專利名稱：用于發(fā)酵制備l－半胱氨酸、l－胱氨酸、n－乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的微生物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于發(fā)酵制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的微生物和方法。
在當(dāng)今技術(shù)水平下，許多氨基酸可以通過氨基酸的發(fā)酵方法制備。然而，在本發(fā)明以前還沒有任何制備L-半胱氨酸的經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵方法。
四氫噻唑衍生物及其對應(yīng)的半酮縮硫醇一般在半胱氨酸與酮或醛縮合時產(chǎn)生。半胱氨酸與不同的酮或醛(特別是與α-酮酸)縮合的化學(xué)方法已是長期已知的?？s合通過中間體半酮縮硫醇發(fā)生，該中間體則由硫游離電子對親核進(jìn)攻醛類或酮類的缺電子碳原子而形成。然后，消去水的閉環(huán)反應(yīng)則產(chǎn)生對應(yīng)的四氫噻唑衍生物。
四氫噻唑衍生物形成的一般方式可以用下列圖式表示
這里，R1和R2，可以表示任何有機(jī)基團(tuán)。
因而起始化合物通過半酮縮硫醇與四氫噻唑衍生物達(dá)到平衡。由于這一原因，在水溶液中除四氫噻唑衍生物之外還有半酮縮硫醇存在。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，＂四氫噻唑衍生物＂也被理解為意指與半酮縮硫醇相關(guān)連的這些物質(zhì)的平衡。
以前從未報導(dǎo)過四氫噻唑是細(xì)胞的直接代謝物。所有關(guān)于細(xì)胞形成四氫噻唑的報導(dǎo)都基于外部加入的過量的一種起始化合物，該化合物通常是L-半胱氨酸，該半胱氨酸經(jīng)脫硫和脫氨基作用轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸依次再與添加的半胱氨酸進(jìn)行反應(yīng)(Ronald C.Simpson等，生物化學(xué)生物物理學(xué)報，496(1977)，12-19)。而Kredich等曾在生物化學(xué)雜志.248，176187-6196中報導(dǎo)通過酶對L-半胱氨酸的脫硫作用，2-甲基-2，4-四氫噻唑二羧酸在體外形成，這些作者認(rèn)為這一物質(zhì)在體內(nèi)形成是極不可能的。
用四氫噻唑作為外消旋前體物通過生物轉(zhuǎn)化(EP-A 0101052，OkHee Ryu等，生物技術(shù)通訊，17(3)，275-28(1995年3月))制備L-半胱氨酸是很常見的。當(dāng)用外消旋物制備L-半胱氨酸時，它得利用酶或者整個細(xì)胞立體選擇轉(zhuǎn)化成為L-半胱氨酸，而且余下的非異構(gòu)體還要再一次經(jīng)過外消旋化。由于這些原因，這一生物轉(zhuǎn)化具有高的成本。
從外消旋半胱氨酸和對應(yīng)的酮或者醛進(jìn)行四氫噻唑的化學(xué)合成會形成四種不同的非異構(gòu)體。從對映異構(gòu)體純化L-半胱氨酸而進(jìn)行化學(xué)合成十分昂貴，并且其后分離L-半胱氨酸的目的也是荒謬的。由于以上原因，制備C4原子上為R構(gòu)型的四氫噻唑非異構(gòu)體，其起始化合物花費(fèi)高的成本。
本發(fā)明涉及適合于發(fā)酵制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸和/或四氫噻唑衍生物的微生物。
按照本發(fā)明的微生物菌株的特征是它過量表達(dá)至少一種基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)直接適合于向胞外分泌抗生素或其它對有機(jī)體有毒的物質(zhì)。
在本發(fā)明內(nèi)，對有機(jī)體有毒的物質(zhì)被認(rèn)為是優(yōu)選的化合物，其對有機(jī)體的生長具有負(fù)作用。這種化合物的例子是羧酸或羧酸衍生物，它們在胞內(nèi)以高濃度存在。
由此，編碼直接適合于向胞外分泌抗生素和其它有毒物質(zhì)或?qū)е逻@種蛋白質(zhì)形成的基因被稱為外向通量基因(efflux gene)。
因而，本發(fā)明也涉及外向通量基因在增強(qiáng)表達(dá)發(fā)酵中胞內(nèi)形成的氨基酸或氨基酸衍生物上的用途。
選自mar基因座(S.P.Cohen等，細(xì)菌學(xué)雜志，mar.1993，1755，1484-1492)，emr基因座，acr基因座，cmr基因座(參見P.F.Miller和M.C.Sulavik，分子微生物學(xué)(1996年)21(3)，441-448)，mex基因(T.Khler等，分子微生物學(xué)(1997年)23(2)，345-354)，bmr基因(A.A.Neyfakh等，美國科學(xué)院院報884781-4785(1991年))和qacA基因(J.M.Tennent等，J.Gen.Microbiol.1351-10(1989年))的至少一種基因作為外向通量基因在本發(fā)明的微生物中被優(yōu)選地過量表達(dá)。
按照本發(fā)明，這些mar基因座基因作為外向通量基因在微生物中優(yōu)選地過量表達(dá)。
編碼包含序列MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ ID NO1)或與SEQ ID NO1具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白質(zhì)的基因在本發(fā)明的微生物中被特別優(yōu)選地過量表達(dá)。
優(yōu)選的是與SEQ ID NO1具有高于75％的序列同源性的序列，并且特別優(yōu)選的是與SEQ ID NO1具有高于90％的序列同源性的序列。
因而，本發(fā)明也涉及編碼一種蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含序列MSRKDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ ID NO1)或與SEQ ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列。
此外，本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含序列MSR KDGVLALLVVVVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ ID NO1)或與SEQ ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列。
優(yōu)選的是與SEQ ID NO1具有高于75％的序列同源性的序列，并且特別優(yōu)選的是與SEQ ID NO1具有高于90％的序列同源性的序列。
例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有下列序列1 MKFRGGRMSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV51 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL101 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML151 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS201 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR251 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK310 AVKVGS*(SEQ.ID.NO2)由此，編碼具有SEQ.ID.NO2中描述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的開放讀框被稱為ORF 306。
下列序列代表本發(fā)明的蛋白質(zhì)的另一例子。
