專利名稱：胸腺素α－1衍生物的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?3119346X、申請(qǐng)日為1993年9月27日、發(fā)明名稱為“胸腺素α-1衍生物”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明提供了一種涉及胸腺素α-1的新的合成化合物。
胸腺素是胸腺分泌的多肽免疫調(diào)節(jié)物。業(yè)已證明胸腺素能誘導(dǎo)T細(xì)胞分化和增強(qiáng)免疫功能。
部分純化的牛犢胸腺提取物稱作胸腺素部分5，此種提取物含許多如稱作胸腺素α-1的化合物的胸腺的肽產(chǎn)物。
US 4,079,127、US 4,148,788和US 4,855,407最初是從胸腺素部分5中分離出胸腺素α-1的。且進(jìn)行了測(cè)序并采用化學(xué)方法合成出來了。US 4,116,951也制備出了胸腺素α-1的類似物。胸腺素α-1的順序與小鼠、牛犢和人具有高度同源性。胸腺素α-1有28個(gè)氨基酸，業(yè)已證明胸腺素α-1具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。胸腺素α-1的免疫作用包括如刺激α-和γ-干擾素的產(chǎn)生、增加巨噬細(xì)胞游走抑制因子的產(chǎn)生、包括如誘導(dǎo)T細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)(如白細(xì)胞介素-2受體)以及改善T細(xì)胞輔助細(xì)胞的的活性。
本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)仍需要其功能類似胸腺天然產(chǎn)物的新的合成化合物。
本發(fā)明涉及了-種(Ⅰ)式化合物。
R1-X-R2-Y(Ⅰ)其中X為Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu，或?yàn)槠渖锘钚匝苌锘驗(yàn)槠淦?；R1是Ac或z，其中Ac是乙酰基團(tuán)，z是

其中的Ac和X定義同上；R2是Asn或Asp；R3是Asn或Asp；和Y是-OH或-NH2；其條件是如R1是Ac和R2是Asn,Y則為-NH2。本發(fā)明還適用于一種(Ⅰ)式化合物的新的中間體及前體。
本發(fā)明的化合物是胸腺素α-1的衍生物，是適宜于治療對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)物應(yīng)答的各種疾病和指征的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)物。本發(fā)明的增強(qiáng)免疫的化合物可用于喪失免疫和免疫抑制的患者重組免疫功能，并能用于治療免疫缺陷疾病。
本發(fā)明的上述(1)式化合物的一個(gè)例子具體為胸腺素α-1酰胺，其中的R1是乙?；琑2是Asn,Y是-NH2。該式的另一化合物的例子為[Asp28]一胸腺素α-1，其中的R1是乙?；?，R2是Asp,Y是-OH。本發(fā)明還適用于胸腺素α-1三聚物，其中R1為具有上述含義的Z。
本發(fā)明的化合物還包括根據(jù)上述(Ⅰ)式的化合物的新穎的中間體和前體。
中間體和前體的例子包括有如下述(Ⅱ)式組成的化合物X2-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-R2(Ⅱ)其中R2是Asn或Asp；并且其中X2是Val,Glu-Val,Lys-Glu-Val,Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Thr-Lys-Asp-Lsu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Lsu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Iys-Lys-Glu-Val,Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Gly-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Gly-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,或Z-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val，其中Z由下列通式表示

其中R3是Asn或Asp并且x3是Glu,Ala-Glu,Glu-Ala-Glu,Glu-Glu-Ala-Glu,Val-Glu-Glu-Ala-Glu,或x4-Val-Glu-Glu-Ala-Glu,其中x4是Val,Glu-Val,Lys-Glu-Val,Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-val,Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-GLu-Val,Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Ala-val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-val,Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val，；其條件是，如R2是Asn時(shí)，X2是Gly-Ser-Asp-Ala-Ale-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Gly-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ssr-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,或Z-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val.
