專(zhuān)利名稱(chēng)：aPL免疫反應(yīng)性肽、其綴合物以及aPL抗體介導(dǎo)的疾病的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，同時(shí)涉及用于治療和診斷抗磷脂(aPL)抗體介導(dǎo)的疾病的組合物與方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及化學(xué)限定的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子和aPL結(jié)合表位的免疫專(zhuān)一的類(lèi)似物的綴合物以及用于產(chǎn)生這些綴合物的方法和組合物。優(yōu)化的類(lèi)似物缺乏T細(xì)胞表位。此外，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)生物樣品中抗磷脂抗體的存在和測(cè)定其總量的診斷測(cè)定方法。本發(fā)明也涉及用隨機(jī)肽文庫(kù)鑒別aPL結(jié)合表位的免疫專(zhuān)一的類(lèi)似物的方法。
背景技術(shù)：
抗磷脂抗體發(fā)生在自身免疫疾病(如全身紅斑狼瘡癥(SLE)和抗磷脂抗體綜合癥(APS))中并與感染和藥物療法有關(guān)。APS的特性為具有如動(dòng)脈或靜脈血栓、血小板減少和流產(chǎn)之類(lèi)的一種或多種臨床特征。APS可能是原發(fā)的，或者它可能與其它病癥相聯(lián)系(主要是SLE)。(《磷脂結(jié)合抗體》(Harris等編輯，CRC出版社，Boca Raton,FL,1991)；McNeil等，免疫學(xué)進(jìn)展，49卷，193-281頁(yè)(Austen等編輯，學(xué)院出版社，圣地亞哥，CA,1991))。大約30-40％的SLE患者有aPL，而50％的帶aPL抗體的病人卻缺乏SLE。這50％的病人可能患有其它的自身免疫風(fēng)濕疾病或各種各樣的病癥，或者它們可能已經(jīng)接受了藥物(特別是氯丙嗪)治療。在對(duì)70位(26位男性和44位女性)原發(fā)性APS(PAPS)(但無(wú)證據(jù)表明有SLE)的患者進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，觀察到下列特征患深靜脈血栓癥(DVT)的有31位；得動(dòng)脈閉塞(特別是中風(fēng)或者瞬時(shí)局部缺血)的有31位；患心肌梗塞的有15位；患習(xí)慣性流產(chǎn)(fetal loss)的有24位；患血小板減少癥(TCP)的有32位；Coomb氏測(cè)驗(yàn)呈陽(yáng)性的有10位；患Evans氏綜合癥的有7位；32位有抗核抗體(ANA)，但其中29位不到1∶160；大約24位有抗線粒體抗體(AMA)(McNeil等，同上)。在所有中風(fēng)患者中估測(cè)只有大約5％的變化，aPL抗體被認(rèn)為是一個(gè)重要的作用因子。
如那些在VDRL試驗(yàn)中檢測(cè)到的瞬時(shí)aPL抗體，發(fā)生在許多感染期間。大約30％的有永久aPL抗體的病人得過(guò)血栓病。aPL抗體的存在可在SLE患者群(他們表現(xiàn)出包括血栓癥、TCP和流產(chǎn)等的一種或多種臨床特征的綜合癥)內(nèi)定義一組病人。在SLE中得這種綜合癥的危險(xiǎn)總體來(lái)說(shuō)大約是25％；當(dāng)aPL抗體存在時(shí)危險(xiǎn)性增加到40％，而當(dāng)它們不存在時(shí)危險(xiǎn)性減少至15％。因?yàn)閍PL抗體被認(rèn)為是針對(duì)原生質(zhì)膜中的磷脂的，所以人們假設(shè)它們可能通過(guò)干擾在細(xì)胞(如血小板或內(nèi)皮細(xì)胞)的磷脂膜上發(fā)生的止血過(guò)程而在體內(nèi)產(chǎn)生直接致病作用。在PAPS患者中，aPL抗體看來(lái)是存在的唯一危險(xiǎn)因子這一事實(shí)進(jìn)一步證明了這些抗體有直接致病作用通過(guò)用人抗心磷脂抗體免疫小鼠誘導(dǎo)PAPS是迄今證明aPL抗體是直接病原性的最好證據(jù)(Bakimer等，1992,J.Clin.Invest.89:1558-1563；Blank等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88:3069-3073)。
在臨床環(huán)境中的aPL抗體測(cè)量仍然不完善。一套市售的標(biāo)準(zhǔn)抗血清(APL診斷公司，Louisville,KY)可產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以用于比較在各種實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的測(cè)定。然而，關(guān)于確切的GPL和MPL,IgG和IgM抗磷脂抗體的各自測(cè)量單位，對(duì)所給血清的等級(jí)分類(lèi)和分為高、中、低滴定率的GPL和MPL的級(jí)別，在這些實(shí)驗(yàn)室獲得的結(jié)果間有很多的不一致性。市售的試劑盒在分配給市售標(biāo)準(zhǔn)的值上變化很大(Reber等(1995)，血栓形成和止血?jiǎng)?3:444-452)。盡管有這些局限性，但一般都認(rèn)為為在APS、PAPS和其它aPL抗體介導(dǎo)的疾病(包括周期性中風(fēng)和習(xí)慣性流產(chǎn))中的抗體所識(shí)別的表位位于β2-GPI的第5區(qū)中，并且在β2-GPI與心磷脂結(jié)合后暴露給抗體。
現(xiàn)在人們一般接受aPL抗體識(shí)別由β2-糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)和帶負(fù)電磷脂(例如心磷脂)構(gòu)成的抗原復(fù)合體(McNeil等(1990)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，87:4120-4124；Galli等(1990),Lancet I；1544-1547)(下文稱(chēng)為“aPL免疫原”)。β2-GPI是所發(fā)現(xiàn)的游離的較小血漿糖蛋白并與脂蛋白脂類(lèi)(其中它也叫作載脂蛋白H(apo H))相聯(lián)系。它由被稱(chēng)作Sushi的5個(gè)獨(dú)立折疊域或者與其它蛋白質(zhì)中的類(lèi)似域相似的短的共有重復(fù)域構(gòu)成。已報(bào)道β2-GPI在結(jié)合磷脂上經(jīng)歷了抗原的和構(gòu)象的變化(Wagenkneckt等(1993)，血栓形成和止血?jiǎng)?9:361-365；Jones等(1992)，第5屆抗磷脂抗體國(guó)際學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集(摘要S5))。第5域包含脂類(lèi)結(jié)合和aPL抗體結(jié)合的假定位點(diǎn)(Hunt J.和S.Krilis(1994)，免疫學(xué)雜志，152:653-659Lauer等(1993)，免疫學(xué)，80:22-28)。aPL的病理機(jī)制是未知的(McNeil等，同上)。大多數(shù)解釋援引內(nèi)皮細(xì)胞功能或者血小板介入作用(Haselaar等(1990)，血栓形成和止血?jiǎng)?3:169-173)。這些解釋提出在血管內(nèi)皮細(xì)胞傷害或者血小板激活后，陰離子磷脂向原生質(zhì)暴露表面的暴露或跨雙層遷移可能會(huì)導(dǎo)致β2-GPI結(jié)合和引發(fā)aPL抗體形成。
aPL抗體可能通過(guò)減少前列環(huán)素形成(Vermylen,J.和J.Arnout(1992)，臨床實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)雜志，120:10-12)，通過(guò)直接干擾凝結(jié)蛋白質(zhì)的作用，或者通過(guò)封阻抑制內(nèi)在血液凝固途徑、血小板凝血原酶活性、和腺苷二磷酸(ADP)介導(dǎo)的血小板聚集的β2-GPI的能力(Arvieux等(1993)，血栓形成和止血?jiǎng)?0:336-341)而直接起原血栓形成作用在搜索鉛化合物的藥物化學(xué)中的一種主要的新工具已引起提供巨大的分子多樣性的組合文庫(kù)的出現(xiàn)。分子多樣性可以從化學(xué)合成或生物系統(tǒng)中產(chǎn)生(Scott.,J.K.[合理的藥物設(shè)計(jì)](CRC出版社，Weiner,D.B.和W.V.Williams編輯，Boca,Raton,FL.,1994)；Moos等(1993)，藥物化學(xué)年報(bào)，28:315-324)。通過(guò)在絲狀噬菌體的表面顯示隨機(jī)肽，人們已經(jīng)創(chuàng)造了包含用臨床顯著的抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的數(shù)以?xún)|計(jì)的克隆的表位文庫(kù)(Scott,J.K.和G.P.Smith(1990)，科學(xué)，249:286-390；Cesareni,G.(1992)FEBS Lett.307:66-70)。通過(guò)把隨機(jī)化的寡核苷酸序列(通常是pⅢ基因，該基因編碼每個(gè)噬菌體表面上的單一肽序列)結(jié)合到噬菌體基因組中來(lái)制備這樣的噬菌體文庫(kù)。在親和純化和擴(kuò)增的順序循環(huán)之后，使結(jié)合抗體的那些噬菌體在大腸桿菌中增殖并通過(guò)測(cè)序病毒脫氧核糖核酸(DNA)的相應(yīng)編碼區(qū)鑒別結(jié)合肽。在大多數(shù)情況下，隨后的研究將涉及相應(yīng)的合成肽(在建立它們結(jié)合抗體的能力之后)?；谑删w的文庫(kù)已用來(lái)模仿不連續(xù)的表位(Luzzago等(1993)，基因，128:51-57；BaLass等(1993)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，90:10638-10642)?；陔牡乃幬锏臐撛诘难獫{不穩(wěn)定性已經(jīng)成功地通過(guò)N-末端封阻或者正確的使用氨基酸類(lèi)似物得到克服(Powell,M.F.(1993)，藥物化學(xué)年報(bào)，28:285-293)。
對(duì)顯示高效價(jià)aPL抗體的患者，現(xiàn)在無(wú)可選擇的免疫專(zhuān)一的療法。在許多情況下，已經(jīng)證明用藥(如阿斯匹林、甾類(lèi)化合物和華法林)在很大程度上不充分([磷脂-結(jié)合抗體](Harris等編輯，CRC出版社，Boca Raton,FL,1991)；McNeil等，同上)。合成的模擬肽(其特征是(ⅰ)不能激活T細(xì)胞但(ⅱ)保持結(jié)合免疫B細(xì)胞的能力)用于以抗原特異性方式耐受B細(xì)胞。這項(xiàng)技術(shù)公開(kāi)在共有的、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)08/118,055(于1993年9月8日申請(qǐng))和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,268,454中，這些申請(qǐng)和專(zhuān)利以其整體與本文一并參考。如以上引用的申請(qǐng)和專(zhuān)利所公開(kāi)的，B細(xì)胞耐受力限制了綴合到多價(jià)的、穩(wěn)定的、非免疫原性效價(jià)平臺(tái)上的肽的施用，從而通過(guò)B細(xì)胞無(wú)變應(yīng)性或在交聯(lián)表面免疫球蛋白后的克隆缺失來(lái)消除抗體的產(chǎn)生。
雖然aPL抗體識(shí)別的靶表位的確切分子性質(zhì)是未知的，然而利用得自表位文庫(kù)的肽將使成功的耐受原得以構(gòu)建。用于與人類(lèi)全身紅斑狼瘡有關(guān)的腎炎的治療的B細(xì)胞耐受原也已經(jīng)在共有的美國(guó)專(zhuān)利5,276,013和5,162,515中公開(kāi)，它們以其整體與本文一并參考。
發(fā)明描述本發(fā)明在于發(fā)現(xiàn)了一種利用隨機(jī)肽噬菌體文庫(kù)的、用于鑒別在患有PAPS、APS和其它aPL抗體介導(dǎo)的疾病(如周期性中風(fēng)和習(xí)慣性流產(chǎn))的患者中為aPL抗體所識(shí)別的關(guān)鍵表位的類(lèi)似物的方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是用于篩選隨機(jī)肽噬菌體文庫(kù)以便鑒別充分模擬由aPL抗體識(shí)別的表位的肽序列的一種改進(jìn)方法。該方法包括以下步驟(a)利用從本領(lǐng)域已知的那些方法修改的方法來(lái)生物淘選(biopanning)所說(shuō)的文庫(kù)；(b)通過(guò)(ⅰ)在涂布有結(jié)合到蛋白質(zhì)G的aPL抗體的微量板孔中培養(yǎng)噬菌體，(ⅱ)洗滌微量板孔以移去未結(jié)合的噬菌體，(ⅲ)洗脫結(jié)合的噬菌體，以及(ⅳ)用洗脫的噬菌體感染微生物(如大腸桿菌)，并通過(guò)在瓊脂上進(jìn)行平板接種來(lái)計(jì)算被感染過(guò)的微生物的數(shù)量，通過(guò)微量淘選(micropanning)由步驟(a)篩選得到的噬菌體來(lái)除去結(jié)合很弱的噬菌體；(c)通過(guò)(ⅰ)用aPL抗體涂布微量板孔，(ⅱ)在所涂布的孔中培養(yǎng)為(b)中微量淘選所鑒別的最強(qiáng)結(jié)合的克隆，并洗掉未結(jié)合的噬菌體，(ⅲ)在比色ELISA測(cè)定中利用酶綴合的山羊抗噬菌體抗體計(jì)算結(jié)合至抗體上的噬菌體的數(shù)量，通過(guò)噬菌體俘獲ELISA的評(píng)價(jià)確定在(b)中回收的最強(qiáng)結(jié)合克?。蝗绻b別到若干相同強(qiáng)結(jié)合的克隆，則附加一步(d)在最強(qiáng)結(jié)合噬菌體俘獲ELISA克隆上進(jìn)行噬菌體ELISA。
在這一點(diǎn)上，本發(fā)明包括用于鑒別特異性結(jié)合aPL抗體(分離自患有aPL抗體介導(dǎo)的疾病的患者)之表位的類(lèi)似物的方法，該方法包括(a)制備噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)；(b)篩選所說(shuō)的具有aPL抗體的文庫(kù)，以鑒別aPL模擬表位，其中所說(shuō)的篩選包括(ⅰ)通過(guò)生物淘選篩選所說(shuō)的文庫(kù)；(ⅱ)通過(guò)微量淘選篩選經(jīng)(ⅰ)中的生物淘選分離的噬菌體；以及(ⅲ)通過(guò)免疫測(cè)定鑒別在(ⅱ)中回收的包含aPL抗體高親和性結(jié)合肽的噬菌體。
本發(fā)明也包括一種生物淘選噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)以鑒別和分離結(jié)合到aPL抗體上的肽的方法，該方法包括(a)使親和純化的aPL抗體與攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體反應(yīng)；(b)回收攜帶有結(jié)合到aPL抗體上的隨機(jī)肽插入片段的噬菌體；(c)用在(b)中回收的噬菌體感染微生物；和(d)在包含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)感染過(guò)的微生物以分離噬菌體。
本發(fā)明還包括一種微量淘選噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)以鑒別和分離具有與aPL抗體的高結(jié)合親和性的肽的方法，該方法包括(a)通過(guò)生物淘選分離攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體；(b)在涂布有結(jié)合到蛋白質(zhì)G上的aPL抗體的微量板孔中培養(yǎng)步驟(a)中回收的噬菌體；(c)洗滌微量板孔，除去未結(jié)合的噬菌體；(d)洗脫結(jié)合的噬菌體；(e)用在(d)中回收的噬菌體感染微生物；和(f)在包含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)感染過(guò)的微生物以分離噬菌體。
本發(fā)明也包括上述的方法，其中免疫測(cè)定是噬菌體俘獲ELISA，該方法包括(a)在涂布有aPL抗體的微量板孔中，培養(yǎng)通過(guò)微量淘選分離的攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體；(b)洗掉未結(jié)合的噬菌體；(c)在孔中溫育酶標(biāo)記的抗噬菌體抗體；(d)洗掉未結(jié)合的酶標(biāo)記的抗噬菌體抗體；(e)添加比色底物；和(f)測(cè)量底物的吸收率，以鑒別高溫(high-t)親和性結(jié)合噬菌體。
本發(fā)明也包括上述的方法，并且還包括進(jìn)行附加的高親和性結(jié)合噬菌體的噬菌體俘獲ELISA測(cè)定，該方法包括(a)在微量板孔上涂布上相同數(shù)量的噬菌體；(b)在孔中培養(yǎng)aPL抗體；(c)洗掉未結(jié)合抗體；(e)用結(jié)合的aPL抗體與酶標(biāo)記的抗aPL抗體一起培養(yǎng)；(f)洗掉未結(jié)合的酶標(biāo)記的抗aPL抗體；(g)將比色底物添加至孔中；(h)測(cè)量底物的吸收率，以測(cè)量噬菌體的相對(duì)結(jié)合親和性。
本發(fā)明也包括以上所述的方法，其中所說(shuō)的免疫測(cè)定是一種菌落印跡免疫測(cè)定，該方法包括(a)在包含瓊脂的培養(yǎng)基頂上的硝酸纖維素膜上培養(yǎng)受到攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體感染的微生物；(b)通過(guò)在包含瓊脂的培養(yǎng)基頂上的第二個(gè)硝酸纖維素膜上印跡微生物來(lái)復(fù)制轉(zhuǎn)移(a)中培養(yǎng)的微生物；(c)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移的微生物；(d)裂解所說(shuō)的微生物；(e)用溶菌酶消化微生物；(f)用明膠溶液封阻膜；(g)將aPL抗體與膜一起培養(yǎng)；(h)洗掉未結(jié)合的aPL抗體；(i)將硝酸纖維素膜與酶標(biāo)記的抗aPL抗體一起培養(yǎng)；(j)洗掉未結(jié)合的酶標(biāo)記的抗aPL抗體；(k)添加比色底物；和(l)測(cè)量底物的吸收率以鑒別高親和性結(jié)合的噬菌體。
本發(fā)明也包括一種用于測(cè)定和分級(jí)親和結(jié)合特征表位的方法，所說(shuō)的表位特異性結(jié)合分離自患有aPL抗體介導(dǎo)的疾病的患者的aPL抗體，該方法包括(a)用心磷脂涂布微量滴定板的孔；(b)添加成年?；蛉搜遄鳛棣?-GPI源以結(jié)合心磷脂并阻止與平板的孔的非特異性結(jié)合；(c)溫育單體類(lèi)似物溶液和高效價(jià)的aPL抗體一段預(yù)定的時(shí)間；(d)向微量滴定板孔中添加aPL抗體/類(lèi)似物混合物并溫育一段預(yù)定的時(shí)間；(e)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的aPL抗體；(f)將與標(biāo)記(例如，酶)綴合的抗人類(lèi)IgG添加到平板孔中，培養(yǎng)一段預(yù)定的時(shí)間；(g)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的抗人類(lèi)IgG綴合物；(h)添加標(biāo)記的綴合物的底物，進(jìn)行底物/標(biāo)記反應(yīng)一段預(yù)定的時(shí)間；(i)測(cè)量底物/標(biāo)記反應(yīng)的最終-產(chǎn)物以定量結(jié)合至孔上的aPL抗體的量；(j)計(jì)算aPL抗體結(jié)合的抑制作用(如果有的話)百分比，以確定類(lèi)似物對(duì)aPL抗體的親和性。
本發(fā)明的另一方面包括測(cè)定結(jié)合到aPL抗體上的肽的解離常數(shù)的熒光極化肽結(jié)合測(cè)定。這一測(cè)定檢測(cè)肽與aPL抗體的直接結(jié)合。
本發(fā)明也包括一種用于確定aPL抗體在得自懷疑患有aPL抗體介導(dǎo)的疾病的患者的體液中的存在的診斷免疫測(cè)定法，該測(cè)定法包括使特異性結(jié)合aPL抗體的表位的類(lèi)似物與體液樣品接觸，以及利用本領(lǐng)域所熟知的方法來(lái)確定aPL抗體是否在體液中存在，如果存在，則定量在液體中存在的aPL抗體的量。一個(gè)這樣的免疫測(cè)定法包括(a)用特異性結(jié)合aPL抗體的表位的類(lèi)似物涂布在微量滴定板的孔上；(b)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的類(lèi)似物；(c)將體液試驗(yàn)樣品添加至孔中，并溫育一段預(yù)定的時(shí)間；(d)洗滌孔以除去未結(jié)合的試驗(yàn)樣品；(e)將與標(biāo)記綴合的抗人IgG添加到平板孔中，溫育一段預(yù)定的時(shí)間；(f)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的抗人IgG綴合物；(g)添加標(biāo)記的綴合物的底物，并進(jìn)行底物/標(biāo)記反應(yīng)一段預(yù)定的時(shí)間；(h)測(cè)量底物/標(biāo)記反應(yīng)的最終產(chǎn)物，以確定抗aPL抗體在試驗(yàn)樣品中的存在。本發(fā)明也包括一種如上所述的診斷免疫測(cè)定法(其中的免疫測(cè)定是定量的)。
噬菌體ELISA測(cè)定包括(ⅰ)在微量滴定板的孔上涂布上相同量的不同克隆，隨后(ⅱ)通過(guò)在孔中添加抗體并用酶標(biāo)記抗人IgG綴合物發(fā)展該反應(yīng)來(lái)鑒別最強(qiáng)地結(jié)合aPL抗體的肽插入片段。具有與aPL抗體的高結(jié)合親和性(正如由噬菌體ELISA、菌落印跡或噬菌體俘獲ELISA所測(cè)量的)的噬菌體所顯示的隨機(jī)肽表示aPL特定的表位的類(lèi)似物。然后合成這些肽并用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法按結(jié)合強(qiáng)度分級(jí)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是特異性結(jié)合到B細(xì)胞(aPL表位結(jié)合到其上)上的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物。優(yōu)化的類(lèi)似物缺乏T細(xì)胞表位。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)方面是引發(fā)耐受aPL免疫原的特定B細(xì)胞的組合物，該組合物包含非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子和aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物的綴合物，所說(shuō)的抗體結(jié)合類(lèi)似物(a)特異性結(jié)合B細(xì)胞(aPL免疫原結(jié)合于其上)和(b)缺乏T細(xì)胞表位。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示在市售的aPL抗體標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測(cè)定中魚(yú)明膠取代成年牛血清廢除了所有抗心磷脂(ACA)活性。這一結(jié)果支持了McNeil等(同上)和Galli等(同上)的研究結(jié)果(涉及β2-糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)在定義ACA的靶表位中的重要性)。
圖2顯示樹(shù)脂結(jié)合類(lèi)似物5AI2免疫專(zhuān)一地結(jié)合到親和純化的IgG(命名為ACA-6501)上。
圖3說(shuō)明通過(guò)利用ACA-6626篩選得到的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物結(jié)合aPL抗血清但不結(jié)合正常的血清。
圖4也說(shuō)明ACA 6501/5AI2類(lèi)似物免疫專(zhuān)一地結(jié)合ACA-6501抗血清，并與ACA-6626進(jìn)行交叉反應(yīng)。
圖4和5說(shuō)明，當(dāng)通過(guò)利用本發(fā)明范圍之內(nèi)的方法篩選得到的ACA6501/5AI2和ACA 6626/4D3 aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物優(yōu)選地與篩選抗體結(jié)合時(shí)，檢測(cè)到明顯程度的交叉反應(yīng)。
圖6說(shuō)明用于計(jì)算ACA-6501aPL抗體的GPL值的方法。
圖7顯示與GPL標(biāo)準(zhǔn)血清相比的親和性分離的ACA-6501活性。
圖8說(shuō)明在通過(guò)第四次生物淘選分離得到的克隆的序列多樣性方面的明顯下降。
圖9說(shuō)明在用ACA-6635的噬菌體俘獲ELISA中三個(gè)克隆(3AI2、3B3和3A5)顯示出很強(qiáng)的免疫專(zhuān)一的信號(hào)，而所試驗(yàn)的所有克隆與正常的IgG都無(wú)反應(yīng)。
圖10顯示在用ACA-6501的噬菌體ELISA中七個(gè)克隆顯示出強(qiáng)的信號(hào)。
圖11顯示利用ACA-6501用肽5AI2、CB2和3B10得到的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ELISA的結(jié)果。0.16μg的肽5AI2對(duì)ACA-6501aPL抗體與四價(jià)肽ACA6501/3B10(結(jié)合至聚苯乙烯微量板孔上)的結(jié)合產(chǎn)生50％的抑制作用，而需要0.08μg CB2和0.54μg 3B10來(lái)產(chǎn)生50％的抑制作用。
圖12說(shuō)明修飾的ACA-6641/3G3類(lèi)似物的競(jìng)爭(zhēng)活性。
圖13說(shuō)明在用ACA-6501 aPL抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ELISA中肽139、142和143的50％抑制值分別是6.9、0.7和0.9μg。
圖14說(shuō)明在肽3B10中的3、9位和3與9兩個(gè)位上取代α-Me-Pro的效應(yīng)。與“天然”肽相比，在9位的α-Me-Pro的取代使肽的活性增加了四倍。
圖15顯示肽6641/3G3(LJP 688)與九種親和純化的ACA抗體高度進(jìn)行交叉反應(yīng)。
圖16和17顯示在脾細(xì)胞(得自用LJP 685-KLH免疫處理過(guò)的小鼠)分別用100、20和4μM的LJP 685-MTU-DABA-PEG綴合物(化合物36)和LJP 685-ATU-MTU-AHAB-TEG綴合物(化合物35)培養(yǎng)2小時(shí)后，利用該脾細(xì)胞在108M下在抗685抗體ABC方面的劑量依賴(lài)性的減弱。
圖18顯示最靠近上述肽925的九種結(jié)構(gòu)的質(zhì)心的核磁共振結(jié)構(gòu)，并且是肽925分子形狀的合理的表示。
圖19把肽925(在如3G3的圖的底部標(biāo)記)的結(jié)構(gòu)與肽5A12的結(jié)構(gòu)相比較。兩種肽在肽序列中大約相同的位置都有轉(zhuǎn)角。
圖20A和20B說(shuō)明aPL類(lèi)似物的藥效基團(tuán)已初步鑒定為小疏水基團(tuán)和帶正電的基團(tuán)。如圖20A所示的肽925的偕二甲基和氨基基團(tuán)初步鑒定為這個(gè)肽的藥效基團(tuán)。在圖20A中說(shuō)明了限制藥效基團(tuán)到一些支架上的碳?xì)浠衔锝宇^的長(zhǎng)度以及分開(kāi)這些接頭連到支架上的位點(diǎn)的距離。
圖21說(shuō)明通過(guò)稀釋6501血清由6501衍生的肽對(duì)β2-GPI的抑制作用。
圖22顯示CB2*-F的ACA-6701滴定FITCGPCILLARDRCG。
圖23顯示CB2*-F的ACA-6501滴定FITCGPCILLARDRCG。
圖24顯示CB2*-F的完全的ACA-6501滴定FITCGPCILLARDRCG。
圖25顯示利用1.04當(dāng)量的CB2*對(duì)來(lái)源于ACA-6701的CB2*-F的置換。
圖26顯示利用CB2*以置換來(lái)源于ACA6701的CB2*-F的cFP滴定。
圖27顯示利用3B10以置換來(lái)源于ACA6701的CB2*-F的cFP滴定。