1 MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV
44 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL94 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML144 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS194 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR244 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK294 AVKVGS*(SEQ.ID.NO3)具有在氨基酸水平上與SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于50％的序列同源性的氨基酸序列的那些蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的是與SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于75％的序列同源性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選的是與SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于90％的序列同源性的蛋白質(zhì)。
因此，編碼以下蛋白質(zhì)的那些基因也是本發(fā)明的基因，所說的蛋白質(zhì)具有SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3所示的氨基酸序列或者具有在氨基酸水平上與SEQ.ID.NO2或SEQ.ID.NO3具有高于50％，優(yōu)選地高于75％，特別優(yōu)選地高于90％的序列同源性的氨基酸序列。
在本發(fā)明中提及的所有同源性值與利用＂威斯康星軟件包版本9.0，遺傳學(xué)計算機(jī)集團(tuán)(GCG)，Madison，威斯康星＂的計算機(jī)程序獲得的結(jié)果相關(guān)。用＂fasta＂子程序和默認(rèn)值在數(shù)據(jù)庫中查找來確定同源性(詞匯大小2)。用“gap”子程序和＂缺口產(chǎn)生罰分12＂及＂缺口延伸罰分4＂默認(rèn)值參數(shù)檢測具有最大相似性的序列間的同源性。
為增加半胱氨酸產(chǎn)量的目的，另一種按照本發(fā)明的基因的超量表達(dá)的例子是一個5.5kb的DNA片段的超量表達(dá)，該片段編碼mar基因座。這一質(zhì)粒(命名為100-1-1，在大腸桿菌K12 W3110中)保藏在德意志微生物保藏中心，D-38124 Braunschweig，保藏號是DSM 11545。

圖1顯示了該質(zhì)粒的圖譜。該質(zhì)粒可以用于PCR擴(kuò)增按照本發(fā)明的基因。
技術(shù)人員熟悉用于在各種情況下所需的序列中的位置上獲得進(jìn)一步的特定修飾的已知方法(例如定點(diǎn)誘變技術(shù))。因而，含有用這一方式修飾過基因的微生物也符合本發(fā)明，只要用這一方法修飾的基因有利于制備L-半胱氨酸，L-胱氨酸，N-乙酰絲氨酸和/或四氫噻唑衍生物。
在本發(fā)明含義內(nèi)，過量表達(dá)被理解為意指在本發(fā)明的微生物中表達(dá)的蛋白質(zhì)的量至少兩倍于在蛋白質(zhì)所來源的野生型微生物中表達(dá)的量。
蛋白質(zhì)在本發(fā)明的微生物中的表達(dá)比在野生型微生物體中的表達(dá)優(yōu)選地至少強(qiáng)5倍，特別優(yōu)選地比在蛋白質(zhì)所來源的野生型微生物體中的表達(dá)至少強(qiáng)10倍。
沒有上述基因的過量表達(dá)，就不能觀察到與起始菌株比較L-半胱氨酸或四氫噻唑衍生物產(chǎn)率的明顯增加，例如，借助于使用分離的啟動子的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，或者例如不使用在質(zhì)粒上以多拷貝存在的編碼marA的基因時。
所說序列的過量表達(dá)引起的產(chǎn)率增加是令人驚奇的，因?yàn)槲墨I(xiàn)報道開放讀框ORF266的基因產(chǎn)物(其序列是從SEQ.ID.NO 2的41位甲硫氨酸開始，相應(yīng)于SEQ.ID.NO4，)的過量表達(dá)不引起L-半胱氨酸產(chǎn)率上的增加。
在來源于ORF306并在以上描述的氨基酸序列中，ORF266的起始甲硫氨酸用粗體印刷并有下劃線。
獲得過量表達(dá)基因的一些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如，其中一種可能性是在質(zhì)粒中表達(dá)該基因，該質(zhì)粒在細(xì)胞中以高拷貝數(shù)存在。這樣的質(zhì)粒是已知的，可以提及的例子有pACYC177，pACYC184，pACYC184的衍生物，pBR322，其它pBR的衍生物，pBluescript，pUC18，pUC19以及其他在大腸桿菌中常用的質(zhì)粒。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的過量表達(dá)的質(zhì)粒是pACYC177，pACYC184，pACYC184的衍生物，pBR322和其它pBR的衍生物。
特別優(yōu)選的質(zhì)粒是pACYC184及其衍生物，如pACYC184-LH(保藏在DSMZ德意志微生物保藏中心，D-38124 Braunschweig，保藏號DSM10172)。
因而，本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的所述基因的質(zhì)粒。
其他增強(qiáng)表達(dá)的可能性在于增加外向通量基因的拷貝數(shù)(通過擴(kuò)增在染色體中的基因片段)或運(yùn)用強(qiáng)啟動子來改進(jìn)外向通量基因轉(zhuǎn)錄。
合適的強(qiáng)啟動子的例子是GAPDK啟動子，tac啟動子(Ptac，lac啟動子(Plac)，trp啟動子(Ptrp)，λPL或λPR。
GAPDH啟動子或tac啟動子(Ptac)是優(yōu)選的合適啟動子。
GAPDH啟動子是特別優(yōu)選的合適啟動子。
加強(qiáng)表達(dá)的另一種可能性是滅活阻抑蛋白基因，該基因?qū)ν庀蛲炕虻谋磉_(dá)有抑制效應(yīng)。在mar基因座的情況下，例如這涉及滅活marR基因。
在翻譯水平上對基因表達(dá)具有正效應(yīng)的因子對外向通量基因的過量表達(dá)也有影響。這種因子的最好的例子是好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(例如Shine-Dalgarno序列)或下游框。
GAPDH基因的好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是在翻譯水平上對基因表達(dá)具有正效應(yīng)的優(yōu)選因子。
為了表達(dá)，外向通量基因?qū)⒈晦D(zhuǎn)化到能產(chǎn)生L-半胱氨酸的微生物中。
外向通量基因優(yōu)選地轉(zhuǎn)化到選自芽孢桿菌屬(如B.subtilis)和棒桿菌屬(如C.Glutamicum)，鏈霉菌屬和大腸桿菌的微生物中。
外向通量基因最好轉(zhuǎn)化到半胱氨酸代謝是去調(diào)節(jié)的微生物中，以實(shí)現(xiàn)L-半胱氨酸或隨后可能的L-半胱氨酸或N-乙酰絲氨酸的四氫噻唑衍生物產(chǎn)量的增加。
產(chǎn)生增加量的L-半胱氨酸的微生物的例子是具有反饋抗性CysE等位基因的微生物。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化這樣的微生物，其借助L-半胱氨酸和酮或者醛(特別是丙酮酸)的縮合胞內(nèi)形成四氫噻唑衍生物。
例如，產(chǎn)生增加量的L-半胱氨酸的微生物在專利申請19539952中描述(19539952引入作參考)。
