專利名稱：環(huán)脂肽物的脫?；椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到酶技術(shù)。
具體地講，本發(fā)明涉及使環(huán)狀脂肽物的?；鶄?cè)鏈脫?；男滦王；敢约坝盟M(jìn)行脫?；姆椒?。
進(jìn)一步講，本發(fā)明涉及由微生物Co1eophoma sp.F-11899株(FERM BP-2635)所產(chǎn)生的、使FR901379物質(zhì)(特開(kāi)平3-184921號(hào)公報(bào)記錄)及其類似物的?；鶄?cè)鏈脫?；男滦王；?，以及用該酶進(jìn)行脫酰化的方法。
背景技術(shù)：
需要能夠使環(huán)脂肽物，具體而言，需要能夠使上述FR901379物質(zhì)及其類似體的?；鶄?cè)鏈有效脫?；孽；?。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的發(fā)明者們?yōu)榱说玫侥軌蚴笷R901379物及棘白菌素B，棘孢曲菌素A等FR901379物的類似體為代表的環(huán)脂肽物的酰基側(cè)鏈脫?；男滦王；高M(jìn)行了大量研究。結(jié)果他們新發(fā)現(xiàn)一種微生物環(huán)圈鏈霉菌(Streptomyces anulatus)產(chǎn)生的?；福皇褂行У剡M(jìn)行目的脫?；蔀榭赡?。
以下說(shuō)明該新型環(huán)狀脂肽?；讣坝迷撁高M(jìn)行脫?；椒ǖ奶卣?。
首先，對(duì)本發(fā)明環(huán)狀脂肽?；傅纳a(chǎn)菌進(jìn)行說(shuō)明。
具體而言新型環(huán)狀脂肽酰基酶的生產(chǎn)菌為鏈霉菌屬的環(huán)圈鏈霉菌No.4811株、環(huán)圈鏈霉菌No.8703株或鏈霉菌屬類6907株。
以下為這些菌株的特征。
命名為環(huán)圈鏈霉菌No.4811的新型環(huán)狀脂肽?；傅纳a(chǎn)菌菌株(以后略稱為No.4811)是從福島縣采集的土壤樣品中新分離出的。以下為No.4811的菌學(xué)性狀。各種培養(yǎng)基上的特征No.4811株在酵母浸膏-麥芽浸膏瓊脂、燕麥粉瓊脂、無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂、甘油-天冬酰胺瓊脂、蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂及酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)14天后在光學(xué)和掃描電鏡下觀察到的發(fā)育特征列在表1。參照1978年的Methuen Handbook of Colour,Methuen,London的命名法對(duì)顏色進(jìn)行命名。
表1 No.4811株在各種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的特征培養(yǎng)基培養(yǎng)性狀酵母浸膏-麥芽浸膏瓊脂 G良好(ISP-2) A豐富、黃灰色(2B2)R茶色(7F4)S少量、茶色燕麥粉瓊脂G良好普通(ISP-3) A豐富、黃灰色(2C3)R茶色(7F4)S微量、茶色無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂 G良好(ISP-4) A豐富、黃灰色(2C3)R黃茶色(5E4)S無(wú)甘油-天冬酰胺瓊脂 G良好(ISP-5) A豐富、黃灰色(2C3)R茶色(6E4)S無(wú)蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂G普通(ISP-6) A貧乏、白色R亮茶色(6D5)S無(wú)酪氨酸瓊脂G普通(ISP-7) A普通、黃灰色(2B2)R茶色(7F4)S無(wú)省略代號(hào)；G生長(zhǎng)A氣菌絲R生長(zhǎng)里面的色S可溶性色素氣菌絲的顏色從黃灰色到綠色，生長(zhǎng)里面的色從黃茶色到茶色，可溶性色素為淺茶色，菌體內(nèi)色素及可溶性色素均非pH敏感性。未見(jiàn)到類黑素的產(chǎn)生。生理學(xué)特征No.4811株的生理學(xué)特征總結(jié)在表2中。表2 No.4811株的生理學(xué)特征條件 性質(zhì)生長(zhǎng)溫度范圍 4.0-35.0℃明膠液化 +乳凝固 ±乳蛋白胨化 +淀粉分解 +類黑素產(chǎn)生 -碳源利用性D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 +肌醇 -甘露醇 +D-果糖 +L-鼠李糖 ±蔗糖 -棉子糖 -+陽(yáng)性±弱陽(yáng)性-陰性No.4811株的營(yíng)養(yǎng)菌絲發(fā)育良好，有不規(guī)則分枝但無(wú)斷裂。從營(yíng)養(yǎng)菌絲延伸長(zhǎng)出的氣菌絲呈單純分枝，形成長(zhǎng)的孢子鏈。氣菌絲的形狀為直狀、曲狀，按Pridham等(Pridham,T.G等實(shí)用微生物學(xué)(Appl.Microbiol).6:54,1958)屬于RF型。一個(gè)孢子鏈由20個(gè)以上的孢子構(gòu)成。孢子的表面光滑，0.5～0.7×0.7～1.1μm大小，呈圓柱型。
未觀察到菌核、孢子囊、游走孢子。細(xì)胞壁類型依照Becker等(Becker,BM.P.Lechevalier,R.E.Gordon and H.A.lechevalier通過(guò)整個(gè)細(xì)胞水解物的紙層析來(lái)快速區(qū)分諾卡菌屬和鏈霉菌屬實(shí)用微生物學(xué)，12:421-423,1964)、山口(Yamaguchi,T.形態(tài)獨(dú)特放線菌的細(xì)胞壁組分的比較細(xì)菌學(xué)雜志，89:444-453,1965)等的方法，對(duì)全菌體的分解物進(jìn)行分析，結(jié)果表明細(xì)胞壁的氨基酸中存在LL-二氨基庚二酸，因此認(rèn)為該菌株的細(xì)胞壁類型為I型。
從以上的形態(tài)觀察及化學(xué)分析的結(jié)果來(lái)看，若按Pridham等(Pridham,T.G.等實(shí)用微生物學(xué)，6:54,1958)的分類，No.4811株屬于鏈霉菌屬。在這里將該菌株與文獻(xiàn)Shirling等(Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。2．研究1的種類描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。18:69-189,1968；Shirling,E.B.和D.GottIieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。3．研究1和2其它種類的描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。18:279-392,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。4．研究2、3和4的種類描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。19:391-512,1969)Skerman等(Skerman,V.BV.McGowan andP.H.A.Sneath統(tǒng)一細(xì)菌名單。修改版。美國(guó)微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)。華盛頓特區(qū)。1989及Moore等(Moore,W.EE.P.Cato andL.V.H.Moore細(xì)菌和酵母分類變化索引。美國(guó)微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)。華盛頓特區(qū)；1992)中記載的鏈霉菌屬進(jìn)行了比較。結(jié)果所記載的環(huán)圈鏈霉菌的性質(zhì)與本株的性質(zhì)基本一致。鑒于此，確定No.4811株為環(huán)圈鏈霉菌，命名為環(huán)圈鏈霉菌No.4811。
該環(huán)圈鏈霉菌No.4811株于平成7年12月27日以FERM P-15377保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵區(qū)305茨城縣筑波市東1-1-3)，后又根據(jù)布達(dá)佩斯條約于平成9年2月3日以FERM BP-5808轉(zhuǎn)移保藏。
命名為環(huán)圈鏈霉菌No.4811株的新型環(huán)脂肽?；傅纳a(chǎn)菌菌株(以下略稱作No.8703)是從福島縣采集的土壤樣品中新分離出的。以下為No.8703株的菌學(xué)性狀。各種培養(yǎng)基上的特征No.8703株在酵母浸膏-麥芽浸膏瓊脂、燕麥粉瓊脂、無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂、甘油-天冬酰胺瓊脂、蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂及酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)14天后在光學(xué)和掃描電鏡下觀察到的發(fā)育特征總結(jié)在表3中。參照1978年的Methuen Handbook of Colour,Methuen,London的命名法對(duì)顏色進(jìn)行命名。
表3 No.8703株在各種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的特征培養(yǎng)基培養(yǎng)性狀酵母浸膏-麥芽浸膏瓊脂 G良好(ISP-2) A豐富、黃灰色(2B2)R灰茶色(5F4)S無(wú)燕麥粉瓊脂G普通(ISP-3) A豐富、黃灰色(2C3)R灰茶色(4C4)S無(wú)無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂 G良好(ISP-4) A豐富、黃灰色(2C3)R暗灰色(1F6)S無(wú)甘油-天冬酰胺瓊脂 G良好(ISP-5) A豐富、黃灰色(2C3)R茶青色 (4E5)S無(wú)蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂G普通(ISP-6) A貧乏、白色R黃茶色(5D5)S無(wú)酪氨酸瓊脂G普通(ISP-7) A普通、黃灰色(2B2)R茶色(7F4)S無(wú)省略代號(hào)；G生長(zhǎng)A氣菌絲R生長(zhǎng)里面的色S可溶性色素氣菌絲的顏色從黃灰色到綠色，生長(zhǎng)在里面的色從黃茶色到茶色，可溶性色素為淺茶色，菌體內(nèi)色素及可溶性色素均無(wú)pH敏感性。在胰蛋白胨-酵母浸膏肉湯、蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂及酪氨酸瓊脂上可看到類黑素。生理學(xué)特征No.8703株的生理學(xué)特征總結(jié)在表4中。表4 No.8703株的生理學(xué)特征條件 性質(zhì)生長(zhǎng)溫度范圍 4.0-35.0℃明膠液化 +乳凝固 ±乳蛋白胨化 +淀粉分解 +類黑素產(chǎn)生 -碳源利用性D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 +肌醇 -甘露醇 +D-果糖 +L-鼠李糖 +蔗糖 -棉子糖 -+陽(yáng)性±弱陽(yáng)性-陰性該菌株未利用肌醇、蔗糖和棉子糖。乳蛋白胨化。生長(zhǎng)發(fā)育的溫度范圍為4.0-35℃。
