專利名稱：用于在轉基因雌禽卵中組織特異性合成蛋白質(zhì)的載體與方法
技術領域：
本發(fā)明一般地涉及用以將遺傳物質(zhì)導入一雞胚和其他鳥類胚胎中的載體與方法，更具體而言，涉及用以將一個目的基因轉移到雞胚細胞中以產(chǎn)生這樣一種轉基因雌禽的載體與方法，目的基因可在該雌禽輸卵管中表達且此基因產(chǎn)物可在雞卵和/或其后代中分泌。
背景技術：
自25年前重組DNA技術發(fā)展以來，大規(guī)模地生產(chǎn)蛋白質(zhì)而不是從其天然表達的組織中提取的希望已成為現(xiàn)實。尤其是在近20年中，對表達載體的研究進展使得在實驗室規(guī)模產(chǎn)生了上千種重組蛋白質(zhì)。商業(yè)化數(shù)量的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)常常需要困難且昂貴的放大步驟，但也已獲得成功。另外，已設計構建了包括鼠、兔、豬、綿羊、山羊及母牛在內(nèi)的轉基因動物，使其組織或分泌物中產(chǎn)生用于人類的藥品。Houdebine,L.M.，生物技術雜志(J.Biotechnology)34:269-287(1994)。
盡管卵清被認為是產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的出色宿主，轉基因鳥類的制備存在技術上的困難，主要因雞胚操作過程中出現(xiàn)的諸多問題。當產(chǎn)卵時，胚胎已處于相當于哺乳動物囊胚晚期或原腸胚早期的階段。在較早期發(fā)育階段過程中胚胎的遺傳操作需要重新導入雌性體內(nèi)或體外培養(yǎng)，這兩步都是困難的。Houdebine,L.M.，生物技術雜志(J.Biotechnology)34:269-287(1994)。盡管存在上述困難，已產(chǎn)生了抗鳥造白細胞組織增生病毒感染的轉基因雞(Crittenden和Salter，藥用及農(nóng)用轉基因牲畜模型(“Transgenic Livestock Models In Medicine And Agriculture”)73-87(Wiley-Liss(1990)))，或有高水平循環(huán)生長激素的轉基因雞。Bosselman,R.A.，等科學(Science)243:533-535(1989)。
已報道有四種產(chǎn)生轉基因鳥類的常規(guī)方法。一種方法涉及自輸卵管中切出正在發(fā)育的卵，將DNA顯微注射入近囊胚層處以及在溶液與替代殼內(nèi)對所處理的胚胎進行體外培養(yǎng)。Love,J.，等生物技術(Biotechnology)12:60-63(1994)。第二種方法則需培養(yǎng)和轉染原生殖細胞，然后移植入照射過的與供體處于同一發(fā)育階段的受體內(nèi)。Carsience等發(fā)育(Development)117:669-675(1993)；Etches等，鳥類科學(PoultryScience)72:882-889(1993)。盡管技術要求很高，上述兩種方法仍充滿吸引力，因為可以轉移大片段DNA。
第三種方法涉及用針將可復制的逆轉錄病毒盲注入(blind injection)新排下的卵的近囊胚層處。Petropoulos,CJ.，等病毒學雜志(J.Virol)65:3728-3737(1991)。雖然此法最簡單，但也有局限，因為待轉移的DNA大小必須約2kb或更小，而且本方法可產(chǎn)生有病毒血癥的雌禽，后者可排出有感染性的重組逆轉錄病毒。Petropoulos,C.J.，等病毒學雜志(J.Virol)66(6):3391-3397(1992)。
第四種涉及一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體系統(tǒng)(見如美國專利No.5,162,215和4,650,764,在此引入作為參考)。這些系統(tǒng)之一衍生于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒A型(REV-A)(Watanabe和Temin，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)3(12):2241-2249(1983))。Sevoian等，鳥類疾病(Avian Dis)8:336-347(1964)。來自REV-A的復制缺陷型逆轉錄病毒載體建立在輔助細胞系C3上(Watanabe和Temin，分子細胞生物學，3(12):2241-2249,(1983))，該細胞系包含有包裝缺陷的輔助原病毒組分。在美國專利No.4,650,764及Watanabe和Temin，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)3(12):2241-2249(1983)中，詳細描述了C3輔助細胞系的來源和幾種復制缺陷型逆轉錄病毒載體。與可復制的方法相比，本方法技術要求更高，因為囊胚層必需暴露出來，而且必須使用顯微注射設備。Bosselman,R.A.，等科學(Science)243:533-535(1989)。然而，這樣可產(chǎn)生沒有可復制的逆轉錄病毒的轉基因雌禽，并能轉移長達8kb大小的DNA。
運用可復制逆轉錄病毒技術，已在一種轉基因雞中實現(xiàn)一種外源基因的組織特異性表達。Petropoulos,C.J.，等，病毒學雜志(J.Virol)66(6):3391-3397(1992)。一種可復制逆轉錄病毒被用來將受一肌肉特異性啟動子αaction引導的報告基因氯霉素乙酰轉移酶(CAT)轉移至骨骼肌中。在轉基因鳥類的卵中組織特異性地表達重組蛋白質(zhì)目前尚未獲成功。
因此，期望提供一種載體和方法用于將基因轉入雞胚(或其他鳥類)細胞中，以產(chǎn)生一種該基因可組織特異性表達的轉基因雌禽。同樣，期望提供一種載體和方法用于將基因轉入雞胚細胞中，使該基因在雌禽輸卵管中表達且此基因產(chǎn)物可分泌入卵中。同樣，期望提供一種載體和方法用于將基因轉入雞胚細胞中，使該基因在該雌禽輸卵管中表達且此基因產(chǎn)物分泌入雌禽卵中，而無損該雌禽和其它與之有關的鳥類的健康。
發(fā)明概述提供了用以將遺傳物質(zhì)導入小雞或其它鳥類細胞中的載體和方法。更具體而言，提供了用以將一種被轉基因轉移入一種雞胚細胞中，從而產(chǎn)生一種被轉基因可在其輸卵管內(nèi)表達并且被轉基因產(chǎn)物可分泌入其卵及/或其后代中的轉基因雌禽的載體和方法。在一種優(yōu)選實施方案中，該被轉基因產(chǎn)物在卵清中分泌。