在實(shí)施方案中X2包括基團(tuán)Z,R3優(yōu)選Asn。
可用任何適宜的方法，如固相肽合成法制備本發(fā)明的化合物，中間體和前體。
將用下面非限定的實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Lsu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-NH2(胸腺素α-1酰胺)于底部裝有燒結(jié)玻璃過濾器和頂部裝有機(jī)械攪拌器的肽合成燒瓶中加入按照合并于這里作參考的US 4,855,407的實(shí)施例1制備的1.0g甲基二苯甲基胺樹脂。用20個(gè)體積溶于氯甲烷的10％三乙胺的洗滌此樹脂，將此樹脂同一份新的同樣的溶液一起攪拌10分鐘。以溶于15ml,N,N′-二甲基甲酰胺中的1.5mmol Boc-L-天冬酰胺(0.35g)、3.0mmol1-hydroxybonsotxrasolo-水合物(0.46g)和1.5mmolN,N′-二環(huán)已基碳化二亞胺(0.309g)與中性的甲基二苯甲基胺樹脂反應(yīng)過夜形成Boc-L天冬酰胺基甲基二苯甲基胺樹脂。為了避免對(duì)茚三酮試驗(yàn)有非常輕微的陽性反應(yīng)，于20ml氯甲烷中，用2mmol乙酸(0.12ml)和1.5mmol N,N′-二環(huán)已基碳化二亞胺對(duì)此氨基酸樹脂乙?；?小時(shí)。
然后，按下面的步驟繼續(xù)進(jìn)行固相肽合成，其中，依次將一種氨基酸并入于此樹脂上增長的肽鏈上(另有說明除外，每次洗滌用20體積溶劑或試劑。另有說明除外，所用的所有氨基酸的衍生物均為L-構(gòu)型。)(1)用溶于氯甲烷的50％的三氟乙酸溶液對(duì)所說樹脂進(jìn)行預(yù)洗滌；(2)于溶于氯甲烷的50％三氟乙酸溶液中攪拌30分鐘；(3)用氯甲烷洗滌三次；(4)用溶于氯甲烷的10％三乙胺溶液預(yù)洗滌；(5)于溶于氯甲烷的10％三乙胺中攪拌5分鐘；(6)用氯甲烷洗滌三次；(7)與溶于氯甲烷中的各為1.5mmol的Boc-Glu(oB21)-OH和N,N′-二環(huán)己基碳化二亞胺攪拌120分鐘；(8)用溶于二氯甲烷的50％異丙醇洗滌二次；(9)用氯甲烷洗滌三次；(10)試驗(yàn)茚三酮的顯色反應(yīng)；如是陽性，重復(fù)步驟7-10；如陰性，則進(jìn)行下一合成循環(huán)。
依次用下述Boc-氨基酸且在每一循環(huán)步驟7中一次用一種氨基酸重復(fù)合成循環(huán)；
Boc-Ala-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Box-Glu(OBzl)-OH,Box-Val-OH,Box-Val-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Box-Lys(Clz)-OH,Boc-Lys(Clz)-0H,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Leu-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Ila-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Val-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH和CH3COOH。完成全部合成循環(huán)后，這樣獲得受保護(hù)的胸腺素α-1酰胺-MBHA-樹脂Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Clz)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Clz)-Glu(OBzl)-Lys(Clz)-Lys(Clz)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-EN-CH(ph-CH3)-樹脂，重2.7g。
把獲得的此肽樹脂(1.0g)與2ml苯甲醚混合，并于0℃下，在液態(tài)氟化氫中攪拌60分鐘以進(jìn)行去保護(hù)和裂解。去除過量的酸后，殘存物用無水醚洗滌幾次后，用50ml 4％乙酸銨萃取，再用25ml蒸餾水萃取，把合并的萃取液濃縮至一小體積(10-12ml)，用Sephadex G-10(2.6×85cm,0.1M HOAc洗脫)脫鹽。冷凍干燥得0.37g粗胸腺素α-1酰胺。
以5.5ml/分流速，在234nm處測(cè)定，用Vydac(多孔層實(shí)心球)C18柱(2.2×25cm,10μ)。線性梯度2.5％-9.0％異丙醇(PH6的碳酸鉀緩沖液洗脫對(duì)上述獲得的主要部分粗肽(0.347g)進(jìn)行半制備HPLC純化。每部分肽均用HPLC進(jìn)行分析檢測(cè)。僅收集純度在98％或98％以上的部分，用Sephadex G-10柱脫鹽，冷凍干燥得0.0767g欲要產(chǎn)品胸腺素α-1酰胺。
HPLC分析表明此品是同源的，遷移比胸腺素α-1略慢。如將胸腺素α-1酰胺同胸腺素α-1混合并用HPLC進(jìn)行色譜分析，此兩種化合物均能很好地彼此溶解于所用的HPLC體系中。用FAB質(zhì)譜對(duì)分子量進(jìn)行測(cè)定表明此物質(zhì)具有正確分子量MH+=3108(計(jì)算的MW=3107.3)。對(duì)此酸水解物(24小時(shí)和100小時(shí))的氨基酸分析表明此肽具有所預(yù)計(jì)的氨基酸比例amino acid ratios:6N HCl 110°,24小時(shí)； Asp,3.86；Thr,2.90；Ser,2.63；Glu,6.14；Ala,2.86；Val,2.23；Ile,0.96；Leu,1.03,Lys,4.12.5N HCl.110°,100小時(shí)；Asp,4.09；Thr,2.90；Ser,1.98；Glu,6.45；Ala,3.00；Val,2.95；Ile,0.98；Leu,1.04；Lys,4.ll.