圖28顯示(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應(yīng)。
圖29顯示(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應(yīng)。
圖30顯示在體外模型中檢驗(yàn)的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應(yīng)。
圖31顯示在體外模型中檢驗(yàn)的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應(yīng)。
圖32顯示比較各種施用途徑和劑量范圍的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的耐受效應(yīng)。
實(shí)施發(fā)明的方法A．定義本文中所用的術(shù)語(yǔ)“aPL抗體”指特異性地結(jié)合介導(dǎo)疾病的β2-GPI的任何抗體。
如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“B細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性”指需要T細(xì)胞輔助來(lái)產(chǎn)生和分泌抗體的那些B細(xì)胞的不反應(yīng)性，包括(但不限制于)未成熟和/或成熟B細(xì)胞的無(wú)性系缺失和/或B細(xì)胞無(wú)能力產(chǎn)生抗體。
“不反應(yīng)性”指在對(duì)免疫原的體液反應(yīng)方面的治療上有效性的降低。數(shù)量上的減弱(如通過(guò)抗體產(chǎn)率減少而測(cè)得的)至少是50％，優(yōu)選地至少是75％，最優(yōu)選為100％。
“抗體”指具有T細(xì)胞依賴(lài)性的那些抗體。
如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“免疫原”是指能引起體液免疫反應(yīng)的實(shí)體(包含aPL抗體)。免疫原有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。在aPL抗體介導(dǎo)的病理學(xué)中涉及的aPL免疫原可能是外部的(對(duì)個(gè)體來(lái)說(shuō)是外源的)免疫原(如藥物)，包括對(duì)個(gè)體來(lái)說(shuō)是外源的天然生物物質(zhì)(如治療蛋白質(zhì)、肽和抗體以及類(lèi)似物)或者自身免疫原(自免疫原)(如與抗體介導(dǎo)的超凝固性(中風(fēng))有關(guān)的那些自免疫原)。
免疫原的“類(lèi)似物”術(shù)語(yǔ)指一種分子，該分子(a)特異性地結(jié)合到與免疫原特異性地結(jié)合的抗體，(b)缺乏T細(xì)胞表位。盡管類(lèi)似物通常是免疫原的片段或者衍生物，并由此具有與免疫原相同的化學(xué)類(lèi)別(例如，免疫原是多肽而類(lèi)似物也是多肽)，但化學(xué)相似不是必要的。因此，只要類(lèi)似物具有以上(a)和(b)的功能特征，則它可以具有與免疫原不同的化學(xué)類(lèi)別(如免疫原是碳水化合物而類(lèi)似物是多肽)。類(lèi)似物可能是肽、碳水化合物、脂類(lèi)、脂多糖、核酸或其他生化體。另外，免疫原和類(lèi)似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)都不需限定于本發(fā)明的目的。
免疫原的“類(lèi)似物”術(shù)語(yǔ)也包括術(shù)語(yǔ)“模擬表位”。術(shù)語(yǔ)“模擬表位”指一種通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)阻止抗體結(jié)合免疫原的分子。因?yàn)樗禺愋越Y(jié)合上述抗體，所以人們認(rèn)為模擬表位模仿了免疫原的抗原決定簇。
如本文所使用的，“效價(jià)平臺(tái)分子”指包含有利于一系列免疫原的類(lèi)似物的連接的位點(diǎn)的非免疫原性分子。
“非免疫原性”用來(lái)描述效價(jià)平臺(tái)分子，同時(shí)指當(dāng)對(duì)個(gè)體自身施用藥物時(shí)效價(jià)平臺(tái)分子本質(zhì)上不引起免疫反應(yīng)。
如本文所使用的，“個(gè)體”指哺乳動(dòng)物物種中的一員，并且包括人類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)、小鼠和家畜(如牛和羊)、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(如馬)和寵物(如狗和貓)。
如本文所使用的，“藥效基團(tuán)”指在aPL類(lèi)似物與抗體靶的結(jié)合中涉及到的主要基團(tuán)的三維取向和化學(xué)性質(zhì)。B.aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物的鑒別aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物可以通過(guò)篩選侯選分子來(lái)確定它們是否(a)特異性結(jié)合到aPL抗體上，以及(b)缺乏T細(xì)胞表位。與aPL抗體的特異性結(jié)合可以用常規(guī)的免疫測(cè)定法(如下列實(shí)施例提到的ELISA法)來(lái)測(cè)定，同時(shí)T細(xì)胞表位的存在與否也可由該實(shí)施例中描述的常規(guī)T細(xì)胞活性測(cè)定法確定。在這一點(diǎn)上，“特異性地結(jié)合”到血清抗體(抗免疫原的)上的類(lèi)似物顯示其合理的親和性，例如107M-1。T細(xì)胞表位的存在與否也可利用在08/118,055系列號(hào)中所公開(kāi)的氚化胸苷摻入測(cè)定法來(lái)測(cè)定。T細(xì)胞表位的存在也能通過(guò)利用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)量源于T細(xì)胞的淋巴激活素的分泌來(lái)測(cè)定。一般認(rèn)為在以上背景下不能引起胸苷的統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的摻入的類(lèi)似物缺乏T細(xì)胞表位。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到胸苷摻入的量可以隨著免疫原變化。典型的刺激指數(shù)大約低于2-3，更常見(jiàn)的是大約1-2(表明缺乏T細(xì)胞表位)。C．綴合物的制備將aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物偶聯(lián)到非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子上以制備本發(fā)明的綴合物。優(yōu)選的效價(jià)平臺(tái)分子是生物上穩(wěn)定的(即它們顯示出一種從幾小時(shí)到幾天到幾個(gè)月的活體內(nèi)排泄半壽期以賦予治療功效)，并優(yōu)選包含限定組合物的一條合成單鏈。它們通常具有在大約200至200,000的范圍內(nèi)的分子量，通常為大約200至20,000。在本發(fā)明范圍內(nèi)的效價(jià)平臺(tái)分子的例子是如聚乙二醇(PEG)、聚-D-賴(lài)氨酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。優(yōu)選的聚合物基于具有大約200至大約8,000分子量的聚乙二醇(PEGs)。
其它適合用于本發(fā)明的效價(jià)平臺(tái)分子是化學(xué)限定的、非多聚的效價(jià)平臺(tái)分子，這些分子公開(kāi)在共有的、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)08/152,506(申請(qǐng)于1993年11月15日)中，該申請(qǐng)以其整體與本文一并參考。特別優(yōu)選的同類(lèi)的化學(xué)限定的適合用于本發(fā)明的效價(jià)平臺(tái)分子是衍生的2,2’-亞乙基二氧基二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。
附加的適合的效價(jià)平臺(tái)分子包括四氨基苯、七氨基β環(huán)化糊精、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷(Cyclam)和1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷(Cyclen)。
aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物與效價(jià)平臺(tái)分子的綴合可以以許多方式實(shí)現(xiàn)，典型地包括一種或多種交聯(lián)劑以及在類(lèi)似物和效價(jià)平臺(tái)分子上的官能團(tuán)。
多肽類(lèi)似物包含氨基酸的側(cè)鏈部分，這些側(cè)鏈部分含有如氨基、羧基或者巰基(作為偶聯(lián)類(lèi)似物到載體上的位點(diǎn))的官能團(tuán)。如果類(lèi)似物還沒(méi)有這些基團(tuán)，那么可以將有這樣的官能團(tuán)的殘基添加到類(lèi)似物上。這些殘基可以用固相合成技術(shù)或者重組技術(shù)摻入，這兩種技術(shù)在肽合成領(lǐng)域中都是已知的。在碳水化合物或者脂類(lèi)類(lèi)似物的情況下，功能性氨基和巰基可用常規(guī)化學(xué)方法摻入其中。例如，伯氨基可以通過(guò)在氰基硼氫化鈉存在下與1,2-亞乙基二胺反應(yīng)來(lái)?yè)饺?，而巰基則可以通過(guò)半胱胺二鹽酸鹽的反應(yīng)以及隨后的利用標(biāo)準(zhǔn)二硫化物還原劑的還原反應(yīng)引入其中。如果不具有適合的官能團(tuán)，那么可以用一種類(lèi)似的方式產(chǎn)生包含官能團(tuán)的效價(jià)平臺(tái)分子。
可變長(zhǎng)度的親水接頭對(duì)把肽或者其它生物活性分子與效價(jià)平臺(tái)分子相連接來(lái)說(shuō)是有用的。適合的接頭包括乙二醇的線性低聚物或者聚合物。這樣的接頭包括具有R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2分子式的接頭，其中n=0-200,m=1或2,R1=H或如三苯甲基的保護(hù)基團(tuán)，R2=H或烷基或芳基(例如4-硝基苯基酯)。這些接頭對(duì)于把包含硫醇反應(yīng)基團(tuán)(如鹵乙酰、馬來(lái)酰亞胺等)的分子(通過(guò)硫醚)連接到含有的氨基的第二分子(通過(guò)酰胺鍵)上是有用的。這些接頭在連接順序上是靈活的，即硫醚可以首先或者最后形成。
通常配制綴合物供注射施用(例如腹膜內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射等)。因此，典型地是將它們與藥學(xué)上可接受的載體(如鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液等等)混合。綴合物通常占制劑重量的大約0.01％至10％。以“治療有效的量”對(duì)個(gè)體施用的綴合物，“治療有效的量”即該施用量足以使B細(xì)胞對(duì)所涉及的免疫原無(wú)反應(yīng)性并實(shí)現(xiàn)所說(shuō)的抗體介導(dǎo)的病癥的預(yù)防、改善或消除。特定的劑量方案(即劑量、用藥時(shí)間和重復(fù))取決于具體的個(gè)體以及該個(gè)體的病史。通常，每周施用一次大約1μg至100mg綴合物/kg體重的劑量，優(yōu)選為大約100μg至10mg/kg體重。其他合適的用藥方案的頻度為例如每日一次或者每周3劑，或者每周1劑，或者每2周至4周1劑，或者每月1劑，或者按照個(gè)體或者疾病狀態(tài)利用頻度較低的方案?？赡苄枰貜?fù)施用(通常按照B細(xì)胞周轉(zhuǎn)率確定施用時(shí)間)以達(dá)到和/或者保持體液無(wú)反應(yīng)性狀態(tài)。如果檢測(cè)到抗體效價(jià)上的增加，那么這樣的重復(fù)施用將典型地包括每30至60天(或者更短時(shí)間)大約1μg到10mg/kg體重(或者更高劑量)。另外，綴合物的持續(xù)不斷的釋放配方可以指示一些病態(tài)。用于實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放的各種配方和儀器是本領(lǐng)域所已知的。
抗輔助T細(xì)胞的治療可與施用綴合物一道進(jìn)行。這樣的治療通常使用抑制T細(xì)胞的藥劑(如甾類(lèi)化合物或者環(huán)孢菌素)。D．a(chǎn)PL抗體的抗原的特性本發(fā)明者在aPL抗體上的初步研究與分析被這些抗體所識(shí)別的抗原位點(diǎn)的特性的出版物相吻合。最初人們認(rèn)為這些抗體很象那些在VDRL試驗(yàn)中檢測(cè)到的抗體一樣可識(shí)別心磷脂分子。如圖1所示，在抗心磷脂抗體(ACA)固相ELISA中，以魚(yú)明膠取代成年牛血清基本上廢除了按照ACA標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)得的抗體制劑的所有ACA活性。這一發(fā)現(xiàn)表明ACA抗體識(shí)別在血清蛋白質(zhì)上的決定簇(如由McNeil等，同上和Galli等，同上所提出的)而非心磷脂本身。這些作者顯示這個(gè)蛋白質(zhì)是β2-GPI，因此術(shù)語(yǔ)“ACA”或者“抗心磷脂抗體”實(shí)際是用詞不當(dāng)，但是今天仍然用來(lái)指這些抗體。
大多數(shù)自身免疫的、IgG aPL抗體識(shí)別在β2-GPI分子上的決定簇。這些表位僅僅在它與心磷脂(新表位)結(jié)合時(shí)才形成或者暴露在β2-GPI上。另外，在β2-GPI上的表位可以存在于每個(gè)β2-GPI分子的單個(gè)拷貝之中，并且可以有較低的對(duì)aPL抗體的親和性。只有通過(guò)這些位點(diǎn)之兩個(gè)在鄰近β2-GPI分子上的排列(由它們與心磷脂的結(jié)合)，才能實(shí)現(xiàn)保持抗體-抗原相互作用的足夠親合力。
在本發(fā)明(模擬天然B2-GPI的表位)范圍之內(nèi)通過(guò)aPL類(lèi)似物的核磁共振(NMR)分析得到了對(duì)β2-GPI表位結(jié)構(gòu)的更深入了解。例如，與aPL抗體進(jìn)行高度交叉反應(yīng)的兩種肽aPL類(lèi)似物的核磁共振溶液結(jié)構(gòu)的比較顯示在肽序列(參見(jiàn)圖18和19)中，兩種肽在大約相同的位置都有轉(zhuǎn)角。E．ACA ELISA與臨床樣品的GPL得分關(guān)連的大規(guī)模檢驗(yàn)和研究抗體與β2-GPI的層析純化的必要性導(dǎo)致開(kāi)發(fā)了一種性能上與市售的試劑盒近乎一致的并且與發(fā)現(xiàn)具有最佳可再現(xiàn)性(Reber等，同上)的設(shè)計(jì)相似的aPL抗體的ELISA測(cè)定法。一種改進(jìn)的ACA ELISA也已經(jīng)完成，其中在缺少心磷脂(首先加至微量板孔中)的情況下直接結(jié)合至特定的微量平板上的β2-GPI用來(lái)直接結(jié)合aPL IgG。(參見(jiàn)Roubey等(1996)，關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病39:1606-1607；R.A.S.Roubey(1996)，關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病，39:1444-1454)。F．a(chǎn)PL抗體的免疫親合純化為了分離aPL抗體，將多層狀、包含心磷脂的分散體(脂質(zhì)體；也包含膽甾醇和三十二烷基磷酸酯)與aPL血漿(或者血清)一起溫育。這些脂質(zhì)體是通過(guò)離心從血清中沉淀得到的。在洗滌后，由2％辛基葡糖苷去垢劑破壞上述脂質(zhì)體混合物，并將其用于蛋白質(zhì)A-瓊脂糖柱。接著充分洗滌以便首先除去脂類(lèi)，然后除去非IgG組分，用弱酸把IgG aPL抗體從蛋白質(zhì)A中洗脫下來(lái)，中和、緩沖交換并在ACA ELISA中測(cè)驗(yàn)該抗體。這一方法產(chǎn)生富含高達(dá)10,000倍的aPL抗體，如利用兔IgG抗人β2-GPI抗血清的Western印跡法所示，其對(duì)β2-GPI沒(méi)有任何污染。通過(guò)在固相β2-GPI上的親和純化的抗體的層析來(lái)完成一個(gè)附加的親和純化步驟。推薦上述第二個(gè)親和純化步驟作為新發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，該新發(fā)現(xiàn)是關(guān)于直接結(jié)合到β2-GPI上的aPL抗體的更大臨床關(guān)聯(lián)的。它也用來(lái)進(jìn)一步確保最終制備物無(wú)污染，尤其是β2-GPI。G．絲狀噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)的構(gòu)建在p-Ⅲ蛋白質(zhì)上構(gòu)建十一個(gè)不同的fUSE 5絲狀噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)(每個(gè)噬菌體含5個(gè)具有肽的p-Ⅲ拷貝)。這些文庫(kù)為模擬表位的發(fā)現(xiàn)提供了大量的形狀和結(jié)構(gòu)。4個(gè)文庫(kù)(指定為“x”文庫(kù))具有肽插入片段(長(zhǎng)度分別為8、10、12和15個(gè)殘基)，并在氨基和羧基末端兩側(cè)連有脯氨酸殘基。這些脯氨酸殘基的作用在于破壞任何對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)(可能從天然P-Ⅲ蛋白質(zhì)產(chǎn)生)并使插入片段進(jìn)入溶劑。“y’”文庫(kù)包含長(zhǎng)度為6、7、8、9、11和13個(gè)氨基酸的半胱氨酸結(jié)合的插入片段。除了缺乏6和8個(gè)氨基酸的插入片段外，“y”文庫(kù)與“y’”文庫(kù)相同。“y”和“y”文庫(kù)的這些肽插入片段在氨基和羧基末端側(cè)連半胱氨酸殘基從而形成環(huán)狀的、更穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)。由于類(lèi)似于以上的“x”文庫(kù)的理由，在這些半胱氨酸殘基的外部摻入脯氨酸殘基?！皒”、“y’”和“y”文庫(kù)定位在天然p-Ⅲ蛋白質(zhì)的氨基末端的5個(gè)殘基上。“z”文庫(kù)包含定位于p-Ⅲ蛋白質(zhì)的氨基末端上的隨機(jī)的8個(gè)氨基酸插入片段，并且不包含任何側(cè)翼脯氨酸或者半胱氨酸殘基?！皒”、“y’”和“z”文庫(kù)的組合代表了十一個(gè)不同的文庫(kù)，其中每個(gè)有大約一億個(gè)不同的肽插入片段。
利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)摻入合適長(zhǎng)度(適合于產(chǎn)生所需長(zhǎng)度的、插入fUSE的p-Ⅲ基因中的插入片段)的隨機(jī)寡核苷酸序列來(lái)構(gòu)建這些文庫(kù)。在fUSE 5 DNA的限制性核酸內(nèi)切酶消化之后，加入過(guò)量的激酶寡核苷酸(作為缺口雙鏈體提供)并連接。將DNA電穿孔進(jìn)入大腸桿菌，并通過(guò)在包含四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)選擇插入片段。從上清液中分離這種培養(yǎng)物的噬菌體(包含肽插入片段)，并在緩沖液中洗滌和再懸浮。典型地，文庫(kù)在每mL8×1012轉(zhuǎn)導(dǎo)單位下顯示有7×108個(gè)獨(dú)立克隆。H．噬菌體篩選方法篩選噬菌體顯示肽文庫(kù)的本質(zhì)在于將幾十億潛在的候選噬菌體減少到相對(duì)較少的具有顯著性質(zhì)的噬菌體的能力。原來(lái)的篩選方案由Scott,J.K.和G.P.Smith(1990)(科學(xué)，249:315-324)推薦，該方案經(jīng)過(guò)大的改動(dòng)而修改為有利于選擇各種aPL抗體的最好表位。設(shè)計(jì)這些方法使選擇更加嚴(yán)格，當(dāng)篩選進(jìn)行直到達(dá)到某一點(diǎn)時(shí)，其中有用數(shù)量的代表最好序列的克隆可以得到全面的研究。對(duì)一些抗體，文庫(kù)看來(lái)似乎沒(méi)有可以結(jié)合很緊的序列，如果用高度嚴(yán)格的方法篩選，則不存在特異性的克隆。在另一方面，所說(shuō)的文庫(kù)經(jīng)常產(chǎn)生代表上述抗原的良好類(lèi)似物的許多克隆，同時(shí)有必要使用高度嚴(yán)格的方法來(lái)鑒別最好的表位。由于這一原因，開(kāi)發(fā)了不同嚴(yán)格程度的測(cè)定法，以便從表位文庫(kù)篩選中鑒別最好的表位。在這里按逐漸增加的嚴(yán)格程度的順序列出測(cè)定法；生物淘選＜微量淘選＜噬菌體俘獲ELISA＜噬菌體ELISA=菌落印跡=肽ELISA。
(ⅰ)生物淘選“生物淘選”描述這樣的技術(shù)，其中使親和純化的aPL抗體和攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體混合，而后抗體-特異性回收俘獲結(jié)合的噬菌體。噬菌體賦予大腸桿菌(在包含四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)然后分離的)以四環(huán)素抗性。多輪生物淘選增加了樣品中免疫專(zhuān)一的噬菌體的數(shù)量。噬菌體總是在3至5輪選擇后得到回收，但是可以?xún)H代表對(duì)選擇的抗體以低親和性非特異性結(jié)合的序列。用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些噬菌體的方法(微量淘選)是需要的。
(ⅱ)微量淘選噬菌體與aPL抗體的結(jié)合的相對(duì)強(qiáng)度的估計(jì)可以通過(guò)“微量淘選”來(lái)進(jìn)行。微量淘選是在3輪或更多輪生物淘選后進(jìn)行的并使用與生物淘選方法相同的抗體。該方法包括稀釋來(lái)自生物淘選的最后一輪的噬菌體，通過(guò)微量淘選對(duì)50或更多個(gè)這樣的克隆進(jìn)行分析。通過(guò)使每個(gè)克隆生長(zhǎng)到相似的密度，并在預(yù)先涂布有常量抗體的微量滴定孔中在最適的單一濃度下培養(yǎng)稀釋的噬菌體來(lái)完成微量淘選。噬菌體的最適的單一濃度是最有可能揭示最寬范圍的微量淘選得分(從0到4+)并因此使得在測(cè)驗(yàn)的克隆中間有最大差別的那一濃度。它是基于6個(gè)隨機(jī)選擇的克隆的微量淘選行為，其中的得分是在由系列稀釋獲得的幾個(gè)噬菌體濃度之每一個(gè)下確定的。在與抗體一起培養(yǎng)之后，洗掉未結(jié)合的噬菌體，并將結(jié)合噬菌體的量用作為噬菌體插入片段對(duì)抗體的親和性的指示。結(jié)合噬菌體的量是由弱酸洗脫隨后中和并以大腸桿菌感染來(lái)確定的。通過(guò)將該微生物平板接種在含四環(huán)素的瓊脂平板上，然后確定每個(gè)克隆所達(dá)到的菌落密度，來(lái)定量感染的大腸桿菌的數(shù)量。
(ⅲ)噬菌體俘獲ELISA開(kāi)發(fā)噬菌體俘獲ELISA試驗(yàn)以提供一種中等水平測(cè)定來(lái)在比較低的嚴(yán)格程度的微量淘選測(cè)定和高的嚴(yán)格程度的噬菌體或肽ELISA測(cè)定之間的間隙搭橋。初步的研究顯示通過(guò)微量淘選(但是沒(méi)有通過(guò)噬菌體ELISA或者肽ELISA)一些抗體制劑給出太多陽(yáng)性克隆。以下所描述的噬菌體ELISA的限制是只有p-Ⅲ的五個(gè)拷貝位于每個(gè)噬菌體中，即使將大量噬菌體涂布在孔上，也只有插入片段的極少拷貝被體現(xiàn)，并且檢測(cè)需要抗體對(duì)插入片段有十分高的親和性。通過(guò)噬菌體俘獲ELISA，信號(hào)擴(kuò)增許多倍從而有利于低親和性的檢測(cè)以及上述抗體與上述插入片段之間的穩(wěn)定的相互作用。
噬菌體俘獲ELISA包括下列步驟。在微量滴定孔上涂布aPL抗體，并如在微量淘選測(cè)定中添加噬菌體克隆。洗掉未結(jié)合的噬菌體，利用酶綴合的山羊抗血清(結(jié)合噬菌體的大多數(shù)外殼蛋白)來(lái)定量結(jié)合噬菌體的量。使利用噬菌體俘獲ELISA篩選得到的噬菌體與許多aPL抗體反應(yīng)，并在隨后進(jìn)行的ELISA測(cè)定中提供強(qiáng)信號(hào)。這一中等水平的靈敏性使得肽合成更為有效率，因?yàn)闃O少微量淘選陽(yáng)性的噬菌體是噬菌體俘獲ELISA陽(yáng)性的。結(jié)果是，由陽(yáng)性的噬菌體俘獲ELISA噬菌體合成的肽一般是免疫反應(yīng)性的。
(ⅳ)噬菌體ELISA這種選擇噬菌體的方法要求插入片段十分緊地結(jié)合篩選的抗體。將噬菌體直接涂布在微量滴定板的孔上并與篩選的抗體一起培養(yǎng)。隨后洗掉未結(jié)合的抗體，添加抗人IgG堿性磷酸酶綴合物以結(jié)合任何結(jié)合到噬菌體上的aPL抗體。然后按照本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)在孔中加入比色底物(其將與堿性磷酸酶反應(yīng))來(lái)檢測(cè)APL抗體。
(ⅴ)菌落印跡該測(cè)定方法使得可以大規(guī)模地菌落篩選由生物淘選噬菌體感染的大腸桿菌。這一方法可替代噬菌體ELISA來(lái)鑒別免疫反應(yīng)的克隆，并且顯示出類(lèi)似的靈敏性水平而不需要在試驗(yàn)前培養(yǎng)單獨(dú)的噬菌體克隆。在這種測(cè)定中，將受到來(lái)源于一輪生物淘選的噬菌體感染的大腸桿菌涂布在一個(gè)大直徑的硝酸纖維素(NC)膜上并且在含四環(huán)素的瓊脂平板的表面上培養(yǎng)一夜(Barbas等(1991)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88:7978-7982)。每個(gè)菌落從含有相同序列的噬菌體的感染產(chǎn)生。利用這種NC“主培養(yǎng)基”在NC上制得若干復(fù)制轉(zhuǎn)移印跡，并且使這些印跡得以在瓊脂平板的表面上生長(zhǎng)。在印跡上的噬菌體感染的菌落的化學(xué)和酶促破壞后，可以用一般用于Western印跡法的技術(shù)(即用染色或者免疫印跡)來(lái)探測(cè)噬菌體。被封阻的印跡可與篩選的aPL抗體一起培養(yǎng)。在洗掉未結(jié)合的抗體后，添加抗人IgG辣根過(guò)氧化物酶綴合物以結(jié)合任何結(jié)合到噬菌體上的aPL抗體。比色底物的添加使得人們可以定位在主平板中的離散菌落，該菌落代表可被克隆供進(jìn)一步研究的免疫專(zhuān)一的噬菌體。
(ⅵ)肽ELISA
在用上述測(cè)定方法確定最佳反應(yīng)的噬菌體的肽插入序列的DNA測(cè)序之后，利用本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc肽化學(xué)制備相應(yīng)的肽。對(duì)于肽ELISA測(cè)定，可以制得上述肽，例如制成分支四價(jià)分子(即每個(gè)分子有插入片段的四個(gè)拷貝)。這樣的分子可以涂布在微量滴定板的孔上，并且仍然使表位向溶液暴露從而使之得以與抗體結(jié)合。以類(lèi)似于用于多抗原肽類(lèi)(MAPS)的方法(Posnett等(1988)，生物化學(xué)雜志，263:1719-1725)，通過(guò)摻入賴(lài)氨酸作為頭兩個(gè)偶聯(lián)的分支點(diǎn)來(lái)合成四價(jià)肽。將由甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸組成的間隔添加在賴(lài)氨酸之后的每個(gè)臂上，然后添加插入片段(包括在噬菌體中所發(fā)現(xiàn)的構(gòu)架氨基酸，在羧基末端的脯氨酸-甘氨酸，和在氨基末端的丙氨酸-甘氨酸脯氨酸)。利用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方法將所有利用這種合成的氨基酸一次加入一個(gè)。
這些肽由ELISA測(cè)定，即通過(guò)把這些肽涂布在微量滴定的孔上，然后以一種標(biāo)準(zhǔn)的ELISA格式測(cè)定它們與aPL抗體的反應(yīng)性。實(shí)際上，肽通常很強(qiáng)地結(jié)合在原來(lái)的篩選抗體上，同時(shí)顯示與其它aPL抗體的一定的交叉反應(yīng)性。包括非aPL抗體的對(duì)照以除去非特異性結(jié)合肽類(lèi)。
