專利名稱：Epothilone C、D、E和F,其制備方法,以及作為細(xì)胞抑制劑和植物保護(hù)劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及epothilone C、D、E和F，其制備方法，以及在制備治療性組合物和用于植物保護(hù)之組合物中的應(yīng)用。Epothilone C和D根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及Epothilone(C和D)，它們是如下得到的(a)在吸附樹脂存在下以本領(lǐng)域已知的方式培養(yǎng)Sorangiumcellulosum DSM 6773，(b)從培養(yǎng)物中取出吸附樹脂，并用水/甲醇混合物洗滌，(c)用甲醇淋洗經(jīng)洗滌的吸附樹脂，然后濃縮洗脫液，得到粗提物，(d)用乙酸乙酯提取上述得到的濃縮物，濃縮提取物，并在甲醇和己烷之間分配，(e)濃縮甲醇相，得到殘液，該濃縮物在Sephadex柱上進(jìn)行分步提取，(f)得到包含所用微生物之代謝產(chǎn)物的提取部分，(g)在C18反相柱上用甲醇/水混合物對(duì)上述得到的部分進(jìn)行色譜分離，并順序得到-包含Epothilone A的第一部分，-包含Epothilone B的第二部分，-包含第一種其它Epothilone的第三部分，-包含第二種其它Epothilone的第四部分；然后分離(h1)上述第三部分中的第一種其它Epothilone；和(h2)上述第四部分中的第二種其它Epothilone。
本發(fā)明還涉及經(jīng)驗(yàn)式為C26H39NO5S的Epothilone(C)，其特征在于具有如表1所示的1H-和13C-NMR光譜。
本發(fā)明還涉及以下式的Epothilone C
Epothilone C:R=H。
本發(fā)明還涉及經(jīng)驗(yàn)式為C27H41NO5S的Epothilone(D)，其特征在于具有如表1所示的1H-和13C-NMR光譜。
本發(fā)明還涉及以下式的Epothilone D
Epothilone D:R=CH3。
Epothilone C和D可用于制備下式1的化合物，其衍生化過程可參考WO-A-97/19086中描述的衍生法。
在上式1中R=H,C1-4-烷基；R1、R2、R3、R4、R5=H,C1-6-烷基，C1-6-?；S氧基，C1-4-三烷基甲硅烷基，芐基，苯基，C1-6-烷氧基，C6-烷基-、羥基-和鹵素-取代的芐基或苯基；R1-R5基團(tuán)中的兩個(gè)也可合并形成基團(tuán)-(CH2)n-(其中n=1-6)，基團(tuán)中包含的烷基或酰基是直鏈或支鏈基團(tuán)；Y和Z可相同或不同，分別是氫，鹵素，如F、Cl、Br或I，假鹵素，如-NCO、-NCS、或-N3,OH,O-(C1-6)-?；?，O-(C1-6)-烷基，O-芐氧基；Y和Z也可是環(huán)氧化物中的O原子，但不要求保護(hù)epothilone A和B，或者形成C=C雙鍵中的一個(gè)C-C鍵。
因此，12,13-雙鍵可選擇性地進(jìn)行-氫化，例如經(jīng)催化或用二亞胺，所得到的式1化合物中Y=Z=H；或者-環(huán)氧化，例如用二甲基二環(huán)氧乙烷或過酸，得到的式1化合物中Y與Z=-O-，或者-轉(zhuǎn)化為二鹵化物、二假鹵化物或二疊氮化物，得到的式1化合物中Y和Z=鹵素、假鹵素或N3。EpothiloneE和F根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及Epothilone A的生物轉(zhuǎn)化體，該生物轉(zhuǎn)化體是如下得到的(a)在吸附樹脂存在下按本領(lǐng)域已知的方式培養(yǎng)Sorangiumcellulosum DSM 6773，取出吸附樹脂，如果需要，用Epothilone A的甲醇溶液處理全部或部分經(jīng)分離的培養(yǎng)物；(b)用Epothilone A處理的培養(yǎng)物進(jìn)行溫育，然后用吸附樹脂處理；(c)從培養(yǎng)物中分離吸附樹脂，用甲醇淋洗，濃縮洗脫液，得到粗提物；(d)在乙酸乙酯和水之間分配上述粗提物，分離出乙酸乙酯相，并濃縮至油狀；
