專利名稱：纖維素結(jié)合區(qū)域的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?4192440.8，申請(qǐng)日為1994年4月14日，發(fā)明名稱為“纖維素結(jié)合區(qū)域”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本申請(qǐng)是1993年4月14日提交的美國專利申請(qǐng)序號(hào)No.08/048,164的部分后續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及以顯著高的親和力和可逆方式與非水溶性形式的，包括結(jié)晶體形式的纖維素和殼多糖結(jié)合的纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD))。已分離了本發(fā)明的CBD。本發(fā)明的CBD基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)其可用于將多種物質(zhì)，特別是生物學(xué)活性分子以生物法固定于纖維素上。還公開了包括CRD和第二種感興趣的蛋白質(zhì)的融合產(chǎn)物，包括其制劑在多種方法中的應(yīng)用。這些融合蛋白質(zhì)具有包括應(yīng)用于分離、純化及診斷方法的多種有益應(yīng)用。
包括生物學(xué)活性蛋白質(zhì)在內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)的固定化在工業(yè)生產(chǎn)上是十分重要的。近年來已發(fā)展了多種固相化方法。然而，其中大多數(shù)方法都需要對(duì)固定基質(zhì)進(jìn)行修飾。一般說來，這些修飾都需要將配體共價(jià)結(jié)合到基質(zhì)上，如此在許多情況下導(dǎo)致配體活性的丟失，以及摻雜某些必須事先除掉后方將基質(zhì)用于藥品或食品加工中的有毒有機(jī)化合物。廣泛使用的產(chǎn)品的一個(gè)典型例子是蛋白A-Sepharose。這種十分昂貴的產(chǎn)品可以親合層析法純化IgG，以及用于診斷方法。
使用那些含有功能性區(qū)域(催化或其他功能)連同結(jié)合區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)是相對(duì)新的技術(shù)，但已證實(shí)作為蛋白質(zhì)純化方法是特別有用的。例如，設(shè)計(jì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)以表達(dá)融合到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶之C末端上的有用基因。該重組蛋白質(zhì)是使用谷胱甘肽-Sepharose柱以親和層析法純化的。
具有功能區(qū)域和結(jié)合區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)的另一個(gè)例子是蛋白A基因融合載體，可使用該融合載體在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞中高水平表達(dá)融合蛋白質(zhì)(B.Nilsson,et al.(1985)EMBO J.4(4):1075-1080)。蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)域提供了一種使用IgG-Sepharose柱迅速純化融合蛋白質(zhì)的方法。已發(fā)展基于在IPTG-Sepharose或金屬螯合層析柱上純化的β-半乳糖苷酶融合蛋白質(zhì)的或使用Ni-樹脂柱純化的組氨酸六聚體蛋白質(zhì)的相似系統(tǒng)。所有這些方法都要使用很貴的基質(zhì)，如Sepharose、丙烯酸樹脂小珠或玻璃珠，這些基質(zhì)都需要進(jìn)行高成本的化學(xué)修飾并且在許多情況下還要使用高毒性化合物。另一方面，纖維素則具有極好的物理性質(zhì)并且價(jià)格便宜，因而為蛋白質(zhì)固定化提供了一種很大應(yīng)用前途的固定基質(zhì)。
纖維素很適于用來固定一種用于處理果酒和果汁的酶，即內(nèi)切-β-糖苷酶(Shoseyov et al.,J.Agric.Food Chem.38:1387-1390(1990))。但固定化時(shí)需要對(duì)纖維素進(jìn)行化學(xué)修飾，并產(chǎn)生一種松軟易壓碎的，并且不適于裝柱應(yīng)用的材料。
可以在沒有借助化學(xué)修飾的情況下結(jié)合上某種配體的(即“生物固定化的”)纖維素，應(yīng)具有某些優(yōu)點(diǎn)，特別是所得到的固相基質(zhì)是天然的而且是無毒性的(沒有進(jìn)行“弄臟的化學(xué)修飾”)。其他優(yōu)點(diǎn)可能包括所得到的固相基質(zhì)保留了它的物理性質(zhì)，以及其相對(duì)低的價(jià)格。目前，纖維素價(jià)格比谷胱甘肽-Sepharose和IPTG-Sepharose低100-500倍，使得纖維素成為一種可以在食品和醫(yī)藥工業(yè)中安全使用的，具有吸引力的、低花費(fèi)的基質(zhì)材料。最近，Greenwood等人(FEBS Lett.224(1):127-131(1989))將糞纖維單孢(Cellulomonas fimi)內(nèi)切糖苷酶的纖維素結(jié)合區(qū)域融合到堿性磷酸酶上。重組融合蛋白質(zhì)保留了其磷酸酶活性和與纖維素結(jié)合的能力(另外參見Kilburn等人的美國專利No.5,137,819)。
但令人遺憾的是，糞纖維單孢(Cellulomnonas fimi)纖維素結(jié)合區(qū)域?qū)w維素只表現(xiàn)有相對(duì)低的親和力。例如，用加在0.5M NaCl中的50mM Tris-HCl(pH7.5)將洗掉30％以上的融合蛋白質(zhì)。糞纖維單孢(C.fimi)纖維素結(jié)合區(qū)域的第二個(gè)缺點(diǎn)是在纖維素纖維在結(jié)合到C.fimi結(jié)合區(qū)域上之后受到破壞(Din et al.,Bio/Technology 9:1096-1098(1991))。因此，即使C.fimi纖維素結(jié)合區(qū)域可能沒有表現(xiàn)出直接的纖維素酶活性，但對(duì)纖維素底物纖維的這種破壞作用(其相當(dāng)于固相基質(zhì)形態(tài)學(xué)的物理改變)同樣是有問題和不期望有的(參見下文第7.3節(jié)的討論)。
許多纖維素酶及其他水解酶，如殼多糖酶都對(duì)它們的底物具高的親和力(Shoseyov,et al。,PNAS,USA 87:2192-2195(1990)；Cahib,Methods Enzymol,161,pp.460-462(1988))。前已證明，結(jié)晶纖維素和纖維素酶之間的強(qiáng)有力結(jié)合與纖維素酶降解結(jié)晶纖維素的能力直接相關(guān)(Klyosov,Biochemistry 29:10577-10585(1990))，而強(qiáng)有力結(jié)合對(duì)于纖維素酶降解非晶態(tài)纖維素的能力則不是必要的。
Shoseyov等人(PNAS,USA 87:2192-2195(1990))報(bào)導(dǎo)了從溶纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)中純化了纖維素酶“復(fù)合物”。該纖維素酶“復(fù)合物”對(duì)結(jié)晶態(tài)纖維素及羧甲基纖維素表現(xiàn)有纖維素酶活性，并且是一種由幾個(gè)不同的多肽組成的大的蛋白質(zhì)復(fù)合物。已發(fā)現(xiàn)為了使催化酶分解結(jié)晶纖維素，必須有一個(gè)大的(約200kD)沒有明顯酶活性的主要纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)(CbpA)與催化酶一起參與。然而，為了酶促降解非晶態(tài)纖維素則不必有這種CbpA的參與。Shoseyov等人(PNAS,USA 89:3483-2487(1992))報(bào)導(dǎo)了CbpA基因的克隆和DNA序列測定，其中還描述了CbpA內(nèi)的4個(gè)分離的“推測的”纖維素結(jié)合區(qū)域。
在處于各種壓力條件下的原核和真核生物體中可誘導(dǎo)產(chǎn)生熱激蛋白(HSP)?；谄浞肿恿?，HSP被分成幾個(gè)同源蛋白質(zhì)家族。
在進(jìn)化期間保留了異常高水平的序列保守性的60kD HSP(hsp60)家族是用作自家免疫病中之潛在抗原的關(guān)注焦點(diǎn)(W.Van Eden(1991)Immunol.Rev.121:1；W.Van Eden,Thole R.Van der Zee,A.Noordzij,J.D.A.Van Einbden,E.J.Hensen and I.R.Cohen(1988)Nature 331:171；M.B.J.Billingham S.Carney,R.Bulter,and M.J.Colston(1990)J.Exp.Med.171:339)。
有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，對(duì)hsp60的反應(yīng)須受調(diào)節(jié)性T細(xì)胞控制。已有證據(jù)提示，T細(xì)胞反應(yīng)性至少部分地針對(duì)哺乳動(dòng)物內(nèi)源性HSP(B.Herman et al.,(1991)Eur.J.Immunol.21:2139)。
已經(jīng)克隆了來自許多不同種生物體，包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻瘋分枝桿菌(Microbacteriumleprae)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis BCG)、大腸桿菌(E.coli)、中國倉鼠及人細(xì)胞的hsp 60蛋白質(zhì)家族，并測定了它們的序列(V.Mera et al.,(1986)PNAS,USA 83:7013；S.Jindal et al.,(1989)Mol.Cell Biol.9:2279；O.J.Picketts et al.,(1989)J.Biol.Chem.264:12001；T.M.Shinnick(1987)J.Bacteriol.169:1080:T.M.Shinnick etal.,(1988)Infect.Immun.56:446:T.J.Venner and R.S.Gupta(1990)Nucl.Acids.Res.,18:5309)。
如下文所描述的，根據(jù)本發(fā)明，可將熱激蛋白(HSP)或其部分、抗HSP抗體或其部分用于CBD-融合體產(chǎn)物中。
對(duì)分枝桿菌和人hsp60的免疫反應(yīng)已牽涉到人和動(dòng)物模型中自家免疫性糖尿病的發(fā)生。
除了免疫優(yōu)勢抗原外，已顯示在各種系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的hsp60家族，在新合成的多肽鏈以及在許多情況下，它們組裝成的蛋白質(zhì)復(fù)合物的適當(dāng)折疊中執(zhí)行“分子伴侶蛋白”作用。(S.M.Memmingsen etal.,Nature 333:330:R.J.Ellis(1990)Sem,Cell Biol.,1:1-9)。
在小鼠胰島素依賴性糖尿病(IDDM)模型系統(tǒng)中-在胰島炎(insulibis)發(fā)作時(shí)可檢測到對(duì)hsp60抗原有反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞，并且很可能是這些T淋巴細(xì)胞也能識(shí)別β細(xì)胞hsp65交叉反應(yīng)性抗原(D.Elias et al.,(1990)Proc.Nat Acad.Sci.USA 87:1576-1580)。
因此，仍有必要發(fā)現(xiàn)一種對(duì)纖維素，特別是結(jié)晶態(tài)纖維表現(xiàn)有高的但可逆的親和性，而且即未顯示有纖維素酶活性又不能破壞結(jié)晶態(tài)纖維底物之纖維(即未表現(xiàn)有“非晶形發(fā)生”作用)的纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人在本文中描述了新的纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)蛋白質(zhì)的鑒定、分子克隆及其纖維索結(jié)合特性。另外，還公開了用于生產(chǎn)包含CBD及第二種有用蛋白質(zhì)之融合產(chǎn)物的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法。
本發(fā)明涉及到發(fā)現(xiàn)CBD能夠執(zhí)行不依賴于與之天然聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)或多肽的功能。此外，還不可預(yù)見地發(fā)現(xiàn)CBD對(duì)結(jié)晶纖維索和殼多糖具有高親和力，Kd值范圍約為1.5μM到0.5μM，較好約為1.4μM至0.8μM。具體地說，就各種結(jié)晶態(tài)纖維素樣品來說，CBD表現(xiàn)有大約1.2μM或較小的Kd值。CBD的其他特征是其真正地不具有纖維素酶活性，并且特別令人驚奇的是，CBD未表現(xiàn)有形態(tài)學(xué)改變特征(即沒有非晶形發(fā)生作用)。還發(fā)現(xiàn)包含CBD和第二種蛋白質(zhì)的CBD-融合體產(chǎn)物保留了CBD與纖維素的結(jié)合能力。
本發(fā)明還涉及到發(fā)現(xiàn)CBD能夠在寬pH范圍內(nèi)和不同的緩沖條件下不受限制地結(jié)合纖維素，大量的CBD與結(jié)晶態(tài)纖維素結(jié)合，并且接觸到水時(shí)沒有從纖維素上釋出CBD。形成明顯對(duì)照的是，主要CbpA蛋白質(zhì)以及來自C.fimi的結(jié)合區(qū)在暴露于水之后很容易從纖維素解離下來。為從纖維素上釋放掉CBD需要使之與6M鹽酸胍、6M尿素或非離子表面活性劑等變性溶液接觸。因此，CBD蛋白質(zhì)的功能和行為完全不依賴于在其與纖維素結(jié)合中與之天然聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供了一種分離的、能夠以高親和力結(jié)合纖維素，并且基本上不含與之天然聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，CBD蛋白質(zhì)包含

圖1中所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，CBD蛋白質(zhì)包含與圖1中公開的氨基酸序列至少有70％同源性，較好的有80％同源性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，期望核苷酸序列與圖1中所示的核苷酸序列至少有60％同源性，較好的有70-80％同源性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，CBD對(duì)纖維素具有高的親和性。本發(fā)明的CBD較好的有大約1.5μM或更小的Kd值，且最好的有大約1.0μM或更小的Kd值。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括能夠以高親和力結(jié)合纖維素的CBD蛋白質(zhì)及第二種蛋白質(zhì)的CBD融合蛋白質(zhì)，其中當(dāng)所說的CBD蛋白質(zhì)是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)時(shí)，所說的CBD蛋白質(zhì)基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，第二種蛋白質(zhì)是蛋白A。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第二種蛋白質(zhì)是HSP蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，與CBD融合的第二種蛋白質(zhì)可由兩個(gè)或多個(gè)多肽區(qū)組成。例如，CBD可與抗體或其功能部分的可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)融合。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了生產(chǎn)CBD或CBD融合產(chǎn)物的方法。一個(gè)可施用于單獨(dú)CBD或CBD融合產(chǎn)物，但在本文列舉來用于CBD融合產(chǎn)物的方法可包括下列步驟提供編碼CBD融合產(chǎn)物的核酸，其中所說的CBD融合產(chǎn)物包含CBD和第二種蛋白質(zhì)，所說的CBD能夠以高親和力結(jié)合纖維素或殼多糖并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)；用該核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或使用等同手段將該核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞以及在適合于表達(dá)CBD融合蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在上述方法中，第二種蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包含N末端氨基酸和C末端氨基酸。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中包括但不僅限于電穿孔、注射、氯化鈣沉淀及反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入等。再者，核酸可以是與宿主細(xì)胞的基因組整合的或未整合的。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了純化CBD融合產(chǎn)物的方法，其中包括使含有重組CBD融合產(chǎn)物的混合物在適于形成包含纖維素及重組體融合產(chǎn)物之不溶性結(jié)合復(fù)合物的條件下與有效量的纖維素接觸；從混合物中分離不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物；以及從纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物中回收CBD融合蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，純化本發(fā)明之CBD融合蛋白質(zhì)的方法進(jìn)一步包括提供編碼位于CBD融合產(chǎn)物之第二種蛋白質(zhì)的N末端氨基酸上游的裂解位點(diǎn)的核酸。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，純化CBD融合蛋白質(zhì)的方法還包括提供編碼CBD融合蛋白質(zhì)之第二種蛋白質(zhì)的C末端氨基酸下游裂解位點(diǎn)的核酸。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，純化本發(fā)明CBD融合蛋白質(zhì)的方法還包括提供編碼CBD融合蛋白質(zhì)之第二種蛋白質(zhì)的N末端氨基酸第一裂解位點(diǎn)上游和第二種蛋白質(zhì)之C末端氨基酸的第二裂解位點(diǎn)下游的核酸。
