，例如用自動合成儀，例如按Needham-VanDevanter等人(1984)NucleicAcids Res.12:6159-6168所述的方法進(jìn)行。寡核苷酸還可在技術(shù)人員已知的多種商業(yè)渠道中定制和定購。如果需要，寡核苷酸的純化通常是用非變性丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC(按Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255:137-149所述)。合成的寡核苷酸的序列，可以用Grossman和Moldave(編輯)Academic Press,New York,Methods in Enzymology 65:499-560中Maxam和Gilbert(1980)的化學(xué)降解法進(jìn)行驗(yàn)證。
技術(shù)人員會知道，有許多方法可產(chǎn)生給定核酸序列的變異形式。這些公知的技術(shù)包括定點(diǎn)誘變、用簡并寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增、將含有核酸的細(xì)胞暴露于誘變劑或輻射、化學(xué)合成所需的寡核苷酸(例如與連接和/或克隆結(jié)合可產(chǎn)生大的核酸)以及其他熟知的技術(shù)。參見例如Giliman和Smith(1979)Gene 8:81-97；Roberts等人(1987)Nature 328:731-734和Sambrook等人(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2版)Vol.1-3；Innis、Ausubel、Berger、Needham VanDevanter和Mullis(全部同上)。
本發(fā)明的多肽可用各種不同的公知方法進(jìn)行合成。較短的多肽通?？稍谌芤褐谢蛟诠滔噍d體上用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行合成。參見例如Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154。各種不同的自動合成儀和測序儀可以購買得到并根據(jù)已知的方案進(jìn)行使用。參見例如Stewart和Young(1984)SolidPhase Peptide Synthesis 2版，Pierce Chemical Co.。多肽的生產(chǎn)還可通過重組表達(dá)編碼多肽的核酸，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。
AFP核酸的篩選和將AFP核酸用作分子探針本發(fā)明的核酸，除了用于編碼本文所述的多肽之外，還可用作分子探針。各種不同格式(format)和標(biāo)記是可供使用和適用于核酸雜交反應(yīng)的，其中包括那些在Tijssen(1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-用核酸探針進(jìn)行雜交(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-hybridization with nucleic acid probes)，第一和第二部分，Elsevier,NewYork和Choo(編輯)(1994)Methods in Molecular Biology Volunm 33-In SituHybridization Protocols,Humana Press Inc.,New Jersey(還可參見分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)系列中其他書籍)中詳述的；尤其參見Choo(編輯)的“用放射性和非同位素原位雜交法檢測病毒核酸”("Detectionof Virus Nucleic Acids by Radioactive and Nonisotopic in situ Hybridization")的第21章。
例如，常規(guī)地可用PCR來檢測生物樣品中的AFP核酸(對于PCR技術(shù)的總體描述，可參見Innis(同上))。因此，在一類例子中，本發(fā)明核酸被用作PCR引物或者用作PCR反應(yīng)的陽性對照，以檢測生物樣品(如冷水魚或基因工程改造的含有AFP的生物體)中是否有AFP。簡而言之，本發(fā)明核酸構(gòu)建物編碼的核酸可以被用作模板，以人工合成產(chǎn)生約15-25個核苷酸的，而且序列與選定的AFP核酸亞序列相似或相同的寡核苷酸。然后，將這些寡核苷酸用作PCR反應(yīng)的引物，以檢測生物樣品(如未分析的魚皮膚提取物)中的AFP核酸。本發(fā)明核酸(即對應(yīng)于被擴(kuò)增區(qū)域的核酸)還可其他反應(yīng)的擴(kuò)增模板，以確定PCR試劑和雜交條件是否合適。
用本發(fā)明核酸在生物樣品中檢測核酸的其他方法包括Southern印跡法、Northern印跡法、原位雜交法(包括熒光原位雜交(FISH)、反相染色體染色法、在DAPI染色的染色體上進(jìn)行FISH、用PCR產(chǎn)生Alphoid DNA探針以進(jìn)行FISH、DNA的PRINS標(biāo)記、游離染色質(zhì)圖譜法和在Choo(同上)中所述的其他各種不同技術(shù))。多種自動的固相檢測技術(shù)也是合適的。例如，極大規(guī)模的固定聚合物列陣(very large scale immobilized polymer arrays,VLSIPSTM)可用于檢測核酸。參見，Tijssen(同上)；Fodor等人(1991)Science,251:767-777和Sheldon等人(1993)Clinical Chemistry 39(4):718-719。
皮膚型AFP核酸可與基于本文核苷酸序列的探針雜交。具體地，皮膚AFP通常含有MDAPA的N末端序列，而且它們的5′不翻譯序列是同源的。以sAFP2為例，互補(bǔ)于5′序列的核苷酸(反義)可用作探針來篩選皮膚cDNA庫中的皮膚AFP。
有義鏈5′-CTC AGA ATC ACT GAC ATC AAA ATG GAC GCA CCA GCC-3′反義鏈3′-GAG TCT TAG TGA CTG TAG TTT TAC CTG CGT GGT CGG-5′通常，探針被用于篩選cDNA文庫或基因組文庫，這些文庫是按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用魚皮膚所建立的(基因組文庫和cDNA文庫還可從熟練的研究人員已知的來源通過公開途徑獲得)。在嚴(yán)緊條件下與反義寡核苷酸雜交的文庫成員(通常是細(xì)菌克隆或細(xì)菌噬菌體)被選為皮膚型AFP的候選者。然后對這些文庫成員進(jìn)行測序，并與其他的皮膚型AFP進(jìn)行比較以證實(shí)它們是皮膚型AFP。注意，對應(yīng)于MDAP或更佳地對應(yīng)于MDAPA序列的核酸可用于區(qū)分皮膚型AFP核酸和肝臟型AFP核酸，因?yàn)槠つw型AFP通常含有MADPA基序，但是肝臟型AFP通常不含有該基序。
還可用上述探針來設(shè)計PCR引物，以擴(kuò)增AFP核酸。例如，對應(yīng)于MDAP序列的引物可以和羧基端探針，或者與結(jié)合于mRNA polyA序列的polyT探針聯(lián)合使用。與polyT引物一起使用的MDAP引物可特異性地擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄的皮膚型AFP mRNA。
制造本發(fā)明核酸和多肽的保守性修飾技術(shù)人員會知道，所公開的序列有許多保守性變異形式可以產(chǎn)生基本上相同的AFP。例如，因?yàn)檫z傳密碼的簡并性，因此“沉默取代”(即核酸序列的取代不造成所編碼多肽的改變)是每一種編碼氨基酸的核酸序列所隱含的特征。類似地，在氨基酸序列中一個或多個氨基酸“保守性氨基酸取代”是指用性質(zhì)高度相似的不同氨基酸進(jìn)行取代(參見上面的定義章節(jié))，修飾后的形式通常被認(rèn)為與公開的氨基酸序列、或與公開的編碼氨基酸的核酸序列是高度相似。對于每種清楚地公開序列，其保守性取代的變異形式都屬于本發(fā)明。
技術(shù)人員知道，有許多方法可產(chǎn)生給定核酸序列的變異形式。這些公知的技術(shù)包括定點(diǎn)誘變、用簡并寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增、將含有核酸的細(xì)胞暴露于誘變劑或輻射、化學(xué)合成所需的寡核苷酸(例如與連接和/或克隆結(jié)合可產(chǎn)生大的核酸)以及其他熟知的技術(shù)。參見例如Giliman和Smith(1979)Gene 8:81-97；Roberts等人(1987)Nature 328:731-734和Sambrook、Innis、Ausubel、Berger、Needham VanDevanter和Mullis(全部同上)。
最常見的是通過改變相應(yīng)的核酸序列然后表達(dá)多肽，從而改變多肽序列。然而多肽序列還可任選地用市售的肽合成儀來合成產(chǎn)生，從而產(chǎn)生任何所需的多肽。(參見Merrifield以及Stewart和Young，同上)。
技術(shù)人員會根據(jù)所提供的序列和本領(lǐng)域關(guān)于AFP的一般知識來選擇所需的本發(fā)明的核酸和多肽。AFP的物理性能和一般性能是熟練技術(shù)人員已知的。在AFP中某些突變形式的具體效果也是已知的。此外，有關(guān)蛋白質(zhì)和核酸性質(zhì)的常識使得技術(shù)人員能夠選擇合適的、活性與本文序列表中公開的合適和多肽相似或相同的序列。本文的定義章節(jié)描述了代表性的保守性氨基酸取代情況。
最后，大多數(shù)核酸和多肽的修飾形式可用常規(guī)的篩選技術(shù)，在與所需那些相合適的分析中加以評估。例如，多肽免疫特性可用合適的免疫分析方法進(jìn)行測定。其他性質(zhì)的改變，如核酸與靶核酸的雜交情況、蛋白質(zhì)的氧化還原性質(zhì)或熱穩(wěn)定性、熱滯后、疏水性、蛋白水解的敏感性、或發(fā)生聚集的傾向等，都可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以分析。
AFP的克隆和表達(dá)一旦分離出和克隆了AFP核酸，那么人們就可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種不同的重組改造的細(xì)胞中表達(dá)該核酸。這樣的細(xì)胞例子包括細(xì)菌、真菌、植物、絲狀真菌、昆蟲(尤其是采用桿狀病毒載體的昆蟲)和哺乳動物細(xì)胞。預(yù)計本領(lǐng)域技術(shù)人員是知曉眾多可供利用的，用于克隆和表達(dá)核酸的表達(dá)系統(tǒng)。
簡而言之，通?？蛇@樣實(shí)現(xiàn)編碼皮膚型AFP的天然或合成核酸的表達(dá)將編碼感興趣多肽的核酸可操作地連于啟動子(組成型或誘導(dǎo)型)，然后將構(gòu)建物整合到表達(dá)載體中。載體適合于在原核生物、真核生物或兩者中復(fù)制和整合。典型的克隆載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列、用于調(diào)控特定核酸表達(dá)的啟動子。載體可任選地含有各類表達(dá)盒(含有至少一個獨(dú)立的終止子序列)、允許該盒在真核生物、原核生物或兩者中復(fù)制的序列(如穿梭載體)和用于原核和真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。例如，參見Sambrook和Ausbel(兩者都同上)。
在原核生物中表達(dá)為了高水平地表達(dá)克隆的核酸，表達(dá)載體通常含有用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動子、用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子。例如，如本文所述，由皮膚型AFP編碼的多肽(例如它可用于保護(hù)細(xì)胞抵抗寒冷和作為抗原物質(zhì))可任選地細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)。大腸桿菌中適用于該目的的調(diào)控區(qū)域的例子是，大腸桿菌色氨酸生物合成途徑中的啟動子和操縱子區(qū)域(Yanofsky,C.,1984,J.Bacteriol.,158:1018-1024),以及噬菌體λ(PL)的左向啟動子(Herskowitz和Hagen,1980,Ann.Rev.Genet.,14:399-445)。在轉(zhuǎn)入大腸桿菌等細(xì)菌的DNA中包含選擇標(biāo)記也是有用的。這些標(biāo)記的例子包括產(chǎn)生對氨芐青霉素、四環(huán)素或氯霉素抗性的基因。對于用于例如大腸桿菌中的選擇標(biāo)記的詳細(xì)內(nèi)容，可參見Sambrook、Ausbel和Berger等的文獻(xiàn)。用于表達(dá)多肽的表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)有的，其中可使用大腸桿菌、桿菌屬(Palva,I.等人，1983,Gene 22:229-235；Mosbach,K.等人，Nature302:543-545)、乳桿菌(Chagnaud等人，(1992)Can.J.Microbiol.38:69-74；Teuber(1993)Food Reviews International 9(3):389-409)、嗜熱鏈球菌(StreptococcusThermophilus)(Mollet等人，(1993)Journal of Bacteriology 175(14):4315-4324；Akahoshi等人，美國專利No.4,970,083；Klaver等人，美國專利NO 4,938,973)和沙門氏菌。大腸桿菌系統(tǒng)是最常用的和研究得最清楚的表達(dá)系統(tǒng)，因而理論上是優(yōu)選的。然而，在需要用于食品生產(chǎn)的細(xì)菌(如乳桿菌，例如用于酸乳和冰淇淋生產(chǎn))中表達(dá)AFP的場合下，這些系統(tǒng)就是優(yōu)選的。在大腸桿菌和乳桿菌之間轉(zhuǎn)移整體的穿梭系統(tǒng)是已知的。參見Chagnaud等人和Teuber等人(兩者都同上)。
用原核細(xì)胞產(chǎn)生的多肽常需要暴露于離液劑，以便進(jìn)行正確的折疊。在從例如大腸桿菌中進(jìn)行純化時，表達(dá)的蛋白質(zhì)可任選地被變性，然后再復(fù)性。這可以這樣實(shí)現(xiàn)，例如將細(xì)菌產(chǎn)生的多肽溶解在離液劑如鹽酸胍中。然后通過緩慢的透析或凝膠過濾而使多肽復(fù)性。參見美國專利No.4,511,503。
在細(xì)菌中表達(dá)皮膚型AFP的一個例子在實(shí)施例章節(jié)的實(shí)施例6中提供。
在真核生物中表達(dá)在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和表達(dá)基因的方法也是本領(lǐng)域中已知的。在真核生物中表達(dá)皮膚型AFP的一個例子在實(shí)施例章節(jié)的實(shí)施例7中提供。
轉(zhuǎn)化冰凍面團(tuán)或面包中的酵母特別有用，因?yàn)楸磉_(dá)皮膚型AFP的酵母在凍融時存活率高，并保留使面團(tuán)自然地發(fā)酵的能力。因此，在一個優(yōu)選例子中，本發(fā)明AFP在酵母中表達(dá)。參見例如，Sherman等人(1982)Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory。用于酵母的啟動子的例子包括GAL1、10(Johnson和Davies(1984)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)4:1440-1448)、ADH2(Russell等人(1983)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)258:2674-2682)、PH05(EMBO J.(1982)6:675-680)和MFα1(Herskowitz和Oshima(1982)The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces(Strathern,Jones和Broach編輯)Cold Spring Harbor Lab.,ColdSpring Harbor,N.Y.,pp 181-209)。具有選擇標(biāo)記如Leu-2、URA-3、Trp-1和His-3等的多拷貝質(zhì)粒也通?？梢允褂?。大量酵母表達(dá)質(zhì)粒如YEp6、YEp13/YEp4等可被用作表達(dá)載體。感興趣的AFP可以與各種酵母載體中的啟動子融合在一起。上述的質(zhì)粒在文獻(xiàn)中有充分描述(Botstein等人(1979)Gene 8:17-24；Broach等人(1979)Gene 8:121-133)。
