專利名稱：固定化模板指導(dǎo)的寡核苷酸合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸的合成方法，尤指以固定化模板為指導(dǎo)的單核苷酸或寡核苷酸片段之間的化學(xué)連接合成寡核苷酸的方法。
寡核苷酸合成在近幾十年中發(fā)展很快，到八十年代后期核酸自動(dòng)合成儀已經(jīng)問(wèn)世。對(duì)生物和醫(yī)學(xué)的研究起了很大的促進(jìn)作用。寡核苷酸，包括反義寡核苷酸、抗基因寡核苷酸是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的治療藥物(Wagner，RW，Nature，1994，372，333-335；Crook，ST，Annu.Rev.Pharmacol.Toxical.，1992，32，329-376；Helene，C，Eur.J.Cancer，1994，30A，1721-1726；Crooke，ST，AntisenseNucleic acids Drug Dev.，1996，6，141-147.)。將寡核苷酸作為藥物就要求發(fā)展出大規(guī)模的經(jīng)濟(jì)的合成寡核苷酸的方法。目前使用的是用全合成的方法，雖然通過(guò)放大規(guī)?？梢源蟠蠼档秃铣沙杀?Geiser，T.AidsAnti-HIV Agents，Therapies，and Vaccines 1990，616，173-183.)，但成本仍然還比較高。其原因在于從核苷制成保護(hù)核苷，再制成活性單體，再合成寡核苷酸，每一步都需一定的成本。此外，用這種方法，需要昂貴的合成儀，合成規(guī)模愈擴(kuò)大，需要設(shè)備的投資愈大。用新的思路，發(fā)展新的合成方法仍是非常重要。
除了全合成方法外，用化學(xué)方法連接單核苷酸或寡核苷酸也有一些報(bào)導(dǎo)。Orgel等在探索生命的起源中以多聚rC為模板，以EDC〔(1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽〕為縮合劑，甲基咪唑?yàn)榇呋瘎膯魏塑账岷铣闪斯丫踨G，用GGCGG為模板從單核苷酸合成了五核苷酸CCGCC(Joice，GF etal.，Nature，1984，310，602-604；Isoue，T.et al.，J.Mol.Biol.1984，178，669-676.)。他們又用PNA作模板從單核苷酸合成了寡聚rG(Bohler C.et al.，Nature，1995，376，578-581.)。Shabarova等用EDC或溴化氰實(shí)現(xiàn)了模板指導(dǎo)的DNA片段的連接(Shabarova，ZAet al.，Nuleic Acids Res.1991，19，4247-4251；Dolinnaya，NGet al.，Nuleic Acids Res.1991，19，3067-3072.)。他們的工作僅僅是在溶液中實(shí)現(xiàn)了單核苷酸或寡核苷酸的連接。這種方法在水溶液中進(jìn)行，不需要對(duì)堿基進(jìn)行保護(hù)，但連接率不高，更主要的是連接需要先合成模板，因此，此方法本身不可能發(fā)展成為一種寡核苷酸的合成方法。
為了尋找更好的合成寡核苷酸的方法，本發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。采取上面兩種合成方法各自之優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展了一種新的適合于大規(guī)模合成寡核苷酸的方法。
本發(fā)明的目的是提供一種固定化模板指導(dǎo)的合成寡核苷酸的新方法，該方法是先提供一條寡核苷酸作為模板，再將它固定到固相載體柱上，然后將單核苷酸或與模板配對(duì)的數(shù)段寡核苷酸片段分別通入柱中與模板通過(guò)堿基配對(duì)排列在一起，在縮合劑的作用下使單核苷酸連接成寡核苷酸或使短的寡核苷酸片段連接成長(zhǎng)的寡核苷酸片段。該方法只需要提供一條寡核苷酸作為模板，這條模板固定化后可以反復(fù)用于寡核苷酸的合成，因而可以大大降低合成成本。
