專利名稱：新型ifn受體1結(jié)合蛋白質(zhì),編碼它們的dna,以及調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)干擾素的反應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及干擾素作用的細(xì)胞機(jī)制，具體地說(shuō)，涉及新型干擾素受體1-結(jié)合蛋白質(zhì)，編碼它們的重組DNA，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)干擾素的反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
I型干擾素(IFN-α和-β亞型)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種效應(yīng)，例如抑制病毒復(fù)制(抗病毒效應(yīng))，抑制細(xì)胞增值(抗腫瘤效應(yīng))和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性(免疫調(diào)節(jié)效應(yīng))。干擾素(IFN)的這些多種效應(yīng)與細(xì)胞的形態(tài)和生化修飾相關(guān)(Revel，1984，綜述)。
干擾素通過(guò)種類特異性的受體發(fā)揮它們的活性。對(duì)于I型IFN來(lái)說(shuō)，已鑒定出兩種跨膜受體鏈IFNAR1(Uze等，1990)和IFNAR2-2(或者IFNAR2-c，Domanski等，1995)。由IFN-α，β，ω產(chǎn)生的信號(hào)的傳導(dǎo)涉及Janus激酶(Jak)家族的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和Stat家族的轉(zhuǎn)錄因子(Darnell等，1994)。Jak-Stat途徑的蛋白質(zhì)通過(guò)結(jié)合到IFNAR1和IFNAR2受體鏈的胞質(zhì)內(nèi)(IC)區(qū)域上而被激活。在結(jié)合到IFNAR1 IC區(qū)域的蛋白質(zhì)中有tyk2和Stat2(Abramovich等，1994)。Stat2然后與Stat1結(jié)合形成IFN-誘導(dǎo)的ISGF3轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，它激活I(lǐng)FN-誘導(dǎo)的基因(Leung等，1995)。含有Stat3的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體也由IFN-β誘導(dǎo)(Harroch等，1994)并且觀察到Stat3與IFNAR1的IFN-依賴性結(jié)合(Yang等，1996)。蛋白質(zhì)-酪氨酸磷酸酶PTP1C和D在加入IFN之后與IFNAR1可逆地結(jié)合(David等，1995a)。此外，兩個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，48kDa的ERK2 MAP激酶(David等，1995b)和cAMP激活的蛋白質(zhì)激酶A(David等，1996)結(jié)合至分離的IFNAR1-IC的膜-附近50個(gè)殘基上。因而，I型IFN受體IC區(qū)域充當(dāng)多個(gè)蛋白質(zhì)的錨定位點(diǎn)，其作用是產(chǎn)生和調(diào)節(jié)IFN在細(xì)胞上的生物效應(yīng)。
酵母中的雙-雜種篩選對(duì)于鑒定與特定的多肽序列結(jié)合的新的蛋白質(zhì)是一種有效的方法(Fields和Song，1989)。簡(jiǎn)而言之，雙-雜種篩選是通過(guò)用(a)一種質(zhì)粒DNA，其中特定的多肽(誘餌)與Gal4轉(zhuǎn)錄因子的DNA-結(jié)合區(qū)域融合，和(b)一種cDNA文庫(kù)，它與pACT質(zhì)粒中的Gal4的激活區(qū)域融合，來(lái)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞而進(jìn)行的。用編碼與多肽誘餌結(jié)合的蛋白質(zhì)的cDNA轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞將重建Gal4活性。這種與多肽誘餌結(jié)合的蛋白質(zhì)的存在通過(guò)從優(yōu)選被導(dǎo)入酵母基因組的lacZ構(gòu)建體的一種酶活性的表達(dá)被顯現(xiàn)出來(lái)，例如β-半乳糖苷酶。從在這一測(cè)試中為陽(yáng)性的酵母克隆，可能分離出pACT質(zhì)粒，來(lái)確定其插入物的核苷酸序列，并鑒定它編碼的蛋白質(zhì)。通過(guò)這一方法已鑒定出了與細(xì)胞因子受體的IC區(qū)域相互作用的新型蛋白質(zhì)(Boldin等，1995)。
