專利名稱：用于避孕的透明帶蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由透明帶蛋白衍生的肽類用于避孕的應用，涉及含有這些肽類的、但是不產(chǎn)生免疫作用的藥物制劑。
隨著世界人口的生長，對有效避孕方法的需求也不斷提高。除了口服避孕藥和殺精子藥以外，還可使用機械性避孕方法，例如IDUs(宮內(nèi)避孕器)、陰道環(huán)和避孕套。另外一種替代方法的原理是，通過阻滯卵子-精子-相互作用而阻止受孕。精子必須穿透透明帶，后者為一種由糖蛋白組成的細胞外基質，它包繞在雌性配子周圍(生長的卵母細胞和排出的卵子)。這一相互作用在配體和精子受體的綜合總體水平上，在卵細胞側面以及精子表面進行。各種哺乳類動物的透明帶由三至四種糖蛋白組成，一般稱之為ZP1、2和3，或者ZPA、B和C[Harris,J.等哺乳類動物變種的透明帶基因和cDNA′s的復制和表征ZPA、ZPB和ZPC基因家族.DAN序列4期，361-393頁，(1994年)]。在小白鼠身上已有說明精子首先通過O-結合的低聚糖鏈結合在ZP3上，而另一種結合或許是通過ZP2促成。ZP3似乎不僅促成精子與透明帶的起始結合，而且還促成對受孕起決定性作用的另一過程，即頂體反應[Dean,J.:哺乳類動物受孕生物學．臨床應用研究雜志89期，1055-1059頁(1992年)；Wassermann,P.M.應用透明帶糖蛋白進行生育調(diào)控。生殖生育增刊42期，79-87頁，(1990年)]。
透明帶糖蛋白獨特地位于卵巢內(nèi)，具有抗原特性，在卵巢內(nèi)生長期可以使循環(huán)中的抗體通過，鑒于以上這些事實，有關研究集中于開發(fā)透明帶蛋白基礎上的避孕疫苗[Naz,R.K，等人類避孕疫苗的研究開發(fā)，應用由配子(精子和透明帶)和激素(人類絨膜促性腺激素)衍生的抗原現(xiàn)狀·人類生殖生育現(xiàn)狀1期，1-18頁，(1995年)；Millar,S.E.等用透明帶肽類接種雌性小白鼠產(chǎn)生長效避孕?？茖W246期，935-938頁，(1989年)]。在幾乎所有的動物體內(nèi)用透明帶蛋白進行免疫時都可以觀察到這樣一種現(xiàn)象，即誘發(fā)卵巢炎。至今尚不能完滿地解釋出現(xiàn)卵巢炎的原因。卵巢炎的產(chǎn)生卻絕對地說明，長期應用透明帶蛋白以及由這些蛋白衍生的肽類用以避孕免疫存在一些問題。
因此便急切地需要一種新的避孕藥，它可以通過阻滯卵子-精子-相互作用而有效地阻止受孕，而又不致免疫作用方面的問題。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過由透明帶蛋白衍生的肽類可以阻滯卵子-精子-相互作用。
本發(fā)明涉及由透明帶蛋白衍生的肽類在避孕中的應用，但這些肽類不致免疫作用。
在另外一種實施方案中，本發(fā)明涉及由透明帶蛋白衍生的肽類的應用，用以制備藥物制劑。
在另外一種優(yōu)選的實施方案中，由小白鼠或人類的ZP1、2或3蛋白衍生出肽類。
在一種特別優(yōu)選的實施方案中，由小白鼠或人類的ZP3蛋白衍生出肽類。
在另外一種特別優(yōu)選的實施方案中，肽類為-RYPRQGNVSS--TPSPLPDPNSSPY--SRNRRHVTDEADVT--CSNSSSSQFQIHGPR--TRKCHSSSYLVSLPQ--SQFQIHGPRQ--TPT..PDQNASPY--CGTPSHSRRQPHVMS--SRNRRHVTEEADVT--TRRCRTASHPVSASE--SRRQPHVMSQ-。在另外一種特別優(yōu)選的實施中，肽類為
-RYPRQGNVSS--TPT..PDQNASPY--SRNRRHVTDEADVT--TRRCRTASHPVSASE--SQFQIHGPRQ-.