(e)在以下條件對(duì)上述油狀物進(jìn)行反相色譜分離柱材料Nucleosil 100C-18 7μm柱尺寸250×16mm洗脫劑甲醇/水=60∶40流速10 ml/min并分離出含有生物轉(zhuǎn)化體的部分，該部分可在254nm處通過UV消光來檢測(cè)，其Rt值為20min，然后分離所述生物轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明還涉及該類型之Epothilone A的生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(a)中培養(yǎng)物培養(yǎng)3或4或更多天時(shí)分離該培養(yǎng)物而得到的。
本發(fā)明還涉及該類型之Epothilone A的生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(b)中進(jìn)行溫育1或2或更多天而得到的。
本發(fā)明還涉及經(jīng)驗(yàn)式為C26N39NO7S的化合物，其特征在于具有以下1H-NMR光譜(300MHz,CDCl3):δ=2.38(2-Ha),2.51(2-Hb),4.17(3-H),3.19(6-H),3.74(7-H),1.30-1.70(8-H,9-H2,10-H2,11-H2),2.89(12-H),3.00(13-H),1.88(14-Ha),2.07(14-Hb),5.40(15-H),6.57(17-H),7.08(19-H),4.85(21-H2),1.05(22-H3),1.32(23-H3),1.17(24-H3),0.97(25-H3),2.04(27-H3)。
本發(fā)明還涉及下式的化合物(Epothilone E)
Epothilone E:R=H。
根據(jù)再一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及Epothilone B的生物轉(zhuǎn)化體，該生物轉(zhuǎn)化體是如下得到的(a)在吸附樹脂存在下按本領(lǐng)域已知的方式培養(yǎng)Sorangiumcellulosum DSM 6773，與吸附樹脂分離，如果需要，用Epothilone B的甲醇溶液處理全部或部分經(jīng)分離的培養(yǎng)物；(b)用Epothilone B處理的培養(yǎng)物進(jìn)行溫育，然后用吸附樹脂處理；(c)從培養(yǎng)物中分離吸附樹脂，用甲醇淋洗，濃縮洗脫液，得到粗提物；(d)在乙酸乙酯和水之間分配上述粗提物，分出乙酸乙酯相，并濃縮至油狀；(e)在以下條件對(duì)上述油狀物進(jìn)行反相色譜分離柱材料Nucleosil 100C-18 7μm柱尺寸250×16mm洗脫劑甲醇/水=60∶40流速10ml/min
并分離出含有生物轉(zhuǎn)化體的部分，該部分可在254nm處通過UV消光來檢測(cè)，其Rt值為24.5min，然后分離所述生物轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明還涉及該類型之Epothilone B的生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(a)中培養(yǎng)物培養(yǎng)3或4或更多天時(shí)分離該培養(yǎng)物而得到的。
本發(fā)明還涉及該類型之Epothilone B的生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(b)中進(jìn)行溫育1或2或更多天而得到的。
本發(fā)明還涉及經(jīng)驗(yàn)式為C27N41NO7S的化合物，其特征在于具有以下1H-NMR光譜(300MHz,CDCl3):δ=2.37(2-Ha),2.52(2-Hb),4.20(3-H),3.27(6-H),3.74(7-H),1.30-1.70(8-H,9-H2,10-H2,11-H2),2.78(13-H),1.91(14-H),2.06(14-Hb),5.42(15-H),6.58(17-H),7.10(19-H),4.89(21-H2),1.05(22-H3),1.26(23-H3),1.14(24-H3),0.98(25-H3),1.35(26-H3),2.06(27-H3)。
本發(fā)明還涉及下式的化合物(Epothilone F)
