專利名稱：從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中純化高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有編碼已附加表位的TATA框結(jié)合蛋白(TBP)的DNA的轉(zhuǎn)基因、產(chǎn)生表達(dá)已附加表位的TBP的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和使用它們從各種類型的真核組織和細(xì)胞親和純化(新的)轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。
對(duì)真核轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)重要的是前起始復(fù)合物的逐步形成和活性。此復(fù)合物是一種大的多亞基復(fù)合物，對(duì)于RNA聚合酶II酶在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的正確定位和起始是必需的。在最近幾年，從真核生物的核中鑒定了這種復(fù)合物的許多一般轉(zhuǎn)錄因子(GTFs)，包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH(Zawel和Reinberg(1995)生物化學(xué)年度綜述64，533-561；Serizawa等(1994)，“轉(zhuǎn)錄機(jī)制和調(diào)節(jié)”，45-66，Raven出版社)。在含有TATA的啟動(dòng)子中，TFIID和TATA框序列具有特異性的親和性。正是通過這種序列識(shí)別出TFIID是在基礎(chǔ)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄中結(jié)合啟動(dòng)子的首要因素，因此是形成復(fù)合物的核心(Lewin，B.(1990)細(xì)胞.611161-1164)。其它的GTFs以確定的逐步的方式結(jié)合，產(chǎn)生了整個(gè)前起始復(fù)合物。其后，這種大的復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)征集并且使RNA聚合酶II(Pol II)正確定位以開始基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。因此，可以看出本身為多亞基復(fù)合物的TFIID在調(diào)節(jié)″活化的轉(zhuǎn)錄″中起關(guān)鍵作用，也可以說成在轉(zhuǎn)錄激活物的存在下mRNA的產(chǎn)生水平提高了。這樣的激活物可以是天然存在的結(jié)合增強(qiáng)子的決定簇(如結(jié)合E框的USF(Sawadogo和Roeder(1985)細(xì)胞43165-175；Kirschbaum等(1992)分子細(xì)胞生物學(xué)125094-5100))或病毒因子(例如VP16(Stringer等(1990)自然345783-786))。
TFIID是由結(jié)合TATA的蛋白質(zhì)(TBP)和一些TBP相關(guān)性因子(TAF11s)(在本申請(qǐng)中″TAF11s”包括任何種類的轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄激活物、轉(zhuǎn)錄抑制劑)組成的。到目前為止已經(jīng)鑒定了多達(dá)20種不同的TAF11s，同時(shí)觀察到了含有TAF11s不同組合的TFIID復(fù)合物(Zawel和Reinberg(1995)生物化學(xué)年度綜述64533-561；Hori，R.和Carey，M.(1994)當(dāng)代遺傳學(xué)的最新發(fā)展4236-244)。此外，TAF11s的不同組合導(dǎo)致了TFIID復(fù)合物不同的性質(zhì)。例如，在果蠅屬中，模式形成蛋白質(zhì)Hunchback(HB)和Bicoid(BCD)完全依靠TFIID復(fù)合物中的TAF1160、TAF11110和TAF11250的存在(Sauer，F(xiàn).等(1995)科學(xué)270，1783-1788)。這些TFIID組分作為上游結(jié)合增強(qiáng)子的HB和BCD蛋白質(zhì)的共激活物。已經(jīng)表明神經(jīng)原因子NTF-1需要TBP、TAF11150(NTF-1與之結(jié)合)和TAF11250的最小復(fù)合物來激活轉(zhuǎn)錄，而SP1需要附加的因子TAF11110來激活(Chen，J.-L.等(1994)細(xì)胞7993-105)。另一個(gè)研究確定了TAF1128，它的存在對(duì)于轉(zhuǎn)錄激活(通過雌激素與維生素D3核受體)是必需的(May，M.等(1996)EMBO 15.3093-3104)。很可能TAF11s作為轉(zhuǎn)錄銜接子通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用從活化劑/阻遏物因子向核心起始復(fù)合物傳遞調(diào)節(jié)信息。
從目前轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)來看，單個(gè)基因和/或密切相關(guān)基因座小組的表達(dá)是由一定數(shù)目的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的亞基控制的。盡管一些因子在大多數(shù)轉(zhuǎn)錄過程中是普遍存在的(例如GTFs)，但是人們描述了數(shù)量不斷增加的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的基因和細(xì)胞特異性因子。已經(jīng)存在一些被證明的用于鑒定轉(zhuǎn)錄因子的方法。揭示RNA Pol II和七個(gè)GTFs(TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、和TFIIJ)的先前的方法主要包括細(xì)胞系中的核制劑的柱分級(jí)分離(Zawel和Reinberg(1995)；Serizawa等(1994)；Roeder，R.G.(1996)TIBS 21327-335)。這些組分產(chǎn)生能夠轉(zhuǎn)錄的各種半純化的蛋白質(zhì)。這些組分的大多數(shù)看來似乎對(duì)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄來說是完全必要的。在這一點(diǎn)上，已知TFIID組分負(fù)責(zé)識(shí)別TATA框。然而，沒能成功地分離出能夠結(jié)合TATA的單一蛋白質(zhì)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)單一組分的酵母顯示出在重建基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄分析中能夠代替TFIID，其能進(jìn)行27kD的結(jié)合TATA的蛋白質(zhì)(TBP)的分離與克隆，那么就會(huì)發(fā)生突破(Buratowski，S.等(1988)自然33437-42；Cavallini，B.等(1988)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)869803-9809)。使用簡(jiǎn)并的引物對(duì)人TBP亞單位和小鼠TFIID的基因進(jìn)行進(jìn)一步鑒定((Kao，C.C.等(1990)科學(xué)2481646-1649；Hoffmann，A.等(1990)自然346387-390；Peterson，M.G.等(1990)科學(xué)2481625-1630)，Drosophila(Hoey，T.等(1990)細(xì)胞611179-1186；Muhich，M.L.等(1990)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)87，9148-9152)；(Tamura，T.等(1991)核酸研究193861-3865))。
從不同物種能夠得到TBP的cDNA使得各種各樣的研究(包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中過量表達(dá)這些蛋白質(zhì))成為可能。產(chǎn)生的HeLa細(xì)胞系在組成上表達(dá)了TBP蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有FLAG-尾或者流感病毒血凝素(HA)附加表位加入到它的氨基末端(Zhou，Q.等(1993)基因和發(fā)展7，180-187，Chiang等(1993)EMBO 12，2749-2762)。FLAG-尾是由八個(gè)氨基酸的合成序列組成的表位。HA-尾是具有SEQ ID NO.1“MGYPYDVPDYAV”(單字母代碼)的氨基酸序列的天然表位。
也將來源于天然的HA尾(來源于流感病毒血凝素的10個(gè)氨基酸)的較短的肽用于在果蠅屬細(xì)胞系中表達(dá)含有TBP的融合蛋白上(Colgan和Manley(1992)，基因發(fā)展.6，304-331；Trivrdi等，(1996)分子細(xì)胞生物學(xué)16，6909-6916)。
在細(xì)菌中已經(jīng)表達(dá)了氨基末端具有兩個(gè)附加表位(FLAG-和HA-表位)的TBP蛋白質(zhì)(Chiang等(1993)EMBO 122749-2762)。在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下也表達(dá)了已附加FLAG的TBP蛋白質(zhì)(Wu等，(1996)生物技術(shù)21718-725)。然而，將抗表位/表位的單克隆抗體用于從核提取物中純化TBP相關(guān)性復(fù)合物，這樣共純化TFIID復(fù)合物的TBP相關(guān)性因子(TAF11s)(Zhou等，(1993)遺傳學(xué)發(fā)展。7180-187)。
隨著最近從HeLa核提取物和酵母中鑒定新的TAFs和TAF-相互作用因子，許多實(shí)驗(yàn)室按照這些方法繼續(xù)研究(Hori和Carey(1994)遺傳學(xué)的最新發(fā)展.4236-244；Zawel和Reinberg(1995)生物化學(xué)年度綜述64533-561；Roeder，R.G.(1996)生物化學(xué)科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)21，327-335)。
在人體中鑒定了TAFs TAF1168、TAF1155、TAF1130、TAF1128、TAF1220和TAF1118(Mengus等(1995)EMBO 141520-1531；Bertolotti等(1996)EMBO 155022-5031；Wu和Chiang(1996)生物技術(shù)21718-725)不能過分強(qiáng)調(diào)的是盡管按照這些方法發(fā)現(xiàn)了大量的因子，但是也不能把研究只局限于對(duì)細(xì)胞系類型或者目前正在使用的酵母菌株具有特異性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、TAFs、和TAF-相互作用因子上。
本發(fā)明涉及一種更″通用的系統(tǒng)″，其中使用已附加表位的TBP來從各種不同類型的真核組織和細(xì)胞中親和純化新型轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄因子(本文中所有動(dòng)物的TAFs、TAF-相互作用因子)。
本發(fā)明涉及能夠表達(dá)已附加表位的TATA框結(jié)合蛋白(TBP)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。另一方面，本發(fā)明涉及到轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的用途，特別是用于鑒定與分離高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和用于鑒定與分離在高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中相關(guān)的蛋白質(zhì)(TAFs和TAF-相互作用因子，如轉(zhuǎn)錄因子)中的蛋白質(zhì)。另一方面本發(fā)明涉及優(yōu)選地在動(dòng)物的特殊發(fā)育階段，通過將轉(zhuǎn)基因引入到非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的種系和/或體細(xì)胞中，從而制備非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明還涉及可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因。
這樣，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了編碼已附加表位的TBP的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地含有編碼一個(gè)或多個(gè)附加表位的第一種DNA序列和含有編碼TBP的第二種DNA序列。所說的轉(zhuǎn)基因還可以含有編碼附加表位的DNA-序列。編碼TBP的DNA優(yōu)選的是cDNA。編碼TBP的DNA可以是任何天然產(chǎn)生的DNA、其衍生物或者它的一部分。DNA(優(yōu)選的是cDNA)可以來源于真核生物例如包括鳥、兩棲類、爬行類、酵母、C.elegans、哺乳動(dòng)物等等。例如可以使用來源于嚙齒動(dòng)物、綿羊、狗、母牛、豬、靈長(zhǎng)類和人的編碼TBP的DNA或者它的一部分。優(yōu)選的是使用人TBP(hTBP)-cDNA。本發(fā)明也包含任何非天然存在的DNA(例如TBP-cDNA衍生物)的用途。DNA的衍生物例如可以具有改變的序列，例如突變的或者修飾的序列和/或包含修飾的核苷酸。此DNA的衍生物也可以是鹽，優(yōu)選的是生理上可耐受的鹽。
轉(zhuǎn)基因包含一種或多種DNA序列，所說的DNA序列編碼一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或者更多的附加表位。優(yōu)選地，所說的轉(zhuǎn)基因含有編碼兩個(gè)附加表位的DNA。編碼個(gè)體附加表位的DNA可以位于編碼TBP的DNA的5’-和/或3’末端，和/或位于編碼TBP的DNA序列中間合適的位置上。編碼個(gè)體附加表位的DNA可以是分開的，和/或以串聯(lián)的方式排列，或者彼此直接鄰近。