(ⅶ)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合肽ELISA一旦ELISA陽(yáng)性的肽類(lèi)得到鑒別，就有必要定量它們相應(yīng)的對(duì)aPL抗體的結(jié)合親和性，同時(shí)通過(guò)肽競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定來(lái)確定是否兩肽結(jié)合在給定的病人血清中的相同的抗體群。在這種測(cè)定中，各種單體肽與涂布在微量滴定板上的四價(jià)肽競(jìng)爭(zhēng)。為完成測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)將要評(píng)價(jià)的肽合成為單體(即沒(méi)有在四價(jià)肽的合成中所用的賴(lài)氨酸分支)。然后將單體肽純化，并且以已知濃度溶解。在微量滴定板的孔中涂布已知結(jié)合到aPL抗體上的四價(jià)肽。系列稀釋的單體肽與恒定量稀釋的aPL抗體一起溫育。通過(guò)滴定抗四價(jià)肽的抗體和在滴定率曲線的下斜部分上選擇稀釋度來(lái)預(yù)先確定aPL抗體的稀釋度。在溫育抗體和單體肽一小時(shí)后，將抗體/肽溶液添加到微量滴定孔中并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的比色ELISA。通過(guò)繪制每個(gè)孔的比色讀數(shù)的散點(diǎn)圖來(lái)測(cè)定減弱aPL抗體與四價(jià)肽的結(jié)合的每個(gè)單體肽的濃度。50％的抑制點(diǎn)用來(lái)測(cè)量單體肽的結(jié)合的相對(duì)強(qiáng)度。
這一測(cè)定方法的一個(gè)變化是利用涂布有人類(lèi)β2-糖蛋白Ⅰ/心磷脂(β2-GPI/CL)(而不是四價(jià)肽)的微量滴定板，并檢驗(yàn)單體肽封阻aPL抗體與在β2-GPICL上的表位的結(jié)合的能力。在這種測(cè)定中，在最適濃度下的IgG耗盡的人類(lèi)血清用作β2-GPI的來(lái)源。用類(lèi)似于利用四價(jià)肽作為平板底物的測(cè)定法，將若干濃度的單體肽與最適濃度的aPL抗體一起溫育。在aPL/肽于(β2-GPI/CL)平板上溫育后，在四價(jià)測(cè)定的半最大吸收率處確定抗體結(jié)合和50％抑制所需的肽濃度。
這一測(cè)定的另一個(gè)變化檢驗(yàn)單體肽封阻aPL抗體與β2-GPI(直接涂布在Nunc Maxisorp微量滴定平板的孔上的)的結(jié)合的能力。在這一變化中，省略心磷脂的利用而代之以魚(yú)明膠，所利用的稀釋劑和封阻劑是無(wú)脂牛奶/Tween。
(ⅷ)熒光極化肽結(jié)合測(cè)定這一測(cè)定檢測(cè)到肽與aPL抗體的直接結(jié)合。由于aPL抗體結(jié)合到β2-GPI(抗原)上，因此ELISA競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定能夠顯示由于結(jié)合到β2-GPI上而致的抑制作用以及由于肽結(jié)合到aPL抗體上而致的抑制作用。因?yàn)樾枰c抗體的結(jié)合以便起作為耐受原的作用，因此重要的是確立肽能夠直接結(jié)合到aPL抗體上。這一測(cè)定用來(lái)測(cè)量結(jié)合到兩種aPL抗體(ACA-6501和ACA-6701)上的肽的解離常數(shù)。而ELISA測(cè)定對(duì)于高流通量篩選來(lái)說(shuō)是有用的，因?yàn)樗枰葻晒鈽O化測(cè)定少的抗體，然而，ELISA陽(yáng)性的肽應(yīng)該由熒光極化測(cè)定來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)以確定它們是否能直接與aPL抗體結(jié)合。
(ⅸ)以取代和缺失合成來(lái)評(píng)價(jià)氨基酸對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)耐受誘導(dǎo)所需表位應(yīng)該盡可能與許多aPL抗體有強(qiáng)的相互作用并且不包含任何不必要的殘基。為了推導(dǎo)一個(gè)表位的最小構(gòu)造，制造了每種肽的類(lèi)似物；該類(lèi)似物(ⅰ)缺乏所給定的殘基，例如缺失在羧基和/或氨基末端的構(gòu)架殘基，或者(ⅱ)其中的氨基酸的取代已進(jìn)行而又不同于在表位文庫(kù)篩選中發(fā)現(xiàn)的序列。這些氨基酸取代可以是天然的，例如異亮氨酸取代亮氨酸，或者非天然的，例如α-甲基脯氨酸取代脯氨酸。然后由肽競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定這些缺失和/或取代的效果。
(ⅹ)通過(guò)β2-GPI第5域的誘變來(lái)分組aPL血清特異性作為一般有效的耐受原，它必須結(jié)合在大多數(shù)患者中的aPL抗體的主要部分上。重要的是確定來(lái)自不同的患者的幾個(gè)抗體是否結(jié)合β2-GPI(其他人已提出其含有靶表位)的84個(gè)氨基酸第5域內(nèi)的相同殘基。如果幾個(gè)抗體結(jié)合相同殘基，則可以構(gòu)建來(lái)源于肽結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)中的單個(gè)模擬表位，它將與所有抗體進(jìn)行反應(yīng)。在另一方面，如果抗體結(jié)合不同的殘基，則每個(gè)抗體需要單一耐受原。進(jìn)行定點(diǎn)誘變來(lái)鑒別aPL抗體結(jié)合中所涉及的關(guān)鍵殘基是否存在于β2-GPI的第5域中。測(cè)定所產(chǎn)生的突變體β2-GPI與幾個(gè)aPL抗體的反應(yīng)性。結(jié)果是不確定的。包含β2-GPI的第5域和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白質(zhì)得自A.Steinkasserer，并在大腸桿菌中表達(dá)(Steinkasserer等(1992),FEBS Lett.313:193-197)。這一融合蛋白成功地取代了在ACA ELISA中的天然β2-GPI。用標(biāo)準(zhǔn)的定點(diǎn)誘變來(lái)進(jìn)行氨基酸的取代。I．合成的aPL表位的分離來(lái)自具有151 GPL得分(高滴度)并有周期性中風(fēng)、流產(chǎn)、狼瘡、和三大血管瓣替代的歷史的患者的抗體ACA-6501在心磷脂脂質(zhì)體上進(jìn)行免疫親和純化。利用xy、xyz、xy’z和特殊的pro/cys結(jié)合的7-mer文庫(kù)(其中基于以前的篩選，將精氨酸固定在第七個(gè)位置)，該抗體用于四個(gè)分開(kāi)的噬菌體文庫(kù)篩選。如表1所示，在(從140個(gè)試驗(yàn)中)微量淘選的噬菌體中得到36種序列。這些序列顯得十分同源，并且在位置6和7的保守DR殘基是非常明顯的。共有的序列是CLLLAPDRC。盡管有這樣的同源性，但只有7個(gè)噬菌體(見(jiàn)表2)在噬菌體ELISA比色檢驗(yàn)之后為陽(yáng)性。用親和純化的ACA-6626(來(lái)自有高的但比ACA-6501的低的滴度的病人)篩選xy’z噬菌體產(chǎn)生五種為噬菌體ELISA所試驗(yàn)的單一序列。沒(méi)有一種序列是顯色陽(yáng)性的，但是當(dāng)用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行ELISA免疫綴合時(shí)，兩種序列是陽(yáng)性的。與ACA-6626聯(lián)系的序列基序似乎是相互聯(lián)系的但是不同于用ACA-6501所看到的序列基序(見(jiàn)表3)。兩個(gè)抗體優(yōu)選在開(kāi)放的前結(jié)合序列上的Cys結(jié)合的(可能是環(huán)化的和受約束的)表位。
表1ACA-6501噬菌體文庫(kù)序列克隆序列克隆序列xy文庫(kù)2101CNILVLDRCxyz文庫(kù)5AI2 CLILAPDRC3C10 CILLAKNRC2D7CLLLAPDRC3C5CIVLVPDRC3B6CLVLALDRC2F4CLVIALDRC3E4CLFVALDRC5B1CWFRSQSSC3E7CILLAHDRC3E1I CSPILRGNC2H1CIILAPGRC3E8CHKFFWLTCxy’z文庫(kù)2A10 CTILAPDRC2D12 CLVLAADRC2G12 CLLITPDRC3B10 CLLLAPDRC2G11 CLLITHDRC3F2CFFHFDHSC2F10 CNILVLDRC2D3CPLHTHHTC2E3CPLITHDRC常規(guī)(X)6R文庫(kù)G11CTILTPDRC1A4CNLLALDRC2H5CTILTPDRC2H6CNLLAIDRC2H2CTILTLDRC1C3CLLLAIDRC2H10CTLLTPDRC1D10 CTIITQDRC2E10CIQLTPDRC2H4CNIITRDRC1B7CHLLTPDRC2G12 CILHAAHRC2H1CLILTPDRC1A9CSSKSYWRC2H12CSILAPDRCxy’z文庫(kù)，菌落印跡篩選測(cè)定CB2CILLARDRC表2ACA-6501比色ELISA陽(yáng)性的噬菌體克隆 序列克隆序列5A12CLILAPDRC 3B6CLVLALDRC2H1 CLILTPDRC 2G11CTILTPDRC3B10CLLLAPDRC*3E7CILLAHDRC2H2 CTILTLDRC*對(duì)應(yīng)于共有或平均序列表3ACA-6626 xy’z噬菌體文庫(kù)序列克隆 序列 克隆序列4B11CGNAADARC4G7CTNLTDSRC4D3 CTNWADPRC4A2CGNPTDVRC4C7 CGNLADPRC按照本文描述的方法，ACA-6644是用來(lái)篩選混合的p-Ⅲ噬菌體文庫(kù)的另一個(gè)高滴定的aPL抗體。發(fā)現(xiàn)以下序列；ACA-6644/CBeGILLNEFAACA-6644/CBdGILTIDNLACA-6644/CBfGILALDYV這些序列都來(lái)自組分“z”表位文庫(kù)，其在N-末端缺乏噬菌體構(gòu)架殘基。當(dāng)合成為肽時(shí)，這些序列與幾種ACA血清(包括ACA-6644和ACA-6501)發(fā)生免疫反應(yīng)。分析揭示這些序列與以前用ACA-6501獲得的序列有出乎意料的同源性，如表4所示。表4ACA-6644/CBd GILTIDNLACA-6501/2H2 CTILTLDRCACA-6644/CBf GILALDYVACA-6501/2F10CNILVLDRCACA-6644/CBcGILLNEFAACA-6501/1D10 CTILTODRC來(lái)源于由這兩種aPL抗體篩選的兩個(gè)十分不同的源文庫(kù)的趨同序列的同源性表明這些序列可以模仿天然靶抗原中的主要區(qū)域(可能是優(yōu)勢(shì)免疫的)。
用ACA-6701對(duì)P-Ⅲ文庫(kù)的篩選產(chǎn)生出有高度的內(nèi)部同源性的兩種單一序列，但是不同于以前以其它aPL抗體獲得的其它序列。序列如下所示ACA-6701/3B1LSDPGYVRNIFHACA-6701/3E1LTDPRYTRDISNFTD作為樹(shù)脂結(jié)合肽類(lèi)，該序列與親本血清(ACA-6701)有強(qiáng)免疫反應(yīng)性，但是與其它aPL抗體有最小的交叉反應(yīng)性。
用親和純化的ACA抗體對(duì)隨機(jī)的pⅢ噬菌體文庫(kù)進(jìn)行繼續(xù)篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種肽，該肽顯示出與抗最初試驗(yàn)的肽的所有九種親和純化的ACA抗體有明顯的交叉反應(yīng)性。這種肽和其它四種肽的性能顯示在表5中。所有五種肽的肽序列緊接著列在該表之后。利用本文所述的CL/β2-GPI平板利用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合肽ACA ELISA來(lái)檢驗(yàn)所有肽。表5肽單體對(duì)AffACA的抑制百分率肽 6626 6638 6641 6644 6701 7004 7005 6903 6501Ave.6641/3G3 100 10093 100 100 100 9510086971mg/mL6501/3B10 768752555187476960651mg/mL6626/4C7889645456999547739681mg/mL6701/3B1436543379672235141521mg/mL6644/CBf37602818225457433739200μg/mL肽 序列ACA-6641/3G3AGPCLGVLGKLCPGACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPGACA-6626/4C7AGPDNIADPRCPGACA-6701/3B1AGPLSDPGYVRNIFHPGACA-6644/CBfGILALDYVGG爾后的檢驗(yàn)測(cè)得這種肽(具有AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)序列的ACA-6641/3G3)是與一些ACA抗血清交叉反應(yīng)的。通過(guò)截短、系統(tǒng)性氨基酸取代以及非二硫化物環(huán)化研究進(jìn)行這種肽的化學(xué)優(yōu)化。
從隨機(jī)噬菌體文庫(kù)篩選中選擇的幾個(gè)肽的基序如下所列。表6ACA抗體 噬菌體插入序列6501CLLLAPDRC(3B10)6626CTNWADPRC6641CLGVLGKLC(3G3)6644GILALDYV6701LTDPRYTRDISNFTD6707CAHPDWDRCJ．a(chǎn)PL有關(guān)的肽與親和純化的IgG aPL抗體的免疫反應(yīng)性在最近開(kāi)發(fā)的用于組合合成肽文庫(kù)的固相支持體上合成噬菌體序列(用親和純化的ACA-6501獲得的并發(fā)現(xiàn)呈噬菌體ELISA陽(yáng)性的)。這種支持體是一種Rapp樹(shù)脂，有高的肽密度并在第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)前使用親水聚乙二醇間隔區(qū)。該合成產(chǎn)生樹(shù)脂結(jié)合的肽，該肽十分適合用于抗體結(jié)合研究。如圖2所示，肽5A12(序列CLILAPDRC)明顯地優(yōu)于一種無(wú)關(guān)的對(duì)照肽，但不顯著地結(jié)合正常的IgG。測(cè)驗(yàn)其它的噬菌體ELISA陽(yáng)性肽類(lèi)獲得了類(lèi)似結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中顯示，通過(guò)免疫結(jié)合顯色反應(yīng)檢測(cè)到樹(shù)脂肽結(jié)合的親和純化的aPL抗體。K.aPL血清抗體與合成肽的反應(yīng)性利用血清可使樹(shù)脂結(jié)合肽類(lèi)免疫專(zhuān)一地結(jié)合aPL的發(fā)現(xiàn)顯著提高了測(cè)驗(yàn)aPL抗體的能力。如圖3所示，來(lái)自用ACA-6626篩選的肽結(jié)合aPL抗血清但沒(méi)有顯示出與正常血清的顯著結(jié)合。圖3也說(shuō)明了ACA-6501-5A12肽與aPL血清的免疫專(zhuān)一結(jié)合行為。在數(shù)據(jù)中是零的正常血清與肽5A12的結(jié)合沒(méi)有顯示。L．合成肽與不是文庫(kù)篩選抗體來(lái)源的aPL抗血清的交叉反應(yīng)性選擇兩個(gè)肽用于aPL血清測(cè)定，一個(gè)(5A12)代表ACA-6501篩選而另一個(gè)(4D3)代表ACA-6626篩選。如圖4和5中所示，其中的每個(gè)肽都與篩選抗體的親本血清優(yōu)先作出反應(yīng)。然而，特別是在ACA-6501和ACA-6626之間可檢測(cè)到明顯程度的交叉反應(yīng)性。用5A12樹(shù)脂結(jié)合肽對(duì)19個(gè)患者血清(低或沒(méi)有GPL得分)和13個(gè)病理血清(GPL得分從中到高)的研究表明13個(gè)病理樣品中的8個(gè)有可檢測(cè)到的肽結(jié)合而19個(gè)對(duì)照樣品中只有2個(gè)顯出低的肽結(jié)合。這些結(jié)果證明在中風(fēng)病人護(hù)理方面合成肽對(duì)診斷或者預(yù)診的測(cè)定來(lái)說(shuō)是有用的。
如在上述第一部分指明的，對(duì)一個(gè)合成肽(6641/3G3)進(jìn)行抗幾種高滴度的ACA抗血清的試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)這種肽似乎與所測(cè)驗(yàn)的大多數(shù)ACA抗血清有交叉反應(yīng)(如圖14中所說(shuō)明的)。在1.8mg/mL完全抑制(＞80％)下6641/3G3顯示出與10種ACA抗體之10種的劑量依賴(lài)性交叉反應(yīng)性，并且似乎對(duì)ACA抗體是專(zhuān)一的，如下表7所示。表7利用心磷脂/β2-GPI涂布的平板的AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)ACA血清的交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)ACA血清Nr IC50,mg/mL，對(duì)于肽LJP688[1]6501RS,RFL0.899 1.1[2]6626RS1.09[3]6635RS1[4]6638RS0.81[5]6641RS0.89,0.51[6]6644RS0.76[7]6701RS1.07[8]6903RS0.8[9]7004RFL 0.67[10]7005RFL 0.75平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 0.86±0.16RS=周期性中風(fēng)RFL=習(xí)慣性流產(chǎn)M．新的合成肽方法經(jīng)aPL文庫(kù)篩選的新的侯選序列的鑒別需要試驗(yàn)新的合成肽的抗體結(jié)合作用。對(duì)于已知肽取代的Rapp樹(shù)脂，利用放射性標(biāo)記的aPL IgG可以實(shí)行定量的結(jié)合研究(如飽和結(jié)合分析和平衡測(cè)量)。
肽合成使得可以通過(guò)選擇性合成對(duì)模擬表位進(jìn)行分子詳細(xì)分析。這包括以增強(qiáng)抗體結(jié)合為目標(biāo)來(lái)修飾沿鏈的每個(gè)氨基酸。選擇性合成揭示每個(gè)氨基酸在序列中的相對(duì)重要性。如果必要，可以設(shè)計(jì)在特殊殘基位置的選擇性的取代以便保持B細(xì)胞反應(yīng)性而廢除在T細(xì)胞測(cè)定中發(fā)現(xiàn)的任何T細(xì)胞增殖反應(yīng)性。
對(duì)肽6641/3G3(LJP)進(jìn)行一些分析。分析包括在N-末端和C-末端截短，二硫化物取代，丙氨酸和甘氨酸對(duì)位置2到8的氨基酸的取代，在2、4、5和8位置上的分支脂族氨基酸的取代，影響肽的構(gòu)象的氨基酸的取代(包括α-甲基氨基酸的取代)，位置7中的堿性氨基酸的取代，位置2至9中的D-氨基酸的取代，以及在1至9位置上的N-α-甲基氨基酸的取代。這些結(jié)果如表9所示。這些取代和平截的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系如表8所示。
表8肽3G3的優(yōu)化3/28/96總肽 144位置號(hào)截短分析 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B 用ACA 6501150μgmL sd1 A G P C L G V L G K L C P G 8502 G P C L G V L G K L C P G 1803 P C L G V L G K L C P G 4204 C L G V L G K L C P G 4605 A G P C L G V L G K L C G4506 C L G V L G K L C 10 #906(LJP 690)二硫化物替代1 C L G V L G K L C 110 #952=1002 H L G V L G K L C 463 C L G V L G K L H 924 H L G V L G K L H 80丙氨酸掃描1 C A G V L G K L C 200 #952=802 C L A V L G K L C 1703 C L G A L G K L C 2604 C L G V A G K L C inf5 C L G V L A K L C 406 C L G V L G A L C inf7 C L G V L G K A C 360甘氨酸掃描1 C G G V L G K L C 310 #952=1202 C L G G L G K L C inf3 C L G V G G K L C inf4 C L G V L G G L C inf5 C L G V L G K G C 500序列優(yōu)化 支鏈脂族氨基酸1CI GVL GKLC60#910=402CV GVL GKLC1303CM GVL GKLC4CCyGVL GKLC5CFLGVL GKLC6CmLGVL GKLC7CIvGVL GKLC8CL GLL GKLC9CL GIL GKLC10 CLG ML GKLC11 CLG Cy L GKLC12 CLG tL L GKLC13 CLG mL L GKLC14 CLG lv L GKLC15 CLG VI GKLC16 CLG VV GKLC17 CLG VM GKL18 CLG VCyGKLC19 CLG VtLGKLC20 CLG VmLGKLC21 CLG VIvGKLC22 CLG VL GKIC23 CLG VL GKVC24 CLG VL GKMC25 CLG VL GKCC26 CLG VL GKtL C27 CLG VL GKmL C28 CLG VL GKlv C構(gòu)象掃描氨基酸1CLPvLGKLC2CL mPVLGKLC3CL mAVLGKLC4CL cGVLGKLC5CLGVLPKLC6CLGVL mPKLC7CLGVL mAKLC8CLGVL cGKLC9CL dAVLGKLC10CLGVL dAKLC11CPGVLGKLC160#952=10012CLPVLGKLC340(掃描)13CLGPLGKLC18014CLGVPGKLCinf15CLGVLPKLC35016CLGVLGPLC16017CLGVLGKPC55018C pGGVLGKLC130#910=4019CL PGVLGkLC7020CLG pGLGKLC7021CLGV pGGKLC3522CLGVL pGKLC30 #910=523CLGVLG pGLC23024CLGVLGk pGC80αMe AA25C aiBGvLGKLC370#910=4026CL aiBVLGkLC8027CLG aiBLGKLC11028CLGV aiBGKLCinf29CLGVL aiB KLC11030CLGVLG aiBLC46031CLGVLGK aiBC＞470堿性氨基酸1CLGVLGRLC160#952-1202CLGVLG OrLC40 910=603CLGVLG mKLC
D-氨基酸(小寫(xiě)字母d)1 dP CLGVLGKLC120#952=1002C dLGVLGKLC180#952=303CLG dVLGKLC260#952=304CLGV dLGKLC230#952-305CLGVLG dKLC170#952=506CLGVLGK dLC140#952= 307C dLG dVLGKLC8C dVG dVLGkLC9C dLG dLLGKLC10CLG dV dLGKLC50#952=3011CLG dL dVGKLC12CLG dV dVGKLC13CLG dL dLGKLC14CLGV dLG dKLC15CLGV dKG dLLC16CLGV cLG dLLC17CLGV dKG dKLC18CLGVLG dK dLC150#952=5019CLGVLG dL dKC20CLGVLG dK dKC21CLGVLG dL dLC140#952=3022CLGVL dAKLC140#952=50CLGVLGKL dCN-Me氨基酸(nAA)1 nCLGVLGKLC2CLGVLGKLC3CL nGVLGKLC 70 #952=504CLG nVLGKLC 2205CLGV nLGKLC 1806CLGVL nGKLC 5507CFGVLG nKLC8CLGVLGK nLC 240 #952=509CLGVLGKL nC其它1 C L G V L G K L CATU-Y300#952=502 Y ATUC L G V L G K L C 1703 C L G V L G K L C TGR樹(shù)脂 5004 C L G V L G K L C dCTGR樹(shù)脂 6205 dC L G V L G K L C C6 cC L G V L G K L C dCTGR樹(shù)脂硫醚單一檢測(cè)1 Hc L G V L A K L C2 Hc G V L A K L C3 Hc L V L A K L C4 Hc L G L A K L C5 Hc L G V A K L C6 Hc L G V L K L C7 Hc L G V L A L C8 Hc L G V L A K C收縮最小化1 Hc V L A K L C2 Hc L A K L C3 Hc L A K C支鏈的1 Hc L G V L G K L Pc2 Hc L G V L G K L dPe3 Pc L G V L G K L Hc4 dPe L G V L G K L Hc5 dPe L G V L G K L dPeD氨基酸1 dHc L G V L G K L C2 dHc L G V L G K L dC3 Hc L G V L G K L dC脫氨基1 By L G V L G K L Hc脫氨基HHTE2 By L G V L G K L C脫氨基HCTE3 Pp L G V L G K L Hc脫氨基CHTE4 Pp L G V L G K L C脫氨基CHTE
表9交叉反應(yīng)的ACA表位的結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系結(jié)構(gòu) 相對(duì)活性AGPCLGVLGKLCPG(3G3)(LJP 688)100CLGVLGKLC (LJP 690)3.5CLGVLAKLC 1.8CLGVLpGKLC 1.4CLGdVdLGKLC 5.9HCLGVLGKLC(硫醚)1.6SLGVLGKLS 00CLGVAGKLC 00CLGVLGALC 00N．利用α-甲基氨基酸取代和非天然的氨基酸來(lái)提高肽的免疫反應(yīng)性并賦與其抗蛋白酶攻擊的抗性脯氨酸殘基有一種特殊的重要性，這是因?yàn)樗鼈儗?duì)多肽的鏈構(gòu)象的影響。它們經(jīng)常出現(xiàn)在球狀蛋白的表面上的轉(zhuǎn)角處。在本發(fā)明的噬菌體表位文庫(kù)中，所有隨機(jī)肽插入片段側(cè)連邊界脯氨酸。此外，用ACA-6501發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)模擬表位有第三個(gè)脯氨酸，根據(jù)基于計(jì)算機(jī)的預(yù)測(cè)，該脯氨酸很有可能作為β-轉(zhuǎn)角的一部分存在。β-轉(zhuǎn)角模擬物能用來(lái)提高小肽中的轉(zhuǎn)角構(gòu)象的穩(wěn)定性。這樣的模擬物是(S)-α-甲基脯氨酸(α-MePro)，這是一種除穩(wěn)定轉(zhuǎn)角構(gòu)象外還賦予抗蛋白酶降解的抗性的脯氨酸類(lèi)似物。對(duì)于所設(shè)計(jì)的在血漿中起作用的潛在藥物，蛋白酶抗性是一種所需的性質(zhì)。肽ACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPG(斜體部分為插入片段)是一種共有肽?；谂c其他35個(gè)同源序列的比較，它具有的序列特性是在每個(gè)位置有最有優(yōu)勢(shì)的殘基。由于其代表性特征，可對(duì)該序列進(jìn)行一些系統(tǒng)的修飾和缺失，而后通過(guò)aPL抗體結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)它的活性。最重要的發(fā)現(xiàn)之一是發(fā)現(xiàn)在3和9位置上的脯氨酸對(duì)于活性來(lái)說(shuō)是重要的。脯氨酸-3來(lái)自噬菌體構(gòu)架而不是隨機(jī)插入片段的一部分。最明顯的影響是通過(guò)由α-MePro在9位置取代脯氨酸來(lái)獲得的。這個(gè)取代導(dǎo)致在免疫活性方面提高6倍。
在肽6641/3G3上進(jìn)行的α-甲基和Nα-甲基氨基酸的取代的研究結(jié)果如上表8所示。
除二十種天然存在的氨基酸以及它們的同源類(lèi)似物(homoanalog)和正類(lèi)似物(noranalog)之外，其它幾類(lèi)α-氨基酸也可以用于本發(fā)明。這些其它類(lèi)α-氨基酸的例子包括d-氨基酸、Nα-烷基氨基酸、α-烷基氨基酸、環(huán)氨基酸、嵌合氨基酸以及混雜的氨基酸。這些非天然的氨基酸已經(jīng)廣泛地用來(lái)修飾生物活性的多肽以提高抗蛋白酶解降解作用的抗性和/或傳遞構(gòu)象限制以改善生物活性(Hruby等，(1990)，生物化學(xué)雜志，268:249-262；Hruby和Bonner(1995)在分子生物學(xué)中的方法，35:201-240)。