專業(yè)技術(shù)人員對轉(zhuǎn)化微生物的方法(例如來自標(biāo)準(zhǔn)教科書的方法)是非常熟悉的。所有已知的方法都可以運(yùn)用來產(chǎn)生本發(fā)明的微生物。
增強(qiáng)外向通量基因在能胞內(nèi)產(chǎn)生氨基酸或者氨基酸衍生物(如L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸，或四氫噻唑衍生物)的微生物中的表達(dá)會令人驚奇地導(dǎo)致在胞內(nèi)形成的氨基酸或者氨基酸衍生物(如L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸，或四氫噻唑衍生物)向胞外分泌量的增加。這導(dǎo)致在發(fā)酵期間可以獲得實(shí)質(zhì)上較高產(chǎn)率的這些產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明也涉及制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的方法。該方法包括使用一種微生物，其在以已知的方式發(fā)酵時過量表達(dá)外向通量基因。
按照本發(fā)明的用于發(fā)酵制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的方法具有下列優(yōu)點(diǎn)只形成在C4碳原子上具有R構(gòu)型的四氫噻唑非對映異構(gòu)體，這是由于細(xì)胞酶裝備的結(jié)果，立體選擇性地形成L-半胱氨酸，然后L-半胱氨酸可以用于與特定的醛或酮反應(yīng)以產(chǎn)生上述四氫噻唑非對映異構(gòu)體。
常規(guī)的化學(xué)和生物方法及技術(shù)可以用來從在C4碳原子上具有R構(gòu)型的四氫噻唑獲取L-半胱氨酸，只需簡單地按起始化合物方向移動平衡。
此外，還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，從胞內(nèi)產(chǎn)生的四氫噻唑衍生物發(fā)酵制備L-半胱氨酸是有利的。對此令人驚奇的事件做更詳細(xì)的研究發(fā)現(xiàn)四氫噻唑?qū)?xì)胞的毒性比L-半胱氨酸實(shí)質(zhì)上要低。
因而，本發(fā)明也涉及制備L-半胱氨酸的方法，該方法包括使由微生物胞內(nèi)形成的L-半胱氨酸在微生物中胞內(nèi)與存在于這一微生物胞內(nèi)的醛或酮反應(yīng)，產(chǎn)生四氫噻唑衍生物；采用直接適用于向胞外分泌抗生素或?qū)υ撐⑸镉卸拘缘钠渌镔|(zhì)的蛋白質(zhì)將這種四氫噻唑衍生物分泌到微生物外；并且在合適時，在分離出四氫噻唑衍生物后，通過向L-半胱氨酸的方向移動L-半胱氨酸和四氫噻唑衍生物之間的平衡獲得L-半胱氨酸。
胞內(nèi)形成四氫噻唑衍生物的一種選擇是將在每種情況下存在于胞內(nèi)的醛或酮與L-半胱氨酸反應(yīng)。許多適合于縮合反應(yīng)的醛和酮在有機(jī)體代謝途徑中是已知的。在細(xì)菌代謝途徑中，例如，這些醛和酮包括丙酮酸，草酰乙酸，α-酮戊二酸和乙醛酸。
L-半胱氨酸優(yōu)選地與丙酮酸或者乙醛酸進(jìn)行反應(yīng)。
因此，按照本發(fā)明，對于按照本發(fā)明的方法中形成的四氫噻唑衍生物，在第1頁所示圖式中至少R1或R2中的一個基團(tuán)優(yōu)選地表示一個羧基基團(tuán)，特別優(yōu)選的是在式I中R1代表COOH和R2代表CH3。
用于產(chǎn)生四氫噻唑衍生物的縮合的起始化合物可以都由微生物產(chǎn)生，或者，僅其中一種起始化合物由微生物產(chǎn)生而第二種起始化合物在發(fā)酵期間加入。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩種用于產(chǎn)生四氫噻唑衍生物的縮合的起始化合物都由微生物產(chǎn)生。
羥胺或2，4-二硝基苯阱可以作為誘導(dǎo)劑以誘導(dǎo)形成丙酮酸，而后其可以從平衡中移走。
在按照本發(fā)明的方法中，四氫噻唑衍生物(和對應(yīng)的半酮縮硫醇)可以有利地由簡單和便宜的C，N和S源制備。
在按照本發(fā)明的方法中，通常用于發(fā)酵中的C源(如葡萄糖，乳糖，果糖，淀粉及其類似物)、N源(如銨或蛋白水解物及其類似物)以及S源(如硫化物，亞硫酸鹽，硫酸鹽，硫代硫酸鹽或連二亞硫酸)可以用于發(fā)酵中。
由發(fā)酵獲得的四氫噻唑衍生物可以用于獲得半胱氨酸及其它目的。許多利用發(fā)酵制備的并且在C4碳原子具有R構(gòu)型的四氫噻唑衍生物作為更廣泛的合成起始點(diǎn)(構(gòu)件)的應(yīng)用可能性是已知的。
下列實(shí)施例用于進(jìn)一步地闡明本發(fā)明。
僅僅可以間接定量測定四氫噻唑衍生物/半酮縮硫醇。在實(shí)施例中，這些化合物由運(yùn)用Gaitonde，M.K.(1967)，Biochem.J.104，627-633的方法測定半胱氨酸來測定。在強(qiáng)酸條件下用茚三酮誘導(dǎo)半胱氨酸并從平衡中移走。這導(dǎo)致半酮縮硫醇隨后發(fā)生反應(yīng)，最終形成四氫噻唑衍生物。在100℃下處理10分鐘，所有四氫噻唑衍生物以及有關(guān)的半酮縮硫醇均轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?茚三酮衍生物，其可以在560nm處定量測定。按此方法，游離半胱氨酸也包括在測定中。
游離SH基和游離半胱氨酸的量借助由Sang-Han，Lee等，生化和生物物理研究通信，Vol.213，第3號(1995)，837ff頁描述的試驗(yàn)方法單獨(dú)地測定，其中使用5，5’-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)。
當(dāng)游離L-半胱氨酸形成時，它在發(fā)酵期間受大氣中氧氣的氧化作用形成L-胱氨酸，胱氨酸僅稍溶于pH7.0的水溶液中并以白色顆粒沉淀。當(dāng)不溶的半胱氨酸顆粒形成時，它能溶解在半濃HCl中，并且在由使用二硫蘇糖醇(DTT)獲得的還原條件下在以上提到的試驗(yàn)中同樣地測定。
在實(shí)施例3中，通過使用Gaitonde試驗(yàn)在上清液中測量的＂總半胱氨酸量＂作為發(fā)酵結(jié)果給出。在本文中，＂總半胱氨酸＂具體地說包括2-甲基四氫噻唑-2，4-二羧酸，有關(guān)的半酮縮硫醇，游離L-半胱氨酸和溶解的胱氨酸。沉淀的胱氨酸單獨(dú)定量測定和表示。
在檢測2-甲基四氫噻唑-2，4-二羧酸時，可以利用一種用二價金屬離子沉淀在本發(fā)明實(shí)施方案中產(chǎn)生的這一衍生物。在以前報導(dǎo)過該衍生物可以用乙酸鋅沉淀(Schubert等，見上述參考文獻(xiàn))。然而，其也可以用其他二價金屬離子(如鎂，鐵，銅，鋅，錳，鈷等)沉淀。形成的四氫噻唑產(chǎn)物的沉淀和隨后的鑒定在實(shí)施例4中描述。該實(shí)施例也表明經(jīng)過24小時的發(fā)酵后，2-甲基四氫噻唑-2，4-二羧酸是主要產(chǎn)物。該發(fā)酵產(chǎn)物易于沉淀在分析時是有幫助的，且在純化時是有用的。
實(shí)施例1運(yùn)用PCR擴(kuò)增等位基因A擴(kuò)增cysE等位基因在下面運(yùn)用的cysE等位基因，即cysEIV和cysEX，是在DE19539952實(shí)施例2/10中描述的。
在上述文獻(xiàn)中論及的突變可以通過定點(diǎn)誘變獲得，實(shí)現(xiàn)這種誘變的試劑盒可以從商家購得，如從Stratagene(Stratagene GmbH，Po.Box105466，D-69044 Heidelberg)以商品名ExSite或Chameleon購得。