可以使用任何天然或者合成的肽作為附加表位。每一附加表位都以帶有TBP的融合蛋白形式表達(dá)，所說的附加表位例如可以與TBP直接連接或者通過間隔肽連接。優(yōu)選地，附加表位應(yīng)該可以使TBP或者融合蛋白進(jìn)行親和純化，也可以使與TBP或者所說的融合蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)(如TAFs和TAF-相互作用因子)進(jìn)行親和純化。此外，當(dāng)附加表位表達(dá)成帶有TBP的融合蛋白時(shí)，其不應(yīng)該破壞TBP的功能活性。為此，優(yōu)選使用較短的肽作為附加表位。它們可以包含大約1-50或更多的氨基酸，特別是使用包含5-15個(gè)氨基酸的肽?？捎米鞲郊颖砦坏碾牡姆窍拗菩岳邮荈LAG-表位、HA-表位、多個(gè)組氨酸殘基(6-10個(gè)組氨酸殘基或者更多，優(yōu)選的是6個(gè)組氨酸殘基)(His尾)、Myc尾(Stone等，(1996)自然384129-134)、抗生蛋白鏈菌素尾和其它。例如HA-表位的用途包括表位“MGYPYDVPDYA“(SEQ ID NO.2)、”GYPYDVPDYA”(SEQ ID NO.3)、″YPYDVPDYA″(SEQ ID NO.4)或者其它來源于HA-表位的肽的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中所說的轉(zhuǎn)基因包含人TBP的cDNA和兩個(gè)編碼附加表位的DNA序列。優(yōu)選的是第一個(gè)DNA序列編碼HA表位，這種表位可以用作免疫反應(yīng)(例如與市售的單克隆抗體)的表位(Kolodziej和Young(1991)酶學(xué)方法194508-519)。編碼6個(gè)組氨酸殘基(His尾)的一段DNA序列恰好位于編碼HA尾之序列的3’端。此His尾可以與Ni2+離子形成非共價(jià)的可逆的復(fù)合物。例如，通常使用市售的Ni2+的瓊脂糖親和柱物質(zhì)來純化已附加His的蛋白質(zhì)(Hochuli，E.等(1987)層析雜志411177-184；Janknecht，R.等(1991)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)744835)。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中轉(zhuǎn)基因包含SEQ ID NO.13的DNA序列。所說的SEQ ID NO.13提供了編碼由雙加尾的hTBP組成的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼已附加表位的TBP以及含有用于表達(dá)所說的融合蛋白的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因。除了編碼TBP的DNA(如TBP的cDNA或者其衍生物)和編碼附加表位的DNA序列外，所說的轉(zhuǎn)基因可以包含一個(gè)或多個(gè)基因調(diào)節(jié)序列。這樣的基因調(diào)節(jié)序列，例如是天然的或者合成的啟動(dòng)子或者它的一部分、和/或順式作用元件(例如增強(qiáng)子、沉默子)。為此，可以使用哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，例如小鼠運(yùn)鐵蛋白基因的啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)基因的啟動(dòng)子(Forss-Petter，S.等(1990)神經(jīng)元5187-197)、或者胸苷激酶基因的啟動(dòng)子。也可以使用病毒啟動(dòng)子(如巨細(xì)胞病毒基因或者SV 40早期基因的啟動(dòng)子)。優(yōu)選使用可誘導(dǎo)的或者組成型啟動(dòng)子或者它們的衍生物?？梢允褂茫缛搜由煲蜃?1α基因(EF)(Uetsuki，T.等(1989)生物化學(xué)雜志2645791-5798)的啟動(dòng)子作為組成型啟動(dòng)子?？梢允褂茫缇哂袔讉€(gè)順式元件的金屬硫蛋白啟動(dòng)子(MT)作為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這些順式元件對(duì)重金屬能夠作出響應(yīng)(Palmiter，R.D.(1987)Experimentia Supplementum 5263-80，BirkhuserVerlag)。另外，為此，可以使用例如具有細(xì)胞周期特異性、細(xì)胞類型特異性或者發(fā)育特異性的基因啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中轉(zhuǎn)基因包含hTBP的cDNA和編碼HA表位(例如天然的HA表位的9個(gè)氨基酸)、His表位(例如6×his尾)的DNA序列以及組成型啟動(dòng)子。例如，人延伸因子-1α(EF)的啟動(dòng)子控制TBP的表達(dá)(Uetsuki等(1989)生物化學(xué)雜志2645791-5798)。EF啟動(dòng)子是沒有TATA的啟動(dòng)子，使用此啟動(dòng)子已經(jīng)在小鼠中以中等但恒定的水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Hanaoka，K.等(1991)分化，183-189)。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所說的轉(zhuǎn)基因包含編碼雙加尾(HA和His表位)的hTBP的DNA序列和EF啟動(dòng)子的序列，具體地說，所說的轉(zhuǎn)基因具有SEQ ID NO.14的DNA序列。
在本發(fā)明另一個(gè)特定的實(shí)施方案中轉(zhuǎn)基因包含編碼TBP的DNA(優(yōu)選的是hTBP的cDNA)、編碼HA(例如天然HA表位的9個(gè)氨基酸)和His表位(例如6×his)的DNA序列、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。優(yōu)選地，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是金屬硫蛋白啟動(dòng)子(MT)。例如，如果向動(dòng)物的基因組導(dǎo)入額外的TBP編碼序列和隨后TBP或者TBP融合蛋白的表達(dá)對(duì)動(dòng)物有毒，本發(fā)明的這一實(shí)施方案將使所說的動(dòng)物，在導(dǎo)入所說的啟動(dòng)子之前能夠忍受編碼TBP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因(此基因保持沉默)。例如可以在所說的動(dòng)物完全發(fā)育成熟時(shí)或在任何感興趣的發(fā)育階段誘導(dǎo)所說的啟動(dòng)子，例如可以通過腹膜間注射含有二價(jià)陽(yáng)離子(如Zn2+、Mg2+、Mn2+或者Cd2+)的溶液來誘導(dǎo)MT啟動(dòng)子。用其它的模型已經(jīng)證明在MT指導(dǎo)下，基因的表達(dá)水平有所提高(Palmiter，R.D.等(1982)細(xì)胞29701-710)。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所說的轉(zhuǎn)基因包含編碼雙加尾的hTBP(HA和His表位)的DNA序列和MT-啟動(dòng)子，具體地說，此轉(zhuǎn)基因具有SEQ ID NO.15的DNA序列。
本發(fā)明還涉及通過將編碼一個(gè)或多個(gè)附加表位的DNA序列與編碼TBP蛋白質(zhì)的DNA序列連接以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的方法。
本發(fā)明還涉及所說的轉(zhuǎn)基因的用途。例如所說的轉(zhuǎn)基因可以用于制備重組載體。
本發(fā)明也涉及制備重組載體的方法。此方法包括將所說的轉(zhuǎn)基因整合到合適的載體(例如含有調(diào)節(jié)序列的載體)中。載體的例子是表達(dá)載體、反轉(zhuǎn)錄病毒或者它的衍生物。
本發(fā)明還涉及含有所說的轉(zhuǎn)基因的重組載體的用途。尤其是本發(fā)明涉及包含轉(zhuǎn)基因的重組載體的用途(如包含TBP(尤其是hTBP)的cDNA或者它的衍生物、編碼附加表位的DNA序列(例如HA和His表位的編碼DNA序列)的重組載體)。本發(fā)明涉及此載體用于將所說的轉(zhuǎn)基因引入到真核細(xì)胞(特別是引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的用途。本發(fā)明還涉及含有這種轉(zhuǎn)基因的載體用于在細(xì)菌或真核細(xì)胞中擴(kuò)增所說的轉(zhuǎn)基因的用途。已經(jīng)導(dǎo)入了含有所說的轉(zhuǎn)基因的載體的真核細(xì)胞也可以用于轉(zhuǎn)基因的異源/轉(zhuǎn)基因表達(dá)。所說的真核細(xì)胞(宿主細(xì)胞)可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一部分。
在本發(fā)明的一個(gè)主要的實(shí)施方案中轉(zhuǎn)基因用于制備轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。因此，可以將轉(zhuǎn)基因或者含有轉(zhuǎn)基因的重組載體引入到宿主細(xì)胞和/或動(dòng)物中。另一方面本發(fā)明涉及通過將所說的轉(zhuǎn)基因引入到動(dòng)物或者它的細(xì)胞中而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠表達(dá)或者過量表達(dá)TPB或者含有或者由已附加表位的TBP組成的融合蛋白。
為了制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使用非人動(dòng)物作為宿主動(dòng)物。這種非人動(dòng)物包括脊椎動(dòng)物(如嚙齒動(dòng)物)、非人靈長(zhǎng)目、綿羊、山羊、狗、母牛、豬、鳥、兩棲類、爬蟲等等。優(yōu)選的動(dòng)物選自動(dòng)物的非人哺乳動(dòng)物種類，優(yōu)選地，所說的動(dòng)物選自嚙齒動(dòng)物科(包括大鼠和小鼠)，最優(yōu)選的是小鼠。
按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物包括任何其基因組上已經(jīng)導(dǎo)入了一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，所說的轉(zhuǎn)基因指導(dǎo)基因的表達(dá)、或者編碼TBP或它的衍生物(如包含TBP和附加表位的融合蛋白)。所說的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)該能夠表達(dá)已附加表位的TBP蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以具有內(nèi)源TBP基因的轉(zhuǎn)基因的間斷或者改變(剔除動(dòng)物)。
按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是通過非天然的手段(即通過人的操作)已經(jīng)將一個(gè)或多個(gè)TBP基因(按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因)導(dǎo)入到其中的動(dòng)物，所說的TBP基因不是所說的動(dòng)物天然存在的基因，如外源TBP基因或者它的衍生物(象通過基因工程方法產(chǎn)生的內(nèi)源或外源TBP基因)。非天然存在的TBP基因稱為轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因可以來自與所說的動(dòng)物相同或者不同的物種，但是在任何情況下，所說的轉(zhuǎn)基因絕不以所說的構(gòu)象天然存在于所說的動(dòng)物和/或此轉(zhuǎn)基因的染色體位點(diǎn)上。
所說的轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)基因DNA)可以包含編碼TBP的外源基因，即通常在宿主動(dòng)物的基因組中不存在的序列，如從不同的動(dòng)物種類中獲得的TBP基因或者cDNA。另外，轉(zhuǎn)基因可以包含編碼TBP的內(nèi)源基因，如不正常的DNA序列，這是因?yàn)轶w外已經(jīng)將這些序列進(jìn)行了重排或突變以便改變TBP基因體內(nèi)正常的表達(dá)模式，或者改變或消除內(nèi)源TBP的生物活性。本發(fā)明也涉及表達(dá)載體，這些表達(dá)載體含有所說的轉(zhuǎn)基因并可以用于制備所說的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。可以通過將轉(zhuǎn)基因和/或載體(如含有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體)分別引入到種系或者種系細(xì)胞和/或非人動(dòng)物的體細(xì)胞中來產(chǎn)生按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如各種發(fā)育階段的胚靶細(xì)胞都可以用來導(dǎo)入本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚靶細(xì)胞的發(fā)育階段可以使用不同的方法。列舉如下1.在實(shí)施本發(fā)明的過程中，合子胚的微注射是將轉(zhuǎn)基因?qū)氲絼?dòng)物基因組中的理想方法。微注射包括在單細(xì)胞階段分離胚。因此，還沒有經(jīng)過生殖核融合或接下來的細(xì)胞分裂的合子胚(受精卵)對(duì)于轉(zhuǎn)基因DNA(轉(zhuǎn)基因的DNA)的微注射是理想的靶細(xì)胞。當(dāng)鼠的雄性生殖核直徑達(dá)到大約20微米時(shí)，它的特性是經(jīng)過1-2微微升的含有轉(zhuǎn)基因DNA的溶液注射后，具有再生性。合子胚用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的好處是，在大多數(shù)情況下所注射的轉(zhuǎn)基因DNA在第一次細(xì)胞分裂之前將摻入宿主動(dòng)物的基因組中(Brinster，等(1985)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)824438-4442)。結(jié)果，所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(新出生的動(dòng)物)的所有細(xì)胞都在特定的基因座位上穩(wěn)定地?cái)y帶有摻入的轉(zhuǎn)基因(稱作轉(zhuǎn)基因的等位基因)。這些轉(zhuǎn)基因的等位基因表現(xiàn)出孟德爾遺傳規(guī)律轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交所得的子代有半數(shù)將遺傳轉(zhuǎn)基因的等位基因，符合孟德爾的隨機(jī)分配規(guī)律。
“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(Carl A.Pinkert編輯，學(xué)院出版社公司(1994))中詳細(xì)描述了通常使用的胚操作和轉(zhuǎn)基因DNA微注射的方法。
2.病毒整合也可以用于將按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因引入到動(dòng)物中。將正在發(fā)育的胚體外培養(yǎng)使之發(fā)育到稱作卵裂球的發(fā)育階段。此時(shí)，用含有轉(zhuǎn)基因的載體(轉(zhuǎn)基因DNA/DNA構(gòu)建體)感染卵裂球，例如可以使用合適的病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體達(dá)到此目的(Jaenich，R.(1976)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)731260-1264)?？梢酝ㄟ^酶促除去透明帶來增強(qiáng)卵裂球的轉(zhuǎn)化或者感染(Hogan，等(1986)小鼠胚的操作，冷泉港出版社，冷泉港，紐約)。如果通過病毒載體將所說的轉(zhuǎn)基因引入到卵裂球中，一般這種載體是復(fù)制缺陷型的，但是它們保留了將與載體序列連接的轉(zhuǎn)基因DNA序列整合到宿主動(dòng)物的基因組上的能力(Jahner等(1985)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)826927-6931；Van der Putten等(1985)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)826148-6152)。通過在能夠產(chǎn)生含有轉(zhuǎn)基因之載體的單層細(xì)胞上培養(yǎng)卵裂球可以很容易且有效地完成轉(zhuǎn)染(Van der Putten等(1985)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)826148-6152；Stewart等(1987)EMBO 6383-388)。
此外，可以在更晚的階段(如囊胚腔)時(shí)進(jìn)行感染(Jahner，D.等(1982)自然298623-628)。在任何情況下，大多數(shù)新出生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒或病毒整合到所有細(xì)胞中的僅一個(gè)上而產(chǎn)生的。此外，多個(gè)(逆轉(zhuǎn)錄)病毒的整合可以發(fā)生在單個(gè)新出生的動(dòng)物上，產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)基因的等位基因，這些等位基因在將來產(chǎn)生子代的過程中將分離。通過這種方法將轉(zhuǎn)基因?qū)氲椒N系細(xì)胞是可能的，但是可能導(dǎo)入的頻率很低(Jahner，D.等(1982)自然298623-628)。然而，一旦用這種方法將轉(zhuǎn)基因?qū)氲椒N系細(xì)胞中，就可以產(chǎn)生所有的動(dòng)物細(xì)胞(即體細(xì)胞和種系細(xì)胞)中都存在轉(zhuǎn)基因的等位基因的子代。