在一個實施方案中，載體含有一種逆轉錄病毒基因組的一部分，其能轉染細胞但無法進行復制，亦即，一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體。此載體還含有一個被可操縱地連接到適當控制元件上的被轉基因，這樣該被轉基因可以組織特異性地表達。在一個實施方案中，控制元件包括一種引導被轉基因在輸卵管中表達的增強啟動子，一段有恰當長度及序列以增強翻譯效率的位于結構基因(編碼區(qū))5’端的非翻譯區(qū)，和一段引導被轉基因產(chǎn)物分泌入卵清中的信號序列。在此實施方案中，啟動子可以選自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵類粘蛋白啟動子及其組合且不局限于此。在另一個實施方案中，控制序列包括一種引導被轉基因在肝臟表達的啟動子和一段引導被轉基因產(chǎn)物吸收和分泌入卵黃中的信號序列。在此實施方案中，啟動子可以選自卵黃原蛋白和載脂蛋白A啟動子及其組合且不局限于此。
通過本領域技術人員熟知的方法如上述四種方法，本發(fā)明中的載體可被用來產(chǎn)生轉基因鳥類，尤其是雞(見發(fā)明背景)。例如，如引入此處供參考的美國專利No.5,162,215所描述的那樣，可用載體將一段核苷酸序列如一個基因導入一種雞胚的胚細胞及干細胞中。在一個實施方案中，將載體顯微注射入一個新排下的雞卵的接近囊胚層處(如正下方)。然后密封該卵，并孵育至小雞孵出。然后在該轉基因雞中檢測被轉基因的表達，如果結果呈陽性且該雞為雌性(母雞)的話，則收集這只小雞的卵并用本領域人員熟知的方法分離蛋白質(zhì)。如果該雞為雄性(公雞)，則飼養(yǎng)之以產(chǎn)生雌性轉基因雞并收集其卵。這樣提供了轉基因鳥類和卵以及產(chǎn)生轉基因鳥類和卵的方法。
從下列描述、所附權利要求再加上附圖，可以明顯看出本發(fā)明的其它特征及優(yōu)點。
附圖簡介通過閱讀以下詳述和所附權利要求并參看附圖后，本領域專業(yè)人員可以看出本發(fā)明的諸多優(yōu)點，在附圖中

圖1為說明本發(fā)明中載體的產(chǎn)生及用載體產(chǎn)生轉基因雞的方法的示意圖；圖2為說明本發(fā)明中的一種優(yōu)選載體的示意圖；圖3為說明本發(fā)明中逆轉錄病毒及表達載體的構建的示意圖；圖4為說明中間物#1pOVSV的構建的示意圖；圖5為說明中間物#2pSigl的構建的示意圖；圖6為說明中間物#3pSigPCR的構建的示意圖；圖7為說明中間物#4pUTR的構建的示意圖；圖8為說明中間物#5pUTRAN的構建的示意圖；圖9為說明中間物#6pERE1的構建的示意圖；圖10為說明中間物#7pERE的構建(注意圖10中箭頭是指位于寡聚核苷酸內(nèi)部的ERE序列方向，而不是寡聚核苷酸本身的方向)；
圖11為說明修飾過的原病毒載體的示意圖；圖12為說明潮霉素B磷酸轉移酶基因3’端的修飾的示意圖；及圖13為說明潮霉素B磷酸轉移酶基因N末端的修飾的示意圖。
優(yōu)選實施方案的詳述提供了用以將遺傳物質(zhì)導入雞細胞或其它鳥類細胞中的載體和方法。更具體而言，提供了用以將一種被轉基因轉移入雞胚細胞以產(chǎn)生一種轉基因雌禽的載體和方法，其中被轉基因可在其輸卵管中表達并且被轉基因產(chǎn)物可分泌入雞卵及/或其后代中。圖1是本發(fā)明方法的示意圖，包括載體構建及在轉基因小雞中的應用。
在一個實施方案中，載體含有一種逆轉錄病毒基因組的一部分，可以轉染入一種細胞但不能復制，即是復制缺陷型逆轉錄病毒載體。優(yōu)選來自REV-A病毒的復制缺陷型逆轉錄病毒載體。載體還含有一個目的基因，在此也稱之為被轉基因，該基因被可操縱地連接至恰當?shù)目刂圃?，以使被轉基因產(chǎn)物可以組織特異性方式合成。
圖2給出了本發(fā)明中優(yōu)選的表達載體的示意圖。應當理解的是示于圖2中的3kb的β-半乳糖苷酶基因僅僅是一報告基因，它可被任何被轉基因或其片段替代。例如可采用編碼血液凝集蛋白如fⅧ的基因。被轉基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)分泌入卵清中然后被分離。一旦被純化，該蛋白質(zhì)可作藥用如治療血友病等。其它優(yōu)選基因可包括但不局限于編碼血液蛋白質(zhì)如人血漿蛋白和α1-抗胰蛋白酶、造血生長因子包括促紅細胞生成素及淋巴細胞生長因子如粒細胞集落刺激因子的基因。也可使用編碼工業(yè)蛋白質(zhì)如α-淀粉酶和葡萄糖異構酶的基因。另外，本發(fā)明中的載體也可包括編碼抗體和其免疫反應部分的基因(見如Lilley等，免疫學方法(J.Immunol.Meth.)171:211-226(1994)和Davis等，生物技術(Biotechnol.).9:165-169(1991)，此處引入作為參考。
采用本領域技術人員周知的諸多方法中的任何一種，可以產(chǎn)生并純化待轉基因或其基因片段。因而，可以通過人工合成得到一個基因，或用逆轉錄酶處理此基因轉錄所得的mRNA以產(chǎn)生一段該基因的cDNA，或直接從一基因組文庫或其它來源分離此基因。
位于被轉基因旁側的控制元件包括啟動子和增強子、非翻譯區(qū)和信號序列，其可使該被轉基因組織特異性地表達。在一種實施方案中，啟動子引導被轉基因在轉基因鳥類輸卵管中表達。本發(fā)明的一種優(yōu)選啟動子選自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵類粘蛋白啟動子及其組合。載體中的信號序列引導轉基因產(chǎn)物分泌入卵清中。在另一個實施方案中，啟動子引導被轉基因在肝臟中表達，載體中的信號序列引導轉基因產(chǎn)物分泌和吸收入卵黃中。在此實施方案中，啟動子選自卵黃原蛋白和載脂蛋白A啟動子及其組合。優(yōu)選的增強子是病毒的增強子，包括但不限于SV40增強子或其一部分。除了被認為可結合轉錄因子的合成DNA，如類固醇激素應答元件(像此處描述的串聯(lián)ERE)以外，也可采用溶菌酶的增強子。
在本發(fā)明的一實施方案中，如圖2所示，目的基因旁側的控制元件包括SV40增強子、三個串聯(lián)雌激素應答元件(ERE)、1.3kb的卵白蛋白啟動子(5’端旁側)、77bp的5’端非翻譯區(qū)(UTR)、來自雞溶菌酶基因的N末端信號肽序列以及來自SV40小T抗原的多腺苷酸化信號和終止信號。序列表1給出了優(yōu)選的構建體的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，5kb長的XbaⅠ片段中有此構建體，該片段被插入到一種用于基因轉移的復制缺陷型逆轉錄病毒載體中。優(yōu)選的原病毒載體是質(zhì)粒pSW272的衍生物。Emerman,M.，等細胞(Cell)39:459-467(1984)；美國專利No.4,650,764。正如援引于此處作參考的美國專利No.4,650,764所描述，已構建了可補充這些載體并產(chǎn)生對包裝復制缺陷型逆轉錄病毒載體所必需的病毒蛋白質(zhì)的細胞系。包裝的載體只能感染一次細胞而不能持續(xù)感染。