No.8703株的營(yíng)養(yǎng)菌絲發(fā)育良好，有不規(guī)則的分枝但無(wú)斷裂。從營(yíng)養(yǎng)菌絲延伸長(zhǎng)出的氣菌絲呈單純分枝，形成長(zhǎng)的孢子鏈。氣菌絲的形狀為直狀、曲狀，按Pridham等(Pridham,T.G等實(shí)用微生物學(xué)(Microbiol.6:54,1958)的分類屬于RF型。一個(gè)孢子鏈由20個(gè)以上的孢子組成。孢子表面光滑，呈圓柱型。孢子的大小為0.5～0.8×0.6～1.1μm。未觀察到菌核、孢子囊及游走孢子。細(xì)胞壁類型依照Becker等(Becker,BM.P.Lechevalier,R.E.Gordon and H.A.lechevalier通過(guò)整個(gè)細(xì)胞水解物的紙層析來(lái)快速區(qū)分諾卡菌屬和鏈霉菌屬實(shí)用微生物學(xué)，12:421-423,1964)、山口(Yamaguchi,T.形態(tài)獨(dú)特放線菌的細(xì)胞壁組分的比較細(xì)菌學(xué)雜志，89:444-453,1965)等的方法，對(duì)全菌體的分解物進(jìn)行分析，結(jié)果表明細(xì)胞壁的氨基酸中存在LL-二氨基庚二酸，因此認(rèn)為該菌株的細(xì)胞壁類型為I型。
從以上的形態(tài)觀察及化學(xué)分析的結(jié)果來(lái)看，若按Pridham等(Pridham,T.G.等實(shí)用微生物學(xué)，6:54,1958)的分類，No.8703株屬于鏈霉菌屬。在這里將該菌株與文獻(xiàn)Shirling等(Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。2．研究1的種類描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。18:69-189,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。3．研究1和2其它種類的描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。18:279-392,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。4．研究2、3和4的種類描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。19:391-512,1969)Skerman等(Skerman,V.BV.McGowan andP.H.A.Sneath統(tǒng)一細(xì)菌名稱表。修改版。美國(guó)微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)。華盛頓特區(qū)。1989及Moore等(Moore,W.EE.P.Cato andL.V.H.Moore細(xì)菌和酵母命名變化索引。美國(guó)微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)。華盛頓特區(qū)；1992)中記載的鏈霉菌屬進(jìn)行了比較。結(jié)果所記載的環(huán)圈鏈霉菌的性質(zhì)與本株的性質(zhì)基本一致。鑒于此，確定No.8703株為環(huán)圈鏈霉菌，命名為環(huán)圈鏈霉菌No.8703。
該環(huán)圈鏈霉菌No.8703株于平成8年3月8日以FERM P-15507保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵區(qū)305茨城縣筑波市東1-1-3)，后又根據(jù)布達(dá)佩斯條約于平成9年2月3日以FERM BP-5810轉(zhuǎn)移保藏。
命名為環(huán)圈鏈霉菌No.6907株的新型環(huán)狀脂肽?；傅纳a(chǎn)菌菌株(以下略稱作No.6907)是從福島縣采集的土壤樣品中新分離出的。以下為No.6907株的菌學(xué)性狀。各種培養(yǎng)基上的特征No.6907株在酵母浸膏-麥芽浸膏瓊脂、燕麥粉瓊脂、無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂、甘油-天冬酰胺瓊脂、蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂及酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)14天后在光學(xué)和掃描電鏡下觀察到的發(fā)育特征總結(jié)在表5中。參照1978年的Methuen Handbook of Colour,Methuen,London的命名法對(duì)顏色進(jìn)行命名。
表5 No.4811株在各種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的特征培養(yǎng)基 培養(yǎng)性狀酵母浸膏-麥芽浸膏瓊脂 G良好(ISP-2)A豐富、黃灰色(白4A2)R灰橙色(5B6)S無(wú)燕麥粉瓊脂 G普通(ISP-3)A豐富、青灰色(22C2)R亮茶色(4D4)S無(wú)無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂G良好(ISP-4)A豐富、青灰色(19C2)R茶色(6F4)S無(wú)甘油-天冬酰胺瓊脂 G良好(ISP-5)A豐富、青灰色(22B2)R赤味茶色(8E4)S無(wú)蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂 G普通(ISP-6)A無(wú)R灰茶色(9F3)S褐色酪氨酸瓊脂 G良好(ISP-7)A普通、黃白色(4A2)R暗品紅色(13F3)S褐色省略代號(hào)；G生長(zhǎng)A氣菌絲R生長(zhǎng)里面的色S可溶性色素氣菌絲的顏色從黃灰色到青灰色，生長(zhǎng)在里面的色從亮茶色到茶色，菌體內(nèi)色素?zé)opH敏感性。在胰白胨-酵母浸膏肉湯、蛋白胨-酵母浸膏-鐵瓊脂及酪氨酸瓊脂上可看到類黑素。生理學(xué)特征No.6907株的生理學(xué)特征總結(jié)在表6中。表6 No.6907株的生理學(xué)特征條件性質(zhì)生長(zhǎng)溫度范圍9.0-40.0℃明膠液化 +乳凝固 +乳蛋白胨化 -淀粉分解 +類黑素產(chǎn)生 +碳源利用性D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 +肌醇 +甘露醇 +D-果糖 +L-鼠李糖 +蔗糖 +棉子糖 ++陽(yáng)性±弱陽(yáng)性-陰性該菌株利用了試驗(yàn)中所有的碳源肌醇、蔗糖和棉子糖。未進(jìn)行乳蛋白胨化。生長(zhǎng)發(fā)育的溫度范圍為9.0-40.0℃。
No.6907株的營(yíng)養(yǎng)菌絲發(fā)育良好，有不規(guī)則分枝但無(wú)斷裂。從營(yíng)養(yǎng)菌絲延伸長(zhǎng)出的氣菌絲呈單純分枝，形成長(zhǎng)的孢子鏈。氣菌絲的形狀為直狀、曲狀或不完整的環(huán)狀，按Pridham等(Pridham,T.G等實(shí)用微生物學(xué)(Appl.Microbiol).6:54,1958)屬于RF或RA型。一個(gè)孢子鏈由20個(gè)以上的孢子構(gòu)成。孢子的表面光滑，0.5～0.7×0.7～1.3μm大小，呈圓柱型。未觀察到菌核、孢子囊、游走孢子。細(xì)胞壁類型依照Becker等(Becker,BM.P.Lechevalier,R.E.Gordon and H.A.lechevalier通過(guò)整個(gè)細(xì)胞水解物的紙層析來(lái)快速區(qū)分諾卡菌屬和鏈霉菌屬實(shí)用微生物學(xué)，12:421-423,1964)、山口(Yamaguchi,T.形態(tài)獨(dú)特放線菌的細(xì)胞壁組分的比較細(xì)菌學(xué)雜志，89:444-453,1965)等的方法，對(duì)全菌體的分解物進(jìn)行分析，結(jié)果表明細(xì)胞壁的氨基酸中存在LL-二氨基庚二酸，因此認(rèn)為該菌株的細(xì)胞壁類型為I型。
從以上的形態(tài)觀察及化學(xué)分析的結(jié)果來(lái)看，若按Pridham等(Pridham,T.G.等實(shí)用微生物學(xué)，6:54,1958)的分類，No.6907株屬于鏈霉菌屬。在這里將該菌株與文獻(xiàn)Shirling等(Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。2．研究1的種類描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。18:69-189,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。3．研究1和2其它種類的描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。18:279-392,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb鏈霉菌類的典型培養(yǎng)物的合作描述。4．研究2、3和4的種類描述。國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志。19:391-512,1969)Skerman等(Skerman,V.BV.McGowan andP.H.A.Sneath統(tǒng)一細(xì)菌名稱表。修改版。美國(guó)微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)。華盛頓特區(qū)。1989及Moore等(Moore,W.EE.P.Cato andL.V.H.Moore細(xì)菌和酵母命名變化索引。美國(guó)微生物學(xué)聯(lián)合會(huì)。華盛頓特區(qū)；1992)中記載的鏈霉菌屬進(jìn)行了比較。結(jié)果未能鑒定到種。鑒于此，將該菌命名為鏈霉菌類No.6907。
該鏈霉菌類No.6907株于平成8年3月8日以FERM P-15506保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵區(qū)305茨城縣筑波市東1-1-3)，后又根據(jù)布達(dá)佩斯條約于平成9年2月3日以FERM BP-5809轉(zhuǎn)移保藏。
該發(fā)明中所講“環(huán)狀脂肽物”指含有多肽環(huán)，該環(huán)上側(cè)鏈含有“?；被?，該物質(zhì)也可有其它的側(cè)鏈。
該“環(huán)狀脂肽物”的代表例為FR901379物質(zhì)，該物質(zhì)是微生物Coleophoma sp.F-11899株(FERM BP-2635)產(chǎn)生的。具有抗真菌活性的已知物(特開(kāi)平3-184921號(hào)公報(bào)記載)，具有下面的結(jié)構(gòu)式〔Ⅰa〕。