本文中對(duì)文獻(xiàn)的引述并不是承認(rèn)這些文獻(xiàn)是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，也不是認(rèn)為對(duì)本申請(qǐng)中的任何一個(gè)權(quán)利要求有實(shí)質(zhì)性的影響。關(guān)于對(duì)任何一個(gè)文獻(xiàn)的內(nèi)容或日期的引述均基于提交本申請(qǐng)時(shí)申請(qǐng)人可以得到的信息，并不構(gòu)成對(duì)這種引述的正確性的承認(rèn)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及兩種新型的人類蛋白質(zhì)，本文稱作IR1B1和IR1B4，它們已被鑒定為IFN受體1(IFNAR1)結(jié)合蛋白質(zhì)，并涉及編碼這兩種蛋白質(zhì)的DNA。IR1B1和IR1B4蛋白質(zhì)中的每一種與IFNAER1的胞質(zhì)內(nèi)(IC)區(qū)域相互作用，并介導(dǎo)對(duì)干擾素的細(xì)胞響應(yīng)。
本發(fā)明涉及含有編碼IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)的核苷酸序列，或其片斷，的重組DNA分子，以及它們編碼的蛋白質(zhì)。在該重組DNA分子中，編碼IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)的核苷酸序列，或其片斷，是在有意方向上或反義方向上與一種啟動(dòng)子相連。
通過(guò)直接將含有與編碼一種新型的IFNAR1結(jié)合蛋白質(zhì)在有意方向上可操縱連接的啟動(dòng)子的重組DNA分子施用于腫瘤，可提高腫瘤的治療中對(duì)外源干擾素療法的響應(yīng)。
而且，本發(fā)明也涉及一種在對(duì)病人進(jìn)行移植前，通過(guò)在移植組織中導(dǎo)入含有與編碼一種新型的IFNAR1結(jié)合蛋白質(zhì)的核苷酸序列在反義方向上可操縱連接的啟動(dòng)子的重組分子，或其片斷，來(lái)延長(zhǎng)移植組織存活性的方法。
因而，本發(fā)明也涉及含有這種DNA，RNA或蛋白質(zhì)的藥物組合物，以及使用它們的治療方法。
本發(fā)明也涉及特異于本發(fā)明的新型蛋白質(zhì)的抗體。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示由酵母中的雙-雜種遺傳相互作用分析方法測(cè)得的IR1B1與IFNAR1-IC區(qū)域的相互作用。在該圖的下部方框中，顯示了與各種“誘餌”相組合的pACT中的cDNA插入物。
圖2顯示由酵母中的雙-雜種遺傳相互作用分析方法測(cè)得的IR1B4與IFNAER1-IC區(qū)域相互作用。在該圖的下部方框中，顯示了與各種“誘餌”相組合的pACT中的cDNA插入物。
圖3顯示IR1B1的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ IDNO2)。
圖4顯示IR1B1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)與兩種鈣結(jié)合蛋白質(zhì)，鈣調(diào)磷酸酶B(簡(jiǎn)稱CALB；SEQ ID NO3)和鈣牽蛋白(簡(jiǎn)稱CATR；SEQ IDNO4)，的氨基酸序列的同源性和線性排列。在IR1B1和CALB或CALB和CATR之間相同的氨基酸由它們之間的符號(hào)“”表示。在IR1B1和CATR之間相同，但與CALB不相同時(shí)由符號(hào)“”表示。由粗體表示的區(qū)域?yàn)殁}結(jié)合螺旋-環(huán)-螺旋EF-手性區(qū)域。
圖5顯示人骨髓瘤U226S細(xì)胞中的IR1B1 mRNA和18S rRNA(較低的一行)與IR1B1 cDNA雜交的Northern印跡以及用INF-α8或者INF-β處理細(xì)胞2至18小時(shí)后IR1B1的快速和瞬間誘導(dǎo)。第一行是沒有INF處理2小時(shí)后的對(duì)照。