有兩個方法被常用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在一種情況下，先用酶解酶(zymolyase)、溶胞酶或glusulase將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)變成原生質(zhì)體，然后加入DNA和聚乙二醇(PEG)。接著，用PEG處理過的原生質(zhì)體在3％瓊脂培養(yǎng)基上，在選擇條件下再生。這一方法的細(xì)節(jié)在下列文獻(xiàn)中有描述Beggs(1978)自然(London)275:104-109；和Hinnen等人(1978)美國科學(xué)院院報75:1929-1933。第二種程序不必去除細(xì)胞壁。取而代之的是，用例如氯化鋰或乙酸鋰和PEG處理細(xì)胞，然后置于選擇平板上(Ito等人(1983)J.Bact.153:163-168)。
通過裂解細(xì)胞，然后對裂解液使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，可以從酵母(或其他細(xì)胞)中分離出感興趣多肽。本發(fā)明的多肽可用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化至基本純凈，這些技術(shù)包括用諸如硫酸銨之類的物質(zhì)進(jìn)行選擇性沉淀、柱色譜、免疫沉淀法、和其他方法。例如，可參見Scopes(1982)Protein Purification:Principlesand Practice,Springer-Verlag,New York。純化過程的監(jiān)測，可用Western印跡技術(shù)或放射免疫分析或其他標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析技術(shù)，或者直接監(jiān)測蛋白質(zhì)例如通過考馬斯藍(lán)或銀染的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
另一例子是將AFP引入指定進(jìn)行冷凍儲藏的其他細(xì)胞，如組織或細(xì)胞儲藏物?？赏ㄟ^產(chǎn)生AFP而得以改善的代表性細(xì)胞是源自真菌、植物、昆蟲或脊椎動物(如魚和哺乳動物)的細(xì)胞。特別優(yōu)選的用途是轉(zhuǎn)化脆弱和昂貴的細(xì)胞系，如雜交瘤細(xì)胞系和組織培養(yǎng)細(xì)胞系。用AFP核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞可用各種已知手段實(shí)現(xiàn)。其中包括磷酸鈣沉淀法、將受體細(xì)胞與含有DNA的原生質(zhì)體融合、用含有DNA的脂質(zhì)體處理受體細(xì)胞、DEAE葡聚糖法、受體介導(dǎo)的胞吞作用、電穿孔法、將DNA直接微注射到細(xì)胞中，將含有編碼感興趣多肽的靶核酸的病毒載體與載體宿主范圍內(nèi)的細(xì)胞一起孵育、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和其他許多技術(shù)人員已知的技術(shù)。參見例如，Methods in Enzymology,vol.185,Academic Press,Inc.,SanDiego CA(D.V.Goeddel編輯)(1990)或M.Krieger,Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,New York,NY(1990)和這些文獻(xiàn)中提及的文獻(xiàn)，以及Sambrook和Ausbel的文獻(xiàn)?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物是本領(lǐng)域中眾所周知的，其中包括例子組織或血液樣品的細(xì)胞系和培養(yǎng)細(xì)胞。Freshney(Cultuteof Animal Cells,a Manual of Basic Technique,3版，Wiley-Liss,New York(1994))及其提及的文獻(xiàn)，提供了培養(yǎng)細(xì)胞的全面指導(dǎo)。還可參見Kuchler等人(1977)Biochemical Methods in Cell Culture and Virology,Kuchler,R.J.,Dowden,Hutchinson and Ross,Inc.。
如上所述，用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表達(dá)載體如質(zhì)粒，宜含有引發(fā)轉(zhuǎn)錄的核酸序列和控制編碼多肽翻譯的序列。這些序列通稱為表達(dá)調(diào)控序列。當(dāng)宿主細(xì)胞是昆蟲或哺乳動物細(xì)胞時，代表性的表達(dá)調(diào)控序列可得自SV-40啟動子(科學(xué)(1983)222:524-527)、CMV I.E.啟動子(美國科學(xué)院院報(1984)81:659-663)或金屬硫蛋白(自然(1982)296:39-42)。采用已知方法，含有表達(dá)調(diào)控序列的克隆載體可用限制性酶進(jìn)行切割，然后在必要時或需要時調(diào)整大小，再與編碼感興趣多肽的DNA連接。
與酵母類似，當(dāng)使用更高級的動物宿主細(xì)胞時，通常將已知哺乳動物基因的聚腺苷酸化序列或轉(zhuǎn)錄終止子序列整合入載體中。終止子序列的一個例子是來自牛生長激素基因的聚腺苷酸化序列。還可包含精確地剪接轉(zhuǎn)錄物的序列。剪接序列的一個例子是SV40的VP1內(nèi)含子(Sprague等人(1983)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)45:773-781)。
此外，在特定宿主細(xì)胞中控制復(fù)制的基因序列被整合入載體中。這種序列的一個例子是在牛乳頭瘤病毒型載體中序列。參見Saveria-Campo(1985)，“牛乳頭瘤病毒DNA，一種真核克隆載體”("Bovine Papilloma virus DNA a EukaryoticCloning Vector")DNA Cloning Vol.Ⅱa Practical Approach Glover(編輯)IRL Press,Arlington,Virginia pp.213-238。
控制真核基因表達(dá)的序列已經(jīng)被廣泛研究。啟動子序列元件含有TATA盒共有序列(TATAAT)，它通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游20-30堿基對(bp)處。在大多數(shù)情況下，TATA盒是精確地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始所需要的。常規(guī)地，起始位點(diǎn)被標(biāo)為+1。在5′方向(上游)延伸的序列用負(fù)的數(shù)字表示，在3′方向(下游)延伸的序列用正的數(shù)字表示。這些序列可任選地整合入表達(dá)載體，作為確定的異源啟動子的一部分。在構(gòu)建異源啟動子/結(jié)構(gòu)基因的合并結(jié)構(gòu)時，啟動子位置與異源轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的間隔距離，宜與啟動子在天然狀態(tài)下與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的間隔距離相同。然而，如本領(lǐng)域中所知，距離上有些變化是可以容忍的，而不會導(dǎo)致啟動子功能的喪失。
在一個特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的AFP是在植物細(xì)胞中表達(dá)的，從而將耐寒性賦予轉(zhuǎn)化的植物中。這對于處于寒冷溫度氣候下的農(nóng)民和其他作物生產(chǎn)者而言是十分有價值的，可用于保護(hù)有價值的作物如柑橘果實(shí)、土豆等。對于在植物中表達(dá)，重組表達(dá)載體除了含有AFP序列之外，還應(yīng)含有植物啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(如果待轉(zhuǎn)錄的序列缺乏轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))、和轉(zhuǎn)錄終止序列，并排列在表達(dá)盒中。在表達(dá)盒的5′和3′端通常包含獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)，以便輕易地插入已有的載體。
在植物中，在TATA盒的更上游，在-80至-100位處，通常有一個啟動子元件，它有一系列的腺嘌呤在三聚核苷酸G(或T)周圍。參見Messing等人,GeneticEngineering in Plants,pp.221-227(Kosage,Meredith和Hollaender編輯，1983)。在啟動子區(qū)域還可找到與賦予組織特異性、對環(huán)境信號作出響應(yīng)、或最高效地轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的其他序列。這些區(qū)域通常在距轉(zhuǎn)錄起始大小為400bp范圍內(nèi)找到，但是也可延伸到距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2000bp或更遠(yuǎn)。
用于植物表達(dá)盒的具體啟動子是本發(fā)明中并不重要的一個方面。眾多在植物中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動子都是合適的。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型。源自細(xì)菌的啟動子包括章魚堿合成酶啟動子、胭脂氨酸合成酶啟動子和其他衍生自天然Ti質(zhì)粒的啟動子。參見Herrara-Estrella等人(1983)，自然，303:209-213。病毒啟動子包括花椰菜花葉病毒的35S和19S RNA啟動子。參見Odell等人(1985)自然，313:810-812?？赡艿闹参飭幼影ê送?1,3-二磷酸羧化酶的小亞基啟動子和云扁豆蛋白啟動子。來自E8基因和其他基因的啟動子序列也可以使用。在Deikman和Fischer,(1988)EMBO J.7:3315-3327中詳細(xì)描述了E8啟動子的分離過程及序列。
聚腺苷酸化作用有助于cDNA在植物細(xì)胞中的表達(dá)。聚腺苷酸化序列包括(但并不限于)農(nóng)桿菌章魚堿合成酶的信號序列(Gielen等人(1984)EMBO J.3:835-846)和胭脂氨酸合成酶信號序列(Depicker等人(1982)Mol.and Appl.Genet,1:561-573)。載體還通常含有可選擇的標(biāo)記基因，以便在培養(yǎng)物中鑒別出轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。通常，標(biāo)記基因編碼抗生素抗性。這些標(biāo)記基因包括對G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素和慶大霉素的抗性基因。在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞之后，通過能夠在含特定抗生素的培養(yǎng)基中能力，可以鑒別出那些具有載體的細(xì)胞。
通過使用機(jī)械式轉(zhuǎn)移重組DNA的微量移液器，可直接將植物表達(dá)載體微注射入植物細(xì)胞中。Crossway(1985)Mol.Gen.Genetics,202:179-185。還可用聚乙二醇將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。參見Krens等人(1982)自然，296:72-74。另一種引入表達(dá)載體的方法是使用帶核酸的小顆粒的高速轟擊穿透法，其中核酸位于小珠或顆粒的基質(zhì)內(nèi)或位于表面。參見Klein等人(1987)自然327:70-73。
另一種引入植物的方法是將原生質(zhì)體與其他實(shí)體(或者是微細(xì)胞、細(xì)胞、溶酶體或者其他可融合的表面為脂質(zhì)的物體)進(jìn)行融合。參見Fraley等人，1982，美國科學(xué)院院報79,1859-1863。還可用電穿孔法將表達(dá)載體引入植物細(xì)胞。參見Fromm等人(1985)美國科學(xué)院院報82:5824。在這種技術(shù)中，植物原生質(zhì)體是在含表達(dá)載體的質(zhì)粒存在下進(jìn)行電穿孔。高電場強(qiáng)度的電脈沖可逆地使生物膜變得可滲透，從而使質(zhì)粒被引入。電穿孔的植物原生質(zhì)體會再形成細(xì)胞壁，分裂并再生。
花椰菜花葉病毒(CaMV)可用作將表達(dá)載體引入植物細(xì)胞的載體。參見Hohn等人(1982)Molecular Biology of Plant Tumors,Academic Press,New York,pp.549-560和Howell的美國專利No.4,407,956。典型地，CaMV病毒的DNA基因組被插入親代質(zhì)粒中，形成可在細(xì)菌中復(fù)制的重組DNA分子。在克隆之后，通過將所需序列引入質(zhì)粒的病毒部分中的唯一的限制性酶切位點(diǎn)，而進(jìn)一步修飾重組質(zhì)粒。再從親代細(xì)菌質(zhì)粒中切取重組質(zhì)粒中修飾過的病毒部分，然后用于接種植物細(xì)胞或植物。
最佳的將表達(dá)載體引入植物細(xì)胞的載體介導(dǎo)法，是將早已用基因轉(zhuǎn)化過的根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)用來感染植物細(xì)胞。在本領(lǐng)域已知的適當(dāng)條件下，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞會生長，形成芽或根，并進(jìn)一步發(fā)育成植物。通過使用根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒或毛根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒，可以將異源的遺傳序列轉(zhuǎn)入合適的植物細(xì)胞。在感染時，Ti或Ri質(zhì)粒被農(nóng)桿菌傳遞給植物細(xì)胞，并穩(wěn)定地整合入植物基因組中。參見J.Schell(1987)科學(xué)(Science),237:1176-1183和Hoekema等人(1983)，自然(Nature),303:179-189。所有的能夠被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化并能再生成完整植株的植物細(xì)胞，都可用本發(fā)明方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的、含有所需DNA的完整植物。參見Hooykas-Van Slogteren等人(1984)自然(Nature),311:763-764；de la Pena等人(1987)自然(Nature),325:274-276；Rhodes等人(1984)科學(xué)(Science)240:204-207；Shimamoto等人(1989)自然(Nature)338:274-276。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生出植株方法，在下列文獻(xiàn)中有描述Evans等人，Handbook of Plant Cell Culture,vol.1:(MacMillan Publishing Co.,NewYork,1983)；和Vasil I.R.(編輯),Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Acad.Press,Orlando,Vol.Ⅰ,1984和Vol.Ⅲ,1986。