3.胚干(ES)細(xì)胞也可以用作將按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因?qū)氲絼?dòng)物中的靶細(xì)胞?？梢詮闹踩肭芭攉@得ES細(xì)胞，這種胚可以進(jìn)行體外培養(yǎng)(Evens，M.J.等(1981)自然292154-156；Bradley，M.O.等(1984)自然309255-258；Gossler，等(1986)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)839065-9069；Robertson等(1986)自然322455-448；Robertson，E.J.，畸形癌和胚干細(xì)胞實(shí)用方法，Robertson，E.J編輯，IRL出版社，牛津(1987)，71-112頁(yè))?？梢允褂靡粋€(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因通過已經(jīng)建立的方法轉(zhuǎn)化市售(例如從基因組系統(tǒng)公司，St.Louis，MO)的ES細(xì)胞(Lovell-Badge，R.H.，畸形癌和胚干細(xì)胞實(shí)用方法，Robertson，E.J編輯，IRL出版社，牛津(1987)，153-182頁(yè))。轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞可以與動(dòng)物卵裂球結(jié)合在一起，這樣ES細(xì)胞定居在胚上并有助于產(chǎn)生的嵌合體(由來源于兩個(gè)或更多的動(dòng)物的細(xì)胞組成的)動(dòng)物的種系(Jaenisch，R.(1988)科學(xué)2401468-1474；Bradley，A.，畸形癌和胚干細(xì)胞實(shí)用方法，Robertson，E.J編輯，IRL出版社，牛津(1987)，113-151頁(yè))。一旦用這種方法將轉(zhuǎn)基因?qū)氲椒N系細(xì)胞中，就可以產(chǎn)生所有的動(dòng)物細(xì)胞(即體細(xì)胞和種系細(xì)胞)中都存在轉(zhuǎn)基因的等位基因的子代。
然而，轉(zhuǎn)基因的最初引入不符合孟德爾規(guī)律。但是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因可以穩(wěn)定地整合到種系細(xì)胞中，并以孟德爾基因座傳遞給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的子代。種系的整合對(duì)產(chǎn)生能夠?qū)⑦z傳信息以孟德爾方式傳遞給其子代的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并能夠以永久的動(dòng)物模型使用這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是至關(guān)重要的。
其它的轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)致嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生，這些動(dòng)物中一些細(xì)胞攜帶轉(zhuǎn)基因，而其它細(xì)胞不攜帶轉(zhuǎn)基因。在種系細(xì)胞不攜帶轉(zhuǎn)基因的嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，轉(zhuǎn)基因不能傳遞給子代。然而，嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)基因有關(guān)的表型，并且可以用于特定轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(TAFs和TAF相互作用的因子)的親和純化。本發(fā)明涉及含有本發(fā)明所描述的轉(zhuǎn)基因的嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因引入的突變，所說的突變包括無(wú)效(“剔除”)等位基因，在這些等位基因中，編碼物種特異性TBP的DNA序列發(fā)生缺失和/或在選擇的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制之下由遺傳上發(fā)生改變的同一或不同物種的TBP序列代替。
本發(fā)明涉及已經(jīng)導(dǎo)入了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所說的轉(zhuǎn)基因包含編碼已附加表位的TBP的DNA，如果需要還包含本文提到的組成型或者誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。具體地說，本發(fā)明涉及已經(jīng)導(dǎo)入了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所說的轉(zhuǎn)基因包含編碼已附加HA和His表位的hTBP的DNA序列和EF啟動(dòng)子的DNA序列。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及已經(jīng)導(dǎo)入了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所說的轉(zhuǎn)基因包含編碼已附加HA和His表位的hTBP的DNA序列和MT啟動(dòng)子的DNA序列。在本發(fā)明一個(gè)特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因具有SEQ ID NO.13的序列。本發(fā)明的另一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因具有SEQ ID NO.14的序列。本發(fā)明的另一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因具有SEQ ID NO.15的序列。具體地說，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有已穩(wěn)定整合到其基因組上的轉(zhuǎn)基因(例如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和/或SEQ IDNO.15的DNA序列)。
通過分析子代的遺傳物質(zhì)，檢測(cè)包含相當(dāng)于轉(zhuǎn)基因序列的唯一序列的生物分子或由轉(zhuǎn)基因編碼的生物分子是否存在，可以將已遺傳了轉(zhuǎn)基因的子代與沒有遺傳轉(zhuǎn)基因的子代區(qū)別開。例如，可以對(duì)含有只由按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因編碼的多肽(例如已附加表位的TBP)的生物液體進(jìn)行免疫測(cè)定，以檢驗(yàn)由轉(zhuǎn)基因編碼的多肽(如已附加表位的TBP)是否存在。鑒定轉(zhuǎn)基因子代的更簡(jiǎn)單和更有效的方法包括從動(dòng)物的遠(yuǎn)端(如尾巴)獲得組織樣品，并分析樣品中是否存在對(duì)應(yīng)于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因特有的一部分或幾部分之DNA序列的核酸序列。例如可以通過使用對(duì)應(yīng)于所說的轉(zhuǎn)基因特有的部分的DNA序列的雜交(“Southern”、“Northern”)分析、以樣品中的DNA序列作為底物和使用來源于轉(zhuǎn)基因的DNA序列的寡核苷酸的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的分析等等來確定所說的核酸序列是否存在。
因此，本發(fā)明也涉及檢驗(yàn)方法，在這種檢驗(yàn)方法中可以檢驗(yàn)可能的第一代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Go)以及所有的后代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(G1、G2、G3、G4...)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系的動(dòng)物是否存在所說的轉(zhuǎn)基因(例如通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng))。為此，可以在蛋白酶K和RNAse處理后，從動(dòng)物組織(如尾組織)中提取基因組DNA。對(duì)于這種PCR反應(yīng)，引物序列應(yīng)該相當(dāng)于部分轉(zhuǎn)基因的序列，例如在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)，編碼附加表位的DNA區(qū)和/或特定TBP構(gòu)建體獨(dú)有的DNA區(qū)。在小鼠的這種PCR反應(yīng)中，例如可以在大約25％注射的卵中檢測(cè)到相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，即大約25％的小鼠產(chǎn)生陽(yáng)性子代。
另一種檢驗(yàn)動(dòng)物是否攜帶轉(zhuǎn)基因的方法涉及到檢驗(yàn)可能的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系中是否存在轉(zhuǎn)基因mRNA。例如最初的實(shí)驗(yàn)可以通過S1分析進(jìn)行，這種分析對(duì)少量的mRNA是十分敏感的(Berk，A.J.和Sharp，P.A.(1977)細(xì)胞12，721)。為此，使用從動(dòng)物組織中分離的總RNA雜交標(biāo)記的反義寡核苷酸。然后，通過S1核酸酶消化所有的單鏈核酸、DNA和RNA。雙鏈DNA或者DNA-RNA雜交體保持完整。如果存在任何的轉(zhuǎn)基因mRNA，其將與反義寡核苷酸雜交，因此“保護(hù)”其免受S1核酸酶的消化。
本發(fā)明包括通過S1保護(hù)測(cè)定檢測(cè)組織制劑(如總肝mRNA的制劑)中是否存在轉(zhuǎn)基因mRNA?？梢院铣膳c部分轉(zhuǎn)基因mRNA(如對(duì)應(yīng)于已附加表位之TBP的DNA序列的mRNA)互補(bǔ)的反義寡核苷酸。例如可以經(jīng)5’-末端標(biāo)記寡核苷酸，例如使用32S、33P、35P、3H或14C進(jìn)行放射性標(biāo)記、或者使用熒光標(biāo)記物或其它類型的標(biāo)記物(如生物素或者地高辛配基)進(jìn)行標(biāo)記。按照標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook等，1989)在選擇性雜交條件下將標(biāo)記的寡核苷酸與轉(zhuǎn)基因小鼠的mRNA混合。然后將所得的混合物用S1核酸酶處理。沒有配對(duì)序列的短區(qū)(如寡核苷酸的3’-末端)應(yīng)該一定被消化掉，這些短區(qū)提供了內(nèi)部對(duì)照以表明所說的S1核酸酶確實(shí)消化了所有可能的單鏈的核酸。在轉(zhuǎn)基因mRNA存在時(shí)，標(biāo)記的寡核苷酸應(yīng)該免受消化，并且例如通過測(cè)序型變性凝膠(如8M脲PAGE)電泳可以很容易地檢測(cè)它的存在和大小。例如可以通過將凝膠曝光在膠片上來檢測(cè)沒有消化的標(biāo)記寡核苷酸的存在。如果沒有轉(zhuǎn)基因mRNA，曝光后不會(huì)顯示出任何帶，這是因?yàn)闆]有保護(hù)的寡核苷酸將由S1核酸酶消化。本發(fā)明包括從所說的動(dòng)物中制備與不同細(xì)胞類型有關(guān)的不同組織和細(xì)胞，并檢測(cè)轉(zhuǎn)基因mRNA的存在。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過Northern分析檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。最優(yōu)選的是通過Northern分析進(jìn)一步檢驗(yàn)經(jīng)PCR或者S1核酸酶圖譜已經(jīng)證明為轉(zhuǎn)基因mRNA陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(McMaster，G.K.和Carmichael(1977)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)744835)。為此，可以從不同的組織和/或細(xì)胞類型中分離總RNA，并且在瓊脂糖凝膠上(例如在變性條件下)將大小不同的片段分開。然后例如使用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和UV交聯(lián)將所得的RNA結(jié)合到膜或?yàn)V膜上。在常規(guī)的Northern印跡條件下使用相當(dāng)于轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)或其部分的標(biāo)記探針(例如使用相當(dāng)于SEQ ID NO.13的轉(zhuǎn)基因5’端的DNA探針)檢測(cè)結(jié)合的RNA。這種DNA探針優(yōu)選的長(zhǎng)度為大約20-1000堿基對(duì)(bp)。它們最優(yōu)選的長(zhǎng)度為大約100、200、300、400和500bp。如果需要將過量的標(biāo)記探針沖洗掉，并將此膜在膠片上曝光。按照如上所述標(biāo)記寡核苷酸的方法來標(biāo)記這些探針。有時(shí)寡核苷酸也可以用于這些Northern印跡實(shí)驗(yàn)中。
使用特異性免疫反應(yīng)(例如使用Western印跡分析或者ELISA)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(優(yōu)選的是在任何其它的分子生物學(xué)檢驗(yàn)中已經(jīng)證明為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)中是否存在轉(zhuǎn)基因TBP蛋白質(zhì)。因此從所說的動(dòng)物的組織或特定的細(xì)胞(優(yōu)選的是從肝臟組織或任何其它的軟組織)中通過標(biāo)準(zhǔn)方法(如在超離心的蔗糖梯度上)分離核。例如可以通過高鹽溶液(如400mM KCl)和非離子表面活性劑(例如NP-40)處理所說的核來從這些核中收集總核蛋白。之后，例如使用合適的變性凝膠電泳(優(yōu)選的是SDS-PAGE)將核蛋白按照大小不同分開。例如可以通過電轉(zhuǎn)移法將這種凝膠轉(zhuǎn)移到固體表面(如膜或者濾膜，優(yōu)選的是硝化纖維素膜)上。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook等″分子克隆″再版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)將膜或?yàn)V膜進(jìn)行預(yù)封阻并使用合適的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
為此，可以使用例如在小鼠、兔、大鼠、綿羊、山羊、馬、鳥等等中產(chǎn)生的多克隆和/或單克隆抗體。可以使用能夠識(shí)別TBP融合蛋白并能夠與酶或標(biāo)記物(如堿性磷酸酶或者熒光標(biāo)記物或者生物素或者地高辛配基或者放射標(biāo)記物)結(jié)合的抗體直接進(jìn)行檢測(cè)。也可以通過使用能夠識(shí)別一級(jí)抗體保守區(qū)的二級(jí)抗體(例如當(dāng)在小鼠中產(chǎn)生第一種抗體時(shí)，二級(jí)抗體必需是在例如綿羊中產(chǎn)生的抗小鼠的抗體)間接進(jìn)行檢測(cè)。這種二級(jí)抗體也可以與用于檢測(cè)的酶或者其它標(biāo)記物結(jié)合。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因或其部分、或者所編碼的融合蛋白或者其部分在產(chǎn)生抗體中的用途，所說的抗體能夠與所說的轉(zhuǎn)基因編碼的已附加表位的TBP結(jié)合，例如本發(fā)明涉及單克隆或者多克隆抗體的制備。
與本發(fā)明有關(guān)的抗體是能夠識(shí)別一個(gè)或多個(gè)TBP融合蛋白表位的抗體。這些抗體可以直接抗屬于TBP的各個(gè)表位，和/或可以直接抗附加表位。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及能夠識(shí)別TBP融合蛋白的氨基末端區(qū)的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及能夠識(shí)別TBP融合蛋白的羧基末端區(qū)的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及能夠識(shí)別氨基酸序列部分附近的表位的抗體，在這段氨基酸序列中TBP和附加表位和/或兩個(gè)附加表位連接在一起。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及能夠識(shí)別融合蛋白表位的抗體，所說的融合蛋白由hTBP和兩個(gè)附加表位組成。具體地說，所說的抗體能夠識(shí)別由His-和HA-尾及hTBP組成的融合蛋白的表位。最優(yōu)選的是抗體能夠HA-和His加尾的TBP氨基末端的表位。本發(fā)明特定的實(shí)施方案涉及能夠識(shí)別SEQ ID NO.16氨基酸序列的抗體或者能夠識(shí)別具有SEQ IDNO.16氨基酸序列或其部分且正確折疊的融合蛋白表位的抗體。本發(fā)明涉及能夠識(shí)別SEQ ID NO.17氨基酸序列或其正確折疊的表位(優(yōu)選的是本文的TBP融合蛋白)的抗體(抗TBP抗體)。