在定點(diǎn)誘變實(shí)現(xiàn)后，形成的等位基因可以從有關(guān)DNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Saiki等，科學(xué)，239487-491)擴(kuò)增，選用下列引物cysE-fw(SEQ.ID.NO5)5’-TGG ACC AGA GCT CTG GGC GCA TCG CTT CGG CGT TG-3’SacIcysE-rev(SEQ.ID.NO6)5’-CTC GAT GCA TTA CGT AGG GGT ATC CGG GAG CGG TAT TG-3’NsiIPCR實(shí)驗(yàn)在存在200微摩爾的三磷酸脫氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1微摩爾的對應(yīng)的寡核苷酸，100ng的包含特定cysE等位基因的模板DNA，1/10的10倍的反應(yīng)緩沖液(100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，200mM tris-HCl(pH8.8)，20mM MgSO4，1％曲通X-100和1000微克/ml BSA)和2.5單位的熱穩(wěn)定重組Pfu DNA聚合酶(Stratagene)于熱循環(huán)器(Gene-ATAQ-Controller，Pharmacia)中進(jìn)行30個循環(huán)，并利用下列條件94℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃3分鐘。
擴(kuò)增產(chǎn)物用SacI和NsiI(都來自Boehringer Mannheim GmbH)水解，水解條件按照制造商的規(guī)定；并在1％瓊脂糖凝膠中分離，運(yùn)用相應(yīng)制造商說明的Geneclean方法(Geneclean試劑盒BIO101 PO.Box.2284LaJolla，加利福尼亞，92038-2284)可分離得到大約1.7kb大小的片段。在進(jìn)一步使用前，將其保存在-20℃條件下。
B.mar基因座的擴(kuò)增大腸桿菌mar基因座通過PCR得到擴(kuò)增，分離擴(kuò)增片段的方法與在實(shí)施例1A部分描述的相同。來自大腸桿菌W3110(ATCC 27325)的染色體DNA用作模板DNA；質(zhì)粒100-1-1(DSM 11545)也可用作模板DNA。裂解細(xì)胞并純化染色體DNA，依據(jù)在Ausubel等，1987，2.4.1-2.4.2，分子生物學(xué)中的當(dāng)前草案，Greene出版協(xié)會和Wiley-Interscience中所描述的方案，用下列引物擴(kuò)增mar基因座mar-fw(SEQ ID NO7)5‘-TTT GGC GCG CCG ATC AGC GGC GGC GCA ACC ATC AG-3’AscImar-rev(SEQ ID.No8)5’-GCC TTA ATT AAG ATC GAC ACT CAG GCT GTA CTG GCG AC-3’PacImar基因座擴(kuò)增出高達(dá)3kb大小的片段，該片段用實(shí)施例1A段中描述的方法純化。序列的限制性消化用酶AscI和PacI(兩者均來自新英格蘭Biolabs GmbH P.O.Box2750，D-65820 Schwalbach/Taunus)依據(jù)制造商的說明和緩沖液進(jìn)行，片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后存儲于-20℃。
C.ORF306 DNA的擴(kuò)增按在實(shí)施例1A段中所述，利用PCR擴(kuò)增編碼ORF306的DNA。以在實(shí)施例1A段中從大腸桿菌W311(ATCC 27325)分離的染色體DNA用作模板。質(zhì)粒100-1-1(DSM 11545)也可用作模板DNA。運(yùn)用下列引物ORF306-fw(SEQ.ID.NO9)
5‘-GGA ATT CAT TAA TCC GGC GAC TAA CGA ATC AAC TG-3’AsnIORF306-rev(SEQ.ID.NO10)5’-GCC TTA ATT AAC GCT ATG TAG TTT GTT CTG GCC CCG-3’PacI擴(kuò)增的DNA片段約1.05kb大小，按前述用瓊脂糖凝膠電泳純化。后續(xù)的限制性消化用酶AscI(Boehringer Mannheim)和PacI(新英格蘭Biolabs)進(jìn)行，所需DNA片段在去除酶后獲得。該片段用前儲存在-20℃。
D.擴(kuò)增編碼GAPDH啟動子的DNA片段3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子用于獲得ORF306的有效轉(zhuǎn)錄。該片段也通過PCR獲得。來自大腸桿菌W311(ATCC 27325)的染色體DNA用作模板。質(zhì)粒100-1-1(DSM 11545)也可用作模板DNA。運(yùn)用下列引物GAPDH-fw(SEQ.ID.NO11)5‘-GTC GAC GCG TGA GGC GAG TCA GTC GCG TAA TGC-3’MluIGAPDH-rev(SEQ.ID.NO12)5‘-GAG CTT AAT TAA GAT CTC ATA TGT TCC ACC AGC TAT TTG TTA G-3’PacI NdeI獲得約0.3kb大小的DNA片段，按實(shí)施例1A部分所述的方法通過瓊脂糖凝膠電泳純化。后續(xù)限制性消化用酶MluI和PacI進(jìn)行即可獲得所需DNA片段。去除限制性消化酶后將DNA片段儲存在-20℃。
實(shí)施例2構(gòu)建本發(fā)明的質(zhì)粒質(zhì)粒pACYC184是用作構(gòu)建本發(fā)明所需質(zhì)粒的基本質(zhì)粒。該質(zhì)粒按在DE 19539952所述修飾并作為質(zhì)粒pACYC184-LH保藏在德意志微生物保藏中心，保藏號是DSM10172。
圖2顯示了質(zhì)粒pACYC184-LH的限制性酶切圖和功能圖。質(zhì)粒pACYC184-LH攜帶多接頭，這一多接頭具有下列限制性酶切點(diǎn)NotI-NcoI-SacI-NsiI-MluI-PacI-NotI在實(shí)施例1中借助PCR獲得的DNA片段和后續(xù)的限制性酶消化物均與此接頭連接。
A.構(gòu)建對照質(zhì)粒pACYC184/cysEIV和pACYC184/cysEX按DE 19539952實(shí)施例3所述制備pACYC184/cysEIV與pACYC184/cysEX質(zhì)粒，簡略總結(jié)如下約1微克質(zhì)粒pACYC184-LH(DSM 10172)按制造商(BoehringerMannheim)的說明用限制酶SacI與NsiI消化，如前所述消化過的DNA用瓊脂糖凝膠電泳純化以去除酶。將在實(shí)施例1A部分中獲得的編碼各cysE等位基因的DNA片段，按等摩爾比例與SacI和NsiI消化的質(zhì)粒pACYC184-LH混合；向混合物中加入1微升T4 DNA連接酶和2微升10倍連接酶緩沖液配制總量為20微升的反應(yīng)體系，不足用無菌雙蒸水補(bǔ)足。將混合物溫育過夜并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110(27325)。下面所述的轉(zhuǎn)化方法可以用于在實(shí)施例中論及的所有轉(zhuǎn)化。
運(yùn)用電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110，為此，在三角瓶中裝入500毫升LB培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，以及NaCl5g)，并接種1％(V/V)的過夜培養(yǎng)物到相同培養(yǎng)基中。經(jīng)定軌搖床37℃培育至600納米光密度值為0.5-0.6。通過離心在4℃無菌容器中收獲細(xì)胞株，所有后續(xù)方法要保證在冰上和無菌條件下操作。細(xì)胞沉淀用預(yù)冷無菌雙蒸水沖洗兩遍，最后將其懸浮于30毫升10％(V/V)的無菌甘油中。經(jīng)進(jìn)一步離心，細(xì)胞沉淀溶解于500微升10％(V/V)甘油中并以每200微升一等份儲存于-80℃條件下。為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，細(xì)胞需在冰上解凍，隨后，加入約10-100ng的DNA，將混合物轉(zhuǎn)入一無菌電擊用吸收池(BioRad)內(nèi)，把該小池放入基因脈沖發(fā)生器(BioRad)中進(jìn)行電擊，條件是電壓2500伏，水平阻抗200歐姆以及25μF的電容。接著將細(xì)胞懸浮在1毫升SOC培養(yǎng)基中(酪蛋白蛋白胨20.0g/l，酵母提取物5.0g/l，NaCl0.58g/l，KCl0.19g/l，MgCl22.03g/l，MgSO42.46g/l，葡萄糖3.60g/l，pH＝7.0)，并且在37℃搖動1小時。之后，適當(dāng)稀釋細(xì)胞，涂布到LB平板(10g/l胰化蛋白胨，5g/l NaCl，15g/l瓊脂，pH＝7.2)上，然后將平板在37℃溫育過夜直到長出單菌落。