本發(fā)明提供的固定化模板指導(dǎo)的寡核苷酸合成方法是基于利用堿基配對(duì)，在縮合劑作用下模板指導(dǎo)的化學(xué)連接合成寡核苷酸，該法是以一條寡核苷酸為模板進(jìn)行固定化，可以反復(fù)使用來(lái)指導(dǎo)寡核苷酸合成的方法。它包括下列步驟1.提供一條寡核苷酸作為模板，此寡核苷酸可以用全合成方法(固相法，液相法)合成，也可用其他方法得到，此寡核苷酸可以是DNA，RNA，PNA或修飾衍生物；2.將該寡核苷酸的一端通過(guò)共價(jià)連接固定到固相載體上并裝柱，固相載體可以是微孔玻璃顆粒或交聯(lián)瓊脂糖或其他有機(jī)高聚體(聚苯乙烯，聚丙烯酰胺等)，連接方法可以通過(guò)寡核苷酸5’或3’的磷酸基團(tuán)或氨臂與固相載體上的氨基或羧基相連接；3.將單核苷酸或數(shù)段與模板配對(duì)的短片段寡核苷酸分別通入柱中與模板通過(guò)堿基配對(duì)，所用的單核苷酸或短片段寡核苷酸可以是由核酸酶將天然DNA切割成的單核苷酸或短寡核苷酸片段，也可以是用DNA合成儀合成短的寡核苷酸片段；4.通入縮合劑使單核苷酸連接成寡核苷酸或使數(shù)段短片段寡核苷酸連接成長(zhǎng)片段寡核苷酸產(chǎn)物，縮合劑可以是EDC或BrCN，或其他縮合劑；5.通入熱水使產(chǎn)物與模板解離，得到所需產(chǎn)物，而模板仍然留在柱上可以反復(fù)使用。
本發(fā)明以固定化的6聚寡核苷酸為模板指導(dǎo)的2片段化學(xué)連接，以17聚寡核苷酸為模板指導(dǎo)的5片段化學(xué)連接及以3聚寡核苷酸為模板指導(dǎo)的單核苷酸化學(xué)連接為例，進(jìn)行試驗(yàn)證明固定化模板為指導(dǎo)的寡核苷酸片段的化學(xué)連接發(fā)展成為寡核苷酸的合成方法是有效可行的。
如實(shí)施例3所介紹的，本發(fā)明先將一條合成的6聚寡核苷酸固定化后裝入一根柱中，按圖1所示與檢測(cè)儀，收集器聯(lián)接起來(lái)，依次將二段與模板配對(duì)的3聚寡核苷酸通入柱中與模板配對(duì)，再通入縮合劑，便可將二段3聚寡核苷酸連接成6聚寡核苷酸，經(jīng)鑒定洗下的產(chǎn)物中80％以上是6聚寡核苷酸(圖2)。如實(shí)施例4所介紹的，幾條短寡核苷酸一起連接也是可行的，每二個(gè)片段之間的連接率也在80％左右(圖3)。從中可以看到，采用本方法裝置簡(jiǎn)單，方便有效，一個(gè)循環(huán)時(shí)間很短，對(duì)于大規(guī)模合成非常有利。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明是提供一種合成寡核苷酸的新方法，此方法采用單核苷酸或短的寡核苷酸片段，以固定化的寡核苷酸為模板，利用堿基配對(duì)由模板將相鄰的單核苷酸或寡核苷酸片段排列在一起，由縮合劑縮合起來(lái)。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)首先在于此方法中，一條固定化的寡核苷酸模板可以反復(fù)用于寡核苷酸的合成，而在模板上進(jìn)行縮合的可以采用由核酸酶將天然DNA切割成的單核苷酸或短寡核苷酸片段，因此可以避免從核苷制成保護(hù)核苷，再制成活性單體，再合成寡核苷酸的步驟，直接從單核苷酸或短的寡核苷酸片段連接產(chǎn)生所需要的產(chǎn)物，因而可以大大降低合成成本。一條模板反復(fù)使用，可以合成出10倍乃至100倍的產(chǎn)物，成本就可以降低幾倍至幾十倍。即使采用合成儀合成的短寡核苷酸片段進(jìn)行連接，由于合成短的DNA片段的得率高于合成長(zhǎng)的片段，因而也可以降低成本。以每一步的縮合率為98％計(jì)算，合成一條24聚的寡核苷酸片段的理論得率為0.628，而合成3聚寡核苷酸片段的理論得率為0.96。雖然片段的連接率也不可能百分之百，由于未連接的小片段還可回收再用，最終寡核苷酸片段的利用率就比較高。其次反應(yīng)可以在水溶液中進(jìn)行，不需要特殊的儀器設(shè)備，可大大減少對(duì)儀器設(shè)備的投資。再者，本發(fā)明提供的方法在規(guī)模上沒(méi)有限制，模板量越多，合成的規(guī)模就越大，而現(xiàn)有的合成儀最大為10毫摩爾起始，一次合成約幾十克。最后，本發(fā)明所用的寡核苷酸片段可以是3′-單磷酸也可以是5′-單磷酸，可以是天然的單核苷酸或寡核苷酸短片段，也可以是帶修飾的寡核苷酸片段。因此，此方法有望成為一種大規(guī)模生產(chǎn)寡核苷酸藥物的有效的方法。