按照Fmoc-策略[Carpino,L.A.和Han,G.Y.(1970年)美國化學學會雜志92期5748-5749頁；Carpino,L.A.和Han,G.Y.(1972年)有機化學雜志37期3404-3409頁]，在固態(tài)載體上[Merrifield,R.B.,(1963年)美國化學學會雜志85期2149頁]，在一種自動肽合成器上進行肽類合成。如果肽類攜帶一個游離的C-終端(COOH)，那么將一種HMP-樹脂[Wang,S.-W.,(1973年)，美國化學學會雜志95期1328頁]應用于合成。如果C-終端己酰胺化(CONH2)，則應用Rink酰胺樹脂[Rink,H.,(1987年)四面體通訊28期，3787頁]。如果肽于N-終端攜帶游離的氨基(H2N-)，則Fmoc-保護基在上一個合成循環(huán)中裂解。相反地，如果N-終端乙?；?Ac-)，則使N-終端氨基酸的氨基按照Fmoc-裂解方式與乙酐反應。
對于0.1-1.5g肽-樹脂，保護基的裂解用0.75g苯酚，0.25ml乙二硫醇，0.5苯硫基甲烷，0.5ml H2O10ml三氟乙酸進行，然后在37℃下，在水浴中攪拌孵育3小時。
肽的離解或者通過在冷卻下(冰浴)用叔-丁基甲基醚沉淀和接著離心，或者真空中旋轉后通過用乙醚沉淀和接著過濾。干燥后，根據(jù)需要，將肽經(jīng)過HPLC提純。
試驗實施例Ⅰ．試管內(nèi)受孕試管內(nèi)受孕法為一種測試系統(tǒng)，它實現(xiàn)了首次檢測受測物質的避孕作用。由此可以檢測避孕作用原本是基于抑制精子功能，還是基于對卵母細胞的抑制作用，或者基于上述二種作用。
Ⅰ.1.試驗動物材料約12周齡的可生育雌性小白鼠(CB6F1-門)，至少14周齡的可生育雄性小白鼠(CB6F1-門)。
Ⅰ.2.準備和實施將派熱克斯瓶和Boerdel瓶進行高壓滅菌。
按照Brinster、Whitten和Wittingham(BWWy)模式，按照Zeneveld方法制備培養(yǎng)基
接著將培養(yǎng)基用0.5M NaOH調(diào)節(jié)至pH7.4。
將滅菌的Boerdel瓶用碳合氣充氣5分鐘，接著將培養(yǎng)基過濾至其中(4℃下最多可保存1周)。為了油的平衡，將100ml石蠟油(熊果甙)加熱2小時后接著冷卻。冷卻后添加20ml BWW/0.3％BSA并且用碳合氣充氣20分鐘。
將所有將要應用的器具在140℃下滅菌過夜。將孵育箱調(diào)節(jié)至37℃、5％Co2和95％O2。
小培養(yǎng)皿a)為了獲得卵母細胞，用碳充氣的石蠟油充填和保持在37℃。b)為了精子獲能(在去除試管后準備)，將0.5ml BWW/2％BSA用吸管滴加至小培養(yǎng)皿的基底上，用平衡油覆層并保持在37℃。c)為了受孕(在去除試管前準備)，將0.1ml BWW/0.3％BSA相應于受測濃度與或不與(對照)物質混合，用平衡油覆層和保持在37℃。
Ⅰ.2.1.排卵過速的誘導對12周齡的可生育小白鼠皮內(nèi)注射10個注射單位PMS/0.1ml,54小時后注射10個注射單位HCG/0.1ml。
Ⅰ.2.2.精子的獲得a)小白鼠為了獲得精子，處死一只雄性小白鼠和取出二只附睪附件，置于準備好的小培養(yǎng)皿上[參見以上b)]。將組織部分在基質中切碎，以使精子可以溢出。將精子在孵育箱中獲能1小時。獲能時間結束后，將精子按1∶5比例用BWW/0.3 BSA稀釋。為了在計數(shù)器中計數(shù)，將等分試樣按1∶1比例用雙倍蒸餾水稀釋。所需要的精子濃度為40.000-80.000/0.1ml。b)人類為了在人類上進行帶結合試驗，應用精子受孕玻璃毛-柱(Mello有限公司，F(xiàn)RG)，將激素繁殖精子的精子捐獻者的精液制成標本。將濾液洗滌和懸浮于HFT-HSA(HFT=人類輸卵管液體培養(yǎng)基按照Quinn等用10mg/ml人類血清白蛋白補充=HSA)中。