Epothilone F:R=CH3。制備和組合物根據(jù)本發(fā)明的化合物或epothilone可通過上述方法得到。
本發(fā)明還涉及用于在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和/或園藝中保護(hù)植物的組合物，該組合物由上述epothilone C、D、E和F中的一種或多種組成或者由一種或多種上述epothilone以及一種或多種常規(guī)載體和/或稀釋劑組成。
本發(fā)明最后涉及治療性組合物，該組合物由一種或多種上述化合物或者一種或多種上述化合物與一種或多種常規(guī)載體和/或稀釋劑組成。具體而言，這些組合物具有細(xì)胞毒性活性和/或產(chǎn)生免疫抑制作用和/或用于控制惡性腫瘤，它們特別優(yōu)選用作細(xì)胞抑制劑。
以下將通過一些具體實(shí)施例的描述來更為詳細(xì)地闡明和描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1Epothilone C和DA、根據(jù)epothilone基礎(chǔ)專利DE-B-4138042制備菌株和培養(yǎng)條件B、用DSM6773進(jìn)行制備如基礎(chǔ)專利所述進(jìn)行75升培養(yǎng)物的培養(yǎng)，并用于制備發(fā)酵罐的接種，該發(fā)酵罐中有700升制備培養(yǎng)基，其由0.8％淀粉、0.2％葡萄糖、0.2％大豆粉、0.2％酵母浸膏、0.1％CaCl2·2H2O、O.1％MgSO4·7H2O、8mg/l的Fe-EDTA組成，其pH=7.4，以及任選的15升Amberlite XAD-16吸附樹脂。發(fā)酵在30℃下持續(xù)7-10天，通氣量為0.1 NL/m3?？刂菩D(zhuǎn)速度，使pO2保持在30％。C、分離使用0.7m2、100目工藝過濾器從培養(yǎng)物中分離吸附樹脂，用3倍床體積的水/甲醇2∶1洗滌，由此除去極性的伴隨物質(zhì)。用4倍床體積的甲醇淋洗，得到粗提物，真空蒸發(fā)該粗提物，直至出現(xiàn)水相。用相同體積的乙酸乙酯提取該物質(zhì)三次。蒸發(fā)有機(jī)相，得到240g的粗提物，在甲醇和己烷之間分配該粗提物，以分離除去親脂性伴隨物質(zhì)。真空蒸發(fā)，從甲醇相中得到180g殘液。該殘液在Sephadex LH-20(柱20×100cm,20ml/min的甲醇)上分步提取，得到三個(gè)部分。Epothilone包含在總共72g的部分中，其洗脫保留時(shí)間為240-300min。為分離epothilone，在Lichrosorb RP-18(15μm，柱10×40cm，洗脫劑180ml/min甲醇/水65∶35)上將所述部分色譜分離為三個(gè)部分。在epothilone A和B后，洗脫出Rt=90-95min的epothilone C和Rt=100-110min的epothilone D，真空蒸發(fā)后分別得到0.3g的無色油狀物。D、物理性質(zhì)
Epothilone C:R=HEpothilone C:R=CH3Epothilone CC26H39NO5S(477)ESI-MS(正離子)478.5[M+H]+1H和13C見NMR表TLC:Rf=0.82TLC鋁箔60 F 254 Merck，洗脫劑二氯甲烷/甲醇=9∶1檢測(cè)254nm處的UV消光。用香草醛-硫酸試劑噴霧，加熱至120℃時(shí)為蘭灰色。
HPLC:Rt=11.5min柱Nucleosil 100C-18 7μm,125×4mm洗脫劑甲醇/水=65∶35流速1ml/min檢測(cè)二極管陣列Epothilone DC27H41NO5S(491)ESI-MS(正離子)492.5[M+H]+1H和13C見NMR表TLC:Rf=0.82TLC鋁箔60 F 254 Merck，洗脫劑二氯甲烷/甲醇=9∶1檢測(cè)254nm處的UV消光。用香草醛-硫酸試劑噴霧，加熱至120℃時(shí)為蘭灰色。
HPLC:Rt=15.3min柱Nucleosil 100C-18 7μm,125×4mm洗脫劑甲醇/水=65∶35流速1ml/min檢測(cè)二極管陣列表1:epothilone C和epothilone D在[D6]DMSO中于300MHz時(shí)的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)