同樣，使包含CBD的混合物與有效量的纖維素接觸以純化CBD。分離所得到的不溶性CBD纖維素結(jié)合復(fù)合物，然后用釋放試劑處理該結(jié)合復(fù)合物以得到純化的CBD。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供編碼能夠以高親和力結(jié)合纖維素之CBD蛋白質(zhì)的并基本上不含天然與之聯(lián)系的其他核酸的分離的核酸。一種分離的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸可用作篩選與cbd基因有同源性之序列的cDNA或基因組文庫的探針。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明之CBD的核酸的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及檢測感興趣物質(zhì)的診斷藥盒，其包含(a)CBD融合產(chǎn)物，括(ⅰ)能夠以高親和力與纖維索結(jié)合并且基本上不含其他與之天然聯(lián)系的蛋白質(zhì)的CBD，和(ⅱ)能夠與感興趣的物質(zhì)結(jié)合的第二種蛋白質(zhì)；(b)可檢測的標(biāo)記；以及(c)纖維素。在這樣一個(gè)藥盒中可用殼多糖代替纖維素。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，CBD融合產(chǎn)物的第二種蛋白質(zhì)可以是蛋白A、HSP蛋白質(zhì)、HSP抗體、HSP相關(guān)蛋白質(zhì)、肽或其抗原性部分。術(shù)語“肽”包括由2-20個(gè)氨基酸組成的分子。上文所述診斷藥盒中的CBD融合產(chǎn)物還可包括與第二種蛋白質(zhì)親和結(jié)合的配體，該配體能夠結(jié)合感興趣的物質(zhì)。“，配體”是指能夠借助非共價(jià)方式與第二種分子結(jié)合的任何分子。例如，初級(jí)IgG可以親和結(jié)合到與CBD融合的蛋白A上。然后IgG即可用作特定蛋白質(zhì)、肽或激素的配體。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，公開了檢測是否存在感興趣之物質(zhì)的免疫檢鍘方法，該方法包括(a)將可能含有感興趣之物質(zhì)的試驗(yàn)樣品與足夠量的CBD融合產(chǎn)物一起保溫，所說的融合產(chǎn)物包括(ⅰ)能夠以高親和力與纖維素結(jié)合并基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD，及(ⅱ)能夠在允許感興趣的物質(zhì)與CBD融合產(chǎn)物中的第二種蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下結(jié)合感興趣之物質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)；(b)加入一定量的有效地與步驟(a)中所用的特定量CBD融合產(chǎn)物結(jié)合的纖維素，以得到不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物；(c)從未結(jié)合的成分中分離出不溶性的纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物；(d)將不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物與足夠量的可檢測標(biāo)記物一起保溫，其中所說的標(biāo)記物能夠與感興趣的待檢測物質(zhì)結(jié)合:以及(e)從未結(jié)合的成分中分離出步驟(d)的不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物并檢測是否存在可檢測標(biāo)記，以鑒定試驗(yàn)樣品中是否存在感興趣的待檢物質(zhì)。
還公開了另一種檢測試驗(yàn)樣品中待檢物質(zhì)的方法，該方法包括(a)使可能含有待檢物質(zhì)的試驗(yàn)樣品與能夠固定待檢物質(zhì)的不溶性基質(zhì)接觸；(b)將不溶性基質(zhì)與足夠量的CBD融合產(chǎn)物一起保溫，其中所說的融合產(chǎn)物包括(ⅰ)能夠以高親和力與纖維素結(jié)合并基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD，和(ⅱ)能夠在允許固定化的待檢物質(zhì)結(jié)合到CBD融合產(chǎn)物的第二種蛋白質(zhì)上的條件下結(jié)合固定化待檢物質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)；(c)從未結(jié)合的成分中分離出步驟(b)的不溶性基質(zhì)；(d)將步驟(c)的不溶性基質(zhì)與能夠在允許標(biāo)記物與感興趣的物質(zhì)或CBD融合產(chǎn)物結(jié)合的條件下，與感興趣的物質(zhì)或CBD融合產(chǎn)物結(jié)合的可檢測標(biāo)記物一起保溫；以及(e)從未被結(jié)合的成分中分離步驟(d)的不溶性基質(zhì)并檢測是否有標(biāo)記物存在，以提供試驗(yàn)樣品中是否存在感興趣的待檢物質(zhì)的指征。
該方法還可包括(ⅰ)在允許纖維素與CBD融合產(chǎn)物結(jié)合以形成纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物的條件下，使步驟(c)的不溶性基質(zhì)與足夠量的纖維素接觸，及(ⅱ)從包括未結(jié)合的纖維素在內(nèi)的未被結(jié)合的成分中分離出步驟(ⅰ)的不溶性基質(zhì)。該方法可使用一種能夠結(jié)合感興趣的物質(zhì)或纖維素-CBD融合蛋白質(zhì)結(jié)合復(fù)合物，特別是纖維素-CBD融合蛋白質(zhì)結(jié)合復(fù)合物中之纖維素的標(biāo)記物。試驗(yàn)樣品可以是體液，其中包括但不只限于血液、尿液、精液、唾液、粘液、淚液、陰道分泌物等等。通常可用殼多糖代替纖維素。另外，不溶性基質(zhì)可以是電泳凝膠印跡。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)了檢測蛋白質(zhì)或肽的方法因此，CBD融合產(chǎn)物的第二種蛋白質(zhì)可以是抗該蛋白質(zhì)或肽的抗體。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體?；蛘?，本發(fā)明的CBD可以直接或通過接頭部分連接到感興趣的抗體上。
感興趣的待檢物質(zhì)還可包括與蛋白質(zhì)、肽、激素、核酸結(jié)合的生物素化的探針或其他可用作靶的探針的分子。在這種情況下，優(yōu)選的第二種蛋白質(zhì)是鏈霉抗生物素蛋白。當(dāng)標(biāo)記物包括酶時(shí)，該方法還包括加入足夠量的酶底物，其中所說的底物被酶轉(zhuǎn)化成可檢測的化合物。
可以以競爭方式進(jìn)行檢測。因此，可以改動(dòng)上述方法，以便通過將不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物與足夠置的包括被標(biāo)記之感興趣物質(zhì)的可檢測標(biāo)記物一起保溫來完成步驟(d)，其中標(biāo)記物能夠與未結(jié)合到感興趣之物質(zhì)上的CBD融合產(chǎn)物中的任何第二種蛋白質(zhì)結(jié)合；并且通過從未結(jié)合的成分中分離步驟(d)的不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物，并將由試驗(yàn)樣品測得的信號(hào)與由對(duì)照樣品測得的信號(hào)相比較來完成步驟(e)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在蘸液棒(dip stick)中包含CBD融合產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的目的還包括提供用于檢測包含CBD融合產(chǎn)物之試驗(yàn)樣品中感興趣物質(zhì)的蘸液棒，其中CBD融合產(chǎn)物包括有(ⅰ)能夠以高親和力與纖維素結(jié)合并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD，和(ⅱ)能夠與感興趣的物質(zhì)結(jié)合的第二種蛋白質(zhì)。第二種蛋白質(zhì)較好選自蛋白A、HSP蛋白質(zhì)、HSP抗體、交叉反應(yīng)性HSP相關(guān)蛋白質(zhì)或肽或其抗原部分、酶、激素、抗原及抗體。
同樣，本發(fā)明的目的還包括提供信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，該系統(tǒng)中包含(a)第一種CBD融合產(chǎn)物，包括(ⅰ)能夠以高親和力與纖維素結(jié)合并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD，和(ⅱ)能夠與可進(jìn)一步結(jié)合感興趣之物質(zhì)的嵌合探針結(jié)合的第二種蛋白質(zhì)；以及(b)第二種CBD融合產(chǎn)物，包括(ⅰ)能夠以高親和力與纖維素結(jié)合并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD，和(ⅱ)能夠作用于一種底物以產(chǎn)生可檢測化合物的酶。
在另一實(shí)施方案中，提供了包括下列組分的信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)(a)一種CBD融合產(chǎn)物，包括(ⅰ)能夠以高親和力與纖維素結(jié)合并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD，和(ⅱ)能夠與可進(jìn)一步結(jié)合感興趣之物質(zhì)的嵌合探針結(jié)合的第二種蛋白質(zhì)；以及(b)被標(biāo)記的CBD，該CBD保留了其以高親和力與纖維素結(jié)合的能力，并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)。
這些信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)可包含嵌合體探針，并且還可包含纖維素基質(zhì)，較好的是礫石研磨的纖維索。
這些信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)可以包括設(shè)計(jì)用來鑒定細(xì)胞或組織中核酸的系統(tǒng)，和設(shè)計(jì)利用缺失序列的寡核苷酸指導(dǎo)的熱循環(huán)DNA擴(kuò)增方法在每個(gè)方向上延伸被鑒定之核酸的長度的系統(tǒng)，其中可聯(lián)合使用DNA特異性引物和簡并的、載體特異性的、或oligo-dT結(jié)合的第二個(gè)寡核苷酸來引導(dǎo)特異性序列合成。
最后，本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供包括與藥物結(jié)合之CBD的藥物釋放系統(tǒng)，其中CBD保留其以高親和力與纖維素結(jié)合的能力，并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)。在這樣一個(gè)藥物釋放系統(tǒng)中，藥物直接或通過接頭部分連接到CBD上。已有許多連接方法并且是本領(lǐng)域中已知的。例如，可使用已有的環(huán)己碳二酰亞胺等酰基活化劑以形成酰胺或酯鍵。因此，具有氨基或羥基等親核基團(tuán)的藥物可以連接到CBD的羧基末端上。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種藥物釋放系統(tǒng)可以是緩慢的或持久的藥物釋放系統(tǒng)，其中感興趣的藥物從結(jié)合到纖維素上的CBD上被緩慢釋放。
在一個(gè)實(shí)施方案中，被釋放的藥物是抗真菌劑。優(yōu)選的藥劑包括但不僅限于兩性霉素B、制霉菌素和十一碳烯酸。藥物通常可以是一種咪唑，如克霉唑(Clotrimazole)?？善谕麑⑦@一藥物釋放系統(tǒng)摻入可經(jīng)非胃腸道、口服、局部或吸入給藥的組合物中。具體地說，給藥途徑包括但不只限于鼻內(nèi)、眼內(nèi)或陰道內(nèi)給藥。此外，該制劑可以是固體、凝膠、液體或氣霧劑。
本文所描述的藥物釋放系統(tǒng)適用于釋放藥物對(duì)抗感染或致病因子，如對(duì)細(xì)胞膜中含有纖維素或殼多糖物質(zhì)的酵母或真菌，這些因子包括但不只限于煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、念珠菌屬(Candida)或叢梗孢屬(Monilia)的成員，或表皮細(xì)胞。使用本發(fā)明的藥物釋放系統(tǒng)，預(yù)期將大大減少為有效地治療疾病或感染所需要的劑量，從而改善這些通常也相當(dāng)有毒性的抗真菌或抗霉菌藥物的使用效果。因希望使藥物的副作用減到最小或消除副作用。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及CBD改變植物組織生長的能力。這種能力可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中，例如可望用于促進(jìn)花粉管生長和/或根生長。另外，因?yàn)楦邼舛鹊腃BD具有抑制根生長的能力，故其可用于阻止不希望有的植物，例如“雜草”植物的發(fā)育。在另一實(shí)施例中，CBD被應(yīng)用于促進(jìn)真菌如蘑菇的生長，其中CBD結(jié)合于殼多糖上并刺激發(fā)育中的擔(dān)子果或子實(shí)體的生長和/或發(fā)育。
本發(fā)明的再一個(gè)方面涉及CBD與昆蟲外骨骼及其他昆蟲部位包括中腸的殼多糖結(jié)合的能力。CBD的這種能力適于將其用作生物殺害蟲劑，其中CBD連接到用于防治害蟲的微生物，如蘇云金芽孢桿菌(BT)或表達(dá)BT毒素基因的其他微生物，或分泌殼多糖酶的微生物或真菌上。CBD使微生物結(jié)合到昆蟲的殼多糖部分上，其中微生物產(chǎn)生的毒素或酶導(dǎo)致害蟲死亡。表現(xiàn)有殼多糖酶活性的微生物包括腸細(xì)菌和鏈霉菌屬的細(xì)菌菌株，以及曲霉、青霉和木霉等屬的真菌菌株。在本發(fā)明該實(shí)施方案的一種形式中，可將CBD-微生物復(fù)合體直接施用可疑受害蟲感染或有被感染危險(xiǎn)的植物部分，或者也可將CBD-微生物復(fù)合體固定于設(shè)在被感染田地中的餌站上或被害蟲侵害的植物上。在本發(fā)明該實(shí)施方案的另一形式中，將CBD-微生物復(fù)合體施用于林木或含纖維素的產(chǎn)品上，以防止或防治由破壞木材的害蟲引起的感染。例如，將CBD-微生物復(fù)合體施用于電話線桿和木材或含纖維素的建筑構(gòu)件上，其中CBD成分緊密地結(jié)合到侵入的昆蟲上，復(fù)合體中的微生物則可有效地防治害蟲。
本發(fā)明再一個(gè)方面涉及CBD與真菌包括適用于生物除污或降解毒性環(huán)境污染物的真菌中的殼多糖結(jié)合的能力。根據(jù)該實(shí)施方案的一種形式，使用其中第二種成分是降解環(huán)境污染物的酶的CBD融合蛋白質(zhì)?？蓪BD-酶融合蛋白質(zhì)固定在纖維索底物上并用此工具經(jīng)酶促降解作用除去環(huán)境中的污染物，例如可將此工具放在地表或地下水的水流中。根據(jù)本發(fā)明該實(shí)施方案的另一個(gè)可代用的實(shí)施方式，CBD被結(jié)合到能產(chǎn)生生物除污的酶的真菌上，即用真菌分泌的酶降解環(huán)境污染物如殺害蟲劑。然后將CBD-真菌復(fù)合體固定在纖維素底物上，并提供適用于酶促降解環(huán)境污染物(如包括DDT在內(nèi)的殺害蟲劑，或伐木或鋸不操作余留下的含木材產(chǎn)物)的工具。在一個(gè)舉例說明性實(shí)施例中，CBD與白色腐敗真菌如黃孢展齒草菌(Phanerochaebe chrysosporium)復(fù)合在一起，借以產(chǎn)生木素過氧化物酶、錳過氧化物酶并降解殺害蟲劑DDT。CBD-真菌復(fù)合體適用于生物除污，例如從環(huán)境中除去DDT等殺害蟲劑。
圖1A-1B核苷酸(上行，原鏈；第二行，互補(bǔ)鏈)和推測的CBD的氨基酸序列。
圖2A-2C編碼CBD之基因片段的制備和克隆。
2A．對(duì)CbpA之一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，其含有N末端信號(hào)肽，獨(dú)特的CBD區(qū)，4個(gè)親水重復(fù)序列(白色箭頭)和9個(gè)疏水重復(fù)段(黑色箭頭)。
2B．沿著CbpA基因安排的PCR引物。為清楚起見其中包括了CBD翼區(qū)的引物序列和CbpA DNA序列。PCR產(chǎn)物包含NcoⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)(劃下線部分)。還注明基因片段的ATG起始密碼子位于NcoⅠ位點(diǎn)內(nèi)，并且TAG終止密碼子與BamHⅠ位點(diǎn)相鄰接。
C．圖解說明含有克隆到pET-8c載體中之CBD基因片段的pET-CBD。載體含有為可誘導(dǎo)性CBD產(chǎn)生的必要的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯信號(hào)。
圖3CBD蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化圖中各泳道分別顯示加在15％丙烯酰胺凝膠中的攜帶pET-8c之細(xì)胞的全細(xì)胞蛋白質(zhì)(泳道2)、攜帶pET-CBD之細(xì)胞的全細(xì)胞蛋白質(zhì)(泳道3)、溶胞的pET-CBD細(xì)胞的胞質(zhì)部分(泳道4)、溶胞的pET-CBD細(xì)胞的鹽酸胍溶解的膜/包涵體部分(泳道5)、Avicel_沉淀物的最后的PC緩沖液洗出液(泳道6)、以及純化的CBD蛋白質(zhì)(泳道7)。各泳道均以各部分的0.005％總蛋白質(zhì)上樣，但泳道6使用高出10倍的蛋白質(zhì)濃度。預(yù)染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(泳道1,8)具有大約2.6、5、12.7、18.1、29和44kDa的遷移率。
圖4CBD-Avicel_結(jié)合的時(shí)間過程。按下文第7部分中所述方法平衡CBD(2.0μmol總蛋白質(zhì))和Avicel_(1mg/ml)，不同的是使用較大的總體積以提供在不同時(shí)間點(diǎn)上取出的樣品。按第7部分中所述方法洗各時(shí)間點(diǎn)的樣品并進(jìn)行檢測。還參見下文表Ⅰ或圖9。
圖5CBD與Avicel_結(jié)合的雙倒數(shù)圖。黑方塊代表0.5mgAvicel_(B)，黑圓圈代表1mg Avicel_(J)、黑三角代表2mg(H)。插入圖PCmax對(duì)所使用的Avicel_的量。檢測值為1.0ml。
圖6CBD與Avicel_結(jié)合的Scatchard作圖。圖示3種不同量Avicel_時(shí)[PC]/[P]對(duì)PC的作圖。[PC]/[P]表示的無量綱比例，[PC]以μM為單位表示。黑圓圈代表1mgAvicel_，空?qǐng)A圈代表2mg Avicel_，黑方塊代表3mg。
圖7CBD結(jié)合Cellulon_的雙倒數(shù)圖。保溫混合物含有每ml0.5mg Cellulon_。
圖8CBD-蛋白A融合蛋白質(zhì)與纖維素及IgG結(jié)合。1M乙酸選擇性地釋放CBD-蛋白A:IgG“鍵合”，但不是CBD-蛋白A纖維素“鍵合”。
圖9CBD蛋白質(zhì)對(duì)非水溶性底物的吸附作用。
圖10CBD的過表達(dá)和純化。
圖11圖解說明信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，其中標(biāo)記的CBD-檢測結(jié)合了CBD融合產(chǎn)物的纖維素或殼多糖。感興趣的物被結(jié)合，其本身又與嵌合探針結(jié)合。
圖12圖解顯示其中感興趣的物質(zhì)結(jié)合到三元CBD融合產(chǎn)物CBD-蛋白A(IgG)上的信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)。
圖13如根據(jù)凝膠電泳檢測樣品所證明的用CBD-蛋白A-纖維素純化IgG。泳道a是人血請(qǐng)。泳道b是不與CBD-蛋白A-纖維素結(jié)合的人血清蛋白質(zhì)。泳道c是IgG已結(jié)合到蛋白A上之后，顯示未被結(jié)合之蛋白質(zhì)的樣品的第-PBS洗出液。泳道d是經(jīng)用乙酸洗而回收的IgG部分。