在質(zhì)粒用QIAprep spin質(zhì)粒試劑盒(Qiagen GmbH，MaxVolmerstrasse4，D-40724 Hilden)分離后，用限制酶切分析確定轉(zhuǎn)化子。它們在實(shí)施例3的發(fā)酵中用作對照。
質(zhì)粒pACYC184/cysEIV和pACYC184/cysEX在圖3中描述。
B.質(zhì)粒pACYC184/cysEIV-mar和pACYC184/cysEX-mar的構(gòu)建在每種情況下，在實(shí)施例2A部分構(gòu)建的1微克質(zhì)粒pACYC184/cysEIV和pACYC184/cysEX連續(xù)地用限制性酶MluI(Boehringer)與PacI(新英格蘭Biolabs)按照制造商的說明消化。經(jīng)過此步消化后，用瓊脂糖凝膠電泳如在實(shí)施例1A部分所述進(jìn)行分離和純化。將大約20ng MluI/PacI 消化載體pACYC184/cysEIV或pACYC184/cysEX與200ng在實(shí)施例1A部分制備的DNA片段，1微升T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)和2微升10倍連接酶緩沖液(Boehringer Mannheim)及足量的無菌雙蒸水混合，使最終體積為20微升。在4℃溫育過夜，這兩種DNA混合物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110(ATCC 27325)。用QIAprep旋轉(zhuǎn)質(zhì)粒試劑盒(Qiagen GmbH)分離質(zhì)粒之后，進(jìn)行限制酶切分析，所需轉(zhuǎn)化子按在實(shí)施例3中所述分離并用于發(fā)酵。圖4顯示的是質(zhì)粒pACYC184/cysEIV-mar和pACYC184/cysEX-mar的限制性酶切圖和功能圖。
C.質(zhì)粒pACYC184/cysEIV-GAPDH和pACYC184/cysEX-GAPDH的構(gòu)建在實(shí)施例2A部分構(gòu)建的質(zhì)粒pACYC184/cysEIV與pACYC184/cysEX均根據(jù)制造商的說明用限制酶MluI(BoehringerMannheim)和PacI(新英格蘭Biolabs)消化。
用該種方法處理后的質(zhì)粒純化后，按實(shí)施例2B部分所述用實(shí)施例1D部分制備的DNA片段開始兩個連接反應(yīng)。
經(jīng)4℃溫育過夜后，將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110中。在質(zhì)粒DNA分離后，用合適的限制酶分析可確定正確的轉(zhuǎn)化子。
如在下面D部分中所述，質(zhì)粒pACYC184/cysEIV-GAPDH和pACYC184/cysEX-GAPDH用作為構(gòu)建質(zhì)粒pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306與pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的起始材料。
D.質(zhì)粒pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306和pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的構(gòu)建在C部分制備的質(zhì)粒按制造商的說明用NdeI(Boehringer Mannheim)和PacI(新英格蘭Biolabs)消化。在質(zhì)粒DNA純化后，利用來自實(shí)施例IC部分的DNA片段開始兩個連接反應(yīng)，該片段用AsnI-PacI切過并編碼ORF306。
在4℃溫育過夜后，將混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌W3110中，并將轉(zhuǎn)化菌平板接種到LB培養(yǎng)基上。一旦單菌落出現(xiàn)，立即分離它們的質(zhì)粒并限制消化以進(jìn)行正確性檢驗(yàn)。
圖5顯示質(zhì)粒pACYC184-cysEIV-GAPDH-ORF306和pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的限制性酶切圖和功能圖。
實(shí)施例3在發(fā)酵中比較本發(fā)明的構(gòu)建體和已知構(gòu)建體的產(chǎn)量在發(fā)酵中比較的所有質(zhì)粒均在大腸桿菌W3110中發(fā)酵。由此保證觀察到產(chǎn)率的增加是基因的新應(yīng)用的結(jié)果。
用各種大腸桿菌構(gòu)建體接種在錐形瓶(100ml)中的含15mg/l四環(huán)素的20ml LB培養(yǎng)基。在搖動溫箱中經(jīng)7小時的培養(yǎng)后(150rpm，30℃)，將各起始培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入100毫升SM1培養(yǎng)基(12g/l K2HPO4，3g/lKH2PO4，5g/l(NH4)2SO4，0.3g/lMgSO4X7H2O，0.015g/l CaCl2X2H2O，0.002g/l FeSO4X7H2O，1g/l檸檬酸三鈉X2H2O，0.1g/l NaCl，1ml/l痕量元素(包括0.15g/l NaMoO4X2H2O，2.5g/l H3BO3，0.7g/l CoCl2X6H2O，0.25g/l CuSO4X5H2O，1.6g/l MnCl2X4H2O，0.3g/l ZnSO4X7H2O))中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有5g/l 葡萄糖，5mg/l 維生素B1和15mg/l 四環(huán)素。培養(yǎng)物在150rpm和30℃條件下于Erlenm eyer瓶(1升)中搖動培養(yǎng)17小時。經(jīng)此培養(yǎng)，在600nm的光密度(OD)值在3和5之間。
發(fā)酵在BIOSTATM Braun-Melsungen發(fā)酵罐中進(jìn)行，使用總體積為2L的培養(yǎng)容器。發(fā)酵培養(yǎng)基含有15g/l葡萄糖，10g/l 胰化蛋白胨(Difco)，5g/l酵母提取物(Difco)，5g/l(NH4)2SO4，1.5g/l KH2PO4，0.5g/lNaCl，0.3g/l MgSO4X7H2O，0.015g/l CaCl2X2H2O，0.075g/l FeSO4X7H2O，1g/l檸檬酸三鈉X2H2O，和1ml/l痕量元素(參見上段)，0.005g/l維生素B1和l5mg/l四環(huán)素。在發(fā)酵罐中的pH最初通過泵入25％的NH4OH溶液調(diào)節(jié)到7.0，在發(fā)酵期間，pH通過25％NH4OH溶液自動地校正保持在7.0。對于接種，將100ml最初培養(yǎng)物泵入發(fā)酵容器中。起始容積約1L，培養(yǎng)物最初在200rpm下攪拌，并通過經(jīng)滅菌過濾器滅菌的1.5vvm壓縮空氣通氣。在發(fā)酵期間將大氣氧飽和度調(diào)整到50％這是通過攪拌速率自動控制的。發(fā)酵在30℃的溫度下進(jìn)行，發(fā)酵2小時以后，以每小時3ml的速率加入無菌的30％的5倍硫代硫酸鈉貯存液。在600納米的OD值達(dá)到10后，以每小時約8-14ml的速率加入無菌的56％葡萄糖貯存液。利用YSI的葡萄糖分析儀酶促測定葡萄糖量。在發(fā)酵期間，葡萄糖濃度通過連續(xù)加入控制在10-20g/l。培養(yǎng)基中的半胱氨酸總量依據(jù)Gaitonde，M.K.(1967)，Biochem.J.104，627-623通過對樣品中無細(xì)胞上清液的比色法測定。在本文中，應(yīng)當(dāng)注意在發(fā)酵期間剩余的半胱氨酸剩余物主要以四氫噻唑衍生物存在溶液中，但仍然被試驗(yàn)記錄。如果酮或者醛(在這種情況下是丙酮酸)的量不夠轉(zhuǎn)化形成四氫噻唑衍生物的半胱氨酸，則游離L-半胱氨酸形成，這種半胱氨酸也被試驗(yàn)記錄。當(dāng)形成L-半胱氨酸時，其在發(fā)酵期間經(jīng)導(dǎo)入的大氣氧氣緩慢氧化形成L-胱氨酸。胱氨酸僅微溶于pH7.0的培養(yǎng)基水溶液并以白色顆粒沉淀。當(dāng)形成不溶的胱氨酸沉淀時，經(jīng)從樣品分離上清液并離心后，其可溶于半濃HCl中，在還原條件(DTT)下用上述試驗(yàn)法同樣地測量。