某些合適的可以被本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物包括例如以下屬的物種草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、歐白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana屬、菊苣屬(Cichorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Hererocallis屬、Nemesia屬、天竺葵屬(Pelargonium)、黍?qū)?Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、Salpiglossis屬、香瓜屬(Cucumis)、Browaalia屬、大豆屬(Glycine)、黑麥草屬(Lolium)、玉蜀黍?qū)?Zea)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)、蘋果屬(Malus)、芹屬(Apium)、和曼陀羅屬(Datura)，包括甘蔗、甜菜、棉花、果樹和豆科植物。
制備和使用針對皮膚型多肽的抗體在一個例子中，提供了特異地結(jié)合于皮膚型多肽的抗體。產(chǎn)生的抗體可針對本發(fā)明的多肽，這些多肽包括個體、等位基因、品系、或物種的變異形式及其片段，或者處于天然存在(全長)形式或者處于處于重組形式。產(chǎn)生的抗體還可針對處于天然構(gòu)型和非天然構(gòu)型的多肽。還可產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。多種制備抗體的方法是技術(shù)人員已知的。技術(shù)人員知道，下列方法的許多變化形式是已知的。
a．制備抗體有許多免疫原可用于產(chǎn)生特異性地結(jié)合AFP的抗體。重組或合成的，長度為10個氨基酸或更長的，序列選自SEQ ID NO.1-6、9和15-30中皮膚型多肽的亞序列的多肽，是優(yōu)選的用于生產(chǎn)單克隆或多克隆抗體的多肽免疫原。一種特別優(yōu)選的多肽含有多肽亞序列MDAP。在一類優(yōu)選的例子中，免疫原性的肽偶聯(lián)物也可作為免疫原被包括在內(nèi)。天然存在的多肽也可以其純凈形式或非純凈形式使用。
重組多肽可在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化，或者用本文描述的技術(shù)直接從冬鰈魚中純化。接著，將多肽或其合成形式注入能夠產(chǎn)生抗體的動物。產(chǎn)生單克隆抗體或多克隆抗體以供以后使用，例如用于免疫分析以測定多肽的存在與否和數(shù)量多少。
產(chǎn)生多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。簡而言之，將免疫原，較佳地是純化的多肽、偶聯(lián)于適當(dāng)載體(如GST、匙孔血藍(lán)蛋白等)的多肽、或摻入免疫載體(如重組的痘苗病毒)的多肽(參見美國專利No.4,722,848)，與佐劑進(jìn)行混合，然后用混合物來免疫動物。動物對免疫原制劑的免疫應(yīng)答反應(yīng)，可通過采集血樣并測定與感興趣多肽的反應(yīng)性效價來加以監(jiān)測。當(dāng)獲得的針對免疫原的抗體效價較高時，可從動物收集血液并準(zhǔn)備抗血清。如果需要，可對抗血清進(jìn)一步分級純化，以富集與多肽反應(yīng)的抗體。參見例如Coligan(1991)Current Protocols inImmunology,Wiley/Greene,NY；以及Harlow和Lane(1989)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NY，這些文獻(xiàn)在此引用作為參考。
針對預(yù)定的皮膚型AFP片段的抗體，包括其結(jié)合片段和單鏈重組形式，可如上所述用例如該片段與載體蛋白的偶聯(lián)物來免疫動物而產(chǎn)生。通常，感興趣的免疫原是至少3個氨基酸的肽，更常見肽的長度為5個氨基酸，較佳地片段的長度為10個氨基酸，更佳地片段的長度為15個氨基酸或更長。肽可任選地偶聯(lián)于載體蛋白(如作為融合蛋白)，或者在免疫載體中進(jìn)行重組表達(dá)。被抗體結(jié)合的多肽上的抗原決定簇通常其長度為3-10個氨基酸。
除了多肽結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)AFP亞序列的非多肽融合配對物也是本發(fā)明的一個特征。脂類、修飾的多肽、碳水化合物和其他分子可任選地連接于本發(fā)明的AFP多肽亞序列，以便例如提高形成的融合分子的免疫原性，或者協(xié)助融合分子的純化。例如，可將親和素或生物素可添加于AFP，從而通過生物素與親和素的結(jié)合而協(xié)助融合分子的純化。類似地，抗體或抗體-配體可與AFP亞序列進(jìn)行融合，以便通過抗體與相應(yīng)配體的結(jié)合而進(jìn)行純化。將多肽亞序列融合于其他分子的許多重組或化學(xué)技術(shù)是已知的。
單克隆抗體可任選地從分泌所需抗體的細(xì)胞中制得。這些抗體可以根據(jù)與正常或修飾多肽的結(jié)合情況而加以篩選，或者根據(jù)促效或拮抗活性而加以篩選，例如有皮膚型AFP所介導(dǎo)的活性(比如熱滯后性)。特異性的單克隆抗體和多克隆抗體的結(jié)合常數(shù)KD通常至少約為0.01mM，更常見地至少約50μM，最佳地至少約1μM或更好。
在某些情況下，需要制備來自不同哺乳動物宿主的單克隆抗體，例如小鼠、嚙齒動物、靈長類動物、人等。有關(guān)制備這些單克隆抗體的技術(shù)的描述，可在下列文獻(xiàn)中找到Stites等人(編輯)Basic and Clinical Immunology(4版)LangeMedical Publication,Los Altos,CA及其引用的文獻(xiàn)；Harlow和Lane，同上；Goding(1986)Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2版)，AcademicPress,New York,NY；以及Kohler和Milstein(1975)自然(Nature)256:495-497。簡言之，該方法涉及用免疫原注射動物。然后殺死動物并從其脾臟中取出細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合。結(jié)果形成雜合細(xì)胞即雜交瘤，它能夠在體外復(fù)制。然后篩選雜交瘤群，以分離出各個克隆，每個克隆分泌一種針對免疫原的抗體品種。用這種方式，獲得的各抗體品種是無限增殖的并被克隆的單一B細(xì)胞的產(chǎn)物，它們是免疫動物對免疫原物質(zhì)上識別的特異位點(diǎn)作出應(yīng)答而產(chǎn)生的。
無限增殖化的其他方法包括用EB病毒、癌基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，或者用本領(lǐng)域中已知的其他方法。對單一無限增殖的細(xì)胞所產(chǎn)生的集落進(jìn)行篩選，以篩選是否產(chǎn)生對抗原有所需特異性和親和力的抗體，并可通過各種不同技術(shù)(包括注射入脊椎動物宿主的腹膜腔中)來提高這些細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的產(chǎn)率。本發(fā)明的多肽和抗體可以以修飾形式或非修飾形式使用，而且包括嵌合抗體如人源化鼠抗體。
其他合適的技術(shù)涉及重組抗體在噬菌體或類似載體中的文庫。參見Huse等人(1989)"Generation of a Large Combination Libray of the Immunoglobulin Repertoirein Phage Lambda"，科學(xué)(Science)246:1275-1281；和Ward等人(1989)自然(Nature)341:544-546。
經(jīng)常地，多肽和抗體可以通過共價地或非共價地連于提供可檢測信號的物質(zhì)上而被標(biāo)記。各種不同的標(biāo)記物和偶聯(lián)技術(shù)是已知的，并且在科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中廣泛報道。合適的標(biāo)記物包括放射性核苷酸、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光繁殖、化學(xué)熒光繁殖、磁性顆粒等。講授使用這些標(biāo)記物的專利包括美國專利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。同樣，還可產(chǎn)生重組的免疫球蛋白。參見Cabilly的美國專利No.4,816,567；和Queen等人(1989)美國科學(xué)院院報，86:10029-10033。
本發(fā)明的抗體還可用于分離皮膚型AFP的親和色譜，或者用于在生物混合物中鑒別出AFP。例如，可將抗體連于固相載體(比如顆粒如瓊脂糖、葡聚糖等)而制備柱，然后讓細(xì)胞裂解液通過柱，洗滌，并用濃度逐漸增加的柔和變性劑進(jìn)行處理，從而釋放出純化的AFP。
抗體可用于在表達(dá)文庫中篩選皮膚型AFP的表達(dá)產(chǎn)物。通常，用于這種程序的抗體是被其他分子標(biāo)記的，以便能夠通過抗體結(jié)合反應(yīng)而輕易地檢測出抗原存在。
針對AFP的抗體還可用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。這對于制備具有抗凍性能的抗體是有用的。
b．免疫分析可用各種不同的免疫分析方法來檢測或測定AFP，其中包括Western印跡法和ELISA分析。對于免疫學(xué)和免疫分析程序的綜述，可參見Stites和Terr(編輯)1991 Basic and Clinical Immunology(7版)。免疫分析可在多種形式下進(jìn)行，例如描述于下列文獻(xiàn)中的形式Maggio(編輯)(1980)Enzyme Immunoassay,CRCPress,Boca Raton,Florida；Tijan(1985)“酶免疫分析的實(shí)踐和理論”("Practice andTheory of Enzyme Immunoassays")Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam；Harlow和Lane同上；Chan(編輯)(1987)Immunoassay:A Practical Guide,Academic Press,Orlando,FL；Price和Newman(編輯)(1991)Principles and Practice of Immunoassays,Stockton Press,NY；和Ngo(ed.)(1988)Non-isotopic Immunoassay,Plenum Press,NY。
免疫分析還常使用標(biāo)記劑來特異性地結(jié)合于并標(biāo)記在由捕獲劑和分析物所形成的結(jié)合復(fù)合體。標(biāo)記劑本身可以是一種含有抗體/分析物復(fù)合體的分子。因此，標(biāo)記劑可以是標(biāo)記的AFP或標(biāo)記的抗AFP抗體。或者標(biāo)記劑可以是第三種分子，如另一種特異地結(jié)合于抗體/AFP復(fù)合體的抗體，或者該抗體可特異地結(jié)合于已共價地連于AFP或抗AFP抗體上的修飾捕獲基團(tuán)(如生物素)。
在優(yōu)選例子中，標(biāo)記劑是特異地結(jié)合于捕獲劑(抗AFP抗體)的抗體。這些試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，最典型地包括能特異結(jié)合于特定動物品種(捕獲劑衍生自該動物)的抗體的標(biāo)記抗體(例如抗獨(dú)特型抗體)。因此，例如當(dāng)捕獲劑是衍生自鼠的抗AFP抗體時，標(biāo)記劑可任選地是羊的抗-鼠IgG，即對鼠抗體恒定區(qū)特異的抗體。
能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的其他蛋白，如鏈球菌A蛋白或G蛋白，也可用作標(biāo)記劑。這些蛋白質(zhì)是鏈球菌細(xì)胞壁的正常組份。它們與許多物種的免疫球蛋白恒定區(qū)有強(qiáng)烈的非免疫反應(yīng)性。總體可參見Kronval，等人J.Immunol.,111:1401-1406(1973)，和Akerstrom等人J.Immunol.,135:2589-2542(1985)。
在這些分析中，孵育和/或洗滌步驟在每次與試劑混合后是需要的。孵育步驟通常為5分鐘至數(shù)小時，較佳地約為5分鐘-24小時。然而，孵育時間取決于分析方式、分析物、溶液體積、濃度等因素。通常，分析是在室溫下進(jìn)行，盡管也可在大范圍溫度內(nèi)如5-45℃下進(jìn)行。
c．產(chǎn)生用于免疫分析的混合抗血清特異地結(jié)合于抗體的AFP，或與該抗體特異地發(fā)生免疫反應(yīng)的AFP，可以在免疫分析中加以確定，其中該抗體是針對特定免疫原(如該免疫原的氨基酸序列選自SEQ ID NO.1-6、9和15-30中的氨基酸序列)而產(chǎn)生的。免疫分析使用多克隆抗血清，該抗血清針對序列表中多肽(免疫原性的多肽)的一種多肽的，較佳地針對sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2或11-3。該抗血清經(jīng)選擇，以便與其他AFP如肝臟型AFP的交叉反應(yīng)性較低，而且在用于免疫分析之前可通過免疫吸附而去除這樣的交叉反應(yīng)性(例如通過用肝臟型多肽如HPLC-6和HPLC-8對抗血清進(jìn)行免疫吸附)。
為了產(chǎn)生用于免疫分析的抗血清，如本文所述的那樣分離出列于SEQ ID NO.1-6、9和15-30的多肽中的一種多肽。例如重組的AFP，如sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2或11-3，可任選地細(xì)胞系中產(chǎn)生，或者從冬鰈魚皮膚中用實(shí)施例中所述的方法進(jìn)行分離?？捎眠x定的AFP和標(biāo)準(zhǔn)佐劑如Freund′s佐劑，從采用標(biāo)準(zhǔn)的小鼠免疫方案(參見Harlow和Lane，同上)對近交品系的小鼠如balb/c進(jìn)行免疫?；蛘?，將衍生自本文所公開序列的合成多肽偶聯(lián)至載體蛋白，然后將其用作免疫原。收集多克隆血清，然后在免疫分析中測定對免疫性多肽的效價，例如采用免疫原固定于固相載體上的固相免疫分析法。選擇效價為104或更高的多克隆抗血清，然后用競爭性結(jié)合免疫分析法測定它們與肝臟型AFP的交叉反應(yīng)性，比如用在Harlow和Lane(同上)第570-573中所述的方法。較佳地，在確定交叉反應(yīng)性時使用兩種肝臟型AFP(如HPLC-6和HPLC-8)以及一種以上的皮膚型AFP。與皮膚型AFP一起，可將肝臟型AFP用作競爭劑，以鑒別出能被皮膚型AFP特異性結(jié)合的抗體。這種競爭性抑制劑，可用如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)以重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)然后加以分離，或者用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從魚肝臟中分離得到。
在競爭性結(jié)合方式的免疫分析通?？捎糜诖_定交叉反應(yīng)性。例如，將免疫原性的多肽固定在固相載體上。加入到分析中的肝臟型AFP，就會與抗血清競爭與固定化抗原的結(jié)合。將肝臟型AFP與抗血清競爭結(jié)合于固定化蛋白的能力，與免疫原性多肽進(jìn)行比較。用標(biāo)準(zhǔn)計算方法，計算出百分?jǐn)?shù)表示的上述蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性。選擇與肝臟型AFP的交叉反應(yīng)性低于10％的抗血清，并混合。然后，通過用肝臟型AFP進(jìn)行免疫吸附，從混合的抗血清中除去會交叉反應(yīng)的抗體。