此外，F(xiàn)R901379的類似體是下面普通式〔Ⅰ〕中所示的化合物或其鹽類。

〔式中，R1為酰基，R2為羥基或酰基氧基，R3為氫或羥基，R4為氫或羥基，R5為氫或羥基磺酰基氧基，R6為氫或氨基甲酰基〕該發(fā)明的新型環(huán)狀脂肽?；甘擎溍咕鷮俚募?xì)菌產(chǎn)生的酰基酶，它能使環(huán)狀脂肽物側(cè)鏈的“酰氨基”脫?；纬伞鞍被?，具體地講它能使物質(zhì)FR901379或其鹽的棕櫚酰側(cè)鏈或者使含有物質(zhì)FR901379、上述普通式〔Ⅰ〕中所示的FR901379類似體或其鹽的酰基側(cè)鏈脫?；?，從而形狀環(huán)狀肽物質(zhì)，具體地講形成下面結(jié)構(gòu)式〔Ⅱa〕中所示的化合物(FR179642物質(zhì))或其鹽或

表含有物質(zhì)FR179642如下面普通式〔Ⅱ〕所示的FR179642類似體或其鹽。

〔式中R2、R3、R4、R5及R6代表與前面相同的基團(tuán)〕。
化合物〔Ⅰ〕和〔Ⅱ〕的優(yōu)選鹽為常規(guī)應(yīng)用的單鹽或二鹽，金屬鹽如堿金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽等)，堿土類金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽等)，銨鹽，具有有機(jī)堿的鹽(例如三甲胺鹽，三乙胺鹽，吡啶鹽，甲基吡啶鹽，二環(huán)己胺鹽，N,N′-二芐基乙烯二胺鹽等)，有機(jī)酸加成鹽(如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟醋酸鹽，馬來(lái)酸鹽，酒石酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽等)，無(wú)機(jī)酸加成鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)，氨基酸(如精氨酸，天冬氨酸、谷氨酸)等的鹽。
優(yōu)選的“低級(jí)烷基”是含有1～6個(gè)碳原子的直鏈或分枝狀烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基。其它優(yōu)選含1～4個(gè)碳原子的烷基，最優(yōu)選甲基。
優(yōu)選的“高級(jí)烷基”包括碳原子數(shù)為7～20的直鏈或分枝狀烷基，如庚基、辛基、3,5-二甲基辛基、3,7-二甲基辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，十七烷基，十八烷基，十九烷基和二十烷基。
優(yōu)選的“低級(jí)烷氧基”包括直鏈或分枝狀的烷氧基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，丁氧基，異丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，叔戊氧基，新戊氧基，己氧基和異己氧基。
優(yōu)選的“高級(jí)烷氧基”包括直鏈或分枝狀的烷氧基，如庚氧基，辛氧基，3,5-二甲基辛氧基，3,7-二甲基辛氧基，壬氧基，癸氧基，十一烷氧基，十二烷氧基，十三烷氧基，十四烷氧基，十六烷氧基，十七烷氧基，十八烷氧基，十九烷氧基，二十烷氧基等。
優(yōu)選的“芳香基”包括任選含有低級(jí)烷基的苯基(如苯，苯基，甲苯基等)、萘基和蒽基等。
優(yōu)選的“酰胺基”或“?；钡孽；糠职ㄓ婶人幔妓?，氨基甲酸或硫酸衍生的脂肪酰基，芳香酰基、雜環(huán)?；⒎枷慊脫Q的脂肪?；?，雜環(huán)置換的脂肪?；?。
優(yōu)選的“?；卑ǖ图?jí)鏈烷酰基(如甲?；?，乙?；?，丙酰基，丁?；?，異丁?；?，戊酰基，己?；挛祯；?，它可有1個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1～3個(gè))合適的替代物，如芳香基(例如苯基，萘基，蒽基等)，而該基團(tuán)可有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1～3)適合的替代物如鹵素(例如氟、氯、溴、碘等)、羥基、所講高級(jí)烷氧基、所講芳香基等；所講低級(jí)烷氧基；氨基酸；保護(hù)氨基酸〔優(yōu)選的酰胺如低級(jí)烷氧基羰基氨基(例甲氧羰基氨基、乙氧羰基氨基、丙氧羰基氨基、丁氧羰基氨基、叔丁氧羰基氨基、戊氧羰基氨基、己氧羰基氨基等)等〕；二(低級(jí))烷基氨基(例如二甲基氨基、N-甲基乙氨基、二乙氨基、N-丙基丁氨基、二戊氨基、二己氨基等)；低級(jí)烷氧亞氨基(例如甲氧亞氨基、乙氧亞氨基、丙氧亞氨基、丁氧亞氨基、叔丁氧亞氨基、戊氧亞氨基、己氧亞氨基等)；芳香(低級(jí))烷氧亞氨基(例如芐氧亞氨基、苯基乙氧亞氨基，二苯甲基氧亞氨基等)如苯基(低級(jí))烷氧亞氨基。該基團(tuán)有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3)適合的替代物如所講高級(jí)烷氧基；雜環(huán)硫基(優(yōu)選吡啶硫基)，具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3個(gè))優(yōu)選的取代基，知高級(jí)烷基(例庚基、辛基、2-乙基己烷、壬基、癸基、3,7-二甲基辛基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、3-甲基-10-乙基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等)；雜環(huán)基團(tuán)(例如噻吩基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、四唑基、噻唑基、噻二唑基等)、它具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3個(gè))合適的取代基，如胺、上述保護(hù)胺、上述高級(jí)烷基等等；高級(jí)鏈烷酰基(例如庚?；?、辛?；?、壬酰基、癸?；⑹煌轷；?、十二烷?；⑹轷；?、十四烷酰基、十五烷?；?、棕櫚?；?0,12-二甲基十四烷?；?、十七烷酰基、十八烷?；⑹磐轷；?、二十烷?；?；低級(jí)鏈烯?；?例如丙烯酰基、甲基丙烯酰基、丁烯?；?、3-戊烯酰基、5-己烯?；?，可含有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3)優(yōu)選的取代基，如所講芳香基，它可任選地含有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3)優(yōu)選的取代基如所講高級(jí)烷氧基等；高級(jí)鏈烯?；?例如4-庚烯酰基，3-辛烯酰基，3,6-癸烯?；?，3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷烯?；?，4,10-十七烷烯酰基，等)；低級(jí)烷氧碳酰基(例甲氧碳?；?，乙氧碳?；?，丙氧碳?；⊙跆减；宥⊙跆减；?，戊氧碳?