用本領域技術人員已知的方法產(chǎn)生轉基因鳥類，尤其是雞時，本發(fā)明中的載體尤其有用。例如援引于此處作參考的美國專利No.5,162,215中所述，可用載體將一段核酸序列如一種基因導入一種雞胚細胞。在一實施方案中，將載體在接近囊胚層處例如其正下方顯微注射入被阻抑在X階段(通常不超過十天，未被孵育過)的新排下的雞卵中。更具體而言，通常用一個適于在卵殼上鉆洞而無損于其下的殼膜的帶旋轉鉆頭的鉆具在卵的一側開一直徑約5mm的口。然后用解剖刀或18號針頭和拇指鑷將膜切下，這樣便切掉了部分卵殼和卵膜，暴露出胚胎。可用肉眼或放大6～50倍的光學解剖顯微鏡下進行觀察。用顯微操作器和一個極小直徑的針頭，優(yōu)選為玻璃的，針尖外徑40～60μm，針身外徑為1mm，將含有本發(fā)明中的載體(通常為組織培養(yǎng)基)的溶液顯微注射入囊胚層下方及周圍處。用于顯微注射的溶液體積優(yōu)選為5～20μl。顯微注射完畢，用殼膜和優(yōu)選為膠或石蠟的密封物質(zhì)將卵封好。然后將密封的卵在約38℃(99.5＂H)下孵育不同時段，達到并超過卵孵出所需的時間以保證胚胎的正常生長與發(fā)育。在胚胎和新孵出的小雞的DNA中檢測有無來自被顯微注射的載體的序列。用本領域已知且適合用于檢測特異性或目的基因的方法檢測插入序列的存在，或檢測基因產(chǎn)物的存在，只要該基因或基因產(chǎn)物(即蛋白質(zhì))存在，收集此轉基因雞的卵并分離蛋白質(zhì)。
在另一個實施方案中，將載體或可產(chǎn)生包含被轉基因的病毒的轉染細胞通過體內(nèi)方式注射入正發(fā)育的卵母細胞，例如引入此處作參考的Shuman和Shoffner，禽類科學(Poultry Science)65:1437-1444(1986)所述，然后是同樣的孵育、孵出等步驟。
此處提到的術語“基因”或“被轉基因”是指天然存在的或合成的可編碼一蛋白產(chǎn)物的一段核酸。術語“核酸”是指自然及/或合成的線性、環(huán)狀和順序排列的核苷酸和核苷，如cDNA、基因組DNA(gDNA)、mRNA和RNA、寡聚核苷酸、寡聚核苷及其衍生物。術語“可操縱地連接”是指以一種容許被轉基因轉錄的方式連接。術語“編碼”是指在合適的表達體系中，該核酸可被轉錄并翻譯成期望的多肽或蛋白質(zhì)。例如在一合適的載體中(如表達載體)當需表達的核酸被連至恰當?shù)目刂圃?，如啟動子和增強子元件上時，以及將載體導入合適的體系或細胞時。此處“多肽”指一段氨基酸序列，包括全部長度的蛋白質(zhì)及其片段。
術語“復制缺陷型逆轉錄病毒載體”是指含有部分逆轉錄病毒基因組、可以轉染細胞但不能進行自由復制即多次感染的載體，這通常是因為病毒基因組的突變或缺失所致。術語“REV衍生的復制缺陷型載體”是指一種不能自由復制的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒載體。
術語“鳥類”可包括但不局限于雞、鵪鶉、火雞、鴨及其它家禽。術語“雌禽”包括所有雌性鳥類?！稗D基因鳥類”通常指有異源DNA序列或一個或多個附加的對于鳥類通常為內(nèi)源性的DNA序列(在此統(tǒng)稱為“被轉基因”)整合入其胚細胞中染色體的鳥類。這樣轉移和整合的結果是，被轉序列可自胚細胞傳至轉基因鳥類的后代。在轉基因鳥類(包括其后代)中，被轉基因也可以會偶然整合入體細胞的染色體中。
為了更全面地證明本發(fā)明的優(yōu)點，列舉下面的實施例。應當理解，下面所述僅意在舉例，本發(fā)明的范圍并不局限于此。
具體實施例1-載體構建討論啟動子卵白蛋白是卵清中含量最豐富的蛋白質(zhì)。卵白蛋白在大輸卵管的腺管細胞內(nèi)合成，并被直接分泌入與正在形成的卵相連的管腔。卵白蛋白的啟動子是已被很好地表征的復合啟動子。見Houdebine,L.M.，生物技術雜志(J.Biotech)34:269-287(1994)。卵白蛋白啟動子受所有已知的類固醇激素調(diào)節(jié)(Gaub,M.P.，等細胞(Cell)63:1267-1276(1990))，至少有8種不同的調(diào)節(jié)蛋白或蛋白組被認為結合在位于帽區(qū)(cap位點)5’端的長1.1kb的區(qū)域。這些蛋白質(zhì)包括TATA結合蛋白復合物(TFIID)、雌激素受體、包括fos和jun基因產(chǎn)物及相關肽的活化蛋白1(AP-1)(Curran,T.，等細胞(Cell)55:395-397(1988))、雞卵白蛋白上游啟動子轉錄因子(COUP-TF)(Wang,L.，等自然(Nature)340:163-166(1989))和相關蛋白S300-Ⅱ(Sagami,I.，等分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)6(12):4259-4267(1986))，一個NF-κB樣的核蛋白(Schweers,L.，等生物化學雜志(J.Biol.Chem.)266(16):10490-10497(1991))及一個核因子Ⅰ(NF-Ⅰ)的同系物。Bradshaw,M.S.，等生物化學雜志(J.Biol.Chem.)263(17):8485-8490(1988)。負責這些相互作用的順式作用序列包含在作為本發(fā)明優(yōu)選啟動子的1.3kb片段中。雖然本發(fā)明中的載體與方法盡力模擬了卵白蛋白的天然表達體系，卵白蛋白長約8kb的5，端調(diào)控區(qū)(Gaub,M.P等，細胞(Ceu)63:1267-1276(1990))加上其它下游元件(LeMeur,M.A.，等(EMBO Journal)3(12):2779-2786(1994))對一個逆轉錄病毒載體而言過于龐大。Emerman，M等，細胞，39:459-467(1984)。因此使用1.3kb長的片段。然而本領域技術人員應當理解，卵白蛋白的啟動子可以含有能引導一個被轉基因在輸卵管內(nèi)表達的卵白蛋白轉錄單位的任何部分。另外應當理解，雖然此處具體討論的是卵白蛋白啟動子，也可使用其它能在產(chǎn)生卵清的細胞中引導表達的啟動子，包括但不限于溶菌酶、伴白蛋白和卵類粘蛋白的啟動子及其組合。