本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限止本發(fā)明的范圍。


圖1 以固定化模板合成寡核苷酸的裝置示意圖。
圖2 6聚寡核苷酸為模板的2片段化學(xué)連接產(chǎn)物的電泳鑒定樣品2為3核苷酸對(duì)照；
樣品4為6核苷酸對(duì)照；樣品1與3為二次連接的產(chǎn)物。
圖3 17聚寡核苷酸為模板的5片段化學(xué)連接產(chǎn)物的電泳鑒定樣品1為3核苷酸對(duì)照；樣品3為6核苷酸對(duì)照；樣品7為17核苷酸對(duì)照；樣品2為片段1與2組合連接的產(chǎn)物；樣品4為片段1，2，3組合連接的產(chǎn)物；樣品5為片段1，2，3，4組合連接的產(chǎn)物；樣品6為片段1，2，3，4，5組合連接的產(chǎn)物。
實(shí)施例1 3′-單磷酸寡核苷酸片段和其它實(shí)驗(yàn)用寡核苷酸片段的合成利用ABI公司的391EP DNA合成儀合成下列8種寡核苷酸片段，其DNA序列及修飾情況如下(1)5’d(CGC)p 3′ 3聚(2)5′d(ATG)p 3′ 3聚(3)5′d(TTGA)p 3′ 4聚(4)5′d(CAAC)p 3′ 4聚(5)5’d(AAG)3’3聚(6)5’ H2N-C6-P-d(CTTGTTGTCAACATGCG)3’17聚(7)5’H2N-C6-P-CATGCG 3’6聚(8)5’H2N-C6-P-CAT 3’3聚第(1)，(2)，(3)，(4)條寡核苷酸的3′為磷酸基團(tuán)；第(5)條寡核苷酸的3′為OH基團(tuán)；
第(6)，(7)，(8)條寡核苷酸的5’為通過(guò)磷酸基團(tuán)連接的六碳原子長(zhǎng)的氨臂，3′為OH基團(tuán)；第(1)，(2)，(3)，(4)條3′-單磷酸寡核苷酸使用0.2μmole 3′磷酸固相柱(3′-phosphate CPG Glen Research公司產(chǎn)品，全稱2-[2-(4，4’-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰長(zhǎng)鏈烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4，4’-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfomyl]ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG)，在ABI 391EP DNA合成儀上用0.2μmole合成順序合成。第(5)，(6)，(7)條3′為OH的寡核苷酸用0.2μmole dG固相柱(Glen Research產(chǎn)品)，用相同的合成順序合成。第(8)條用dT固相柱(Glen Research產(chǎn)品)，用相同的合成順序合成，最后(6)，(7)，(8)用5’加氨臂試劑(5’六碳氨基修飾試劑，英文商品名5’-Amino-Modifier C6，Peninsula Laboratories Inc.產(chǎn)品)加上六碳原子的氨臂。合成結(jié)束后，取出掛有寡核苷酸的載體，用濃氨水55℃處理15小時(shí)脫去保護(hù)基，吸出溶液，真空濃縮至干，重新溶解于200μl 50％甲酰胺中，經(jīng)7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，紫外燈下割帶，重蒸水浸泡，透析去鹽，濃縮后-20℃保存。測(cè)A260，計(jì)算產(chǎn)物量。