然后，如本文所述，將免疫吸附過的混合抗血清用于競爭性結(jié)合免疫分析，以便將第二種“靶”AFP與該免疫原性多肽進(jìn)行比較。為了進(jìn)行這種比較，兩種AFP都在大范圍的濃度下進(jìn)行分析，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定抑制50％抗血清結(jié)合于固定化蛋白時所需的每種多肽的數(shù)量。如果所需的靶多肽數(shù)量低于該免疫原性多肽所需數(shù)量的1/2，那么就認(rèn)為該靶多肽特異性地結(jié)合于該針對免疫原性的抗體。作為特異性的最終確定方法，將混合的抗血清用免疫原性多肽充分進(jìn)行免疫吸附，直至檢測不出與免疫吸附中所用多肽發(fā)生結(jié)合。接著，完全免疫吸附過的抗血清被用于測試待測多肽的反應(yīng)性。如果觀察不到反應(yīng)性，那么測試的AFP就是被免疫原性AFP所引發(fā)的抗血清特異結(jié)合。
熱滯后和相關(guān)測試可以用各種不同方法來分析本發(fā)明AFP對水溶液發(fā)生冰凍的影響。皮膚型AFP可改變冷凍后所形成的冰晶的大小，并改變水冰凍時的溫度，這兩者都是以濃度依賴型方式進(jìn)行的。因此，皮膚型AFP的活性通?？梢杂眠@兩種方法中的一種或兩種進(jìn)行測試。第一種測試方法是分析快速冰凍時冰晶尺寸的減小。這可以這樣進(jìn)行將一系列含有已知濃度AFP的稀釋水溶液滴在冷的金屬塊上，并測定形成的冰晶的大小，然后再使從金屬塊表面上刮下的冰晶再結(jié)晶。這就是例如Knight等人(1988)Cryobiology25:55-60；Knight和Dugman(1986)Cryobiology 23:256-262；Knight等人(1984)自然(Nature)308:295-296和Warren等人的美國專利No.5,118,792中所述的“驟冷(splat)”測試法。
測定皮膚型AFP活性的優(yōu)選方法，是測量含有AFP的水溶液的熱滯后現(xiàn)象(在融化溫度和凍結(jié)溫度之間的差值)。這可以這樣進(jìn)行制備一系列含有AFP的稀釋水溶液，然后逐漸冷卻溶液并監(jiān)測溶液的冰點(diǎn)。這通常用市售的專門用于該用途的設(shè)備如毫微升滲透壓計進(jìn)行。參見Kao等人(1986)Can.J.Zool.64:578-582。一種優(yōu)選的滲透壓計是Clifton毫微升滲透壓計(Clifon Technical Physics,Hartford,NY)。使用這種設(shè)備測量熱滯后的說明可從制造商處獲得。對于測量熱滯后的優(yōu)選程序，還可參見Chakrabartty等人(1989)J.Biol.Chem.264:11313-11316。
本發(fā)明AFP的用途如本文所述，本發(fā)明AFP以濃度依賴型方式降低水溶液的冰點(diǎn)。因此，本發(fā)明AFP通?？捎糜诒Ｗo(hù)溶液免受凍結(jié)。在延長了許多冷凍食物的保存期，使得食物更美味。在冷的粘性液態(tài)物如軟包裝的冰淇淋和冷凍酸乳的情況下，可用各種乳化劑來保持溶液中的液體組份。當(dāng)加入AFP時，AFP會在冷凍儲藏期抑制冰的重結(jié)晶，從而提高食物的質(zhì)感和可口程度。
表達(dá)本發(fā)明AFP的細(xì)胞比不表達(dá)AFP的相應(yīng)細(xì)胞更耐寒。這是因?yàn)榘麅?nèi)區(qū)室的冰點(diǎn)下降，因而防止了細(xì)胞脫水和滲透方面受破壞。因此，本發(fā)明的AFP可用于提高細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、植物和動物的耐寒性。這在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面具有許多有用的商業(yè)用途。例如，耐寒的植物在溫帶和北方氣候下能比對應(yīng)的植物有更長的生長期。這樣便可以提高產(chǎn)量，并保護(hù)免受未預(yù)計到的早霜。基本上每種在溫帶或北方氣候下生長的作物都可通過提高耐寒性而加以改良。具體地，諸如桔子、葡萄柚、檸檬和橘子之類的柑橘作物可以因耐寒性而受益，番茄、煙草、土豆、豆類等也可受益。
在一個優(yōu)選例子中，AFP在商業(yè)性養(yǎng)殖的魚如鯰魚和talipia中表達(dá)，從而提高這些魚的耐凍性。在這方面，AFP啟動子還可用于將表達(dá)的重組AFP導(dǎo)向一般動物的皮膚，尤其是魚類的皮膚。轉(zhuǎn)基因魚可通過微注射或電穿孔受精卵而產(chǎn)生。還可以使用魚精子電穿孔法。對于轉(zhuǎn)化魚技術(shù)的討論，可參見Fletcher等人(1988)Can.J.Fish Aquatic Sci.45:352-357；以及Gong和Hew(1995)“在水產(chǎn)養(yǎng)殖和發(fā)育生物學(xué)中的轉(zhuǎn)基因魚”("Transgenic Fish in Aquaculture andDevelopmental Biology"),Current Topic in Developmental Biology 30:178-214。
在一個優(yōu)選例子中，AFP在醫(yī)學(xué)上有價值的細(xì)胞系如雜交瘤細(xì)胞系中表達(dá)，以提高細(xì)胞系的耐凍性。
AFP還具有一定的抗菌性能，這提供又一種減少食物如表達(dá)AFP的重組水果和混合食品中不利細(xì)菌的方法。這改善了保質(zhì)期和食物質(zhì)量，并使這些產(chǎn)品能夠更安全地被消費(fèi)。
實(shí)施例下列提供的實(shí)施例僅用于闡述目的而不起限制作用。技術(shù)人員知道，許多無關(guān)緊要的參數(shù)可以被改變或修改，并產(chǎn)生基本相同的結(jié)果。
材料和方法在下面的實(shí)施例1-7中使用下列材料和方法。
皮膚型AFP的結(jié)構(gòu)分析-從反相HPLC中純化出的皮膚AFP被用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析。氨基酸分析和蛋白質(zhì)測序都由Biotechnology ServiceCentre,Hospital for Sick Children,Toronto進(jìn)行，而質(zhì)譜分析由CarbohydrateCentre,University of Toronto,Toronto進(jìn)行。對于氨基酸分析，樣品是在110℃，6N HCl中水解24小時，然后用Waters Picotag System設(shè)備進(jìn)行分析。因?yàn)镹端被甲硫氨酸封閉，所以皮膚AFP用溴化氰進(jìn)行預(yù)處理(5％甲酸中用200倍摩爾過量的溴化氰處理24小時)，然后在Porton Gas Phase Sequencer(氣相測序儀)進(jìn)行蛋白質(zhì)測序。
DNA測序--用17 DNA測序試劑盒，根據(jù)制造商的說明(Pharmacia,Montreal,Quebec,Canada)，通過雙脫氧核苷酸鏈中斷法進(jìn)行雙鏈DNA測序。每個克隆含有約240-300bp cDNA插入片段，從兩個末端開始，用SK和T7引物進(jìn)行測序，從而獲得完整的序列。
引物延伸--由Biotechnology Service Centre,Toronto合成一個22聚的寡核苷酸，5′-GGCTG GTGCG TCCAT GTTGA TG-3′(SEQ ID No.8)，該引物與sAFP(克隆S3)中ATG密碼子上游7個堿基開始的區(qū)域互補(bǔ)(圖5)。通過T4 DNA激酶，用y-32P-ATP標(biāo)記該寡核苷酸。引物延伸按Sambrook等人(1989)所述的方法進(jìn)行。
基因組Southern印跡雜交分析-用Blin等人(1976)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)3:2303-2308所述的方法，從來自一條魚的睪丸中分離出基因組DNA。簡而言之，約0.4克睪丸，用蛋白酶K在50mM Tris,pH8,100mM EDTA,0.5％SDS中于50℃消化過夜。用苯酚/氯仿對混合物進(jìn)行充分萃取。將水相在TE中進(jìn)行透析(10mM Tris,pH 8；1mM EDTA)，然后通過添加NaCl至濃度至0.1M以及2倍體積的乙醇而收集高分子量DNA。限制性消化后的基因組DNA，通過在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳而分離。將凝膠浸泡在0.4M氫氧化鈉，0.6M氯化鈉中30分鐘，然后印跡于位于相同溶液中的Hybond膜(Amersham)。雜交按以前所述的方法進(jìn)行(Gong等人，(1992)Can.J.Zool.70:810-814)。
Northern印跡雜交分析-得自選定組織的總RNA，按上述方式同樣抽提。按以前所述的方法(Gong等人，(1992)Can.J.Zool.70:810-814)，通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，然后進(jìn)行Northern印跡雜交分析。通過用ScanJet 3P(HewlettPackard)進(jìn)行放射自顯影的密度測量掃描并用計算機(jī)程序(NIH Image 1.52)進(jìn)行分析，從而估測AFP mRNA的相對水平。
實(shí)施例1來自皮膚刮消物的皮膚型AFP的分離和定性研究對皮膚型AFP用HPLC進(jìn)行純化，隨后進(jìn)行定性研究，以直接確定數(shù)種皮膚型AFP的蛋白質(zhì)組成和序列，并研究天然合成的皮膚型AFP的熱滯后性能。
從Conception海灣(Newfoundland,Candana)捕獲冬鰈魚(Pleuronectusamericanus)。取下數(shù)種組織，并冷凍在液氮中，儲藏于-70℃?zhèn)溆?。將冬鰈魚皮膚的刮削物(46克)，在500毫升0.1M碳酸氫銨中用Polytron勻漿器進(jìn)行勻漿。在低速離心后，上清液被凍干，再溶解并用Sephadex G75柱(2.5×80厘米)上，與0.1M碳酸氫銨進(jìn)行色譜分離。用毫微升滲透壓計測定的活性組份被混合，并在同樣的柱上再次進(jìn)行色譜分離。再純化后的物質(zhì)(約50-100毫克)，在Bondclone10 C18柱(Phenomenex,Torrance,CA)上，用0.5％三氟乙酸和乙腈梯度進(jìn)行進(jìn)一步分級?；旌细鹘M分，并凍干。
從皮膚刮削物分離出的AFP，其HPLC圖譜示于圖1。為了比較，還列出了用凝膠過濾色譜純化后的血清AFP的HPLC圖譜。血清AFP僅含有2種主要組份，即HPLC-6和HPLC-8(圖1A)。用氨基酸分析檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了HPLC-5、7和9(它們代表血清AFP的翻譯后形式和次要的血清AFP)之外，其他較早的洗脫峰都與AFP無關(guān)(Fourney等人(1984)Can.J.Zool.62:28-33)。然而，從皮膚刮削物分離出的AFP的HPLC圖譜則明顯更混雜，含有至少5-6種組份(圖1B)。主要的皮膚AFP被命名為sAFP1、sAFP2、sAFP3。因?yàn)槠つw刮削物受血液污染的緣故，HPLC-6*和HPLC-8*也出現(xiàn)在HPLC圖譜中(如下所述，HPLC-6*和HPLC-8*被證實(shí)是肝臟型AFP的主組份HPLC-6和HPLC-8)。此外，在HPLC中有數(shù)個早期的洗脫峰。這些早期洗脫峰有很小的抗凍活性。此外，對這些物質(zhì)的氨基酸分析表明，這些峰不明顯富含丙氨酸，因而沒有進(jìn)一步研究。HPLC-6*和HPLC-8*的保留時間分別與肝臟型AFP主組份HPLC-6和HPLC-8相同。隨后的氨基酸組份和蛋白質(zhì)程序分析證實(shí)，它們事實(shí)上分別是HPLC-6和HPLC-8，這表明皮膚樣品受到了血液的污染。
氨基酸分析表明，皮膚AFP也富含丙氨酸，它含有60.2％丙氨酸(與HPLC-6和HPLC-8的62.2％相當(dāng))。此外，皮膚AFP含有甲硫氨酸和脯氨酸，這兩種氨基酸殘基是血清AFP中沒有的。而且與HPLC-6和HPLC-8相比，皮膚AFP的亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸含量較低。一種皮膚AFP(sAFP1)含有組氨酸，而組氨酸在血清AFP中是沒有的。皮膚刮削物中氨基酸組成示于表1。
表1從鰈魚皮膚刮削物中分離出的抗凍多肽的氨基酸組成sAFP1 sAFP2 sAFP3 HPLC-6*HPLC-8*Asx4.98(1)2.10(1)1.60(2)3.42(4)22.77(5)Glx3.89(1)1.23(1)1.24(1)0.98(1)1.41(0)Ser0.64 - - 0.73(1)3.45(1)Gly0.88 0.11(1) - - -His2.50(1) - - - -Arg3.74(1)1.60(1)1.71(1)1.13(1)4.23(1)Thr6.67(3)2.44(2)2.77(3)2.12(3)12.0(4)Ala56.92(25) 30.10(26) 30.28(25) 19.69(23) 68.4(23)Pro3.76(1)1.19(1)1.35(1)0.20 1.71Val0.45 - - - -Met2.37(1)0.90(1)0.84(1) - -Leu1.53 0.22 -1.52(2)8.52(2) -Lys11.47(4) 2.78(3)3.40(5)0.58(1)5.3(1)(在括號內(nèi)的數(shù)字是用cDNA序列推導(dǎo)出的氨基酸殘基數(shù)目，HPLC-6*和HPLC-8*分別對應(yīng)于肝臟型HPLC-6和HPLC-8(參見Davies等人，(1982)；Pickett等人(1984)Eur.J.Biochem.143:35-38))與血清AFP(HPLC-6和HPLC-8)不同，皮膚AFP的N末端是被封閉的。用Atmospheric Pressure Ionization Mass Spectroscopy(大氣壓離子化質(zhì)譜儀)(API-MS)來分析，以確定封閉基團(tuán)的性質(zhì)。根據(jù)在下一章節(jié)中所述的其cDNA序列，這些多肽的Mr分別為3376.56、3480.61和3482.67。API-MS分析顯示，sAFP1、sAFP2和sAFP3相應(yīng)地有更大的Mr離子，分別為3419.06、3490.61和3525.41。該差值(+42Mr)與在N端添加一個?；窍喾?。此外，sAFP2還有一個較小的Mr為3366.87，這表明它受到了sAFP7(Mr為3324.46)的輕度污染。在用溴化氰切去N端的甲硫氨酸后，用蛋白質(zhì)程序法證實(shí)了氨基酸序列。與血清AFP相似，皮膚AFP也含有類似的蘇氨酸11個氨基酸的重復(fù)序列。
實(shí)施例2測定皮膚型AFP的抗凍活性皮膚型AFP的活性可用毫微升滲透壓計進(jìn)行測量?；旧习凑誄hakrabartty等人(1989)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264:11313-11316中的程序，測得的抗凍活性以熱滯后表示(融化溫度和冷凍溫度的差值)。將蛋白質(zhì)溶解在0.1M碳酸氫銨中，通過兩次氨基酸分析來確定其濃度。活性測量是用Clifton毫微升滲透壓計(Clifon Technical Physics,Hartford,NY)，對一系列每種蛋白質(zhì)濃度為0.1-7.0mM的稀釋液進(jìn)行的。在對每種蛋白質(zhì)進(jìn)行一系列測量之前，測量僅含緩沖液的3個樣品孔，將其平均值作為滯后的背景值。對于每個稀釋濃度，測量3個孔并取平均值。從該數(shù)值中減去滯后的背景值，從而獲得抗凍活性。
在圖3中，相對濃度而作出了皮膚型AFP的活性曲線是雙曲線，這與Ⅰ型AFP(Scott等人(1987)《歐洲生物化學(xué)雜志》Eur.J.Biochem.168:629-633；Chakrabartty等人(1989)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264:11313-11316；Wen等人(1992)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267:14102-14108)以及大多數(shù)其他魚類的AFP(Kao等人(1986)《加拿大動物學(xué)雜志》(Can.J.Zool.)64:578-582)中通常觀察到的情況相同。主要的血清AFP，即HPLC-6的活性曲線與早先用該蛋白的合成類似物(Chakrabartty等人(1989)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264:11313-11316)以及鰈魚血清的AFP混合物(Kao等人(1986)《加拿大動物學(xué)雜志》(Can.J.Zool.)64:578-582)所獲得的曲線相一致。