；?，己氧碳酰基等)；高級(jí)烷氧羰基(例庚氧羰基，辛氧羰基，2-乙基己氧羰基，壬氧羰基，癸氧羰基，3,7-二甲基辛氧羰基，癸氧羰基，十二烷氧羰基，十三烷氧羰基，十四烷氧羰基，十五烷氧羰基，3-甲基-10-乙基十二烷氧羰基，十六烷氧羰基，十七烷氧羰基，十八烷氧羰基，十九烷氧羰基，二十烷氧羰基等)；芳香基氧羰基(例苯氧羰基，萘氧羰基等)；芳香基乙醛?；?例苯基乙醛酰基、萘基乙醛?；?；可以含一個(gè)或多個(gè)取代基的芳香(低級(jí))烷氧羰基，例如有硝基或低級(jí)烷氧基取代基的苯基烷氧羰基(例芐氧羰基，苯基乙氧羰基，對(duì)一硝基芐氧羰基，對(duì)-甲氧基芐氧羰基等)；低級(jí)烷基磺酰基(例甲基磺酰基，乙基磺酰基、丙基磺酰基，異丙基磺?；?、戊基磺酰基、丁基磺酰基等)；芳基磺酰基(例如苯基磺?；⑤粱酋；?，它可含有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3)優(yōu)選的取代基，如所講低級(jí)烷基、所講高級(jí)烷氧基等等；芳香基(低級(jí))烷基磺?；?例如芐基磺?；?、苯乙基磺?；?、二苯甲基磺?；?，例如苯(低級(jí))烷基磺?；患胺减；?例如芐?；?、萘?；⑤祠驶?，它可有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-5)優(yōu)選的取代基，如所講鹵素；低級(jí)烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基等)；所講高級(jí)烷基；低級(jí)烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等)，它可有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-10)合適的取代基，如所講的低級(jí)烷氧基、所講的鹵素、芳香基等等；高級(jí)烷氧基(例如庚氧基、辛氧基、2-乙基己氧基、壬氧基、癸氧基、3,7-二甲基辛氧基、十一烷氧基、十二烷氧基、十三烷氧基、十四烷氧基、十五烷氧基、3-甲基-10-乙基十二烷氧基、十六烷氧基、十七烷氧基、十八烷氧基、十九烷氧基、二十烷氧基等等)，它們含有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-17)優(yōu)選的取代基，如上述鹵素等等；高級(jí)鏈烯氧基(如3-庚烯氧基，7-辛烯氧基、2,6-辛二烯氧基、5-壬烯氧基、1-癸烯氧基、3,7-二甲基-6-辛烯氧基、3,7-二甲基-2,6-辛二烯氧基、8-十一烯氧基、3,6,8-十二三烯氧基、5-十三烯氧基、7-十四烯氧基、1,8-十五-戊-十二烯氧基、15-十六烯氧基、11-十七烯氧基、7-十八烯氧基、10-十九烯氧基、18-二十烯氧基等)；羧基；上述芳香基可含有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3)合適的取代基，如上述高級(jí)烷氧基等；芳氧基(例如苯氧基、萘氧基、蒽氧基等等)，它可含有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1-3)合適的取代基，如上述低級(jí)烷氧基和上述高級(jí)烷氧基。
上述“?；钡膶?shí)例中，優(yōu)選高級(jí)鏈烷?；顑?yōu)選的是棕櫚?；?。
“酰氧基”中合適的“酰基”可為前面所提到的“?；被鶊F(tuán)。
優(yōu)選的“酰氧基”包括低級(jí)鏈烷酰氧基(例甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、異丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基、新戊酰氧基等)或磷酰氧基。
本發(fā)明的新型環(huán)狀脂肽?；缚赏ㄟ^(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)象環(huán)圈鏈霉菌No.4811株(FERM BP-5808)、環(huán)圈鏈霉菌No.8703株(FERM BP-5810)、或鏈霉菌類No.6907株(FERM BP-5809)等屬于鏈霉菌屬的?；干a(chǎn)菌株而獲得。
通常情況下是在含有可同化的碳源和氮源的水性培養(yǎng)基中，優(yōu)選在通氣良好的條件下如振蕩培養(yǎng)、深部培養(yǎng)等條件下培養(yǎng)該新型的?；干a(chǎn)菌株而產(chǎn)生該?；?。
培養(yǎng)基中優(yōu)選的碳源為葡萄糖、木糖、甘油、淀粉、糊精等碳水化合物。其它的碳源可有麥芽糖、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、甘露糖、水楊苷、琥珀酸鈉鹽等等。
優(yōu)選的氮源有酵母浸膏、蛋白胨、麩質(zhì)粉、棉子粉、大豆粉、谷物浸液、干酵母、小麥胚芽、羽毛粉、花生粉等以及硝酸銨、硫酸銨、磷酸銨等的銨鹽、尿素、氨基酸等無(wú)機(jī)或有機(jī)氮化合物等。
若碳源和氮源優(yōu)選聯(lián)合應(yīng)用的時(shí)候，通常使用含有適量生長(zhǎng)因子和一定量的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的低純度物質(zhì)，沒(méi)有必要使用純化物。根據(jù)需要可向培養(yǎng)基中添加碳酸鈉或碳酸鈣、磷酸鈉或磷酸鉀、氯化鈉或氯化鉀、碘化鈉或碘化鉀、鎂鹽、銅鹽、鈷鹽等無(wú)機(jī)鹽。特別是當(dāng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生明顯氣泡時(shí)，有必要加入液體石蠟、脂肪油、植物油、礦物油或者硅等消泡劑。
大量生產(chǎn)該新型酰基酶時(shí)，優(yōu)選深部通氣培養(yǎng)的條件，小量生產(chǎn)時(shí)可在燒瓶或瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)或表面培養(yǎng)。此外，當(dāng)在大型罐內(nèi)培養(yǎng)時(shí)為了避免新型酰基酶的生產(chǎn)線中的生長(zhǎng)延遲，優(yōu)選應(yīng)用微生物前培養(yǎng)將細(xì)菌接種到生產(chǎn)罐中。即，在較少量的培養(yǎng)基上接種微生物的孢子或菌絲，培養(yǎng)該接種培養(yǎng)物，首先生產(chǎn)前培養(yǎng)接種物，然后將所培養(yǎng)的前培養(yǎng)接種物無(wú)菌轉(zhuǎn)移到大容量發(fā)酵罐中。生產(chǎn)該前培養(yǎng)接種物的培養(yǎng)基可與生產(chǎn)新型?；杆褂玫呐囵B(yǎng)基基本上一致也可不同。
可用多種方法進(jìn)行培養(yǎng)混合物的攪拌及通氣?？捎猛七M(jìn)器或類似的攪拌裝置進(jìn)行攪拌，或轉(zhuǎn)動(dòng)或振蕩發(fā)酵器、選用各種泵裝置，或者向培養(yǎng)基中通入滅菌空氣。可將滅菌空氣通過(guò)發(fā)酵混合物進(jìn)行通氣。