圖14A和14B證明CBD處理的纖維素纖維仍保持完整，即CBD沒有纖維索破壞非晶形發(fā)生活性。圖14A顯示用CBD處理的棉纖維。圖14B顯示未被處理的棉纖維(對(duì)照)。
圖15證明pH和NaCl濃度對(duì)CBD-蛋白A結(jié)合纖維素之能力的影響。
圖16證明CBD與黑曲霉的結(jié)合。泳道a是加有CBD的黑曲霉。泳道b是沒有CBD的黑曲霉(對(duì)照)。泳道c是單一CBD。
圖17證明CBD與Spodoptera Littoralis的結(jié)合。泳道a是沒有CBD的Spodoptera Littoralis的中腸膜(對(duì)照)。泳道b是加有CBD的Spodoptera Littoralis的中腸膜。
圖18證明CBD與Heliothis armigera的結(jié)合。泳道a是沒有CBD的Heliothis armigera的中腸膜(對(duì)照)。泳道b是加有CBD的Heliothis armigera的中腸膜。
圖19證明CBD和BSA(作為對(duì)照)對(duì)花粉管生長的影響。
圖20證明CBD對(duì)用白色熒光增亮劑(calcofluor)染色的花粉管之晶細(xì)胞壁成分的影響。圖20A顯示如根據(jù)在頂端區(qū)帶上沒有亮顏色所表明的，CBD處理的花粉管產(chǎn)生了非結(jié)晶花粉管頂端。圖20B顯示如根據(jù)亮顏色所表明的，對(duì)照花粉管頂端含有較多的結(jié)晶細(xì)胞壁成分。
圖21A和21B證明對(duì)CBD處理的花粉管的金免疫標(biāo)記。圖21A證明在用CBD處理的花粉中，如由頂端區(qū)帶上的強(qiáng)暗點(diǎn)所表明的，金標(biāo)記是沿著花粉管但優(yōu)選出現(xiàn)在頂端區(qū)帶。圖21B顯示對(duì)照組即沒有經(jīng)CBD處理的花粉。
圖22證明CBD對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)籽苗的根生長的影響。不同的字母標(biāo)出根長度值間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P≤0.05)。
圖23證明CBD處理的擬南芥(Arabidopsis thaliana)籽苗的金免疫標(biāo)記。該圖顯示金標(biāo)記限于根部而莖干則未顯示標(biāo)記。
圖24證明白色熒光增亮劑(calcofluor)對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)籽苗的著染情況。該圖證明只有根部著染，表明其易接近纖維素。
本發(fā)明涉及鑒定能夠以高親和力和可逆方式與纖維素結(jié)合的纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)蛋白質(zhì)。本發(fā)明的CBD例如可用于生物活性分子在纖維素上的生物法固定化。本發(fā)明的CBD可與第二種蛋白質(zhì)融合以形成CBD融合蛋白質(zhì)。CBD融合蛋白質(zhì)中存在CBD蛋白質(zhì)可經(jīng)與纖維素保溫而容易地和選擇性地純化CBD融合蛋白質(zhì)。第二種蛋白質(zhì)的例子包括A蛋白、G蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、Taq聚合酶和其他聚合酶、堿性磷酸酶、核糖核酸酶(RNase)、脫氧核糖核酸酶(DNase)、各種限制性酶、過氧化物酶、葡聚糖酶如內(nèi)-1,4-β-葡聚糖酶、內(nèi)-1,3-β-葡聚糖酶、殼多糖酶、以及β和α葡糖苷酶、β和α-glucoronidase、淀粉酶、轉(zhuǎn)移酶如葡糖基轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、氯霉素-乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-內(nèi)酰胺酶及其他抗生素修飾和降解酶、蟲熒光素酶、酯酶、脂酶、蛋白酶、細(xì)菌素、抗生素、酶抑制劑、不同的生長因子、激素、受體、膜蛋白質(zhì)、核蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯因子及核酸修飾酶。特別是CBD可與抗體或抗原因子融合，以形成用于診斷藥盒和免疫檢測的CBD融合產(chǎn)物。
因此，例如可利用CBD和BSP抗原因子檢驗(yàn)體液中是否存在特定抗體(如熱激蛋白(HSP)抗體)。相反，可使用CBD-HSP抗體融合蛋白質(zhì)檢測HSP蛋白質(zhì)、交叉反應(yīng)性HSP相關(guān)蛋白質(zhì)或其抗原性蛋白質(zhì)。
術(shù)語“CBD”或“CBD蛋白質(zhì)”或“纖維素結(jié)合區(qū)域蛋白質(zhì)”是指含有圖1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并包括其功能性同系物及功能性衍生物，條件是功能性同系物或功能性衍生物具有以高親和力和可逆方式與纖維素結(jié)合的能力。本發(fā)明的CBD基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)，例如上文討論的主要CbpA蛋白質(zhì)的剩余部分。另外，例如可以取代、插入或刪除多肽中的一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的氨基酸殘基，借以產(chǎn)生具有改善了生物學(xué)性質(zhì)的CBD，或使之達(dá)到不同的結(jié)合和表達(dá)水平。某些落入本發(fā)明范圍內(nèi)的所需CBD蛋白質(zhì)可以具有對(duì)天然產(chǎn)生之分子的共價(jià)或非共價(jià)修飾，其中包括但不只限于糖基化修飾?？赏ㄟ^使用重組DNA技術(shù)，經(jīng)改變其編碼核酸制備具有殘基缺失、取代和/或插入的本發(fā)明的CBD蛋白質(zhì)?？稍诰幋a本發(fā)明CBD的DNA水平上的修飾和突變不一定改變閱讀框架，并且最好不會(huì)造成將產(chǎn)生次級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)(參見歐洲專利公開No.EP75,444)。
本發(fā)明的CBD蛋白質(zhì)與圖1中所示的氨基酸序列至少有70％同源性，較好有80％同源性，更好有至少90％同源性，且最好有至少95％同源性。術(shù)語“X％同源性”不是只限于在蛋白質(zhì)的整個(gè)長度范圍內(nèi)有X％同源性的序列。70％同源性還包括在圖1所示CBD蛋白質(zhì)內(nèi)的已鑒定的功能性區(qū)域中出現(xiàn)的X％同源性。功能性區(qū)域的例子可以是限定的一組具有以高親和力和以可逆方式結(jié)合纖維素之能力的氨基酸。這種蛋白質(zhì)同系物在本文中也稱為“CBD功能性同系物”。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這種功能區(qū)域可以有大約100個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，這種功能區(qū)域可以有大約50個(gè)氨基酸。本發(fā)明的最理想的CBD蛋白質(zhì)是由圖1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“CBD功能衍生物”在本文中是指圖1所示CBD蛋白質(zhì)氨基酸序列的任何“片段”、“變異性”、“類似物”、或“化學(xué)衍生物”，其保留了以高親和力和以可逆方式與纖維素結(jié)合的能力，并且其較好長度在大約2至160個(gè)氨基酸之間，更好在大約25至125個(gè)氨基酸之間，最好在大約50至100個(gè)氨基酸之間。
術(shù)語“片段”是指由圖1所示CBD蛋白質(zhì)衍生的，并且具有天然存在之序列的CBD蛋白質(zhì)?？山?jīng)蛋白水解性裂解全長度蛋白質(zhì)而產(chǎn)生這樣的片段?；蛘?，可經(jīng)適當(dāng)?shù)匦揎椌幋aCBD蛋白質(zhì)的DNA序列，以在天然序列的C末端、N末端、及序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸而重組產(chǎn)生所說的片段。可根據(jù)其以高親和力和以可逆方式結(jié)合纖維素的能力，確定功能性衍生物的同一性或?qū)嵱眯?，以篩選CBD蛋白質(zhì)的片段。
術(shù)語“變異體”在本文中是指其中天然分子的氨基酸序列、糖基化方式或其他特征已受到共價(jià)或非共價(jià)修飾的分子，并傾向子包括突變體。有些落入本發(fā)明范圍內(nèi)的變異體具有氨基酸取代、缺失和/或插入，條件是最后的構(gòu)建體具有以高親和力和以可逆方式結(jié)合纖維素的所需能力?？苫谒婕爸畾埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性物質(zhì)的相似性進(jìn)行CBD蛋白質(zhì)中的氨基酸取代。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；有不帶電荷的極性中心集團(tuán)或具相似親水性數(shù)值之非極性關(guān)鍵基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。在變異體的定義內(nèi)還包括在N末端、C末端及天然CBD序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上具有附加氨基酸的那些蛋白質(zhì)，條件是這些變異體保留有以高親和力和以可逆方式結(jié)合纖維素的能力。
術(shù)語“化學(xué)衍生物”在本文中是指經(jīng)化學(xué)修飾天然存在的CBD蛋白質(zhì)或其變異體而產(chǎn)生的CBD蛋白質(zhì)。舉例說明的化學(xué)修飾的例子應(yīng)是由烷基、?；虬被鶊F(tuán)替代H的。
短語“以高親和力結(jié)合纖維素”在本文中是指CBD蛋白質(zhì)結(jié)合纖維素的能力，其以μM為單位的Kd值范圍為大約1.5至0.5，較好大約1.4至0.8。更優(yōu)選的是，高親和力結(jié)合是指現(xiàn)成CBD以大約1.1或更小，最好以大約1.0或更小的Kd值結(jié)合結(jié)晶態(tài)纖維素的能力。
短語“以可逆方式結(jié)合纖維素”在本文中是指借助釋放劑或溶液，如6M尿素、6M鹽酸胍及包括非離子表面活性劑在內(nèi)的其他變性試劑從纖維素一CBD蛋白質(zhì)結(jié)合復(fù)合物上釋放CBD蛋白質(zhì)的能力。但最好使用那些允許被釋放的CBD或融合產(chǎn)物將得以重新構(gòu)成的變性試劑。例如，可使變性的蛋白質(zhì)經(jīng)受如下文6、1、4、7、1、1、7、2.1和8、1.4節(jié)中所述復(fù)性條件，從用6 M尿素或6 M鹽酸胍處理得到的材料重新構(gòu)成CBD。
本文所用的術(shù)語“CBD融合蛋白質(zhì)”是指將至少兩種蛋白質(zhì)，即CBD蛋白質(zhì)和第二種蛋白質(zhì)連接在一起。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，第二種蛋白質(zhì)的例子包括酶，如核酸修飾酶、蛋白酶、激素或激素前體，多肽，肽，抗體，抗原，抗原決定基和其變異體。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，第二種蛋白質(zhì)是蛋白A在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，第二種蛋白質(zhì)是HSP蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是由CBD蛋白質(zhì)、蛋白A或抗HSP重組IgG組成的融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的CBD融合蛋白質(zhì)可包含酶促或化學(xué)裂解位點(diǎn)上游并最好與第二種蛋白質(zhì)的N末端相鄰，和/或酶促或化學(xué)裂解位點(diǎn)下游并最好與第二種蛋白質(zhì)的C末端相鄰，從而為使用裂解試劑從CBD融合蛋白質(zhì)中回收第二種蛋白質(zhì)提供手段。
本文所使用的術(shù)語“CBD融合蛋白質(zhì)-纖維素結(jié)合復(fù)合物”是指當(dāng)纖維素結(jié)合CBD融合蛋白質(zhì)中的CBD蛋白質(zhì)時(shí)所形成的復(fù)合物。
“核酸”是指含有在5＇至3′方向以磷酸二酯鍵連接的一系列核酸的，可以是RNA或DNA序列的核苷酸序列。如果核酸是DNA，核苷酸序列是單股或雙股的。編碼CBD蛋白質(zhì)的核酸是編碼能夠以高親和力結(jié)合纖維素之CBD蛋白質(zhì)的，是與編碼這種CBD蛋白質(zhì)的核酸序列互補(bǔ)的，或與編碼這種CBD蛋白質(zhì)的核酸序列雜交的，并在嚴(yán)格條件下仍與其穩(wěn)定結(jié)合的RNA或DNA。
短語“編碼本發(fā)明CBD蛋白質(zhì)的核酸”包括根據(jù)其來源或操作，與天然與之聯(lián)系的任何多核苷酸部分無關(guān)的，并且可以與天然與之連接的多核苷酸以外的多核苷酸連接的基因組，cDNA的核酸，以及合成和半合成來源的核酸，并且包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物或其組合的單股或雙股聚合物，只要其所編碼的CBD保留其以高親和力結(jié)合纖維素的能力即可。該短語還包括本領(lǐng)域中已知的各種不同的修飾，其中包括但不只限于放射活性和化學(xué)標(biāo)記、甲基化、加帽、棱苷酸內(nèi)修飾如經(jīng)帶電荷鍵合(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和不帶電荷的鍵合(如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、carbamites等)的修飾，以及含有側(cè)接部分、嵌入都分、螯合體等的修飾，條件是由核酸編碼的CBD保留有以高親和力和以可逆方式結(jié)合纖維素的能力。
可使用編碼CBD的核酸構(gòu)建能夠表達(dá)本發(fā)明之CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)的重組表達(dá)載體。如果一個(gè)核酸構(gòu)建體含有包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信息的核苷酸序列并且該序列被“可操作地連接”到核苷酸編碼序列上，則它就能夠表達(dá)某種蛋白質(zhì)?！翱刹僮鞯剡B接”是指一種鍵合，其中調(diào)節(jié)DNA序列和待表達(dá)的DNA序列以一種允許轉(zhuǎn)錄和最終轉(zhuǎn)錄的方式相連接。
在構(gòu)建CBD融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，編碼CBD蛋白質(zhì)的棱酸將被連接到編碼第二種蛋白質(zhì)的核酸上，從而使CBD蛋白質(zhì)和第二種蛋白質(zhì)的開放閱讀框架保持完整，以允許轉(zhuǎn)譯CBD融合蛋白質(zhì)?？蓮母鞣N產(chǎn)生纖維素結(jié)合區(qū)域的或產(chǎn)生CBD編碼mRNA的細(xì)胞來源得到CBD核酸，其中所說的結(jié)合區(qū)域能夠以高親和力并以可逆方式與纖維素結(jié)合。CBD編碼核酸的優(yōu)選來源是溶纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)?？砂?.1節(jié)中所述方法制得編碼CBD的核酸。
可從分離的和純化的細(xì)胞來源的DNA制得，或經(jīng)基因組克隆制得本發(fā)明的編碼CBD蛋白質(zhì)的核酸。可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備克隆的cDNA或基因組庫，并可用基本上互補(bǔ)于基因之任何部分的核苷酸探針篩選特定的CBD編碼核酸。如果期望檢測編碼CBD蛋白質(zhì)的保守的核苷酸區(qū)，核苷酸探針應(yīng)是基于種間保守的CBD核苷酸序列的。如想要檢測編碼CBD蛋白質(zhì)的獨(dú)特的核營酸區(qū)，核苷酸探針應(yīng)是基于獨(dú)特的CBD棱苷酸序列的。或者，也可使用cDNA或基因組DNA作為以適應(yīng)的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR克隆的模板?？梢院Y選用于構(gòu)建表達(dá)載體的全長克隆，即含有所需CBD蛋白質(zhì)之整個(gè)編碼區(qū)的克隆，或者可將交迭c(diǎn)DNA連接在一起以形成完整的編碼序列。另外，也可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，經(jīng)化學(xué)合成法整個(gè)地或部分地合成編碼CBD的DNA序列。
有許多載體均可利用，并可以依據(jù)下述幾個(gè)因素來選擇適當(dāng)?shù)妮d體1)它是用于核酸擴(kuò)增還是核酸表達(dá)，2)將被插入載體中的核酸的大小，以及3)將被載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞屬于何種細(xì)胞。每種載體都依據(jù)其功能(擴(kuò)增核酸或表達(dá)核酸)及與其宿主細(xì)胞的相容性而含有不同的組分。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指能夠在培養(yǎng)物中生長并能夠表達(dá)CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括體外培養(yǎng)物中的細(xì)胞并包括原核、真核、及昆蟲細(xì)胞?？梢赃x擇那些調(diào)節(jié)被插入之序列表達(dá)的，或以所期望的特殊方式修飾與加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株?？稍谀承┱T導(dǎo)劑(如用于金屬硫蛋白啟動(dòng)子的鋅和鎘離子)提高某些啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。因此可以控制CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。如果CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞是致死性的，則控制表達(dá)的能力將是很重要的。修飾和加工蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)于蛋白質(zhì)的功能來說是很重要的。不同的宿主細(xì)胞都具有其特征性或特異性轉(zhuǎn)譯后加工與修飾蛋白質(zhì)的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以保證正確修飾和加工所表達(dá)的CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞應(yīng)分泌最小量的蛋白水解酶。
在本發(fā)明中，所提供的宿主細(xì)胞含有編碼能夠以高親和力結(jié)合纖維素之本發(fā)明CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)的核酸。優(yōu)選的用于克隆和表達(dá)本發(fā)明CBD蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。原核細(xì)胞特別適用于迅速產(chǎn)生大量核酸、產(chǎn)生用于位點(diǎn)特異性誘變的單股核酸模板、同時(shí)篩選許多突變體、以及測定所產(chǎn)生之突變體的核酸序列。用于克隆和表達(dá)本發(fā)明CBD蛋白質(zhì)的原核細(xì)胞的例子是由Stratagene提供的大腸桿菌XL1-蘭菌株。用于克隆和表達(dá)CBD融合蛋白質(zhì)的原核細(xì)胞的另一個(gè)例子是金黃色葡萄球菌。用于克隆和表達(dá)CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)的系統(tǒng)的再一個(gè)例子是Invitrogen Corporation(San Diego,CA)的畢赤酵母(Pichia)表達(dá)試劑盒。
