專(zhuān)利名稱(chēng)：重組人紅細(xì)胞生成素制劑的制備生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用攜帶編碼人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的核苷酸序列的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，大規(guī)模生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的方法。特別是涉及以高產(chǎn)率為目的的分離和純化高比活性人促紅細(xì)胞生成素的方法。
人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)是一種主要由腎臟產(chǎn)生的分子量約36KD的糖蛋白。該蛋白質(zhì)作為一種正常激素，可有效地作用于骨髓干細(xì)胞，調(diào)節(jié)和刺激網(wǎng)織紅細(xì)胞及紅細(xì)胞的生成與分化，從而維持外周循環(huán)內(nèi)的正常紅細(xì)胞數(shù)量。因此臨床上可用于治療各種形式的貧血，特別是腎性貧血和因該激素產(chǎn)生不足而引起的紅細(xì)胞缺乏癥。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)NO.570,075(New york，University)和美國(guó)專(zhuān)利NO.4,677,195(Genetics Institute，Inc.)分別公開(kāi)了以反相免疫層析法從天然來(lái)源純化人促紅細(xì)胞生成素的方法，后者以反相高效液相層析法制備的紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)比活性為160,000 IU/280nm吸光率單位。中國(guó)專(zhuān)利CN85106191A(柯瑞英-艾格公司)公開(kāi)了利用真核細(xì)胞和原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)具有天然人促紅細(xì)胞生成活性的蛋白質(zhì)(人促紅細(xì)胞生成素)的方法。其中以反相高效液相法得到的以大腸桿菌表達(dá)的hEPO產(chǎn)物體內(nèi)活性只有120-720IU/mg蛋白質(zhì)，特別是該文獻(xiàn)中提到，發(fā)明人用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)獲得EPO產(chǎn)物體外和體內(nèi)活性分別為2589IU/ml和3089 IU/ml。另外，其表達(dá)產(chǎn)物的純度約95％，而且明確缺乏足夠的分子均一性。至于其所制備的人促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物的活性只是其“親代”的1/4-1/10。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0232 034公開(kāi)使用宿主人細(xì)胞(Hala細(xì)胞)作宿主發(fā)酵生產(chǎn)rhEPO的方法，其中提到了產(chǎn)物活性為490單位。PCT專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO88/00241，公開(kāi)使用COS-7(猴腎)和BHK(倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素基因的Apa I限制性片段的方法，雖然該文獻(xiàn)沒(méi)有描述表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化方法，但其實(shí)施例7中指出的分泌產(chǎn)物的比活為700單位/ml，估計(jì)有相當(dāng)于天然EPO的7800單位/ml蛋白質(zhì)的比活性。最后，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0236 059公開(kāi)了使用帶有neor選擇標(biāo)記基因的重組載體(線性轉(zhuǎn)導(dǎo)載體)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并以親和層析法純化EPO的方法，經(jīng)體外放射免疫法檢測(cè)證明促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的產(chǎn)量為100-1500單位/106細(xì)胞/天。
綜上所述，這些現(xiàn)有材料僅就實(shí)驗(yàn)室水平表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化手段而言，均不能獲得令人滿意的效果。特別是由實(shí)驗(yàn)室研究到工業(yè)化規(guī)模大批量生產(chǎn)過(guò)程，技術(shù)上存在本質(zhì)性的差異，不經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)期的創(chuàng)造性探索和大量的實(shí)驗(yàn)積累，盡管在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)成功地得到了所需產(chǎn)物，但要以高收率、低成本獲得高比活性的基因工程產(chǎn)品，如人促紅細(xì)胞生成素，真正實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的商品化并獲取應(yīng)有的利益將是不可能的。