*、**可以互換實(shí)施例2Epothilone A和由epothilone C得到的12,13-二環(huán)氧-epothilone A將50mg epothilone A溶解在1.5ml丙酮中，用1.5ml之0.07mol二甲基二環(huán)氧乙烷丙酮溶液處理。在室溫下靜置6小時(shí)后，真空蒸發(fā)混合物，用制備性HPLC在硅膠上(洗脫劑叔丁基甲醚/石油醚/甲醇33∶66∶1)分離殘留物。產(chǎn)量25mg的epothiloneA,Rt=3.5min(分析HPLC,7μm，柱4×250mm，洗脫劑如上，流速1.5ml/min)，和20mg的12,13-二環(huán)氧-epothilone A,Rt=3.7min,ESI-MS(正離子)m/e=494[M+H]+,1H-NMR([D4]甲醇)選擇信號(hào)δ=4.32(3-H),3.79(7-H),3.06(12-H),3.16(13-H),5.54(15-H),6.69(17-H),1.20(22-H),1.45(23-H)
12,13-二環(huán)氧-epothilone A:R=H實(shí)施例3Epothilone E和F,epothilone A和B的新型生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物制備菌株GBF在1985年7月從Zambesi河岸的土壤樣品中分離出Sorangiumcelluslosum So ce90菌株，并于1991年10月28日保藏在德國(guó)微生物保藏中心(German Collection for Microorganisms)中，保藏號(hào)為DSM6773。
產(chǎn)物特征和培養(yǎng)條件描述在Hlfe,G.；N.Bedorf,K.Gerth & HReichenbach:Epothilones，制備方法和包含該物質(zhì)的組合物(Epothilones,processes for their preparation and compostions containing them)。DE4138042 A1，于1993年5月27日公布。在發(fā)酵期間epothilone E和F的形成如下進(jìn)行典型的發(fā)酵反應(yīng)100升生物反應(yīng)器中裝入60升培養(yǎng)基(0.8％淀粉、0.2％葡萄糖、0.2％大豆粉、0.2％酵母浸膏、0.1％CaCl2·2H2O、0.1％MgSO4·7H2O、8mg/l的Fe-EDTA,pH7.4)。另外加入2％的吸附樹脂(XAD-16,Rohm & Haas)。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌(2小時(shí)，120℃)。用在相同培養(yǎng)基(另外加入50mM HEPES緩沖液，pH7.4)中于搖瓶(160rpm,30℃)中培養(yǎng)的預(yù)培養(yǎng)物10升進(jìn)行接種。在32℃下進(jìn)行發(fā)酵，攪拌器速度為500rpm，每小時(shí)每立方米引入0.2 Nl的空氣，通過添加氫氧化鉀使pH保持在7.4。發(fā)酵持續(xù)7-10天。在發(fā)酵期間，所形成的epothilone連續(xù)地結(jié)合在吸附樹脂上。在除去培養(yǎng)液(例如用工藝過濾器進(jìn)行過篩)后，用3倍床體積的水洗滌樹脂，然后用4倍床體積的甲醇淋洗。洗脫液濃縮至干，并放入700ml甲醇中。XAD洗脫液的HPLC分析相對(duì)于反應(yīng)器的起始體積(70升)，將洗脫液濃縮為100∶1。用Hewlett Packard的1090 HPLC裝置進(jìn)行分析。為分離組分，使用Machery-Nagel(Düren)的微孔柱(125/2 Nucleosil 120-5 C18)。使用水/乙腈由開始75∶25至5.5分鐘后50∶50的梯度進(jìn)行洗脫。該比例保持至第7分鐘，然后在第10分鐘時(shí)增加至100％乙腈。
在250nm的波長(zhǎng)、4nm的帶寬下進(jìn)行測(cè)量。在200-400nm的波長(zhǎng)范圍中測(cè)量二極管陣列光譜。在XAD洗脫液中，發(fā)現(xiàn)兩種新型物質(zhì)，Rt分別為5.29和5.91，它們的吸收光譜與epothilone A和B的相同(