在另一實施方案中，使用可使被轉基因在肝臟中表達的啟動子，例如卵黃原蛋白或載脂蛋白A的啟動子及其組合。盡管卵黃原蛋白和載脂蛋白A在卵黃中含量豐富，它們是在肝臟中合成然后經(jīng)血液運至卵黃的。通過可識別卵黃原蛋白前體的N端近側片段的特異性受體的介導得以沉積在卵黃。因此本發(fā)明的載體當含有卵黃原蛋白或載脂蛋白A的啟動子(或其組合)時，還含有一段在卵黃內(nèi)可引導蛋白質(zhì)的分泌和吸收的信號序列或獨立序列。雖然需要一個血液來源的中間步驟，此種載體類型尤其適合用于生產(chǎn)抗體或在其它種類血液中發(fā)現(xiàn)的化合物。增強子SV40增強子以前曾被用來增強卵白蛋白啟動子引導的表達。Dierich,A.，等EMBO Journal 6(8):2305-2312(1987)。已表明AP-1作用在卵白蛋白啟動子近側，SV40增強子可提高AP-1復合物或其某一部分的局部濃度。Curran,T.,等細胞(Cell)55:395-397(1988)。在卵白蛋白5’端尚有其它的控制元件未被納入1.3kb長的卵白蛋白啟動子中。Kaye等EMBO Journal 5(2):277-285(1986)，發(fā)現(xiàn)在卵白蛋白染色質(zhì)5’側翼有4個激素依賴的DNAaseⅠ高敏位點與卵白蛋白基因的表達相關。有兩個位點被納入此處采用的優(yōu)選啟動子內(nèi)，另兩個位點位點位于距帽區(qū)5’端的3.3kb和6kb處(相應地為位點Ⅲ和Ⅳ)。在-3.3kb處的位點Ⅲ位于675bp的Pst1-XbaⅠ片段內(nèi)，此片段大約距帽區(qū)5’端3.7kb至3.1kb范圍。該片段內(nèi)有四個半回文結構的雌激素應答元件(ERE)，它們以一種協(xié)同方式增強卵白蛋白啟動子引導的表達。Kato,S.，等，細胞(Cell)68:731-742(1992)。這些半EREs彼此間隔超過100bp。不過，融合和缺失實驗已證明了這些元件在賦予截短的卵白蛋白啟動子雌激素反應性方面的功能和必要性。Kato,S.，等，細胞(Cell)68:731-742(1992)?，F(xiàn)在認為，幾個不穩(wěn)定結合的雌激素受體在此位點發(fā)生協(xié)同作用，產(chǎn)生更穩(wěn)定的受體-DNA復合物，然后此復合物降低螺旋的穩(wěn)定性或提高啟動子附近的轉錄因子的局部濃度。
區(qū)域Ⅲ片段未被納入本發(fā)明的優(yōu)選載體內(nèi)，取而代之的是一段含有位于一個單一ERE的5’端并與之相鄰的全回文結構ERE的合成的寡聚核苷酸。與單一半位點相比，雌激素受體與回文ERE元件以二聚體結合，親和力更強。將回文結構ERE和單一ERE間隔7個堿基對串聯(lián)排列還可提高穩(wěn)定性。Klein-Hitapaβ,L.，等分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)201:537-544(1988)。現(xiàn)在認為這個寡聚核苷酸在體內(nèi)取代了一個-3.3kb處的高敏位點的功能。
串聯(lián)排列的ERE可能對基因表達有正效應。已表明ERE可提高含不完善ERE的啟動子的雌激素應答細胞內(nèi)的基因表達。Tsai,S.Y.，等，細胞(Cell)57:443-448(1989)；Ponglikitmongkol,M.，等EMBO Journal9(7):2221-2231(1990)。卵白蛋白啟動子中有不完善的ERE，可能合成的完善的共有ERE與天然的ERE之間有協(xié)同作用。
位于-6kb處的激素依賴的DNAseⅠ高敏位點包含在1.2kb內(nèi)。對該DNA片段的融合研究未發(fā)現(xiàn)卵白蛋白啟動子有雌激素反應性的增強作用。Kato,S,等，細胞(Cell)68:731-742(1992)。鑒于此，圖2所示載體中未包括該部分或其類似序列。
曾有研究者證明，卵白蛋白基因對雌激素的應答必需一種由促生長因子、胰島素或cAMP介導的細胞內(nèi)磷酸化級聯(lián)反應。Evans,M.L.，等，細胞(Cell)25:187-193(1981)。Evans,M.L.，等，內(nèi)分泌學(Endocrinology)115(1):368-377(1984)。盡管這些研究已有十多年歷史，而且目前對細胞內(nèi)第二信使級聯(lián)機制了解得更加詳細，關于卵白蛋白啟動子內(nèi)特異性順式作用序列的確切機制尚未得到明確證明。然而有理由設想，該機制涉及AP-1的結合，其順式作用元件被納入優(yōu)選卵白蛋白啟動子和SV40增強子中。Curran,T.，等，細胞(Cell)55:395-397(1988)。5’非翻譯區(qū)5’非翻譯區(qū)(UTR)是卵白蛋白RNA的一部分。卵白蛋白基因含有一剪接到第一編碼外顯子的5’先導外顯子，以產(chǎn)生長為65堿基的非翻譯區(qū)。O’Hare,K.等，核酸研究(Nucleic Acids Research)7(2):321-334(1979)。載體UTR序列幾乎完全拷自cDNA以產(chǎn)生5’UTR，其與卵白蛋白RNA的5’UTR非常類似。僅有的差別是近5’端有一個對構建很重要的堿基的突變，有一附加的3’端接頭，從而產(chǎn)生一長為77bp的UTR。77堿基的先導子更加符合Kozak的研究結果，該結果認為為達到最高翻譯效率，至少需77個堿基(Kozak,M.，等，細胞生物學雜志(J.Cell.Biol.)115(4):887-903(1991))。不過，可使用起始密碼子周圍的帶有功能序列的任何UTR。信號序列信號肽負責將蛋白質(zhì)運出細胞，信號肽序列理論已被充分發(fā)展。VonHeijne,G.，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)133:17-21(1983)；VonHeijne,G.，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)184:99-105(1985)。在多數(shù)分泌蛋白質(zhì)中，該序列位于新生蛋白質(zhì)N端，在蛋白質(zhì)合成和轉運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中時被切除。然而對于卵白蛋白，該序列居蛋白質(zhì)內(nèi)部且不被切除(Robinson,A,等FEBS 203(2):243-246(1986))，因此不適于用在表達載體內(nèi)。本發(fā)明中的載體使用的是卵清溶菌酶的信號序列作為轉運信號，這是由于此信號是一可被切除的N端序列，它可在體內(nèi)雞輸卵管中發(fā)揮作用并可釋放出具有酵母(Saccharomyces)的天然N端的蛋白質(zhì)。