發(fā)酵通常在大約20℃～32℃的溫度范圍，優(yōu)選25～30℃、pH6～8、進(jìn)行50-150小時(shí)，但可依據(jù)發(fā)酵條件及發(fā)酵規(guī)模進(jìn)行優(yōu)選的調(diào)整。
可用回收其它已知生物活性物質(zhì)時(shí)通常使用的方法從培養(yǎng)基中回收這樣所生產(chǎn)的新型酰基酶。在培養(yǎng)菌絲中及濾液中可找到所生產(chǎn)的新型酰基酶，因此，培養(yǎng)肉湯經(jīng)過(guò)濾或離心所得的菌絲及濾液經(jīng)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行分離、純化、如減壓濃縮，冷凍干燥，常用溶劑的抽提，pH調(diào)整，陰離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、非離子吸附樹(shù)脂等常用樹(shù)脂的處理，活性炭、硅酸、硅膠、纖維素、鋁等常用吸附劑的處理、結(jié)晶、再結(jié)晶等可得到該新型?；浮?br> 以下列舉實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明由環(huán)圈鏈霉菌No.4811株、環(huán)圈鏈霉菌No.8703株、鏈霉菌類No.6907株生產(chǎn)?；傅那闆r，但該發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例1-1
環(huán)圈鏈霉菌No.4811株產(chǎn)生的?；傅闹苽鋵?0ml由玉米淀粉1％、葡萄糖1％、花生粉0.5％、大豆粉0.5％、干酵母0.5％、碳酸鈣0.2％組成的種子培養(yǎng)基分別注入到100ml三角燒瓶中，120℃滅菌20分鐘，接種1-2鉑環(huán)量的環(huán)圈鏈霉菌No.4811株的斜面瓊脂培養(yǎng)物，30℃振蕩培養(yǎng)3天作為種子培養(yǎng)。
接著將蔗糖4％、花生粉1％、干酵母1％、磷酸二氫鈉0.05％、磷酸二氫鉀0.12％、硫酸鎂·7H2O 0.025％組成的生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH調(diào)整到6.5，將100ml該生產(chǎn)培養(yǎng)基注入到500ml三角燒瓶中120℃滅菌20分鐘，將前述種培養(yǎng)物2ml接種其上，30℃振蕩培養(yǎng)3天作為酵母培養(yǎng)液。實(shí)施例1-2環(huán)圈鏈霉菌No.8703株產(chǎn)生的?；傅闹苽鋵?0ml玉米淀粉1％、葡萄糖1％、花生粉0.5％、大豆粉0.5％、干酵母0.5％、碳酸鈣0.2％組成的種子培養(yǎng)基注入到100ml三角燒瓶中，120℃滅菌20分鐘，接種1-2鉑環(huán)量的環(huán)圈鏈霉菌No.8703株斜面瓊脂培養(yǎng)物，30℃振蕩培養(yǎng)3天作為種培養(yǎng)。
然后將蔗糖4％、花生粉1％、干酵母1％、磷酸二氫鈉0.05％、磷酸氫二鉀0.12％、硫酸鎂·7H2O 0.025％組成的生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH調(diào)整為6.5，將該生產(chǎn)培養(yǎng)基100ml注入到500ml三角燒瓶中，120℃滅菌20分鐘，接種2ml前述種培養(yǎng)于其上，30℃振蕩培養(yǎng)3天作為酵母培養(yǎng)液。實(shí)施例1-3鏈霉菌類No.6907株生產(chǎn)的?；傅闹苽鋵?0ml由可溶性淀粉6％、脫脂大豆粉4％、碳酸鈣0.5％組成的種子培養(yǎng)基注入到100ml三角燒瓶中，120℃滅菌20分鐘，接種鏈霉菌類No.6907株斜面瓊脂培養(yǎng)的1-2鉑環(huán)量，30℃振蕩培養(yǎng)3天作為種培養(yǎng)。
然后將蔗糖4％、花生粉1％、干酵母1％、磷酸鈣0.5％組成的生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH調(diào)整到6.5，將該生產(chǎn)培養(yǎng)基100ml注入到500ml三角燒瓶中，120℃滅菌20分鐘，接種2ml前述種培養(yǎng)于其上，30℃振蕩培養(yǎng)4天作為酵母培養(yǎng)液。實(shí)施例1-4屬于鏈霉菌菌屬的保存株生產(chǎn)酰基酶的制備對(duì)于(財(cái))發(fā)酵研究所(大阪市淀川區(qū)十三本町2-17-85)分給的屬于鏈霉菌菌屬的保存株，采用與實(shí)施例1-1相同的方法，可得到與環(huán)圈鏈霉菌No.4811株相同的酵母培養(yǎng)液。
灰色鏈霉菌灰色亞種(Streptomyces griseus subsp.griseus)IFO 13189接著是用本發(fā)明的新型環(huán)狀脂肽?；笇?duì)環(huán)狀脂肽抗真菌物(例如FR901379及其類似體)的?；鶄?cè)鏈進(jìn)行脫?；姆椒?，對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明脫?；膶?shí)施可如下進(jìn)行。
將屬于鏈霉菌菌屬、生產(chǎn)新型酰基酶的微生物接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，約20-35℃振蕩培養(yǎng)數(shù)日，以此作酵母培養(yǎng)液。將該培養(yǎng)液加入到底物FR901379等環(huán)狀脂肽物中，45～60℃。pH保持約6.0～9，通過(guò)高速液相色譜(HPLC)來(lái)檢測(cè)，分離FR179642等物的環(huán)狀肽核。
列舉以下實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的脫?；椒ㄟM(jìn)行具體說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例2-1向?qū)嵤├?-1中所得的環(huán)圈鏈霉菌No.4811株的培養(yǎng)液700μl中加入FR901379物的水溶液(100mg/ml)100μl(FR901379物10mg；8.35μmol)、甲醇100μl和緩沖液(0.5M磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液；pH6.0)100μl,30℃反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)終了后加4％醋酸1ml終止反應(yīng)，加入2ml甲醇，用濾膜(0.45μm)過(guò)濾，除去高分子蛋白等之后，通過(guò)HPLC、在210nm處監(jiān)測(cè)生成的FR179642物、測(cè)定?；富钚浴?br> HPLC由波長(zhǎng)可變的UV檢測(cè)器(島津SPD-10A)、泵(島津LC-10AD)及積分裝置(島津C-R6A)構(gòu)成，使用LiChrospher100RP-18(e)(250mm×4mmi.d.、粒徑5μm)作固相，以3％己腈/0.5％磷酸二氫銨作移動(dòng)相，以1ml/分的流速洗脫物質(zhì)FR179642。