圖1,E相應(yīng)于A,F相應(yīng)于B)。這些物質(zhì)在給定的條件下僅形成非常少的量。Epothilone A和B向epothilone E和F的生物轉(zhuǎn)化500ml的So ce90培養(yǎng)物，已培養(yǎng)4天，與吸附樹脂在一起，用該培養(yǎng)物進(jìn)行具體的生物轉(zhuǎn)化。250ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無菌的1升Erlenmeyer燒瓶中，而留下XAD。然后加入總共36mg epothilone A+14mg epothilone B的混合物的甲醇溶液，該燒瓶在振蕩架上于30℃、200rpm下溫育2天。Epothilone E和F的形成直接由10μl培養(yǎng)物的離心上清液來分析(圖2)。僅在有細(xì)胞時(shí)才發(fā)生轉(zhuǎn)化，而且取決于所用細(xì)胞的密度和時(shí)間。Epothilone A的轉(zhuǎn)化作用動(dòng)力學(xué)見圖3。EpothiloneE和F的分離為分離Epothilone E和F，合并三個(gè)生物轉(zhuǎn)化用搖瓶中的物料(見上)，然后與20ml XAD-16振搖1小時(shí)。過濾得到XAD，用200ml甲醇淋洗。真空蒸發(fā)洗脫液，得到1.7g的粗提物。該粗提物在30ml乙酸乙酯和100ml水之間分配。真空蒸發(fā)，從乙酸乙酯相中得到330mg的油狀殘留物，該殘留物在250×20mm的RP-18柱(洗脫劑甲醇/水58∶42,254nm檢測(cè))進(jìn)行5輪色譜分離。產(chǎn)量epothilone E:50mgF:10mgEpothilone E的生物作用在細(xì)胞培養(yǎng)物中，測(cè)定生長(zhǎng)降低50％時(shí)的濃度(IC50)，并與epothilone A進(jìn)行比較
Epothilone EC26H39NO7S(509)ESI-MS(正離子)510.3[M+H]+TLC:Rf=0.58TLC鋁箔60 F 254 Merck，洗脫劑二氯甲烷/甲醇=9∶1檢測(cè)254nm處的UV消光。用香草醛-硫酸試劑噴霧，加熱至120℃時(shí)為蘭灰色。
HPLC:Rt=5.0min柱Nucleosil 100C-18 7μm,250×4mm洗脫劑甲醇/水=60∶40流速1.2ml/min檢測(cè)二極管陣列1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=2.38(2-Ha),2.51(2-Hb),4.17(3-H),3.19(6-H),3.74(7-H),1.30-1.70(8-H,9-H2,10-H2,11-H2),2.89(12-H),3.00(13-H),1.88(14-Ha),2.07(14-Hb),5.40(15-H),6.57(17-H),7.08(19-H),4.85(21-H2),1.05(22-H3),1.32(23-H3),1.17(24-H3),0.97(25-H3),2.04(27-H3)Epothilone FC27H41NO7S(523)ESI-MS(正離子)524.5[M+H]+TLC:Rf=0.58
TLC鋁箔60F 254 Merck，洗脫劑二氯甲烷/甲醇=9∶1檢測(cè)254nm處的UV消光。用香草醛-硫酸試劑噴霧，加熱至120℃時(shí)為蘭灰色。
HPLC:Rt=5.4min柱Nucleosil 100C-18 7μm,250×4mm洗脫劑甲醇/水=60∶40流速1.2ml/min檢測(cè)二極管陣列1H-NMR光譜(300MHz,CDCl3):δ=2.37(2-Ha),2.52(2-Hb),4.20(3-H),3.27(6-H),3.74(7-H),1.30-1.70(8-H,9-H2,10-H2,11-H2),2.78(13-H),1.91(14-H),2.06(14-Hb),5.42(15-H),6.58(17-H),7.10(19-H),4.89(21-H2),1.05(22-H3),1.26(23-H3),1.14(24-H3),0.98(25-H3),1.35(26-H3),2.06(27-H3)。