Jigami,Y.，等基因(Gene)43:273-279(1986)。然而，本領域人員應當理解的是可以使用任何信號序列?；驁D2所示的載體中使用β-半乳糖苷酶基因的原因有二。首先，長3kb，是可得到的最長的報告基因；許多編碼有商業(yè)價值的蛋白質(zhì)的基因均比之短得多。因此，如果該體系能表達β-半乳糖苷酶到卵中，那么同樣也會表達其它基因。第二，可以容易地檢測β-半乳糖苷酶的表達，這樣有利于篩選本發(fā)明中的轉基因雌禽所產(chǎn)的卵。應當理解的是，可以使用任何被轉基因或其片段。3’控制區(qū)由于本發(fā)明中的轉基因載體是一種逆轉錄病毒，其基因組為RNA，并且在基因組合成方向的轉錄終止信號可提前終止合成并產(chǎn)生低滴度的逆轉錄病毒。其它研究者使用過終止和多聚腺苷酸化信號，但發(fā)現(xiàn)效果甚微。Bradyopadhy,P.K.等，分子細胞生物學(Mol.Cell Biol.)4(4):749-754(1984)。如果置于相反方向，一個轉錄終止信號不會影響基因組的合成，但可能無法受益于逆轉錄病毒載體中更近側LTR的增強效應。因此，就逆轉錄病毒載體而言，構建了雙向表達載體。標準的終止密碼子和已證實的來自SV40小T抗原的多聚腺苷酸化信號被納入結構基因3’端。
材料與方法簡介購自Promega公司的表達載體pSVβ-半乳糖苷酶中的3.5kb ClaⅠ-XbaⅠ片段上含有β-半乳糖苷酶基因及來自SV40小T抗原的轉錄終止信號和多聚腺苷酸化信號。質(zhì)粒pOV1.7的1.7kb的PstⅠEcoRⅠ片段上含有卵白蛋白啟動子(序列見Helig,R.，等分子生物學雜志(J.Mol.Biol)156:1-19(1982).Genback保藏號#J00895 M24999)。購自Promega公司的質(zhì)粒pCAT-增強子的247bp的NcoⅠ-EcoRⅠ片段上含有SV40增強子。此構建體中所有其它的DNA均系從頭合成。圖3為逆轉錄病毒載體和表達載體的構建示意圖。中間體1#的構建；pOVSV質(zhì)粒pOV1.7在卵白蛋白基因的第一個內(nèi)含子中有一HindⅢ位點，在帽區(qū)5’端1.37kb處有一PstⅠ位點(見圖4)。將此pOV1.7上的PstⅠ HindⅢ片段連至pSVβ-半乳糖苷酶的HindⅢ和NsiⅠ位點(NsiⅠ有可與PstⅠ相容的末端)；產(chǎn)生名為pOVSV的質(zhì)粒，見圖4。pOVSV是用以構建最復雜的載體樣式的8個中間體的第一個。中間體2#的構建；pSig1將一含有編碼來自雞溶菌酶的信號肽的核苷酸序列的合成接頭插入pOVSV的SspBⅠ和ClaⅠ位點，見圖5。產(chǎn)生的質(zhì)粒為pSigⅠ。圖5包括該核苷酸序列以及信號肽的氨基酸序列和起始密碼子。中間體3#的構建；pSigPCR質(zhì)粒pSigⅠ包含不期望的卵白蛋白啟動子的3’端及β-半乳糖苷酶基因5’端的缺失。通過PCR可恢復β-半乳糖苷酶。采用與該基因內(nèi)單一SacⅠ位點3’端的35bp雜交的3’端引物。其序列及PCR設計見圖6。與β-半乳糖苷酶基因5’端雜交的5’端引物，含有包括單一Csp45Ⅰ位點和8個5’核苷酸的17個堿基的5’端伸出區(qū)。用Csp45Ⅰ酶切可產(chǎn)生與ClaⅠ酶切相容的末端。進行30個循環(huán)的PCR，以及用SacⅠ和Csp45酶切PCR產(chǎn)物后，在低熔點膠上純化。將這段1.9kb片段連至pSigⅠ的單一ClaⅠ和SacⅠ位點上，從而恢復β-半乳糖苷酶基因并將其直接置于信號序列密碼子的3’端且與其構成框架(見圖6)。此質(zhì)粒稱為pSigPCR，并通過PvuⅠ酶切及隨后的序列分析得以確證。中間體4#的構建；pUTR將編碼卵白蛋白5’UTR的合成寡聚核苷酸連入pSigPCR的BgⅠⅡSspBⅠ位點。該寡聚核苷酸的近5’末端也含有一個Acc65Ⅰ位點(帽區(qū)周圍)以保證啟動子在后面步驟中得到恢復，(見圖7)。正確的構建體用KpnⅠ酶切得以確證。這個質(zhì)粒稱之為pUTR，它含有在帽區(qū)3’端的所有必需元件。中間體5#的構建；pUTRAN將含有來自pOVSV的完整啟動子的1.4kb的SspBⅠ部分-NcoⅠ限制性片段連至pUTR的NcoⅠ和Acc65Ⅰ位點上，以恢復啟動子，見圖8。正確的重組體用BglⅡSspB1雙酶切得以驗證。此質(zhì)粒pUTRAN含有一個可引導構建體中所有必需下游元件表達的卵白蛋白啟動子。中間體6#的構建；pERE1串聯(lián)雌激素應答元件(ERE)含于一個合成的寡聚核苷酸中。由于ERE元件內(nèi)部的反向重復區(qū)可形成莖環(huán)結構而阻礙退火后雙鏈結構的形成，將該寡聚核苷酸分兩步插入。第一個寡聚核苷酸含有兩個同向ERE，二者被單一HindⅢ和SpeⅠ位點隔離開來。將這個寡聚核苷酸連到pUTRAN的單一NsiⅠ和NcoⅠ位點上形成質(zhì)粒pERE1。pERE1還含有用于SV40增強子插入的AccⅢ和NcoⅠ位點，以及一個末端XbaⅠ位點，該位點可使隨后的構建體插入到逆轉錄病毒載體的單一XbaⅠ位點。用XbaⅠ酶切和序列分析驗證正確的重組體。中間體7#的構建；pERE將含有3’半位點的合成寡聚核苷酸連至pERE的單一HindⅢ和SpeⅠ位點上可產(chǎn)生一個完全回文結構的ERE。產(chǎn)生的質(zhì)粒pERE含有一個完全回文結構的ERE和一個ERE半位點，二者相距7個堿基對(見圖9和圖10)。由于第二個寡聚核苷酸的連入使單一HindⅢ位點消失，用HindⅢBglⅡ雙酶切驗證正確的重組體。中間體8#的構建；pUCEREpERE質(zhì)粒含有除SV40增強子之外的表達載體的所有元件。SV40增強子位于購自Promega的質(zhì)粒pCAT-增強子的247bp的EcoRⅠNcoⅠ片段上。pERE含3個EcoRⅠ位點，2個NcoⅠ位點，這樣可將它亞克隆入缺乏上述位點的載體中。