本發(fā)明的抗體可以是多克隆或者單克隆抗體?？梢栽诜侨藙?dòng)物的所有物種中產(chǎn)生抗體，優(yōu)選地從小鼠、大鼠、兔、綿羊、山羊、馬、鳥(例如從鳥蛋中)產(chǎn)生。可以按照標(biāo)準(zhǔn)方案產(chǎn)生這種抗體(Hurlow和lane，“抗體”“實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(1988))冷泉港出版社)。如果需要可以使用原來的免疫肽(表位)親和純化抗體。本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案涉及一種在兔中產(chǎn)生的多克隆抗體，這種多克隆抗體是用具有SEQ IDNO.17序列的肽通過兔免疫產(chǎn)生的(例如連接到合適的載體蛋白質(zhì)上)。多克隆抗體(抗TBP抗體)識(shí)別hTBP融合蛋白(HA和His尾)。
與本發(fā)明有關(guān)的抗體可以用于Western印跡分析、TPB融合蛋白的親和純化、與TBP融合蛋白相關(guān)的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的親和純化。高級(jí)復(fù)合物包含與TBP融合蛋白相關(guān)的TAFs和TAF-相互作用因子。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的用途。按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織和/或培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中親和共純化高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、TAFs和TAF-相互作用因子?？梢詮母鞣N不同的組織和/或細(xì)胞類型中分離并純化這種高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。優(yōu)選地，從這種組織/細(xì)胞類型中制備核制劑，最優(yōu)選的是從均質(zhì)化的細(xì)胞中按照標(biāo)準(zhǔn)方案制備核制劑(Dignam等(1983)核酸研究111575；Lichtenstein等(1987)細(xì)胞51963-973；Gorsky等(1986)細(xì)胞47767-776)。如果需要，然后可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法收集核蛋白。因此，本發(fā)明也涉及從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中親和共純化高級(jí)或轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、TAFs和TAF-相互作用因子的方法。
例如，本發(fā)明涉及通過使用表位-特異性抗體或帶電荷(正電荷或負(fù)電荷)的物質(zhì)對(duì)高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物TAFs和TAF-相互作用因子進(jìn)行親和純化。例如，可以將已詳細(xì)描述的抗體用于所說的親和純化。包含已附加HA和His表位的TBPs(優(yōu)選的是hTBPs)的最優(yōu)選的共純化方法之一包括使用Ni2+和/或抗HA抗體(例如市售的抗體)和/或識(shí)別SEQ ID NO.17序列之表位的抗體進(jìn)行親和純化。可以將這種抗體或者Ni2+連接到合適的柱物質(zhì)上，以便能夠通過使用例如Ni2+柱或帶有特異性抗體的柱(例如具有抗HA抗體或者抗TBP抗體的柱)進(jìn)行親和純化。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中涉及TBP融合蛋白、已附加表位的TBP。優(yōu)選的TBP融合蛋白是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)的。特別是本發(fā)明涉及一種hTBP融合蛋白。可以從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離和純化TBP融合蛋白。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是已附加HA和His的TBP蛋白質(zhì)，特別是已附加HA和His的hTBP蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是具有SEQID NO.16氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中TBP融合蛋白含有一個(gè)或多個(gè)蛋白酶或肽酶的切割位點(diǎn)，例如凝血酶切割位點(diǎn)。在融合蛋白的氨基酸序列內(nèi)優(yōu)選的切割位點(diǎn)是在附加表位和TBP-蛋白質(zhì)之間。
本發(fā)明涉及到制備TBP融合蛋白的方法，其中在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因，所說的宿主細(xì)胞優(yōu)選的是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的。
可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的不同類型的組織和/或細(xì)胞(例如大腦、心臟、腎、肝、肺臟、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、腺、骨髓、屬于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞、皮膚等)中分離轉(zhuǎn)基因mRNA和/或由轉(zhuǎn)基因編碼的TBP融合蛋白和/或與TBP融合蛋白相關(guān)的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。
本發(fā)明涉及到TBP融合蛋白的用途，特別是用于從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以及鑒定從不同的物種、不同的組織和/或不同的細(xì)胞類型中得到的分離的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。因此，按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和TBP融合蛋白可以用于分離和鑒定單個(gè)的蛋白質(zhì)，例如在不同的高級(jí)復(fù)合物中相關(guān)的TAFs和TAF相互作用因子。例如，可以分開和分離在特殊的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中相關(guān)的蛋白質(zhì)，因此可以鑒定單個(gè)的TAFs和TAF相關(guān)性因子。至少在一定程度上在不同的高級(jí)復(fù)合物(組織和/或細(xì)胞類型和/或發(fā)育階段和/或表達(dá)的轉(zhuǎn)基因不同)中的TAFs和TAF-相互作用因子的組成是不同的。
可以快速鑒定TAFs和TAF-相互作用因子，特別是已經(jīng)鑒定的組織特異性因子和已經(jīng)存在抗體的因子，并且評(píng)價(jià)它們和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)的程度。Bob-I/OCA-B因子就是一個(gè)例子，此因子是負(fù)責(zé)B-細(xì)胞被限激活的組織特異性共激活劑(Gstaiger，M.等(1996)EMBO 15，2781-2790)。雖然沒有內(nèi)在的結(jié)合DNA的能力并需要幾乎廣泛存在的Oct因子，但是這種因子的組織被限表觀通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)機(jī)制給予B-細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄激活。
此外，可以在高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中鑒定新型的TAFs和TAF-相互作用因子，特別是組織和/或細(xì)胞類型特異性和/或發(fā)育階段特異性和/或細(xì)胞周期特異性的TAFs和TAF-相互作用因子。如上所述，有大量數(shù)據(jù)明顯表明許多結(jié)合增強(qiáng)子的組織特異性因子能夠?qū)虻霓D(zhuǎn)錄活性發(fā)揮組織特異性的作用。因此，可以鑒定調(diào)節(jié)基因特異性表達(dá)的“獨(dú)特的”、組織特異性、細(xì)胞類型特異性、細(xì)胞周期特異性、發(fā)育階段特異性因子。
“通用”轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)還提供了研究在組織和細(xì)胞類型中的所說的TAFs和TAF-相互作用因子(例如助激活劑)與TBP和/或TAFs以及轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)程度的強(qiáng)有力工具。
本發(fā)明也涉及用于確定和鑒定不同的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方法，其中從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離所說的與高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)的已附加表位的TBP。鑒定不同的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成的方法包括a)將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物中，b)在不同的動(dòng)物組織和/或不同的細(xì)胞類型(任選的是在動(dòng)物的不同發(fā)育階段)中分離已附加表位的TBP，和c)鑒定高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成。
一種從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中分離高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方法包括通過使用至少一種已附加表位的TBP進(jìn)行親和純化。當(dāng)分離已附加表位的TBP時(shí)，優(yōu)選的是對(duì)高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和在這種復(fù)合物中相關(guān)的TAFs和TAF-相互作用因子進(jìn)行共純化。例如，當(dāng)通過結(jié)合一種ist表位(優(yōu)選的是表位和此表位能特異性結(jié)合的物質(zhì)連接)來純化已附加表位的TBP時(shí)，可以分離得到高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。所說的物質(zhì)可以是，例如Ni2+柱(結(jié)合His-表位)或抗體(例如抗HA抗體(和HA表位結(jié)合)或與具有SEQ ID NO.17序列或其一部分序列的已附加表位的TBP的表位(例如SEQ ID NO.17序列的表位)結(jié)合的抗體)。
本發(fā)明也涉及鑒定新的和/或特異性的TAF和/或TAF-相互作用因子的方法。優(yōu)選的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物是從按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離的。這樣一種方法可以包括，例如a)將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物中，b)從不同的動(dòng)物組織和/或不同的細(xì)胞類型(任選的是在動(dòng)物的不同發(fā)育階段)中分離已附加表位的TBP，c)分開和分離與高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的已附加表位的TBP相關(guān)的TAF和/或TAF-相互作用因子，和d)如果需要，確定TAF和/或TAF-相互作用因子的氨基酸序列。
此外，為了進(jìn)一步證實(shí)已知的機(jī)制，在發(fā)現(xiàn)和鑒定新的TAFs或者TAF相關(guān)的因子方面轉(zhuǎn)基因模型優(yōu)于目前的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。如上所述，到目前為止通過親和共純化得到的TAF蛋白質(zhì)來源于HeLa和酵母的研究。使用時(shí)間消耗相互作用文庫(kù)篩選方法也發(fā)現(xiàn)了其它有機(jī)體的TAF-cDNAs。所說的轉(zhuǎn)基因模型的“整個(gè)有機(jī)體”方面使得這個(gè)通用的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)通過和體內(nèi)的實(shí)際轉(zhuǎn)錄過程保持非?！跋嘟睆亩鴮?duì)新型組織特異性活化因子的識(shí)別作出響應(yīng)。
很明顯，這樣一種表達(dá)附加的TBP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)將會(huì)對(duì)藥物開發(fā)領(lǐng)域起推動(dòng)作用。大量的藥物學(xué)興趣可以歸因于給定的基因(特別是與疾病有關(guān)的基因)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的任何“獨(dú)特的”、組織特異性、細(xì)胞類型特異性、細(xì)胞周期特異性、發(fā)育階段特異性因子(TAFs和TAF-相互作用因子)。參與一個(gè)或者幾個(gè)與疾病相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄控制的“關(guān)鍵”TAFs和TAF-相互作用因子的確定和鑒定是開發(fā)減輕這種遺傳疾病的治療組合物的合理方案。一旦鑒定和克隆出這類TAFs和TAF-相互作用因子，可以采取任何一種篩選方法來鑒定能特異性地和TAFs或TAF相關(guān)性因子的分子種類/物質(zhì)。在藥學(xué)上有用的種類/物質(zhì)可以是一種能在體內(nèi)或者體外增強(qiáng)或者減弱TAF或者TAF-相互作用因子天然活性，從而能治療性地操縱有關(guān)的基因的物質(zhì)。
然而，也可以將鑒定的TAFs和TAF-相互作用因子作為生物化學(xué)和分子生物學(xué)中使用的工具，例如，可以將來源于轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的蛋白質(zhì)作為探針來分離相應(yīng)的人類TAFs和TAF-相互作用因子或它們的cDNA。然后可以將人TAFs和TAF-相互作用因子用于篩選具有高度特異性的新藥物。
在下列非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明。
實(shí)施例1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建潛在的動(dòng)物來源從一般的商業(yè)途徑、Charles River(Wilmington，MA)、Taconic(Germantown，NY)、和Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，Maine)得到了適合用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的動(dòng)物。將B6SJL/F1小鼠用于得到胚和轉(zhuǎn)移?？梢园袯6SJL/F1雄性小鼠用于交配，并將切除輸精管的SwissWebster studs用于刺激假孕。轉(zhuǎn)基因小鼠通過(0.1cc，腹膜內(nèi))的懷孕母馬血清促性腺素(PMSG；例如Sigma，Saint Louis，Missouri，美國(guó))，48小時(shí)后再注射5IU(0.1cc，腹膜內(nèi))的人絨毛膜促性腺素(hCG；例如Sigma)來誘導(dǎo)六周齡的雌性小鼠超數(shù)排卵。在hCG注射后立即將雌鼠和雄鼠放在一起。hCG注射后21小時(shí)，通過CO2窒息或者頸部脫臼殺死已經(jīng)交配的雌鼠，并從切開的輸卵管取出胚，放置在M2培養(yǎng)基(例如Sigma)中。在丘周圍使用透明質(zhì)酸酶(1mg/ml)除去細(xì)胞。然后洗滌原核胚并且放置在M16培養(yǎng)基(例如Sigma)中，然后在注射前一直放置在37℃的培養(yǎng)箱(其中含有濕潤(rùn)的空氣、CO2和O2的濃度為5％、N2的濃度為90％)中。