FR179642的保持時(shí)間大約為6.3分鐘。以該結(jié)果來(lái)計(jì)算物質(zhì)FR179642的生成量，為730μg(0.78μmol)。實(shí)施例2-2向700μl實(shí)施例1-2中所得的環(huán)圈鏈霉菌No.8703株的培養(yǎng)液中加入物質(zhì)FR901379的水溶液(100mg/ml)100μl(FR901379物10mg；8.35μmol)、甲醇100μl和緩沖液(0.5M磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液；pH6.0)100μl,30℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)終了后，加入4％醋酸1ml終止反應(yīng)，加入2ml甲醇，用濾膜(0.45μm)過(guò)濾，除去高分子蛋白后，通過(guò)HPLC在210nm處監(jiān)測(cè)所生成的FR179642物并測(cè)定?；富钚?。
HPLC由波長(zhǎng)可變的UV檢測(cè)器(島津SPD-10A)、泵(島津LC-10AD)及積分裝置(島津C-R6A)構(gòu)成，使用LiChrospher100RP-18(e)(250mm×4mmi.d.、粒徑5μm)作固相，以3％乙腈/0.5％磷酸二氫鈉作移動(dòng)相，以1ml/分的流速洗脫物質(zhì)FR179642。物質(zhì)FR179642的保持時(shí)間約為6.3分鐘。用該結(jié)果計(jì)算FR179642的生成量，為830μg(0.89μmol)。實(shí)施例2-3將FR901379物的水溶液(100mg/ml)100μl(FR901379物為10mg38.35μmol)100μl、甲醇100μl和緩沖液(0.5M磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液；pH6.0)100μl加入到實(shí)施例1-3中所得的鏈霉菌類No.6907株的培養(yǎng)液700μl中，30℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)終了后加入4％醋酸1ml終止反應(yīng)，加入2ml甲醇，用濾膜(0.45μm)過(guò)濾，除去高分子蛋白質(zhì)等物后，通過(guò)HPLC于210nm監(jiān)測(cè)生成的FR179642物并測(cè)定其?；富钚浴?br> HPLC由波長(zhǎng)可變的UV檢測(cè)器(島津SPD-10A)、泵(島津LC-10AD)及積分裝置(島津C-R6A)構(gòu)成，LiChrospher100RP-18(e)(250mm×4mmi.d.、粒徑5μm)作固相，以3％乙腈/0.5％磷酸二氫鈉作移動(dòng)相，以1ml/分的流速洗脫物質(zhì)FR179642。FR179642的保持時(shí)間約6.3分鐘。以該結(jié)果計(jì)算FR179642的生成量為560μg(0.60μmol)。用Lineweaver-Burk法測(cè)定時(shí)Km值為257μm,Vmax為14.3U/mg-蛋白質(zhì)。實(shí)施例2-4將棘孢曲菌素A的二甲基亞砜溶液(100mg/ml)100μl(棘孢曲菌素A10mg；9.65μmol)含有1.2M KCl的500mM磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液(pH7.0)500μl、水300μl加入到實(shí)施例1-3中所得的鏈霉菌類No.6907株的培養(yǎng)液100μl中，40℃反應(yīng)15分鐘。用4％醋酸1ml終止反應(yīng)，加入甲醇2ml后用濾膜(0.45μm)過(guò)濾除去高分子蛋白，之后通過(guò)HPLC于210nm監(jiān)測(cè)所生成的棘孢曲菌素A核物質(zhì)并測(cè)定?；富钚?。HPLC由波長(zhǎng)可變的UV檢測(cè)器(島津SPD-10A)、泵(島津LC-10AD)及積分裝置(島津C-R6A)構(gòu)成，使用LiChrospher 100RP-18(e)(4mm×250mmi.d.、粒徑5μm(Merck))作固相，以4％乙腈/1％磷酸二氫銨作移動(dòng)相，以1ml/分的流速洗脫棘孢曲菌素A核物質(zhì)。棘孢曲菌素A核物質(zhì)的保持時(shí)間約8.7分鐘。以該結(jié)果計(jì)算棘孢曲菌素A核物質(zhì)的生成量為370μg(0.47μmol)。用Lineweaver-Burk法測(cè)定時(shí)Km值為279μm,Vmax為16.8U/mg-蛋白質(zhì)。實(shí)施例2-5將棘白菌素B的二甲基亞砜溶液(100mg/ml)100μl(棘白菌素B為10mg；9.43μmol)100μl、含1.2M KCl500mM磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液(pH7.0)500μl、水300μl加入到實(shí)施例1-3中所得的鏈霉菌類No.6907株的培養(yǎng)液100μl中，40℃反應(yīng)15分鐘。用1ml 4％醋酸終止反應(yīng)，加入2ml甲醇后用濾膜(0.45μm)過(guò)濾，除去高分子蛋白質(zhì)等，之后通過(guò)HPLC于210nm監(jiān)測(cè)生成的棘白菌素B核物質(zhì)并測(cè)定酰基酶活性。HPLC由波長(zhǎng)可變的UV檢測(cè)器(島津SPD-10A)、泵(島津LC-10AD)及積分裝置(島津C-R6A)構(gòu)成，用LiChrospher 100RP-18(e)(4mm×250mmi.d.、粒徑5μm(Merck))作固定相，以4％乙腈/1％磷酸二氫銨作移動(dòng)相，以1 ml/分的流速洗脫棘白菌素B核物質(zhì)。棘白菌素B核物質(zhì)的保持時(shí)間約8.7分鐘。以該結(jié)果計(jì)算棘白菌素B核物質(zhì)的生成量為90μg(0.11μmol)。用Lineweaver-Burk法測(cè)定時(shí)Km值為146μm,Vmax為7.85U/mg-蛋白質(zhì)。
應(yīng)用鏈霉菌屬的本發(fā)明新型?；傅纳a(chǎn)菌所生產(chǎn)的酰基酶對(duì)環(huán)狀脂肽抗真菌物(例物質(zhì)FR901379)的?；鶄?cè)鏈進(jìn)行脫?；^(guò)程中的特征在下面論述。
這些數(shù)據(jù)是應(yīng)用實(shí)施例2-1、2-2或2-3中所述的實(shí)施方法、改變緩沖液的種類(0.5M檸檬酸鈉緩沖液、0.5M磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液的適當(dāng)組合)、反應(yīng)溫度、甲醇的添加濃度等而得到的。各種?；傅幕钚砸苑磻?yīng)終了時(shí)物質(zhì)FR179642的濃度(用HPLC測(cè)定)表示。
反應(yīng)時(shí)的最適pH試驗(yàn)1-1環(huán)圈鏈霉菌No.4811株生產(chǎn)?；傅淖钸mpH