實(shí)施例2Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asp-OH([Asp28]-胸腺素α-1于肽合成燒瓶中，加入1.0g Boc-天冬氨酸β-芐酯樹脂(0.5mmol/g)并采用下述步驟進(jìn)行固相肽合成，其中，在每一循環(huán)中，按順序?qū)⒁环N氨基酸并入于所說樹脂上的正在增長的肽鏈上。另有說明除外，所有所用氨基酸衍生物均為L-構(gòu)型(1)以溶于氯甲烷的50％三氟乙酸進(jìn)行預(yù)洗滌；(2)同溶于氯甲烷的50％三氟乙酸一道攪拌30分鐘；(3)用氯甲烷洗滌三次；(4)用溶于氯甲烷的10％三乙胺溶液進(jìn)行預(yù)洗滌；(5)同溶于氯甲烷的10％三乙胺一道攪拌5分鐘；(6)用氯甲烷洗滌三次；(7)同溶于氯甲烷的各為1.5mmol的Boc-Glu(OB21)-OH和N,N′-二環(huán)己基碳化二亞胺一道攪拌150分鐘；(8)用溶于氯甲烷溶液的50％異丙醇洗滌二次；(9)用氯甲烷洗滌三次；(10)茚三酮的顯色反應(yīng)試驗(yàn)；如為陽性重復(fù)步驟7-10；如為陰性，進(jìn)行下一合成循環(huán)。
依次用下述Boc-氨基酸并在每一循環(huán)的步驟7中每次用一種氨基酸重復(fù)合成循環(huán)Boc-Ala-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Val-OH,Boc-Val-OH,Boc-GLu(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Leu-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Thr(Szl)-OH,Boc-Ile-OH,Boc-Glu-(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Val-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH和CH3COOH.全部合成循環(huán)畢，保護(hù)的[Asp28]-胸腺α-1樹脂具有結(jié)構(gòu)Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Clz)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Clz)-Glu(OBzl)-Lys(Clz)-Lys(Clz)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OCH2C6H4-樹脂，重2.08g。
于2ml苯甲醚存在下，0℃下，將上述得到的受保護(hù)的部分肽樹脂(1.0g)同10ml無水液態(tài)氫一起攪拌60分鐘。蒸去過量的酸，殘余物迅速用無水醚洗滌兩次。接著把肽萃取入4％的乙酸銨(50ml)中，然后用蒸餾水(25ml)再萃取。把合并的萃取物濃縮到一小體積，爾后用Sephadex G-10柱(2.6×85cm,0.1M HOAC)進(jìn)行脫鹽。對(duì)肽峰洗脫液冷凍干燥得0.327g粗品。
用Hamilton PRP-1柱(2.15×25cm，粒度10μ，先3％后6％的乙腈(PH6)的磷酸鉀緩沖液洗脫)對(duì)此粗品0.27g進(jìn)行純化。用HPLC進(jìn)行分析，收集含所要物質(zhì)的部分，用SephadexG-10柱脫鹽。冷凍主峰部分得35mg[Asp28]-胸腺素α-1。用HPLC進(jìn)行分析，由于此胸腺素極性略強(qiáng)，酸性略高，所以正如所預(yù)計(jì)的那樣，它的遷移率比胸腺素α-1的略高。經(jīng)FAB質(zhì)譜分析表明MH+=3110(計(jì)算值MW=3109.3)。對(duì)該酸水解物進(jìn)行氨基酸分析表明此品具有正確的氨基酸成分；6N HCl,110°,24小時(shí)；Asp,4.00；Thr,3.10；Ser,2.54；Glu,5.85；Ala,2.80；Val,1.70；Ile,0.95；Leu,1.03；Lys,3.76 6N HCl,110°,100小時(shí)；Asp,4.00；Thr,3.03；Ser,2.2l；Glu,6.12；Ala,2.81；Val,3.04；Ile,0.96；Leu,1.09；Lys,4.17.