在這些條件下，在表1和2中所顯示的產(chǎn)量分別是在24小時和48小時發(fā)酵后獲得的。這些表提供了清楚證據(jù)說明在本發(fā)明中使用的基因，即E.coli mar基因座，尤其是編碼ORF306的片段，顯著地增加半胱氨酸和/或四氫噻唑衍生物(總半胱氨酸)的產(chǎn)量。胱氨酸沉淀的形成在表中單獨(dú)地記錄。
表1利用cysEIV等位基因的半胱氨酸總產(chǎn)量
*胱氨酸的量，以克/升表示，其以顆粒存在。
表2利用cysEX等位基因的半胱氨酸總產(chǎn)量
*胱氨酸的量，以克/升表示，其以顆粒存在。
實(shí)施例4形成2-甲基四氫噻唑-2，4-二羧酸的證明將構(gòu)建體大腸桿菌W3110XpACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306按在實(shí)施例3中所述用于發(fā)酵，以證明2-甲基四氫噻唑-2，4-二羧酸是如在實(shí)施例3中所述的發(fā)酵中的主要產(chǎn)物。
24小時后，通過離心將發(fā)酵上清液與細(xì)胞分離。按描述的半胱氨酸測量法測出上清液中半胱氨酸的總量為12.8g。然后，將MgSO4加入發(fā)酵上清液中，使其達(dá)到0.3M的終濃度。通過在攪拌下4℃溫育過夜后，上清液中形成白色沉淀。該沉淀是2-甲基四氫噻唑-2，4-二羧酸的微溶性鎂鹽。
經(jīng)離心分離該沉淀后，測得上清液中剩余的半胱氨酸量僅為2.5g/l。
將沉淀溶解在半濃HCl中，并同樣地用于半胱氨酸檢測。在這種情況下，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸濃度為9.5g/l。在溶于D2O+HCl中的沉淀經(jīng)1HNMR和13C NMR分析后，可確定它不同于參考物質(zhì)(M.P.Schubert，生物化學(xué)雜志.121539-548(1937))，而是2-甲基四氫噻唑-2，4-二羧酸。
實(shí)施例5L-半胱氨酸和2-甲基四氫噻唑-2，4(R)-二羧酸的不同的毒性對于該實(shí)驗(yàn)，2-甲基四氫噻唑-2，4(R)-二羧酸是運(yùn)用Schubert方法(M.P.Schubert，J.Biol.Chem.121，539-548(1937))從L-半胱氨酸和丙酮酸合成的。將在LB培養(yǎng)基中過夜溫育的大腸桿菌W3110接種到20mlSM1培養(yǎng)基中(見實(shí)施例3)，后者補(bǔ)充了10g/l葡萄糖，10％LB培養(yǎng)基，5mg/l維生素B1，15mg/l四環(huán)素和適當(dāng)量的L-半胱氨酸或2-甲基四氫噻唑-2，4(R)-二羧酸。經(jīng)37℃下培養(yǎng)7小時，在含1mM或1mM以上濃度L-半胱氨酸的培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的生長。而在含高達(dá)50mM 2-甲基四氫噻唑-2，4(R)-二羧酸的培養(yǎng)基中可以觀察到生長。不可能培養(yǎng)更長的時間，因?yàn)榘腚装彼嵋子谘趸?。故L-半胱氨酸對大腸桿菌的毒性比2-甲基四氫噻唑-2，4(R)-二羧酸更顯著。因此，2-甲基四氫噻唑-2，4(R)-二羧酸更適合于用發(fā)酵法獲得L-半胱氨酸，即便在這種情況下，為釋放L-半胱氨酸，仍需要一個化學(xué)步驟。
實(shí)施例6增強(qiáng)N-乙酰-L-絲氨酸的形成N-乙酰-L-絲氨酸是由O-乙酰-L-絲氨酸自發(fā)重排形成的，該O-乙酰-L-絲氨酸在細(xì)菌生物合成途徑中是L-半胱氨酸的直接前體物。因此，當(dāng)向O-乙酰-L-絲氨酸中摻入的硫不夠或缺乏時，其發(fā)酵的終產(chǎn)物是N-乙酰-L-絲氨酸。當(dāng)沒有硫供給時，按照本發(fā)明的基因仍會增加該發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率。
進(jìn)行實(shí)施例3中所述的發(fā)酵，但不加入硫代硫酸鹽。為了說明它們所包含的基因特別是ORF306的功效而使用構(gòu)建體pACYC184/cysEX和pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306。
如表3顯示的結(jié)果，本發(fā)明的基因，特別是ORF306，可顯著增加發(fā)酵中N-乙酰-L-絲氨酸的產(chǎn)量。
表3發(fā)酵24小時后N-乙酰-L-絲氨酸產(chǎn)量
當(dāng)用更強(qiáng)的反饋抗性CysE等位基因(例如來自DE 19539952的cysEXIV，cysEXI和cysEXXII)與本發(fā)明的基因結(jié)合時，可以獲得超過30克/升N-乙酰-L-絲氨酸的產(chǎn)量。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)(B)街道Zielstattstr.20(C)城市慕尼黑(D)聯(lián)邦州巴伐利亞(E)國家德國(F)郵區(qū)代碼81379(G)電話089-74844-0(H)傳真089-74844-350(ii)發(fā)明名稱用于發(fā)酵制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的微生物和方法(iii)序列數(shù)12(iv)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度43個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部片段(vi)原始來源(A)有機(jī)體大腸桿菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO1
Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp1 5 10 l5Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Arg20 25 30Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val35 40(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度306個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)原始來源(A)有機(jī)體大腸桿菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Phe Arg Gly Gly Arg Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala1 5 10 15Leu Leu Val Val Val Val Trp Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val20 25 30Gly Leu His Asn Met Pro Arg Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met35 40 45Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile Phe Phe Val ALa Arg Pro Lys Val Pro50 55 60Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe65 70 75 80Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala85 