試驗(yàn)1-2環(huán)圈鏈霉菌No.8703株生產(chǎn)酰基酶的最適pH

試驗(yàn)1-3鏈霉菌類6970株生產(chǎn)?；傅淖钸mpH

試驗(yàn)2-2環(huán)圈鏈霉菌No.8703株生產(chǎn)酰基酶的最佳溫度

試驗(yàn)2-3環(huán)圈鏈霉菌No.6907株生產(chǎn)?；傅淖罴褱囟?

以上結(jié)果表明，在本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)于每一?；阜磻?yīng)時(shí)的最佳溫度為40-60℃。
反應(yīng)時(shí)添加甲醇的效果試驗(yàn)3-1用環(huán)圈鏈霉菌No.4811株生產(chǎn)的?；高M(jìn)行反應(yīng)時(shí)甲醇的效果

試驗(yàn)3-2用環(huán)圈鏈霉菌No.8703株生產(chǎn)的酰基酶進(jìn)行反應(yīng)時(shí)甲醇的效果

試驗(yàn)3-3鏈霉菌類No.6907株生產(chǎn)的?；高M(jìn)行反應(yīng)時(shí)甲醇的效果

以上結(jié)果表明，在本發(fā)明的實(shí)施例中對(duì)于每一?；鶃?lái)講，向反應(yīng)液中加入5-20％的甲醇，活性會(huì)提高1.6～2.2倍。
下面對(duì)由培養(yǎng)鏈霉菌屬的?；傅纳a(chǎn)菌而得到的環(huán)狀脂肽?；高M(jìn)行具體說(shuō)明?！び涉溍咕?907株而來(lái)的?；傅奶卣?)作用能催化FR901379及棘白菌素B、棘孢曲菌素A等FR901379物的類似體所代表的環(huán)狀脂肽物的脂質(zhì)?；糠置擋；?。2)最佳pH:pH8～93)作用優(yōu)選的溫度范圍50℃附近4)抑制、活化及穩(wěn)定性甲醇反應(yīng)液中的含量到10％時(shí)呈濃度依賴性活化作用，此濃度以上為抑制作用。5)分子量純化的該酶經(jīng)SDS-PAGE后分出2帶。
大片段肽；61kD
小片段肽；19kD6)結(jié)晶構(gòu)造純化的蛋白質(zhì)量少，未得到結(jié)晶。7)氨基酸分析N末端氨基酸序列大片段肽；Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly小片段肽；Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro-His-His-Val-Ala8)底物特異性對(duì)FR901379、棘白菌素B及棘孢曲菌素A有催化作用。但對(duì)FR901469無(wú)效。
為了對(duì)本發(fā)明的酰基酶進(jìn)行具體說(shuō)明，列舉了以下實(shí)施例，但本發(fā)明并不局限于此。酰基酶的純化實(shí)施例3低溫下、用1.5M KCl攪拌抽提實(shí)施例1-3中所得的鏈霉菌類No.6907株的培養(yǎng)液，用No.2濾紙所得的抽提濾液在UF膜(旭化成；AIP-1010)上脫鹽(20mM Tris-HCl緩沖液(pH9)置換，過(guò)HP-20柱所得流出液上DEAE-Toyopearl柱(Cl-型)，用含0.3M NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液(pH9)洗脫。向活性級(jí)分中添加、溶解0.5M相當(dāng)量的(NH4)2SO4，過(guò)Phenyl-Toyopeanl柱，用含0.1M NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8)洗脫。用DF膜(旭化成；SIP-0013)將所得活性級(jí)分脫鹽濃縮(20mMTris-HCl緩沖液(pH9)置換)，在YMC-Diol柱上進(jìn)行凝膠過(guò)濾(移動(dòng)相含0.2M NaCl的0.1M磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液pH7.0)，再由用遞相系的Cosmosil 5C4-AR-300柱對(duì)活性級(jí)分進(jìn)行分離純化(移動(dòng)相(A液)0.5％三氟醋酸。(B液)0.5％三氟醋酸-80％乙腈、A∶B=60∶40→40∶60(線性梯度))。該純化的酰基酶經(jīng)SDS-PAGE分出2條帶。由此得到分子量為61kD和19kD的2種肽。底物特異性FR901469物是由真菌No.11243株(FERMBP-3373)所產(chǎn)生的、具有抗真菌活性的已知物質(zhì)(WO92/19468號(hào)公報(bào)記載)，是具有下面結(jié)構(gòu)式〔Ⅲ〕