最普通的Nα-烷基氨基酸是Nα-甲基氨基酸，如Nα-甲基半胱氨酸(nC)、Nα-甲基甘氨酸(nG)、Nα-甲基亮氨酸(nL)、Nα-甲基賴(lài)氨酸(nK)以及Nα-甲基纈氨酸(nV)。α-烷基氨基酸的例子包括α-甲基丙氨酸(niA)、α-氨基異丁酸(aiB)、α-甲基脯氨酸(mP)、α-甲基亮氨酸(mL)、α-甲基纈氨酸(mV)、α-甲基α-氨基丁酸(tv)、二乙基甘氨酸(deG)、二苯基甘氨酸(dpG)以及二環(huán)己基甘氨酸(dcG)(Balararn(1992)，純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)，64:1061-1066；Toniolo等(1993)，生物聚合物，33:1061-1072；Hinds等(1991),Med Chem.34:1777-1789)。
環(huán)氨基酸的例子包括1-氨基-1-環(huán)丙烷羧酸(cG)、1-氨基-1-環(huán)戊烷羧酸(Ac5 c)、1-氨基-1-環(huán)己烷羧酸(Ac6c)、氨基茚滿(mǎn)羧酸(ind)、四氫異喹啉羧酸(Tic)以及2-哌啶酸(Pip)(C.Toniolo(1990)Int’l.J.Peptide Protein Res.35:287-300；Burgess等(1995)J.Am.Chem.Soc.117:3808-3819)。嵌合的氨基酸的例子包括青霉胺(Pc)、半胱氨酸與纈氨酸的混合物、4R-和4S-巰基脯氨酸(Mpt)、高胱氨酸和脯氨酸以及4R-和4S-羥基脯氨酸(hyP)的混合物、以及高絲氨酸和脯氨酸的混合物?；祀s的α氨基酸的例子包括如鳥(niǎo)氨酸(Or)、Nε-甲基賴(lài)氨酸(mK)、4-吡啶基丙氨酸(pyA)、4-哌啶子基丙氨酸(piA)以及4-氨基苯基丙氨酸的堿性氨基酸類(lèi)似物；如瓜氨酸(Cit)以及3-羥基纈氨酸的酸性氨基酸類(lèi)似物；如1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、苯基甘氨酸(pG)、3,3-二苯基丙氨酸(dpA)、3-(2-噻吩基)丙氨酸(TE)以及鹵苯基丙氨酸(例如2-氟苯丙氨酸和4-氯苯丙氨酸)的芳香族氨基酸類(lèi)似物；如叔丁基甘氨酸(即叔亮氨酸(tL))、2-氨基丁酸(Abu)、環(huán)己基丙氨酸(Cy)、4-四氫吡喃基丙氨酸(tpA)、3,3-二環(huán)己基丙氨酸(dcA)以及3.4-脫氫脯氨酸的疏水氨基酸類(lèi)似物。
除了α-氨基酸，其它如β-氨基酸也可用于本發(fā)明。這些其它氨基酸的例子包括2-氨基苯甲酸(Abz)、β-氨基丙酸(β-Apr)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)以及6-氨基己酸(ε-Ahx)。在環(huán)硫醚肽的合成中，如4-氯丁酸(By)和3-氯丙酸(Pp)的羧酸也已用作為在N-末端上的第一個(gè)殘基。O．環(huán)硫醚類(lèi)似物的制備可以進(jìn)一步修飾由本發(fā)明方法鑒別的模擬肽從而使其包含硫醚取代物。環(huán)二硫化物類(lèi)似物變?yōu)榄h(huán)硫醚類(lèi)似物的修飾將延長(zhǎng)該類(lèi)似物綴合物的血漿半壽期，因此需要低劑量。環(huán)硫醚類(lèi)似物也消除了二硫鍵交換的問(wèn)題，這種交換經(jīng)常隨環(huán)二硫化物多肽發(fā)生。此外，環(huán)硫醚類(lèi)似物也可以干擾MHCⅡ類(lèi)向T細(xì)胞的呈遞，因此有利于無(wú)反應(yīng)性的誘導(dǎo)。最后，環(huán)硫醚類(lèi)似物在用于產(chǎn)生效價(jià)平臺(tái)分子綴合物的硫醇依賴(lài)性綴合反應(yīng)方面是有用的。
按照在共有的共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng)(代理號(hào)252312006600)(以其整體與本文一并參考)中描述的方法，制得四種環(huán)硫醚類(lèi)似物。利用RinkTM酰胺4-甲基二苯甲氨基樹(shù)脂或者M(jìn)BHA樹(shù)脂制備6641/3G3的全長(zhǎng)度肽類(lèi)似物，將其轉(zhuǎn)化成氯肽，并從固相支持體上切割下來(lái)，然后環(huán)化該類(lèi)似物。參見(jiàn)以下的硫醚反應(yīng)方案。適合的環(huán)硫醚類(lèi)似物包括以下顯示的類(lèi)似物。

另外，也可按照以下反應(yīng)方案制備硫醚類(lèi)似物。
環(huán)硫醚反應(yīng)方案2
下列類(lèi)似物表示按照環(huán)硫醚反應(yīng)方案2制得的類(lèi)似物。
測(cè)定例證性的環(huán)硫醚類(lèi)似物抗ACA抗體ACA-6501和ACA-6701的活性。結(jié)果如下表10所示。表10IC50值(μg/0.1 mL)硫醚 ACA-6501 ACA-6701CCTE,LJP 698 11.05.0HCTE,LJP 6994.63.0CHTE,LJP 7029.23.2HHTE,LJP 7038.03.6LJP 69010.04.0CTE A 0.08CTE B 0.5CTE C 0.9CTE D 3.2CTE E 6.3HCTE類(lèi)似物L(fēng)JP 699，優(yōu)于參考肽LJP 690,LJP 690是LJP 688(即AGPCLGVLGKLCPG)的截短形式，即CLGVLGKLC。
本文引用的所有文章、文檔、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)以其整體與本文一并參考。下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明和它的獨(dú)特性。這些實(shí)施例無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1:血清6501中的抗心磷脂抗體(ACA)的測(cè)定以每孔30μL乙醇用50μg心磷脂(西格馬化學(xué)公司，圣路易斯，MO)涂布Immulon I微量滴定板(Dynatech實(shí)驗(yàn)室，Inc.,Chantilly,VA)的偶數(shù)孔。使平板在4℃下干燥一夜，并在室溫(RT)下在磷酸鹽緩沖鹽水(ABS/PBS)中用200μL 10％的成年牛血清(ABS)(Irvine科學(xué)公司，SantaAna,CA)封阻2小時(shí)。在加入10μL aPL標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn)血清ACA-6501之前，用Tris-緩沖鹽水(TBS)將平板洗滌5次。按照制造廠商的說(shuō)明重建該aPL標(biāo)準(zhǔn)(APL診斷公司，Louisville,KY)，并用10％ABS-PBS將其稀釋至1∶50。將試驗(yàn)血清ACA-6501用10％的ABS-PBS稀釋成連續(xù)稀釋液(從1∶50到1∶2,000)，將其加到選擇的重復(fù)孔中并在室溫下溫育2小時(shí)。將平板用TBS和100μL的1∶1,000的山羊抗人IgG/堿性磷酸酶綴合物(Zymed，南舊金山，CA，目錄號(hào)62,8422)洗滌5次，加入10％ABS-PBS并在室溫下溫育1小時(shí)。將平板用TBS再洗滌5次并通過(guò)添加100μL酚酞脫單磷酸(PPMP)底物溶液(西格馬，目錄號(hào)P-5758)進(jìn)行測(cè)定，該溶液是從0.13M PPMP和7.8M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的儲(chǔ)備溶液制備的(在用去離子水稀釋到1∶26之后，用HCl將其pH值調(diào)到10.15)。在大約30分鐘之后，在每孔中加入50μL的0.2 M磷酸二鈉(Mallinckrodt，分析試劑)來(lái)終止反應(yīng)。在微量平板自動(dòng)讀數(shù)儀(Bio-Tek儀器，Winooski,VT,EL311型)中在550 nm處讀其光密度。從偶數(shù)孔的光密度中減去奇數(shù)對(duì)照孔(空白，沒(méi)有心磷脂(CL))的光密度。用Graph Pad Prizm軟件(graph Pad軟件公司，圣地亞哥，CA)將aPL標(biāo)準(zhǔn)的吸收率讀數(shù)制成散點(diǎn)圖從而形成GPL(IgG磷脂)標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)GPL標(biāo)準(zhǔn)曲線用稀釋的6501試驗(yàn)血清吸收率讀數(shù)來(lái)計(jì)算GPL得分。
在改進(jìn)的ACA ELISA中，Nunc Maxisorp微量滴定平板在室溫下溫育1小時(shí)后涂布100μL/mL β2-GPI(用PBS制得)。接著這一步驟，在室溫下用PBS(包含2％無(wú)脂牛奶和0.4％(w/v)Tween 80)封阻微量平板2小時(shí)。除了利用無(wú)脂牛奶/Tween作為稀釋劑和封阻劑外，直接涂布有β2-GPI的Nunc微量平板可用于ACA IgG結(jié)合研究，如以前描述的Dynatech微量平板(在β2-GPI加入之前首先在其上涂布一層心磷脂)的ACA IgG結(jié)合研究。實(shí)施例2來(lái)自血清6501的抗心磷脂抗體(ACA)純化在25 ml圓底燒瓶(Kontes Scientific Co.,Vineland,N.J.)中，用Rotavap(Buchi，瑞士)將1.2ml抗心磷脂(西格瑪化學(xué)公司，圣路易斯，MO,#C-1649),0.464ml膽固醇(西格瑪Diag.，圣路易斯，MO.,#965-25),0.088ml 5mg三十二烷基磷酸酯(西格瑪化學(xué)公司，圣路易斯，MO,D-2631)(在每mL氯仿中)的混合物干燥約5分鐘。在除去溶劑后，添加2ml 0.96％(wt./vol.)的NaCl(J.T.Baker,Inc..Phillipsburg,NJ,Baker分析試劑)，并在Vortex Genie Mixer(科學(xué)工業(yè)，公司，Bohemia,NY)中混合1分鐘。于37℃下將脂質(zhì)體懸液溫育1小時(shí)。同時(shí)，于8℃下在Sorvall RT 6000離心機(jī)(杜邦公司W(wǎng)ilmington,DE)中在600Xg下離心血清6501 10分鐘。將4ml上清液置于含有1ml制備的脂質(zhì)體懸液的25ml圓底燒瓶中，于4℃下在中等速度攪拌下在有軌搖床TektatorV(Scientific Products，McGraw Park,IL)上溫育混合物48小時(shí)，在37℃溫育另外的2小時(shí)。加入20 ml冷的TBS，將混合物轉(zhuǎn)移到50ml聚碳酸酯離心管(Nalge Co.,Rochester,NY)中，于4℃下在27,000Xg下離心15分鐘(在SS-34回轉(zhuǎn)裝置中的RC3離心機(jī)(Sorvall-DupontWilmington,DE)中)。用RC3離心機(jī)以25ml冷的0.96％NaCl洗滌沉淀3次。將沉淀溶解在1ml 2％(wt/vol)(在TBS中)的正-辛基-對(duì)-D-葡糖吡喃糖苷(Calbiochem,La Jolla,CA)的溶液中，并用于0.6ml蛋白質(zhì)A/交聯(lián)瓊脂糖(Repligen公司，Cambridge,MA)柱，該柱已以15倍柱床體積的1M乙酸預(yù)洗滌過(guò)，并用15倍柱床體積的TBS平衡過(guò)。用40倍柱床體積的2％辛基葡糖吡喃糖苷洗滌抗體-蛋白質(zhì)A/瓊脂糖柱，以除去脂質(zhì)，接著用TBS充分洗滌，直到洗脫物在280nm的光密度接近基線。結(jié)合的抗體用1M乙酸洗脫。收集1ml組分，每一組分立即用0.34ml 3M Tris(Bio-Rad，電泳級(jí)試劑)中和，并保持在冰浴上。在分光光度計(jì)(Hewlett-Packard,8452A Diode Array分光光度計(jì)，Palo Alto,CA)中在280nm處測(cè)定各組分的光密度。合并含有抗體的組分，按制造者的方案在Centricon-30濃縮器(Amicon Division,W.R.Grace & Co.,Beverly,MA)中濃縮和用TBS洗滌4次。通過(guò)讀取濃縮試樣在280nm的光密度確定從4ml血清6501產(chǎn)生純化的抗體的最終產(chǎn)率，其中1mg=1.34 OD280。所獲得的平均產(chǎn)率是從4ml血清6501中得到750μg抗體。試驗(yàn)純化的抗體的ACA活性，并由Laemmli SDS-PAGE檢查其純度。利用市售的純化的β2-GPI(Perimmune,Rockville,MD)，按照制造廠商的說(shuō)明，利用CNBr活化的瓊脂糖(Pharmacia,Inc.,Piscataway,NJ)或者Affi-Gel10(BioRad,Richmond,CA)，制備包含β2-GPI的親和性吸附劑。在包含β2-GPI親和性吸附劑的1mL凝膠柱中，加入高達(dá)100μg的脂質(zhì)體純化的aPL IgG(在1mL TBS中)。在1小時(shí)之后，用緩沖液廣泛地洗滌柱以便置換污染物和不結(jié)合β2-GPI的任何IgG。用1M HOAc置換結(jié)合β2-GPI的IgG，并用Tris(如上所述)中和該組分。集中、濃縮包含IgG的組分，并使之進(jìn)行如前所述的緩沖交換。實(shí)施例3:P-Ⅲ文庫(kù)載體制劑的構(gòu)建fUSE 5(Scott,J.K.和G.Smith，同上)用作構(gòu)建p-Ⅲ文庫(kù)的載體，利用Holmes,D.S.和M.Quigley(1981)(Anal.Biochem.144:193)的方法的修改方法來(lái)產(chǎn)生雙鏈復(fù)制型(RF)。簡(jiǎn)言之，在劇烈振蕩下，于37℃下在含有20毫克/mL四環(huán)素的2YT培養(yǎng)基(Difco Labs,Ann Arbor,MI)中培養(yǎng)大腸桿菌K802(包含fUSE5)的800ml培養(yǎng)物18小時(shí)。通過(guò)離心來(lái)收集細(xì)胞，并將其重懸浮于75ml STET中。STET由在50mM Tris/HClpH8.0中的8％蔗糖、50mM EDTA組成，并含有0.5％Triton X-100。加入10mg/mL溶菌酶(在STET中)至最終濃度為1mg/mL。在室溫下在5分鐘后，將三個(gè)等分試樣置于沸水浴(偶爾振蕩)中3.5分鐘。在18000Xg下離心粘性漿狀物30分鐘，將等體積的異丙醇添加到上清液中。將溶液冷卻至-20℃，通過(guò)離心收集核酸。按照Sambrook等(分子克??；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY，第二版，1989)描述的方法由CsC1梯度分離RF。隨機(jī)插入片段的按比例分配由Cwirla等(1990，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，87:6378-6382)描述的＂缺口雙螺旋＂法產(chǎn)生用于插入的DNA。在這一方法中，中間含有簡(jiǎn)并區(qū)的寡核苷酸被寡核苷酸每一端的短的恒定區(qū)所包圍。使兩個(gè)較短的互補(bǔ)的寡核苷酸退火以形成＂缺口雙螺旋＂，該＂缺口雙螺旋＂具有互補(bǔ)于由用于消化載體的限制性?xún)?nèi)切核酸酶產(chǎn)生的粘性末端的突出端。在這種情況下，較長(zhǎng)的簡(jiǎn)并寡核苷酸具有序列5’GGGCTGGACCC(NNK)xCCGGGGGCTGCTG 3’，其中N=A或C或G或T，K=G或T,x是隨機(jī)區(qū)中的密碼子數(shù)量。EpiGS2被設(shè)計(jì)成簡(jiǎn)并寡核苷酸的5’末端的堿基對(duì)，并具有序列5’GGGTCCAGCCCCGT 3′。類(lèi)似地EpiGS3被設(shè)計(jì)成退火到簡(jiǎn)并寡核苷酸的3’末端，并具有序列5’CAGCCCCCGG 3’。當(dāng)正確退火時(shí)，三種寡核苷酸形成＂缺口雙螺旋＂，當(dāng)其插入到用Sfil消化的fUSE 5中時(shí)，其恢復(fù)具有接近5’末端的隨機(jī)插入片段的p-Ⅲ讀框。
以上所描述的寡核苷酸是通過(guò)從聚丙烯酰胺凝膠上的切除來(lái)制備的。1納摩爾的EpiGS2、EpiGS3和50皮摩爾的簡(jiǎn)并寡核苷酸分別在66微升體積中用激酶處理。然后集中三種寡核苷酸，添加NaCl至50 mM，并將混合物加熱至65℃并保持5分鐘，其后緩慢冷卻至室溫。將退火的寡核苷酸在冰上冷卻，并直接用于與fUSE 5的連接反應(yīng)。連接反應(yīng)物由10微克fUSE 5 DNA(用Sfil完全消化的)、30μL＂缺口雙螺旋＂溶液和1000 U的T4連接酶組成(在450微升總體積中)。于16℃下溫育連接物18小時(shí)。然后用苯酚-氯仿提取混合物，用乙醇沉淀，并將沉淀溶解在20μL水中。產(chǎn)生和擴(kuò)增文庫(kù)經(jīng)電穿孔(Dower等(1988)，核酸研究，16:6127-6145)將連接的DNA引入大腸桿菌中。將冷凍的電感受態(tài)MC1061細(xì)胞(0.1mL)在冷的2mm透明小容器中與連接的DNA(4μL)混合，用BTX電穿孔裝置(BTX公司，San Diego,CA)施加2.5kV、5.2 mS脈沖。緊接著脈沖之后，加入1 mL SOC(一種細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，參見(jiàn)Dower等，同上)。進(jìn)行5種不同的電穿孔，收集產(chǎn)物并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。此時(shí)，移走樣品并稀釋以測(cè)定產(chǎn)生的克隆的總數(shù)。用包含20微克/毫升四環(huán)素的1升2YT(1.6％蛋白胨，140,1％酵母膏，和0.5％NaCl,Difco,Labs,Ann Arbor,MI)稀釋混合物的平衡溶液，并于37℃下在275 rpm振蕩下培養(yǎng)18小時(shí)。通過(guò)2次PEG/NaCl沉淀和在1.2mL TBS(包含0.02％疊氮化鈉)中懸浮來(lái)純化噬菌體。由在269nm的吸收率來(lái)估計(jì)顆粒數(shù)量。通過(guò)將10μL稀釋的噬菌體與10微升饑餓的大腸桿菌混合來(lái)測(cè)定噬菌體的滴度。實(shí)施例4篩選具有aPL抗體的P-Ⅲ文庫(kù)在硅氧烷化的1.4mL微量離心聚丙烯管中，于室溫下將親和純化的ACA-6501(affACA-6501,10μg；7μL 1.44mg/mL儲(chǔ)備溶液)溫育2小時(shí)，其中該微量離心聚丙烯管含有來(lái)源于x、y和z文庫(kù)(epiXYZ)[分別11μL+8.5μL+2μL；總體積=21.5μL,～1010個(gè)克隆]的集中的噬菌體以及有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的最終體積為100μL的TBS(pH 7.4)。在這一溫育期間，進(jìn)行制備新鮮的饑餓大腸桿菌菌株K-91的最后步驟。用50mL聚丙烯管在1000Xg下于室溫下將在37℃下在250rpm振蕩下在2YT培養(yǎng)基中新鮮生長(zhǎng)約5小時(shí)的大腸桿菌懸液離心10分鐘。將20 mL 80mMNaCl添加到緊密的大腸桿菌沉淀上，并在100rpm下于37℃下溫育45分鐘。在以上離心后，將饑餓的大腸桿菌沉淀懸浮在1mL 50mM磷酸銨/80mM NaCl中，而后用于噬菌體擴(kuò)增。將蛋白質(zhì)G-瓊脂糖珠用TBS/BSA洗滌2次，用TBS/0.5％Tween-20洗滌2次，并以在TBS/Tween中的50％懸液儲(chǔ)備在4℃下。
然后將200μL蛋白質(zhì)G-瓊脂糖珠懸液添加到ACA-650l/噬菌體混合物中，在室溫下繼續(xù)溫育1小時(shí)。此時(shí)，急冷混合物，用冷的TBS/Tween洗滌3次，通過(guò)在冷的房間離心來(lái)收集沉淀。將洗滌過(guò)的珠轉(zhuǎn)移到新的用TBS/BSA和TBS/Tween預(yù)洗滌的離心管中，以阻止非特異性粘附。在用TBS/Tween額外洗滌3小時(shí)后，通過(guò)在室溫下攪動(dòng)用300μL 0.2N HCl/甘氨酸、pH2.1洗脫具有噬菌體(攜帶結(jié)合的ACA-6501)的珠10分鐘。以16,000Xg離心后，收集酸性洗脫物上清液，將另外的100μL洗脫液添加到珠沉淀上，重復(fù)這一操作。10分鐘后，收集(～400μL)包含噬菌體的洗脫物(代表未擴(kuò)增的第一輪噬菌體)，并將其置于無(wú)菌的17×100mm聚丙烯細(xì)胞培養(yǎng)管中，向該管中添加50μL 0.5M NaCl，接著用2.5M Tris堿(通?！?5-35μL)進(jìn)行pH中和。立即加入等體積的饑餓的大腸桿菌懸液，然后在37℃下在100rpm下培養(yǎng)10分鐘。接著將混合物轉(zhuǎn)移至250mL無(wú)菌培養(yǎng)瓶(含有具有20μg/mL四環(huán)素(Tet)的25mL 2YT)中，在37℃下在250rpm下培養(yǎng)一夜。
為了分離從過(guò)夜培養(yǎng)物擴(kuò)增的噬菌體，用聚碳酸酯試管在12,000×g下將懸浮液離心10分鐘。棄去沉淀。在70℃下加熱在聚丙烯管中的上清液30分鐘后，再次用聚碳酸酯管離心，保存上清液。向上清液中加入1/4體積的20％(w/v)分子量為8000(PEG 8000)的聚乙二醇，以沉淀噬菌體。通過(guò)倒轉(zhuǎn)100次來(lái)混合溶液，然后在4℃下溫育2小時(shí)。于40℃下在35,000Xg下離心30分鐘后，將含有噬菌體的沉淀重懸于～0.5mL TBS/BSA中，并轉(zhuǎn)移至1.4mL離心管中。在16,000xg下在微量離心機(jī)中離心1分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移至清潔的試管中，標(biāo)記第一輪擴(kuò)增的噬菌體。
在第二、三和四輪生物淘選期間，在100微升終體積中將三輪的75μL擴(kuò)增的噬菌體與7μL affACA-6501一起溫育。對(duì)第五輪噬菌體，首先以1∶1000稀釋affACA-6501，然后如其它輪所述處理。如第一輪所述進(jìn)行所有其它的后續(xù)步驟。將生物淘選第五輪的噬菌體點(diǎn)滴(spot-titered)在2YT/Tet平板上，以測(cè)定噬菌體濃度。點(diǎn)滴擴(kuò)增的噬菌體需要利用TBS/BSA或2YT培養(yǎng)基的1×106初始的噬菌體稀釋度。對(duì)每一輪，在37℃下將10μL稀釋的噬菌體與40μL饑餓的大腸桿菌一起無(wú)振蕩培養(yǎng)10分鐘。在加入950μL2YT/稀釋的Tet(0.2μg/mL)后，于37℃下在250rpm振蕩下將混合物培養(yǎng)30-45分鐘。利用含有20μg/mL Tet的瓊脂板，將10μL純的和稀釋(1∶10,1∶100和1∶1000)的噬菌體溶液試樣點(diǎn)滴在2YT/稀釋Tet上。微量淘選用蛋白質(zhì)G涂布Immulon 2型平板。用0.1M NaHCO3以10μg/mL制備蛋白質(zhì)G，以每孔100μL添加到微量滴定板的孔中，于4℃下溫育一夜。在從平板棄去過(guò)量的蛋白質(zhì)G溶液后，于室溫下在攪拌下在振動(dòng)平臺(tái)上用250-300μL 2YT封阻每孔1小時(shí)。將Tris緩沖的鹽水(pH 7.4/0.5％Tween 20(TBS/Tween))與自動(dòng)平板洗滌儀一起使用，以便用200μL洗滌每孔4次。用2YT將100μL affACA-6501(或?qū)φ盏恼gG)稀釋成2.5μg/mL，并將其添加到洗滌的孔中。在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上于室溫下溫育接近1小時(shí)后，把平板轉(zhuǎn)移至冷室回轉(zhuǎn)裝置(rotator)中。
微量淘選所試驗(yàn)的噬菌體得自由生物淘選產(chǎn)生的瓊脂板。用無(wú)菌牙簽將每個(gè)待試克隆轉(zhuǎn)移至圓底96孔微量滴定板(Corning,Corning,NY)的不同孔(每孔含有250μL 2YT/Tet)中，并在37℃下培養(yǎng)一夜?？寺〉拿诤Y選的抗體，起始點(diǎn)的生物淘選輪次以及克隆在過(guò)夜培養(yǎng)板上的位置，例如ACA-6501/3B10指這樣一種克隆，其是在第三輪中通過(guò)ACA-6501從位于微量滴定板上的命名為B10的孔中分離得到的。在過(guò)夜培養(yǎng)后，利用微量滴定板夾持裝置于室溫下在1300Xg下離心噬菌體培養(yǎng)物10分鐘。上清液構(gòu)成＂純的＂噬菌體的源。
起始微量淘選限制在6個(gè)克隆，這些克隆用以1∶10到1∶106的系數(shù)擴(kuò)展的稀釋度來(lái)試驗(yàn)。從這些試點(diǎn)克隆產(chǎn)生的結(jié)果用來(lái)說(shuō)明合適的單一稀釋度(對(duì)各輪的源平板中的克隆其產(chǎn)生可分級(jí)的結(jié)果)。將代表培養(yǎng)的從生物淘選的第三、第四和第五輪隨機(jī)選擇的克隆的平板用2YT在微量滴定板中以每孔250μL的終體積從“純的”溶液稀釋成1∶100,000。將代表所需稀釋度的最后平板的100μL添加到含有蛋白質(zhì)G結(jié)合的ACA-6501和如上所述制備的正常IgG的平板上。在水平的回轉(zhuǎn)裝置上于4℃下進(jìn)行稀釋噬菌體與aPL抗體或?qū)φ誌gG的溫育。在自動(dòng)平板洗滌儀中用TBS/Tween洗滌9次后，用20μL 0.2 N HCl-甘氨酸/0.1％BSA,pH2.2洗脫IgG-結(jié)合的噬菌體。在室溫下繼續(xù)溫育洗脫物10分鐘，在此期間，制備每孔含有20μL新鮮饑餓大腸桿菌的新的Corning微量滴定板，并冷卻。將140μL 29mM Tris添加到含有噬菌體洗脫物的平板上，以中和pH，接著將20μL噬菌體懸液從各孔轉(zhuǎn)移到含有饑餓的大腸桿菌的平板的相應(yīng)的孔中。在37℃下培養(yǎng)10分鐘后，加入200μL 2YT/稀釋Tet，在37℃下進(jìn)行另外的30分鐘培養(yǎng)。用多道吸移管將各孔的10μL培養(yǎng)液點(diǎn)滴在大的2YT/Tet瓊脂板上，而保留原來(lái)的8×12孔格式和最后微量滴定板的方向。在使斑點(diǎn)干燥30分鐘后，將平板在37℃下溫育。第二天，用0到4+來(lái)半定量計(jì)分菌落，0表示＜10個(gè)菌落；+/-,10-20個(gè)；1+,20-50個(gè)；2+,50-70％鋪滿(mǎn)；3+,70-90％鋪滿(mǎn)；4+代表＞90％鋪滿(mǎn)菌落。在以1∶105稀釋度[代表81個(gè)第三輪、6個(gè)第四輪、7個(gè)第五輪克隆]來(lái)進(jìn)行測(cè)定的94個(gè)克隆中，6個(gè)克隆具有0的微量淘選得分，3個(gè)得分為1+,14個(gè)得分為2+,62個(gè)得分為3+,9個(gè)得分為4+。通過(guò)如以下所描述的G-跟蹤DNA測(cè)序來(lái)進(jìn)行得自代表生物淘選的第二到第五輪的平板的隨機(jī)克隆的測(cè)定。結(jié)果顯示第四輪生物淘選的序列差異明顯地下降(參見(jiàn)圖8)，因此，第二平板用1∶3×105稀釋度的噬菌體來(lái)微量淘選，此時(shí)包含較早(第二)輪的克隆。試驗(yàn)總共94個(gè)克隆，包括在1×105稀釋度下具有高分的29個(gè)克隆[26個(gè)來(lái)源于第三輪，1個(gè)來(lái)源于第四輪，2個(gè)來(lái)源于第五輪]以及以前還沒(méi)有試驗(yàn)的第二輪的65個(gè)克隆。在1∶3×105稀釋度下試驗(yàn)的94個(gè)克隆中，26個(gè)得分為0,11個(gè)得分為+/-,10個(gè)得分為1+,13個(gè)得分為2+,34個(gè)得分為3+,0個(gè)得分為4+。G-跟蹤DNA測(cè)序從在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)的培養(yǎng)物中分離得到單鏈病毒DNA。為了制備培養(yǎng)物，用來(lái)源于以前生長(zhǎng)的微量滴定板培養(yǎng)物的擴(kuò)散平板的單個(gè)噬菌體來(lái)接種2YT/Tet(以在試管中的2mL或者在微量滴定板圓底孔中的250μL)。按照Smith,G.P.和J.K.Scott(＂絲狀噬菌體上顯示的肽和蛋白質(zhì)文庫(kù)＂(1993)，酶學(xué)方法，217:228-257)(有關(guān)試管中的培養(yǎng)物)描述的方法以及Haas,S.J.和G.P.Smith G.P.(＂從絲狀噬菌體快速測(cè)序DNA＂(1993)生物技術(shù)，15:422-431)(有關(guān)微量滴定板中的噬菌體)描述的方法，通過(guò)培養(yǎng)物上清液的20％PEG/2.5 M NaCl沉淀來(lái)進(jìn)行純化噬菌體，以及通過(guò)苯酚-氯仿抽提或堿變性來(lái)進(jìn)行分離或釋放病毒粒子DNA。按照Smith和Scottt(同上)(有關(guān)試管培養(yǎng)物噬菌體DNA)描述的方法以及Haas和Smith(同上)(有關(guān)微量滴定板上噬菌體DNA)描述的方法，利用市售的測(cè)序試劑盒(U.S.Biochemical/Amersharn,Arlington Heights,IL)實(shí)施Sanger等(＂用鏈終止抑制劑的DNA測(cè)序＂(1970)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，74:5463-5467)的雙脫氧核苷酸鏈終止DNA測(cè)序技術(shù)。通過(guò)僅利用ddCTP終止混合物，在7％聚丙烯酰胺/脲測(cè)序凝膠上電泳之后獲得G跟蹤或由單堿基(G)給出的序列格式，并且為放射自顯影所顯示。而后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的凝膠電泳和放射自顯影過(guò)程(Sambrook等，同上)。