實(shí)施例4通過用Sorangium cellulosum So ce90生物轉(zhuǎn)化制備epothilone E和F1)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化為進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，使用Sorangium cellulosum So ce90的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物已在2％XAD 16吸附樹脂(Rohm & Haas,Frankfurt/M.)存在下于30℃、160rpm下振搖了4天。培養(yǎng)基具有以下組成(g/升蒸餾水)馬鈴薯淀粉(Maizena),8；葡萄糖(Maizena),8；脫脂大豆粉，2；酵母浸膏(Marcor),2；乙二胺四乙酸，鐵(Ⅲ)鈉鹽，0.008；MgSO4·7H2O,1；CaCl2·2H2O,1；HEPES,11.5。在高壓滅菌之前，用氫氧化鉀將pH調(diào)節(jié)為7.4。用不銹鋼篩網(wǎng)(篩孔寬200μm)過篩，由此從培養(yǎng)物中分離XAD。在10000rpm下離心10分鐘，使細(xì)菌沉積，將沉淀物重新懸浮在1/5的培養(yǎng)物上清液中。然后以0.5g/升的濃度將甲醇溶液中的epothilone A或epothilone B添加至濃縮細(xì)菌懸浮液中。如上所述進(jìn)一步培養(yǎng)培養(yǎng)物。為分析生物轉(zhuǎn)化作用，在所希望的時(shí)間取1ml樣品，加入0.1ml的XAD，然后在30下振搖樣品30分鐘。用甲醇淋洗XAD。濃縮洗脫液至干，然后再溶于0.2ml甲醇中。通過HPLC分析該樣品。
圖4是epothilone A向epothilone E轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)。
圖5是epothilone B向epothilone F轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)。2)通過生物轉(zhuǎn)化1g epothilone A來制備epothilone E在10升生物反應(yīng)器中，Sorangium cellulosum So Ce90菌株于30℃在8.5升上述培養(yǎng)基(但沒有XAD)中培養(yǎng)4天，旋轉(zhuǎn)速度為150rpm，并引入0.1vvm的空氣。
通過交叉流過濾將該培養(yǎng)物濃縮至3升。為此，使用0.6m2的膜，其孔徑為0.3μm。
將經(jīng)濃縮的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至一個(gè)4升的生物反應(yīng)器中，然后加入1gepothilone A在10ml甲醇中的溶液。進(jìn)一步培養(yǎng)該培養(yǎng)物21.5小時(shí)。溫度為32℃，攪拌器速度為455rpm，空氣引入速率為61/min。在收集時(shí)，加入100ml的XAD，再將該混合物溫育1小時(shí)。過篩從細(xì)胞中分離XAD，并用甲醇完全洗脫。用HPLC分析經(jīng)濃縮的洗脫液。
生物轉(zhuǎn)化的平衡所用的epothilone A: 1000mg=100％21.5小時(shí)后回收的epothilone A:53.7mg=5.4％21.5小時(shí)后形成的epothilone E:661.4mg=66.1％完全分解的epothilone A: =28.5％實(shí)施例5測(cè)試本發(fā)明之epothilone對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物(表2)和促進(jìn)聚合反應(yīng)(表3)的作用。
表2用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的epothilone實(shí)驗(yàn)
表3用epothilone進(jìn)行的聚合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)至與對(duì)照相比為半最大聚合反應(yīng)時(shí)的時(shí)間