Ⅰ.2.3.卵母細胞的獲得a)小白鼠注射HCG后13小時將動物處死，取出輸卵管并置于預先準備好的小培養(yǎng)皿中[參見以上a)]。在進一步處理前，將小器皿保持在37℃下的熱板上。在立體顯微鏡下，將置于油中的輸卵管分離。同時擠出卵丘，然后涂布至預先準備好的培養(yǎng)基滴劑中(每滴劑二個卵丘)。b)人類所有的人類卵母細胞均由死亡后材料中獲得。我們一貫注意在整個試驗過程中嚴格堅持所有的法醫(yī)學原則、倫理學原則和道德原則。
如果沒有另作說明，則卵母細胞保存在含有1.5M MgCl2和0.1％PVP的36.6mM Hepes(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸)-緩沖液中，pH7.4。
Ⅰ.2.4.體外授精向存在于介質液滴劑中的卵母細胞加入0.1ml限定了濃度的稀釋精液，并在孵育箱中于37℃下孵育24小時。
Ⅰ.3.評估在孵育箱中孵育24小時后，測出以下參數(shù)a)總卵母細胞數(shù)目b)分裂卵母細胞數(shù)目c)未分裂卵母細胞數(shù)目d)變性卵母細胞數(shù)目受孕率等于完整卵母細胞的總數(shù)目中所包含的分裂卵母細胞數(shù)目。
Ⅱ．帶-結合測定按照試管內(nèi)受孕中的說明，獲得精子和卵母細胞。
將在Ⅰ.2.3.中所獲得的卵母細胞，用一根精細抽出的巴氏吸管，其直徑稍小于卵母細胞的直徑，吸收幾個μl的BWW培養(yǎng)基中。該過程多次重復，直至導致透明帶的破裂。游離出卵母細胞的胞漿部分，收集離解的透明帶，以備于進一步的試驗，并且在0.1ml BWW培養(yǎng)基中用平衡油覆層和保持在37℃。
Ⅱ.1.透明帶結合試驗a)小白鼠將獲能的小白鼠精子(見Ⅰ.2.2．)或者用一種溶劑或者用所希望的物質預先孵育，接著在一個0.1ml的滴劑中添加至隔離的透明帶中，以使孵育液容量總共為0.2ml(油中)。每一滴劑檢查出約20個透明帶。每一滴劑的精子濃度在10,000至30,000/μl之間。將精子和透明帶在孵育箱中孵育45分鐘(見Ⅰ.2中的說明)。孵育時間后，在反轉顯微鏡下計算每個透明帶的結合精子數(shù)目。能精確計數(shù)的上界值在對照條件下為每個透明帶20個精子。b)人類試驗包括三個含有10μl標準THF-HSA培養(yǎng)基(s.o.)和40μl處理培養(yǎng)基(s.u.)的孵育滴劑。在每個滴劑中添加一定數(shù)目的卵母細胞(用以TEM)以及用以結合的半透明帶。為了進行結合試驗，在每個滴劑中添加10μl精子滴劑(50×106/ml)，用礦物油覆層，然后在37℃下在5％CO2中孵育4小時。按照非參數(shù)Mann-Whitney雙樣試驗法進行統(tǒng)計學評估。處理培養(yǎng)基的組成為20μl 5mM NaH2PO4(用磷酸調(diào)節(jié))pH2.5，加20μl一種特異組成的雙濃HTF-HSA培養(yǎng)基，按照1∶1(容積/容積)的比例混合。雙濃HTF-HSA培養(yǎng)基的組成
應用所列舉的肽類可應用于各種不同的藥物產(chǎn)品。
肽類的用藥途徑可以是侵入性途徑(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮下)和非侵入性途徑(局部、口服)。為了達到持續(xù)的作用效果，長效應用形式特別受到歡迎。a)微粒膠囊形式的肽制劑作為微粒膠囊材料常常應用乳酸和乙醇酸的共聚聚合物。該化合物包埋肽類。微粒膠囊本身則懸浮于液狀蠟和油中，如肉豆蔻酸異丙酯或蓖麻油中。b)鹽形式的劑型基礎陽離子肽類還可以與陰離子聚合物如聚酯生成非水溶性鹽，因此能穩(wěn)定地懸浮于水溶性載體中。c)可生物分解的植入體也可以擠壓或壓出a)和b)中所列舉的材料而使之成型。有一種大劑型為適用于6個月至6年應用時限的皮下活性物質緩釋型制劑。d)微脂體同樣可以作為肽類的載體。