圖6A和6B是SDS-PAGE電泳泳道，顯示IR1B4與分離的IFNAR1-IC區(qū)域(圖6A)和與人U266S細(xì)胞和U266R細(xì)胞膜(圖6B)提取物的體外相互作用。在圖6A中，具有或沒有旗IR1B4體外轉(zhuǎn)錄物的[S35]甲硫氨酸-標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物被用抗-旗M2珠(泳道1和4)免疫沉淀(10μl)，或與谷胱甘肽珠反應(yīng)(50μl)，該甘谷胱甘肽珠與融合于100氨基酸的長(zhǎng)IFNAR1區(qū)域(泳道2和5)的GST偶聯(lián)，或者僅與GST(泳道3和6)偶聯(lián)。在4℃過(guò)夜溫浴(終體積100μl)之后，將珠洗滌，并在SDS-PAGE之前在還原條件下沸煮SDS-洗提的蛋白質(zhì)。在圖6B中，將U266S(泳道1)或者U266R細(xì)胞(泳道2)用Brij緩沖液和抗蛋白酶(Abramovich等，1994)抽提，并將0.35ml(107細(xì)胞)用75μl的旗-IR1B4轉(zhuǎn)錄物的[35S]甲硫氨酸標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物在4℃過(guò)夜溫浴。將固定在蛋白質(zhì)G珠上的抗-IFNAR1單克隆抗體R3(25μl)加入2.5小時(shí)，在Brij緩沖液中洗滌，并用SDS-PAGE分析SDS-洗提的，沸煮的和還原的蛋白質(zhì)。電泳一個(gè)如上所述的用抗-旗M2珠的對(duì)照(泳道3)。在一個(gè)Phosphor-Imager中觀察干燥的膠。在圖6A的前三個(gè)泳道中，在體外翻譯反應(yīng)中沒有加入IR1B4 mRNA。在圖6A的下面三個(gè)泳道中，編碼融合于旗蛋白質(zhì)的IR1B4蛋白質(zhì)的mRNA在一個(gè)體外系統(tǒng)中被翻譯。
圖7顯示IR1B4的核苷酸序列(SEQ ID NO7)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖8顯示IR1B4(SEQ ID NO8)和PRMT1(SEQ ID NO9)的氨基酸排列以及它們的差異。
圖9顯示IR1B4和HCP-1(SEQ ID NO10)的氨基酸排列以及它們的差異。
圖10顯示一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶測(cè)試。將U266S細(xì)胞與用蛋白質(zhì)A和抗-IFNAR1抗體(泳道1)或者僅用蛋白質(zhì)A(泳道2)涂覆的珠進(jìn)行反應(yīng)。甲基轉(zhuǎn)移酶活性是通過(guò)將組蛋白用14C(甲基)-S-腺苷基甲硫氨酸標(biāo)記并分析SDS-PAGE電泳中組蛋白帶的放射性進(jìn)行測(cè)量的。
圖11顯示一個(gè)在U266S細(xì)胞中蛋白質(zhì)-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的測(cè)試。在泳道1中，人U266S細(xì)胞的蛋白質(zhì)-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性是通過(guò)具有SEQID NO11的序列的肽R1的甲基化測(cè)量的。在泳道2中，加入了SEQ ID NO12的反義寡核苷酸，它與IR1B4 cDNA的啟始密碼子附近的核苷酸12-33的序列互補(bǔ)。在泳道3中，加入了相應(yīng)的有意寡核苷酸?？梢钥闯?，反義寡核苷酸基本上抑制了蛋白質(zhì)-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性，而對(duì)照的有意寡核苷酸具有很小的效果。
圖12顯示人U266S細(xì)胞在圖11(AS-1)中使用的反義寡核苷酸，相應(yīng)的有意寡核苷酸(S-3)，和另一個(gè)指向IR1B4 cDNA(AS-2)的中間部分的反義寡核苷酸的存在或不存在下，在響應(yīng)IFN-β治療時(shí)的生長(zhǎng)抑制。細(xì)胞密度是通過(guò)使用Alamar Blue(見實(shí)施例7)的顯色測(cè)試進(jìn)行定量的，細(xì)胞密度的降低是使用沒有處理的對(duì)照孔的百分比計(jì)算的，并以生長(zhǎng)抑制作圖。