與之相反，從皮膚中分離出的AFP活性較低。在除了最低濃度(0.1mM)之外的所有測量濃度下，皮膚型AFP的活性都比血清AFP低，而且其活性曲線在比血清蛋白更低的濃度就到達(dá)了飽和平臺(圖3)。兩種皮膚AFP(sAFP2和sAFP3)的曲線基本上是一樣的，活性比HPLC-6的觀察值低一半。
實(shí)施例3皮膚AFP CDNA克隆的分離和定性；皮膚型AFP核酸與肝臟型探針的雜交對數(shù)種皮膚型AFP CDNA和基因組DNA進(jìn)行克隆，測序，和定性研究，以確定皮膚型基因和基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和組織關(guān)系。用一條魚(該魚是在冬天捕獲的)的含有鱗的皮膚組織和背鰭，通過最初由Chomczynski等人(1987)分析生物化學(xué)(Ahal.Biochem.)162:156-159提出并由Gong等人(1992)《加拿大動物學(xué)雜志》(Can.J.Zool.)70:810-814針對魚組織進(jìn)行改進(jìn)后的酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法分離總RNA。按Sambrook等人(1989)所述的方法，通過寡聚dT Separose對polyA+RNA進(jìn)行選擇。用Stratagene(La Jolla,CA)公司的λUni-ZAP XR載體系統(tǒng)構(gòu)建cDNA庫。用2微克polyA+RNA獲得約2.9×109個原始克隆。通過用肝臟cDNA克隆pkenc 17(圖7)進(jìn)行雜交而篩選皮膚型AFP的cDNA克隆，pkenc 17編碼最豐富的血清型AFP組份A(即HPLC-6)(Pickett等人(1984)《歐洲生物化學(xué)雜志》Eur.J.Biochem.143:35-38)。
當(dāng)小部分原始文庫用pkenc在低嚴(yán)緊度(0.3M Na+,55℃)下進(jìn)行篩選時，約20％克隆是陽性的，這表明AFP mRNA在皮膚中是豐富的。對14個獨(dú)立克隆進(jìn)行了完全測序，獲得了9個不同的DNA序列，它們編碼8種AFP，即sAFP1至sAFP8(圖4)。14個cDNA克隆被列在每種蛋白質(zhì)序列后的括號中。在嚴(yán)緊條件下，這些克隆基本上不與pkenc雜交。除了P12和S3有單個核苷酸替換情況之外，編碼相同sAFP的cDNA克隆都具有相同的核苷酸序列。
除了編碼額外C末端序列的P13和S6之外，所有的克隆相互之間有很高的序列相同性(91.7-99.2％)，與肝臟AFP DNA序列也有較高相同性(72.1-82.2％)。大多數(shù)皮膚AFP克隆編碼37-40個氨基酸殘基的短多肽，并有一種皮膚型AFP(sAFP8)具有54個殘基(圖4)。編碼的sAFP基本上相同，只有少數(shù)氨基酸差異，差異主要局限于多肽C末端的最后幾個殘基。此外，與編碼分泌型AFP的肝臟型AFP基因不同，皮膚型AFP基因編碼的是成熟的沒有pre序列和pro序列的多肽。
DNA序列比較表明，皮膚AFP克隆與早先鑒別出的兩個基因組序列F2和11-3(Davies等人(1992)Gene 112:171-178)密切相關(guān)。部分F2序列的示于圖5。11-3的序列與F2基本相同，在圖5中所示的區(qū)域僅有5個核苷酸改變和5個堿基缺失(Davies等人(1992)Gene 112:171-178)。因?yàn)樵趯?yīng)于肝臟AFP基因的前序列的5′上游區(qū)域中存在閱讀框內(nèi)的終止密碼子，并且在推定的啟動子區(qū)域中沒有典型的TATA盒，因此這兩個基因以前被認(rèn)為是假基因(Davies等人(1992)Gene112:171-178)。如圖4所示，sAFP2與“假基因”F2所編碼的蛋白質(zhì)相同，并且與11-3所編碼的蛋白質(zhì)僅差一個氨基酸。一個編碼sAFP2的克隆(S3)，與F2相比有2個核苷酸取代(圖5)。這些取代僅發(fā)生在3′非翻譯區(qū)。另一個編碼sAFP2的cDNA克隆(P12)也有在不同位置上的兩個核苷酸取代(數(shù)據(jù)未給出)。cDNA和基因組序列的排列顯示，在核苷酸167和168之間有一個內(nèi)含子。因此，現(xiàn)在確定F2和11-3都編碼皮膚和其他外周組織中的功能基因。
為了證實(shí)分離的克隆含有全長編碼序列并且標(biāo)出皮膚型AFP基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，進(jìn)行了引物延伸。用皮膚總RNA為模板時有2個主要的延伸產(chǎn)物。延伸是從S3(sAFP2)cDNA克隆的5′端起延伸17或18堿基對。用肝臟RNA為模板，僅對一個延伸產(chǎn)物(對應(yīng)于鱗中長延伸產(chǎn)物)進(jìn)行檢測。兩種延伸產(chǎn)物將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位于F2基因的130和131位堿基(圖5)。在第一個起始密碼子上游25個核苷酸處發(fā)現(xiàn)了推定的TFIID結(jié)合基序AATAAAT，這進(jìn)一步表明F2和11-3是功能基因。這些數(shù)據(jù)也證實(shí)了皮膚AFP克隆含有全長的編碼序列，并且沒有信號肽和pro序列。兩種延伸產(chǎn)物可能表示皮膚型AFP基因有2中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。或者，因?yàn)槲覀兪褂玫囊锟膳c全部皮膚型AFP基因雜交，所以兩種延伸產(chǎn)物可能是基因多態(tài)性的結(jié)果。
實(shí)施例4在基因組中有多拷貝的皮膚型AFP基因因?yàn)殍b別出9種皮膚AFP cDNA克隆，它們編碼8種不同的皮膚型AFP，所以很清楚這些皮膚型AFP基因?qū)儆谝粋€類似于肝臟型AFP基因的多基因家族。為了確定家族中的成員，進(jìn)行基因組印跡雜交分析。從一條魚的睪丸中分離出基因組DNA，用4種不同的限制性酶HindⅢ、EcoRⅠ、SstⅠ和BamHⅠ進(jìn)行切割。制備兩份相同的印跡，并用肝臟型(pkenc 17)和皮膚型(S3)AFP探針分別進(jìn)行探測。兩種探針都與多個條帶雜交。皮膚型探針識別大多數(shù)(如果不是全部)的肝臟型AFP片段，而肝臟型AFP探針僅與數(shù)目有限的DNA片段雜交。因?yàn)榇蠖鄶?shù)肝臟AFP基因是規(guī)則的串聯(lián)重復(fù)片段，而且大多數(shù)肝臟AFP片段含有多拷貝的AFP基因(可高達(dá)40個拷貝)，因此，與皮膚型探針發(fā)生的弱雜交也很可能產(chǎn)生強(qiáng)信號。還在Northern印跡分析中觀察到交叉雜交。另一種可能性是某些皮膚型AFP基因可能與肝臟型AFP基因是堆積在一起的。如用BamHⅠ消化的DNA中所得到的雜交模式所表明的那樣，其中皮膚型AFP基因信號被局限在兩個高分子量的片段(超過23kb)中，許多皮膚型AFP基因還可能是連鎖的。這些數(shù)據(jù)加上鑒別出至少9種不同的皮膚AFP cDNA序列，都明確地表明存在皮膚型AFP多基因家族。
肝臟型探針的雜交模式與早先出版的Scott等人的基因組雜交結(jié)果((1985)，美國科學(xué)院院報82:613-2617)相似，該文獻(xiàn)估計在冬鰈魚基因組中有約40個拷貝的AFP基因。這一估計沒有包括皮膚型AFP基因。通過比較皮膚和肝臟AFP DNA片段的雜交強(qiáng)度，皮膚型AFP基因的數(shù)目與肝臟型AFP基因數(shù)目基本相同。因此，皮膚型AFP基因在鰈魚基因組中含有30-40個拷貝。如本文所述，已有編碼8種不同AFP的9種不同的皮膚AFP cDNA克隆被分離和確定。在蛋白質(zhì)水平，至少有3種不同的抗凍多肽被反相HPLC所鑒別。
實(shí)施例5AFP轉(zhuǎn)錄物在組織中的分布AFP轉(zhuǎn)錄物在組織中的分布情況早已用肝臟cDNA探針在冬鰈魚中檢測過(Gong等人，(1992)《加拿大動物學(xué)雜志》(Can.J.Zool.)70:810-814)。因?yàn)殡s交是在較低嚴(yán)緊度下進(jìn)行的，因此由于交叉雜交反應(yīng)還會檢測到非肝臟型AFP轉(zhuǎn)錄物。在可獲得皮膚型AFP探針的情況下，用高嚴(yán)緊洗滌條件(0.015M氯化鈉，72℃)再次檢查AFP mRNA的組織分布情況。肝臟型和皮膚型cDNA克隆會交叉雜交的試驗(yàn)表明，這一洗滌條件可導(dǎo)致降低皮膚和肝臟基因之間的交叉雜交。從一條魚的選定組織中分離出總RNA，然后分別用皮膚和肝臟AFP探針進(jìn)行探測。在所有檢測的組織其中包括肝臟、胃、腸、心、脾、腎，都檢測到皮膚型AFPmRNA，而且在外部組織如皮膚、鱗、鰭和鰓中有高表達(dá)。這后四種組織表達(dá)皮膚型AFP mRNA的水平的相近，而其他組織的表達(dá)水平為這些外部組織的1-10％。因?yàn)锳FP cDNA克隆占皮膚cDNA庫中克隆的20％，所以AFP mRNA是在冬季所有組織中豐富的mRNA品種。在外部組織，AFP mRNA的水平異常地高。
兩種AFP mRNA可通過它們的大小來區(qū)分，因?yàn)楦闻K型AFP mRNA通常比皮膚型大，這是因?yàn)楦闻K型AFP基因含有編碼pre和pro序列的約132個額外核苷酸。在肝臟中，觀察到皮膚型探針與極豐富的肝臟型AFP mRNA(它占總RNA的約0.5-1％(Pickett等人(1983)Biochim.Biophys.Acta.739:97-104))有某些交叉雜交。然而，皮膚型AFP mRNA被清楚地檢測到。肝臟型AFP mRNA的表達(dá)限于肝臟和腸，以及胃中。為了比較AFP mRNA在肝臟和皮膚組織中的總水平，將含有肝臟、鱗和胃的總RNA的印跡，與肝臟和皮膚型AFP探針混合物進(jìn)行雜交，其中這兩種探針是被混合并在相同的反應(yīng)中被標(biāo)記以保證兩種探針有相同的比活。鱗AFP mRNA的水平是肝臟中水平的約10-20％，這表明皮膚和其他外部組織如鰓中也是合成AFP的主要部位。根據(jù)比較，胃主要表達(dá)皮膚型AFP mRNA，其水平為鱗中表達(dá)水平的約10％。
為了進(jìn)一步確定在肝臟中存在皮膚型AFP MrNA，采用皮膚AFP特異性寡核苷酸CATCA ACATG GACGC ACCAG CC(參見圖5中劃線部分，SEQ ID No.34)，進(jìn)行更特異的檢測方法即引物延伸。從肝臟RNA中檢測到清晰的延伸信號，它與來自鱗RNA的兩種主要延伸產(chǎn)物是相同的，這表明皮膚型AFP在肝臟中也存在。皮膚型AFP mRNA在肝臟中的相對水平，根據(jù)延伸信號強(qiáng)度和RNA的用量，估計被在鱗中(在鱗中皮膚型AFP基因的表達(dá)水平最高)觀察到水平低至少100倍。來自大西洋鮭魚(一種沒有AFP基因的物種)的肝臟RNA被用作對照。它沒有延伸產(chǎn)物，這表明所使用的引物有高特異性。
實(shí)施例6用細(xì)菌表達(dá)載體進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)提供sAFP2基因在細(xì)菌中的表達(dá)，作為一個例子。sAFP2的核苷酸序列示于SEQ ID No.17。
將Stratagene(La Jolla,CA,USA)提供的pET系統(tǒng)用作代表性的克隆系統(tǒng)表達(dá)載體。pET質(zhì)粒是在強(qiáng)原核轉(zhuǎn)錄信號，噬菌體T7啟動子，控制下的細(xì)菌表達(dá)載體。將靶基因克隆入pET質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，在該宿主細(xì)胞的染色體中以整合了T7 RNA聚合酶基因(宿主細(xì)胞可例如是市售的大腸桿菌菌株BL21DE3)。因?yàn)門7聚合酶基因在lac操縱子(lac UV5)控制之下，所以靶基因的表達(dá)可通過加入IPTG而進(jìn)行誘導(dǎo)。
為了最初以天然蛋白形式表達(dá)sAFP，基因被克隆在Stratagene公司pET3表達(dá)載體(該載體含有高效的核糖體結(jié)合位點(diǎn))的Ndel和BamHⅠ位點(diǎn)之間。合成兩個特異性的寡聚物，以便用于PCR以及將sAFP克隆人pET3中過程。5′-引物應(yīng)保證形成ATG密碼子，從而產(chǎn)生未融合的AFP蛋白。兩個寡聚核苷酸的序列如下5′寡聚核苷酸CATAT GGACG CACCA GCCAA AGCC(SEQ ID No.11)3′寡聚核苷酸GGATC CTTAA CGGGC TGCTC CGGC(SEQ ID No.12)這兩個寡聚物被用于PCR反應(yīng)。擴(kuò)增的在5′端含有Ndel位點(diǎn)和在3′端含有BamHⅠ位點(diǎn)的片段，用Ndel和BamHⅠ進(jìn)行酶切，再克隆入Ndel/BamHⅠ雙酶切過的pET3中。用常規(guī)的分子克隆技術(shù)(參見Sambrook和Ausbel，同上)來選擇重組質(zhì)粒。通過將IPTG加入到細(xì)菌培養(yǎng)基中，來實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)。一旦表達(dá)，細(xì)菌中的重組AFP就可用毫微升滲透壓計測量活性或者用抗AFP抗體進(jìn)行免疫印跡分析的方法加以檢測。
實(shí)施例7用真核表達(dá)載體進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)無數(shù)哺乳動物表達(dá)載體，主要是基于病毒啟動子如SV40早期啟動子、巨細(xì)胞病毒早期基因啟動子pCMV、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子的載體，可以購買得到(如Clontech,Palo Alto,CA).pCMV被作為例子用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)sAFP。pCMVβ載體含有病毒啟動子、內(nèi)含子(剪接供體/剪接受體)、SV40的聚腺苷酸化信號、和全長的帶有真核起始信號的大腸桿菌β半乳糖苷酶基因。該載體高水平地表達(dá)β-gal。攜帶β半乳糖苷酶基因的NotⅠ片段被sAFP2基因所替代。合成2個寡聚核苷酸，以便用于PCR以及將sAFP基因克隆入pCMV載體的過程(帶下劃線的核苷酸是NotⅠ酶切位點(diǎn))。
5′GCGGC CGCAT GGACG CACCA GCCAA AGCC(SEQ ID No.13)3′GCGGC CGCTT AACGG GCTGC TCCGG C(SEQ ID No.14)用已知方法如轉(zhuǎn)染或電穿孔法，將重組質(zhì)粒引入哺乳動物細(xì)胞。一旦轉(zhuǎn)錄，AFP的存在就可用毫微升滲透壓計測量活性或者用抗AFP抗體進(jìn)行免疫印跡分析的方法加以監(jiān)測。
實(shí)施例8表達(dá)胞內(nèi)抗凍融合蛋白用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白系統(tǒng)，在細(xì)菌中表達(dá)皮膚型AFP(Smith和Johnson(1988)《基因》(Gene)67,31-40)。將來自cDNA克隆S3的AFP DNA插入片段(EcoRⅠ和XhoⅠ片段)連入pGEX-2T(Pharmacia)的EcoRⅠ位點(diǎn)，從而制得表達(dá)構(gòu)建物pGST-AFPS3。在連接后用限制性酶切法和DNA測序法驗(yàn)證了閱讀框的正確性。
按以前所述的方法(Gong和Hew(1994)Biochem.33:15149-15158)，進(jìn)行GST融合蛋白的表達(dá)。簡而言之，將pGST-AFPS3轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。通過在OD600約為0.5的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.1mM，而誘導(dǎo)GST-AFP融合蛋白的表達(dá)。GST-AFP融合蛋白的存在可用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。
在IPTG誘導(dǎo)3小時后，收集表達(dá)GST-AFP融合蛋白的細(xì)菌，然后懸浮在15％蔗糖/50mM Tris,pH 8.3/2mM EDTA中。向懸浮液中加入溶菌酶至終濃度為5毫克/毫升。在室溫下孵育細(xì)菌5分鐘，加入Triton-X100至終濃度為1％，然后超聲波處理溶液1分鐘。在裂解滯后，加入氯化鎂和DNaseⅠ至終濃度分別為5mM和10微克/毫升。通過在微離心器(microfuge)中離心而使裂解物澄清。GST-AFP存在于可溶組份中，再用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱，按Smith和Johnson(1988)(同上)所述的方法與其他細(xì)菌蛋白分離開。