標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用0.9mg的微管蛋白/ml和1μm樣品濃度聚合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是體外實(shí)驗(yàn)，其使用從豬腦中純制的微管蛋白。用分光光度計(jì)進(jìn)行評(píng)估。促進(jìn)聚合反應(yīng)的物質(zhì)如epothilone降低達(dá)到半最大聚合反應(yīng)所需要的時(shí)間，即、時(shí)間越短，化合物的活性越高。w、x、y和z是四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，相對(duì)活性以最后一欄中對(duì)照的百分?jǐn)?shù)來表示；該值最低表明活性最佳。排名表與細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的值非常一致。
權(quán)利要求
1.Epothilone，它們是如下得到的(a)在吸附樹脂存在下以本領(lǐng)域已知的方式培養(yǎng)Sorangiumcellulosum DSM6773，(b)從培養(yǎng)物中取出吸附樹脂，并用水/甲醇混合物洗滌，(c)用甲醇淋洗經(jīng)洗滌的吸附樹脂，然后濃縮洗脫液，得到粗提物，(d)用乙酸乙酯提取上述得到的濃縮物，濃縮提取物，并在甲醇和己烷之間分配，(e)濃縮甲醇相，得到殘液，該濃縮物在Sephadex柱上進(jìn)行分步提取，(f)得到包含所用微生物之代謝產(chǎn)物的提取部分，(g)在C18反相柱上用甲醇/水混合物對(duì)上述得到的部分進(jìn)行色譜分離，并順序得到-包含Epothilone A的第一部分，-包含Epothilone B的第二部分，-包含第一種其它Epothilone的第三部分，-包含第二種其它Epothilone的第四部分；然后分離(h1)上述第三部分中的第一種其它Epothilone；和(h2)上述第四部分中的第二種其它Epothilone。
2.經(jīng)驗(yàn)式為C26H39NO5S的Epothilone，其特征在于具有如表1所示的1H-和13C-NMR光譜。
3.以下式的Epothilone C
Epothilone C:R=H。
4.經(jīng)驗(yàn)式為C27H41NO5S的Epothilone，其特征在于具有如表1所示的1H-和13C-NMR光譜。
5.以下式的Epothilone D
Epothilone D:R=CH3。
6.Epothilone A的生物轉(zhuǎn)化體，其是如下得到的(a)在吸附樹脂存在下按本領(lǐng)域已知的方式培養(yǎng)Sorangiumcellulosum DSM 6773，取出吸附樹脂，如果需要，用Epothilone A的甲醇溶液處理全部或部分經(jīng)分離的培養(yǎng)物；(b)溫育用Epothilone A處理的培養(yǎng)物，然后用吸附樹脂處理；(c)從培養(yǎng)物中分離吸附樹脂，用甲醇淋洗，濃縮洗脫液，得到粗提物；(d)在乙酸乙酯和水之間分配上述粗提物，分出乙酸乙酯相，并濃縮至油狀；(e)在以下條件對(duì)上述油狀物進(jìn)行反相色譜分離柱材料Nucleosil 100C-18 7μm柱尺寸250×16mm洗脫劑甲醇/水=60∶40流速10ml/min并分離出含有生物轉(zhuǎn)化體的部分，該部分可在254nm處通過UV消光來檢測(cè)，其Rt值為20min，然后分離所述生物轉(zhuǎn)化體。
7.如權(quán)利要求6所述的Epothilone A生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(a)中培養(yǎng)物培養(yǎng)3或4或更多天時(shí)分離該培養(yǎng)物而得到的。
8.如權(quán)利要求6或7所述的Epothilone A生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(b)中進(jìn)行溫育1或2或更多天而得到的。