為了重組表達(dá)CBD蛋白質(zhì)及CBD融合蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以同樣有效地利用各種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括但不只限于微生物，如用包含所需CBD編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘性質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用包含所需CBD編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母用包含所需CBD編碼序列的重組病毒表達(dá)裁體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用包含所需CBD編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如花柳菜花葉病毒CaMV，煙草花葉病毒TMV)感染的，或用包含所需CBD編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或用重組病毒表達(dá)系統(tǒng)(如腺病毒、牛痘病毒)感染的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，其中包括經(jīng)基因工程處理而含有穩(wěn)定擴(kuò)增之CBD核酸的多拷貝的細(xì)胞系(如CHO/dnfr,CHO/谷氨酰胺合成酶)或含有在雙小片染色體中未穩(wěn)定擴(kuò)增之CBD核酸之多拷貝的細(xì)胞系(如小鼠細(xì)胞系)。
載體成分一般包括但不只限于下列的一個(gè)或多個(gè)成分信號(hào)序列、復(fù)制原點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄終止序列。這些載體的表達(dá)元件在其長度和特異性上均有所不同。依據(jù)所利用的宿主/載體系統(tǒng),可以使用任何一種適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯元件。例如，當(dāng)在原核細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用從原核細(xì)胞的基因組中分離的啟動(dòng)子(如細(xì)菌色氨酸啟動(dòng)子)。也可以使用以重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)被插入之序列的轉(zhuǎn)錄。
信號(hào)序列可以是載體的成分，或者可以是被插入載體中之CBD核酸的一部分。信號(hào)序列可以是CBD序列前面的天然存在的序列，或是非天然存在的序列。信號(hào)序列應(yīng)是由宿主細(xì)胞識(shí)別并加工的。復(fù)制原點(diǎn)是指宿主生物體的復(fù)制起始的獨(dú)特位點(diǎn)。期望克隆和表達(dá)載體包含有選擇基因，也稱為可選擇標(biāo)志。該基因編碼被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中存活或生長所必需的蛋白質(zhì)。沒有被含有選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不能在此培養(yǎng)基中存活。典型的選擇基因編碼賦予抗生素或其他毒素抗性的蛋白質(zhì)，例如抗氫芐青霉素、補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷型缺陷或提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基中得到的重要營養(yǎng)素。選擇方案的一個(gè)例子是利用某種藥物阻止宿主細(xì)胞的生長。這些被異源基因成功地轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可表達(dá)賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，并因此能經(jīng)受得住此選擇體系。
表達(dá)和克隆載體通常含有可被宿主生物體識(shí)別的并且被可操作地連接到編碼有用多肽之核酸上的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游(5′)的非轉(zhuǎn)譯的序列(通常在大約100至l000bp范圍內(nèi))，其可控制與之可操作地連接的特定核酸序列,如編碼CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)之核酸序列的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯。這樣的啟動(dòng)子一般分為兩類，即可誘導(dǎo)的和結(jié)構(gòu)性的?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子是在對(duì)某些培養(yǎng)條件改變?nèi)绱嬖诨虿淮嬖谀撤N營養(yǎng)素，或溫度改變的反應(yīng)中，啟動(dòng)處于它們的控制下之核酸的漸增轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子。目前，有許多被各種潛在的宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子都是已知的?？捎孟拗菩詢?nèi)切酶除去原料核酸中的啟動(dòng)子并將分離的啟動(dòng)子序列插入藏體中，以將這些啟動(dòng)子可操作地連接到編碼感興趣多肽的核酸上。可使用天然存在的啟動(dòng)子序列和許多異源啟動(dòng)子指弓引感興趣之多肽的擴(kuò)增和/或表達(dá)。但最好是使用異源啟動(dòng)子，因?yàn)榕c天然存在的啟動(dòng)子相比，它們通常允許更大強(qiáng)度地轉(zhuǎn)錄和更高水平地產(chǎn)生被表達(dá)的有用多肽。就這些宿主來說，通常是使用含有衍生于與該宿主細(xì)胞相容之物種的啟動(dòng)子和控制序列的質(zhì)粒載體。該載體通常都攜帶有復(fù)制原點(diǎn)及能夠在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)志序列。例如，一般是使用衍生于大腸桿菌質(zhì)粒pBR322(Bolivar,et al,Genen 2:95)轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322質(zhì)粒含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因而為鑒定被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提供了容易的工具。pBR322質(zhì)?；蚱渌⑸镔|(zhì)粒還必須含有或經(jīng)修飾后含有常用于重組DNA構(gòu)建的啟動(dòng)子及其他控制元件。
適于與原核宿主使用的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang et al.,Nature,275:615(1978)；Goeddel eta l.,Nature 281:544(1979))；堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel,Nucleic Acids Res,8:4057(1980))和EPO申請(qǐng)No.36,776)及雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子(H,de Boeret al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:21-25(1983))。但其他-些功能性細(xì)菌啟動(dòng)子也是適用的。它們的核苷酸序列一般是已知的，從而使熟練技術(shù)人員能夠使用接頭或銜接子提供任何所需的限制性位點(diǎn),將它們可操作地連接到編碼前松弛素的核酸上(Siebenlist et al.,Cell 20:269(1980))。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還將含有與編碼前松弛素的核酸可操作地連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于原核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體還將含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的序列。利用常規(guī)連接技術(shù)構(gòu)建含有一個(gè)或多個(gè)上述成分并包括所需的編碼和控制序列的適當(dāng)裁體。切割分離的質(zhì)?；蚝怂崞危艚?、并再連接成所需形式以產(chǎn)生所需的質(zhì)粒。
本發(fā)明實(shí)踐中特別有用的是適于在原核細(xì)胞中表達(dá)編碼CBD蛋白質(zhì)之棱酸的表達(dá)載體。一般說來，表達(dá)包括使用能夠在宿主細(xì)胞中有效復(fù)制的表達(dá)載體，以使宿主細(xì)胞中集聚許多這樣的表達(dá)載體的拷貝，并由其合成與水平的由該表達(dá)載體編碼的所需多肽。
用上述本發(fā)明的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染并較好是轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子而適當(dāng)改變成份的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)之，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
“轉(zhuǎn)化”是指將核酸導(dǎo)入生物體中，從而使核酸作為染色體外元件或經(jīng)染色體整合而得以復(fù)制。除非另外指出，本文使用的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法都是如Cohen,F.N.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)69:2110(1972))所述的使用氯化鈣的鈣處理方法。
為了分析證明所構(gòu)建的質(zhì)粒上存在正確插入的序列，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株294(ATCC 31446)并根據(jù)氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇成功獲得的轉(zhuǎn)化株。制備這些轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，進(jìn)行限制性酶切分析和/或用Messing等人(Nucleic Acids Res.9:309(1981))或Maxam等人(Methods in Enzymology 65:499(1986))所述的方法進(jìn)行序列測定。
可用本發(fā)明的表達(dá)裁體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子的改動(dòng)的常規(guī)營養(yǎng)索培養(yǎng)基中培養(yǎng)之，然后選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增基因。溫度、pH等培養(yǎng)條件是以前為進(jìn)行表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞所適用的，并且對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
在Sambrook等人((1989)Electrophoresis buffers inMolecular Cloning(Nolan,C.ed.),Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,pp.B.23-24；Sambrook et al.(1989)Bacterial Media in Molecular Cloning(Nolan,C.ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,pp.A.1-4)所述的適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞。
可用至少4種一般方法鑒定對(duì)產(chǎn)生本發(fā)明CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)之宿主細(xì)胞的選擇(a)DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-反義RNA雜交可使用包含與CBD編碼序列同源之核苷酸的雜交探針和/或PCR反應(yīng)引物，以核酸雜交法檢測是否存在編碼本發(fā)明CBD蛋白質(zhì)的核酸。
(b)存在或沒有”標(biāo)志”基因功能可基于是否存在某些標(biāo)志基因功能，如抗生素抗性來鑒定和選擇攜帶有編碼本發(fā)明CBD蛋白質(zhì)之核酸的宿主細(xì)胞。例如，如果編碼CBD的序列被插入克隆或表達(dá)載體的標(biāo)志基因序列內(nèi)，則可根據(jù)標(biāo)志基因功能的消失來鑒定含有該編碼序列的轉(zhuǎn)化體。另外也可以將標(biāo)志基因與CBD核酸序列串聯(lián)，其中所說的核酸序列處于用來控制CBD編碼序列之表達(dá)的相同或不同啟動(dòng)子的控制之下。在對(duì)誘導(dǎo)或選擇的反應(yīng)中表達(dá)標(biāo)志基因即表明編碼CBD之序列的表達(dá)。
(c)經(jīng)檢測宿主細(xì)胞中CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，估計(jì)轉(zhuǎn)錄水平可用雜交檢測法估測CBD編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。例如，可以分離聚腺苷酸化的RNA并使用與CBD編碼序列或相特定部分同源的探針以Northern印跡法分析之。另外，也可以提取宿主細(xì)胞的總核酸并檢測與這些探針的雜交情況；以及(d)以免疫檢測法檢測，或根據(jù)蛋白質(zhì)以高親和力及可逆水方式結(jié)合纖維素的能力確定CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)?？梢杂妹庖邔W(xué)方法，例如用Western印跡法或免疫檢測法如RIA法估計(jì)CBD蛋白質(zhì)的表達(dá)?？梢愿鶕?jù)所表達(dá)的蛋白質(zhì)以高親和力及可逆方式結(jié)合纖維素的能力來估計(jì)CBD蛋白質(zhì)的表達(dá)。
“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”兩詞可以互換使用，并且所有這些都包括其后代和祖先。還應(yīng)明確的是，所有后代的DNA含量不可能是完全相同的，因此可能存在預(yù)有準(zhǔn)備的或偶然發(fā)生的突變。當(dāng)篩選細(xì)胞時(shí)可得到具有同樣功能或生物學(xué)活性的突變體后代。
本文所用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指這樣的雜交條件(1)利用低離子強(qiáng)度和高洗滌溫度，例如干50℃在0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS中(2)雜交期間利用變性劑如甲酰胺，如50％(v/v)甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mN磷酸鈉緩沖液(pH6.5)并加有750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉，溫度以42℃；或者(3)在42℃下利用50％甲酰胺、5×SSC(0.75N NaCl、0.075M焦磷酸鈉)5×Denhardt′s溶液、超聲波處理的鮭精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并在42℃于0.2×SSC和0.1％SDS中洗滌。
本文所用的術(shù)語“回收”是指在一定條件下從纖維素-CBD蛋白質(zhì)結(jié)合復(fù)合物中釋放CBD蛋白質(zhì)的能力，所說的條件包括使用釋放劑，例如6M尿素或6M鹽酸胍等變性試劑?？墒褂萌魏我环N具有從纖維素-CBD蛋白質(zhì)結(jié)合復(fù)合物中釋放CBD蛋白質(zhì)之能力的釋放劑。CBD最好是暫時(shí)變性的并且不會(huì)因用釋放劑處理而被不可逆地降解。因此，可按7.1.1、7.2.1.和8.1.4.節(jié)中所述方法經(jīng)重新構(gòu)成被洗脫的蛋白質(zhì)來回收CBD。
本文所述的術(shù)語“裂解劑”是指特異性地裂解CBD蛋白質(zhì)或CBD融合蛋白質(zhì)以便根據(jù)需要釋放或切掉某些成分。例如CBD融合蛋白質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)牧呀鈩┌?，如蛋白?nèi)切酶、激素原轉(zhuǎn)化酶、例如PC1、PC2、弗林蛋白酶(furin)、Kex2、枯草蛋白酶、或其突變體以及化學(xué)試劑，如有機(jī)酸和無機(jī)酸、羥胺、N-溴琥珀酰亞胺及溴化氰。下列文獻(xiàn)中教導(dǎo)了用各種蛋白水解酶催化肽鍵水解的方法The Enzymes,3rd Edition,Boyer,Ed.,Academic Press,Vol.Ⅲ(1971)；Meth.Enzymology,Vol.XIX,Perlman and Lorand,Ed.,New York:Academic Press(1970)；Meth.Enzymol.,Vol.XLV,Lorand,Ed.,New York:Academic Press(1976)；Drapeau,J.Biol.Chem.,253:5899-5901(1978)和Drapeau,Meth.Enzymology,47:89-91(1977)。更廣泛列舉化學(xué)裂解劑的文獻(xiàn),可參見Witcop,Advances in Protein Chemistry,Anfinsen et al.,ed.,16:221-321,Academic Press,New York(1961)，包括其226頁上的表Ⅲ。適用于本發(fā)明的其他裂解劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解的，并可根據(jù)裂解需要以及制劑是否可作用還原態(tài)或氧化態(tài)CBD融合蛋白質(zhì)而選用之。用于裂解CBD融合蛋白質(zhì)的條件將取決于所用的裂解劑，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所使用的裂解劑來確定裂解條件。
設(shè)計(jì)并構(gòu)建本發(fā)明的CBD融合蛋白質(zhì)，以使之包括為在所期望的位置(即在上游，優(yōu)選在相鄰CBD融合蛋白質(zhì)中第二種蛋白質(zhì)的N末端處或在下游，優(yōu)選在相鄰第二種蛋白質(zhì)的C末端處；或者當(dāng)融合蛋白質(zhì)中的第二種蛋白質(zhì)是融合蛋白質(zhì)的內(nèi)部氨基酸時(shí)則在相鄰兩末端處)用所期望的裂解劑完成裂解所必需的密碼子。