用毫微升滲透壓計測定，胞內(nèi)AFP的活性比胞外AFP低。為了說明胞內(nèi)AFP的較低活性是由于多肽結(jié)構(gòu)造成的，而不是例如蛋白質(zhì)分離或修飾而造成的，就對GST-AFP融合蛋白的活性進(jìn)行測定。sAFP和GST-AFP的活性是難以區(qū)分的，這暗示胞內(nèi)AFP的活性較低是由于它們的一級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，盡管與例如HPLC-6相比有類似的螺旋度。這還表明，本發(fā)明的AFP可與無關(guān)的蛋白合并形成融合分子如融合蛋白，而不會破壞融合分子中AFP結(jié)合域的抗凍活性。
按Chakrabartty等人(1989)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264:11307-11312中所述的方法，以熱滯后(融化溫度和凍結(jié)溫度之間的差值)形式測定抗凍活性。將蛋白質(zhì)溶解在0.1M碳酸氫銨中，通過兩次氨基酸分析來確定其濃度?；钚詼y量是用Clifton毫微升滲透壓計(Clifon Technical Physics,Hartford,NY)，對一系列每種蛋白質(zhì)濃度為0.1-7.0mM的稀釋液進(jìn)行的。在對每種蛋白質(zhì)進(jìn)行一系列測量之前，測量僅含緩沖液的3個樣品孔，將其平均值作為滯后的背景值。對于每個稀釋濃度，測量3個孔并取平均值，從該數(shù)值中減去滯后的背景值，從而獲得抗凍活性。
實(shí)施例9用圓二色性和熱變性研究皮膚AFP的熱穩(wěn)定性肝臟型的胞外AFP(HPLC-6)和皮膚型的胞內(nèi)AFP(sAFP2、sAFP3)兩者的二級結(jié)構(gòu)用圓二色性加以確定。早先的研究形式胞外AFP在低溫下是螺旋形的，這已被X光晶體衍射所證實(shí)(Ananthanarayan和Hew(1977)Biochem.Biophys.Res.Comm.74,685；Sicheri和Yang(1995)自然(Natute)375,427-431)。本實(shí)施例表明，胞外和胞內(nèi)的AFP的螺旋含量上是相近的(圖12,A-C以及表1)。在0℃時，與HPLC-6的71％螺旋度相比，sAFP2和sAFP3的螺旋度為61和67。螺旋度比在較高溫度下時低得多；在50℃時，兩種類型的AFP完全為隨機(jī)的卷曲。然而，在兩種AFP中，熱變性是可逆的(圖12,A-C)。
用Jasco J-600偏振儀測定圓二色性譜(CD譜)。使用水套式(0.1厘米)的石英槽(cell)。肽濃度根據(jù)230納米處的紫外吸收(OD230=6.1mM/L肽鍵)加以計算。用于測量CD的肽濃度為0.1-0.2毫克/毫升，并在0.1M碳酸氫銨，pH8.5中。通過在0-60℃范圍內(nèi)以每次改變5℃而測量肽的熱變性溫度。在測得60℃的CD后，將樣品冷卻至0℃并測定重新折疊的程度。在給定波長[q]下的平均殘留橢圓度用“度·cm2·dmol-1”表示。級分的螺旋度按Greenfield和Fasman(1969)Biochemistry8:4108-4116所述的方法進(jìn)行，并用222納米代替208納米。
每種肽在6.0M鹽酸胍，25℃時的橢圓度[q]222卷曲被假設(shè)為形成了0％螺旋，并且按J.T.Yang等人(1986)Method in Enzymology 130:208-269所述的方法計算出形成100％螺旋時的橢圓度[q]222卷曲:[q]n=[q]∞(1-k/n)；其中n是鏈長度，而k是波長依存因子(在222納米處時k=2.5，而[q]∞=-37,400度·cm2·dmol-1)
表1肝臟型和皮膚型AFP的熱穩(wěn)定性
a:在0℃,pH8.5,0.1M碳酸氫銨中測定b:當(dāng)級分的螺旋度為0.5時的溫度熱變性研究(圖13)顯示，兩種螺旋的AFP的Tm值相近。與sAFP3和HPLC-6的15.6℃相比，sAFP2稍低，為12℃(表1)。
實(shí)施例11冰結(jié)合基序大多數(shù)胞內(nèi)AFP缺少血清中AFP中的冰結(jié)合基序(ice binding motif，簡稱IBM)，比如冬鰈魚中的“-LT--N-”或“-T--D-”或杜父魚AFP中的“-KT--D-，取而代之的是僅含有蘇氨酸殘基(不完整的IBM)(還可參見(Sicheri和Yang(1995)自然(Nature)375:427-431)。然而，一種AFP即sAFP3確實(shí)含有推定的IBM,“-DT--K-”。為了將該IBM與血清AFP的其他IBM比較，并且為了確定其在皮膚型AFP結(jié)合冰時所起的作用，制備了一系列基于sAFP3結(jié)構(gòu)的合成肽(表2)。一種肽(1-IBM)是用sAFP3序列合成的，它含有單個完整的IBM。在其他肽中，對應(yīng)于完整IBM中Asp和Lys的殘基的具體位置被替換成Ala，以便產(chǎn)生型的IBM基序(圖14；表2)。將Ala置于1-IBM肽的IBM中對應(yīng)于D和K的位置上，從而合成不含有完整IBM的肽(0-IBM)。該肽的活性比1-IBM肽稍高，這表明沒有該IBM對抗凍性沒有影響(圖15)。含有2和3個IBM的肽類似物的活性比1-IBM肽稍差。這些肽用CD測定時其螺旋度也較低。
制備的肽類似物(521C)對應(yīng)于3-IBM序列，但是沒有天然的N端帽結(jié)構(gòu)。該肽的活性與3-IBM肽基本相同。注意，所提供的代表性修飾形式表明，可制備與天然的皮膚型AFP相似的肽并保留抗凍活性。
表2合成的和天然皮膚型抗凍多肽的氨基酸序列01BM MDAPAKAAAA TAAAAKAAAEA TAAAAAKAAAA TKAAAAR1IBM MDAPAKAAAA TAAAAKAAAEA TAAAAAKAAAD TKAKAAR2IBM MDAPAKAAAA TAAAAKAAAED TAAKAAKAAAD TKAKAAR3IBM MDAPAKAAAD TAAKAKAAAED TAAKAAKAAAD TKAKAARH521-C AAAAAKAAAD TAAKAKAAAED TAAKAAKAAAD TKAKAARSAFP2 MDAPAKAAAA TAAAAKAAAEA TAAAAAKAAAA TKAGAARSAFP2 DAPAKAAAA TAAAAKAAAEA TAAAAAKAAAD TKAKAAR0IBM是SEQ ID No.35；1IBM是SEQ ID No.36；2IBM是SEQ ID No.37；3IBM是SEQ ID No.38；H521-C是SEQ ID No.39；SAFP2是SEQ ID No.18；SAFP3是SEQ ID No.40。
實(shí)施例12肽合成在Hispital for Sick Children,Biotechnology Service Centre,Toronto，用Pharmacia-LKB-Biolynx 4170型自動肽合成儀(Pharmacia Biotech,Montreal,Quebec)，通過連續(xù)流Fmoc-化學(xué)法在NovaSyn KA 100樹脂上合成多肽(Sheppard(1983)Chem.Brit.19:402-414)。使用20％哌啶的DMF溶液來去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。對于每克樹脂(0.1nmol取代)，將4倍過量的用Fmoc-氨基酸(已用HATU和二異丙基乙基胺活化過，(1∶1∶2摩爾/摩爾/摩爾))(Carpino等人(1994)J.Chem.Soc.Chem.Commun.201-203,.Carpino等人，1994)用于偶聯(lián)反應(yīng)。反應(yīng)時間是1小時。
在合成之后，單獨(dú)用乙酸酐/二異丙基乙基胺(2∶1)，在室溫下處理1小時而使側(cè)鏈被保護(hù)的肽-樹脂偶聯(lián)物乙酰化。乙?；碾?樹脂偶聯(lián)物用DMF、二乙醚洗滌，并減壓干燥。干的肽-樹脂偶聯(lián)物用20毫升TFA(其中含有4毫升苯甲硫醚、0.4毫升m-teresol、2毫升1,2-乙二硫醇(etanedithiol)、3毫升乙基甲基硫醚和4毫升溴代三甲基硫化物和4毫升溴代三甲基硅烷)在0℃處理1小時。萃取出肽，溶解在0.1％TFA中，并在Sephadex G10柱上脫鹽。
肽的均一性，用μBondapak C18柱上反相HPLC法、氨基酸分析和常壓離子化質(zhì)譜分析法(API-MS(Carbohydrate Analysis Facility,University of Toronto))進(jìn)行分析。
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都在此引用作為參考，就如同每篇出版物和專利申請被具體地和單獨(dú)地指明全部在此引用作為參考。盡管為了清楚理解，上述的發(fā)明是以闡述和實(shí)施例的方式詳細(xì)描述的，但是對于知曉了本發(fā)明的的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，很明顯可以作出各種改變和改動，這些都落于所附權(quán)利要求的范圍或精神之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人NEW,ChoyGONG,Zhiyuan(ⅱ)發(fā)明名稱胞內(nèi)抗凍多肽和核酸(ⅲ)序列數(shù)目40(ⅳ)通信地址(A)收信人TOWNSEND AND TOWNSEND AND CREW LLP(B)街道Two Embarcadero Center,8th Floor(C)城市San Francisco(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵編94111-3834(ⅴ)計算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(ⅵ)本申請資料(A)申請?zhí)栁吹玫?B)申請日1997年1月23日(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/010,920(B)申請日1996年1月31日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Weber,Kenneth A.
(B)登記號31,677(C)參考/案卷號16252-0016-10(ⅸ)通訊信息(A)電話(415)576-0200(B)傳真(415)576-0300(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:
Met Asp Ala Pro1(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其他信息/注意點(diǎn)=“Xaa=Arg,Lys或Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號修飾位點(diǎn)(B)位置23(D)其他信息/注意點(diǎn)=“Xaa=Lys或Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號修飾位點(diǎn)(B)位置28(D)其他信息/注意點(diǎn)=“Xaa=Lys或Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號修飾位點(diǎn)(B)位置32(D)其他信息/注意點(diǎn)=“Xaa=Ala,Asp或無”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:
Met Asp Ala Pro Ala Xaa Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Xaa Ala Ala Ala Ala Xaa Ala Ala Ala Xaa20 25 30Thr(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:
Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:
Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:
Thr Xaa Xaa Asx Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
CTCAGAATCA CTGACATCAA AATGGACGCA CCAGCC36(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:
GGCTGGTGCG TCCATTTTGA TGTCAGTGAT TCTGAG36(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:
Met Asp Ala Pro Ala1 5(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:
GGCTGGTGCG TCCATGTTGA TG22(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:
CATATGGACG CACCAGCCAA AGCC24(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:
GGATCCTTAA CGGGCTGCTC CGGC24(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:
GCGGCCGCAT GGACGCACCA GCCAAAGCC29(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:
GCGGCCGCTT AACGGGCTGC TCCGGC 26(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度241堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號CDS(B)位置33…146(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP1(S4)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:ACTGTCGACC ACTCAGAATC ACTGACATCA AC ATG GAC GCA CCA GCC AGAGCC53Met Asp Ala Pro Ala Arg Ala1 5GCC GCA GCC ACC GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCA GAA GCC ACCAAA101Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr Lys10 15 20GCC GCA GCC GCC AAA GCA GCA GCT GCC ACC AAA GCC GCA GCC CAT146Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Ala Ala His25 30 35TAATGATCGT GGTCGTCTTG ATGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCGAGATGTTACC 206AATCTGCTGA ATAAACCTGA GAAGCTGTTT GTTGA241(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:
Met Asp Ala Pro Ala Arg Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Lys Ala Ala Ala His35(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度248堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號CDS(B)位置37…153(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP2(S3)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:TTTCACTGTC GACCACTCAG AATCACTGAC ATCAAC ATG GAC GCA CCA GCCAAA54Met Asp Ala Pro Ala Lys40GCC GCC GCA GCC ACC GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCA GAA GCCACC102Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr45 50 55 60GCC GCC GCA GCT GCC AAA GCA GCA GCC GCC ACC AAA GCC GGA GCAGCC150Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Gly Ala Ala65 70 75CGT TAATGATCGT GGTCGTCTTG ATGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCG203ArgAGATGTTACC AATCTGCTGA ATAAACCTGA GAAGCTGTTT GTTGA248(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Lys Ala Gly Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度240堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號CDS(B)位置30…146(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP3(P9)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:GTCGAACACT CAGAATCACT GACATCAAC ATG GAC GCA CCA GCC AAA GCCGCC53Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala40 45GCA GCC ACC GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCA GAA GCC ACC GCCGCC101Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala50 55 60GCA GCC GCC AAA GCA GCA GCC GAC ACC AAA GCC AAA GCA GCC CGT146Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp Thr Lys Ala Lys Ala Ala Arg65 70 75TAAGGATCGT GGTCGTCTTG ATGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCGAGATGTTACC 206AATCTGCTGA ATAAACCTGA GAAGCTGTTT TTTA240(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:
Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp20 25 30Thr Lys Ala Lys Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度262堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號CDS(B)位置30…146(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP4(P7)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:GTCGACCACT CAGAATCACT GACATCAAC ATG GAC GCA CCA GCC AAA GCCGCC53Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala40 45GCA GCC ACC GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCA GAA GCC ACC GCCGCC101Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala50 55 60GCA GCT GCC AAA GCA GCA GCC GCC ACC AAA GCC GGA GCA GCC CAT146Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Gly Ala Ala His65 70 75TAATGATCGT GGTCGTCTTG ATGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCGAGATGTTACC 206AATCTGCTGA ATAAACCTGA GAAGCTGTTT GTTGAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAA 262(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:
Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Lys Ala Gly Ala Ala His35(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度247堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號CDS(B)位置39…152(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP5(S2)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23CTTTTCACTG TCGACCACTC AGAATCACTG ACATCAAC ATG GAC GCA CCAGCC 53Met Asp Ala Pro Ala40AAA GCC GCC GCA GCC ACC GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCA GAAGCC101Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala45 50 55 60ACC AAA GCC GCA GCC GCC AAA GCA GCA GCT GCC ACC AAA GCC GCAGCC149Thr Lys Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Ala Ala65 70 75CAT TAATGATCGT GGTCGTCTTG CTGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCG202HisAGATGTTACC AATCTGCTGA ATAAACCTGA GAAGCTGTTT GTTGA247(2)SEQ ID NO:24的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度38氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:
Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Lys Ala Ala Ala His35(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度228堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號CDS(B)位置20…133(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP6(L4)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:CAGAATCACT GACATCAAC ATG GAC GCA CCA GCC AAA GCC GCC GCA GCCACC 52Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr40 45GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCA GAA GCC ACC GCC GCC GCA GCTGCC 100Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala50 55 60 65AAA GCA GCC GCC ACC AAA GCC GGA GCA GCC CGT TAATGATCGTGGTCGTCTTG 153Lys Ala Ala Ala Thr Lys Ala Gly Ala Ala Arg70 75ATGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCG AGATGTTACC AATCTGCTGAATAAACCTGA 213GAAGCTGTTT GTTGA228(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Thr20 25 30Lys Ala Gly Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度245堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征
(A)名稱/分類符號CDS(B)位置34…150(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP7(S9)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:CACTGTCGAC CACTCAGAAT CACTGACATC AAC ATG GAC GCA CCA GCCGCC GCC 54Met Asp Ala Pro Ala Ala Ala40 45GCC GCA GCC ACA GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCC GAA GCC ACCGCA102Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala50 55 60GCT GCC GCA GCC AAA GCA GCA GCC GCC ACC AAA GCC GCA GCA GCCCGT150Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Ala Ala Ala Arg65 70 75TAAGGATCGT GGTCGTCTTG CTGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCGAGATGTTACC 210AATCTGCTGA ATAAACCTGA GAAGCTGTTT GTTTA 245(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Met Asp Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Lys Ala Ala Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度292堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/分類符號CDS(B)位置36…197(D)其他信息/產(chǎn)物=“sAFP8(S6)”TTCACTGTCG AACACTCAGA ATCACTGACA TCAAC ATG GAC GCA CCA GCCGCC 53Met Asp Ala Pro Ala Ala40 45GCC GCC GCA GCC ACC GCC GCC GCC GCC AAG GCC GCC GCA GAA GCCACC101Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Thr50 55 60GCA GCT GCC GCA GCC GCA GCC GCC GCA GCC ACT GCC GAA GCC GCCGCC149Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ala65 70 75AAA GCA GCC GCC GCC ACC AAA GCC GCA GCC GCC GCA GCC GCC GCCCGT197Lys Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg80 85 90TAAGGATCAT CGTCGTCTTG CTGTGGGATC ATGTGAACAT CTGAGCAGCGAGATGTCACC 257AATCTGTTGA ATAAAGCTGA GAAGCTGTTT GTTTA292(2)SEQ ID NO:30的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度54氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Met Asp Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Ala Ala35 40 45Ala Ala Ala Ala Ala Arg50(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1287堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:TTACAAAACA AGTTCATACT GGATGGTTGC CACACCTTCC TGTTGATGTGAACCAGTCGG 60AGCCGACGCC CTGCTGCGTC ACGAAATCAA AGTGAATAAA TAGAGGCTGCTCCCTAAAAG 120TTTTCATCAG GACTCAAACA CTTTTCACTG TCGACCACTC AGGTACGTGAACACTCACTT 180TGTTTCTCAT ACAAATCTGG TTTTACTGTA AATATCTTGG GAAGGAAGGAAGGATATCTG 240CATTATCCTG AGGGGCCATT TGTTTTACAG CCAGCGGTGA AAGATGAAGATCTTCATCCA 300TGTTCGTCTG ATGGAAAGTT TGTTCTGAAA CCTTCAGTGG AAGAAACAGATTCATGTCTT 360CAGGCTTAAA CCTGCAAAAA TCTGAGCTCT GTTAAATCAT GGGAAACAACTTTTTAATTC 420AGTCAGGGCT GGAAAACTAT TTTATATGCA CAGAAGAAGA AGAAGTGATCTTTAGTTCAT 480CACCATGGAA ACATCATCAG CAGTTAAAGT CTGTCTGCTT CAGTATCACCGGCCAGTTCC 540AGTGCTCATG TTTCTGATCA GCTTGGTTTG AATGATATAA AAACGGATTGAGTGCCTGTT 600TGACCCTGTT TAACACAAGA TTGGACGCAT GGACCATCTT TATTTACATAATGTTTTACA 660TCAGCACTTC CTGTTTTCAG CCCTAAACTT AAAGAGGCCT CATGGAAACTTCCTGATGAT 720CTGGTGACAC CTGCTGGTTG AAGGAAACAG AGTTTGAGAG GCAGCAGAAAAAATGATTTT 780AGTTTGAATG AAGAAGCTGT CATTTTATTT TATATTTGGA GGGGGGGGGGGGGGGATCAC 840CACACACAGA TATTGAACAC TGTCATCACT GGGTTCGGTG AAAGTGAAGAACCAGTACAT 900GTTGTGATAT ATAATATTAT CATAATAATT ATAATTAATA CCATTAATCTCTGCAGAATC 960ACTGACATCA ACATGGACGC ACCAGCCAAA GCCGCCGCAG CCACCGCCGCCGCCGCCAAG 1020GCCGCCGCAG AAGCCACCGC CGCCGCAGCT GCCAAAGCAG CAGCCGCCACCAAAGCCGCA 1080GCAGCCCGTT AATGATCGTG