的化合物。
與本發(fā)明的新型酰基酶同樣具有脫?；饔玫膩?lái)源于猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanes utahensis)的?；?特開(kāi)平4-228072號(hào)公報(bào)記載)對(duì)前面所講化合物FR901469或其鹽具有催化活性，能產(chǎn)生下面結(jié)構(gòu)式〔Ⅳ〕<p>試驗(yàn)1-3鏈霉菌類6970株生產(chǎn)?；傅淖钸mpH

以上結(jié)果表明，本發(fā)明的實(shí)施中對(duì)于每一?；竵?lái)講反應(yīng)在弱酸性(pH4附近)以上進(jìn)行，pH值一高反應(yīng)速度就上升。
反應(yīng)的最適溫度試驗(yàn)2-1環(huán)圈鏈霉菌No.4811株生產(chǎn)酰基酶時(shí)的最佳溫度

生產(chǎn)FR901379物的Coleophoma sp.F-11899株及生產(chǎn)本發(fā)明?；傅沫h(huán)圈鏈霉菌No.4811株、環(huán)圈鏈霉菌No.8703株及鏈霉菌類No.6907株保藏于通商產(chǎn)生省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣筑波市東1-1-3)。
微生物 保藏號(hào)Coleophoma sp.F-11899株 FERM BP-2635Streptomyces anulatus No.4811株 FERM BP-5808Streptomyces anulatus No.8703株 FERM BP-5810Streptomyces sp.No.6907株FERM BP-5809No.11243株 FERM BP-337權(quán)利要求
1．由鏈霉菌屬菌而來(lái)的環(huán)脂肽?；浮?br> 2．權(quán)利要求1的?；?，它能催化通式〔Ⅰ〕
〔式中，R1為?；琑2為羥基或酰氧基，R3為氫或羥基，R4為氫或羥基，R5為氫或羥基磺酰氧基，及R6為氫或氨基甲?；乘镜沫h(huán)狀脂肽化合物或其鹽中R1的酰基脫?；?，能產(chǎn)生通式〔Ⅱ〕
〔式中，R2、R3、R4、R5和R6代表與前相同的基團(tuán)〕中所示的環(huán)肽化合物或其鹽。
3．權(quán)利要求2的?；?，其特征在于權(quán)利要求2中R5為羥基磺酰氧基和R6為氨基甲酰基。
4．權(quán)利要求1的?；?，其特征在于酰基酶的生產(chǎn)菌為環(huán)圈鏈霉菌。
5．權(quán)利要求1的?；福涮卣髟谟邗；傅纳a(chǎn)菌為環(huán)圈鏈霉菌No.4811株。
6．權(quán)利要求1的?；福涮卣髟谟邗；傅纳a(chǎn)菌為環(huán)圈鏈霉菌No.8703株。
7．權(quán)利要求1的?；?，其特征在于酰基酶的生產(chǎn)菌為鏈霉菌類No.6907株。
8．具有下列性質(zhì)的權(quán)利要求1的酰基酶1)作用催化FR901379及棘白菌素B、棘孢曲菌素A等FR901379物類似體所代表的權(quán)利要求1的環(huán)脂肽物的脂質(zhì)酰基部分脫酰化；2)最佳pH:pH8～9；3)作用優(yōu)選的溫度范圍50℃附近4)抑制、活化及穩(wěn)定性甲醇反應(yīng)液中含量達(dá)10％呈濃度依賴性的活化作用，濃度高于此則呈抑制作用；5)分子量大片段肽61kD小片段肽19kD6)氨基酸分析N末端氨基酸序列大片段肽Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly小片段肽；Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro-His-His-Val-Ala7)底物特異性對(duì)FR901379、棘白菌素B及棘孢曲菌素A有催化作用，但對(duì)FR901469無(wú)作用。
9．權(quán)利要求8的酰基酶，其特征在于酰基酶的生產(chǎn)菌為鏈霉菌類No.6907株。
10．生產(chǎn)權(quán)利要求1的酰基酶的屬于鏈霉菌屬的?；干a(chǎn)菌。
11．生產(chǎn)權(quán)利要求1的酰基酶的環(huán)圈鏈霉菌生產(chǎn)菌。
12．環(huán)圈鏈霉菌No.4811。
13．環(huán)圈鏈霉菌No.8703。
14．鏈霉菌類No.6907。
15．環(huán)肽物或其鹽的制備方法，它是通過(guò)將環(huán)脂肽物或其鹽與生產(chǎn)菌為鏈霉菌屬的酰基酶的粗提或純化酶液接觸，對(duì)其脂質(zhì)部分進(jìn)行脫?；纬傻摹?br> 16．通式〔Ⅱ〕
〔式中，R2、R3、R4、R5和R6代表與后相同的基團(tuán)〕中所示環(huán)肽化合物或其鹽的制備方法，其特征在于通式〔Ⅰ〕
〔式中，R1為酰基，R2為羥基或酰氧基，R3為氫或羥基，R4為氫或羥基，R5為氫或羥基磺酰氧基，及R6為氫或氨基甲酰基〕所示的環(huán)脂肽化合物或其鹽在水性溶劑中與培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬的?；干a(chǎn)菌所得的酰基酶的粗提或純化酶液接觸進(jìn)行。
17．權(quán)利要求16的制備方法，其特征在于權(quán)利要求16的式中R5為羥基磺酰氧基，及R6為氨基甲?；?。
18．權(quán)利要求15的制備方法，其特征在于?；傅纳a(chǎn)菌為環(huán)圈鏈霉菌。
19．權(quán)利要求15的制備方法，其特征在于?；傅纳a(chǎn)菌為環(huán)圈鏈霉菌No.4811。
20．權(quán)利要求15的制備方法，其特征在于酰基酶的生產(chǎn)菌為環(huán)圈鏈霉菌No.8703。
21．權(quán)利要求15的制備方法，其特征在于酰基酶的生產(chǎn)菌為鏈霉菌類No.6907。
全文摘要
環(huán)脂肽?；?它能有效地使環(huán)脂肽化合物,具體而言,它能使下面通式[Ⅰ]中所示的FR901379物及其類似體的?；鶄?cè)鏈脫酰化,以及用該?；钢苽洵h(huán)脂肽物的方法。通式[Ⅰ]如右式[式中,R
文檔編號(hào)C07K7/56GK1218507SQ9719447
公開(kāi)日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年3月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月8日
發(fā)明者上田聰, 田中美穗, 江崎正美, 坂本憲俊, 橋本正治, 大煙暢敬, 平井勝, 山下道雄 申請(qǐng)人:藤澤藥品工業(yè)株式會(huì)社