本發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明涉及兩種新型人蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，它們與干擾素1型(IFN-α，β或ω)受體的IFNAR1鏈的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(IC)相互作用，在本文中被稱為IFN受體結(jié)合蛋白質(zhì)1(IR1B1)和IFN受體結(jié)合蛋白質(zhì)4(IR1B4)。這兩種新型蛋白質(zhì)與IFNAR1的相互作用用酵母中的雙-雜種遺傳測(cè)試被顯示出來(lái)，其中，只有當(dāng)IFNAR1-IC區(qū)域(與Gal4 DNA-結(jié)合區(qū)域融合)被用作誘餌時(shí)，用與Gal4激活區(qū)域融合的IR1B1或IR1B4 cDNA對(duì)酵母報(bào)告菌株SFY526(Bartel等，1993)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生β-半乳糖苷酶活性。
IR1B1 cDNA序列編碼一種191氨基酸的多肽。序列數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)檢索顯示IR1B1是一種新型蛋白質(zhì)，它顯示出與鈣結(jié)合蛋白質(zhì)，鈣調(diào)磷酸酶β和鈣牽蛋白具有顯著的同源性，例如鈣結(jié)合位點(diǎn)(E-F把手)。鈣調(diào)磷酸酶β(Guerini等，1989)是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的19kDa亞基，它在激活轉(zhuǎn)錄因子NFAT到T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位起著重要的作用，并且它被免疫抑制藥物例如環(huán)孢酶素抑制。鈣牽蛋白(Lee和Huang，1993)，一種21kDa蛋白質(zhì)，是一種發(fā)現(xiàn)于中心體的細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)，在有絲分裂期間參與染色體的運(yùn)動(dòng)，并更多地參與微管組織中心。因而，新型的IR1B1蛋白質(zhì)是鈣調(diào)蛋白的鈣調(diào)磷酸酶和鈣牽蛋白家族中的一個(gè)新的成員。
IR1B1的基因被意外地發(fā)現(xiàn)在人細(xì)胞中被IFN治療快速激活。因而，這是第一個(gè)被IFN誘導(dǎo)的鈣-結(jié)合蛋白的例子。由于鈣離子調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)，粘連和分裂，調(diào)節(jié)細(xì)胞中IR1B1的活性可影響普通和惡性細(xì)胞對(duì)IFN的響應(yīng)。IR1B1在介導(dǎo)細(xì)胞中IFN的活性中的作用由于IR1B1與IFN受體鏈的IC-區(qū)域的相互作用而得到支持。
雖然IR1B4與IR1B1一樣，通過(guò)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)檢索被確定為一種新型的蛋白質(zhì)，但也發(fā)現(xiàn)，IR1B4與使用S-腺苷基甲硫氨酸使蛋白質(zhì)中的精氨酸殘基甲基化的酶具有同源性，并被稱為蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT1；Kagan和Clarke，1994；Lin等，1996)。發(fā)現(xiàn)IR1B4在體外直接與IFNAR1的IC-區(qū)域結(jié)合，并且通過(guò)組蛋白的甲基化證實(shí)了PRMT活性與從人細(xì)胞中分離出的IFN-α，β受體的組成型聯(lián)系。當(dāng)將來(lái)自IR1B4的反義寡核苷酸加入人細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)，觀察到細(xì)胞培養(yǎng)物中PRMT活性的喪失。以這種方式處理的人骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)生長(zhǎng)抑制測(cè)量顯示對(duì)IFN的響應(yīng)極大地降低。因而，IR1B4/PRMT參與IFN受體在腫瘤細(xì)胞中造成生長(zhǎng)抑制的途徑中，并且也參與IFN受體的其它功能中。已知的PRMT底物包括一些RNA和DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，特別是異源核核糖核蛋白(hnRNP)。這種hnRNP參與mRNA從細(xì)胞核到胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)，前-mRNA的其它剪切，和轉(zhuǎn)錄后控制(Liu和Dreyfuss，1995)。因而，由于其與IFN受體相關(guān)聯(lián)而被發(fā)現(xiàn)的該新型人類IR1B4/PRMT cDNA和蛋白質(zhì)，可用來(lái)改變?nèi)祟惢騽?dòng)物細(xì)胞對(duì)IFN的響應(yīng)。