實(shí)施例3

(胸腺素α-1三聚物)于肽合成燒瓶中加入2.0g甲基二苯甲基胺樹脂(0.5mmol/g,1.0mmol)，用氯甲烷洗滌三次，接著用溶于氯甲烷的10％三乙胺洗滌一次。同溶于氯甲烷的10％三乙胺一道攪拌10分鐘，用氯甲烷洗滌三次。然后把中性的此樹脂同溶于氯甲烷的Boc-天冬氨酸α-芐酯和N,N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(各為3mmo1)反應(yīng)75分鐘形成具有Boc-Asp[HN-CH(C6H1-CH3)-樹脂]-OB21結(jié)構(gòu)的甲基二苯甲基胺樹脂的Boc-天冬氨酸α-芐酯β--酰胺。為了去除對(duì)茚三酮實(shí)驗(yàn)很弱的陽性反應(yīng)，用溶于氯甲烷中的4mmol乙酸和3mmol N,N′-二環(huán)己基碳化二亞胺對(duì)此Boc-氨基酸樹脂作進(jìn)一步處理(180分鐘)。
按下面的步驟繼續(xù)進(jìn)行固相合成，其中，在每一循環(huán)中，把一種特定的氨基酸并入于樹脂增長的肽鏈上。[在樹脂上的肽鏈起初是單線性結(jié)構(gòu)，直至在第28次循環(huán)并入甘氨酸殘基和在第29次循環(huán)并入N2,N6-Di-Boc-賴氨酸。然后從第30次循環(huán)開始分成兩個(gè)與同-賴氨酸殘基相連的平行的鏈，此處兩個(gè)單位的Boc-天冬酰胺殘基同時(shí)并入兩個(gè)鏈]?；景瓷鲜鰧?shí)施例同樣的辦法。把20個(gè)體積的溶劑或試劑用于每一步驟(1)用溶于氯甲烷的50％三氟乙酸進(jìn)行預(yù)洗滌；(2)同溶于氯甲烷的50％三氟乙酸一道攪拌30分鐘；(3)用氯甲烷洗滌三次；(4)用溶于氯甲烷的10％三乙胺進(jìn)行預(yù)洗滌；(5)用溶于二氯甲烷的10％三乙胺一道攪拌5分鐘；
(6)用氯甲烷洗滌三次；(7)同溶于氯甲烷的各為3mmol的Boc-Glu(OB2.1)-OH和N，N′-二環(huán)已基碳化二亞胺一道攪拌120分鐘；(8)用溶于氯甲烷的50％異丙醇洗滌兩次；(9)用氯甲烷洗滌三次；(10)實(shí)驗(yàn)茚三酮顯色反應(yīng)，如為陽性，重復(fù)步驟7-10；如為陰性，進(jìn)行下一合成循環(huán)。
依次使用下述Boc-氨基酸且在每一循環(huán)步驟7使用一種氨基酸來重復(fù)合成循環(huán)；Boc-Ala-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Val-OH,Boc-Val-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-LyB(Clz)-OH,Boc-Leu-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Bcc-Ils-OH,Boc-Glu-(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Val-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH.此時(shí)，從肽合成燒瓶中取出3.96g肽樹脂，將Boc-Gly-OH用于一個(gè)循環(huán)而將N°-Boc-N′-Boc-Lys(C12)-OH用于下一循環(huán)的步驟7以產(chǎn)生肽鏈組裝的分叉點(diǎn)來讓剩下的1.96g肽樹脂繼續(xù)合成。用Boc-Asn-OH,Boc-Glu(OBzl),Boc-Ala-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Val-OH,Boc-Val-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Leu-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Lys(Clz)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Ile-OH,Boc-Glu(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,Boc-Thr(Bzl)-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Val-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Ala-OH,Boc-Asp(OBzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH,和CH3COOH.繼續(xù)進(jìn)行合成。完成的受保護(hù)的胸腺素α-1三聚物樹脂具有下述結(jié)構(gòu)；重2.64g

腺素(α-1樹脂)在2ml苯乙醚存在下，0℃度下，將上述獲得的保護(hù)的胸腺素α-1三聚物樹脂0.91g同10ml無水氟化氫一起攪拌60分鐘。除去過量的酸后，用無水醚洗滌殘余物兩次。先將肽物質(zhì)萃取入4％的乙酸銨中，然后用10ml蒸餾水再萃取。把合并的萃取物濃縮至約10ml，用Sephadex G-10柱(2.6×85cm,0.1M HOAC)脫鹽，收集主峰值部分的洗脫物，冷凍干燥得0.35g或粗胸腺素α-1三聚物。