9.經(jīng)驗(yàn)式為C26N39NO7S的化合物，其特征在于具有以下1H-NMR光譜(300MHz,CDCl3):δ=2.38(2-Ha),2.51(2-Hb),4.17(3-H),3.19(6-H),3.74(7-H),1.30-1.70(8-H,9-H2,10-H2,11-H2),2.89(12-H),3.00(13-H),1.88(14-Ha),2.07(14-Hb),5.40(15-H),6.57(17-H),7.08(19-H),4.85(21-H2),1.05(22-H3),1.32(23-H3),1.17(24-H3),0.97(25-H3),2.04(27-H3)。
10.下式的化合物(Epothilone E)
Epothilone E:R=H。
11.Epothilone B的生物轉(zhuǎn)化體，其是如下得到的(a)在吸附樹脂存在下按本領(lǐng)域已知的方式培養(yǎng)Sorangiumcellulosum DSM 6773，與吸附樹脂分離，如果需要，用Epothilone B的甲醇溶液處理全部或部分經(jīng)分離的培養(yǎng)物；(b)溫育用Epothilone B處理的培養(yǎng)物，然后用吸附樹脂處理；(c)從培養(yǎng)物中分離吸附樹脂，用甲醇淋洗，濃縮洗脫液，得到粗提物；(d)在乙酸乙酯和水之間分配上述粗提物，分出乙酸乙酯相，并濃縮至油狀；(e)在以下條件對(duì)上述油狀物進(jìn)行反相色譜分離柱材料Nucleosil 100C-18 7μm柱尺寸250×16mm洗脫劑甲醇/水=60∶40流速10ml/min并分離出含有生物轉(zhuǎn)化體的部分，該部分可在254nm處通過UV消光來檢測(cè)，其Rt值為24.5min，然后分離所述生物轉(zhuǎn)化體。
12.如權(quán)利要求11所述的Epothilone B生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(a)中培養(yǎng)物培養(yǎng)3或4或更多天時(shí)分離該培養(yǎng)物而得到的。
13.如權(quán)利要求11或12所述的Epothilone B生物轉(zhuǎn)化體，其是在步驟(b)中進(jìn)行1或2或更多天而得到的。
14.經(jīng)驗(yàn)式為C27N41NO7S的化合物，其特征在于具有以下1H-NMR光譜(300MHz,CDCl3):δ=2.37(2-Ha),2.52(2-Hb),4.20(3-H),3.27(6-H),3.74(7-H),1.30-1.70(8-H,9-H2,10-H2,11-H2),2.78(13-H),1.91(14-H),2.06(14-Hb),5.42(15-H),6.58(17-H),7.10(19-H),4.89(21-H2),1.05(22-H3),1.26(23-H3),1.14(24-H3),0.98(25-H3),1.35(26-H3),2.06(27-H3)。
15.下式的化合物(Epothilone F)
Epothilone F:R=CH3。
16.用于在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和/或園藝中保護(hù)植物的組合物，該組合物由如前述任一權(quán)利要求所述的化合物中的一種或多種組成或者由一種或多種所述化合物以及一種或多種常規(guī)載體和/或稀釋劑組成。
17.治療性組合物，其用作細(xì)胞抑制劑，由如前述任一權(quán)利要求所述的化合物中的一種或多種組成或者由一種或多種如前述任一權(quán)利要求所述的化合物以及一種或多種常規(guī)載體和/或稀釋劑組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及epothilone，特別是涉及式(Ⅰ)之epothilone C(R＝氫)和epothilone D(R＝甲基)以及式(Ⅱ)之epothilone E(R＝氫)和epothiloneF(R＝甲基)。本發(fā)明還涉及它們的制備方法，以及在制備治療劑和植物保護(hù)劑中的應(yīng)用，所述治療劑特別是細(xì)胞抑制劑。
文檔編號(hào)C07D417/06GK1237970SQ97199814
公開日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月18日
發(fā)明者漢斯·賴興巴赫, 格哈德·赫夫勒, 克勞斯·格特, 海因里希·施泰因梅茨 申請(qǐng)人:生物技術(shù)研究有限公司(Gbf)