按照本發(fā)明的重組DNA分子含有編碼IR1B1和IR1B4蛋白質(zhì)的核苷酸序列，或其片斷，并可被用于通過(guò)提高IR1B1或IR1B4的表達(dá)提高細(xì)胞對(duì)IFN的響應(yīng)，或者通過(guò)使用反義RNA分子降低IR1B1或IR1B4的表達(dá)來(lái)降低細(xì)胞對(duì)IFN的響應(yīng)。
IR1B1或IR1B4 cDNA提高的體內(nèi)表達(dá)可用于腫瘤治療，其中對(duì)IFN提高的細(xì)胞響應(yīng)將導(dǎo)致惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的降低并提高對(duì)外源IFN治療的響應(yīng)。為了提高IR1B1和IR1B4在體內(nèi)靶位點(diǎn)的表達(dá)，從而提高對(duì)IFN的細(xì)胞響應(yīng)，可在諸如腦腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)(如黑素瘤或乳房癌)的靶位點(diǎn)直接注入含有IR1B1和IR1B4 cDNA的表達(dá)載體，該IR1B1和IR1B4與一種強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子在有意方向上可操縱連接。
反過(guò)來(lái)，IR1B1和IR1B4在體內(nèi)表達(dá)的降低可用于延長(zhǎng)移植組織的存活，因?yàn)檫@些移植物在宿主體內(nèi)的排斥是由組織相容性抗原(MHC I型)介導(dǎo)的，其合成依賴于IFN的刺激。當(dāng)適當(dāng)?shù)妮d體上攜帶的并以反義方向與一種啟動(dòng)子可操縱連接的IR1B1和IR1B4的cDNA或其片斷被導(dǎo)入待移植的組織細(xì)胞中時(shí)，反義RNA的表達(dá)導(dǎo)致IR1B1或IR1B4 mRNA(或IR1B1/IR1B4有義RNA)的降解，從而降低細(xì)胞中IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)的水平。
反義RNA是從與在反義方向上定向的編碼序列可操縱連接的啟動(dòng)子上游進(jìn)行翻譯的，即與DNA的正?；蛴辛x方向及其轉(zhuǎn)錄的有義RNA(mRNA)相反。與有義RNA互補(bǔ)的反義RNA的表達(dá)是一個(gè)調(diào)節(jié)RNA分子的生物學(xué)功能的強(qiáng)有力的方法。通過(guò)有義RNA和反義RNA之間形成的穩(wěn)定的雙螺旋，使正常的和有義RNA轉(zhuǎn)錄物失去活性并且不能被翻譯。
作為本發(fā)明實(shí)施方案的重組DNA分子含有與一種啟動(dòng)子在有義或反義方向上可操縱連接的IR1B1或IR1B4 cDNA，或其片斷。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”包括一種可結(jié)合RNA聚合酶并啟始“可操縱連接”的核酸序列轉(zhuǎn)錄的雙鏈DNA或RNA序列。因而，如果啟動(dòng)子能夠使DNA序列轉(zhuǎn)錄，而不管該DNA序列的定向，則該DNA序列是與該啟動(dòng)子可操縱連接的。
用于控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的類型可以是任何一種在宿主/靶細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子的例子包括SV40早期啟動(dòng)子，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子，單純皰疹(HSV)胸苷激酶啟動(dòng)子，魯斯氏肉瘤(RSV)LTR啟動(dòng)子，人細(xì)胞肥大病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子，鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)LTR啟動(dòng)子，干擾素β啟動(dòng)子，熱休克蛋白70(hsp70)啟動(dòng)子，以及現(xiàn)有技術(shù)中已知的許多其它的啟動(dòng)子。