實(shí)施例2用于轉(zhuǎn)染和微注射的構(gòu)建體的制備用合適的酶切割用于微注射的DNA克隆，用Cla I和BamHI切割含有MT-hTBP轉(zhuǎn)基因(雙加尾的，按照表3的序列)的DNA克隆，或者用Eco RI/Eco RI切割EF-hTBP轉(zhuǎn)基因(雙加尾的，按照表2的序列)，使用TBE緩沖液在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳獲得大小合適的DNA片段(Sambrook等，1989)。通過溴化乙錠染色顯示DNA帶，切下DNA帶并將其放置在含有0.3M乙酸鈉(pH7.0)的透析袋中。將DNA電洗脫到透析袋中，用酚-氯仿(1∶1)提取，通過兩倍體積的乙醇沉淀。將所得的DNA重新溶解在TE緩沖液(10mM Tris，pH7.4和1mM EDTA)并在DEAE葡聚糖纖維素(例如Pharmacia，Uppsala，Schweden)柱上純化。首先用0.5ml高鹽緩沖液(1.5M NaCl、10mM Tris(pH7.4)和1mM EDTA)引發(fā)此柱，然后用3ml的低鹽緩沖液(0.15M NaCl、10mM Tris(pH8.0)和1mM EDTA)洗滌此柱。將DNA溶液的鹽調(diào)整到0.15M NaCl，然后使DNA通過此柱以便DNA與柱基質(zhì)結(jié)合。用3ml的低鹽緩沖液洗滌三次后，用每份0.3ml的高鹽緩沖液將DNA洗脫4次，用2倍體積的乙醇沉淀。將DNA溶解在200μl的TE中并合并各組分，酚∶氯仿提取一次，氯仿提取兩次，然后用乙醇過夜沉淀所說的DNA。將DNA重新懸浮在微注射緩沖液TE(10mM Tris pH7.4和0.1mM EDTA)中，并將DNA濃度調(diào)到2ng/μl，通過瓊脂糖凝膠電泳與已知DNA標(biāo)準(zhǔn)物比較來顯示所說的DNA。微注射將DEAE純化的轉(zhuǎn)基因DNA(MT-hTBP或者EF-hTBP)以2ng/μl的濃度溶解在微注射緩沖液中。將顯微操作針和手握移液管裝入到FlamingBrown微量移液管的拉出器(如P87型，Sutter研究所公司)中。然后打碎手握移液管，然后把它放在deFonbrune型微型熔爐(例如技術(shù)產(chǎn)品研究所公司)中拋光(fire poished)。將移液管安裝在與ZeissAxiovert135顯微鏡連接的顯微操作器(例如on Leitz)上。通過吸頭將DNA溶液加入到充滿空氣的注射移液管(例如醫(yī)療系統(tǒng)公司)中。將胚(每組40-50個(gè))在用于微注射的聚硅氧烷油存在下放置在200μl的M2培養(yǎng)基中。通過手握移液管將胚按方向排好并固定，然后將注射移液管插入到與之最近的生殖核中。通過生殖核的膨脹來監(jiān)測(cè)注射。注射后，在轉(zhuǎn)移到受體雌鼠前，將每組胚放置在M16培養(yǎng)基中。
實(shí)施例3通過微注射轉(zhuǎn)移胚胎將成年雌性小鼠與切除輸精管的雄性小鼠進(jìn)行隨機(jī)循環(huán)配對(duì)。Swiss Webster或者其它類似的品系可以用于此目的。同時(shí)將受體雌鼠作為供體雌鼠進(jìn)行交配。在胚轉(zhuǎn)移時(shí)，通過每克體重腹膜內(nèi)注射0.015ml的2.5％三溴乙醇來麻醉受體雌性。通過單一背中線切開暴露出輸卵管，然后直接切開位于輸卵管上面的體壁。然后用watchmakers鉗撕裂卵巢囊。將待轉(zhuǎn)移的胚放置在M16中，然后放在轉(zhuǎn)移移液管的吸頭中(大約10-12個(gè)胚)。將此移液管吸頭插入到漏斗中并轉(zhuǎn)移這些胚。轉(zhuǎn)移后，用兩個(gè)縫線來縫合切口，同時(shí)縫合皮膚。受體在暖托盤上恢復(fù)三小時(shí)，然后放置在用于傳遞的集群中。
用MT-hTBP總共微注射了469個(gè)原核胚，產(chǎn)生了170個(gè)幼鼠，對(duì)于EF-hTBP總共微注射了407個(gè)原核胚，產(chǎn)生了76個(gè)幼鼠。
實(shí)施例4在新出生的小鼠中檢測(cè)轉(zhuǎn)基因DNA4a)DNA提取從一塊2-4周齡的子代的尾組織(大約1cm)提取可能的新出生的小鼠基因組的DNA。54℃下將尾切片在含有500-750μl尾緩沖液(尾緩沖液10mM Tris pH7.5，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5％SDS，30μg/ml蛋白酶K)的振蕩器中過夜溫育。然后向每份尾樣品中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)。將樣品在低速旋渦儀上通過手動(dòng)或自動(dòng)溫和振蕩。將樣品在臺(tái)式離心機(jī)上離心10分鐘。將水相轉(zhuǎn)移到5ml聚丙烯管(例如falcon管)中。向此管中慢慢加入等體積的乙醇(逐滴加入)以便使DNA緩慢沉淀。再加入一倍體積的乙醇以便混合管中的組分。然后將此管上下顛倒幾次混合均一。然后將基因組DNA纏繞在平移液管吸頭(測(cè)序凝膠吸頭)上，并轉(zhuǎn)移到微量滴定板的每一個(gè)孔中。將DNA在平皿中吹干4小時(shí)。然后向每個(gè)孔中加入200μl的1X TE(1X TE10mMTris pH7.4，1mM EDTA)。然后在室溫下溶解基因組DNA 15-30分鐘，小心地上下顛倒移液管溫和混合DNA。通常在PCR檢驗(yàn)前將微量滴定板保存在-20℃。測(cè)試前取出10μl并用EcoRI消化(例如10μl基因組DNA，2μl 10 x EcoRI緩沖液，7μl H2O，1μl EcoRI；酶和緩沖液來自Boehringer-Mannheim，Mannheim，德國(guó))。4b)PCR反應(yīng)將消化的基因組DNA用水以1∶3稀釋。然后在加熱塊上將樣品加熱到100℃，10分鐘。取出2μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)以50μl的體積進(jìn)行，其中包含2μl的基因組DNA、1x反應(yīng)緩沖液、1.5mM MgCl2、0.8μM正向寡核苷酸引物、0.8μM反相寡核苷酸引物、8μl的核苷酸混合物(每種核苷酸(dATP、dCTP、dTTP和dGTP)的濃度都為0.2mM)、2.5單位的Taq聚合酶。例如使用Perkin Elmer(Perkin Elmer Norwalk，Conneticut，美國(guó))的AmpliTaq酶和緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。
使用正向引物寡核苷酸(有意義引物)5′GGAGCA ACC GCC TGC TGGGTG C 3′(SEQ ID NO.5)和反向引物寡核苷酸(反義引物)5′CCT GTG TTGCCT GCT GGG ACG 3′(SEQ ID NO.6)進(jìn)行MT-hTBP轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。
使用正向引物寡核苷酸(有意義引物)5′GGA GAC TGA AGT TAG GCCAGC 3′(SEQ ID NO.7)進(jìn)行EF-hTBP轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。同時(shí)使用了在MT-hTBP檢測(cè)中使用的相同反向引物(5′CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG3′)。
使用自動(dòng)循環(huán)變溫儀(例如來自Stratagene，La Jolla，CA，美國(guó))進(jìn)行循環(huán)變溫。循環(huán)溫度是循環(huán)1 94℃ 5分鐘60℃ 3分鐘 72℃ 2分鐘；循環(huán)2-25 94℃ 1分鐘60℃ 2分鐘 72℃ 3分鐘；循環(huán)2694℃分鐘 60℃ 2分鐘 72℃ 5分鐘；或者循環(huán)1-4095℃ 2分鐘 55℃ 1分鐘 72℃ 1分鐘；通過連續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳(例如1.2-1，5％瓊脂糖)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，并用溴化乙錠染色凝膠，用UV燈觀察DNA。
通過大約580bp擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的存在來區(qū)分陽(yáng)性的MT-hTBP樣品。陽(yáng)性的EF-hTBP樣品產(chǎn)生了大約500bp的擴(kuò)增的DNA片段。
通過PCR反應(yīng)對(duì)170個(gè)幼鼠的MT-hTBP的DNA分析表明35個(gè)基因組DNA的樣品呈轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。通過PCR分析對(duì)76個(gè)EF-hTBP幼鼠的基因組DNA的分析表明EF-hTBP轉(zhuǎn)基因包含在9只小鼠中。4d)轉(zhuǎn)基因模型擴(kuò)展將DNA陽(yáng)性的G0小鼠和非轉(zhuǎn)基因B6SJL小鼠雜交，并將產(chǎn)生的幼仔進(jìn)行PCR遺傳型分析。將G1子代用于連續(xù)繁育，并保持單個(gè)系以用于進(jìn)一步的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)分析。實(shí)施例5通過S1核酸酶保護(hù)測(cè)定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因mRNA5a)特異性產(chǎn)生了和轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物的5’末端和3’末端互補(bǔ)的寡核苷酸5′寡核苷酸序列(有意義引物)(SEQ ID NO.8)5′GCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGACTGCGTAATGCGGTCATGACGCTTT 3′。5′寡核苷酸序列(反義引物)(SEQ ID NO.9)5′GAAGGGGGTGGGGGAGGCAAGGGTACATGAGAGCCATTACGTCGTCTTCCTGAATCCCTTTAGCCGCTTTGCTCG 3’。
下劃線區(qū)是非雜交序列。用(32Pγ)ATP(5000cpm/mM)通過T4多核苷酸激酶和緩沖液(例如Boehringer-Mannheim(Mannheim))對(duì)40ng的寡核苷酸進(jìn)行5’標(biāo)記。在30℃ 50μl的反應(yīng)體積中反應(yīng)1小時(shí)。通過使用大小排阻層析(例如Push-Columns，Stratagene，La Jolla，CA，美國(guó))從未加入(32Pγ)ATP的反應(yīng)物中分離出標(biāo)記的寡核苷酸。5b)啟動(dòng)子誘導(dǎo)在RNA分析前需要誘導(dǎo)MT-hTBP小鼠，因?yàn)樵赯n2+存在時(shí)啟動(dòng)子是活化的。在取出肝臟前18小時(shí)和4小時(shí)對(duì)每一個(gè)MT-hTBP小鼠腹膜內(nèi)兩次注射ZnSO4(溶于水)，劑量為0.1mg ZnSO4/10g鼠體重。5c)RNA提取使用市售的Trizol試劑(例如Gibco-BRL，Paisly，UK)從1-5g的組織中提取總RNA。在12ml聚丙烯管(例如falcon管)中將組織在5ml的Trizol溶液中用Ultra-Turrax勻化。加入1ml的氯仿，將試管塞上并用手劇烈振蕩15秒種。在室溫下將溶液溫育3分鐘，然后4℃下在12,000xg離心15分鐘(Sorvall SS-34轉(zhuǎn)子)。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中，加入2.5ml異丙醇并混合。然后在室溫下溫育10分鐘。在4℃下在12,000xg離心樣品10分鐘。除去上清液，用5ml的75％乙醇洗滌RNA沉淀。將樣品混合并在7,500xg離心10分鐘。將RNA沉淀重新懸浮在不含有RNAse的水中，然后通過測(cè)量在260nm吸收率確定RNA的量。5d)S1核酸酶保護(hù)相同量的RNA(10-20μg)加入到不含RNAse的100μl水中。并加入50,000-150,000dpm標(biāo)記的寡核苷酸(0.1-1ng，取決于標(biāo)記效率)。用0.3M乙酸鈉和乙醇沉淀RNA/寡核苷酸混合物。洗滌RNA/寡核苷酸沉淀并在空氣中干燥。加入23μl雜交溶液(80％甲酰胺，10mMPIPES(pH6.4)(Sambrook等1989)，1mM EDTA，0.05％SDS)。將反應(yīng)物混合，并在65℃下變性20分鐘。然后在65℃下向每一種樣品中加入2μl的5M NaCl。65℃下在水浴中將樣品溫育1小時(shí)，然后將水浴的溫度調(diào)整為37℃。將溫度逐漸從65℃降低至37℃(過夜)以有利于特異性的寡核苷酸-mRNA雜交。第二天，將300μl的S1緩沖液(S1緩沖液167U/ml S1核酸酶(例如Gibco BRL，Paisly，UK)，0.3M NaCl，30mM NaOAc(pH4.5)，3mM ZnSO4)加入到每一種樣品中。在室溫下將樣品溫育1小時(shí)，然后加入1ml乙醇(冷)以沉淀出所有的核酸。將沉淀離心、洗滌并在Speed-Vac中簡(jiǎn)單地干燥。然后將沉淀懸浮在12μl的S1加樣緩沖液(85％甲酰胺，0.01％溴酚藍(lán)，0.01％二甲苯苯胺，1xTBE)。在加樣前，將樣品加熱至70℃(保持5分鐘)并使用變性(6M脲)薄聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。干燥凝膠的放射自顯影有利于檢測(cè)帶保護(hù)基的未消化的帶。
當(dāng)通過S1保護(hù)測(cè)定分析時(shí)，在35只MT-hTBP幼鼠中有7只幼鼠顯示出可檢測(cè)的mRNA水平。而在EF-hTBP幼鼠中有3只幼鼠顯示出可檢測(cè)的mRNA水平。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因mRNA的Northern印跡檢測(cè)6a)通過TBP的PCR擴(kuò)增合成雜交探針和TBP探針的標(biāo)記設(shè)計(jì)和合成了包括雙加尾hTBP構(gòu)建體498bp片段的寡核苷酸/引物。
正向寡核苷酸開始于″AUG”起始位點(diǎn)的10個(gè)堿基下游(表1中的ATG位點(diǎn))。有意義引物的序列為SEQ ID NO.105’CCCTATGACGTCCCGGATTACG 3’。
反向引物結(jié)束于″AUG″起始位點(diǎn)的507bp下游(表1中的ATG位點(diǎn))。反義引物的序列是SEQ ID NO.115’GTGGAGTGGTGCCCGGCAAGGG 3’。
使用0.2μg pAG-17，0.5mM MgCl2，0.8μM各引物，1x PCR緩沖液(Perkin-Elmer)，0.2mM dATP、dTTP、dCTP、dGTP和2.5U的AmpliTaq酶(Perkin Elmer Norwalk，Conneticut，美國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。熱循環(huán)儀程序循環(huán)1-3594℃1分鐘 55℃1分鐘 72℃1分鐘；然后，72℃10分鐘，并在4℃下保存。由0.7％瓊脂糖凝膠純化擴(kuò)增的帶。
用隨機(jī)引物和Megaprime標(biāo)記試劑盒(Amersham，英國(guó))的克列諾片段酶標(biāo)記TBP-DNA探針。將25-50ng探針DNA與5μl的隨機(jī)六聚體引物(例如Amersham)和20μl的水結(jié)合。在100℃下將DNA變性5分鐘。將標(biāo)記混合物與1x的反應(yīng)緩沖液、1xdATP、1xdTTP、1xdGTP、4μl 3000Ci/mmol α-32P dCTP(例如Amersham)和2U克列諾酶混合至最終體積為50μl。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。使用大小排阻層析(例如Push Columns)從未加入的核苷酸中分離標(biāo)記的DNA。6b)凝膠電泳和轉(zhuǎn)移用乙醇沉淀出10-20μg的總RNA。在65℃下在RNA加樣緩沖液(65％甲酰胺，20％甲醛(37％溶液)，1x MOPS緩沖液(Sambrook等(1989))，5％甘油，0.01％溴酚藍(lán)，0.01％二甲苯苯胺，0.1mg/ml溴化乙錠)中將所說的沉淀變性10分鐘。在含有18％甲醛(37％溶液)的1％瓊脂糖凝膠和1x MOPS運(yùn)行緩沖液(40mM MOPS(pH7.0)，10mM乙酸鈉，1mM EDTA)上按大小分級(jí)分離RNA。在含有18％甲醛(37％溶液)的1x MOPS運(yùn)行緩沖液中以1V/cm將凝膠緩慢地電泳過夜。然后在0.05M NaOH/1.5MNaCl中將凝膠處理30分鐘，然后在0.5M Tris(pH7.4)/1.5M NaCl中處理20分鐘。使用毛細(xì)管技術(shù)將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(例如Hybond-N+，Amersham，UK)上，將結(jié)合膜的RNA交聯(lián)，例如使用Stratalinke(Stratagene，La Jolla，CA，美國(guó))進(jìn)行UV-交聯(lián)。6c)雜交和洗滌例如65℃下在″Rapid-Hyb″緩沖液(Amersham，英國(guó))中在旋轉(zhuǎn)雜交烘箱(例如Hybaid)中進(jìn)行1-2小時(shí)預(yù)雜交。例如65℃下在含有106-10×106cpm的變性探針的6-10ml″Rapid-Hyb″緩沖液中進(jìn)行2-3小時(shí)雜交。在室溫下用2x SSC/0.1％SDS(1xSSC150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)將膜洗滌兩次(10分鐘/洗滌)。在65℃下用1x SSC/0.1％SDS將膜進(jìn)一步洗滌兩次(15分鐘/洗滌)。在65℃下用0.5x SSC/0.1％SDS進(jìn)行洗滌兩次，每次15分鐘，此后，如果需要，在65℃下用0.2x SSC/0.1％SDS最后洗滌1或2次，每次15分鐘。將洗滌的膜進(jìn)行放射自顯影。