本文所用的術(shù)語“糖基化”和語法上的派生術(shù)語是指在轉(zhuǎn)譯后經(jīng)在蛋白質(zhì)上加入一系列糖殘基而產(chǎn)生糖蛋白的修飾過程。糖基化可以發(fā)生在哺乳動(dòng)物的胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基氏器中。另外，也可以以合成方法完成糖基化，例如提供適當(dāng)?shù)奶腔w(例如參見Kahne etal.,J.Am.Chem.Soc.,111:6881-2(1989))。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的CBD融合蛋白質(zhì)，診斷檢測試驗(yàn)樣品，特別是組織提取物等生物學(xué)樣品，或血清或尿等體液中的感興趣的蛋白質(zhì)。生物學(xué)樣品較好的是哺乳動(dòng)物來源的，且最好是人來源的。待檢測的哺乳動(dòng)物生物學(xué)樣品中的優(yōu)選感興趣蛋白質(zhì)是HSP蛋白質(zhì)、HSP抗體、交叉反應(yīng)性HSP相關(guān)蛋白質(zhì)、或其抗原部分。哺乳動(dòng)物生物學(xué)樣品中存在HSP抗體，可能是胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的預(yù)兆或指征。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，例如借助本領(lǐng)域中已知的各種免疫檢測法，使用包含第三種蛋白質(zhì)，例如抗HSP之IgG抗體的CBD-蛋白A融合蛋白質(zhì)檢測生物學(xué)樣品中抗原，例如HSP的存在?；蛘?，可用包含抗原決定基之CBD融合蛋白質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)檢測可識(shí)別該抗原決定基的抗體。優(yōu)選的抗原決定基是HSP蛋白質(zhì)。
蛋白A是一種見于金黃色葡萄球菌胞壁中的，與IgG分子的Fc部分結(jié)合并因而可沉淀抗體的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在免疫檢測法例如RIA或ELISA中具有實(shí)用性，其可用于分離抗體或抗原-抗體復(fù)合物。
在本發(fā)明中，蛋白A是CBD融合蛋白質(zhì)的優(yōu)選的第二種蛋白質(zhì)。CBD-蛋白A融合蛋白質(zhì)可用于診斷性免疫檢測法，以檢測抗體或抗體-抗原復(fù)合物的存在，或測定抗體或抗體-抗原復(fù)合物的量或濃度。
本發(fā)明的CBD-蛋白A融合蛋白質(zhì)還可用于包含有纖維素和CBD融合蛋白質(zhì)的診斷試劑盒中，其中CBD融合蛋白質(zhì)成分保留其與纖維素和第二種成分的IgG,例如抗原-抗體復(fù)合物或抗體結(jié)合的能力。本發(fā)明的CBD融合蛋白質(zhì)還可用作親和純化抗體或抗原決定基的工具。本發(fā)明的優(yōu)選抗原決定基是HSP蛋白質(zhì)、其相關(guān)蛋白質(zhì)或抗原部分。優(yōu)選的CBD融合蛋白質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)包括HSP蛋白質(zhì)或抗HSP IgG。在本發(fā)明中，CBD-HSP抗原決定基融合蛋白質(zhì)可用于定量檢測人血清中HSP抗體的免疫檢測法中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，CBD融合蛋白質(zhì)包括保留其結(jié)合纖維素或殼多糖的能力的CBD成分，以及作為保留其催化活性的酶的第二種成分。該實(shí)施方案的CBD融合蛋白質(zhì)可用作在纖維素或殼多糖固相底物上進(jìn)行酶催化反應(yīng)的工具。如上所述，可以用常規(guī)化學(xué)方法將純化的CBD與純化的酶制劑連接，或者用重組方法表達(dá)編碼CBD和酶的核酸，以制備CBD-酶融合蛋白質(zhì)。在本發(fā)明之該實(shí)施方案的一個(gè)例子中，CBD融合蛋白質(zhì)的第二種成分是肝素酶(hepavanase)。可將CBD-肝素酶固定在纖維素基質(zhì)上并催化肝素轉(zhuǎn)化成糖成分。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及CBD改變植物組織的生長的能力，基于這種能力適于將其用于農(nóng)業(yè)中，例如可望用于促進(jìn)花粉管生長和/或根生長。另外，因?yàn)楦邼舛菴BD具有抑制根生長的能力，故可用于阻止不希望有的植物，例如“雜草”的生長發(fā)育。在另一個(gè)實(shí)例中，CBD可用于增進(jìn)真菌如蘑菇的生長，其中CBD結(jié)合殼多糖并刺澈發(fā)育中的擔(dān)子果或結(jié)果體的生長和/或發(fā)育。
本發(fā)明的再一個(gè)方面涉及CBD與昆蟲外骨骼或包括中腸在內(nèi)的其他昆蟲部分的殼多糖結(jié)合的能力。這種能力適于將CBD用作生物殺害蟲劑，其中使CBD連接到用于控制害蟲的微生物如蘇云金芽孢桿菌(BT)或表達(dá)BT毒素基因的微生物上，或者連接到分泌殼多糖酶的真菌上。CBD的功能是使微生物結(jié)合到昆蟲的殼多糖部分上，其中微生物產(chǎn)生的毒素或酶導(dǎo)致害蟲的死亡。在本發(fā)明該實(shí)施方案的一個(gè)例子中，可將CBD-微生物復(fù)合體直接施用于可能受害蟲侵害或有侵害危險(xiǎn)的植物部分上，或者可將CBD-微生物復(fù)合體固定在設(shè)置于被侵害農(nóng)田中的餌料站上，或被害蟲侵害的植物上。在本發(fā)明該實(shí)施方案的另一個(gè)實(shí)例中，將CBD-微生物復(fù)合體施用于木材或纖維素基產(chǎn)品，以防止或控制由破壞木材的害蟲的侵害。例如，將CBD-微生物復(fù)合體施用于電話線桿或木材或含纖維素的建筑構(gòu)件上，其中CBD成分緊密地結(jié)合到侵入的昆蟲上，并且復(fù)合體中的微生物對(duì)于控制害蟲是有效的。
本發(fā)明的再一個(gè)方面涉及CBD與真菌，包括適用于生物除污或降解毒性環(huán)境污染物之真菌的殼多糖結(jié)合的能力。根據(jù)該實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例，使用其中第二種成分是降解環(huán)境污染物之酶的CBD融合蛋白質(zhì)?？蓪BD-酶融合蛋白質(zhì)固定在纖維素底物上并用此工具經(jīng)酶促降解作用除去環(huán)境中的污染物，例如可將此工具放在地表或地下水的水流中。根據(jù)本發(fā)明之該實(shí)施方案另一個(gè)可代用的實(shí)施方式，CBD被結(jié)合到分泌用于生物除污即降解環(huán)境污染物如殺害蟲劑之酶的真菌上。然后將CBD-真菌復(fù)合體固定于纖維素底物上并提供適用于酶促降解環(huán)境污染物(如包括DDT在內(nèi)的殺害蟲劑，或伐木或鋸木操作余留下來的含木材產(chǎn)物)的工具。在一個(gè)舉例說明性的實(shí)施例中，CBD與白色腐敗真菌如Phanerochaete chxysosporium復(fù)合在一起，借以產(chǎn)生木素過氧化物酶、錳過氧化物酶并降解殺害蟲劑DDT。CBD-真菌復(fù)合體適用于生物除污，例如從環(huán)境中除去DDT等殺蟲劑。
本文所用的術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(MAb)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體，以及這些抗體的抗原表位結(jié)合片段?？乖砦皇侵缚乖肿拥目乖詻Q定基。
術(shù)語“IgG”是指一類抗體。IgG是含有代表所有免疫球蛋白之80％的兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體。
本文所用的術(shù)語“可檢測標(biāo)記”是指任何直接或間接提供可檢測之信號(hào)的標(biāo)記，并包括酶、放射標(biāo)記的分子、熒光素、顆粒、化學(xué)發(fā)光劑、酶底物或輔因子、酶抑制劑、磁性顆粒。本發(fā)明中用作可檢測標(biāo)記的酶包括堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶?？捎枚喾N方法將可檢測標(biāo)記連接到感興趣的蛋白質(zhì)上，例如可使用雙功能試劑，如4,4＇-二氟-3,3′-二硝基-二苯砜，將酶例如辣根過氧化物酶連接到感興趣的蛋白質(zhì)上。然后使所連接的酶與底物反應(yīng)，以產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括信號(hào)擴(kuò)增方法，其中使用由允許檢測毫微微克量感興趣物質(zhì)的CBD蛋白質(zhì)組成的可檢測標(biāo)記。該方法中，在適于形成纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物的條件下，將作為CBD融合產(chǎn)物之-部分的第-種CBD蛋白質(zhì)與纖維素纖維保溫。在適于過量標(biāo)記的CBD結(jié)合的條件下，將過量標(biāo)記的CBD，例如與酶如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶或熒光素或化學(xué)染料融合或結(jié)合的CBD，與纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物-起保溫。過量標(biāo)記的CBD與纖維索-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物的有效結(jié)合得以檢測很低量的感興趣的物質(zhì)。在本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法中，優(yōu)選的纖維素纖維是卵石磨碎的纖維素纖維?？捎酶鞣N化學(xué)染料著染卵石磨碎的纖維素纖維或與熒光增白劑calcofluor混合，借以結(jié)合纖維素并在紫外光照射后產(chǎn)生強(qiáng)的亮蘭色熒光。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括固相聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中在適于形成纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物的條件下，將作為CBD融合產(chǎn)物之-部分的第-CBD蛋白質(zhì)與纖維素纖維-起保溫，并且其中在結(jié)合復(fù)合物上發(fā)生熱循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括使用鏈霉抗生物素蛋白/生物素檢測系統(tǒng)。生物素能夠與鏈霉抗生物素蛋白形成緊密的，基本上不可逆的復(fù)合物。在本發(fā)明的這個(gè)方面中，提供了包含上鏈霉抗生物素蛋白融合之CBD蛋白質(zhì)的CBD)融合產(chǎn)物。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)使核苷酸或蛋白質(zhì)生物素化，以形成能夠結(jié)合感興趣的物質(zhì)的生物索化的嵌合探針。將生物素化的探針與感興趣的物質(zhì)一起保溫，將CBD-鏈霉抗生物素蛋白與生物素化的探針一起保溫，并用可檢測標(biāo)記檢測生物素化的探針繼而檢測感興趣的物質(zhì)?？蓹z測標(biāo)記可以是如上文信號(hào)擴(kuò)增方法中所述的標(biāo)記，或者是其他任何標(biāo)記如熒光素或化學(xué)染料。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括CBD融合產(chǎn)物的治療或診斷應(yīng)用，其中CBD融合對(duì)象是單克隆抗體。例如，可在以藥物/纖維素復(fù)合物或針對(duì)產(chǎn)生抗原之癌細(xì)胞的影象劑/纖維素復(fù)合物為靶標(biāo)的方法，使用包含(ⅰ)能夠以高親和力結(jié)合纖維素并且基本上不含天然與之聯(lián)系的其他蛋白質(zhì)的CBD，和(ⅱ)能夠結(jié)合抗原的單克隆抗體的CBD融合產(chǎn)物。在該實(shí)施方案中，給哺乳動(dòng)物使用CBD-單克隆抗體(或其同功抗體片段、scFv片段或抗原結(jié)合區(qū))融合產(chǎn)物。同時(shí)或在使用CBD融合產(chǎn)物后，使用藥/纖維素或影象劑/纖維素復(fù)合物。藥物/纖維素或影象劑/纖維素復(fù)合物與CBD融合產(chǎn)物的結(jié)合定位在抗原靶的部位，藥物或影象劑在相關(guān)部位發(fā)揮預(yù)期的治療或診斷活性。
實(shí)施例克隆推斷的纖維素結(jié)合區(qū)域的實(shí)驗(yàn)細(xì)菌菌株和質(zhì)粒所有的克隆實(shí)驗(yàn)都使用得自StrateGene(La Jolla,CA)的大腸桿菌Xll蘭菌株。Studier等人(J.Mol.Biol.,189:113-130(1986))描述了大腸桿菌BL21(DE3)和pET-8c。
材料PC緩沖液，pH7，含有50mM KH2PO4、10mM Na33C5H5O7(檸檬酸鈉)和1mM NaN3。TEDG緩沖液(Chang et al.,J.Bacteriol.172:3257-3263(1990))含有10mM Tris,pH7,0.1mM EDTA,0.1mM二硫蘇糖醇，和5％(v/v)甘油。雖然Tris在pH7條件下有低的緩沖能力，但因?yàn)榧葲]有產(chǎn)生也沒有使用氫離子，所以該緩沖液是適用的。限制性核酸內(nèi)切酶得自BRL(Bethesda,MD)所使用的所有其他化學(xué)試劑都是有最高純度的商品試劑。結(jié)晶纖維Avicel_PH101(批號(hào)#1117)得自FMC公司(Philadelphia,PA)。脫脂棉花得自Seamless Rubber Co.(New Haven CT)。Cellulon_纖維由Weyerhaeuser(Tacoma,WA)提供。蟹殼的顆粒殼多糖購自Sigma公司。所有其他結(jié)合底物均購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。每種多糖均在使用前用PC緩沖液洗兩次。除黑曲霉多糖、Cellulon_和棉花外，多糖的質(zhì)量都是指它們的由制造商提供時(shí)的干重。這三種結(jié)合底物都有大的干擾檢測的顆粒大小。將黑曲霉多糖的固體溶解在熱水中，過濾并在冰上冷卻，以得重結(jié)晶體。用Gifford-Wood磨碎5分鐘以降低Cellulon_和棉纖維的大小。
克隆推斷的纖維素結(jié)合區(qū)域用Gene Assembler Plus(Pharmaci a)合成互補(bǔ)于側(cè)接推斷的CBD(cbpA殘基28-189)之cbpA區(qū)域(Shoseyov et al.,PNAS,USA 89:3483-3487(1992))的DNA引物。正向引物含有NcoⅠ識(shí)別位點(diǎn)(識(shí)別序列CCATGG)，其中有與基因片段片同在讀碼內(nèi)的ATG，以在基因克隆到pET-8c載體克隆位點(diǎn)內(nèi)時(shí)起到轉(zhuǎn)錄起始密碼子的作用。反向引物含有終止密碼子和BamHⅠ位點(diǎn)。使用各20pmol引物、200μMdNTP和作為模板的Ing cbpA DNA[克隆到載體pGEMEX-1(Promega)中(Shoseyov et al.,1992，文獻(xiàn)出處同上)]，以100μl的總體積完成聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。其中Taq聚合酶購自Amersham，并使用制造商推薦的緩沖條件。PCR按已述條件(Innis et al.,Optimization of RCRs.PCR Protocols Ed.Innis et al.,Pub.Academic Press,San Diego,pp.3-12(1990))進(jìn)行40次循環(huán)。經(jīng)用苯酚/氯仿提取，再用乙醇沉降并用70％乙醇洗滌以純化PCR產(chǎn)物，然后真空干燥并重新懸浮在27μl蒸餾水中。然后用NcoⅠ和BamHⅠ切割DNA，于TBE緩沖液中在2.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖(Nuseieve GTG,FMC)凝膠上電泳(Sambrook et al.,(1989)Electrophoresis buffers in Molecular Cloning(Nolan,C.ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,pp.B.23-24)。在長波紫外光下肉眼觀察用溴乙錠著染的DNA帶并從凝膠上切下之。經(jīng)用NcoⅠ/BamHⅠ切割1μg pET-8c DNA并從凝膠上切下線性化的DNA帶以制備載體質(zhì)粒pET-8c。使用Takara連接試劑盒和100ng載體DNA及300ng插入片段將載體與插入段DNA連接在一起。用連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue菌株，然后將其鋪敷在含有100μg/ml氨芐青霉素和12.5μg/ml四環(huán)素的LB平板上(Sambrooket al.,(1989)Bacterial Media in Molecular Cloning(Nolan,C.ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,pp.A.1-4)。37℃過夜保溫后，收集菌落并培養(yǎng)在含氨芐青霉素和四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基中。按已述方法從各培養(yǎng)物中得到質(zhì)粒DNA(Sambrook et al.,(1989),Molecular Cloning(Nolan,C.ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)并用限制酶切割以證實(shí)基因片段的插入。使用Shoseyor等人[(1992)PNAS,USA 89:3483-87]報(bào)導(dǎo)的方法經(jīng)DNA序列分析進(jìn)一步證實(shí)插入段序列。
CBD的表達(dá)過表達(dá)載體(pET-CBD)可以使我們?cè)诖竽c桿菌菌株BL21(DE3)中過量產(chǎn)生17kDa CBD。CBD積聚在包涵體內(nèi)可達(dá)至少70mg/升。但可從大腸桿菌的水溶性聲波提取物中回收到約20mg/升額外量的水溶性CBD。將澄清的提取物與(Sigmacell20)纖維素混合；然后用1M NaCl溶液及蒸餾水洗CBD-纖維素復(fù)合物以除去非特異性蛋白質(zhì)，然后用6M鹽酸胍洗脫純的CBD。經(jīng)在室溫下緩慢透析使CBD完全復(fù)性并重新恢復(fù)其與纖維素結(jié)合的能力。(圖10，泳道2)實(shí)施例CBD蛋白質(zhì)的純化CBD蛋白質(zhì)的制備CBD蛋白質(zhì)的純化用含有插入段的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。37℃下，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的NZCYM(Sambrook et al.,(1989),Molecular Cloning(Nolan,C.ed.)Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY)培養(yǎng)基中將含質(zhì)粒的培養(yǎng)物振蕩培養(yǎng)到Klett讀數(shù)為160(綠色濾光片)。此時(shí)，加入IPTG至終濃度1mM。4小時(shí)后，離心收獲細(xì)胞，重新懸浮在含有RNAseA(10μg/ml)和DNAse I(1μg/ml)的50mM磷酸鹽/12mM檸檬酸鹽pH7(PC)緩沖液中，并在冰上經(jīng)用BiosonicⅡ超聲波發(fā)生器以最大功率超聲波處理45秒；再冷卻15秒以溶解細(xì)胞，此處理過程重復(fù)4次。離心(4℃,12,000g,30分鐘)收集1升細(xì)胞培養(yǎng)物的非可溶部分并將其重新懸浮在20ml 6M鹽酸胍中。將此懸液在冰上放置30分鐘，同時(shí)間斷攪動(dòng)以分離沉淀團(tuán)塊。離心(4℃,12,000g,30分鐘)除去不溶性碎片，4℃下，在2小時(shí)期間里用TEDG復(fù)性緩沖液將可溶性鹽酸胍提取物逐步稀釋到總體積400ml。加入硫酸銨至80％飽和度。4℃下放置4小時(shí)后，離心(4℃,12,000g,30分鐘)收集沉淀的蛋白質(zhì)，重新懸浮在40ml PC緩沖液中，并對(duì)PC緩沖液透析。