實(shí)施例2 6聚寡核苷酸模板的固定化先將6-氨基己酸4克加入到5克BrCN活化的瓊脂糖凝膠(Sepharose4B)，在50毫升10mM磷酸鉀緩沖液pH8.0，4℃反應(yīng)2小時(shí)，使氨基連接到Sepharose4B上，洗凈。再將實(shí)施例1中合成的第(7)條5’帶有六碳原子氨臂的6聚寡核苷酸5’H2N-C6-P-CATGCG 3’0.315 OD加入500mg上述樹脂，加0.115克縮合劑EDC，加水至1毫升，23℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)20小時(shí)，最終約有0.1 OD 6聚寡核苷酸被固定化在樹脂上。
實(shí)施例3 以固定化的6聚寡核苷酸為模板的2片段化學(xué)連接將連接有6聚寡核苷酸的樹脂裝入一個(gè)小柱，并與蠕動(dòng)泵，紫外檢測(cè)儀，記錄儀如圖1連接。
通過(guò)蠕動(dòng)泵依次將下列溶液輸入柱中1，二段與6聚寡核苷酸模板配對(duì)的三核苷酸片段與模板配對(duì)1)0.2M NaCl 0℃平衡柱；2)第一條三核苷酸d(ATG)p通入d(ATG)p的0.2 NaCl水溶液0℃上柱，在柱中停留5分鐘，與模板配對(duì)，然后用0.2M NaCl 0℃洗柱到無(wú)紫外吸收；3)第二條三核苷酸d(CGC)p通入d(CGC)p的0.2M NaCl水溶液0℃上柱，在柱中停留5分鐘，與模板配對(duì)。然后用0.2M NaCl 0℃洗柱到無(wú)紫外吸收；2，縮合1)0.2M MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)-三乙胺pH7.5，20mM MgCl2，0℃平衡柱；2)縮合劑0.4M BrCN，及0.2 MES pH 7.5，20mM MgCl2，0℃上柱，在柱中停留5分鐘，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接后用0.2M MES-三乙胺pH 7.5，0℃洗柱；3，產(chǎn)品洗脫1)ddH2O 0℃洗柱；2)ddH2O 37℃洗脫，收集樣品。重復(fù)上述過(guò)程，可以進(jìn)行第二次，第三次，---合成。
4，產(chǎn)品鑒定以6聚寡核苷酸為模板的2片段化學(xué)連接產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。取2次連接產(chǎn)物加入[γ-32P]ATP和T4PNK在5’標(biāo)記磷32，標(biāo)記條件為取約1pmole樣品加50μ Ci[γ-32p]-ATP，2單位T4多聚核苷酸激酶，1μl 10倍緩沖液，加雙蒸水至10μl，37℃保溫1小時(shí)。取5μl加等體積上樣緩沖液混勻，用7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠電泳。以d(CGC)p同樣進(jìn)行標(biāo)記作對(duì)照，結(jié)果見圖2。產(chǎn)物的80％為6聚寡核苷酸，少量3聚寡核苷酸，連接產(chǎn)率很好。實(shí)施例4以17聚寡核苷酸模板為指導(dǎo)的5片段化學(xué)連接以實(shí)施例1中所得到的17聚寡核苷酸片段H2N-C6-P-d(CTTGTTGTCAACATGCG)3’為模板，同實(shí)施例2固定在Sepharose4B上。將實(shí)施例1中所得到的第(1)條d(CGC)p用T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)在其5′端標(biāo)記上32P，標(biāo)記條件為取實(shí)施例1中所得到的第(1)條寡核苷酸1pmol加50μ Ci[γ-32p]-ATP，2單位T4多聚核苷酸激酶，1μl 10倍緩沖液，加雙蒸水至10μl，37℃保溫1小時(shí)，同實(shí)施例1一樣，用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法純化標(biāo)記的寡核苷酸，加入未標(biāo)記的寡核苷酸至10pmol，分別與40pmol實(shí)施例1中所得到的第(2)，(3)，(4)，(5)條寡核苷酸片段進(jìn)行不同組合通入柱中，形成氫鍵配對(duì)如下5’CTT GTTG TCAACAT GCG 3’3’GAApCAACpAGTTpGTApCGCp325’(5) (4) (3) (2) (1)同實(shí)施例3，通入縮合劑BrCN進(jìn)行連接，連接反應(yīng)在含0.25M MES-三乙胺緩沖液pH 7.5，20mM MgCl2，0.4M BrCN，中進(jìn)行，0℃，5分鐘。