迄今為止，已建立并在生產(chǎn)實(shí)踐中成功地使用了許多從天然來(lái)源或從以DNA重組技術(shù)制備的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞及其培養(yǎng)物中分離和純化所需的目的產(chǎn)物的方法，這些方法包括鹽析、超濾、電泳(如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦、毛細(xì)電泳等)、柱層析(如離子交換層析、凝膠層析、高效液相層析、親和層析等)。由于所需產(chǎn)物分子量大小、帶電性和分子電荷數(shù)目、親水性及等電點(diǎn)的不同，改變?cè)诜蛛x和純化產(chǎn)物時(shí)所需的方法或方法組合及它們的次序也將完全不同。因此在找到一套適合工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模使用的對(duì)重組菌株或細(xì)胞株的發(fā)酵培養(yǎng)條件，以提高產(chǎn)物表達(dá)效率，并且改進(jìn)分離和純化DNA重組產(chǎn)物，例如目前已在臨床應(yīng)用中證實(shí)其效果十分明確的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的方法，是一個(gè)本領(lǐng)域有待解決的問(wèn)題。
本發(fā)明通過(guò)采用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶編碼人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的核苷酸序列的真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞)表達(dá)系統(tǒng)，利用特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件及連續(xù)柱層析方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其技術(shù)方案要點(diǎn)包括以下步驟取凍存的生產(chǎn)細(xì)胞株，39℃水浴，在無(wú)菌操作下離心。棄上清后加入適量的含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在二氧化碳孵箱中37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)良好并貼滿培養(yǎng)瓶壁后，繼續(xù)傳代(傳三代)培養(yǎng)。用顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)，在細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用消化液將細(xì)胞消化，收集于接種瓶中。用于接種的細(xì)胞數(shù)量為2.5×106個(gè)/ml。
含人紅細(xì)胞生成素基因的重組細(xì)胞株的表達(dá)采用容積為5L的連續(xù)型細(xì)胞反應(yīng)器(以下簡(jiǎn)稱(chēng)細(xì)胞罐)，加入纖維素載體片(Disc)、PBS緩沖液(pH7.0)，連好管路，高壓滅菌1.5小時(shí)。待細(xì)胞罐冷卻至室溫后接入主機(jī)，并連接空氣、氧氣、二氧化碳、氮?dú)獾人姆N氣體。校正好pH電極和D0.電極后，排出細(xì)胞罐內(nèi)的PBS緩沖液，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，再將細(xì)胞接種液緩慢加入細(xì)胞罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)低于50rpm/分鐘，溫度為37℃，通入四種氣體，控制D0.50-80％，pH7.0，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)一段時(shí)間。然后提高轉(zhuǎn)數(shù)到80-100rpm/min，進(jìn)行細(xì)胞罐內(nèi)擴(kuò)增培養(yǎng)十天。(有血清培養(yǎng)基可有效刺激細(xì)胞的分化和增殖)。將含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的合成培養(yǎng)基，用連續(xù)灌流培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，應(yīng)用AFS軟件控制細(xì)胞的發(fā)酵條件，包括溫度、溶氧、pH值等。收獲的培養(yǎng)基于4-8℃低溫貯藏。本生產(chǎn)條件下收獲的培養(yǎng)基中hEPO的表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)到1萬(wàn)IU/ml。同時(shí)應(yīng)用無(wú)血清的合成培養(yǎng)基可降低純化過(guò)程中雜蛋白質(zhì)的含量，增加各層析色譜柱的容量，延長(zhǎng)其使用壽命，有效提高半成品的純度。)取收獲的培養(yǎng)基濾膜過(guò)濾，然后以一定的流速上CM親和層析柱(預(yù)先用NaCl-HAc-異丙醇活化，20mM Tris.HCl平衡緩沖液平衡)，再用平衡緩沖液平衡CM柱。采用0-2M NaCl-20mM Tris洗脫液以一定流速進(jìn)行梯度洗脫，收集有活性的洗脫峰裝入透析袋，在10mM Tris透析液中過(guò)夜透析。將已透析除鹽的蛋白質(zhì)溶液濾膜過(guò)濾，以一定的流速上DEAE離子交換層析柱(預(yù)先用10mM Tris平衡緩沖液平衡)。采用0-1M NaCl-Tris的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集有活性的洗脫峰，上RP-HPLC(RP-HPLC層析柱填料為C4，預(yù)先用乙腈-三氟乙酸平衡)層析柱，然后用10％的乙腈溶液平衡該層析柱，再用10-70％的乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫。收集有活性的洗脫峰，上凝膠層析柱(預(yù)先用20mM檸檬酸鹽緩沖液平衡)，再用20mM檸檬酸鹽緩沖液平衡并洗脫，收集有活性的洗脫峰(即hEPO)。取樣測(cè)定hEPO的比活、蛋白含量，經(jīng)質(zhì)檢合格后將hEPO中加入0.5％的人血白蛋白，無(wú)菌過(guò)濾后制成hEPO成品制劑。經(jīng)本工藝純化的rh-EPO，其比活可達(dá)到2×105IU/mg。