質(zhì)粒pUC18僅含1個EcoRⅠ位點，缺乏NcoⅠ位點。用EcoRⅠ和BamH1(均在多克隆位點)酶切pUC18后，用Klenow聚合酶切成平端，然后自連接。用EcoRⅠ-ScaⅠ雙酶切驗證正確的缺失。修飾過的載體稱為pUCΔBE，它含有用于將構建體亞克隆的單一XbaⅠ位點。隨后，將含有該構建體的pERE的5kbXbaⅠ片段連入修飾過的載體的上述位點。該質(zhì)粒稱之為pUCERE。PWMO的構建在pUCERE的ERE5’端和XbaⅠ位點的3’端有NcoⅠ和EcoRⅠ位點，此位點是將質(zhì)粒亞克隆入逆轉錄病毒載體中所必需的。該質(zhì)粒還含有一個位于β-半乳糖苷酶基因內(nèi)的額外EcoRⅠ位點，這就需要運用部分酶切策略。pUCERE用EcoRⅠ部分酶切，并分離出線性帶。該DNA用NcoⅠ酶切，從低熔點膠中回收8kb片段，用標準方法分離pCAT-增強子的247bp的EcoRⅠ-NcoⅠ片段，將其連至pUCERE上。用Xbal-BglⅡ雙酶切驗證正確的重組體。此質(zhì)粒稱pWMO，在其5kb的XbaⅠ片段上含有被轉基因的全部元件。pBCWM的構建pWMO和pSW272均可將氨芐青霉素抗性賦予宿主。為了在亞克隆入氨芐青霉素抗性的REV載體時降低背景質(zhì)粒的水平，將pWMO的5kb插入?yún)^(qū)克隆到購自Stratagene(La Jolla,CA)的pBCSK+的單一XbaⅠ位點上，后者可將氯霉素抗性賦予宿主。pWMO用XbaⅠ酶切，并從低熔點膠上分離5kb片段。pBCSK+用XbaⅠ酶切，然后去磷酸化，再用瓊脂糖純化。將載體與插入片段連接，通過用XbaⅠ酶切在含氯霉素(34μg/ml)的LB培養(yǎng)板上生長的克隆的培養(yǎng)物來驗證正確的重組體。在氯霉素抗性背景上該質(zhì)粒含有完整的表達載體，其可插入到復制缺陷型逆轉錄病毒載體上。
具體實施例2-逆轉錄病毒載體設計與構建逆轉錄病毒載體設計pSW272質(zhì)粒(Emerman和Temin，細胞(Cell)39:459-467)含有一個脾壞死病毒(SNV)，亦即現(xiàn)在的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(REV)的缺失突變體。質(zhì)粒包含的原病毒含有LTR、包裝序列及可作為檢測病毒滴度的選擇性標志的胸苷激酶基因及其啟動子。胸苷激酶啟動子5′端有Xba Ⅰ單一位點。在以前研究中，將新霉素磷酸轉移酶插入到此附近(在一個HindⅢ位點中)產(chǎn)生了另一個構建體pME111(Emermam和Temin，細胞(Cell)39:459-467(1984))，并成功地用此構件產(chǎn)生了一種轉基因雞(Bosselman，等，科學(Science)243:533-535(1989))。在同一研究中，將編碼雞生長激素的基因克隆入pSW272中，結果轉基因雞內(nèi)的循環(huán)性生長激素水平顯著高于非轉基因對照組。為使其更好地用作表達載體，將pSW272進行修飾。
修飾逆轉錄病毒結構的目的包括用賦予潮霉素B抗性的基因代替胸苷激酶基因(這樣就不再需要共轉染，可是仍需對潮霉素基因末端重新設計)；去除引導潮霉素基因的5′啟動子和其多聚腺苷酸化信號(這樣可產(chǎn)生更穩(wěn)定的結構)；提供一個在潮霉素基因3端的XbaⅠ信號以用于表達載體的插入。
分三階段重新構建pSW272。第一階段是刪除皰疹病毒胸苷激酶的啟動子和結構基因，用一合成的接頭代替之。該連接子含有以后操作所需的位點，包括可允許pBCWM內(nèi)5kb的表達構建體插入的位于3′端的單一XbaⅠ位點。第二階段是將接頭導入潮霉素抗性基因的5′和3′端，以使在該基因末端更具體地構建控制序列。第三階段對四種不同排列的控制序列檢測穩(wěn)定轉染C3細胞系的能力。選擇可穩(wěn)定轉染C3細胞系的含最少控制序列的排列作為優(yōu)選的原病毒載體。
逆轉錄病毒載體pSW272含有網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(REV)的長末端重復序列(LTR)，以及由其自身啟動子引導的選擇性標志胸苷激酶(TK)。LTR位于原病毒末端，有啟動子的功能。
就其自身而言，pSW272是一個穩(wěn)定的結構，此處穩(wěn)定是指可從基因組產(chǎn)生無內(nèi)在缺失的全長逆轉錄病毒。選擇性標志可用于檢測TK-細胞內(nèi)的逆轉錄病毒滴度，但無助于轉染用來產(chǎn)生逆轉錄病毒所必需的輔助細胞。
另外，將表達載體插入pSW272然后將整個構建體轉染入C3細胞系時會出現(xiàn)一些問題。此時構建體的結構含有兩個內(nèi)在的啟動子。在此情況下，5′端或左側啟動子(此例中為卵白蛋白啟動子)并不穩(wěn)定，也就是說用該構建體轉染后的細胞所產(chǎn)生的逆轉錄病毒在此區(qū)中經(jīng)常缺失(Emerman和Temin，病毒學雜志(J.Virology)50(1):42-49)。
同一研究還證明，在此處的單個結構基因是穩(wěn)定的，可由LTR引導表達，從而不再需要啟動子。既然此基因實際上可為任何結構基因，它也可以為選擇性標志。C3包裝細胞系有內(nèi)源性的TK活性，因此必須將其與帶有潮霉素B抗性的質(zhì)粒共轉染。為產(chǎn)生更完善的結構，將編碼潮霉素B磷酸轉移酶的基因克隆到逆轉錄病毒載體上。
然后在單一XbaⅠ位點插入表達載體，產(chǎn)生一個穩(wěn)定結構，不再需要共轉染但仍可滴定CEF細胞內(nèi)的病毒。
逆轉錄病毒載體的構建pREVΔ的修飾圖3為逆轉錄病毒載體的構建示意圖。胸苷激酶的啟動子和結構基因位于2kb的XbaⅠ-XmaⅠ片段上，在pSW272中二者都是單一的。用XbaⅠ和XmaⅠ酶切pSW272，在低熔點膠上回收較大片段(約7kb)。將上述片段與一段含有5個限制性位點的合成寡聚核苷酸連接。用ClaⅠ酶切來驗證產(chǎn)生的構建體pREVΔ，因為ClaⅠ可識別合成的接頭內(nèi)部的一個位點和原病毒DNA外部的另一個位點。
潮霉素B磷酸轉移酶基因的修飾pREP4的修飾購自Invitrogen的pREP-4質(zhì)粒上含有潮霉素B磷酸轉移酶基因。然而在潮霉素B磷酸轉移酶基因的5′端和3′端均存在問題。在5′端，起始密碼子周圍有一不利序列，具體說是在第二個框架外上游4bp處的第二個起始密碼。3′端含有可影響逆轉錄病毒滴度的多聚腺苷酸化信號和需被切除的來自Raus肉瘤病毒(RSV)的LTR。3′端還缺乏用以產(chǎn)生所需構建體的適宜限制性位點，通過重新設計，將這些位點包含入內(nèi)。