經(jīng)在纖維素柱上親和層析進(jìn)一步純化cbpA的CBD蛋白質(zhì)片段三次加入1.0g Avicel_PH101微晶纖維素從溶液中除去CBD蛋白質(zhì)。每次加入之后均要使懸浮液恢復(fù)平衡(室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)1小時(shí))。然后離心收集纖維素并在下次加入前除去之。3克纖維素先用1M NaCl/PC緩沖液洗1次，再用PC緩沖液洗2次。經(jīng)用10ml 6M尿素洗3次從纖維素上洗脫純化的CBD。合并尿素洗脫部分并對(duì)PC緩沖液透析(4℃至室溫)。使用Micro BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Pierce,Rockford,IL)，用牛血清白蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)品，以比色法分析最終純化的部分中的蛋白質(zhì)濃度。
CBD-纖維素解離常數(shù)和纖維素結(jié)合容量的檢測向含有添加了1mg/ml BSA和所需量纖維素(一般加入1ml含有10mg/ml纖維素和1mg/ml BSA(在P C緩沖液中)的儲(chǔ)備溶液)之PC緩沖液的1.5ml微量離心管內(nèi)加入CBD蛋白質(zhì)的樣品(一般為0至100μg)。經(jīng)加入200μl的20mg/ml儲(chǔ)備溶液(在PC/BSA緩沖液中)而使其中包含可能的競爭劑，如纖維素(4mg/ml)或羧甲基纖維素(CMC,4mg/ml)。終體積一直是1ml。除非另外注明，緩沖液的pH均為7.0。如在其他p H值下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可加入濃鹽酸或NaOH來調(diào)節(jié)PC/BSA緩沖液的pH。
在37℃下將檢測試管緩慢旋轉(zhuǎn)(30RPM)1小時(shí)以混合內(nèi)容物。然后在微量離心機(jī)中將樣品離心1分鐘以沉淀纖維素和纖維素一蛋白質(zhì)復(fù)合物。除去緩沖液后，經(jīng)重新懸浮在1ml PC緩沖液中洗滌沉淀。離心分離洗液并棄去之。然后將沉淀重新懸浮在終體積1ml的PC緩沖液中(因?yàn)閇C]和[PC]被濃縮到同樣的程度，故預(yù)期濃縮步驟不會(huì)擾亂平衡)。
洗滌步驟后，在檢測試管內(nèi)的原有BSA中(約1mg/ml)只保留約0.1μg不是非特異吸附的材料，并且在沉淀團(tuán)塊中留有10μl液體。以對(duì)照管為0CBD，計(jì)算由于此殘留BSA所致的任何顯色。分取該充分混合之懸液的等分試品，用Micro BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測。按照制造商提供的說明書進(jìn)行檢測，但其中用PC緩沖液將樣品體積調(diào)到0.5ml，再向其中加入0.5ml BCA工作試劑。將檢測混合物于60℃保溫30分鐘。在Shimadzu 160U型分光光度計(jì)中在562nm處以分光光度法檢測澄清之上清液的蛋白質(zhì)濃度。使用其中沒有加CBD蛋白質(zhì)的檢測試管校正由纖維素和殘留BSA引起的小量顯色。將所得數(shù)據(jù)與BSA標(biāo)準(zhǔn)品相比較，并調(diào)整到與用來確定各樣品中結(jié)合到纖維素上之蛋白質(zhì)量相適應(yīng)的稀釋度。該檢測法的實(shí)際檢測限度約為0.2μg/ml。校正稀釋度后，即相當(dāng)于檢測試管中結(jié)合到纖維素上的約0.034nmolCBD。從加到試管中的總CBD濃度[P]t減去結(jié)合的蛋白質(zhì)濃度[PC]算出游離CBD蛋白質(zhì)濃度[P][P]=[P]C-[PC](1)假定一種簡單的平衡關(guān)系(Segel,1975)來分析該系統(tǒng)其中解離常數(shù)Kd定義為Kd=k-1k1=[P][C][PC]]]>方程式(4)和W在纖維索的不同的固定水平上借助1/[PC]對(duì)1/[P]的雙倒數(shù)作圖1[PC]=Kd[PC]max·1[P]+1[PC]max----(4)]]>和[PC]/[P]對(duì)[PC]的Scatchard作圖[PC][P]=-1Kd[PC]+[PC]maxKd----(5)]]>分析這些數(shù)據(jù)。
必須說明的是，纖維素不是可溶性成分，并且[C]代表每單位體積暴露于緩沖液的纖維素表面上結(jié)合位點(diǎn)的濃度。同樣，[PC]則代表每單位體積結(jié)合位點(diǎn)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的濃度。使用DeltaGraphProfessionBl plotting application(Deltapoint,Inc.,Monterey,CA)，以最小二乘方法繪出與各數(shù)據(jù)點(diǎn)配合的直線。每個(gè)點(diǎn)都是從同一結(jié)合試驗(yàn)管得到的三個(gè)獨(dú)立的蛋白質(zhì)檢測數(shù)據(jù)的平均值。以一式兩份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。至少使用兩個(gè)不同的纖維素量確定Kd和PCmax/g纖維素。求出這些值的平均數(shù)以得到表1、圖9中列出的數(shù)值。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定溫度對(duì)CBD結(jié)合纖維素的影響。向300μl的50mMPC緩沖液(pH6)、1M NaCl(終濃度)和1mg纖維素中加入200μl CBD(40μg)。在不同溫度(16至60℃)下將CBD/纖維素混合物的幾種混合物保溫1小時(shí)并不時(shí)地混合之，然后以10,000g離心5分鐘。用含有NaCl的PC緩沖液pH6將沉淀團(tuán)塊洗2次。向離心沉淀物中加入40μl 6M鹽酸胍，懸浮后于室溫下繼續(xù)保溫30分鐘。離心后，將20μl樣品稀釋在780μl ddH2O中并使用Bio Rad試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。
檢測與其他多糖的結(jié)合在檢測法使用木聚糖、黑曲霉多糖、Sephadex_G-75及殼多糖，以確定它們是否為CBD蛋白質(zhì)的結(jié)合底物。在所有例子中，均使用檢測與纖維素結(jié)合的相同方法。在MicroBCA檢測法中殼多糖表現(xiàn)出很高的本底，其中按比例增加到60℃的保溫時(shí)間，從而顏色展現(xiàn)時(shí)間減少到15分鐘。因?yàn)闅ざ嗵堑母弑镜祝灾皇褂脙蓚€(gè)寬的不同的蛋白質(zhì)濃度。
用于結(jié)合分析的CBD的純化為了選擇性地產(chǎn)生推測的cbpA的CBD區(qū)域(殘基28-189)，設(shè)計(jì)互補(bǔ)于cbpA之堿基67至86和558至579的寡核苷酸引物(圖1A-1B)。如圖2A-2C中所示，設(shè)計(jì)這些有錯(cuò)配的引物以在PCR產(chǎn)物的一個(gè)末端造成一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn)和一個(gè)ATG起始密碼子，并在另一端造成一個(gè)TAG終止密碼子，然后是BamHⅠ位點(diǎn)。然后將此基因片段克隆到T7 RNA聚合酶表達(dá)載體pET-8c中，得到質(zhì)粒pET-CBD(參見Studier,F.,and B.A.Moffatt(1986)J.Mol.Biol.189:113-130)?？寺〉幕蚱尉幋aCBD之N末端上的蛋氨酸，但CBD氨基酸序列的其余部分相當(dāng)于CbpA的殘基28至189。該蛋白質(zhì)片段分子量為17634。經(jīng)DNA序列分析證實(shí)已被插入。由攜帶pET-CBD的大腸桿菌EL21(DE3)細(xì)胞產(chǎn)生CBD蛋白質(zhì)。加入IPTG后，該宿主菌株產(chǎn)生可識(shí)別pET載體中T7啟動(dòng)子的T7 RNA聚合酶。cbd基因片段處于該可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，并且在誘導(dǎo)后大量合成CBD蛋白質(zhì)(圖3)。4小時(shí)生產(chǎn)階段后，來自溶解之細(xì)胞的可溶性提取物只含有小量的CBD蛋白質(zhì)，而大多數(shù)CBD蛋白質(zhì)是見于非可溶性部分中。該蛋白質(zhì)很容易溶解在濃縮的鹽酸胍中，并且可在TEDG緩沖液中經(jīng)緩慢稀釋后復(fù)性。已發(fā)現(xiàn)以這種分離的蛋白質(zhì)可結(jié)合Avicel_，從而證實(shí)其為推測的CBD。雖然該部分基本上都是CBD蛋白質(zhì)，但所述的檢測法要求蛋白質(zhì)是高純度的。用7.1.1。小節(jié)中所述方法，經(jīng)一次纖維索親和結(jié)合純化步驟即可達(dá)到這一純度。當(dāng)用考馬斯亮蘭染色時(shí)，親和純化的CBD蛋白質(zhì)即作為單一帶呈現(xiàn)在丙烯酰胺凝膠上?？蓮?升培養(yǎng)物中的細(xì)胞內(nèi)回收到大約70mg CBD蛋白質(zhì)。
CBD與纖維素結(jié)合的時(shí)間過程及溫度對(duì)結(jié)合的影響Avicel_與CBD相互作用的時(shí)間過程(圖4)揭示了該過程的以下幾個(gè)特征(a)在1.0mg/ml Avicel_和2.0μM CBD的起始濃度(即[P]o)下，經(jīng)60分鐘達(dá)到1.2μM復(fù)合物的平臺(tái)值。單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，纖維索樣品的最大CBD結(jié)合容量為2.1μmole×g-1，相當(dāng)于2.1μM總纖維素位點(diǎn)的有效濃度(即[C]o)。假定平衡確立(如下證實(shí)的)，則限定為[P][C]/[PC]的Kd約為0.6μM。
(b)由可逆BiUni反應(yīng)的綜合速度方程式(Capellos &Bielski,1980:Wilkinson,1980)計(jì)算的結(jié)合的二級(jí)速度常數(shù)約為2.7×104M-1×min-1(5-60分鐘各點(diǎn)的平均值)。作為K1Kd計(jì)算的復(fù)合物解離的速度常數(shù)為1.6×10-2×min-1(t1/2=43分鐘)。相對(duì)長的復(fù)合物解離的t1/2允許一次洗出C+PC沉淀團(tuán)塊而沒有明顯地丟失結(jié)合的CBD(最初沉淀團(tuán)塊的重新懸浮和再離心于1分鐘內(nèi)完成。在此期間，將丟失不到3％的結(jié)合的CBD)。還觀察到，在延長保溫后所測得的[PC]降低，18小時(shí)后降低到最大值的約50％的水平。這種[PC]降低可因蛋白質(zhì)的逐步變性而引起。為了堿小因這些影響造成的假象，我們使用了對(duì)其平衡似乎是“完全的”最短保溫時(shí)間(60分鐘以后結(jié)合的進(jìn)一步增加可因?qū)嶒?yàn)誤差而不易看清)。與纖維素結(jié)合的CBD量為4.5+/-0.5mg/克纖維素，并且在大約16至60℃溫度范圍內(nèi)不受溫度的影響。
CBD-纖維素結(jié)合親和力和結(jié)合容量分析圖5A-5B顯示了純CBD與Avicel_微晶纖維素結(jié)合的典型診斷標(biāo)示圖。在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，該圖是線性的，所得Kd值約為0.6μM，每克Avicel_結(jié)合CBD的[PC]max為2.1μmoles。后一數(shù)值相當(dāng)于大約每克Avicel_37mg CBD蛋白質(zhì)。診斷圖的線性提示只呈現(xiàn)一種類型的CBD-纖維素相互作用。
還研究了CBD與Avicel_以外的其他類型纖維素結(jié)合的能力。表1，圖9顯示用各不同底物測得的Kd和PCmax的數(shù)值。Sigmacell20和50被描述為微晶形式的纖維素；發(fā)現(xiàn)這些材料也與CBD結(jié)合。高結(jié)晶形式的纖維素如脫脂棉和Cellulon_纖維(得自Acetobacterxylinum的結(jié)晶纖維索)能夠結(jié)合實(shí)質(zhì)上更多的CBD(多達(dá)每克底物結(jié)合6.4μmol CBD)。然而，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過更多加工的并因此而含有較少天然結(jié)晶形式纖維素的纖維狀或微顆粒纖維素則結(jié)合較小量的CBD。所有形式的纖維素的CBD-纖維素解離常數(shù)都大致相同，而PCmax值則相差達(dá)30倍。
結(jié)合位點(diǎn)競爭為了確定是否可溶性碳水化合物與Avicel_競爭結(jié)合CBD蛋白質(zhì)，在某些試驗(yàn)中包含4倍(w/v)于Avicel_量的纖維素二糖(β-1,4鍵連接的葡萄糖二聚體)和CMC(一種纖維素的可溶性衍生物)(每毫升試驗(yàn)樣品含1mg Avicel_,4mg纖維素二糖或CMC)。如表1，圖9所示，沒有觀察到Kd和PCmax的明顯差異，表明這些可溶性碳水化合物沒有影響CBD與Avicel_的結(jié)合。
pH對(duì)解離常數(shù)的影響溶纖維梭菌(C.Cellulovorans)是一種只在pH7左右生長旺盛的嗜中性生物體(Sleat et al.,1984)，所以大多數(shù)結(jié)合試驗(yàn)中使用這一pH。在pH5.0至8.0范圍內(nèi)，PCmax沒有隨pH改變而發(fā)生明顯的變化。另外，應(yīng)提到的是，偏酸達(dá)pH3.5或偏堿達(dá)pH9.5的PC緩沖液在1分鐘洗滌期間不會(huì)從Avicel_上洗掉CBD。
CBD與其他多糖的結(jié)合使用木聚糖、Sephadex_G-75、黑曲霉多糖、和殼多糖檢驗(yàn)CBD的結(jié)合特異性。這些多糖中，只有殼多糖顯示有可檢測的CBD肽結(jié)合(表1，圖9)。殼多糖-CBD Kd和結(jié)合容量相似于Avicel_-CBD結(jié)合容量值。
我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，cbpA含有可靠的結(jié)合纖維素的區(qū)域，并且顯示該區(qū)域可獨(dú)立于cbpA的其他區(qū)域發(fā)揮功能。因?yàn)榧兓椒ㄖ邪俗冃院蛷?fù)性步驟，所以純化的蛋白質(zhì)是功能性的這一事實(shí)即表明CBD蛋白質(zhì)序列是可保證該蛋白質(zhì)片段的適當(dāng)折迭。
我們已發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)中CBD與檢測試管的非特異性結(jié)合是一個(gè)問題，并建立了一種在過量BSA存在下平衡CBD和纖維素的檢測法。BSA可有效地消除CBD與試管的非特異性相互作用。達(dá)到平衡后，收集并洗滌纖維素和纖維素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后檢測結(jié)合的蛋白質(zhì)。如前所述，因?yàn)镃BD-纖維素的解離緩慢，所以在快速洗滌步驟中沒有除去可檢測量的CBD。
用蛋白質(zhì)檢測法直接檢測結(jié)合的CBD，并按第7.1.2。節(jié)方程式1中所示，從總CBD中減去結(jié)合的CBD以計(jì)算游離CBD。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，可經(jīng)洗滌步驟除掉以低親和力非特異地吸附到纖維素上的CBD分子，從而得到更準(zhǔn)確地反映CBD與纖維素表面之間特異的、高親和力相互作用的數(shù)據(jù)。如圖5中所示，使用這種類型的檢測法采集的數(shù)據(jù)構(gòu)成了(在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi))線性診斷圖。雙倒數(shù)作圖對(duì)于可逆的Bi Uni系統(tǒng)來說是一種確定結(jié)合親和性及容量的方便的、常規(guī)的方法。PCmax隨著所用纖維素的量呈線性增加，而Kd值則不依賴于纖維素量這一觀察結(jié)果支持該檢測法的有效性。表1，圖9顯示了用各種形式的纖維素及其他碳水化合物獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些結(jié)果表明，描述為“結(jié)晶”類型的纖維素比因經(jīng)過較多加工處理而喪失了其大部分結(jié)晶性的纖維素有更高的CBD結(jié)合容量。纖維素樣品的PCmax因纖維素類型不同有寬范圍的變化，而Kd則保持恒定這一事實(shí)表明，我們已檢測到了發(fā)生在CBD和纖維素之間的一種類型的強(qiáng)的蛋白質(zhì)-纖維素相互作用。經(jīng)高度加工的纖維素的較低PCmax反映了樣品中存在較小數(shù)目的潛在蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)，并且似乎與樣品的結(jié)晶性相關(guān)。雖然不希望拘泥于理論，但這一結(jié)果將表明結(jié)晶纖維素具有某些特殊的性質(zhì)使之可被接受為結(jié)合底物，而非結(jié)晶纖維素則沒有這樣的性質(zhì)。
為了進(jìn)一步確定CBD的底物特異性，我們檢測了所加入的可溶性底物(纖維素二糖或CMC)對(duì)纖維素結(jié)合的影響。如表1，圖9中所示，過量的纖維素或CMC對(duì)CBD-Avicel_Kd或PCmax沒有影響。這一缺乏競爭的事實(shí)提示，CBD識(shí)別位點(diǎn)是對(duì)比簡單重復(fù)的葡萄糖或纖維素二糖部分更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特異的，并進(jìn)一步提示也許需要纖維素鏈的特定三維空間排布。
CBD對(duì)結(jié)晶纖維素的特異性提示考慮殼多糖酶，已知該酶可與殼多糖-一種以β-1,4鍵連接的乙酰葡糖胺的聚合物-緊密結(jié)合。與纖維素一樣，殼多糖也可根據(jù)其來源和其分離中所使用的純化方法分為多種不同的形式(Cabib(1988)Methods Enzymol.161:460-462；Blackwell(1988)Methods Enzymol.161:435-442)。用于親和純化殼多糖酶的殼多糖是α-殼多糖，其中鏈間是以反平行的方式排列的。這種形式的殼多糖是結(jié)晶態(tài)的，其結(jié)構(gòu)相似于天然結(jié)晶纖維素(通常稱為纖維素Ⅰ)。與其中各鏈以反平行構(gòu)象排列的纖維素Ⅱ相反，纖維素Ⅰ是其中纖維素鏈以平行束排列的形式的。在苛刻條件下加工纖維素I可致使其破壞而產(chǎn)生纖維素Ⅱ。由于廣泛的氫鍵形成，所以這兩種形式都是結(jié)晶態(tài)的。因?yàn)槲覀兊姆蛛x的CBD與受到較少處理的纖維素結(jié)晶，即主要與纖維素I結(jié)合，所以我們有興趣了解CBD是否也可與具有相似晶體結(jié)晶，但鏈的排列方向相反的α-殼多糖結(jié)合。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)CBD接受殼多糖為結(jié)合底物，其Kd近似于對(duì)纖維素結(jié)合的Kd值。還試驗(yàn)了木聚糖(β-1,4木糖)、黑曲霉多糖(交替的α-1,4和α-1,3葡萄糖)、及Sephadex_G-75(有α-1,3分支的α-1,6葡萄糖)(Coutinho et al.(1992)Mol.Microbiol.6:1243-1252)，但在未檢測法條件下CBD沒有顯示出與它們之中任何一種多糖有可檢測的結(jié)果。因?yàn)闅ざ嗵侵皇沁@些結(jié)晶的底物中的一種，所以我們感到這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明底物的結(jié)晶性是很重要的。