下面借助實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例一細(xì)胞的增殖取凍存細(xì)胞株，39℃水浴，無(wú)菌操作下離心(1000rpm×5分鐘)。棄上清后加入5ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(每10L含DMEM 135克，胎牛血清500ml，慶大霉素50萬(wàn)單位，葡萄糖13.5克，碳酸氫鈉24.5克)吹打均勻，接種于100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加10ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、含5％CO2的二氧化碳孵箱(Forma公司生產(chǎn))中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，貼滿培養(yǎng)瓶壁后，傳入四個(gè)500ml培養(yǎng)瓶中，并在細(xì)胞再次貼滿瓶壁時(shí)，傳入32瓶500ml的培養(yǎng)瓶。用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用消化液(每升含有EDTA0.2g，葡萄糖1g，胰酶2g，pH7.6)將細(xì)胞消化，收集于接種瓶中。用于接種的細(xì)胞數(shù)量為2.5×106個(gè)/ml，共900ml。
實(shí)施例二人紅細(xì)胞生成素的表達(dá)細(xì)胞罐采用容積為5L的連續(xù)型細(xì)胞反應(yīng)器(CELLIGEN PLUS，NBS公司制造)，加入150克纖維素載體片(Disc，LifeGen Co.生產(chǎn))、3.5L的PBS緩沖液(pH7.0)，連好管路，在121℃、15磅下高壓滅菌1.5小時(shí)。待細(xì)胞罐冷卻至室溫后接入主機(jī)，連接空氣、氧氣、二氧化碳和氮?dú)獾人姆N氣體，校正好pH電極和D0.電極。排出細(xì)胞罐內(nèi)的PBS緩沖液，加入2500ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，再將900ml細(xì)胞接種液緩慢加入細(xì)胞罐中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)數(shù)為50rpm/分鐘，通入四種氣體(氧氣、氮?dú)狻⒍趸細(xì)夂蛪嚎s空氣)，控制D0.50％，pH7.0，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)四小時(shí)。然后提高轉(zhuǎn)數(shù)到80rpm/分鐘，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)十天。將培養(yǎng)基更換成無(wú)血清的合成培養(yǎng)基(每10L含CHO-S-SFM-II9L，慶大霉素50萬(wàn)單位，胰島素1mM，轉(zhuǎn)鐵蛋白20nM，葡萄糖25克，碳酸氫鈉30.5克)，用連續(xù)灌流培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，應(yīng)用AFS軟件(NBS公司設(shè)計(jì)生產(chǎn))控制細(xì)胞發(fā)酵條件(溫度37℃、D0.40-80％、pH6.5-7.5，培養(yǎng)基灌流量為3L/天)，收獲液于4-8℃低溫下貯藏。
實(shí)施例三hEPO的純化取收獲培養(yǎng)基40L，用0.22um濾膜過(guò)濾，上樣于體積為2500ml的預(yù)先用1.4M NaCl-40％異丙醇-0.1MHAc 13000ml(pH3.0)活化，用10000ml三蒸水沖洗，最后用20mM Tris(pH7.0)10000ml平衡緩沖液平衡的CM Affi-Gel Blue Gel柱(BioRad公司生產(chǎn))，上樣流速為30ml/min上樣完畢，再用平衡緩沖液平衡柱體，洗掉不能吸附的雜蛋白。采用0-2M NaCl-20mM Tris(pH7.0)洗脫液進(jìn)行梯度洗脫吸附的蛋白質(zhì)，洗脫流速40ml/min。收集洗脫峰3000ml，蛋白含量為1mg/ml。將收集的蛋白溶液裝入透析袋，用10mM Tris.HCl(pH7.0)透析液過(guò)夜透析，按15倍體積計(jì)算，分四次換液。
將已透析除鹽的蛋白質(zhì)溶液用0.22um濾膜過(guò)濾，上樣于體積為2500ml的預(yù)先用l0mM Tris.HCl(pH7.0)50000ml平衡緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Parmacia公司生產(chǎn))，上樣流速為4ml/分鐘。上樣完畢，采用0-1M NaCl-Tris.HCl(pH7)的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為40ml/min。收集第三個(gè)洗脫峰1800ml，蛋白含量為0.37mg/ml，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后制成含hEPO的粗品準(zhǔn)備用于RP-HPLC的進(jìn)一步純化。