質(zhì)粒用其控制信號的性質(zhì)命名。例如，含有一個啟動子和一個多聚腺苷酸化信號的構建體稱為p++。類似地，含有一個啟動子但無多聚腺苷酸化信號的質(zhì)粒稱為p+-。p++的構建用合成的雙鏈寡聚物修飾潮霉素B磷酸轉移酶基因的3′末端。圖12示意了Hyg基因3′端的修飾。在此基因內(nèi)部，距離終止密碼子60bp處有單一ScaⅠ位點(見圖12)。將包含ScaⅠ位點、潮霉素標記基因的C末端密碼子和終止密碼子、一個HindⅢ位點以及NsiⅠ和SalⅠ的末端的一段合成寡聚核苷酸克隆至pREP4的NsiⅠ和SalⅠ位點。用HindⅢ-NruⅠ雙酶切驗證正確的重組體。并稱之為p++。p+-的構建用ScaⅠ將p++部分酶切，在低熔點膠上回收6.3kb的片段，使其自身連接，產(chǎn)生一個除終止密碼子外無3′控制元件的潮霉素基因構建體(見圖12)。用ScaⅠ-ClaⅠ雙酶切驗證正確的重組體，該重組體稱為p+-。p-+和p-的構建用類似方法修飾N端密碼子。AflⅢ在p++中為單一位點，恰位于潮霉素B磷酸轉移酶基因起始密碼子的5′端。一個AatⅡ位點位于潮霉素基因內(nèi)25個堿基處，使AflⅢ-AatⅡ雙酶切便于切除啟動子。p++中AatⅡ位點并非單一，所以使用了一個雙酶切策略。先用ClaⅠ和AatⅡ酶切p++，再在一個單獨反應中用ClaⅠ和AflⅢ酶切。將酶切產(chǎn)物走低熔點膠，回收5.5kb的ClaⅠAatⅡ產(chǎn)物和2.4kb的Cla AflⅢ產(chǎn)物。用一合成寡聚核苷酸將這兩段DNA連接起來(見圖13)得到p-+。通過BclⅠ Alw N1雙酶切和序列分析來驗證正確的重組體，同樣方式處理質(zhì)粒p+-得到質(zhì)粒p-。
單獨對p++和p+-進行基因N端部分的操作，所產(chǎn)生的四種構建體包括了控制信號的所有排列組合，分別為1)有啟動子和poly A信號--位于p++的NruⅠ-HindⅢ片段上；2)有啟動子無poly A信號--位于p+-的NruⅠ-HindⅢ片段上；3)無啟動子有poly A信號--位于p-+的BclⅠ-HindⅢ片段上；4)無啟動子無poly A信號--位于p-的BclⅠ-HindⅢ片段上。
帶有啟動子的片段(上述1和2)被克隆入pREVΔ多克隆位點的SmaⅠ(XmaⅠ)和HindⅢ位點上。由于總要考慮到不完全酶切后的重新環(huán)化，將pREVΔ質(zhì)粒在三個位點酶切SmaⅠ，HindⅢ和AccⅢ。從低熔點膠上回收得到的2個有合適長度的片段確保了對多克隆位點內(nèi)兩個位點的酶切，在一個三分子連接反應中將上述片段連至NruⅠ-HindⅢ片段上，可容易地產(chǎn)生所需質(zhì)粒。這些質(zhì)粒稱為p++R和p+-R。
用類似方法將無啟動子的潮霉素磷酸轉移酶基因克隆入REV中。用BclⅠ和HindⅢ將潮霉素構建體(p-+和p-)酶切后，在一個三分子連接反應中將其克隆到經(jīng)凝膠純化的pREVΔ的BclⅠ、HindⅢ和AccⅢ片段上，稱為p-+R和p--R。
按下述將表達載體插入這些逆轉錄病毒載體。每個逆轉錄病毒載體都含有一個單一XbaⅠ位點。合適的質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ切開、去磷酸化并進行凝膠純化。pBCWM包含的表達載體是位于一氯霉素抗性質(zhì)粒上的5kb的XbaⅠ片段。pBCWM經(jīng)XbaⅠ酶切，從低熔點膠上回收得到的5kb片段，將其連至合適的逆轉錄病毒載體上。通過XbaⅠ酶切來驗證正確的重組體，并用EcoRⅠ酶切來檢查方向。這些質(zhì)粒用它們的逆轉錄病毒載體命名，再加上添加的酶和克隆編號。例如p++RE1即為，有啟動子、多聚腺苷酸化信號、在REV上并有方向1的表達載體。
具體實施例3-基因轉移方法1對一種給定的逆轉錄病毒載體，把兩個方向的構建體中的每一個都轉染入C3細胞系，篩選穩(wěn)定的克隆。從克隆中分離出DNA并用Southern印跡法對整合的完整的原病毒DNA進行分析。在經(jīng)潮霉素抗性篩選的CEF細胞內(nèi)擴增及分析用于逆轉錄病毒的適宜的克隆。產(chǎn)生高滴度的克隆用于產(chǎn)生逆轉錄病毒，其通過過濾及/或離心使之進一步濃縮。
當找到可產(chǎn)生高滴度的完整病毒DNA的克隆時，將其注射入卵中，如美國專利No.5,162,215和Bosselman,R.A.等科學(Science)243:533-535(1989)所述，在此引入作為參考。新排下的O系SPF卵獲自SPAFAS(Preston,CT)，保持20℃?zhèn)确胖辽?個小時。卵的頂部用70％乙醇預處理并在空氣中干燥。然后用一個配有鋼毛口的Dremmel motool把殼打開口。在囊胚層下方顯微注射入15～25微升含逆轉錄病毒載體的溶液。封好卵口并在Humidaire孵箱中溫育直至孵出。
孵出10天后，采集雞血，用Southern印跡和PCR檢測基因組中是否存在病毒DNA。待所有的雞發(fā)育成熟后，檢測這些嵌合雞的卵中有無β-半乳糖苷酶，并用Southern印跡法檢測公雞精液中的病毒DNA。精液陽性的公雞用來產(chǎn)生真正的雜合轉基因雞-G2雞。
方法2把pBCWM的5 kb插入?yún)^(qū)(表達載體)用XbaⅠ酶切、去磷酸化、并在低溶點凝膠上純化后，連至pREVΔ或p+-上。通過XbaⅠ酶切來篩選插入的克隆，并用EcoRⅠ酶切來檢測插入方向。
在一個6孔板(孔徑35mm)上以每孔2-3×105個細胞的濃度接種C3細胞并在37℃,10％CO2條件下培養(yǎng)過夜，所用培養(yǎng)基DMEM內(nèi)包含有高濃度葡萄糖及L-谷氨酰胺、10mM HEPES、7％小牛血清、400μg/mlG-418、100μg/ml慶大霉素、5μg/ml兩性霉素(兩性霉素B)、100單位/ml青霉素G、100μg/ml硫酸鏈霉素。按照制造商說明，以1.5μgDNA:8μl脂質(zhì)轉染胺的比例用脂質(zhì)轉染胺試劑(Gibco LifeTechonologies)轉染細胞。5個小時后抽吸掉轉染培養(yǎng)基，換為含7％小牛血清和HEPES的0.5mlDMEM。溫育48小時后除去培養(yǎng)基，用于顯微注射或通過超濾法用截留分子量50kd的濾膜將培養(yǎng)基濃縮20倍后再用于顯微注射。
新排下的白色來亨(leghorn)雞的受精卵SPF獲自SPAFAS，將其側放至少5個小時。用一配有鋼切割頭的Dremmel mototool從卵的最頂端完整切下一塊約0.5cm2的五角形蛋殼(113部分)。用一18號注射針切下殼膜。微量移液管由Sutter牽引器牽引，用剃刀片修整，并在顯微鏡下檢查其直徑和尖的角度。用Narishige顯微操縱器(MN-151型)和顯微注射器(IM-6型)將15至20μl培養(yǎng)基注入胚下空隙中。孔由供體膜補蓋，該膜來自在含有上述濃度青霉素G和硫酸鏈霉素的PBS中短暫浸泡的卵的同一區(qū)域。把切下的蛋殼放到供體膜上面，空氣干燥10分鐘。用DUCO粘和劑封好邊緣，空氣干燥至少30分鐘。然后將卵放入Humidaire溫箱中按照廠家說明孵育。
從上述描述中本領域專業(yè)技術人員可以理解的是，根據(jù)本發(fā)明中的教導可以以多種形式實施。因此，盡管采用具體實例描述了本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍不應僅限于此，因為對本專業(yè)人員來說，研究附圖、說明及下列權利要求后便會發(fā)現(xiàn)其它修飾是顯而易見的。