雖然這旨定是有利于緊密地纖維素結(jié)合的部分因素，但最近的研究(Din et al.(1991)Bio/Technol.9:1096-1099)已表明分離的、非酶促的CBD對(duì)纖維素的結(jié)合導(dǎo)致了以非水解方式破壞纖維素纖維。據(jù)信蛋白質(zhì)-纖維素結(jié)合降低了晶體表面附近鏈內(nèi)氫鍵結(jié)合的程度。進(jìn)而導(dǎo)致這些纖維素鏈的廣泛水合作用。最終結(jié)果是降低了結(jié)晶性。這一稱為“非晶態(tài)發(fā)生”的過程使纖維素纖維更易接近內(nèi)-β-1,4-殼多糖酶。正如我們已發(fā)現(xiàn)的，CBD沒有表現(xiàn)出這種非晶形化作用。
與Aspergillus niger、Spodoptera littoralis及Heliothis armigera結(jié)合的CBD室溫下將黑曲霉菌絲體(約20mg)與400μl CBD(120μg)在20mM Tris-HCl(pH7)中保溫1小時(shí)。用同樣緩沖液將菌絲體洗兩次，然后將沉淀物再懸浮于含有β-巰基乙醇和SDS的SDS-PAGE上樣緩沖液中。將混合物煮沸5分鐘并經(jīng)SDS-PAGE分樣蛋白質(zhì)。圖16顯示CBD與黑曲霉的菌絲體結(jié)合。
在顯徽鏡下分離Spodoptera littoralis和Heliotbisarmigera(農(nóng)業(yè)中的主要昆蟲病原體)的中腸膜，取大約20mg與400μl含CBD(120μg)的20mM Tris-HCl(pH7)在室溫下保溫1小時(shí)。在同樣緩沖液中用1M NaCl將含殼多糖的膜洗一次，再用沒有NaCl的同樣緩沖液洗兩次，然后用含有β-巰基乙醇和SDS的SDS-PAGE上樣緩沖液重新懸浮沉淀物。將混合物煮沸4分鐘并經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)。所得結(jié)果示于圖17和18中。結(jié)果表明CBD與Spodoptera littoralis和Heliothis armigera的中腸結(jié)合。
CBD-ProtA基因的構(gòu)建和其在大腸桿菌中的表達(dá)酶和化學(xué)試劑除特別說明者外，化學(xué)試劑均購自Sigma Chemicals Inc.。限制酶購自New England Biolabs Inc.。Taq聚合酶購自Promega,Inc.。
質(zhì)粒和細(xì)菌使用攜帶cbpA的質(zhì)粒pCBl(Shoseyov et al.,1992)以PCR方法擴(kuò)增cbd。使用表達(dá)載體pRIT2(Nilsson et al.(1985)EMB0J.4(4):1075-1080)構(gòu)建融合體基因。使用大腸桿菌菌株XL1-blue(Strategene)進(jìn)行最初的轉(zhuǎn)化。在含有溫度敏感性阻遏蛋白的菌株，2097中表達(dá)CBD-ProtA。另外大腸桿菌菌株N4830-1攜帶溫度敏感性阻遏蛋白ci857，等同于大腸桿菌菌株2097。大腸桿菌菌株N4830-1可購自Pharmacia,Inc.。
CBD-ProtA的克隆CBD是使用cbpA基因作模板經(jīng)PCR擴(kuò)增的。引物A(N末端引物；5＇-GGGGGAATTCCATGGCAGCGACAT-8′)含有EcoRⅠ位點(diǎn)，引物B(C末端引物5′-GGGGGGATCCTATGGTGCT-3′)含有終止密碼子，之后是BamHⅠ位點(diǎn)。設(shè)計(jì)并以一種能夠強(qiáng)制EcoRⅠ/BamHⅠ 500bpDNA片段克隆到“讀碼內(nèi)”與蛋白A基因之C末端部分融合的質(zhì)粒pRIT2中的方式合成這些引物。PCR條件如Innis和Gelfand(1990)所述，但作了如下改動(dòng)反應(yīng)混合物中使用2ng模板DNA(cbpA)和1mM MgCl2。使用可編程序的熱控制器(M & J Research Inc.)進(jìn)行反應(yīng)。按照Sambrook等人在Molecular Cloning(Nolan,C.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)中所述方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNA操作。用EcoRⅠ和BamHⅠ消化PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，并使用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen Inc.)從1.5％瓊脂糖凝膠中分離期望的500bp DNA片段(圖1A-1B)。使用T4連接酶將此EcoRⅠ/BamHⅠ片段連接到已用EcoRⅠ/BamHⅠ切成線性的pRIT2中。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞并在含有100mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇已被轉(zhuǎn)化的菌落。將含有DNA插入段的成功地得到的構(gòu)建體定名為pCBD-ProtA1。
CBD-ProtA的表達(dá)和純化按文獻(xiàn)中描述的方法(Nilsson et al.(1985)EMBO J.4(4):1075-1080)進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。將400ul含有pCBD-ProtA1的大腸桿菌菌株2097培養(yǎng)過夜接種到40ml含有50mg/L氨芐青霉素的LB中。使培養(yǎng)物于30℃下生長至100 Klett(綠色濾光片)，改變溫度至42℃培養(yǎng)45分鐘，然后于40℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。以2,000g離心10分鐘以收獲細(xì)胞，然后將細(xì)胞重新懸浮在10ml 20mM Tris-HCl緩沖液(pH7)中。使用W-385超聲波發(fā)生器(Heat Systems-Ultrasonic,Inc.)以最大功率超聲處理1分鐘，然后冷卻30秒鐘，如此重復(fù)3次以破碎細(xì)胞。溶胞產(chǎn)物離心(4,000g,10分鐘)得到澄清液并加入500mg纖維素顆粒(Sigmacell 20，平均粒度20微米)。室溫下將懸浮液保溫10分鐘并離心(2,000g,10分鐘)。除去上清，并用5ml 1MNaCl將沉淀洗1次以除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用10ml去離子水洗2次。用5ml 6M鹽酸胍從纖維素中除去CBD-ProtA。離心(2,000g,10分鐘)后，在20mM Tris-HCl緩沖液(pH7)中透析所得溶液，按照Laemmli(1970)所述方法在12.5％SDS-PAGE上分析蛋白質(zhì)。
CBD-ProtA的結(jié)合分析按下述方法檢驗(yàn)CBD-ProtA與IgG的結(jié)合將已用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水pH7.4)預(yù)洗過的兔IgG(H+L)-Sepharose(8mg/ml,Bio-Makor Inc.)的100μl懸浮液與1ml分離的CBD-ProtA(50μg/ml)混合。將混合物于8℃下保溫1小時(shí)，然后離心(2,000g,5分鐘)。除去上清并用500μl PBS將沉淀物洗兩次。然后，用200μl1M乙酸洗脫CBD-ProtA。將沉淀物與15μl上樣緩沖液(SAB；125mM Tris-HCl pH6.8,4％SDS,20％甘油和0.002％溴酚蘭)混合，將15μl不同洗脫部分的樣品與15μl SAB混合，然后煮沸5分鐘并在SDS-PAGE上分析。
按下述方法檢驗(yàn)CBD-ProtA與纖維素的結(jié)合將20mg纖維素(Sigmacell 20)與200μl分離的CBD-ProtA(50μg/ml)混合。將混合物于室溫下保溫15分鐘并以2,000g離心5分鐘。用200μl 1M乙酸洗沉淀物后，重新懸浮于40μl SAB中。將懸液與15μl乙酸洗液(與15μl SAB混合的)一起煮沸并在SDS-PAGE上分析。
結(jié)果顯示可以在大腸桿菌中表達(dá)CBD-ProtA，并可以使用纖維素以一步驟純化法純化之。融合蛋白質(zhì)具有期望的分子大小，即45kDa(圖8)。CBD-ProtA保留了其對(duì)纖維素及IgG的親和性。已表明1M乙酸可分離CBD-ProtA∶IgG鍵但不能分離CBD-ProtA∶纖維素鍵。
使用表達(dá)載體，我們每升培養(yǎng)物能生產(chǎn)6mg CBD-ProtA，我們使用T7過表達(dá)系統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌蛏a(chǎn)10倍以上的純CBD(70mg/L，圖9)。
CBD-HSP融合蛋白質(zhì)的克隆克隆CBD-HSP融合蛋白質(zhì)的一個(gè)實(shí)例如下所述使用質(zhì)粒SJ60作為模板制備擴(kuò)增HSP基因的PCR引物。Jindal等人(1989)Mol.Cell.Biol.9:2279)描述了該質(zhì)粒。引物含有HSP之N末端上的KpnⅠ位點(diǎn)和C末端上的終止密碼子，其后是BamHⅠ位點(diǎn)。正向引物5＇-ACGGTACCACTTCGGTTACCCACAGTC-3＇反向引物5′-GGGGATCCTACATGCCACCTCCCATTAG-為了能使CBD的C末端轉(zhuǎn)錄融合到HSP的N-末端上，我們?cè)?′末端引入了一個(gè)KpnⅠ位點(diǎn)，這個(gè)引入用PET-CBD作為模板和下列引物完成了cbd的PCR擴(kuò)增正向引物5 ′-GTATACCAGCCATGGCAGCG-3′反向引物5＇-GTACATCTGGATCCTATGGTACCGT-3＇用NcoⅠ和BamHⅠ消化擴(kuò)增的DNA，然后將其連接到NcoⅠ/BamHⅠ預(yù)消化的pET-8c載體中。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化XL1-Blue并將新的質(zhì)粒是名為pET-CBDK。用KpnⅠ/BamHⅠ消化該質(zhì)粒，并與用KpnⅠ/BamHⅠ限制性消化的HSP-PCR擴(kuò)增的片段連接轉(zhuǎn)化到XL1-Blue中，并在進(jìn)一步證實(shí)后用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，以過量產(chǎn)生CBD-HSP。
NH2-VH-VL-CBD-CO2的構(gòu)建使用“重組相抗體系統(tǒng)”(“Recombinant Phase AntibodySystem”)(Pharmacia Inc.)克隆所需的VH-VL完成CBD與重組抗體的融合。使用所得到的攜帶VH-VL的pCANTAB5質(zhì)粒作為模板，借助下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增正向引物5＇-AGCCATGGCGGCCCAGC-3′反向引物5＇-GGGGTACCAACAGTTTGTGCGGCC-3′這些引物在VH-VL的5′末端導(dǎo)入NcoⅠ位點(diǎn)，并在3′末端導(dǎo)入KpnⅠ位點(diǎn)。用NcoⅠ和KpnⅠ消化經(jīng)擴(kuò)增的片段并按下述方法用于CBDC末端融合的表達(dá)載體中。
為了使CBD的N末端部分轉(zhuǎn)錄融合到VH-VL的C末端部上，我們?cè)赾bd基因的3′末端導(dǎo)入一個(gè)KpnⅠ位點(diǎn)。使用作為模板的pET-CBD和下列引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增cbd完成這一導(dǎo)入正向引物5＇-GGGCCATGGCAGGTACCTCATCA-3 ′反向引物5＇-GTACATCTGGATCCTATGGTGCTGT-3′這些引物使KpnⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入至5＇末端NcoⅠ位點(diǎn)之后的cbd基因，并保留了3′末端的終止密碼子，其后為BamHⅠ位點(diǎn)，擴(kuò)增DNA經(jīng)NcoⅠ和BamHⅠ酶切后，再連接到經(jīng)NcoⅠ/BamHⅠ酶切的pETSC載體上。該連接混合物用來轉(zhuǎn)化XL1Blue，并將這個(gè)新質(zhì)粒定名為pET-KCBD。該質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和KpnⅠ酶切與NcoⅠ/KpnⅠ限制性酶切VH-VL擴(kuò)增片段連接，轉(zhuǎn)變?yōu)閄L1Blue。該結(jié)構(gòu)一經(jīng)證實(shí)，便可用來轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，以產(chǎn)生過量VH-VL-CBD融合蛋白質(zhì)。
從上文公開的和本領(lǐng)域普通已知的觀點(diǎn)看，本領(lǐng)域普通人員顯然可以制備包含CBD和第二種已知序列的蛋白質(zhì)的各種CBD融合產(chǎn)物。
用CBD-ProtA纖維素純化IgG本實(shí)施例證明使用CBD純化IgG。將在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)中稀釋的人血清(500μl,1∶10)加到20mg CBD-ProtA-纖維素懸浮液(4μg/mg)中。將混合物于8℃下保溫1小時(shí)，然后快速離心和兩次500μl PBS洗滌除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)用200μl 1M乙酸洗滌(室溫下15分鐘)回收IgG，而CBD-ProtA則仍與纖維素結(jié)合。
CBD的特征鑒定本實(shí)施例證明CBD并不破壞纖維素。CBD沒有纖維素破壞/非晶形發(fā)生的活性。在20mM Tris-HCl緩沖液pH7中將大約1mg CBD與各10mg兩種不同類型的纖維素(棉花和Cellulon_)干37℃保溫過夜。在掃描電子顯微下用金涂包并觀察纖維素樣品。圖14A和14B清楚地證明，與對(duì)照組未經(jīng)處理的棉花相比，CBD處理的纖維素纖維仍保持完整。
檢測pH和NaCl濃度對(duì)CBD-ProtA對(duì)纖維素之結(jié)合容量的影響。將450μl CBD-ProtA(100μg)加到含有550μl含有不同緩沖液(含有不同濃度NaCl，即0、0.25、0.5、1M NaCl、1mg纖維素(Sigmacell 20)和1mg BSA)的試管中。在不時(shí)地混合的同時(shí)將試管于37℃保溫1小時(shí)，并以10,000g離心5分鐘。用它們的相應(yīng)緩沖液將沉淀物洗兩次。將40μl 6M鹽酸胍加到經(jīng)懸浮的沉淀中并于室溫下繼續(xù)保溫30分鐘。離心后，用780μl ddH2O稀釋20μl樣品并使用BioRad試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。圖15顯示低pH，漸增NaCl濃度可增加CBD-ProtA與纖維素的結(jié)合，以致達(dá)到70mg/g纖維素。
CBD改變植物組織的生長植物材料從Rehovot的苗圃得到桃(Prunus persica CV.Texas)的花。在開花期的第1天從花絲上切掉從花上出集的花藥，并在30℃至少脫水24小時(shí)。所釋放的花粉可以新鮮使用或者儲(chǔ)存在-20℃下。Arabidopsis thaliana的種子得自University Stock。
體外花粉萌發(fā)使花粉粒在各含100μl生長培養(yǎng)基之液體培養(yǎng)物的Eppendorf試管中發(fā)芽。按下述方法制得生長培養(yǎng)基使桃花粉粒在含有15％(w/v)蔗糖、100μg/ml H3BO3、200μg/mlMgSO47H2O和200μg/ml Ca(NO3)2·4H2O的生長培養(yǎng)基中發(fā)芽。向試管內(nèi)加入不同濃度的CBD或BSA。各試管中花粉粒的數(shù)量約為1,000個(gè)。每份處理作三次重復(fù)。在暗的小室內(nèi)25℃保溫過夜后，各標(biāo)品中以最少100個(gè)花粉粒的群體檢驗(yàn)花粉(每份處理300粒)。
種子萌發(fā)在蒸餾水中洗Arabidopsis taliana的種子。將每種處理的約100粒種子浸在加于直徑2cm和長10cm玻璃培養(yǎng)管內(nèi)的1ml蒸餾水中。將培養(yǎng)管放在溫度恒定在25℃的生長小室中并施加光/暗分別為16/8小時(shí)的光照周期。4天后，測出籽苗、莖、根和根毛(各籽苗中最長)的長度，以檢查不同處理對(duì)植物器官的影響。
組織化學(xué)研究以10,000g離心于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中含4％戊二醛固定過夜的生長培養(yǎng)基1分鐘，從此生長培養(yǎng)基中洗出加或不加CBD培養(yǎng)的桃花粉管。用同樣緩沖液洗花粉管，然后小心懸浮在加于同樣緩沖液內(nèi)的同體積的4％戊二醛中，并于4℃保留過夜。再次離心分離花粉管，用同樣緩沖液洗，再用蒸餾水洗，然后用熒光增白劑(calcofluor,0.1％在0.1M K3PO4)染色，以顯示結(jié)晶細(xì)胞壁成分。用黃光顯微鏡(RA Zeiss Oberkochen)進(jìn)行顯微觀察。以同樣方式處理擬南芥(Arabidopsis)籽苗，但其中改變了溶液使其不產(chǎn)生沉淀。
以免疫金-銀染色法(IGGSS)檢驗(yàn)桃花粉管和Arabidopsis籽苗，以證明CBD與纖維素的結(jié)合。首先用加在PBST(磷酸鹽緩沖鹽水TWEEN 2TM)中的4％戊二醛將植物材料固定過夜。用PBST洗樣品洗1小時(shí)，在1％脫脂乳中浸1小時(shí)，然后與在PBST中以1∶500稀釋的多克隆免抗CBD抗體保溫1小時(shí)。在PBST中將樣品洗3×10分鐘，然后與在PBST中以1∶100倍稀釋的連接有5nm金顆粒的羊抗兔IgG一起保溫1小時(shí)。用PBST將樣品洗2×10分鐘，然后在水中洗1次。使用銀染色藥盒(BioCell Research Laboratories)使反應(yīng)最后顯色。將樣品置于藥盒的合并的溶液中浸大約10分鐘，然后用足夠的蒸餾水洗。在光學(xué)顯微鏡下觀察樣品。
CBD對(duì)花粉管生長的影響圖19顯示與BSA(對(duì)照蛋白質(zhì))比較的CBD對(duì)花粉管長度的影響。不同的字母指示花粉管長度值之間的實(shí)質(zhì)上顯著的不同(P≤0.05)。此證明CBD促進(jìn)花粉管生長。BSA可能是借助滲透作用抑制花粉管生長。在這方面，以50μg/ml濃度獲礙的結(jié)果最為明顯，其中，CBD處理的花粉產(chǎn)生的花粉管增長幾乎是用50μg/ml BSA處理之花粉增長的2倍。
在檢測CBD之作用方式的嘗試中，用熒光增白劑(calcofluor)著染花粉管(CBD處理組和對(duì)照組)以顯示結(jié)晶細(xì)胞壁成分。圖20A和20B證明，如由在頂芽區(qū)沒有亮顏色所顯示的，CBD處理的花粉管產(chǎn)生了非結(jié)晶花粉管頂芽。頂芽區(qū)沒有堅(jiān)質(zhì)的結(jié)晶細(xì)胞壁可能有利于花粉管延長。對(duì)CBD處理的花粉管的金-免疫標(biāo)記證明，如由頂芽區(qū)上的密集的暗點(diǎn)所顯的，CBD沿著花粉管被結(jié)合。另外，還強(qiáng)有力地表明，在頂芽區(qū)沒有堅(jiān)硬的結(jié)晶細(xì)胞壁是由于CBD造成的。一個(gè)可能的機(jī)制是，CBD隨所形成的纖維素纖維插入，從而抑制結(jié)晶化過程。