柱填料為C4(300A°、15um，Separation Group生產(chǎn))，柱體積為500ml的RP-HPLC(Warters公司生產(chǎn)，2000型)層析柱用10％的乙腈溶液(含0.1％三氟乙酸)平衡，流速為60ml/min。取1800ml粗品上樣，流速為15ml/min；上樣結(jié)束后用10％的乙腈溶液(含0.1％三氟乙酸)平衡C4柱。再用10-70％的乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫。收集有活性的洗脫峰330ml，蛋白含量為1.0mg/ml。
凝膠過(guò)濾采用的是Sephadex G-25柱(Pharmacia公司生產(chǎn))，裝柱體積3000ml，用20mM檸檬酸鹽緩沖液6000ml平衡，取RP-HPLC純化后的樣品上樣，流速為1ml/min。上樣完畢，再用20mM檸檬酸鹽緩沖液平衡并洗脫，收集洗脫峰250ml，蛋白含量為1.2mg/ml。取樣用酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，3550型)測(cè)定半成品中hEPO的比活，用紫外分光光度計(jì)(BECKMAN公司生產(chǎn)，DU-640型)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；經(jīng)質(zhì)檢合格后，加入0.5％的人血白蛋白并無(wú)菌過(guò)濾，制成hEPO成品。經(jīng)本生產(chǎn)工藝流程純化的hEPO，其比活可達(dá)到2×105IU/mg。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明的目的是提供一種在工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模上提高攜帶編碼人促紅細(xì)胞生成素或其突變蛋白之基因的真核宿主細(xì)胞的表達(dá)效率的方法，該方法包括在轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入適當(dāng)量胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、糖及碳酸氫鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基，且其中添加的胰島素量為1nM-10mM，轉(zhuǎn)鐵蛋白加入量0.1nM-100nM，微量元素硒加入量為1-1,000ppm，葡萄糖加入量為1-10克/升，碳酸氫鈉加入量為2-4克/升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，一種在工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模上純化由攜帶編碼人促紅細(xì)胞生成素基因或其突變蛋白基因的真核宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將終發(fā)酵液依次過(guò)親和層析柱、離子交換層析柱、反相高效液相層析柱和凝膠過(guò)濾層析柱。根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中在親和層析步驟中使用含0-2M NaCl梯度的20mM Tris.HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，以使該層析步驟后所得產(chǎn)物的濃度達(dá)到約8-12％(W/W)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中在離子交換層析步驟中，使用含0-1M NaCl梯度的Tris.HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，以使該層析步驟后所得產(chǎn)物的濃度達(dá)到約40-50％(W/W)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中反相高效液相層析步驟中使用含10-70(V/V)乙腈的三蒸水梯度洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，以使該層析步驟后所得產(chǎn)物的濃度達(dá)到95％(W/W)以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中凝膠過(guò)濾層析步驟中使用10-40mM檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡和洗脫，以使該層析步驟后所得EPO產(chǎn)物的純度達(dá)到100％(W/W)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大規(guī)模生產(chǎn)人紅細(xì)胞生成素的制劑方法。該方法包括用添加了胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,于特定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)攜帶人促紅細(xì)胞生成素DNA編碼序列的被轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,以獲得該蛋白質(zhì)產(chǎn)物的高表達(dá)。然后對(duì)富含人紅細(xì)胞生成素的收獲液依次進(jìn)行親和層析、離子交換、反相高效液相及凝膠過(guò)濾純化,以獲得純度高并具有高生物活性的人紅細(xì)胞生成素。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1190130SQ98100248
公開(kāi)日1998年8月12日 申請(qǐng)日期1998年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月19日
發(fā)明者婁丹, 徐莉萍, 鄒鐘誠(chéng) 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)三生制藥股份有限公司