G-跟蹤的76個(gè)克隆(來(lái)源于ACA-6501文庫(kù)篩選的、得自在噬菌體稀釋度1∶1×105下試驗(yàn)的微篩選平板的)揭示出11個(gè)獨(dú)特的序列，而得自在噬菌體稀釋度1∶3×105下試驗(yàn)的第二微篩選平板的64個(gè)克隆顯示出30個(gè)獨(dú)特的序列。將利用所有4個(gè)雙脫氧核苷酸三磷酸的常規(guī)DNA測(cè)序用于具有最高微量淘選得分和獨(dú)特的序列的噬菌體克隆，結(jié)果產(chǎn)生如表1所示的xyz文庫(kù)的12個(gè)序列。噬菌體俘獲ELISA將克隆ACA-6635/3A12、3B3、3C8、3A5、3C9和3B7以3mL培養(yǎng)物培養(yǎng)。將親和純化的ACA-6635在磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.2)中稀釋到2.5μg/mL，向Immulon-2微量滴定板的孔中加入100μL。2小時(shí)后，在無(wú)振蕩的自動(dòng)平板洗滌器中用TBS/Tween洗滌平板3次。然后在每孔中用溶解在PBS中的150μL 0.1％BSA(無(wú)球蛋白)封阻此平板。在4℃下放置1小時(shí)后，將此平板如上所述洗滌3次。以17,000×g將每一種噬菌體培養(yǎng)物離心3分鐘后，在0.1％BSA/PBS中以1∶10稀釋每一種上清液，并在涂上一層親和純化的ACA-6635的每個(gè)孔中加入100μL，在4℃下溫育2小時(shí)。然后如上所述用TBS/Tween洗滌平板。在0.1％BSA/PBS中以1∶5,000稀釋辣根過(guò)氧化物酶-綴合的綿羊IgG抗-M13噬菌體抗體(Pharmacia公司，Piscataway,NJ)，并向每個(gè)孔中加入100μL。在4℃下溫育1小時(shí)后，如上所述將此平板洗滌4次。將按照綴合物廠商的指導(dǎo)制備的100μL底物加入到每個(gè)孔中。19分鐘后，在自動(dòng)微量平板吸收率讀數(shù)儀(Biotek,Winooski,VT)上測(cè)定每孔在405 nm處的吸收率。選擇來(lái)源于的ACA-6635噬菌體文庫(kù)篩選的試驗(yàn)的7個(gè)克隆，這是因?yàn)樗鼈兊母呶⒘刻赃x得分和陰性噬菌體ELISA得分(參見(jiàn)下文)。如圖9所示，所試驗(yàn)的7個(gè)克隆中有3個(gè)(3A12、3B3和3A5)在噬菌體俘獲ELISA中顯示出很強(qiáng)的免疫專(zhuān)一性信號(hào)。噬菌體ELISA由上述以親和純化的ACA-6501在幾個(gè)噬菌體文庫(kù)篩選物中分離的35個(gè)克隆來(lái)制備3mL培養(yǎng)物，并以一個(gè)缺乏肽插入片段的fUSE 2噬菌體克隆作為對(duì)照。在以17,000×g離心3分鐘后，將100μL的各種噬菌體上清液(以吸收率為基礎(chǔ)調(diào)至-2×1011粒子/毫升)加入到微量滴定板的孔(Falcon,Becton-Dickinson Labware,Lincoln Park,NY)中，并在40℃下過(guò)夜溫育。用TBS7.4洗滌4次后，在室溫下用125μL的0.5％BSA/TBS將此平板封阻1小時(shí)。經(jīng)TBS再洗滌4次后，將100μL原來(lái)在TBS/BSA中稀釋至2.5μg/mL的affACA-6501加入到每個(gè)孔中，在37℃下溫育1小時(shí)。再洗滌4次后，將在TBS/0.5％Tween中以1∶1000稀釋的100μL抗人IgG加入到每個(gè)孔中。在室溫下放置1小時(shí)后，加入酶底物，并溫育2小時(shí)。然后加入50μL 0.2M Na2HPO4以終止反應(yīng)，在自動(dòng)平板吸收率讀數(shù)儀上在550 nm處測(cè)量吸收率。如圖10所示，7個(gè)克隆在用ACA-6501的噬菌體ELISA中具有明顯的信號(hào)5A12、3B6、3E7、3B10(和2D7具有相同的序列)、2G11、2H1和2H2。這些克隆的序列如表2所示。肽-ELISA在標(biāo)準(zhǔn)方案中，用pH 9.5的碳酸鹽緩沖液將溶解在二甲基甲酰胺中的四體肽儲(chǔ)備溶液稀釋1000倍，即稀釋為10μg/mL。每孔涂布有100μL的稀釋肽的微量滴定板在40℃下放置一夜，然后用緩沖白蛋白封阻。在室溫下將涂布有肽的微量滴定板與不同稀釋濃度(以1∶50開(kāi)始)的aPL血清一起溫育1-2小時(shí)。洗滌后，按照標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法使用酶-綴合的抗人IgG確定結(jié)合肽的人IgG的存在。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合肽-ELISA(A)除用作空白對(duì)照的3個(gè)孔外，在每個(gè)ImmulonⅡ平板(Dynatech實(shí)驗(yàn)室公司，Chantilly VA)的孔中涂上一層含有溶解在50 mM碳酸鈉(pH9.5，含有35 mM碳酸氫鈉)(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA，試劑等級(jí))中的10μg四價(jià)肽ACA6501/3B10，在室溫下放置至少1小時(shí)。然后，將此液體從孔中除去，向每個(gè)孔(包括空白孔)中加入用于封阻的200μL的溶解在TBS中的0.5％(wt/vol)BAS(Sigma化學(xué)藥品，St.Louis,MO,#A7638)，將其在室溫下溫育至少1小時(shí)。將4個(gè)1.5毫升的離心管標(biāo)記為1-4號(hào)。在第一個(gè)離心管(Brinkman Instruments,Westbury,NY)中混合下列試劑30μL的5％ BSA；284μL TBS；8 μL大約400-500μg/mL的單體肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混雜的-3B10作為陰性對(duì)照)TBS溶液的儲(chǔ)備溶液；8.2μL 1∶10稀釋的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第二個(gè)離心管中混合下列試劑；30μL的5％BSA；290μLTBS；2μL大約400-500μg/mL的單體肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混雜的-3B10作為陰性對(duì)照)TBS溶液的儲(chǔ)備溶液；8.2μL 1∶10稀釋的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第三個(gè)離心管中混合下列試劑；30μL的5％BSA；287μL大約400-500μg/mL的單體肽(5A12或-CB2或-3B10或混雜的-3B10作為對(duì)照)的1∶10稀釋液；8.2μL原來(lái)以1∶10稀釋的ACA-6501血清的0.5％BSA-TBS溶液。在第四個(gè)Eppendorf離心管中混合下列試劑；60μL 5％BSA；584μL TBS和16.5μL的1∶10稀釋的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。用TBS將封阻的平板洗滌5次。將第一個(gè)離心管的溶液加入到3個(gè)孔中，每孔100μL。將相同數(shù)量的第二、第三和第四離心管的溶液也加入到三重孔中。將第四個(gè)離心管中的100μL溶液加入到微量滴定板的三個(gè)封阻的空白孔的每一個(gè)中。在室溫下將此平板在40rpm的有軌振蕩器(American Dade,Miami,FL,RotatorⅤ)中溫育1小時(shí)，然后用TBS洗滌5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀釋的山羊抗人IgG/堿性磷酸酯酶綴合物(Zymed，南舊金山，CA，產(chǎn)品號(hào)62-8422)溶液，并在室溫下溫育1小時(shí)。然后用TBS洗滌此平板5次，如實(shí)施例1所述通過(guò)加入100μL PPMP稀釋的底物溶液進(jìn)行測(cè)定。20分鐘后，通過(guò)向每孔中加入50μL的0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt,St.Louis,MO.，試劑等級(jí))終止反應(yīng)。在微量平板讀數(shù)儀(Bio-Tek儀器，Winoosli,VT,EL 311型)上以550nm測(cè)定光密度。將550nm下的光密度對(duì)每孔中的肽量在Graph Pad Prizm(Graph Pad軟件公司，San Diego,CA)上作圖。從此圖計(jì)算血清6501與四價(jià)3B10結(jié)合的50％抑制作用所需的肽量。
(B)以30μL/孔的量將Immulon I96孔平底的聚苯乙烯微量滴定板(Dynatech實(shí)驗(yàn)室公司，Chantilly,VA)涂布上心磷脂(CL,50μg；Sigma化學(xué)藥品公司，St.Louis,MO)的乙醇溶液。兩個(gè)對(duì)照孔中只含有30μL的乙醇。4℃下，過(guò)夜蒸發(fā)后，室溫下將每個(gè)孔用200μL 5％(w/v)魚(yú)明膠的PBS溶液封阻2小時(shí)。然后用TBS洗滌5次涂布有CL的封阻的平板，并向每個(gè)孔中加入β2-GPI作為100μL的2.3％(v/v，在PBS中)IgG耗盡的人血清(Sigma化學(xué)藥品公司，St.Louis,MO)，并在室溫下溫育2小時(shí)。
在溫育過(guò)程中，使用Eppendorf離心管，將數(shù)量可變化的6種肽的每一種與22μL ACA6501血清混合(所說(shuō)的血清是用溶解在1∶1 TBS/PBS中的3％魚(yú)明膠稀釋(最終為1∶400的稀釋液)的，最終體積為220μL。具體地，在#1管中混合181.3μL的3％魚(yú)明膠/TBS-PBS溶液、16.7μL的肽儲(chǔ)備溶液以及22μL的ACA6501血清(在3％魚(yú)明膠/TBS-PBS溶液中稀釋40倍)。對(duì)于肽#951(二絲氨酸非環(huán)化的陰性控制)，#952(大量的LJP 690)和硫醚CCTE-3G3、CHTE-3G3、HCTE-3G3和HHTE-3G3，儲(chǔ)備溶液的濃度變化范圍為450-800μg/mL。在2號(hào)管中加入下列物質(zhì)；148μL的魚(yú)明膠/TBS-PBS,50μL的肽儲(chǔ)備溶液+22μL 40倍稀釋的ACA6501血清。3號(hào)管含有48μL的魚(yú)明膠/TBS-PBS,50μL的肽儲(chǔ)備溶液+22μL 40倍稀釋的ACA6501血清。4號(hào)對(duì)照管中含有396μL的魚(yú)明膠/TBS-PBS和44μL 40倍稀釋的ACA6501血清(不含肽)。在室溫下將每一個(gè)管溫育大約1小時(shí)。
用TBS洗滌CL/β2-GPI微量滴定板5次，將100μL Eppendorf1、2、3、4號(hào)管中的含有抗體-肽(或者沒(méi)有肽混合物)的溶液重復(fù)加入到這些孔中。將100μL的管4的溶液重復(fù)加入到不含心磷脂的對(duì)照孔中。室溫下將此平板在40 rpm的軌道振蕩器(American Scientific,RotatorⅤ)中溫育1小時(shí)，然后用TBS洗滌5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀釋的山羊抗人IgG/堿性磷酸酯酶綴合物(Zymed，產(chǎn)品號(hào)62-8422)溶液。室溫下溫育1小時(shí)后，再用TBS洗滌此平板5次，通過(guò)加入100μLPPMP溶液(7.8g酚肽一磷酸+69.5g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的100mL水儲(chǔ)備溶液，用水以1∶26稀釋)進(jìn)行酶比色測(cè)定。21分鐘后，通過(guò)向每孔中加入50μL的0.2 M Na2HPO4(Mallinckrodt)來(lái)終止反應(yīng)。在微量平板讀數(shù)儀(Bio-Tek儀器，Winooski,VT,EL 311型)上在550nm處測(cè)定吸收率。將吸收率對(duì)加入的肽量在Graph Pad Prism(Graph Pad軟件公司)上作圖。從此圖的與最大吸收率一半的交叉點(diǎn)的肽加入量來(lái)計(jì)算50％抑制ACA6501結(jié)合(IC50)的肽量。
(C)在Nunc Maxisorp96孔平底微量滴定平板上以100μL/孔(在PBS中)涂布一層純化的人P2-糖蛋白I(Perlmmune,Rockville,MD)。兩個(gè)對(duì)照孔只接收100μL PBS。在室溫下溫育兩小時(shí)之后，除去液體。在室溫下用200μL/孔的包含2％(w/v)無(wú)脂干牛奶(Carnation,Glendale,CA)和0.4％(w/v)Tween 80(Calbiochem,San Diego,CA)的PBS封阻涂布的平板2小時(shí)。封阻液也用作為稀釋劑。
在溫育的第二小時(shí)期間，利用Eppendorf微量離心管，使可變量的四個(gè)檢驗(yàn)肽之每一個(gè)與22μL ACA-6501血清(以220μL的終體積用樣品稀釋劑稀釋的)混合。具體地說(shuō)，在管1中，加入188μL的樣品稀釋劑、10μL的肽儲(chǔ)備溶液(2mg-4mg/mL稀釋劑)、以及22μL的用樣品稀釋劑稀釋為1∶35的ACA-6501血清。在管2中，加入158μL的樣品稀釋劑、40μL的肽儲(chǔ)備溶液、以及22μL的1∶35稀釋的ACA-6501血清。管3包含38μL樣品稀釋劑、160μL肽儲(chǔ)備溶液以及22μL的1∶35稀釋的ACA-6501血清。對(duì)照管(管94)包含396μL樣品稀釋劑和44μL的1∶3.5稀釋的ACA-6501血清(沒(méi)有肽)。在室溫下溫育每管大約1小時(shí)。
用TBS洗滌β2-GPI微量平板5次，并加入100μL的包含在Eppendorf管1、2、3和4中的混合物至微量平板的重復(fù)孔中。將管4的100μL內(nèi)含物加入到?jīng)]有涂布β2-GPI的重復(fù)對(duì)照孔中。在室溫下溫育平板1小時(shí)，用TBS洗滌5次，并加入100μL的用樣品稀釋劑緩沖液稀釋為1∶1000的山羊抗人IgG/A-P綴合物(Zymed，產(chǎn)品號(hào)62-8422)。在室溫下溫育1小時(shí)后，用TBS再洗滌平板5次，并通過(guò)加入100μL PPMP溶液(在100 mL水儲(chǔ)備液中的用水稀釋為1∶26的7.8g酚酞一磷酸和69.5g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇)來(lái)進(jìn)行比色酶檢測(cè)。在22分鐘之后，通過(guò)每孔加入50μL的0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt)來(lái)停止反應(yīng)。用微量平板讀數(shù)儀(Boi-Tek儀器，EL 311型)讀取A550 nm。將吸光度與加入的肽量點(diǎn)繪在Graph PadPrism(Graph Pad Software公司)上，如圖21所示。從圖上在最大之一半的吸光度與加入的肽量的相交點(diǎn)處，計(jì)算50％抑制ACA-6501結(jié)合的肽量(IC-50)。實(shí)施例5肽3B10的截短實(shí)驗(yàn)和所形成的肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果在室溫下以每孔100μL的四體ACA-6501/3B10肽(為10μg/mL的碳酸鹽緩沖液(pH 9.6,15mM Na2CO/35mM NaHCO3))溶液)涂布微量滴定板(96孔、平底的聚苯乙烯，Immulon-2,Dynatech實(shí)驗(yàn)室公司，Chantilly,VA)。從孔中除去液體后，在室溫下用200μL的0.5％(wt/vol)BSA(無(wú)球蛋白，產(chǎn)品號(hào)A7638,Sigma化學(xué)藥品公司，St.Louis,MO)的TBS溶液封阻每孔1小時(shí)。此平板左邊的三重孔沒(méi)有涂布四價(jià)的肽，目的是作為空白對(duì)照孔。
在封阻期間，將每一種可溶的待測(cè)的單體肽裝入三個(gè)試管(Eppendorf小試管，Brinkmann儀器，Westbury,NY)中，每個(gè)管中含有30μL 5％BSA/TBS、8.2μL ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀釋)+體積可變的肽/TBS儲(chǔ)備物、必要量的TBS，使最終體積為330μL。330μL體積足以產(chǎn)生3個(gè)100μL的每一種肽濃縮物的樣品，這些樣品用于檢測(cè)其封阻ACA-6501與四價(jià)肽涂布的平板的結(jié)合能力。對(duì)于肽139(其氨基末端是截短的，并缺乏正常試驗(yàn)的構(gòu)架ala-gly)，此儲(chǔ)備溶液的濃度為大約340-400μg/mL TBS，除去19μL、75μL和292μL等分溶液以便制備三種肽濃度的管。對(duì)于肽142(只是沒(méi)有N-末端ala)和肽143(沒(méi)有截短)，儲(chǔ)備溶液的濃度為大約400-500μg/mL TBS。從每一種儲(chǔ)備物溶液中除去1μL、4μL和16μL的等分溶液以制備每種肽的三種濃度的管。對(duì)于肽單體對(duì)照管(沒(méi)有肽)，制備最終體積為660μL的管，其包含60μL 5％BSA、16.5μL的ACA-6501的1∶10稀釋液和583.5μL的TBS(即與330μL的管具有相同的最終濃度(0.5％BSA和1∶400的ACA-6501血清)，但是體積是它的兩倍，不含肽)。
封阻溫育后，將用四價(jià)肽涂布的平板用TBS洗滌5次。將每一個(gè)330μL的以不同濃度含有肽139、142和143的管中的100μL溶液加入到涂布的三重孔中。將不含肽的660μL的對(duì)照管中的三份100μL等分溶液分別加入到涂布的孔中，另外三份100μL的等分溶液分別加入到未涂布的空白孔中。在室溫下將此平板在40轉(zhuǎn)/分鐘的旋轉(zhuǎn)有軌振蕩器(Rotator V,American Dade,Miami,FL)中溫育1小時(shí)，然后用TBS洗滌5次。向微量滴定板每孔中加入溶解在BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀釋的山羊抗人IgG/堿性磷酸酯酶綴合物(產(chǎn)品號(hào)62-8422,Zymed,South SanFrancisco,CA)溶液。在室溫下溫育1小時(shí)后，然后再用TBS洗滌此平板5次。向每孔中加入100μL新制備的稀釋PPMP底物溶液后可產(chǎn)生顏色。PPMP的稀釋溶液(酚肽一磷酸，產(chǎn)品號(hào)P-5758,Sigma化學(xué)藥品公司，St.Louis,MO)是通過(guò)以1∶26用水稀釋PPMP儲(chǔ)備溶液(0.13MPPMP、7.8M氨基-2-甲基-1-丙醇(用HCl將其pH調(diào)至10.15))制備的。30分鐘后，通過(guò)向每孔中加入50μL的0.2M Na2HPO4(試劑級(jí)，Mallinckrodt,St.Louis,MO)終止反應(yīng)。在微量平板讀數(shù)儀(Bio-Tek儀器，Winooski,VT,EL 311型)上以550nm測(cè)定吸收率，將吸收率對(duì)每孔加入的肽量在Graph Pad Prizm(Graph Pad軟件公司，San Diego,CA)上作圖。如圖11所示，劃出的基線相當(dāng)于在沒(méi)有單體肽競(jìng)爭(zhēng)抑制作用時(shí)的結(jié)合反應(yīng)最大值的一半。50％的抑制值如圖12所示。所得的結(jié)果表明N-末端Ala的缺失沒(méi)有負(fù)作用，而Gly的再缺失則增加了獲得50％抑制作用所必需的濃度大約8倍。實(shí)施例6:3B10中的α-甲基脯氨酸取代及所產(chǎn)生的ELISAs使用實(shí)施例5描述的方法試驗(yàn)肽ACA-6501/3B10和其類(lèi)似物(其中3和9位上的脯氨酸由α-Me-Pro代替)。使用四體肽3B10涂布的微量滴定板和ACA-6501血清在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ELISA中檢驗(yàn)作為可溶單體肽的肽3B10，726(在3位上αMe-Pro被取代)，727(在9位上αMe-Pro被取代)，和728(在3和9位上αMe-Pro被取代)。
如實(shí)施例5所述將微量滴定板用四體肽3B10涂上一層。對(duì)于所試驗(yàn)的4種肽的每一種，在管中制備3種濃度的肽。這12個(gè)管的最終濃度為0.5％BSA/TBS、以1∶400最終稀釋的ACA-6501血清，終體積為330μL。所有的肽儲(chǔ)備溶液為400-500μL/mL TBS。向含有30μL 5％BSA/TBS和8.2μL ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀釋)的管中，加入4種肽儲(chǔ)備溶液的每一種的1μL、4μL和16μL的等分溶液，另外加入合適體積的TBS，使最終體積為330μL。如實(shí)施例5所述，制備最終體積為660μL的不含競(jìng)爭(zhēng)肽的對(duì)照管。
四價(jià)肽涂布的平板的溫育封阻后，如實(shí)施例5的描述試驗(yàn)來(lái)源于四種肽的各種肽濃度管中的三份100μL等份樣品、以及來(lái)源于不包含肽的對(duì)照管和空白對(duì)照中的等份樣品。如實(shí)施例5的描述實(shí)施微量滴定板ELISA方法和進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。如圖13所示，肽727(其中在9位置上的α-Me-Pro被取代)與未修飾的肽3B10或帶有改變的脯氨酸的類(lèi)似物(肽728)相比具有明顯提高的活性。肽726(其在3位發(fā)生取代)由于這種取代而失去了活性。實(shí)施例7利用6626抗體的篩選的簡(jiǎn)要描述和相應(yīng)的序列通過(guò)親和純化從上述的8mL ACA-6626血漿中分離親和純化的ACA-6626(AffACA-6626)。將AffACA-6626(10μg)與含有全部的p-Ⅲ感受態(tài)的一組文庫(kù)(最終體積為100μL)(如上文用于ACA-6501生物淘選的描述)的表位xy’z噬菌體文庫(kù)一起溫育。在三輪生物淘選之后，通過(guò)微量淘選檢驗(yàn)從第二輪和第三輪中隨機(jī)選擇的噬菌體。只有幾個(gè)克隆在1∶1000稀釋度下具有微弱的免疫陽(yáng)性。對(duì)另外的第四輪進(jìn)行生物淘選。94個(gè)第四輪克隆的微量淘選顯示出43個(gè)免疫陽(yáng)性，有些在高達(dá)1∶100000稀釋度下表現(xiàn)出免疫陽(yáng)性。如上文用于ACA-6501的描述所進(jìn)行的43個(gè)免疫陽(yáng)性克隆的G-示蹤DNA測(cè)序表明5個(gè)單一序列。在常規(guī)的四堿基DNA測(cè)序后，獲得了表3的翻譯氨基酸序列。實(shí)施例8對(duì)患者6644的ACA特異的序列的鑒定使用與實(shí)施例4類(lèi)似的方法通過(guò)患者6644的ACA親和純化的抗體篩選epixy’z噬菌體顯示文庫(kù)。在肽合成前使用上述的菌落印跡分析作為最后的鑒定步驟。在原來(lái)硝酸纖維素膜上接種大約150個(gè)菌落，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。以1μg/mL的濃度使用患者6644的抗體。在此篩選中，在硝酸纖維素膜上平板接種和測(cè)定的150個(gè)菌落中，只有四個(gè)具有較強(qiáng)的陽(yáng)性，2個(gè)表現(xiàn)出微弱的陽(yáng)性。此篩選中選擇出的6個(gè)陽(yáng)性噬菌體的插入片段的測(cè)序表明所有這些插入片段都來(lái)自具有游離氨基末端(epiz)的8-mer文庫(kù)。
Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Gly(3個(gè)插入片段)Gly-Ile Leu-Thr-Ile-Asp-Asn-Leu-Gly-Gly(1個(gè)插入片段)Gly-Ile-Leu-Leu-Asn-Glu-Phe-Ala-Gly-Gly(2個(gè)插入片段)實(shí)施例9利用ACA-6641的噬菌體文庫(kù)篩選的概述從取自患者6641的4mL血漿中分離AffACA-6641。如上所述將AffACA-6641(10μg)與一組p-Ⅲ噬菌體文庫(kù)(最終體積為100μL)一起溫育。在四輪生物淘選之后，通過(guò)微量淘選檢驗(yàn)第三輪和第四輪中的45個(gè)克隆。在45個(gè)克隆中有23個(gè)是陰性的。第三輪噬菌體產(chǎn)生得分為4+的兩個(gè)克隆、得分為3+的兩個(gè)克隆、得分為2+的兩個(gè)克隆。在第四輪中一個(gè)克隆得分為4+，一個(gè)克隆得分為3+,3個(gè)克隆得分為2+。G-示蹤的DNA測(cè)序顯示出6個(gè)單一序列。只有一個(gè)克隆(3G3)在噬菌體俘獲ELISA中顯示出較強(qiáng)的陽(yáng)性。四個(gè)堿基的DNA測(cè)序得到下列翻譯的肽序列CLGVLGKLC。實(shí)施例10肽與非免疫原性多價(jià)載體的綴合如共有共同未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/118,055(1993年9月8日申請(qǐng))、08/152,506(1993年11月15號(hào)申請(qǐng))和美國(guó)專(zhuān)利5,268,454、5,276,013和5,162,515(其全部?jī)?nèi)容本文一并參考)中所述，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于產(chǎn)生B細(xì)胞耐受原的一些四價(jià)平臺(tái)。結(jié)合通過(guò)表位文庫(kù)的aPL抗體篩選選擇的候選肽，并檢驗(yàn)它的免疫化學(xué)行為(如抗體結(jié)合)的改變。
按照下面的方案合成帶有胺基團(tuán)的非免疫原性多價(jià)平臺(tái)。平臺(tái)上的胺-肽上的羧基
化合物2將溶解在50mL純EtOH和35mL環(huán)己烯中的8.0g(5.7mmol)化合物1溶液放置在氮?dú)庵?，加?00mg 10％Pd/碳。將混合物攪拌回流2小時(shí)。冷卻時(shí)經(jīng)Celite過(guò)濾，濃縮得到油狀的5.0g化合物2。1H NMR(50/50CDCl3/CD3OD)d1.21(m,8H),1.49(m,8H).1.62(m,8H),2.19(t,J=7.4Hz,8H),2.67(t,J=7.4 Hz,8H),3.36(bd s,16H),3.67(s,4H),3.71(m,4H)；4.21(m,4H)。帶有游離羧基的保護(hù)肽(PHN-肽-CO2H)在Wang(對(duì)烷氧基芐基)樹(shù)脂上利用FMOC化學(xué)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)固相方法合成肽，其中使用三氟乙酸(TFA)穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)(在羧基上的芐基酯或環(huán)己基酯和在氨基上的芐氧羰基(CBZ))。將氨基酸殘基順序地加入到氨基末端。利用TFA從樹(shù)脂上取出肽，以便提供在羧基末端具有一個(gè)游離羧基的肽，所有其它的羧基和氨基都被封阻。通過(guò)反相HPLC純化保護(hù)的肽。肽-平臺(tái)綴合物4把保護(hù)的肽(0.3mmol)溶解在1mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，向溶液中加入0.3mmol二異丙基碳化二亞胺、0.3mmol 1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)。將此溶液加入到含有0.025mmol四氨基平臺(tái)、化合物2(1mLDMF溶液)的溶液。加入后真空除去DMF以產(chǎn)生粗制的完全保護(hù)的綴合物3。在0℃下用氫氟酸(HF)在茴香醚存在下處理綴合物3產(chǎn)生綴合物4。
通過(guò)制備型反相HPLC進(jìn)行純化。
下列的方案顯示出肽的氨基連接到平臺(tái)的羧基上。平臺(tái)上的羧基-配體上的胺