實(shí)施例7加尾hTBP特異性多克隆抗體的產(chǎn)生一般的方案在小鼠和人TBP之間存在著足夠量的序列同源性。因此，大多數(shù)市售的抗體會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測(cè)內(nèi)源性和轉(zhuǎn)基因的TBP。為了區(qū)別二者，產(chǎn)生了抗轉(zhuǎn)基因TBP的加尾區(qū)(相對(duì)應(yīng)于凝血酶切割位點(diǎn)和加尾的hTBP的His尾)的多克隆抗體SEQ ID NO.12H2N--MGSSHHHHHHSSGLVPRGC--COOH。
將這種肽連接到載體蛋白上，并使用標(biāo)準(zhǔn)的方案注射到兔中。在一定的時(shí)間間隔內(nèi)收集血清并使用ELISA測(cè)定檢驗(yàn)抗hTBP滴度。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的Western-印跡檢測(cè)8a)肝臟核提取物的制備將MT-hTBP小鼠進(jìn)行2次腹膜內(nèi)注射ZnSO4(參見5b)。通過頸部脫臼殺死小鼠并取出肝臟。立即在10ml的勻漿緩沖液(1.8M蔗糖，10mMHEPES(pH7.4)(Sambrook等(1989)，25mM KCl，1mM EDTA，5％甘油，0.15mM精胺，0.5mM亞精胺，0.4mM PMSF)將肝臟勻化。勻化后，加入同種緩沖液使體積增加到25ml。將勻漿小心地分裝(layer)在含有7ml勻漿緩沖液的離心管中，所用的離心管如Ultra-Clear SW-28管(Beckman，Palo Alto，CA，美國(guó))。將樣品在SW-28轉(zhuǎn)頭上以25,000rpm(4℃)離心1小時(shí)。小心地除去上清液，將沉淀的核懸浮在200μlNEXB緩沖液(20mM HEPES pH7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM PMSF，10％甘油，2μg/ml抑肽酶，2μg/ml亮抑蛋白酶肽，2μg/ml胃蛋白酶抑制劑-A)中。將懸浮的核在冰上溫育15-30分鐘，同時(shí)經(jīng)?；旌喜⑸舷挛?。通過干冰/乙醇浴及37℃的水浴將樣品進(jìn)行5次凍融循環(huán)。將樣品高速離心30秒，然后，例如通過使用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑(例如Bio-Rad，Hercules，CA，美國(guó))測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。8b)電泳和轉(zhuǎn)移將20-75μg的提取物通過變性凝膠電泳按大小分開。分離膠10％丙烯酰胺(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝1∶37)、0.1％SDS、375mM TrispH8.8。濃縮膠5％丙烯酰胺、0.1％SDS、125mM Tris pH8.3。運(yùn)行緩沖液25mM Tris pH8.3、192mM甘氨酸、0.1％SDS。使用改良的Bjerrum轉(zhuǎn)移緩沖液(48mM Tris，39mM甘氨酸，10％甲醇，0.0375％SDS，pH9.2)通過半干吸墨紙(例如Hoefer，San Francisco，CA，美國(guó))將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到純品硝化纖維素膜(如Bio-Rad)上。使轉(zhuǎn)移物在0.8mA/cm下電泳2-4小時(shí)。8c)免疫檢測(cè)室溫下將膜在含有3％明膠(例如Bio-Rad)的1×TBS(20mM TrispH7.5，500mM NaCl)的振蕩表面封阻1-2小時(shí)。室溫下將此膜在1×TTBS(含有0.05％Tween-20的1×TBS)中洗滌10分鐘。將膜與一級(jí)抗體在1％明膠/1×TTBS中雜交4小時(shí)，室溫下在振蕩的表面上過夜。用1×TTBS洗滌膜2-3次(5分鐘/洗滌)。將其和與堿性磷酸酶(AP)偶聯(lián)的二級(jí)抗體在1％明膠/1×TTBS中雜交2-3小時(shí)。室溫下將此膜用1×TTBS再洗滌2-3次(5分鐘/次)，之后在1×TBS緩沖液中洗滌5分鐘。然后室溫下將膜在含有NBT/BCIP試劑的1倍展開緩沖液(例如BioRad)中溫育，直到其上的帶完全顯示出。通過水洗滌終止AP反應(yīng)。
序 列 表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Hoechst Aktiengesellschaft(B)街道-(C)城市Frankfurt(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵編代碼(ZIP)65926(G)電話069-305-7072(H)傳真069-35-7175(I)電傳-(ii)發(fā)明名稱從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中純化高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(iii)序列數(shù)17(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0，Version #1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..12(xi)序列描述SEQ ID No1
Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val1 5 10(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..11(xi)序列描述SEQ ID No2Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..10(xi)序列描述SEQ ID No3Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..9(xi)序列描述SEQ ID No4Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..22(xi)序列描述SEQ ID No5GGAGCAACCG CCTGCTGGGT GC 22(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQ ID No6CCTGTGTTGC CTGCTGGGAC G 21(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQ ID No7GGAGACTGAA GTTAGGCCAG C21(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度76個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..76(xi)序列描述SEQ ID No8GCGGCACCAG GCCGCTGCTG TGATGATGAT GATGATGGCT GCTGCCCATGACTGCGTAAT GCGGTCATGA CGCTTT 76(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..75(xi)序列描述SEQ ID No9GAAGGGGGTG GGGGAGGCAA GGGTACATGA GAGCCATTAC GTCGTCTTCCTGAATCCCTT TAGCCGCTTT GCTCG 75(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..22(xi)序列描述SEQ ID No10CCCTATGACG TCCCGGATTA CG 22(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..22(xi)序列描述SEQ ID No11GTGGAGTGGT GCCCGGCAAG GG22(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1..19(xi)序列描述SEQ ID No12Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val1 5 10 15Pro Arg Gly Cys(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1310個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子
(B)位置1..1310(xi)序列描述SEQ ID No13CCATGGGCTA TCCCTATGAC GTCCCGGATT ACGCAGTCAT GGGCAGCAGC CATCATCATC 60ATCATCACAG CAGCGGCCTG GTGCCGCGCG GCAGCCATAT GGATCAGAAC AACAGCCTGC120CACCTTACGC TCAGGGCTTG GCCTCCCCTC AGGGTGCCAT GACTCCCGGA ATCCCTATCT180TTAGTCCAAT GATGCCTTAT GGCACTGGAC TGACCCCACA GCCTATTCAG AACACCAATA240GTCTGTCTAT TTTGGAAGAG CAACAAAGGC AGCAGCAGCA ACAACAACAG CAGCAGCAGC300AGCAGCAGCA GCAGCAACAG CAACAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC360AGCAGCAGCA GCAGCAGCAA CAGGCAGTGG CAGCTGCAGC CGTTCAGCAG TCAACGTCCC420AGCAGGCAAC ACAGGGAACC TCAGGCCAGG CACCACAGCT CTTCCACTCA CAGACTCTCA480CAACTGCACC CTTGCCGGGC ACCACTCCAC TGTATCCCTC CCCCATGACT CCCATGACCC540CCATCACTCC TGCCACGCCA GCTTCGGAGA GTTCTGGGAT TGTACCGCAG CTGCAAAATA600TTGTATCCAC AGTGAATCTT GGTTGTAAAC TTGACCTAAA GACCATTGCA CTTCGTGCCC660GAAACGCCGA ATATAATCCC AAGCGGTTTG CTGCGGTAAT CATGAGGATA AGAGAGCCAC720GAACCACGGC ACTGATTTTC AGTTCTGGGA AAATGGTGTG CACAGGAGCC AAGAGTGAAG780AACAGTCCAG ACTGGCAGCA AGAAAATATG CTAGAGTTGT ACAGAAGTTG GGTTTTCCAG840CTAAGTTCTT GGACTTCAAG ATTCAGAACA TGGTGGGGAG CTGTGATGTG AAGTTTCCTA900TAAGGTTAGA AGGCCTTGTG CTCACCCACC AACAATTTAG TAGTTATGAG CCAGAGTTAT960TTCCTGGTTT AATCTACAGA ATGATCAAAC CCAGAATTGT TCTCCTTATT TTTGTTTCTG 1020GAAAAGTTGT ATTAACAGGT GCTAAAGTCA GAGCAGAAAT TTATGAAGCA TTTGAAAACA 1080TCTACCCTAT TCTAAAGGGA TTCAGGAAGA CGACGTAATG GCTCTCATGT ACCCTTGCCT 1140CCCCCACCCC CTTCTTTTTT TTTTTTTAAA CAAATCAGTT TGTTTTGGTA CCTTTAAATG 1200GTGGTGTTGT GAGAAGATGG ATGTTGAGTT GCAGGGTGTG GCACCAGGTG ATGCCCTTCT 1260GTAAGTGCCC CTTCCGGCAT CCCGGAATTC CTGCAGCCCA ACGCGGCCGC 1310(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4286個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..4286(xi)序列描述SEQ ID No14GAATTCCCCT GCAGGTCACT TAGCGTTGGC CACATAGTAG GTTCTCAAAT ACTTGTTAAT 60AAATAAGTTT GTTCGAGAAG CTGGGCAATG ATATTCTACA GCTGGAAGAA GAAACATAAT120GATCTAGTAA TTAGCTCAAT TAAAAATAAA CGTTCTTCTT TCCTCAGAGG AGCATTTCCC180AAGGCCTGCC TTGATAGCCA TCCAAAAAGG CCAAGCTCAT CCAATCTTGC CCTAGATTTA240TGCTAAAATG CAGTTACAAT CGATAGGATG ACAGAAAACG ACAGCACTTA TTTAAATATA300ATAGGCACTT ATTTAAATAG GAGAAGCTGT GACTTCATAG CAAGTGTTGG GGTTAGGAAA360CTGGGTGGAT AAACTTGCTG ATGCTGTAGA TCTTAGCCTC TACATGAGAT CATGTGGAAA420ATCTGAAAGC ATTTTAGGTT CCTTATGTTT GCAATCAAAT AACTGTACAC CTTTTAATTT480AAAAAGTACC ATGAGGCACA CACACACACT CGCAGGAACT TTTTGGCGTA ACAAAACTAG540AATTAGATCT AAAAGCTAAC TGTAGGACTG AGTCTATTCT AAACTGAAAG CCTGGACATC600TGGAGTACCA GGGGGAGATG ACGTGTTACG GGCTTCCATA AAAGCAGCTG GCTTTGAATG660GAAGGAGCCA AGAGGCCAGC ACAGGAGCGG ATTCGTCGCT TTCACGGCCA TCGAGCCGAA720CCTCTCGCAA GTCCGTGAGC CGTTAAGGAG GCCCCCAGTC CCGACCCTTC GCCCCAAGCC780CCTCGGGGTC CCCGGGCCTG GTACTCCTTG CCACACGGGA GGGGCGCGGA AGCCGGGGCG840GAGGAGGAGC CAACCCCGGG CTGGGCTGAG ACCCGCAGAG GAAGACGCTC TAGGGATTTG900TCCCGGACTA GCGAGATGGC AAGGCTGAGG ACGGGAGGCT GATTGAGAGG CGAAGGTACA960CCCTAATCTC AATACAACCT TTGGAGCTAA GCCAGCAATG GTAGAGGGAA GATTCTGCAC 1020GTCCCTTCCA GGCGGCCTCC CCGTCACCAC CCCCCCCAAC CCGCCCCGAC CGGAGCTGAG 1080AGTAATTCAT ACAAAAGGAC TCGCCCCTGC CTTGGGGAAT CCCAGGGACC GTCGTTAAAC 1140TCCCACTAAC GTAGAACCCA GAGATCGCTG CGTTCCCGCC CCCTCACCCG CCCGCTCTCG 1200TCATCACTGA GGTGGAGAAG AGCATGCGTG AGGCTCCGGT GCCCGTCAGT GGGCAGAGCG 1260CACATCGCCC ACAGTCCCCG AGAAGTTGGG GGGAGGGGTC GGCAATTGAA CCGGTGCCTA 1320GAGAAGGTGG CGCGGGGTAA ACTGGGAAAG TGATGTCGTG TACTGGCTCC GCCTTTTTCC 1380CGAGGGTGGG GGAGAACCGT ATATAAGTGC AGTAGTCGCC GTGAACGTTC TTTTTCGCAA 1440CGGGTTTGCC GCCAGAACAC AGGTAAGTGC CGTGTGTGGT TCCCGCGGGC CTGGCCTCTT 1500TACGGGTTAT GGCCCTTGCG TGCCTTGAAT TACTTCCACG CCCCTGGCTG CAGTACGTGA 1560TTCTTGATCC CGAGCTTCGG GTTGGAAGTG GGTGGGAGAG TTCGAGGCCT TGCGCTTAAG 1620GAGCCCCTTC GCCTCGTGCT TGAGTTGAGG CCTGGCCTGG GCGCTGGGGC CGCCGCGTGC 1680GAATCTGGTG GCACCTTCGC