反應(yīng)后收集產(chǎn)物，取10μl加等體積上樣緩沖液混勻，用7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，放射性自顯影。由于只有寡核苷酸(1)標(biāo)有同位素，連接產(chǎn)物中只有有第(1)條寡核苷酸片段的才能顯影。因此除了都有寡核苷酸片段(1)以外，能看到的(1)與(2)組合的連接產(chǎn)物為6核苷酸，(1)與(2)與(3)組合的連接產(chǎn)物為6核苷酸和10核苷酸，(1)與(2)與(3)與(4)組合的連接產(chǎn)物為3個(gè)片段6核苷酸，10核苷酸和14核苷酸，(1)與(2)與(3)與(4)與(5)組合的連接產(chǎn)物應(yīng)為4個(gè)片段6核苷酸，10核苷酸，14核苷酸和17核苷酸。結(jié)果如圖3所示，在5片段連接反應(yīng)中可以見到片段(1)以及2片段，3片段，4片段，5片段連接產(chǎn)物。割下條帶測(cè)定放射性，計(jì)算連接率為(1)與(2)與(3)與(4)與(5)組合時(shí)，2片段46％，3片段17％，4片段12％，5片段10％，實(shí)際上片段(1)與(2)之間的連接率為46％+17％+12％+10％＝85％?？磥?lái)，每二個(gè)片段之間的連接率雖然可達(dá)80％以上，多片段連接的最后產(chǎn)率還不高。因此，先分別進(jìn)行2片段連接，再進(jìn)行連接產(chǎn)物之間的連接，效果更好。
實(shí)施例5，以3聚寡核苷酸模板為指導(dǎo)的單核苷酸化學(xué)連接以實(shí)施例1中所得到的3聚寡核苷酸片段5’H2N-C6-P-CAT 3’為模板，同實(shí)施例2固定在Sepharose4B上。混合核苷酸(5’dAMP，5’dTMP，5’dGMP)與縮合劑EDC，催化劑咪唑一起通入柱中，反應(yīng)體系為0.1M EDC，0.2M MES-三乙胺pH 6.0，20mM MgCl2，0.1M咪唑，10mM 5’dNMP，0℃，過(guò)夜。先用ddH2O0℃洗柱，洗去未連接的單核苷酸，而連接產(chǎn)生的3核苷酸與模板配對(duì)留在柱上。再用37℃ ddH2O洗脫，將3核苷酸洗下收集，得到pATG。
權(quán)利要求
1.一種合成寡核苷酸的方法，是利用堿基配對(duì)，在縮合劑的作用下模板指導(dǎo)的化學(xué)連接，其特征在于該法是以一條寡核苷酸為模板進(jìn)行固定化，可以反復(fù)使用來(lái)指導(dǎo)寡核苷酸合成的固定化模板指導(dǎo)的寡核苷酸合成方法，該方法包括下列步驟1〕，提供一條寡核苷酸作為模板；2〕，將該寡核苷酸模板固定到固相載體上；3〕，將單核苷酸或數(shù)段與模板配對(duì)的短片段寡核苷酸通入柱中與模板通過(guò)堿基配對(duì)；4〕，通入縮合劑使單核苷酸或短片段寡核苷酸連接成長(zhǎng)片段寡核苷酸產(chǎn)物；5〕，通入熱水使產(chǎn)物與模板解離，得到所需產(chǎn)物，而模板仍然留在柱上可以反復(fù)使用。
全文摘要
一種固定化模板指導(dǎo)的寡核苷酸合成方法,該法是提供一條寡核苷酸,將它固定到固相載體上作為模板,然后將單核苷酸或數(shù)段與模板配對(duì)的短片段寡核苷酸通入柱中與模板通過(guò)堿基配對(duì),再通入縮合劑使單核苷酸或短片段寡核苷酸連接成長(zhǎng)片段寡核苷酸,通入熱水使產(chǎn)物與模板解離,得到所要產(chǎn)物。由于模板可以反復(fù)使用,因此該方法合成寡核苷酸具有成本低,條件要求不高的優(yōu)點(diǎn)。適宜于寡核苷酸的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1245809SQ9811101
公開日2000年3月1日 申請(qǐng)日期1998年8月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月21日
發(fā)明者陸長(zhǎng)德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所