將琥珀酐(1.0g,10mmol)加入到溶解在20mL1/1二噁烷/水中的861mg(1.0mmol)的化合物2和252mg(3.0mmol)的NaHCO3溶液中，將混合物在室溫下攪拌16小時(shí)。用1N HCl將混合物酸化，并將其濃縮。通過(guò)硅膠層析純化此濃縮物，產(chǎn)生化合物5。帶有游離胺的保護(hù)的肽(H2N-肽-CONH2)使用TFA穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)(在羧基上的芐基酯或環(huán)己基酯和在氨基上的CBZ)在酰胺樹(shù)脂上經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的固相方法合成肽，這樣，從此樹(shù)脂上切割后產(chǎn)生羧基末端的酰胺，使用標(biāo)準(zhǔn)的FMOC化學(xué)向氨基末端順序加入氨基酸殘基。使用三氟乙酸從樹(shù)脂上除去此肽以產(chǎn)生帶有游離胺接頭的保護(hù)的肽。經(jīng)反相HPLC純化此保護(hù)的肽。肽-平臺(tái)綴合物7制備溶解在1mL的DMF中的0.05mmol帶有游離胺的保護(hù)肽(H2N-肽-CONH2)、0.1mmol二異丙乙基胺、0.01mmol的化合物5溶液。加入BOP試劑(苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽)(0.1mmol)，攪拌混合物直到經(jīng)分析型HPLC確定反應(yīng)完全。0℃下在茴香醚存在時(shí)通過(guò)HF處理除去肽保護(hù)基團(tuán)，得到除去肽保護(hù)基因的綴合物7。經(jīng)制備型反相HPLC純化化合物7。
下列方案表明如何將巰基接頭與肽的氨基末端連接，接下來(lái)將肽胺頭與四溴乙?；钠脚_(tái)連接產(chǎn)生化合物13。平臺(tái)上的鹵乙酰和肽上的巰基三苯基乙醇
化合物9將濃硫酸(100μL)添加到4.48g(17.2mmol)三苯甲醇和1.62g(15.3mmol,1.3mL)3-巰基丙酸在35mL EtOAc中的60℃溶液中。在60℃將混合物攪拌10分鐘，使其冷卻至室溫(RT)，置于冰上1小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集所形成的白色固體，給出4.52g(75％)化合物9?；衔?0將二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)(2.41g,11.7mmol)添加到2.72g(7.8mmol)化合物9和1.08g(7.8mmol)對(duì)硝基苯酚在41mL CH2Cl2中的0℃溶液中。將混合物攪拌16小時(shí)，使其到達(dá)RT。過(guò)濾混合物以除去N,N-二環(huán)己基脲(DCU)，濃縮濾液。從己烷/二氯甲烷結(jié)晶殘?jiān)?，產(chǎn)生3.17 g(86％)淡黃色結(jié)晶狀的化合物10?；衔?1-具有連接的巰基丙酰接頭的環(huán)狀硫醚肽將環(huán)狀硫醚肽(一種二硫化物環(huán)化肽類(lèi)似物，其中一個(gè)硫原子被一個(gè)CH2取代)和碳酸氫鈉在水和二噁烷中的溶液用對(duì)硝基苯酯10處理。如果肽含有賴(lài)氨酸，則其必須進(jìn)行合適的封阻。將所形成的稀釋肽用三氟乙酸處理，產(chǎn)生硫醇接頭修飾的肽11?；衔?3-環(huán)狀硫醚肽和溴乙?；脚_(tái)的綴合物向0.10mmol硫醇修飾肽11在100mM硼酸鈉(pH9)中的He吹洗的溶液加入0.025溴乙酰化平臺(tái)12(在9/1 MeOH/H2O中的40mg/mL溶液)。在N2氛圍下攪拌溶液，直到由HPLC證實(shí)綴合完全。通過(guò)反相HPLC純化綴合物。實(shí)施例12:LJP 685的合成
γ-溴代-N-BOC-α-氨基丁酸叔丁酯，化合物14:
在40mL干THF中的4.03g(13.3mmol)N-BOC-谷氨酸-α-叔丁酯和1.61mL(1.48g,14.6mmol)N-甲基嗎啉在N2氛圍下冷卻至15℃。將氯甲酸異丁酯(1.73mL,1.82g,13.3mmol)逐滴加入到混合物中。將混合物攪拌10分鐘，加入2.03g(16.0mmol)N-羥基-2-巰基吡啶在8mL THF中的溶液，接著加入2.23mL(1.62g,16.0mmol)Et3N。將混合物用箔包裹以避光，使其在室溫下攪拌1小時(shí)。過(guò)濾混合物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮濾液，小心盡量不暴露于光下。將濃縮物溶解在20mL BrCCl3中，將溶液冷卻至-70℃。將固體置于真空中，然后用N2清洗，使其達(dá)到室溫，置于20℃的水浴中，在近距離內(nèi)從上方用500W太陽(yáng)燈照射5分鐘。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物，經(jīng)硅膠色譜純化(40mm×150mm，甲苯用作洗脫液直到UV活性物完全洗脫，2％EtOAc/甲苯(500mL),5％EtOAc/甲苯(500 mL)。再純化不純的組分。合并TLC(Rf 0.23,5％EtOAc/甲苯)純化的組分，濃縮，產(chǎn)生3.23g(72％)蠟狀固體狀化合物14。N-BOC-甘氨酰脯氨酸-4-硝基苯酯，化合物15將3.0g(11.6mmol)N-BOC-甘氨酰脯氨酸和1.93g(13.9mmol)4-硝基苯酚在82mL干THF中的溶液冷卻至0℃，加入3.34g(16.2mmol)DCC。將混合物在0℃下攪拌1小時(shí)，移去冰浴。將混合物在室溫下攪拌16小時(shí)。將HOAc(579μL)加入到混合物中攪拌30分鐘。將混合物保持在冰箱中30分鐘，在真空下過(guò)濾。濃縮濾液，經(jīng)硅膠色譜(18×150mm柱床，2.5％EtOAc/97.5％CH2Cl2/1％HOAc)純化。通過(guò)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上從二噁烷環(huán)濃縮幾次除去微量的乙酸。用3/1己烷/Et2O研磨濃縮物，經(jīng)過(guò)濾收集所形成的白色固體，產(chǎn)生4.1g(90％)白色固體狀化合物15。TLC Rf0.09,40/60/1 EtOAc/己烷/HOAc；1H NMR(CDCl3)(1.09-2.55(m,4H),1.48(s,9H),3.47-3.77(m,2H),4.05(m,2H),4.74(m,1H),5.45(bd s,1H),7.35(d,2H),8.30(d,2H)。N-FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸酰胺(thiocysteineamide)，化合物16將5.0g(11.6mmol)FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸和1.33g(11.6mmol)N-羥基琥珀酰亞胺在115mL THF中的溶液冷卻至0℃。向溶液中加入3.58g(17.37mmol)DCC，在0℃攪拌混合物1小時(shí)，加入1.6g(NH4)HCO3在50mL水中的42.9mL溶液。將混合物攪拌4.5小時(shí)，使冰浴逐漸溫?zé)嶂潦覝?，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，以除去THF，產(chǎn)生具有白色固體的水相。將混合物與200mL CH2Cl2一起攪拌，直到大多數(shù)固體溶解，然后與100mL 1N HCl溶液一起振蕩。用100mL飽和NaHCO3溶液洗滌CH2Cl2層。干燥(Na2SO4)并過(guò)濾。在熱的平板上使濾液沸騰，從300mLCH2Cl2/己烷結(jié)晶，產(chǎn)生4.36g(87％)白色固體狀化合物16；mp127-129℃；TLC Rf 0.29,95/5/1 CH2Cl2/CH3CN/MeOH,1H NMR(CDCl3)δ1.36(s,9H)；3.06-3.24(m,2H),4.25(t,1H),4.55(m,3H),5.56(bd s,1H),5.70(bd s,1H),6.23(bd s,1H)；13C NMR(CDCl3)29.8,41.9,47.1,48.5,54.2,67.2,120.0,125.0,127.1,127.8,141.3,143.6,156.1,172.2.分析，計(jì)算值C,61.4％；H,6.1％；N,6.5％。實(shí)測(cè)值C,61.5％；H,6.0％；N,6.5％。化合物17將水(16.9mL)添加到在33.8mL二噁烷中的2.91g(6.75mmol)化合物16中，用氮?dú)獯迪慈芤?-10分鐘。將混合物保持在氮氛圍下，加入1.13g(13.5mmol)NaHCO3，接著加入1.77mL(1.44g,7.09mmol)PBu3。在室溫下攪拌混合物1小時(shí)，在1×100mL 1N HCl和2×100mLCH2Cl2之間分配。合并CH2Cl2層，濃縮，將所形成的白色固體部分溶解在33.8mL二噁烷中。加入水(9mL)，用氮?dú)馇逑椿旌衔?-10分鐘。將混合物保持在氮氛圍下，加入2.17g(16.9mmol)K2CO3，接著加入2.63 g(8.1mmol)化合物14。將混合物攪拌16小時(shí)，在1×100mL 1N HCl和2×100mL 10％MeOH/CH2Cl2之間分配。合并CH2Cl2層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮成半固體殘?jiān)＝?jīng)硅膠色譜(1/3 CH3CN/CH2Cl2)純化，產(chǎn)生3.2g(80％)化合物17白色固體；TLC Rf0.27,1/3 CH3CN/CH2Cl2。通過(guò)從己烷/EtOAc重結(jié)晶進(jìn)行分析樣品的進(jìn)一步純化；mp104-106.5℃；1HNMR(CDCl3)δ1.47(s,9H),1.49(s,9H),1.96(m,1H),2.11(m,1H),2.69(m,2H),2.88(m,1H),3.03(m,1H),4.29(t,1H),4.36(m,2H),4.50(m,2H),5.21(m,1H),5.49(m,1H),5.81(m,1H),6.54(m,1H),7.34(t,2H),7.42(t,2H),7.61(d,2H),7.80(d,2H)；13C NMR(MeOH)δ26.1,26.7,28.2,28.7,34.8,54.8,55.7,68.1,80.5,82.7,120.9,126.3,128.2,128.8,142.6,145.2,160.0,162.7,173.4,175.8。C31H41N3O7S分析，計(jì)算值C,62.08；H,6.89；N,7.01實(shí)測(cè)值C,62.23；H,7.12；N,7.39?；衔?8將20/1/1 TFA/H2O/巰基乙醇(23.2mL)溶液加入到1.27g(2.11mmol)化合物17中。在室溫下攪拌混合物1小時(shí)，濃縮至約3mL體積。添加50mL乙醚以沉淀產(chǎn)物。用兩份更多的乙醚洗滌所形成的固體，并在真空下干燥，產(chǎn)生812mg固體。將該固體懸浮在10.6mL二噁烷和10.6mL H2O中。將NaHCO3(355mg,4.22mmol)添加到混合物中，接著添加1.33g(3.38mmol)化合物15在10.5mL二噁烷的溶液中。在室溫下攪拌混合物20小時(shí)，在100mL 1N HCl和3×100mL CH2Cl2中分配。干燥合并的CH2Cl2層(Na2SO4)，過(guò)濾并濃縮。經(jīng)硅膠色譜純化(35×150mm；梯級(jí)梯度，5/95/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc(1L)到10/95/1)。濃縮純的組分，與乙醚一起研磨殘?jiān)?，產(chǎn)生881mg(60％)化合物18；TLC Rf 0.59,10/90/1MeOH(CH2Cl2/HOAc；mp 116-117.5℃；1H NMR(CDCl3)δ1.41(s,9H),2.00(m,2H),2.18(m,2H),2.56(m,1H),2.69(m,1H),2.85(m,2H),3.49(m,2H),3.62(m,2H),3.85(m,2H),4.08(m,1H)；4.12(m,1H),4.22(t,1H),4.38(m,1H),4.49(m,2H),4.61(m,2H),7.78(d,bd s,1H),6.12(bd s,1H),6.43(bds,1H),7.35(d,2H),7.40(d,2H),7.61(d,2H),7.78(d,2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.3,27.8,28.6,29.4,32.6,35.1,44.1,46.9,47.3,52.2,53.9,61.2,67.8,80.8,120.8,125.7,128.2,129.0,142.0,144.5,157.6,157.8,170.6,181.2,182.9,183.1。C34H43N5O9S分析，計(jì)算值C,58.52；H,6.21:N,10.03。實(shí)測(cè)值C,58.38,11,6.17；N,10.20。
N-FMOC-L-丙氨酰-L-2-甲基脯氨酸，化合物19:
將2-甲基脯氨酸(Seebach等(1983)美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志，105:5390-5398)(1.00g；4.76 mmol),4.00g(47.6mmol)NaHCO3和31mg(0.23mmol)HOBT在6.9mL DMF中的溶液冷卻至0℃，加入3.18g(6.66mmol)N-FMOC-L-丙氨酸。在0℃攪拌反應(yīng)物1小時(shí)，然后在室溫下攪拌18小時(shí)。將混合物在50mL EtOAc和3×50mL 1N HCl中分配，干燥EtOAc層(MgSO4)，過(guò)濾并濃縮。經(jīng)硅膠色譜(梯級(jí)梯度45/55/1 EtOAc/己烷/HOAc到47/53/1 EtOAc/己烷/HOAc到50/50/1 EtOAc/己烷/HOAc)純化，產(chǎn)生1.72g(86％)化合物19白色固體。將產(chǎn)物從二噁烷濃縮幾次，以除去微量的乙酸；mp 59-60℃；1H NMR(CDCl3)δ1.39(d,3H),1.93(m,2H),2.06(m,2H),3.78(m,2H),4.22(m,1H),4.40(d,2H),4.56(m,1H),5.09(t,1H),5.69(d,1H),7.32(t,2H),7.42(t,2H),7.62(d,2H),7.78(d,2H)；13C NMR(CDCl3)δ17.8,21.8,23.8,37.9,47.1,48.5,65.9,67.0,120.0,125.1,127.1,127.7,141.3,144.1,155.6,172.9,175.1。N-FMOC-L-亮氨酰-HMPB-MBHA樹(shù)脂制備N(xiāo)-FMOC-L-亮氨酸在22.5mL CH2Cl2中的溶液和幾滴DMF，冷卻至0℃。向溶液中加入1.71mL(1.38g,10.9mmol)二異丙基碳化二亞胺(DIC)，在0℃下攪拌混合物20分鐘。將混合物濃縮成油狀，同時(shí)，將足夠量的DMF(約3mL)加入到2.5g(0.87mmol/g,2.18mmol)HMPB-MBHA樹(shù)脂(Nova Biochem)上，以溶脹樹(shù)脂。將濃縮的油狀物溶解于少量DMF(約1mL)中，并添加到溶脹的樹(shù)脂上，接著加入溶解在約1mLDMF中的266mg(2.18mmol)DMAP溶液。輕輕搖動(dòng)混合物1小時(shí)，洗滌(2XDMF,2XMeOH,2XDMF,2XMeOH)。將樹(shù)脂在真空下干燥，產(chǎn)生2.77g(85％)，取代由Geisen試驗(yàn)測(cè)得為0.540mmol/g。具有在天冬氨酸上的叔丁酯和在精氨酸上的Pmc基以及具有硫醚插入片段的N-FMOC-線性肽，化合物20在N-FMOC-L-亮氨酰-HMPB-MBHA樹(shù)脂上經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)FMOC合成法制備該肽。除了化合物18的偶聯(lián)步驟外，在各偶聯(lián)步驟中使用三當(dāng)量的氨基酸，HOBT和(DIC)。兩當(dāng)量的化合物18與三當(dāng)量的HOBT和二異丙基碳化二亞胺一起使用。利用10μL溴酚藍(lán)指示劑監(jiān)測(cè)各步反應(yīng)。也用茚三酮試驗(yàn)(在100℃加熱2分鐘，用1滴吡啶和1滴在EtOH中的5％茚三酮和1滴在EtOH中的80％苯酚，液滴變藍(lán))估計(jì)反應(yīng)的完成情況。這樣，將1.13mg(0.613mmol)樹(shù)脂用于制備所說(shuō)的肽。在最后的偶聯(lián)步驟后，通過(guò)用1％三氟乙酸在CH2Cl2中的溶液處理2分鐘完成從樹(shù)脂上裂解。2分鐘后，減壓過(guò)濾到30mL 10％吡啶在MeOH中的溶液中。重復(fù)這一操作10次。合并經(jīng)HPLC(C18，梯度，60/40/0.1 CH3CN/H2O/TFA到90/10/0.1CH3CN/H2O/TFA,210nm,1mL/min,4.6mm×250mm柱)正實(shí)含有肽的濾液并濃縮。將濃縮物溶解在40mL 10％HOAc溶液中，經(jīng)HPLC純化，產(chǎn)生0.528g(49％)肽20。將肽20轉(zhuǎn)化成環(huán)狀肽21(除去FMOC基，環(huán)化和除去保護(hù)基)將99μL DBU在10mL CH3CN中的溶液(5mL)添加到96mg(0.052mmol)肽20中。攪拌溶液1小時(shí)，濃縮成殘?jiān)?。將該殘?jiān)c2×10mL Et2O一起研磨，產(chǎn)生白色固體。將該固體溶解在100mL CH3CN和312μL(0.312mmol)0.1M二苯基磷?；B氮化物(DPPA)在CH3CN中的溶液中。將混合物攪拌20小時(shí)，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。將該殘?jiān)c2×50mL Et2O一起研磨，白色的不透明殘?jiān)?mL 92/3/2/3 TFA/茴香醚/EDT/Me2S處理1小時(shí)。通過(guò)將混合物加入到在50mL聚丙烯離心管中的40mL Et2O中沉淀產(chǎn)物。將沉淀冷卻至0℃，在2000rpm下離心5分鐘。傾析上清液，用Et2O洗滌沉淀并再離心。干燥沉淀并溶解在4mL 50/50 CH3CN/H2O中。用36mL H2O/0.1％TFA稀釋混合物，經(jīng)HPLC(1＂C18柱，梯度，10/90/0.1 CH3CN/H2O/TFA到35/65/0.1 CH3CN/H2O/TFA,230nm)純化。冷凍干燥經(jīng)HPLC證實(shí)的純化的組分，產(chǎn)生52 mg(90％)化合物21。實(shí)施例13:LJP 685綴合物的合成
用3-三苯甲基巰基丙酸PNP酯處理LJP 685(也稱(chēng)為化合物21)，將產(chǎn)生的產(chǎn)物脫三苯甲基化，產(chǎn)生化合物22，具有游離硫醇接頭的肽。過(guò)量化合物22與效價(jià)平臺(tái)分子12的反應(yīng)產(chǎn)生四價(jià)的綴合物25。用較長(zhǎng)的接頭，化合物33(參見(jiàn)以下反應(yīng)方案)處理化合物21，接著脫三苯甲基產(chǎn)生化合物24?；衔?4與效價(jià)平臺(tái)分子12反應(yīng)產(chǎn)生四綴合物26。通過(guò)HPLC，兩種綴合反應(yīng)看來(lái)非常清楚。將MTU接頭連接到LJP685上，合成化合物24向15mg(0.013mmol)化合物21中加入160μL 29.5mg化合物23的溶液和17.5μL在0.5mL DMF中的二異丙基乙胺的溶液。將混合物攪拌2小時(shí)，并從Et2O中沉淀。干燥沉淀并溶解在650μL1/1/0.056/0.040TFA/CH2C12/苯硫酚/Me2S溶液中，使溶液靜置1小時(shí)。從Et2O沉淀，產(chǎn)生粗化合物24，經(jīng)HPLC(C18,15-45％CH3CN/H2O,0.1％TFA)純化。將含有純化的產(chǎn)物的組分冷干，產(chǎn)生8.6mg化合物24白色固體。LJP 685-MTU-AHAB-TEG，化合物26:
向8.6mg(6.3×10-6mol)化合物24在630μL He吹洗的pH8.5 200mM硼酸鹽緩沖液中的溶液中加入40μL 40mg/mL化合物12在9/1MeOH/H2O中的溶液，攪拌混合物24小時(shí)，加入1mL 10％HOAc/H2O溶液，經(jīng)HPLC(C18，梯度25-55％CH3CN/H2O,0.1％TFA)純化混合物，產(chǎn)生8.3mg化合物26(LJP 685-MTU-AHAB-TEG)。實(shí)施例14展開(kāi)延伸的SH接頭從化合物27制備硫代苯甲酸酯，化合物28。將化合物28部分轉(zhuǎn)化成化合物29。經(jīng)乙醇解除去硫代苯甲酸酯，將形成的硫醇三苯甲基化。然后水解乙基醚，產(chǎn)生化合物29。從化合物29制備硝基苯基磷酸(PNP)酯，化合物30。通過(guò)用疊氮化鈉處理化合物27并還原成胺制備氨基十一烷酸乙基酯，化合物31，用化合物30使胺31?；a(chǎn)生化合物32。通過(guò)用氫氧化鈉處理進(jìn)行化合物32的水解，產(chǎn)生游離的羧酸。用對(duì)硝基苯酚縮合中間體羧酸，產(chǎn)生對(duì)硝基苯基(PNP)酯，化合物33。將接頭33連接到肽上，除去三苯甲基，產(chǎn)生化合物34，其用于產(chǎn)生MTU-ATU-AHAB-TEG綴合物。
實(shí)施例15合成(LJP685)4/MTU-ATU-AHAB-TEG綴合物，化合物35如下所示制備四價(jià)綴合物35。將具有連接的接頭的肽(化合物34)溶解在He吹洗的(pH8.5)200mM硼酸鹽緩沖液中，向混合物中加入0.3mol當(dāng)量的平臺(tái)化合物12。將混合物攪拌1小時(shí)，經(jīng)HPLC純化產(chǎn)物。
實(shí)施例16合成(LJP685)4/DABA-PEG綴合物，化合物36用在8.5硼酸鹽緩沖液中的化合物24處理IA-DABA-PEG產(chǎn)生綴合物36。
實(shí)施例17T細(xì)胞活化測(cè)定在96孔圓底平板中監(jiān)測(cè)肽-刺激T細(xì)胞對(duì)三苯甲基化胸腺嘧啶核苷的攝取。將消耗淋巴結(jié)細(xì)胞(小鼠)或分離的外圍血淋巴細(xì)胞(人)的單-細(xì)胞懸液5×105以每孔150μL終體積與1和30μg之間的肽混合，在5％二氧化碳中于37℃下培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)加入1微居里標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷，并培養(yǎng)另外的15-24小時(shí)。將收獲的細(xì)胞收集在濾器上，由液態(tài)閃爍光譜測(cè)定法計(jì)數(shù)。實(shí)施例18耐受性的體外誘導(dǎo)8組(每組包含5只C57B1/6只小鼠)用10μg/小鼠在明礬上的LJP685-KLH綴合物加作為佐劑的百日咳巴爾通氏體(B.pertussis)疫苗致敏。在3周之后，收獲脾并制備單細(xì)胞懸液，用平衡鹽溶液洗滌3次，以等同于1個(gè)脾/1.5mL培養(yǎng)基的濃度重懸于完全RPMI-1640培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液分成2.5mL/培養(yǎng)皿的等分試樣，在37℃以100μM、20μM和4μM濃度與(LJP685)4-DABA-PEG(化合物36)和(LJP685)4-TEG(化合物35)一起培養(yǎng)2小時(shí)。一組細(xì)胞在沒(méi)有耐受原存在下培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照。然后用大體積的平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，并重懸于2.5mL平衡鹽溶液中。接著將細(xì)胞注射進(jìn)650R放射同系(syngeneic)受體小鼠，使得所有來(lái)源于給定處理組的細(xì)胞平等地分成5組受體。用10μg鹽水中的LJP 685-KLH腹膜內(nèi)加強(qiáng)免疫包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi)的所有受體小鼠。在加強(qiáng)免疫后七天，對(duì)小鼠放血，其血清用于試驗(yàn)抗LJP 685抗體的存在。用兩種綴合物處理產(chǎn)生如圖16和圖17所示的抗LJP 685抗體的明顯劑量依賴(lài)性降低，其是通過(guò)如Iverson,G.M.，在試驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，第二卷，細(xì)胞免疫學(xué)中的＂體內(nèi)過(guò)繼免疫反應(yīng)測(cè)定＂(Weir,D.M.,ed.,Blackwell科學(xué)出版社，Pale Alto,CA,1986)中所描述的抗原結(jié)合能力(ABC)測(cè)定的。實(shí)施例19:5A12、CB2和3G3肽的NMR溶液結(jié)構(gòu)分析對(duì)利用以上實(shí)施例中所描述的方法從噬菌體文庫(kù)篩選分離的兩種肽進(jìn)行NMR分析。原來(lái)的肽在倒數(shù)第二位有脯氨酸，而這一氨基酸被除去，因?yàn)槎S(2D)雙量子濾過(guò)相關(guān)光譜學(xué)(DQF-COSY)NMR數(shù)據(jù)表明兩個(gè)在這一位置上的不同于順式和反式異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。除去脯氨酸給出具有結(jié)合ACA抗體的在50-100nM范圍內(nèi)的K’D和在DQF-COSY譜指紋區(qū)中預(yù)期數(shù)目的峰的肽。所形成的環(huán)狀肽是5A12(GPCLILAPDRCG)和CB2(GPCILLARDRCG)。所述肽之間的主要區(qū)別是8位上脯氨酸取代精氨酸，其導(dǎo)致CB2(與5A12是剛性更強(qiáng)的肽是一致的)的1D1H NMR譜中少得多的分散。精氨酸取代也產(chǎn)生pKa值所反映的離子化天冬氨?；然?.55kcal/mol穩(wěn)定化。在更加規(guī)則的5A12肽上進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。盡管重氫交換和溫度系數(shù)數(shù)據(jù)顯示沒(méi)有氫鍵合的證據(jù)，但核歐沃毫斯效應(yīng)(NOE)、旋轉(zhuǎn)歐沃毫斯效應(yīng)(ROE)和連接數(shù)據(jù)是與一個(gè)結(jié)構(gòu)一致的。距離幾何學(xué)計(jì)算給出50個(gè)結(jié)構(gòu)的家族。15個(gè)最好的具有2.1±0.2埃的所有原子的平均根平均平方偏差(RMSD)。我們確定,所說(shuō)的肽具有橢圓形，在分子相對(duì)的端、二硫化物和脯氨酸8(其是順式的)處有轉(zhuǎn)角。在骨架LIL區(qū)中也有結(jié)。最后，羧基末端甘氨酸是非常易變的，因?yàn)槠涫蔷哂嘘?yáng)性?xún)?nèi)殘基NOE的僅有的殘基。這代表有關(guān)肽(其模仿在β2-GPI上的ACA表位)的所確定的第一結(jié)構(gòu)信息。
與距離幾何學(xué)計(jì)算相聯(lián)系的NMR數(shù)據(jù)用來(lái)確定肽925(CLGVLAKLC)、具有在肽925的6位丙氨酸取代甘氨酸的截短的肽3G3(AGPCLGVLGKLCPG)的三維結(jié)構(gòu)。于25℃pH3.8下在水中測(cè)定肽925的結(jié)構(gòu)。計(jì)算了全部9個(gè)結(jié)構(gòu)，所有的均與NMR數(shù)據(jù)一致。當(dāng)每一結(jié)構(gòu)與質(zhì)心比較時(shí)，所有非氫原子的RMSD是2.45±0.36埃。圖18顯示最接近質(zhì)心的結(jié)構(gòu)，因此是肽925分子形狀的合理的代表。圖19將肽925的結(jié)構(gòu)(在圖的底部標(biāo)記為3G3)與肽5A12的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。在肽序列中兩種肽大約在相同的位置具有轉(zhuǎn)角。
肽的藥效基團(tuán)已被暫時(shí)鑒定為小的疏基團(tuán)和帶正電荷的基團(tuán)。肽925的偕二甲基和氨基已被暫時(shí)鑒定為這一肽的藥效基團(tuán)，如圖20所示。限制藥效基團(tuán)在某些支架上的碳?xì)浠衔锝宇^具有圖20限定的長(zhǎng)度，這些接頭連接到支架上的位點(diǎn)由限定的距離分開(kāi)。最后，限定兩種接頭相對(duì)取向的兩面角被確定為22°。
實(shí)施例20:TEG氨基甲酸酯接頭的合成
2-[2-(2-叔-丁基硫代乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物38:
在2-[2-(2-氯代乙氧基)乙氧基]乙醇(11.0g,65.24mmol)和叔丁基硫醇(7.35mL,65.23mmol)的混合物(在冰浴中冷卻)中緩慢加入1,8-二氮雜二環(huán)[5.40]十一-7-碳烯(DBU,9.75mL,65.23mmol)。將反應(yīng)混合物溫暖至室溫，并且攪拌一夜。然后用乙酸乙酯稀釋這一混合物，并過(guò)濾之。在用乙酸乙酯洗脫過(guò)的過(guò)濾柱上純化濾液中的粗產(chǎn)物以給出淡黃色油(14.4g,64.6mmol,99％):1H NMR(300Mhz,CDCl3):d 3.73(brs,2H),3.69-3.60(m,8H,2.75(t,J=7.4,2H),2.62(brs,1H),1.32(s,9H)；13C NMR(75 Mhz,CDCl3):d 72.47,71.08,70.33,70.27,61.71,42.09,30.95,27.87；MS(ESI):m/e(M+1)C10H23O3S的計(jì)算值223，觀測(cè)值223。2-[2-(2-叔-丁基硫代乙氧基)乙氧基]乙基對(duì)硝基苯基碳酸酯，化合物39:
在化合物38(2.0g,8.98mmol)和對(duì)硝基苯酚氯甲酸酯(1.81g,8.98mmol)的溶液(在5mL干THF中，在冰浴中冷卻)中緩慢加入在1mL干THF中的無(wú)水吡啶(0.73mL,8.98mmol)。立即形成白色沉淀。在室溫下攪拌15分鐘之后，用10mL乙醚稀釋反應(yīng)混合物，并過(guò)濾之。濃縮濾液并將其直接用于肽合成而無(wú)須進(jìn)一步純化。實(shí)施例21四價(jià)平臺(tái)IA/DABA/ATEG 46的合成雙-N-(叔-丁氧基碳酰)-二氨基苯甲酸，化合物40在3,5-二氨基苯甲酸(2.5g,16.4mmol)和NaHCO3(2.76g,32.9mmol)的溶液(在44.5mL水和22.5mL MeOH中)中緩慢加入在5.5mLMeOH中的二叔丁基重碳酸酯溶液(7.18g,32.9mmol)，并在室溫下攪拌該混合物24小時(shí)。將混合物冷卻至0℃，并加入6.53g檸檬酸，然后用EtOAc提取混合物。干燥(MgSO4)合并的EtOAc層，過(guò)濾之，并濃縮之。將殘余物溶解在40mL Et2O中，并通過(guò)Celite過(guò)濾溶液。用兩份各40mL的HCl提取該Et2O層。干燥(MgSO4)、過(guò)濾和濃縮該Et2O層從而給出3.81g(66％)的化合物40(為泡沫狀的粉紅色固體)?；衔?0的N-羥基琥珀酰亞胺基酯，化合物41在化合物40(3.8g,10.8mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(1.24g,10.8mmol)的溶液(在55mL EtOAc中，已冷卻至0℃)中，加入二環(huán)乙基碳化二亞胺(3.34g,16.2mmol)，并在使所產(chǎn)生的混合物升至室溫的過(guò)程中將其攪拌18小時(shí)。在混合物中加入0.55mL乙酸。攪拌混合物30分鐘，并將其放置在冷凍器中凍結(jié)2小時(shí)。過(guò)濾混合物以除去固體，并濃縮濾液以給出5.80g的粉紅色的泡沫狀固體。硅膠色譜(60/40/1己烷/EtOAc/HOAc)的純化給出4.30g(89％)的化合物41(為淡粉紅色固體)。單-N-(叔丁氧基碳酰)-乙二胺，化合物42將1.5g(25.0mmol)乙二胺溶液(在15mL CH2Cl2中)冷卻至0℃，并在該混合物中緩慢加入1.82g(8.33mmol)的二叔丁基重碳酸酯溶液。在室溫下攪拌該混合物18小時(shí)并過(guò)濾之，然后濃縮濾液。硅膠色譜(90/10/1CH2Cl2/MeOH/HOAc)的純化給出0.98g(67％)的化合物42(為油狀物)。雙-N-(叔丁氧基碳酰)-氨基-TEG，化合物43在750mg(4.25mmol)化合物42和345μL(337mg,4.25mmol)吡啶的溶液(在6mL CH2Cl2中)中，加入445μL(559mg,2.02mmol)三甘醇二氯甲酸酯。攪拌該化合物3.5小時(shí)，并在35mL CH2Cl2和35mL 1N HCl之間分配該混合物。用水洗滌CH2Cl2層，干燥(NaSO4)、過(guò)濾并濃縮之，從而給出1.14g的直接用于下一步的粗化合物43。二氨基-TEG雙三氟乙酸鹽，化合物44將300mg(0.57mmol)的化合物43溶解于3.5g CH2Cl2中，并加入3.5mL三氟乙酸。在室溫下攪拌混合物3小時(shí)，并濃縮溶液以給出398mg的直接用于下一步的粗化合物44。化合物45在398mg粗化合物44(估計(jì)為316mg,0.57mmol)和193mg(2.30mmol)NaHCO3的溶液中，加入在6mL二噁烷中的化合物41(567mg)的溶液。攪拌混合物3小時(shí)，并用1N HCl酸化之，并且在20mL 1N HCL和30mL EtOAc之間分配之。用飽和NaHCO3溶液洗滌合并的EtOAc層，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮之以給出490mg(86％)的粗化合物45(為白色的泡沫狀固體)。硅膠色譜(EtOAc)的純化給出276mg(48％)的化合物45(為白色的泡沫狀固體)。IA/DABA/ATEG，化合物46制備100 mg(0.1mmol)的化合物45溶液，并加入1mL三氯乙酸，同時(shí)在室溫下攪拌混合物1小時(shí)。在真空下濃縮混合物。用Et2O研制殘余物，并在真空下干燥之以給出一種白色的晶狀固體。用1mL DMF溶解該固體，加入104μL(77mg,0.6 mmol)二異丙基乙胺，將混合物冷卻至0℃，并加入212mg(0.6mmol)的碘乙酸酐。移去冰浴，并在室溫下攪拌該混合物2小時(shí)。將混合物冷卻至0℃，用1N H2SO4酸化之，并在10ml 1N H2SO4和6×20mL部分的8/2 CH2Cl2/MeOH之間分配之。干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮合并的有機(jī)層以給出330 mg的橙色油狀物。制備HPLC(25cm×22.4mM C18，梯度30％B至40％B 0-40分鐘。A=H2O/0.1％TFA。B=CH3CN/0.1％TFA,12 mL/分鐘)的純化給出19mg的化合物46(為白色固體)。
實(shí)施例22四價(jià)平臺(tái)BA/PABA/DT/TEG,51的合成N-(叔丁氧基碳酰)PABA，化合物47制備3.0g(21.9mmol)的在60mL水中的對(duì)氨基苯甲酸溶液。緩慢加入Na2CO3(2.16g,25.7mmol)，隨后加入30mL MeOH。當(dāng)所有固體都溶解時(shí)，加入4.77g(21.9mmol)二叔丁基重碳酸酯(在10mL MeOH中)，并在室溫下攪拌18小時(shí)。在上述混合物中加入4.92g(25.6mmol)檸檬酸，并將所產(chǎn)生的混濁的混合物分配在200mL水和200mL EtOAc之間。用200mL 0.1N HCl和200mL水連續(xù)洗滌EtOAc層，干燥(Na2SO4)、過(guò)濾并濃縮之從而產(chǎn)生3.0g(58％)的化合物47(為白色固體)。N-(叔丁氧基碳酰)PABA N-羥基琥珀酰亞胺基酯，化合物48在2.0g(8.43mmol)化合物47和0.97g(8.43mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的0℃溶液(在50mL EtOAc中)中，加入DCC(2.61g,12.6mmol)。移去冰浴，在室溫下攪拌混合物16小時(shí)，并加入0.5mL乙酸。攪拌混合物附加的30分鐘，在冷凍器中放置1.5小時(shí)，過(guò)濾并濃縮之從而給出3.75g粗化合物48。硅膠層析(50/50己烷/EtOAc)的純化給出2.53g(90％)的化合物48(為白色固體)?；衔?9在485μL的二亞乙基三胺溶液(在30μL CH2Cl2中，已在冰浴中冷卻)中，滴加入3.00g(8.97mmol)的化合物48(在50mL CH2Cl2中)，歷時(shí)30分鐘。在5-7℃下攪拌混合物30分鐘，然后在室溫下攪拌16小時(shí)。用200mL水將牛奶狀混合物放置在分液漏斗中，用3M NaOH溶液將水層的pH值調(diào)整至10，并用200mL 4/1 CH3Cl/MeOH提取該混合物。干燥(Na2SO4)有機(jī)層，并濃縮之從而給出0.971g(40％)的化合物49，該化合物純得足以用于以下步驟。用六份各100mL的4/1 CH3Cl/MeOH提取含水層。合并有機(jī)層，干燥(Na2SO4)并濃縮之從而給出另一個(gè)1.08g(44％)的化合物49，該化合物需要進(jìn)一步純化。由硅膠色譜(梯度，80/20-70/30CH3Cl/MeOH)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步純化?；衔?0在855mg(1.58mmol)化合物49和275μL(1.mmol)二異丙基乙胺的0℃溶液(在13mL THF中)中，加入135μL(0.66mmol)三甘醇雙氯甲酸酯溶液(在0.3mL THF中)。當(dāng)移去冰浴時(shí)，混濁的混合物變清。再加入70μL二異丙基乙胺以便保持堿性pH。在室溫下攪拌混合物共3小時(shí)，并將其分配在25mL水和25mL EtOAc之間.用第二份25mL的EtOAc提取含水層，并干燥(Na2CO3)、過(guò)濾和濃縮合并的EtOAc層，從而給出0.986 g的粗化合物50。硅膠色譜(80/4/16 CH3Cl/二噁烷/異丙醇)的純化給出516 mg(61％)的化合物50(為一種白色固體)。制備BA/PABA/DT/TEG，化合物51將化合物50(487mg,8.79mmol)溶解在9mL CH2Cl2和5mL三氟乙酸中。攪拌混合物1.5小時(shí)并濃縮之。用7ml Et2O研制殘余物，并將其溶解在5mL MeOH和1mL 48％HBr溶液中。濃縮混合物并將其放置在真空下直到干燥。將所產(chǎn)生的HBr鹽溶解在10mL水中，并加入191mg(2.27mmol)NaHCO3。將591mg(2.27mmol)的溴乙酸酐溶液(在10mL二噁烷中)加入至混合物中。再用2mL二噁烷來(lái)沖洗。需要時(shí)加入更多的NaHCO3以保持堿性pH。在室溫?cái)嚢杌旌衔?小時(shí)，并用1N H2SO4酸化之。用3×25mL EtOAc提取混合物。干燥(Na2SO4)合并的EtOAc層，過(guò)濾并濃縮之，從而給出773mg的油狀物。由硅膠色譜(梯度，90/10-85/15CH3Cl/MeOH)實(shí)現(xiàn)純化，從而給出401mg(77％)的化合物51(為一種白色固體)。
實(shí)施例23四價(jià)平臺(tái)BMP/TEG,55的合成二甲基-5-羥基異鄰苯二甲酸酯，化合物52將2.00g(11mmol)5-羥基異鄰苯二甲酸和0.5mL濃鹽酸的溶液(在30mL MeOH中)回流5小時(shí)。濃縮混合物，并將所產(chǎn)生的殘余物溶解在100mL EtOAC中。用兩份各50mL的5％NaHCO3溶液和兩份各50mL的NaCl溶液連續(xù)洗滌上述EtOAc溶液，干燥(Na2CO3)、過(guò)濾并濃縮之，從而給出2.09g(90％)的化合物52(為一種白色結(jié)晶固體)。化合物53在500mg(2.38mmol)化合物52和395mg(2.86mmol)K2CO3的懸浮液(在11mL CH3CN中)中，加入546mg(1.19mmol)三甘醇二甲苯磺酸酯并在N2下回流該混合物16小時(shí)。濃縮混合物，并將殘余物溶解在25mLCHCl3中，然后用25mL水和25mL飽和NaCl溶液洗滌之。干燥(Na2SO4)、過(guò)濾并濃縮CHCl3層。硅膠色譜(梯度，50/50己烷/EtOAc-100％EtoAc)的純化給出93 mg(41％)的化合物53?；衔?41.82mL(1.82mmol)1M LiBHEt3溶液滴加入混合物時(shí)，在N2氣氛下攪拌在4mL THF中的93mg(0.18mmol)化合物53的懸浮液。獲得一種清亮的溶液，該溶液攪拌了18小時(shí)，攪拌的同時(shí)加入10％HOAc水溶液直到pH呈酸性。在真空下濃縮混合物，并將殘余物溶解在10mL水中。用3×10mL部分的EtOAc提取混合物，并干燥(Na2SO4)、過(guò)濾和濃縮合并的EtOAc層。由硅膠色譜(梯度，90/10-85/15 CH3Cl/MeOH)實(shí)現(xiàn)純化，從而給出20mg(27％)的化合物54(為一種白色固體)?；衔?5在20mg(0.048mmol)化合物54的懸浮液(在5mL Et2O和1mL THF中)中，加入9.6μL(0.1mmol)PBr3。攪拌混合物3小時(shí)，并將其分配在水和EtOAc之間。干燥(Na2SO4)EtOAc層，過(guò)濾和濃縮之，并由硅膠色譜(CH3Cl/MeOH)純化殘余物，從而提供了化合物55。
實(shí)施例24四價(jià)平臺(tái)BA/PIZ/IDA/TEG,60的合成化合物56在1.02g(4.37mmol)N-(叔-丁氧基碳酰)-亞氨基二乙酸(該化合物5在美國(guó)專(zhuān)利5,552,391，“化學(xué)限定的非聚合價(jià)平臺(tái)分子及其綴合物”中)和1.01g(8.75mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的溶液(在50mL的干THF中，冷卻至0℃)中，加入2.26g(10.94mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺。在緩慢溫暖至室溫的過(guò)程中，攪拌混合物16小時(shí)。并在混合物中加入2.22g(10.1mmol)單-CBZ-哌嗪(在25mL THF中)，隨后加入1.22mL(887mg,8.75mmol)Et3N。在室溫下攪拌混合物7小時(shí)，并過(guò)濾之。濃縮濾液，并將殘余物溶解在125mL EtOAc中，同時(shí)與2×125mL部分的1N HCl和125mL的飽和NaHCO3溶液一起振蕩，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮所得產(chǎn)物，從而給出2.39 g的粘性固體。硅膠層析(95/5；CH2Cl2/MeOH)的純化給出1.85g(66％)的化合物56?；衔?7在1.74g(2.74mmol)化合物56的溶液(在10mL CH2Cl2中)中，加入10mL三氟乙酸，并在室溫下攪拌混合物3小時(shí)。濃縮混合物，并將殘余物溶解在5mL CH2Cl2中。將混合物冷卻至0℃并加入100mL飽和NaHCO3。然后用四份各100mL的CH2Cl2提取混合物。合并CH2Cl2層，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮之，從而給出1.46g(99％)的化合物57(為一種粘性吸濕固體)，其直接用于下一步?；衔?8在0.7g(1.3mmol)化合物57和226μL(168mg,1.30mmol)二異丙基乙胺的0℃溶液中，加入127μL三甘醇雙氯甲酸酯溶液(在4 mL CH2Cl2中)，并在室溫下攪拌混合物3小時(shí)。將混合物分配在80mL CH2Cl2和80mL 1N HCl之間。用兩份各80mL的水洗滌CH2Cl2層，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮之，從而給出736 mg(93％)的化合物58(為結(jié)晶固體)?；衔?0將化合物58(61mg,0.48mmol)溶解在3mL 30％HBr/HOAc中，并在室溫下攪拌所產(chǎn)生的混合物1小時(shí)，其時(shí)加入5mL Et2O。在冰箱中放置混合物1小時(shí)并離心之。用Et2O洗滌所產(chǎn)生的沉淀并干燥之，從而給出四氫溴化物鹽59，該化合物被溶解在1mL水中。在混合物中加入49mg(0.58mmol)NaHCO3和3mL二噁烷。如果需要的話，加入更多的NaHCO3以產(chǎn)生堿性混合物。將混合物冷卻至0℃，并加入748mg(2.89mmol)溴乙酸酐。攪拌混合物2小時(shí)，并將其分配在20mL 1N H2SO4和20mL 80/20CH2Cl2/MeOH之間。干燥(Na2SO4)有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮之，從而給出粗化合物60，該化合物由硅膠色譜(CH2Cl2/MeOH)純化以給出化合物60。
實(shí)施例25四價(jià)平臺(tái)四-BAIPIZ/PMA,63的合成化合物61在640mg(2.52mmol)1,2,4,5-苯四酸和1.16g(10.1mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的0℃溶液(在50mL THF中)中，加入2.6g(12.6mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺，并將混合物升至室溫，其時(shí)攪拌16小時(shí)。在混合物中加入2.5g(11.3mmol)單-CBZ-哌嗪的溶液(在25mL THF中)，其后加入1.4mL(1.02g,10.1mmol)Et3N。過(guò)濾混合物，并濃縮濾液。將殘余物分配在100mL EtOAc和2×100mL 1N HCL之間，并用100mL飽和NaHCO3、100mL水、100mL飽和NaHCO3洗滌EtOAc層，干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮之。由硅膠色譜(97.5/2.5 CH2Cl2/MeOH)實(shí)現(xiàn)純化以給出1.78g(66％)的化合物61(為白色結(jié)晶固體)?；衔?3以本質(zhì)上與上述把58轉(zhuǎn)化成60相似的方法(在實(shí)施例23中)將化合物61轉(zhuǎn)變成化合物63，利用硅膠色譜實(shí)現(xiàn)純化。
實(shí)施例26四價(jià)平臺(tái)BA/PIZ/IDA/HB/TEG,68的合成化合物64在725mg(4.36mmol)4-羥基苯甲酸乙酯和723mg(5.23mmol)K2CO3的溶液中，加入三甘醇二甲苯磺酸酯(1.0g,2.18mmol)，并回流該混合物16小時(shí)。濃縮該混合物，并將殘余物分配在20mL水和3×20mLEt2O之間，用2×40mL飽和NaHCO3溶液、40mL飽和NaCl溶液洗滌合并的有機(jī)層。用Et2O洗滌含水層，干燥(MgSO4)合并的Et2O層，過(guò)濾并濃縮之。硅膠色譜(70/30己烷/EtOAc)的純化給出902 mg(93％)的化合物64(為結(jié)晶固體)?；衔?5將化合物64溶解在包含2.2當(dāng)量LiOH的丙酮中，并攪拌混合物3小時(shí)(直到為T(mén)LC所證明的完全溶解)。以乙酸酸化混合物并濃縮之，并且由硅膠色譜純化殘余物以給出化合物65?；衔?6以與實(shí)施例23中的制備化合物56的同樣的方法制備化合物66。用化合物65代替N-BOC-亞氨基二乙酸，并用化合物57代替單-CBZ-哌嗪。利用硅膠層析實(shí)現(xiàn)純化?；衔?8以本質(zhì)上與實(shí)施例23所描述的把化合物58轉(zhuǎn)化成化合物60相同的方法，將化合物66轉(zhuǎn)化成化合物68。利用硅膠層析實(shí)現(xiàn)純化。
實(shí)施例27四價(jià)平臺(tái)BA/PIZ/HIP/TEG,72的合成化合物69以本質(zhì)上與實(shí)施例25所描述的水解化合物64相同的方法(例外情況是利用4.4當(dāng)量的LiOH)，用LiOH水解化合物53。化合物70以本質(zhì)上與實(shí)施例24所描述的把1,2,4,5-苯四酸轉(zhuǎn)化成化合物61相同的方法(例外情況是利用化合物69代替1,2,4,5-苯四酸)，將四酸(化合物69)轉(zhuǎn)化成化合物70?；衔?2以本質(zhì)上與實(shí)施例23所描述的把化合物58轉(zhuǎn)化成化合物60相同的方法，將化合物70轉(zhuǎn)化成化合物72。利用硅膠色譜實(shí)現(xiàn)純化。
實(shí)施例28因乙?；乃膬r(jià)化合物的綴合物的合成(LJP685)4/MTU/A/DABA/ATEG綴合物，化合物73的合成在He吹洗的pH 8.5 200mM硼酸鹽緩沖液中，制備21mg(15.5μmol)化合物24的溶液。在該溶液中加入包含3.25mg(2.6μmol)IA/DABA/ATEG(化合物46，溶解在396μL MeOH中)的第二種溶液。形成沉淀，并加入1mL MeOH以溶解所有固體。在室溫下攪拌混合物18小時(shí)，并加入6mL 9/1水/HOAc。以50mL水/CH3CN稀釋混合物，并將其裝載在HPLC制備柱上。由制備HPLC(25cm×22.4mm C18。梯度35％B-40％B 0-40分鐘。A=水/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1％TFA,12mL/分鐘)實(shí)現(xiàn)純化以提供10.8mg(67％)的化合物73(在冷凍干燥之后為固體)。
合成(LJP685)4/MTU綴合物，化合物74、75、76、77和78利用與上述用于合成(通過(guò)用適當(dāng)平臺(tái)化合物替代平臺(tái)化合物46)化合物73相同的反應(yīng)條件，分別由化合物51、60、63、68和72制備這些綴合物。制備物可以是LJP685或者其它有關(guān)肽。
實(shí)施例29合成四價(jià)平臺(tái)55綴合物，綴合物79,(LJP685)4/MP/TEG在DMF中制備四當(dāng)量化合物24和五當(dāng)量Cs2C3的溶液。在混合物中加入一當(dāng)量BMP/TEG，平臺(tái)化合物55，并攪拌1小時(shí)。以80/20/10水/CH3CN/HOAc稀釋混合物，并將其裝載在制備HPLC柱上。由制備HPLC(C18,A=H2O/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1％TFA)實(shí)現(xiàn)純化以在冷凍干燥之后給出化合物79。制備物可以是LJP685或者其它有關(guān)肽。
實(shí)施例30合成綴合物四價(jià)平臺(tái)四-BMB，綴合物80,(LJP685)4/MTU/四-MB在DMF中制備四當(dāng)量化合物24和五當(dāng)量Cs2C3的溶液。在混合物中加入一當(dāng)量四-溴甲基苯，然后將其攪拌1小時(shí)。以80/20/10水/CH3CN/HOAc稀釋混合物，并將其裝載在制備HPLC柱上。由制備HPLC(C18,A=H2O/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1％TFA)實(shí)現(xiàn)純化以在冷凍干燥之后給出化合物80。制備物可以是LJP685或者其它有關(guān)肽。
實(shí)施例30:FITC-GPCILLARDRCG(CB2*)的熒光極化肽結(jié)合測(cè)定合成在室溫下攪拌環(huán)狀二硫化物肽GPCILLARDRCG(20.0mg,14.4μmol)和熒光素異硫氰酸酯(FITC)(5.6mg,14.4μmol)的溶液(在20mLACN/水中，包含20 mg碳酸鈉(Na2CO3,pH約為10.5)。由分析HPLC監(jiān)控反應(yīng)。在消耗熒光標(biāo)記試劑之后，在以10mL/分鐘洗脫的制備HPLC(具有30至50％B的線性梯度，歷時(shí)40分鐘，其中A是在水中的0.1％(v/v)TFA,B是在CAN中的0.085％(v/v)TFA)上純化粗產(chǎn)物。在凍干之后獲得一種亮黃色的FITC肽粉末(3.7mg,15％產(chǎn)率)MS(ESI):m/e(M+1)對(duì)于C73H102N19O20S3的計(jì)算值為1661，觀測(cè)值為1661。直接結(jié)合熒光極化結(jié)合測(cè)定(dbFP)該方法描述在PanVera應(yīng)用指南(1994,PanVera公司)中。簡(jiǎn)言之，以抗體(ACA 6501或者6701)滴定痕量熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記的肽(CB2*-F)，并將樣品的極化與抗體濃度繪制成圖。用Pan Vera Beacon儀器測(cè)量極化。該數(shù)據(jù)適應(yīng)于公式1。公式1Y=[PL*(KD/R)+PH]KD/R+1.0]]>其中Y是Y軸值(毫極化單位，mP),R是抗體受體的總濃度，PL是游離FITC標(biāo)記的肽(F)的極化，PH是與R復(fù)合的F(FR)的極化，KD是F(來(lái)源與FR復(fù)合體)的離解常數(shù)(對(duì)偶結(jié)合常數(shù))。為使這些公式有效，F(xiàn)＜＜R必須是真的。對(duì)于分別與ACA-6701和ACA-6501抗體結(jié)合的CB2*-F，這一滴定分別顯示在圖22和23中。如圖23所示，用ACA-6501沒(méi)有獲得完全的滴定，但是顯示在圖24中的以前的滴定給出241nM的KD。通過(guò)加入稍比抗體6701多的CB2*(GPCILLARDRCG)以從6701中置換出CB2*-F，測(cè)得CB2*-F的離解速度常數(shù)為Koff=0.0184秒-1(其對(duì)應(yīng)于t1/2=38秒)。假如KD為256nM，那么這對(duì)應(yīng)于離解速度常數(shù)為Kon=3.6×104M-1秒-1(在校正為抗體雙價(jià)之后)。因此，結(jié)合到ACA-6701上的CB2*-F只受這兩個(gè)分子的共同擴(kuò)散作用限制。競(jìng)爭(zhēng)熒光極化測(cè)定(cFP)上述的dbFP測(cè)定提供了FITC標(biāo)記的肽的結(jié)合常數(shù)，并需要約為0.5mg的純化的抗體。cFP測(cè)定提供了缺乏FITC基團(tuán)的肽的結(jié)合常數(shù)，并且它只消耗很少的抗體(大約10μg)。cFP測(cè)定由在Pan Vera應(yīng)用指南(1994,PanVera公司)中報(bào)道的測(cè)定方法修改得到，因此它消耗少50倍的抗體。簡(jiǎn)言之，將抗體(ACA-6701)與痕量FITC標(biāo)記的肽(CB2*-F)混合，用足夠時(shí)間使之達(dá)到平衡。對(duì)于ACA6701和CB2*-F，這需要1小時(shí)。然后在管中加入逐漸增加濃度的所檢驗(yàn)的未標(biāo)記的肽(CB2*或者3B10)。在每一次加入之后，用足夠時(shí)間(大約15分鐘)使之達(dá)到平衡，并讀取mP值。雖然需要選擇6701和CB2*-F(F)的濃度以便達(dá)到F＜＜R，但是R的濃度只需要高到足以使所測(cè)量的極化(PH)明顯比PL高(參見(jiàn)圖22)。這一△(mP)值應(yīng)該是20或者更多個(gè)mP單位以確保獲得可靠的結(jié)果。公式2△(mP)=PH-P1當(dāng)加入未標(biāo)記的(無(wú)FITC的)肽(I)以抑制F與R的結(jié)合時(shí)，Y從它的最大值PH降至平頂值PL，這與公式1一致。對(duì)于分別為CB2*和3B10所置換的來(lái)源于ACA-6701的CB2*-F，這些滴定分別顯示在圖26和27中。得到描述這一滴定的公式，其如下所示公式3Y=PH′+PL*(I/K1′)I/KL′+1.0]]>其中，PL如同公式中的PL一樣，I是未標(biāo)記的肽競(jìng)爭(zhēng)劑的濃度，K1’是該肽的表觀離解常數(shù)。通過(guò)將cFP滴定數(shù)據(jù)代入上述公式得到這些參數(shù)的值。
I的真實(shí)離解常數(shù)得自公式4。公式4K1=K1’/(1.0+R/KD)其中，R和KD如公式1所定義。R/KD利用公式5得自PH’(來(lái)源于公式3)以及PH和PL(來(lái)源于公式1)的值。公式5 R/KD=(PH’-PL)/(PH-pH’)一般來(lái)說(shuō)，一旦由公式1所定義的滴定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，那么公式5就可用來(lái)確定aPL抗體濃度。因此。除為確定K1提供一種手段外，這一方法還提供了使所有aPL抗體儲(chǔ)備液濃度標(biāo)準(zhǔn)化的一種手段以及分析(每個(gè)cFP測(cè)定在整個(gè)時(shí)間只利用5-10μg抗體)它們的結(jié)合活性/穩(wěn)定性的一種手段。
由dbFP和cEP確定的離解常數(shù)肽 抗體序列 KDa或KICB2*-F 6501FITC-482nMaGPCILLARDRCGCB2*-F 6701FITC-512nMaGPCILLARDRCGCB2*6701GPCILLARDRCG 35nM3B106701AGPCLLLAPDRCPG313nMaKD值已乘以2以校正由公式1確定的在二價(jià)抗體中沒(méi)有乘以因子的KD值。