CBD對(duì)根和根發(fā)生長的影響檢測CBD對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)籽苗之根生長的影響，結(jié)果如圖22所示。在高濃度時(shí)，CBD顯著地降低根長度，而較小濃度(100μg/ml)的BSA則沒有影響。不同的字母指示根長度值之間的實(shí)質(zhì)性顯著差異(≤0.05)。對(duì)莖干長度的影響顯示有相似的趨勢，但不象對(duì)根影響那么顯著，并且沒有實(shí)質(zhì)上的顯著性。對(duì)CBD處理的Arabidopsis thaliana籽苗的金-免疫標(biāo)記(圖23)顯示金標(biāo)記只限于根，而在莖干上則沒有顯示出標(biāo)記。用熒光增白劑(calcofluor)著染擬南芥(Arabidopsis thaliana)籽苗呈示出只表明可接近纖維素的根被著染(圖24)。在莖上沒有亮顏色表明染色不能穿透臘質(zhì)表皮，則解釋了為什么CBD對(duì)根有效，而對(duì)莖干無效。
高濃度(1×10-6至1×10-4μg/ml)CBD對(duì)根延長的抑制作用可解釋為纖維素的空間阻礙，從而通過松解堅(jiān)質(zhì)纖維索纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而阻止其接近酶如內(nèi)-葡聚糖酶或木糖葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長的蛋白質(zhì)。在低濃度時(shí)，CBD可增加細(xì)胞壁的結(jié)晶性，或者干擾木糖葡聚糖纖維素相互作用，從而阻止纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)。
本申請(qǐng)所描述的這些結(jié)果清楚地證明，可使用纖維素作為可溶性固相基質(zhì)，將CBD融合蛋白質(zhì)用于親和純化蛋白質(zhì)和酶。此外，基于上文的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然可以了解到CBD融合產(chǎn)物具有廣泛的潛在應(yīng)用，其中包括但不只限于親和純化方法及用于診斷試劑盒中。
微生物的寄存下列微生物于1993年4月12日寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockyille,MD)并給出如下指出的登記號(hào)微生物 登記號(hào)———————E.coli pCBD-ProtAl/2097 69283E.coli pET-CBD/BL21(DE3)69282E.coli pCBD-ProtAl 75443E.coli pET-CBD 75444
本文描述并提出權(quán)利要求的發(fā)明不只限于特定實(shí)施方案的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在舉例說明本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何等同的實(shí)施方案也將落入本發(fā)明范圍內(nèi)。除了本文顯示和所描述的這些實(shí)例外，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以根據(jù)上文的描述作出各種改動(dòng)。這些改動(dòng)也將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
還應(yīng)了解的是，所有給定的核苷酸和肽的堿基對(duì)和氨基酸殘基編號(hào)及大小都是近似的，并且只用于描述的目的。
本文所引用的許多參考文獻(xiàn)，均以其全文公開的方式插入本文作為本文參考文獻(xiàn)。
International Application No:PCT/Form PCT/RO/134(cont.)American Type Culture Collection12301 Parklawn OriveRockville,MD 20852USAccession No. Date of Deposit69283 April 12,199375443 April 12,199375444 April 12,199權(quán)利要求
1．一種纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，它包含纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)和第二蛋白，所述纖維素結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列是由圖1A-1B所示的氨基酸序列組成的。
2．一種纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，它包含纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)和第二蛋白，所述纖維素結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列由ATCC登記號(hào)為No.75444載體表達(dá)的CBD氨基酸序列組成。
3．一種纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，它包含纖維素結(jié)合區(qū)域和第二蛋白，所述纖維素結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列與圖1A-1B的氨基酸序列有至少80％的序列相似性，并且該纖維素結(jié)合區(qū)域能夠以高親和力與纖維素或殼多糖結(jié)合，基本上不含與之自然結(jié)合的其他蛋白。
4．一種纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)融合蛋白，它包含纖維素結(jié)合區(qū)域和第二蛋白，所述纖維素結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列與具有ATCC登記號(hào)No.75444的載體表達(dá)的氨基酸序列有80％的序列相似性，并且該纖維素結(jié)合區(qū)域能夠以高親和力與纖維素或殼多糖結(jié)合，基本上不含與之自然結(jié)合的其他蛋白。
5．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4的纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，其中第二蛋白是蛋白A、肝素酶、能夠降解環(huán)境污染物的酶、HSP蛋白、HSP抗體、交叉反應(yīng)性HSP相關(guān)蛋白或肽，或其抗原部分。
6．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4的纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，其中所說的第二蛋白是重組抗體。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，其包含纖維素結(jié)合區(qū)域-VL-VH。
8．根據(jù)要求權(quán)利要求1、2、3或4的纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，其中所說的第二蛋白是激素。
9．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4的纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，其中所說的第二蛋白是酶。
10．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4的纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白，其中所說的第二蛋白選自蛋白A、蛋白G、鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、Taq聚合酶、非Taq聚合酶、堿性磷酸酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、限制性酶、過氧化物酶、葡聚糖酶、殼多糖酶、β和α-葡糖苷酶、β和α-glucoronidase、淀粉酶、轉(zhuǎn)移酶、β-內(nèi)酰胺酶、非β-內(nèi)酰胺酶抗生素修飾和降解酶、熒光素酶、酯酶、脂酶、蛋白酶、細(xì)菌素、抗生素、酶抑制劑、生長因子、激素、受體、膜蛋白、核蛋白、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯因子及核酸修飾酶。
11．以登記號(hào)75443保藏于ATCC的質(zhì)粒pCBD-ProtA1。
12．包含編碼權(quán)利要求1、2、3或4的纖維素結(jié)合區(qū)域融合蛋白的核苷酸序列的重組載體。
13．以登記號(hào)No.69283保藏于ATCC的重組大腸桿菌pCBD-ProtAl/2097。
14．生產(chǎn)纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)融合產(chǎn)物的方法，該方法包括(a)提供編碼CBD融合產(chǎn)物的核酸，所說的CBD融合產(chǎn)物包含CBD和第二蛋白，所述CBD的氨基酸序列由圖1A-1B的氨基酸序列組成，所說的CBD能夠以高親和力結(jié)合纖維素或殼多糖，并且基本上不含與之自然結(jié)合的其他蛋白，并且所說的第二蛋白包含N末端和C末端；(b)用所說的核酸轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；以及(c)在適于表達(dá)所說的CBD融合產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的核酸還編碼所說纖維素結(jié)合區(qū)域融合產(chǎn)物中第二蛋白的N末端氨基酸上游的裂解位點(diǎn)。
16．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的核酸還編碼所說纖維素結(jié)合區(qū)域融合產(chǎn)物中第二蛋白的C末端氨基酸下游的裂解位點(diǎn)。
17．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的核酸還編碼所說纖維素結(jié)合區(qū)域融合產(chǎn)物中第二蛋白的N末端氨基酸上游的第一裂解位點(diǎn)，和所說纖維素結(jié)合區(qū)域融合產(chǎn)物中第二蛋白的C末端氨基酸下游的第二裂解位點(diǎn)。
18．生產(chǎn)纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)融合產(chǎn)物的方法，該方法包括(a)提供編碼CBD融合產(chǎn)物的核酸，所說的CBD融合產(chǎn)物包含CBD和第二蛋白，其中CBD的氨基酸序列由ATCC登記號(hào)為NO.75444的載體所表達(dá)的氨基酸序列組成，所說的CBD能夠以高親和力結(jié)合纖維素或殼多糖，并且基本上不含與之自然結(jié)合的其他蛋白，且所說的第二蛋白包含N末端和C末端；(b)用所說的核酸轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；以及(c)在適于表達(dá)所說的CBD融合產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
19．純化纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)融合產(chǎn)物的方法，該方法包括(a)在適于形成包含纖維素和所說重組CBD融合產(chǎn)物的不溶性結(jié)合復(fù)合物的條件下，使含有重組CBD融合產(chǎn)物的混合物與有效量的纖維素接觸，其中所說的融合產(chǎn)物包含CBD和第二種蛋白質(zhì)，且所說的CBD的氨基酸序列由圖1A-1B的氨基酸序列組成；(b)分離所說的不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物；和(c)從所說不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物中回收所說的CBD融合產(chǎn)物。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所說的纖維素由殼多糖替代。
21．根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所說的回收包括使所說的不溶性纖維素-纖維素結(jié)合區(qū)域融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物與釋放試劑接觸，并從所說的纖維素或殼多糖中分離出所釋放的纖維素結(jié)合區(qū)域融合產(chǎn)物。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所說的釋放試劑包括6M尿素或6M鹽酸胍。
23．根據(jù)權(quán)利要求15、16或17的方法，其進(jìn)一步包括使所說的纖維素結(jié)合區(qū)域融合產(chǎn)物與能夠裂解所說第一和/或第二裂解位點(diǎn)的裂解試劑接觸。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說的裂解試劑是酶。
25．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說的裂解試劑是化學(xué)裂解劑。
26．純化感興趣的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)在適于形成包含CBD融合產(chǎn)物和所說的嵌合探針的第一結(jié)合復(fù)合物的條件下，使包括下列組分的纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)融合產(chǎn)物與嵌合探針接觸(ⅰ)CBD，其氨基酸序列由圖1A-1B的氨基酸序列組成，或由ATCC登記號(hào)為No.75444的載體編碼，并且基本上不含與之自然結(jié)合的其他蛋白質(zhì)，及(ⅱ)能夠結(jié)合嵌合探針的第二種蛋白質(zhì)，所說的嵌合探針能夠進(jìn)一步結(jié)合感興趣的蛋白質(zhì)。(b)在適于形成包含所說的第一結(jié)合復(fù)合物和所說的感興趣的蛋白質(zhì)之第二結(jié)合復(fù)合物的條件下，使第一結(jié)合復(fù)合物與所說的感興趣的蛋白質(zhì)接觸；(c)在適于形成包含纖維素和所說的第二結(jié)合復(fù)合物的第三不溶性結(jié)合復(fù)合物的條件下，使所說的第二結(jié)合復(fù)合物與有效量的纖維素接觸(d)從所說的不溶性結(jié)合復(fù)合物中回收所說的感興趣的蛋白質(zhì)。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其進(jìn)一步包括在從所說的不溶性結(jié)合復(fù)合物中回收所說的感興趣的蛋白質(zhì)之前，先分離所說的不溶性結(jié)合復(fù)合物。
28．根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說的第二種蛋白質(zhì)包括鏈霉抗生物素蛋白且所說的嵌合探針包括生物素。
29．純化感興趣蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在適于形成包含CBD融合產(chǎn)物和第三種蛋白質(zhì)的第一結(jié)合復(fù)合物的條件下，使包括下列組分的CBD融合產(chǎn)物與第三種蛋白接觸(ⅰ)CBD，其氨基酸序列由圖1A-1B的氨基酸序列組成，或由ATCC登記號(hào)為No.75444的載體編碼，并且基本上不含與之自然結(jié)合的其他蛋白質(zhì)，和(ⅱ)能夠結(jié)合第三種蛋白質(zhì)的第二種蛋白質(zhì)，其中所說的第三種蛋白質(zhì)能夠進(jìn)一步結(jié)合感興趣的蛋白質(zhì)，(b)在適于形成包含所說的第一結(jié)合復(fù)合物和所說的感興趣之蛋白質(zhì)的第二結(jié)合復(fù)合物的條件下，使第一結(jié)合復(fù)合物與感興趣的蛋白質(zhì)接觸；(c)在適于形成包含纖維素和所說的第二結(jié)合復(fù)合物之第三不溶性結(jié)合復(fù)合物的條件下，使所說的第二結(jié)合復(fù)合物與有效量的纖維素接觸；以及(d)從所說的不溶性結(jié)合復(fù)合物中回收所說的感興趣的蛋白質(zhì)。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所說的第二種蛋白質(zhì)是A蛋白且所說的第三種蛋白質(zhì)是IgG。
31．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其進(jìn)一步包括在從所說的不溶性結(jié)合復(fù)合物中回收所說的感興趣的蛋白質(zhì)之前，先分離所說的不溶性結(jié)合復(fù)合物。
32．純化纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)融合產(chǎn)物的方法，其包括(a)在適于形成包含纖維素和所說的重組CBD融合產(chǎn)物的不溶性結(jié)合復(fù)合物的條件下，使包含重組CBD融合產(chǎn)物的混合物與有效量的纖維素接觸，其中所說的重組CBD融合產(chǎn)物包含CBD和第二種蛋白質(zhì)，所說CBD的氨基酸序列由具有ATCC登記號(hào)No.75444的載體所表達(dá)的氨基酸序列組成；(b)分離所說的不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物；以及(c)從所說的不溶性纖維素-CBD融合產(chǎn)物結(jié)合復(fù)合物中回收所說的CBD融合產(chǎn)物。
33．固定包含CBD和第二種蛋白質(zhì)的纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)融合產(chǎn)物的方法，其中所說CBD的氨基酸序列由圖1A-1B所示的氨基酸序列組成，該方法包括在適于形成包含纖維素和所說CBD融合產(chǎn)物之不溶性結(jié)合復(fù)合物的條件下，使包括CBD融合產(chǎn)物的混合物與有效量的纖維素接觸。
34．根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所說的第二種蛋白質(zhì)選自蛋白A、蛋白G、鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、Taq聚合酶、非Taq聚合酶、堿性磷酸酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、限制性酶、過氧化物酶、葡聚糖酶、殼多糖酶、β和α葡糖苷酶、β和α glucoronidase、淀粉酶、轉(zhuǎn)移酶、β-內(nèi)酰胺酶、非β-內(nèi)酰胺酶、抗生素修飾和降解酶、熒光素酶、酯酶、脂酶、蛋白酶、細(xì)菌素、抗生素、酶抑制劑、生長因子、激素、受體、膜蛋白質(zhì)、核蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯因子及核酸修飾酶。
35．根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所說的第二種蛋白質(zhì)是酶。
全文摘要
公開了對(duì)結(jié)晶纖維素和殼多糖有高親和性的纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD),及其分子克隆和重組體生產(chǎn)方法。還描述了包括CBD和第二種蛋白質(zhì)的融合產(chǎn)物。預(yù)期CBD和融合產(chǎn)物具有藥物釋放、親和分離及診斷技術(shù)等多方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/00GK1217339SQ9811844
公開日1999年5月26日 申請(qǐng)日期1994年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月14日
發(fā)明者O·索塞耶夫, I·施皮爾, R·H·多伊, M·A·戈斯坦 申請(qǐng)人:加州大學(xué)評(píng)議會(huì), 耶路撒冷希伯來大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司