90 95Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala100 105 110Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala115 120 125Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly130 135 140Gln His Val Ala Met Leu Gly Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe145 150 155 160Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser165 170 175Thr Arg Pro Ala Val Met Ser Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro180 185 190Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr195 200 205Met Ile His Ser Leu Val Thr Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu210 215 220Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ile Trp Gly225 230 235 240Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu245 250 255Leu Val Pro Val Val Gly Leu Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu260 265 270Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly275 280 285Leu Thr Ile Asn Val Phe Gly Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val290 295 300Gly Ser305(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度299個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)原始來源(A)有機(jī)體大腸桿菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp1 5 10 15Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Arg20 25 30Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile35 40 45Phe Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr50 55 60Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile65 70 75 80Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln85 90 95Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu100 105 110His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu115 120 125Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Leu Gly130 135 140Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Cly Asn Tle145 150 155 160Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser165 170 175Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala150 185 190Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr195 200 205Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala210 215 220Thr Ile Val Gly Thr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu225 230 235 240Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu245 250 255Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe260 265 270Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly275 280 285Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser290 295(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度266個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)原始來源(A)有機(jī)體大腸桿菌(B)菌株K12(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile Phe1 5 10 15Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr Gly20 25 30Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile Asn35 40 45Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln Ala50 55 60Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu His65 70 75 80Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu Val85 90 95Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Ieu Gly Phe100 105 110Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile Phe115 120 125Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser Leu130 135 140Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Aal Ser145 150 155 160Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr Ile165 170 175Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Thr Leu Ala Phe Val Ala Thr180 185 190Ile Val Gly Thr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Gly Thr195 200 205Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu Ala210 215 220Ser ALa Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe Leu225 230 235 240Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly Leu245 250 255Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser260 265(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種核酸(A)描述/desc＝＂合成＂(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO5TGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT CGGCGTTG 38(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種核酸(A)描述/desc＝＂合成＂(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO6CTCGATGCAT TACGTAGGGG TATCCGGGAG CGGTATTG 38(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種核酸(a)描述/desc＝＂合成＂(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO7TTTGGCGCGC CGATCAGCGG CGGCGCAACC ATCAG 35(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種各樣的核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO8GCCTTAATTA AGATCGACAC TCAGGCTGTA CTGGCGAC38(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO9GGAATTCATT AATCCGGCGA CTAACGAATC AACTG35(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假設(shè)否
(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO10GCCTTAATTA ACGCTATGTA GTTTGTTCTG GCCCCG36(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO11GTCGACGCGT GAGGCGAGTC AGTCGCGTAA TGC 33(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型各種核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO12GACCTTAATT AAGATCTCAT ATGTTCCACC AGCTATTTGT TAG 4權(quán)利要求
1.一種適合于制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸和/或四氫噻唑衍生物的微生物菌株，該菌株過量表達(dá)至少一種編碼直接適用于向胞外分泌抗生素或?qū)υ撐⑸镉卸拘缘钠渌镔|(zhì)的蛋白質(zhì)的基因。
2.如權(quán)利要求1所要求的微生物菌株；其中選自mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex基因、bmr基因及qacA基因的至少一種基因作為編碼直接適用于向胞外分泌抗生素或?qū)υ撐⑸镉卸拘缘钠渌镔|(zhì)的蛋白質(zhì)的基因被過量表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1所要求的微生物菌株；其中編碼包含序列MSRKDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ.ID.NO1)或者與SEQ.ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白質(zhì)的基因作為編碼直接適用于向胞外分泌抗生素或?qū)υ撐⑸镉卸拘缘钠渌镔|(zhì)的蛋白質(zhì)的基因被過量表達(dá)。
4.一種基因，該基因編碼包含序列MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVIKVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ.ID.NO1)或者與SEQ.ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白質(zhì)。
5.一種基因，該基因編碼包含以下序列SEQ.ID.NO2或者與SEQ.ID.NO2具有高于50％的序列同源性的序列的蛋白質(zhì)1 MKFRGGRMSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV51 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL101 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML151 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS201 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR251 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK301 AVKVGS*(SEQ.ID.NO2)
6.一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含序列MSR KDGVLALLVV VVWGLNFVVIKVGLHNMPRL MLAGLRFMLV(SEQ.ID.NO1)或者與SEQ.ID.NO1具有高于50％的序列同源性的序列。
7.一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有至少一種如權(quán)利要求4或5所要求的基因。
8.一種制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或其四氫噻唑衍生物的方法，該方法包括在發(fā)酵中以已知的方式使用如權(quán)利要求1、2和3中所要求的微生物菌株。
9.外向通量基因在增強(qiáng)表達(dá)發(fā)酵中胞內(nèi)形成的氨基酸或氨基酸衍生物中的用途。
10.一種制備L-半胱氨酸的方法，該方法包括使由微生物胞內(nèi)形成的L-半胱氨酸在微生物胞內(nèi)與存在于這一微生物胞內(nèi)的醛或酮反應(yīng)，以產(chǎn)生四氫噻唑衍生物；采用直接適用于向胞外分泌抗生素或?qū)υ撐⑸镉卸拘缘钠渌镔|(zhì)的蛋白質(zhì)將這種四氫噻唑衍生物分泌到微生物外；并且在合適時，在分離出四氫噻唑衍生物后，通過向L-半胱氨酸的方向移動L-半胱氨酸和四氫噻唑衍生物之間的反應(yīng)平衡獲得L-半胱氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于發(fā)酵制備L－半胱氨酸、L－胱氨酸、N－乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的微生物和方法。按照本發(fā)明的微生物菌株適合于制備L－半胱氨酸、L－胱氨酸、N－乙酰絲氨酸和/或四氫噻唑衍生物,其過量表達(dá)至少一種編碼直接適用于向胞外分泌抗生素或?qū)υ撐⑸镉卸拘缘钠渌镔|(zhì)的蛋白質(zhì)的基因。
文檔編號C07K14/245GK1203274SQ9810261
公開日1998年12月30日 申請日期1998年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月19日
發(fā)明者克里斯托弗·溫特豪特, 威爾弗雷德·萊因費(fèi)爾德 申請人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)