在5.45ml/分的流速下，以溶于磷酸鉀8.5％-20％乙腈(PH6)線性梯度洗脫，用Hamilton PRP-1反相聚苯乙烯柱(2.15×250mm,10μ粒度)對(duì)所說粗品(0.34g)進(jìn)行純化后再用Sephadex G-10柱脫鹽產(chǎn)出0.045g欲要的胸腺素α-1三聚物。HPLC分析表明，此三聚物是同源的且具有預(yù)計(jì)的氨基酸組成。6N HCl,110°,24小時(shí)；Asp,11.83；Thr,9.17；Ser,8.00；Glu,18.16；Gly,0.97；Ala,8.68；Val,6.54；Ile,3.04；Leu,3.18；Lys,12.58.6N HCl,110°,10(小時(shí)；Asp,Asp,12.14；Thr,9.45；Ser,6.47；Glu,17.86；Gly,1.07；Ala,8.51；Val,8.79；Ile,2.89；Leu,3.11；Lys,13.11。ES質(zhì)譜分析表明此物具有正確的分子量9432.13(計(jì)算值MW=9432.1)。
由于對(duì)所描述的實(shí)施方案在細(xì)節(jié)上可作許多變更，修改和變化，但其目的用以進(jìn)行說明而并非用于限制本發(fā)明。
權(quán)利要求
1．式(Ⅰ)化合物R1-X-R2-Y (Ⅰ)其中X是Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu或其生物活性衍生物或片段；R1是Z，其中Z是
其中Ac是乙?；鶊F(tuán)，X的含義同上；R2是Asn或Asp；R3是Asn或Asp；Y是-OH或-NH2。
2．權(quán)利要求1的化合物，其中R3是Asn,R2是Asp,Y是-OH。
3．權(quán)利要求1的化合物，其中R3是Asn,R2是Asn,Y是-OH。
4．式(Ⅱ)化合物X2-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-R2(Ⅱ)其中R2是Asn或Asp；并且其中X2是Z-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val，其中Z是
其中R3是Asn或Asp,X3是Glu,Ala-Glu,Glu-Ala-Glu,Glu-Glu-Ala-Glu,Val-Glu-Glu-Ala-Glu,或x4-Val-Glu-Glu-Ala-Glu,其中X4是Val,Glu-Val,Lys-Glu-Val,Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val, Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val。
5．權(quán)利要求4的化合物，其中R3是Asn或Asp，X3是Glu,Ala-Glu,Glu-Ala-Glu,Glu-Glu-Ala-Glu或Val-Glu-Glu-Ala-Glu。
6．權(quán)利要求5的化合物，其中R3是Asn。
7．權(quán)利要求4的化合物，其中R3是Asn或Asp,X3是X4-Val-Glu-Glu-Ala-Glu，其中X4是Val,Glu-Val,Lys-Glu-Val,Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val或Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val。
8．權(quán)利要求7的化合物，其中R3是Asn。
9．權(quán)利要求4的化合物，其中R3是Asn或Asp,X3是X4-Val-Glu-Glu-Ala-Glu，其中X4是Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val或Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val。
10．權(quán)利要求9的化合物，其中R3是Asn。
11．權(quán)利要求4的化合物，其中R3是Asn或Asp,X3是X4-Val-Glu-Glu-Ala-Glu，其中X4是Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val,Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val或Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val。
12．權(quán)利要求11的化合物，其中R3是Asn。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種其中X具有下述含義的(Ⅰ)式化合物或生物活性衍生物或其片段:R
文檔編號(hào)C07K14/575GK1223266SQ9810958
公開日1999年7月21日 申請(qǐng)日期1998年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月3日
發(fā)明者王世升 申請(qǐng)人:施塞克龍藥品公司