結(jié)果表明CB2*-F與兩種極為不同的aPL抗體ACA-6501和ACA-6701進(jìn)行交叉反應(yīng)，并以相等的高親和性與兩種抗體結(jié)合。FITC基團(tuán)的除去使CB2*與ACA-6701的結(jié)合能力提高14倍。有關(guān)肽3B10與ACA-6701的結(jié)合能力比CR2*與ACA-6701的結(jié)合能力少9倍。而這一結(jié)果可能是因?yàn)樵?B10上的附加的構(gòu)架殘余物所致，也可能是由于在CB2*中的位置8的由脯氨酸對(duì)精氨酸的取代所致。5A12(一種類(lèi)似于3B10的肽)的NMR結(jié)構(gòu)的以前研究表明位于轉(zhuǎn)角位置的這一脯氨酸給出結(jié)構(gòu)剛性。CB2是更具柔性的肽，它在此位置上有精氨酸。如同CB2一樣的更具柔性的肽能夠具有更強(qiáng)的交叉反應(yīng)，因?yàn)樗菀渍{(diào)整它的形狀以適合一個(gè)給定的抗體結(jié)合位點(diǎn)。在結(jié)合親和性方面的藥物剛性的含義已在Koehler等(251頁(yè)，在藥物設(shè)計(jì)中的分子模擬指導(dǎo)手冊(cè)，學(xué)院出版社，N.Cohen編輯，1996)中討論。實(shí)施例31肽綴合物的耐受活性?xún)煞N含相同肽的不同綴合物，檢驗(yàn)其體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性耐受性的能力。簡(jiǎn)言之，用連結(jié)于免疫原性載體匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)的肽免疫接種小鼠，以便產(chǎn)生肽特異性記憶B細(xì)胞。三周后，利用不同劑量的檢驗(yàn)綴合物處理每組小鼠(每組5只)，其中一組小鼠不進(jìn)行綴合物處理作為對(duì)照。五天后，以連結(jié)于KLH的肽加強(qiáng)免疫所有小鼠(包括對(duì)照組在內(nèi))，七天后，對(duì)所有小鼠取血樣并利用一種改進(jìn)的Farr測(cè)定來(lái)檢測(cè)它們的血清的抗肽抗體。根據(jù)由G.M Iverson(“體內(nèi)過(guò)繼免疫反應(yīng)的測(cè)定”，第Ⅱ卷，第67章，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，Blackwell科學(xué)出版社，Weir等編輯，第4版，牛津大學(xué)，1986)所描述的方法計(jì)算每一個(gè)體血清樣品的抗原結(jié)合量(ABC)。這些值隨后用于確定一組中所有個(gè)體的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
當(dāng)綴合物之一引起耐受性時(shí)，另一種綴合物在檢驗(yàn)的劑量范圍之內(nèi)并不抑制抗肽抗體。這一差別的最可能解釋是后一種綴合物具有短的體內(nèi)半壽期。為解決這一問(wèn)題，使用在體內(nèi)誘導(dǎo)耐受性并由此取消對(duì)半壽期的考慮的一種系統(tǒng)，并把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至擴(kuò)散受體上。簡(jiǎn)言之，收獲用連結(jié)于KLH的肽致敏的小鼠的脾細(xì)胞，并在37℃下在完全RPMI-1640培養(yǎng)基中用不同劑量的檢驗(yàn)綴合物溫育該脾細(xì)胞2小時(shí)。一組細(xì)胞不用耐受原培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照。洗滌細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到擴(kuò)散的同系受體上，并用連結(jié)于KLH的肽加強(qiáng)免疫。七天后，對(duì)所有小鼠取血樣并化驗(yàn)其血清的抗肽抗體。當(dāng)在體外模型中檢驗(yàn)時(shí)，在體內(nèi)模型中檢驗(yàn)時(shí)不引起任何可檢測(cè)耐受性的綴合物的確引起耐受性。這一結(jié)果支持了綴合物之間的差別是由于綴合物具有短的半壽期的假定。為了直接驗(yàn)證這一假說(shuō)，在一延長(zhǎng)的時(shí)段內(nèi)通過(guò)植入滲透泵連續(xù)地施用綴合物。結(jié)果清楚地表明這一綴合物引起耐受性，這發(fā)生在通過(guò)持續(xù)釋放來(lái)施用的情況下而不是在以大丸劑施用的情況下，如圖32所示。用體內(nèi)模型檢驗(yàn)(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG的耐受活性在明礬加作為佐劑的百日咳上用LJP-685-KLH致敏小鼠。三周后，用-定范圍劑量的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物處理小鼠。不用綴合物處理的一組小鼠作為對(duì)照組。五天后，以10μg的LJP685-KLH加強(qiáng)免疫所有小鼠(包括對(duì)照組在內(nèi))，七天后，取小鼠血樣。利用改進(jìn)的上述Farr測(cè)定法來(lái)分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖28中的結(jié)果表明利用(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的處理(在1至50 nmoles的劑量范圍內(nèi))對(duì)抗LJP685反應(yīng)沒(méi)有任何可檢測(cè)的效應(yīng)。用體內(nèi)模型檢驗(yàn)(LJP685)4/MTU-DABA-TEG的耐受性誘導(dǎo)在明礬加百日咳上用LJP 685-KLH致敏小鼠。三周后，用5、10或者50 nmoles的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物處理小鼠。其中一組不用綴合物處理，作為對(duì)照組。五天后，以10μg的LJP685-KLH加強(qiáng)免疫所有小鼠(包括對(duì)照組在內(nèi))，七天后，取小鼠血樣。利用改進(jìn)的Farr測(cè)定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖29中的結(jié)果表明(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物在體內(nèi)模型中以5 nmoles的ED50誘導(dǎo)耐受性。用體外模型檢驗(yàn)(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG的耐受性誘導(dǎo)收獲用LJP685-KLH致敏3周的小鼠的脾細(xì)胞，在37℃下在完全RPMI-1640培養(yǎng)基中用4、20或者100μM的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物培養(yǎng)該脾細(xì)胞2小時(shí)。其中一組不用耐受原培養(yǎng)，作為對(duì)照組。洗滌細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到擴(kuò)散受體上，并以10μg的LJP685-KLH加強(qiáng)免疫。七天后，取小鼠血樣，并利用改進(jìn)的Farr測(cè)定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖30中的結(jié)果清楚地表明(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物可以引起耐受性，當(dāng)其在體內(nèi)模型中檢驗(yàn)時(shí)達(dá)到IC50＜4μM。用體外模型檢驗(yàn)(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG的耐受性誘導(dǎo)收獲用LJP685-KLH致敏3周的小鼠的脾細(xì)胞，在37℃下在完全RPMI-1640培養(yǎng)基中用0.4、1.3或者4μM的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物培養(yǎng)該脾細(xì)胞2小時(shí)。其中一組不用耐受原培養(yǎng)，作為對(duì)照組。洗滌細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到擴(kuò)散受體上，并以10μg的LJP685-KLH加強(qiáng)免疫。七天后，取小鼠血樣，并利用改進(jìn)的Farr測(cè)定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖31中的結(jié)果清楚地表明(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物可以引起耐受性，當(dāng)其在體內(nèi)模型中檢驗(yàn)時(shí)達(dá)到IC50＜4μM。利用連續(xù)輸送泵體內(nèi)檢驗(yàn)(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的耐受性誘導(dǎo)小鼠在明礬加百日咳上用LJP685-KLH致敏。三周后，將小鼠分成5組，每組五只小鼠。在第一天，一組用鹽水丸劑處理，另一組用包含50 nmole(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的丸劑處理。余下的三組用滲透泵植入。在一組中，泵用鹽水充滿(mǎn)，并以1μL/小時(shí)的速度釋放3天。余下的兩組接收裝滿(mǎn)(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物(50nmole)的泵。一組接收以1μL/小時(shí)的速度釋放三天的泵，其它組接收以0.5μL/小時(shí)的速度釋放七天的泵。在第5天，以外科手術(shù)移去釋放三天的泵。在第七天，以10μg的LJP685-KLH加強(qiáng)免疫所有小鼠(包括對(duì)照組)。在第10天，以外科手術(shù)移去釋放七天的泵。在第14天，取所有小鼠血樣。利用改進(jìn)的Farr測(cè)定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。結(jié)果顯示在圖32中。用體內(nèi)模型檢驗(yàn)(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG綴合物的耐受性誘導(dǎo)在明礬加百日咳上用LJP685-KLH致敏小鼠。三周后，用(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG綴合物處理小鼠，其中一組不用綴合物處理作為對(duì)照組。五天后，以10μg的肽-KLH加強(qiáng)免疫所有小鼠(包括對(duì)照組)，七天后，取小鼠血樣。利用改進(jìn)的Farr測(cè)定法加強(qiáng)免疫它們的血清的抗肽抗體。結(jié)果表明在體內(nèi)模型中，(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG綴合物以等于或大于(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的效力誘導(dǎo)耐受性。
權(quán)利要求
1．一種aPL類(lèi)似物，其特異性結(jié)合到B細(xì)胞上，aPL表位結(jié)合到所說(shuō)的B細(xì)胞上。
2．權(quán)利要求1的類(lèi)似物，其中所說(shuō)的類(lèi)似物缺少T細(xì)胞表位。
3．權(quán)利要求1的類(lèi)似物，其中所說(shuō)的類(lèi)似物是肽。
4．權(quán)利要求3的類(lèi)似物，其中所說(shuō)的肽包括序列CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH或LTDPRYTRDISNFTD。
5．權(quán)利要求3的肽類(lèi)似物，其中所說(shuō)的肽包括序列AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG或AGPILLATDTCPG。
6．權(quán)利要求3的類(lèi)似物，其中所說(shuō)的肽含有至少一個(gè)脯氨酸，并且其中α-甲基脯氨酸取代了至少一個(gè)所說(shuō)的脯氨酸。
7．權(quán)利要求3的類(lèi)似物，其中D-氨基酸取代了至少一個(gè)L-氨基酸。
8．權(quán)利要求3的類(lèi)似物，其中所說(shuō)的肽是被二硫鍵環(huán)化的。
9．權(quán)利要求8的類(lèi)似物，其中硫醚鍵取代了二硫鍵。
10．權(quán)利要求3的類(lèi)似物，其中所說(shuō)的肽包含至少一個(gè)亮氨酸，并且其中異亮氨酸取代了至少一個(gè)所說(shuō)的亮氨酸。
11．一種誘導(dǎo)特異性B細(xì)胞耐受aPL免疫原的組合物，該組合物包含非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子和aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物，所說(shuō)的抗體結(jié)合類(lèi)似物(a)特異性結(jié)合aPL免疫原結(jié)合于其上的B細(xì)胞和(b)缺少免疫原的T細(xì)胞表位。
12．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物是包含以下序列的肽CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH或LTDPRYTRDISNFTD。
13．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物是包含以下序列的肽AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG或5AGPILLARDRCPG。
14．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物是按照權(quán)利要求6的類(lèi)似物。
15．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物是按照權(quán)利要求7的類(lèi)似物。
16．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物是按照權(quán)利要求8的類(lèi)似物。
17．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物是按照權(quán)利要求9的類(lèi)似物。
18．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的aPL抗體結(jié)合類(lèi)似物是按照權(quán)利要求10的類(lèi)似物。
19．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括三甘醇。
20．權(quán)利要求19的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子包括AHAB-TEG。
21．權(quán)利要求19的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子包括化合物46,A-DABA-ATEG。
22．權(quán)利要求19的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子包括化合物51,A-PABA-DT-TEG。
23．權(quán)利要求19的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子化合物55,MP-TEG。
24．權(quán)利要求19的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子包括化合物60,A-PIZ-IDA-TEG。
25．權(quán)利要求19的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子包括化合物68,A-PIZ-IDA-HB-TEG。
26．權(quán)利要求19的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子包括化合物72,A-PIZ-MP-TEG。
27．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括聚乙二醇。
28．權(quán)利要求28的組合物，其中所說(shuō)的效價(jià)平臺(tái)分子包括DABA-PEG。
29．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括四氨基苯。
30．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括七氨基β-環(huán)糊精。
31．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括四氨基季戊四醇。
32．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷(Cyclam)。
33．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷(Cyclen)。
34．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括化合物63，四-A-PIZ-PMA。
35．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子包括化合物55,MP-TEG。
36．權(quán)利要求11的組合物，其中所說(shuō)的綴合物得自四-BMB。
37．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括AHAB-TEG。
38．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括化合物46,IA-DABA-ATEG。
39．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括化合物51,BA-PABA-DT-TEG。
40．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括化合物55,BMP-TEG。
41．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括化合物60,BA-PIZ-IDA-TEG。
42．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括化合物68,BA-PIZ-IDA-HB-TEG。
43．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括化合物72,BA-PIZ-HIP-TEG。
44．一種非免疫原性效價(jià)平臺(tái)分子，其包括化合物63，四-BA-PIZ-PMA。
45．一種治療患有aPL抗體介導(dǎo)的疾病的患者的方法，其包括給其所需個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求11組合物。
46．權(quán)利要求45的方法，其中所說(shuō)的aPL抗體介導(dǎo)的疾病是中風(fēng)。
47．權(quán)利要求45的方法，其中所說(shuō)的aPL抗體介導(dǎo)的疾病是流產(chǎn)。
48．權(quán)利要求45的方法，其中所說(shuō)的aPL抗體介導(dǎo)的疾病是抗磷脂抗體綜合癥(APS)。
49．權(quán)利要求45的方法，其中所說(shuō)的aPL抗體介導(dǎo)的疾病是原發(fā)性抗磷脂抗體綜合癥(PAPS)。
50．權(quán)利要求45的方法，其中所說(shuō)的aPL抗體介導(dǎo)的疾病是血栓形成。
51．一種用于鑒別特異性地與自患有aPL抗體介導(dǎo)的疾病的人體分離得到的aPL抗體結(jié)合的表位之類(lèi)似物的方法，該方法包括(a)制備噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)；(b)篩選所說(shuō)的具有aPL抗體的文庫(kù)，以鑒別aPL模擬肽，其中所說(shuō)的篩選包括(ⅰ)通過(guò)生物淘選篩選所說(shuō)的文庫(kù)；(ⅱ)通過(guò)微量淘選進(jìn)一步篩選在(ⅰ)中的由生物淘選分離得到的噬菌體；以及(ⅲ)通過(guò)免疫測(cè)定鑒別包含在(ⅱ)中回收的aPL抗體高親和性結(jié)合肽的噬菌體。
52．一種生物淘選噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)以鑒別和分離結(jié)合到aPL抗體上的肽的方法，該方法包括(a)使親和純化的aPL抗體與攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體反應(yīng)；(b)回收攜帶有結(jié)合到aPL抗體上的隨機(jī)肽插入片段的噬菌體；(c)用在(b)中回收的噬菌體感染微生物；以及(d)在包含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)感染過(guò)的微生物以分離噬菌體。
53．一種微量淘選噬菌體隨機(jī)肽文庫(kù)以鑒別和分離對(duì)aPL抗體有高結(jié)合親和性的肽的方法，該方法包括(a)通過(guò)生物淘選分離攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體；(b)在涂布有結(jié)合到蛋白質(zhì)G上的aPL抗體的微量板孔中培養(yǎng)在步驟(a)中回收的噬菌體；(c)洗滌微量板孔，以除去未結(jié)合的噬菌體，(d)洗脫結(jié)合的噬菌體；和(e)用在(d)中回收的噬菌體感染微生物；以及(f)在包含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)感染過(guò)的微生物以分離噬菌體。
54．權(quán)利要求51的方法，其中所說(shuō)的免疫測(cè)定是噬菌體俘獲ELISA，其包括(a)在涂布有aPL抗體的微量板孔中培養(yǎng)經(jīng)微量淘選分離的攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體；(b)洗掉未結(jié)合的噬菌體；(c)在孔中溫育標(biāo)記的抗噬菌體抗體；(d)洗掉未結(jié)合的標(biāo)記的抗噬菌體抗體；(e)添加標(biāo)記底物；以及(f)測(cè)量底物的信號(hào)發(fā)展以鑒別高親和性結(jié)合的噬菌體。
55．權(quán)利要求54的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記是酶。
56．權(quán)利要求的54的方法，其中所說(shuō)的底物是比色的。
57．權(quán)利要求54的方法，該方法還包括進(jìn)行高親和性結(jié)合噬菌體的附加的噬菌體俘獲ELISA測(cè)定，其包括(a)在微量板孔上涂布上相同數(shù)量的噬菌體；(b)在孔中溫育aPL抗體；(c)洗掉未結(jié)合的抗體；(e)將結(jié)合的aPL抗體與標(biāo)記的抗aPL抗體一起溫育；(f)洗掉未結(jié)合的標(biāo)記的抗-aPL抗體；(g)將底物添加至孔中；以及(h)測(cè)量底物的信號(hào)發(fā)展以測(cè)量噬菌體的相對(duì)結(jié)合親和性。
58．權(quán)利要求57的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記是酶。
59．權(quán)利要求57的方法，其中所說(shuō)的底物是比色的。
60．權(quán)利要求51的方法，其中所說(shuō)的免疫測(cè)定是菌落印跡免疫測(cè)定，其包括(a)在包含瓊脂的培養(yǎng)基頂部的膜上培養(yǎng)受攜帶隨機(jī)肽插入片段的噬菌體感染的微生物；(b)通過(guò)在包含瓊脂的培養(yǎng)基頂部的膜上印跡微生物來(lái)重復(fù)轉(zhuǎn)移在(a)中培養(yǎng)的微生物；(c)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移的微生物；(d)裂解所說(shuō)的微生物；(e)消化所說(shuō)的微生物；(f)封阻上述膜；(g)將上述膜與aPL抗體一起溫育；(h)洗掉未結(jié)合的aPL抗體；(i)將標(biāo)記的抗-aPL抗體與上述膜一起溫育；(j)洗掉未結(jié)合的標(biāo)記的抗-aPL抗體；(k)添加底物；以及(l)測(cè)量底物的信號(hào)發(fā)展以鑒別高親和性結(jié)合的噬菌體。
61．權(quán)利要求60的方法，其中所說(shuō)的膜是硝酸纖維素。
62．權(quán)利要求60的方法，其中所說(shuō)的微生物用溶菌酶消化。
63．權(quán)利要求60的方法，其中所說(shuō)的封阻液是明膠。
64．權(quán)利要求60的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記是酶。
65．權(quán)利要求60的方法，其中所說(shuō)的底物是比色的。
66．一種用于測(cè)定和分級(jí)親和結(jié)合特征表位的方法，所說(shuō)的表位特異性結(jié)合分離自患有aPL抗體介導(dǎo)的疾病的患者的aPL抗體，該方法包括(a)用心磷脂涂布微量滴定板的孔；(b)添加成年牛或人類(lèi)血清，其作為結(jié)合到心磷脂上的β2-GPI源，并阻止非特異性結(jié)合到平板的孔上；(c)溫育單體類(lèi)似物和高滴度aPL抗體溶液一段預(yù)定的時(shí)間；(d)向微量滴定板孔中添加aPL抗體/類(lèi)似物混合物并溫育一段預(yù)定的時(shí)間；(e)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的aPL抗體；(f)將與標(biāo)記綴合的抗人IgG添加到平板孔中，溫育一段預(yù)定的時(shí)間；(g)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的抗人IgG綴合物；(h)添加標(biāo)記的綴合物的底物，將底物/標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行一段預(yù)定的時(shí)間；(i)測(cè)量底物/標(biāo)記反應(yīng)的最終-產(chǎn)物，并定量結(jié)合至孔上的aPL抗體的量；(j)計(jì)算aPL抗體結(jié)合的抑制(如果有的話)百分比，以確定類(lèi)似物對(duì)aPL抗體的親和性。
67．權(quán)利要求66的方法，其中所說(shuō)的綴合物是用酶標(biāo)記的。
68．權(quán)利要求66的方法，其中所說(shuō)的底物是比色的。
69．一種用于確定體液中aPL抗體存在的診斷免疫測(cè)定法，上述體液得自懷疑患有aPL抗體介導(dǎo)的的疾病的患者，該測(cè)定法包括(a)將特異性結(jié)合aPL抗體的表位類(lèi)似物與體液樣品接觸，(b)檢測(cè)與上述類(lèi)似物結(jié)合的aPL抗體。
70．權(quán)利要求69的免疫測(cè)定法，其中所說(shuō)的免疫測(cè)定法包括(a)將特異性結(jié)合aPL抗體的表位的類(lèi)似物涂布在微量滴定板的孔上；(b)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的類(lèi)似物；(c)將一種體液試驗(yàn)樣品添加至孔中，并溫育一段預(yù)定的時(shí)間；(d)洗滌孔以除去未結(jié)合的試驗(yàn)樣品；(e)將與標(biāo)記綴合的抗人IgG添加到平板孔中，溫育一段預(yù)定的時(shí)間；(f)洗滌孔以洗掉未結(jié)合的抗人IgG綴合物；(g)添加標(biāo)記的綴合物的底物，并將底物/標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行一段預(yù)定的時(shí)間；(h)測(cè)量底物/標(biāo)記反應(yīng)的最終-產(chǎn)物，以確定抗-aPL抗體在試驗(yàn)樣品中的存在。
71．權(quán)利要求70的免疫測(cè)定法，其中所說(shuō)的標(biāo)記是酶，并且所說(shuō)的底物是比色的。
72．用于將肽或其它生物活性分子與效價(jià)平臺(tái)分子連接起來(lái)的具有下式的親水接頭；R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2其中n=0-200；m=0-10；R1=H或如三苯甲基的保護(hù)基；R2=H或烷基或如4-硝基苯基酯的芳基。
73．權(quán)利要求72的接頭，其中m=0或2。
74．權(quán)利要求11的綴合物，其中所說(shuō)的aPL類(lèi)似物通過(guò)包含巰基的部分與非免疫性效價(jià)平臺(tái)分子結(jié)合。
全文摘要
本文公開(kāi)了(a)特異性結(jié)合B細(xì)胞(aPL表位與其結(jié)合)的aPL類(lèi)似物。無(wú)T細(xì)胞表位的優(yōu)化類(lèi)似物作為治療aPL抗體介導(dǎo)的疾病的綴合物是有用的。本文提供了作為新的非免疫性效價(jià)平臺(tái)分子和接頭的、包含aPL類(lèi)似物和非免疫性效價(jià)平臺(tái)分子的綴合物。本文也公開(kāi)了制備和鑒別所說(shuō)的類(lèi)似物的方法、利用所說(shuō)的類(lèi)似物的治療方法、制備所說(shuō)的類(lèi)似物的綴合物的方法和組合物以及aPL抗體的診斷免疫測(cè)定法。
文檔編號(hào)C07K7/50GK1225015SQ97196260
公開(kāi)日1999年8月4日 申請(qǐng)日期1997年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月6日
發(fā)明者E·J·維多利亞, D·M·馬奎斯, D·S·瓊斯, L·于 申請(qǐng)人:拉卓拉藥物公司