在此引用的所有專利和其他出版物均被明確地收入?yún)⒖嘉墨I。
Sequence ID No.權利要求
1．一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體，它包括a)一種被轉基因；和b)被可操縱地連接到被轉基因上且能引導被轉基因產(chǎn)物在鳥類卵清中合成的控制元件，其中控制元件包括一種啟動子、一段5’非翻譯區(qū)和一段信號序列。
2．權利要求1的載體，其中復制缺陷型逆轉錄病毒載體來自REV-A。
3．權利要求1的載體，其中啟動子選自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵類粘蛋白啟動子及其組合。
4．權利要求1的載體，其中鳥類為雞。
5．權利要求1的載體，其中控制元件還包括一種增強子。
6．權利要求3的載體，其中啟動子包括一種卵白蛋白啟動子。
7．權利要求5的載體，其中增強子包括一種類固醇激素應答元件。
8．權利要求5的載體，其中增強子是一種病毒增強子。
9．權利要求8的載體，其中增強子是SV40的一部分。
10．一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體，它包括a)一種被轉基因；和b)被可操縱地連接到被轉基因上且能引導被轉基因產(chǎn)物在鳥類卵黃中合成的控制元件，其中控制元件包括一種啟動子、一段5’非翻譯區(qū)、一段信號序列和一段吸收序列。
11．權利要求10的載體，其中復制缺陷型逆轉錄病毒載體來自REV-A．
12．權利要求10的載體，其中啟動子選自卵黃原蛋白和載脂蛋白A啟動子及其組合。
13．權利要求10的載體，其中的鳥類為雞。
14．權利要求10的載體，其中控制元件還包括一種增強子。
15．權利要求14的載體，其中增強子包括一種類固醇激素應答元件。
16．權利要求14的載體，其中增強子是一種病毒增強子。
17．權利要求16的載體，其中增強子是SV40的一部分。
18．一種將一被轉基因轉移至雞胚細胞中的方法，其包括把復制缺陷型逆轉錄病毒載體導入細胞內(nèi)的步驟，其中的載體包括被轉基因和被可操縱地連接到該基因上且能引導被轉基因產(chǎn)物在卵清中合成的控制元件，其中控制元件包括一種啟動子、一段5’非翻譯區(qū)和一段信號序列。
19．權利要求18的方法，其中復制缺陷型逆轉錄病毒載體來自REV-A。
20．權利要求18的方法，其中控制元件還包括一種增強子。
21．權利要求18的方法，其中啟動子選自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵類粘蛋白啟動子及其組合。
22．權利要求20的方法，其中增強子包括一種類固醇激素應答元件。
23．權利要求20的方法，其中增強子是一種病毒增強子。
24．權利要求23的方法，其中增強子是SV40的一部分。
25．一種將一被轉基因轉移到雞胚細胞中的方法，其包括把復制缺陷型逆轉錄病毒載體導入細胞內(nèi)的步驟，其中的載體包括被轉基因和被可操縱地連接到該基因上且能引導該被轉基因產(chǎn)物在卵黃中合成的控制元件，其中控制元件包括一種啟動子、一段5’非翻譯區(qū)、一段信號序列和一段吸收序列。
26．權利要求25的方法，其中復制缺陷型逆轉錄病毒載體來自REV-A。
27．權利要求25的方法，其中控制元件還包括一種增強子。
28．權利要求25的方法，其中啟動子選自卵黃原蛋白和載脂蛋白A啟動子及其組合。
29．權利要求27的方法，其中增強子包括一種類固醇激素應答元件。
30．權利要求27的方法，其中增強子是一種病毒增強子。
31．權利要求30的方法，其中增強子是SV40的一部分。
32．一種產(chǎn)生轉基因雞的方法，包括下列步驟a)在被抑制在X階段且含有胚胎的雞卵上打一開口，暴露出囊胚層；b)經(jīng)開口把溶液顯微注射入囊胚層周圍的區(qū)域，該溶液中含有復制缺陷型逆轉錄病毒載體，該載體包括一種被轉基因和被可操縱地連接到該基因上且能引導該被轉基因產(chǎn)物在卵清中合成的控制元件，其中控制元件包括一種啟動子、一段5’非翻譯區(qū)和一段信號序列；c)顯微注射完畢密封開口；并d)溫育該卵至雞孵出。
33．權利要求32的方法，其中復制缺陷型逆轉錄病毒載體來自REV-A。
34．權利要求32的方法，其中控制元件還包括一種增強子。
35．權利要求32的方法，其中啟動子選自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵類粘蛋白啟動子及其組合。
36．權利要求34的方法，其中增強子包括一種類固醇激素應答元件。
37．權利要求34的方法，其中增強子是一種病毒增強子。
38．權利要求37的方法，其中增強子是SV40的一部分。
39．一種產(chǎn)生轉基因雞的方法，包括下列步驟a)在不超過7日齡且含有胚胎的雞卵上打一開口，暴露囊胚層；b)經(jīng)開口把溶液顯微注射入囊胚層周圍的區(qū)域，該溶液中含有復制缺陷型逆轉錄病毒載體，該載體包括一種被轉基因和被可操縱地連接到該基因上且能引導該被轉基因產(chǎn)物在卵黃中合成的控制元件，其中控制元件包括一種啟動子、一段5’非翻譯區(qū)、一段信號序列和一段吸收序列；c)顯微注射完畢密封開口；并d)溫育該卵至雞孵出。
40．權利要求39的方法，其中復制缺陷型逆轉錄病毒載體來自REV-A。
41．權利要求39的方法，其中控制元件還包括一種增強子。
42．權利要求39的方法，其中啟動子選自卵黃原蛋白和載脂蛋白A啟動子及其組合。
43．權利要求41的方法，其中增強子包括一種類固醇激素應答元件。
44．權利要求41中的方法，其中增強子是一種病毒增強子。
45．權利要求44的方法，其中增強子是SV40的一部分。
全文摘要
提供了用以將遺傳物質(zhì)導入雞或其它鳥類細胞中的載體和方法。更具體而言,提供了用以將一種被轉基因轉移入雞胚細胞中,從而產(chǎn)生一種該被轉基因可在其輸卵管內(nèi)表達并且被轉基因產(chǎn)物可分泌入其卵及/或其后代中的轉基因雌禽的載體和方法。在一種優(yōu)選實施方案中,該被轉基因產(chǎn)物被分泌入卵清中。
文檔編號C07H21/00GK1225127SQ97196343
公開日1999年8月4日 申請日期1997年6月6日 優(yōu)先權日1996年6月12日
發(fā)明者W·麥卡瑟 申請人:密執(zhí)安州立大學執(zhí)行理事會, 基因工程責任有限公司