GTCGTCTTGA TGTGGGATCA TGTGAACATCTGAGCAGCGA 1140GATGTTACCA ATCTGCTGAA TAAACCTGAG AAGCTGTTTG TTTAAAACCAAGTGTCCTGT 1200TCATTTCATC TCTGAAACTC ATTCACAGTT TCTGTAGATC ATGTTTTATTTTGTTCAGA 1260CGATGTTGAA CTGGATCAGA ATCCAGA1287(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1236堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:TTACAAAACA AGTTCATACT GGCCTGGATG GTCGCCACAC CTTCCTGTTGATGTGAACCA60GTCGGAGCCG ACGCCCTGCT GCGTCACAAA ATCAAAGTGA ATAAATAGAGGCTGCTCCCT 120AAAAGTTTTC ATCAGGACTC AAACACTTTT CACTGTCGAC CACTCAGGTACGTGAACACT 180CACTTTGTTT CTCTTACAAA TTTGTTTTAC TGTAAATATC TTGGGAAGGAAGGAAGGATA 240TCTGCATTAT CCGAGGGGCC ATTTGTTTTA CAGCCAGCGG TGAAAGATGAAGATCTTCAT 300CCGTGTTCGT ATGATGGAAA GTTTGTTCTG AAACCTTCAT TGGAAGAAACAGATTCATGT 360GTTCAGGCTT AAACCTGCAA AAATCTGAGC TCTGTTAAAT CATGGGAAACAACTTTATAA 420TTCAGTCAGG GCTGGAAAAC TCTTTTATAT GCACAGAAGA AGAAGAAGATGTGATCTTTA 480GTTCATCACC ATGGAAACAT CATCAGCAGT TAAAGTCTGT CTGCTTCAGTATCACCGGCC 540AGTTCCAGTG CCTGTTTGAC CCTGTTTAAC ACAAGATGGC CACCTGGACCATCTTTATTT 600ACATAATGTT TTACATCAGC ACTTCCTGTA TTCAGCCCTA AACTTAAAGAGGCCTCACTT 660CCTGATGATC TGGTGACACC TGCTGGTTGA AGGAAACAGA GTTTGAGAGGCAGCAGAACA 720AATGATTTTA GTTTGAATGA AGAAGCTGTC ATTTGATTTT ATGTTTGGAGGGGGGGGGGG 780GGGGGATCAC CACACACAGA TATTGAACAC TGTCATCACT GAGTTCGGTGAAAGTGAAGA 840ACCAGTACAT GTTGTGATAT ATAATATAAT CATAATAATT ATAATAATACCATTAATCTC 900TGCAGAATCA CTGACATCAA CATGGACGCA CCAGCCAAAG CCGCCGCAGCCACCGCCGCC 960GCCGCCAAGG CCGCCGCAGA AGCCACCGCC GCCGCAGCTG CCAAAGCAGCAGCCGCCACC 1020AAAGCCGGAG CAGCCCGTTA ATGATCGTGG TCGTCTTGAT GTGGGATCATGTGAACATCT 1080GAGCAGCGAG ATGTTACCAA TCTGCTGAAT AAACCTGAGA AGCTGATTGTTAAAAACCAA 1140GTGTCCTGTT CATTTCATCT CTGAAAGTCC GTCACAGTTT CTGTAGATCATGTAGACTCC 1200AGGAAGTGAT GCCATTGTGC TGTTGAACCT GCAGGG 1236(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)長度322堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:ACCACATCTT CATTTTGTAG TGAACCAGTG CTCCCTACAA GTTCTCAAAATGGCTCTCTC60ACTTTTCACT GTCGGACAAT TGATTTTCTT ATTTTGGACA ATGAGAATCACTGAAGCCAG 120CCCCGACCCC GCAGCCAAAG CCGCCCCAGC AGCAGCTGCC GCCCCTGCCGCAGCCGCCCC 180AGACACCGCC TCTGACGCCG CCGCTGCAGC CGCCCTTACC GCCGCCAATGCCGCCGCCGC 240CGCCAAACTC ACCGCCGACA ACGCCGCCGC CGCCGCAGCA GCCACCGCCAGAGGTTAAGG 300ATCGTGGTCG TCTTGATGTG GG 322(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:
CATCAACATG GACGCACCAG CC 22(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Lys Ala Ala Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp20 25 30Thr Lys Ala Lys Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Asp Thr Ala Ala Lys Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp20 25 30Thr Lys Ala Lys Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:Met Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Asp Thr Ala Ala Lys Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Asp Thr Ala Ala Lys Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp20 25 30Thr Lys Ala Lys Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp Thr Ala Ala Lys Ala Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Glu Asp Thr Ala Ala Lys Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp20 25 30Thr Lys Ala Lys Ala Ala Arg35(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:
Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala1 5 10 15Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp Thr20 25 30Lys Ala Lys Ala Ala Arg3權(quán)利要求
1．一種分離的皮膚型胞內(nèi)抗凍多肽及其保守的修飾形式，其特征在于，該多肽含有N端的MDAP亞序列；該多肽含有內(nèi)部AATAAAAKAAA亞序列；該多肽不含有信號序列；該多肽誘導(dǎo)水溶液的冰點(diǎn)發(fā)生濃度依賴型下降。
2．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽的分子量約為3400道爾頓。
3．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽具有N端的MDAPA序列。
4．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽的長度約為35-55個氨基酸。
5．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽含有序列MDAPAX1AAAATAAAAKAAAEATX2AAAAX2AAAX3T；其中X1選自R、K和A；X2選自K和A；以及X3選自A、D和一個鍵。
6．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽選自sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3。
7．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽結(jié)合于扣除的多克隆抗體的混合物，其中該扣除的多克隆抗體是針對sAFP抗體而產(chǎn)生的并用HPLC-6多肽進(jìn)行扣除。
8．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該分離的多肽是水溶液的組份。
9．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽用圓二色性測定有約60-70％的螺旋。
10．如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽是融合蛋白。
11．一種分離的皮膚型胞內(nèi)抗凍多肽及其保守的修飾形式，其特征在于，它是由一編碼核酸所編碼的，該編碼核酸在0.015M氯化鈉，72℃的高嚴(yán)緊洗滌條件下的Northern印跡分析中，與選自sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3的皮膚型抗凍核酸雜交，而且該編碼核酸在0.015M氯化鈉，72℃的高嚴(yán)緊洗滌條件下基本上不雜交于pkenc 17核酸，而且該皮膚型抗凍多肽誘導(dǎo)水溶液的冰點(diǎn)發(fā)生濃度依賴型下降。
12．如權(quán)利要求11所述的分離的多肽，其特征在于，該多肽選自sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3。
13．一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有皮膚型抗凍核酸，該皮膚型抗凍核酸編碼皮膚型多肽，其中，該多肽含有N端的MDAP亞序列；該多肽含有內(nèi)部AATAAAAKAAA亞序列；該多肽不含有信號序列；以及該多肽誘導(dǎo)水溶液的冰點(diǎn)發(fā)生濃度依賴型下降。
14．如權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體，其特征在于，該皮膚型抗凍核酸編碼序列MDAPAX1AAAATAAAAKAAAEATX2AAAAX2AAAX3T；其中X1選自R、K和A；X2選自K和A；以及X3選自A、D和一個鍵。
15．如權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體，其特征在于，該皮膚型抗凍核酸選自sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3。
16．一種表達(dá)載體，其特征在于，它編碼第一皮膚型胞內(nèi)抗凍核酸，該抗凍核酸是第一核酸，第一核酸在0.015M氯化鈉，72℃的高嚴(yán)緊洗滌條件下的Northern印跡分析或Southern印跡分析中，可與選自sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7、sAFP8、F2和11-3的第二皮膚型抗凍核酸雜交，而且該第一編碼核酸在相同的洗滌條件下基本上不雜交于pkenc 17核酸，并且該第一核酸編碼抗凍多肽，該抗凍多肽誘導(dǎo)水溶液的冰點(diǎn)發(fā)生濃度依賴型下降。
17．如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體編碼的核酸選自對應(yīng)于下組的核酸sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7和sAFP8。
18．一種表達(dá)載體，其特征在于，它編碼一核酸，該核酸選自對應(yīng)于下組的核酸sAFP1、sAFP2、sAFP3、sAFP4、sAFP5、sAFP6、sAFP7和sAFP8，或它們的保守修飾形式。
19．一種重組細(xì)胞，其特征在于，它含有異源的皮膚型抗凍核酸，該核酸編碼皮膚型抗凍多肽，其中該多肽含有N端的MDAP亞序列；該多肽含有內(nèi)部AATAAAAKAAA亞序列；以及該多肽誘導(dǎo)水溶液的冰點(diǎn)發(fā)生濃度依賴型下降。
20．如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞表達(dá)皮膚型抗凍多肽。
21．如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞表達(dá)皮膚型抗凍多肽，而且該細(xì)胞耐寒。
22．如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
23．如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是原核細(xì)胞。
24．如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞，而且該細(xì)胞是在動物中。
25．如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞，而且該細(xì)胞是在植物中。
26．一種使水性組合物耐凍結(jié)的方法，其特征在于，它包括步驟向組合物中加入足夠量的皮膚型抗凍多肽，從而改變組合物的熱滯后，其中該皮膚型抗凍多肽含有N端的MDAP亞序列和內(nèi)部AATAAAAKAAA亞序列，以及該多肽不含有信號序列。
27．如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，加入皮膚型抗凍多肽的步驟是在細(xì)胞中進(jìn)行，其中通過用編碼皮膚型抗凍多肽的核酸來轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后在細(xì)胞中表達(dá)抗凍多肽，從而將皮膚型抗凍多肽加入到細(xì)胞中。
28．一種抗體，其特征在于，它特異性地結(jié)合于皮膚型抗凍多肽，而且該抗體不結(jié)合于肝臟型抗凍多肽。
29．一種重組的皮膚型啟動子，其特征在于，該皮膚型啟動子包括在冬鰈魚的皮膚中指導(dǎo)核酸高水平表達(dá)的核酸，其中該啟動子在嚴(yán)緊條件下雜交于選自下組的核酸11-3基因編碼序列的5′序列、11-3基因編碼序列的3′序列，F(xiàn)2基因編碼序列的5′序列、和F2基因編碼序列的3′序列。
30．如權(quán)利要求29所述的皮膚型啟動子，其特征在于，該啟動子包含在嚴(yán)緊條件下可雜交于選自下組的內(nèi)含子的核酸11-3基因和F2基因的內(nèi)含子。
31．如權(quán)利要求29所述的皮膚型啟動子，其特征在于，該啟動子包含選自下組的核酸亞序列GAATAAAT；CATCAGGACT CAAACACTTT TCACTGTCGACCACTCAG；CTGCAAAA和AATAAAA。
32．如權(quán)利要求29所述的皮膚型啟動子，其特征在于，該啟動子是核酸亞序列GAATAAAT；CATCAGGACT CAAACACTTT TCACTGTCGA CCACTCAG；CTGCAAAA和AATAAAA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一族相關(guān)的胞內(nèi)皮膚型抗凍多肽和相應(yīng)的編碼核酸。它們是目前報道的第一批皮膚型胞內(nèi)抗凍多肽及其編碼核酸。這些多肽在冬鰈魚的皮膚中天然表達(dá),還提供了皮膚型特異性啟動子。這些多肽可用于產(chǎn)生耐寒的細(xì)胞、提高冷凍食物和飲料的美味。用這些皮膚型胞內(nèi)抗凍多肽和核酸可制備耐寒的真核和原核生物,包括植物、動物和細(xì)菌。
文檔編號C07K14/46GK1215430SQ97193403
公開日1999年4月28日 申請日期1997年1月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月31日
發(fā)明者C·丘, 宮知遠(yuǎn) 申請人:Hsc研究發(fā)展合伙有限公司