優(yōu)選包衣由磷脂酰膽堿和膽固醇和任選其它不可通過活性物質的成份組成。為此它最好是被保護的。微脂體包裹的肽類既可以侵入性用藥，也可以局部或口服用藥。e)TDS特別適合于上述應用說明。例如它們可以應用7天以上，并且恒定地釋放活性物質。作為皮膚粘附劑可以應用所有常用的硅酮粘附劑和丙烯酸鹽粘附劑。重要的是可以添加通常的增強劑以克服皮膚屏障。該劑型原則是可應用至有1000道爾頓以下的分子重量的物質，它們特別適合于所說明的肽類。f)粘膜粘合劑系統(tǒng)特別適合于經(jīng)粘膜用藥和經(jīng)鼻用藥。根據(jù)已知，附著有肽類的這種屏障較皮膚更易于通過。在此還可以附加應用增強劑。藥物劑型可以考慮粉劑和溶劑(噴霧劑)和所有形式的軟膏。g)正如f)中所述，肽類難以通過皮膚，因此可以對較小分子以非帶電狀態(tài)以乳霜、凝膠或軟膏形式應用。因為具有更安全的應用性，一次使用劑量包裝更合需要。h)帶電肽類可以借助于離子電滲療法皮膚用藥。一種相應的裝置由二部分組成即一個帶有電極的供體凝膠面和一個反極，其中的活性物質在給定的供體電壓下被促使進入皮膚。
其它的藥物劑型可以含有通常的佐劑和載體物質。
實施例實施例1(小白鼠)精子結合在小白鼠透明帶的％抑制作用
10,000個精子/0.01ml中每個透明帶有20個精子結合相應于100％。實施例2試管內(nèi)受孕時小白鼠的％抑制作用
實施例3(人類)精子結合在人類透明帶上的％抑制作用
肽類hu(141-150)和hu(327-341)在獲能的人類精子中不引起頂體反應。
肽類hu(141-150)不影響精子運動的參數(shù)。
權利要求
1．由透明帶蛋白衍生的肽類的應用，用以避孕，但這些肽類不致免疫作用。
2．按照權利要求1的肽類的應用，其序列由小白鼠或人類ZP1、2或3蛋白衍生。
3．按照權利要求1的肽類的應用，其序列由小白鼠或人類ZP3蛋白衍生。
4．按照權利要求1至3的肽類的應用，其序列為-RYPRQGNVSS--TPSPLPDPNSSPY--SRNRRHVTDEADVT--CSNSSSSQFQIHGPR--TRKCHSSSYLVSLPQ--SQFQIHGPRQ--TPT..PDQNASPY--CGTPSHSRRQPHVMS--SRNRRHVTEEADVT--TRRCRTASHPVSASE--SRRQPHVMSQ-。
5．由透明帶蛋白衍生的肽類的應用，用以制備避孕藥物制劑，但這些肽類不致免疫作用。
6．按照權利要求5的肽類的應用，其序列由小白鼠或人類ZP1、2或3蛋白衍生。
7．按照權利要求5的肽類的應用，其序列由小白鼠或人類ZP3蛋白衍生。
8．按照權利要求5至7的肽類的應用，其序列為-RYPRQGNVSS--TPSPLPDPNSSPY--SRNRRHVTDEADVT--CSNSSSSQFQIHGPR--TRKCHSSSYLVSLPQ--SQFQIHGPRQ--TPT..PDQNASPY--CGTPSHSRRQPHVMS--SRNRRHVTEEADVT--TRRCRTASHPVSASE--SRRQPHVMSQ-.
全文摘要
本發(fā)明涉及由透明帶蛋白衍生的肽類用于避孕的應用,和含有這些肽類的、但是不產(chǎn)生免疫作用的藥物制劑。
文檔編號C07K7/08GK1219175SQ97194854
公開日1999年6月9日 申請日期1997年5月22日 優(yōu)先權日1996年5月23日
發(fā)明者U－F·哈比尼克特, A·羅比亞 申請人:舍林股份公司