GCCTGTCTCG CTGCTTTCGA TAAGTCTCTA GCCATTTAAA 1740ATTTTTGATG ACCTGCTGCG ACGCTTTTTT TCTGGCAAGA TAGTCTTGTA AATGCGGGCC 1800AAGATCTGCA CACTGGTATT TCGGTTTTTG GGGCCGCGGG CGGCGACGGG GCCCGTGCGT 1860CCCAGCGCAC ATGTTCGGCG AGGCGGGGCC TGCGAGCGCG GCCACCGAGA ATCGGACGGG 1920GGTAGTCTCA AGCTGGCCGG CCTGCTCTGG TGCCTGGCCT CGCGCCGCCG TGTATCGCCC 1980CGCCCTGGGC GGCAAGGCTG GCCCGGTCGG CACCAGTTGC GTGAGCGGAA AGATGGCCGC 2040TTCCCGGCCC TGCTGCAGGG AGCTCAAAAT GGAGGACGCG GCGCTCGGGA GAGCGGGCGG 2100GTGAGTCACC CACACAAAGG AAAAGGGCCT TTCCGTCCTC AGCCGTCGCT TCATGTGACT 2160CCACGGAGTA CCGGGCGCCG TCCAGGCACC TCGATTAGTT CTCGAGCTTT TGGAGTACGT 2220CGTCTTTAGG TTGGGGGGAG GGGTTTTATG CGATGGAGTT TCCCCACACT GAGTGGGTGG 2280AGACTGAAGT TAGGCCAGCT TGGCACTTGA TGTAATTCTC CTTGGAATTT GCCCTTTTTG 2340AGTTTGGATC TTGGTTCATT CTCAAGCCTC AGACAGTGGT TCAAAGTTTT TTTCTTCCAT 2400TTCAGGTGTC GTGAGGAATT GCCCGGGGGA TCCATGGGCT ATCCCTATGA CGTCCCGGAT 2460TACGCAGTCA TGGGCAGCAG CCATCATCAT CATCATCACA GCAGCGGCCT GGTGCCGCGC 2520GGCAGCCATA TGGATCAGAA CAACAGCCTG CCACCTTACG CTCAGGGCTT GGCCTCCCCT 2580CAGGGTGCCA TGACTCCCGG AATCCCTATC TTTAGTCCAA TGATGCCTTA TGGCACTGGA 2640CTGACCCCAC AGCCTATTCA GAACACCAAT AGTCTGTCTA TTTTGGAAGA GCAACAAAGG 2700CAGCAGCAGC AACAACAACA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAACA GCAACAGCAG 2760CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGGCAGTG 2820GCAGCTGCAG CCGTTCAGCA GTCAACGTCC CAGCAGGCAA CACAGGGAAC CTCAGGCCAG 2880GCACCACAGC TCTTCCACTC ACAGACTCTC ACAACTGCAC CCTTGCCGGG CACCACTCCA 2940CTGTATCCCT CCCCCATGAC TCCCATGACC CCCATCACTC CTGCCACGCC AGCTTCGGAG 3000AGTTCTGGGA TTGTACCGCA GCTGCAAAAT ATTGTATCCA CAGTGAATCT TGGTTGTAAA 3060CTTGACCTAA AGACCATTGC ACTTCGTGCC CGAAACGCCG AATATAATCC CAAGCGGTTT 3120GCTGCGGTAA TCATGAGGAT AAGAGAGCCA CGAACCACGG CACTGATTTT CAGTTCTGGG 3180AAAATGGTGT GCACAGGAGC CAAGAGTGAA GAACAGTCCA GACTGGCAGC AAGAAAATAT 3240GCTAGAGTTG TACAGAAGTT GGGTTTTCCA GCTAAGTTCT TGGACTTCAA GATTCAGAAC 3300ATGGTGGGGA GCTGTGATGT GAAGTTTCCT ATAAGGTTAG AAGGCCTTGT GCTCACCCAC 3360CAACAATTTA GTAGTTATGA GCCAGAGTTA TTTCCTGGTT TAATCTACAG AATGATCAAA 3420CCCAGAATTG TTCTCCTTAT TTTTGTTTCT GGAAAAGTTG TATTAACAGG TGCTAAAGTC 3480AGAGCAGAAA TTTATGAAGC ATTTGAAAAC ATCTACCCTA TTCTAAAGGG ATTCAGGAAG 3540ACGACGTAAT GGCTCTCATG TACCCTTGCC TCCCCCACCC CCTTCTTTTT TTTTTTTTAA 3600ACAAATCAGT TTGTTTTGGT ACCTTTAAAT GGTGGTGTTG TGAGAAGATG GATGTTGAGT 3660TGCAGGGTGT GGCACCAGGT GATGCCCTTC TGTAAGTGCC CCTTCCGGCA TCCCGGATAT 3720CCTGCAGCCC AACACGGCCG CTCGAGCATG CATCTAGAGA ACGTCACGGC CGCGATCCCC 3780CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGGTT GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC 3840CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT 3900CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT 3960TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGGTAC CCAGGTGCTG 4020AAGAATTGAC CCGGTTCCTC CTGGGCCAGA AAGAAGCAGG CACATCCCCT TCTCTGTGAC 4080ACACCCTGTC CACGCCCCTG GTTCTTAGTT CCAGCCCCAC TCATAGGACA CTCAACTTGG 4140AGCGGTCTCT CCCTCCCTCA TCAGCCCACC AAACCAAACC TAGCCTCCAA GAGTGGGAAG 4200AAATTAAAGC AAGAAGGCTA TTAAGTGCAG AGGGAGAGAA AATGCCTCCA ACATGTGAGG 4260AAGTAATGAT AGAAATCATA GAATTC 4286(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3263個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..3263(xi)序列描述SEQ ID No15ATCGATAAGC TGAGATCCGG CTAGAAACTG CTGAGGGCTG GACCGCATCT GGGGACCATC60TGTTCTTGGC CCTGAGCGGG GCAGGAACTG CTTACCGCAG ATATCCTGTT TGCCCCAATT 120CAGCTGTTCC ATCTGTTCTT GGCCCTGAGC GGGGCAGGAA CTGCTTACCA CAGATATCCT 180GTTTGGCCCA TATTCAGCTG TCTCTCTGTT CCTGACCTTG ATCTGAACTT CTCTATTCTC 240AGTTATGTAT TTTTCCCATG CCTTGCAAAA TGGCGTTACT TAAGCTAGCT TGCCAAACCT 300ACGGCTGGGG TCTTTCACGT TTATATCTAT GAGGGGAAGG ACCCAGAGTG GGGAAGCTGG 360GATCTTGGGA ACACGCTTCT CTACATGGCA TTGTCTGCAC GGTGGAGTCC GGATCTGAGC 420TTGGCTTGGT TTTTAAAACC AGCCTGGAGT AGAGCAGATG GGTTAAGGTG AGTGACCCCT 480CAGCCCTGGA CATTCTTAGA TGAGCCCCCT CAGGAGTAGA GAATAATGTT GAGATGAGTT 540CTGTTGGCTA AAATAATCAA GGCTAGTCTT TATAAAACTG TCTCCTCTTC TCCTAGCTTC 600GATCCAGAGA GAGACCTGGG CGGAGCTGGT CGCTGCTCAG GAACTCCAGG AAAGGAGAAG 660CTGAGGTTAC CACGCTGCGA ATGGGTTTAC GGAGATAGCT GGCTTTCCGG GGTGAGTTCT 720CGTAAACTCC AGAGCAGCGA TAGGCCGTAA TATCGGGGAA AGCACTATAG GGACATGATG 780TTCCACACGT CACATGGGTC GTCCTATCCG AGCCAGTCGT GCCAAAGGGG CGGTCCCGCT 840GTGCACACTG GCGCTCCAGG GAGCTCTGCA CTCCGCCCGA AAAGTGCGCT CGGCTCTGCC 900AGGACGCGGG GCGCGTGACT ATGCGTGGGC TGGAGCAACC GCCTGCTGGG TGCAAACCCT 960TTGCGCCCGG ACTCGTCCAA CGACTATAAA GAGGGCAGGC TGTCCTCTAA GCGTCACCAC 1020GACTTCAACG TCCTGAGTAC CTTCTCCTCA CTTACTCCGT AGCTCCAGCT TCACCAGATC 1080CTCGAGAACG TCTCCCATGG GCTATCCCTA TGACGTCCCG GATTACGCAG TCATGGGCAG 1140CAGCCATCAT CATCATCATC ACAGCAGCGG CCTGGTGCCG CGCGGCAGCC ATATGGATCA 1200GAACAACAGC CTGCCACCTT ACGCTCAGGG CTTGGCCTCC CCTCAGGGTG CCATGACTCC 1260CGGAATCCCT ATCTTTAGTC CAATGATGCC TTATGGCACT GGACTGACCC CACAGCCTAT 1320TCAGAACACC AATAGTCTGT CTATTTTGGA AGAGCAACAA AGGCAGCAGC AGCAACAACA 1380ACAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGCAACAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA 1440GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGGCA GTGGCAGCTG CAGCCGTTCA 1500GCAGTCAACG TCCCAGCAGG CAACACAGGG AACCTCAGGC CAGGCACCAC AGCTCTTCCA 1560CTCACAGACT CTCACAACTG CACCCTTGCC GGGCACCACT CCACTGTATC CCTCCCCCAT 1620GACTCCCATG ACCCCCATCA CTCCTGCCAC GCCAGCTTCG GAGAGTTCTG GGATTGTACC 1680GCAGCTGCAA AATATTGTAT CCACAGTGAA TCTTGGTTGT AAACTTGACC TAAAGACCAT 1740TGCACTTCGT GCCCGAAACG CCGAATATAA TCCCAAGCGG TTTGCTGCGG TAATCATGAG 1800GATAAGAGAG CCACGAACCA CGGCACTGAT TTTCAGTTCT GGGAAAATGG TGTGCACAGG 1860AGCCAAGAGT GAAGAACAGT CCAGACTGGC AGCAAGAAAA TATGCTAGAG TTGTACAGAA 1920GTTGGGTTTT CCAGCTAAGT TCTTGGACTT CAAGATTCAG AACATGGTGG GGAGCTGTGA 1980TGTGAAGTTT CCTATAAGGT TAGAAGGCCT TGTGCTCACC CACCAACAAT TTAGTAGTTA 2040TGAGCCAGAG TTATTTCCTG GTTTAATCTA CAGAATGATC AAACCCAGAA TTGTTCTCCT 2100TATTTTTGTT TCTGGAAAAG TTGTATTAAC AGGTGCTAAA GTCAGAGCAG AAATTTATGA 2160AGCATTTGAA AACATCTACC CTATTCTAAA GGGATTCAGG AAGACGACGT AATGGCTCTC 2220ATGTACCCTT GCCTCCCCCA CCCCCTTCTT TTTTTTTTTT TAAACAAATC AGTTTGTTTT 2280GGTACCTTTA AATGGTGGTG TTGTGAGAAG ATGGATGTTG AGTTGCAGGG TGTGGCACCA 2340GGTGATGCCC TTCTGTAAGT GCCCCTTCCG GCATCCCGGA ATTCCTGCAG CCCAACGCGG 2400CCGCTTCGAG GGATCTTTGT GAAGGAACCT TACTTCTGTG GTGTGACATA ATTGGACAAA 2460CTACCTACAG AGATTTAAAG CTCTAAGGTA AATATAAAAT TTTTAAGTGT ATAATGTGTT 2520AAACTACTGA TTCTAATTGT TTGTGTATTT TAGATTCCAA CCTATGGAAC TGATGAATGG 2580GAGCAGTGGT GGAATGCCTT TAATGAGGAA AACCTGTTTT GCTCAGAAGA AATGCCATCT 2640AGTGATGATG AGGCTACTGC TGACTCTCAA CATTCTACTC CTCCAAAAAA GAAGAGAAAG 2700GTAGAAGACC CCAAGGACTT TCCTTCAGAA TTGCTAAGTT TTTTGAGTCA TGCTGTGTTT 2760AGTAATAGAA CTCTTGCTTG CTTTGCTATT TACACCACAA AGGAAAAAGC TGCACTGCTA 2820TACAAGAAAA TTATGGAAAA ATATTCTGTA ACCTTTATAA GTAGGCATAA CAGTTATAAT 2880CATAACATAC TGTTTTTTCT TACTCCACAC AGGCATAGAG TGTCTGCTAT TAATAACTAT 2940GCTCAAAAAT TGTGTACCTT TAGCTTTTTA ATTTGTAAAG GGGTTAATAA GGAATATTTG 3000ATGTATAGTG CCTTGACTAG AGATCATAAT CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT 3060TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT GAACCTGAAA CATAAAATGA ATGCAATTGT 3120TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA 3180TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA 3240TGTATCTTAT CATGTCTGGA TCC 3263(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度371個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..371(xi)序列描述SEQ ID No16Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val Met Gly Ser Ser1 5 10 15His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His20 25 30Met Asp Gln Asn Asn Ser Leu Pro Pro Tyr Ala Gln Gly Leu Ala Ser35 40 45Pro Gln Gly Ala Met Thr Pro Gly Ile Pro Ile Phe Ser Pro Met Met50 55 60Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Thr Pro Gln Pro Ile Gln Asn Thr Asn Ser65 70 75 80Leu Ser Ile Leu Glu Glu Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln85 90 95Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln100 105 110Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala115 120 125Val Ala Ala Ala Ala Val Gln Gln Ser Thr Ser Gln Gln Ala Thr Gln130 135 140Gly Thr Ser Gly Gln Ala Pro Gln Leu Phe His Ser Gln Thr Leu Thr145 150 155 160Thr Ala Pro Leu Pro Gly Thr Thr Pro Leu Tyr Pro Ser Pro Met Thr165 170 175Pro Met Thr Pro Ile Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ser Glu Ser Ser Gly180 185 190Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Gly Cys195 200 205Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala Glu Tyr210 215 220Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Arg225 230 235 240Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly Ala245 250 255Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala Arg Val260 265 270Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys Ile Gln275 280 285Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly290 295 300Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe305 310 315 320Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu Leu Ile325 330 335Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg Ala Glu340 345 350Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly Phe Arg355 360 365Lys Thr Thr370(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID No17Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu15 10Val Pro Arg Gly1權(quán)利要求
1.能夠表達(dá)已附加表位的TATA框結(jié)合蛋白(TBP)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
2.按照權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所說的TBP是以含有兩個(gè)附加表位的融合蛋白形式表達(dá)的。
3.按照在權(quán)利要求1和2中一個(gè)或多個(gè)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所說的融合蛋白含有人類TBP(hTBP)。
4.按照權(quán)利要求1-3中一個(gè)或多個(gè)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所說的融合蛋白含有HA-和His-表位。
5.按照權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所說的融合蛋白具有SEQ ID NO.16的序列。
6.按照權(quán)利要求1-5中的一個(gè)或多個(gè)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所說的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是小鼠。
7.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-6中一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法，該方法是通過將轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物的種系和/或體細(xì)胞而完成的。
8.一種通過將轉(zhuǎn)基因DNA微注射到非人動(dòng)物合子中而產(chǎn)生如權(quán)利要求7所要求的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
9.一種通過使用含有轉(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染卵裂球來產(chǎn)生如權(quán)利要求7所要求的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
10.一種通過將轉(zhuǎn)基因引入到胚胎干細(xì)胞來產(chǎn)生如權(quán)利要求7所要求的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
11.一種轉(zhuǎn)基因，這種轉(zhuǎn)基因編碼已附加表位的TBP，并且可以用來產(chǎn)生權(quán)利要求1-6中的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。
12.如權(quán)利要求11所要求的轉(zhuǎn)基因，這種轉(zhuǎn)基因含有第一種編碼TBP的DNA序列和第二種編碼一個(gè)或多個(gè)附加表位的DNA序列。
13.如權(quán)利要求11和12的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的編碼TBP的DNA序列是cDNA。
14.如權(quán)利要求13所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的DNA序列是人TBP(hTBP)的cDNA。
15.如權(quán)利要求11-14的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的第二種DNA序列編碼兩個(gè)附加表位。
16.如權(quán)利要求15所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的附加表位是HA-表位和His-表位。
17.如權(quán)利要求15和16的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的HA-表位具有下列序列之一SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3或SEQ ID NO.4。
18.如權(quán)利要求11-17的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因，這種轉(zhuǎn)基因含有SEQ ID NO.13的序列。
19.如權(quán)利要求11-18的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因，這種轉(zhuǎn)基因含有可誘導(dǎo)的或者組成型啟動(dòng)子的DNA。
20.如權(quán)利要求19所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的啟動(dòng)子是EF基因的啟動(dòng)子。
21.如權(quán)利要求19所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的啟動(dòng)子是MT基因的啟動(dòng)子。
22.如權(quán)利要求11-22的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因，其中所說的轉(zhuǎn)基因具有SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15的序列。
23.如權(quán)利要求11-22的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因在產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面的用途。
24.一種通過將編碼一個(gè)或多個(gè)附加表位的DNA序列與編碼TBP蛋白質(zhì)的DNA序列連接來產(chǎn)生如權(quán)利要求11-22的一個(gè)或多個(gè)的轉(zhuǎn)基因的方法。
25.如權(quán)利要求11-22的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因在產(chǎn)生已附加表位的TBP上的用途。
26.如權(quán)利要求1-6的一個(gè)或多個(gè)中所要求的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在表達(dá)已附加表位的TBP上的用途。
27.一種在如權(quán)利要求1-6中的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)的已附加表位的TBP。
28.一種含有兩個(gè)表位的如權(quán)利要求27所要求的已附加表位的TBP。
29.一種如權(quán)利要求27和28的一個(gè)或多個(gè)所要求的已附加表位的TBP，其中所說的TBP是hTBP。
30.一種如權(quán)利要求27-29的一個(gè)或多個(gè)所要求的已附加表位的TBP，其中所說的TBP與HA-表位和His-表位連接。
31.如權(quán)利要求27-30的一個(gè)或多個(gè)所要求的已附加表位的TBP，其中所說的HA表位具有下列序列之一SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
32.如權(quán)利要求27-31的一個(gè)或多個(gè)所要求的已附加表位的TBP，其具有SEQ ID NO.16的序列。
33.一種通過將如權(quán)利要求11-22的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因引入到動(dòng)物的種系和/或體細(xì)胞中來產(chǎn)生如權(quán)利要求27-32的一個(gè)或多個(gè)所要求的已附加表位的TBP的方法。
34.一種通過將含有組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物中來產(chǎn)生如權(quán)利要求33所要求的已附加表位的TBP的方法，其中所說的已附加表位的TBP可以在也可以不在動(dòng)物發(fā)育的特定階段在動(dòng)物特定的細(xì)胞類型和/或組織中表達(dá)。
35.一種通過將含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物中并在此啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下表達(dá)已附加表位的TBP來產(chǎn)生如權(quán)利要求33所要求的已附加表位的TBP的方法。
36.已附加表位的TBP在從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物及鑒定TAFs和TAF-相互作用因子方面的用途。
37.如權(quán)利要求1-6的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物在表達(dá)已附加表位的TBP方面的用途。
38.如權(quán)利要求1-6的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物在從不同的組織和/或細(xì)胞類型中分離高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物方面的用途，可以任選動(dòng)物的不同發(fā)育階段。
39.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物在鑒定新的和/或特異性TAFs和/或TAF-相互作用因子方面的用途。
40.一種鑒定和定性不同的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方法，其中所說的與高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)的已附加表位的TBP是從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離出來的。
41.一種確定不同的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成的方法，其中a)將如權(quán)利要求11-22的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物中，b)在任選的動(dòng)物的不同發(fā)育階段從不同的動(dòng)物組織和/或不同的細(xì)胞類型中分離已附加表位的TBP，c)確定高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成。
42.一種鑒定新的和/或特異性TAF和/或TAF-相互作用因子的方法，其中a)將如權(quán)利要求11-22的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物中，b)可以在也可以不在動(dòng)物的特定發(fā)育階段從動(dòng)物的特定組織和/或特定的細(xì)胞類型中分離已附加表位的TBP，c)將在高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中與已附加表位的TBP相關(guān)的TAF和/或TAF-相互作用因子分開并分離，d)可以確定也可以不確定TAF和/或TAF-相互作用因子的氨基酸序列。
43.一種從權(quán)利要求1-6的一個(gè)或多個(gè)所要求的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中分離不同的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方法，其中對(duì)與已附加表位的TBP相關(guān)的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)行親和共純化，而已附加表位的TBP經(jīng)使用至少一種已附加到TBP上的表位進(jìn)行親和純化。
44.一種分離如權(quán)利要求43所要求的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方法，其中已附加表位的TBP是通過其His表位與Ni2+柱的結(jié)合而純化的。
45.一種分離如權(quán)利要求43和44的一個(gè)或多個(gè)所要求的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方法，其中已附加表位的TBP是通過其HA表位與抗HA抗體的結(jié)合而純化的。
46.一種分離如權(quán)利要求43-45的一個(gè)或多個(gè)所要求的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方法，其中所說的高級(jí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物是通過使用含有抗體的親和柱分離的，所說的抗體能夠識(shí)別具有SEQ ID NO.17序列的已附加表位的TBP的表位。
47.一種能夠識(shí)別已附加表位的TBP的表位的抗體，所說的TBP具有SEQ ID NO.17的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有編碼已附加表位的TATA框結(jié)合蛋白(TBP)的DNA的轉(zhuǎn)基因、表達(dá)已附加表位的TBP的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生和使用它們從各種類型的真核組織和細(xì)胞親和純化(新型的)轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1200235SQ9810898
公開日1998年12月2日 申請(qǐng)日期1998年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月26日
發(fā)明者B·克什巴姆, E·比格倫德, M·梅斯特雷斯特 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司