與IR1B1或IR1B4 cDNA在有義方向上可操縱連接用于表達(dá)IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子最好是一種強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子。這樣可產(chǎn)生高水平的IR1B1或IR1B4，而不管調(diào)節(jié)IR1B1或IR1B4表達(dá)的內(nèi)源性細(xì)胞機(jī)制是否存在。
同樣，與IR1B1或IR1B4 cDNA在反義方向上可操縱連接的啟動(dòng)子最好是一種強(qiáng)的啟動(dòng)子，例如存在于Epstein-Barr病毒(EBV)調(diào)節(jié)區(qū)域中可使反義RNA高水平表達(dá)的啟動(dòng)子(Deiss和Kimchi，1991)。
該反義序列優(yōu)選僅在宿主/靶細(xì)胞中表達(dá)，該宿主/靶細(xì)胞優(yōu)選為人類細(xì)胞并且該表達(dá)的反義RNA應(yīng)是穩(wěn)定的(即不迅速降解)。該反義RNA應(yīng)僅特異地與宿主/靶細(xì)胞中表達(dá)的有義mRNA雜交，并形成基本上不被翻譯的穩(wěn)定的雙螺旋RNA分子。也就是說(shuō)，在宿主/靶細(xì)胞中表達(dá)的反義RNA阻止表達(dá)的有義Mrna翻譯成IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)。載體攜帶的反義序列可以攜帶整個(gè)的IR1B1或IR1B4 cDNA序列或者僅僅它們的一部分，只要該反義部分能夠與有義mRNA雜交，從而防止其被翻譯成IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)。因而，在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中使用的“反義”被定義為一種能夠在轉(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)，并也能夠特異地與“有義”IR1B1或IR1B4 mRNA雜交形成不可翻譯的雙鏈RNA分子的整個(gè)反義序列或其一部分。
反義序列并不需要與完整長(zhǎng)度的IR1B1或IR1B4 mRNA雜交。而是它可以與選定的區(qū)域，例如該“有義”mRNA的5’-不翻譯的非編碼序列，編碼序列，或3’-不翻譯序列，相雜交。優(yōu)選該反義序列與5’-編碼序列和/或5’非編碼序列，例如帽和起始密碼子位點(diǎn)，相雜交，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)在很多實(shí)例中靶擊起始密碼子的反義寡核苷酸更為有效，而靶擊編碼區(qū)域中的中間序列不是同樣有效(Wickstrom，1991)。一種反義序列在阻止IR1B4有義mRNA的翻譯中的有效性可容易地通過(guò)實(shí)施例7中所述的U266S細(xì)胞中蛋白質(zhì)-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的測(cè)試來(lái)檢測(cè)?？紤]到哺乳動(dòng)物基因組的大小，反義IR1B1或IR1B4序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少17，更優(yōu)選為至少30個(gè)堿基對(duì)。但是較短的序列也可使用，即，它們或者幸運(yùn)地不與其它的哺乳動(dòng)物序列雜交，或者這種“交叉雜交”不影響細(xì)胞的代謝，其方式和程度不妨礙本發(fā)明的目的的實(shí)現(xiàn)。
通過(guò)系統(tǒng)的試驗(yàn)可快速地確定優(yōu)選的雜交靶和優(yōu)選的反義序列的長(zhǎng)度。標(biāo)準(zhǔn)的方法描述于例如Ausubel等編，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，GreenePublishing Assoc.，New York，N.Y.，1987-1996，和Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港出版社，冷泉港，NY(1989)，這些方法可用于從載體中系統(tǒng)地除去大部分的反義序列。除了全長(zhǎng)的反義序列，可以產(chǎn)生一系列的交錯(cuò)缺失，優(yōu)選在反義序列的5’-端。這樣產(chǎn)生了一系列的截短的反義序列，它們?nèi)匀槐Ａ襞c優(yōu)選的有義mRNA的5’-端的互補(bǔ)性，結(jié)果，仍然形成一種在有義mRNA的5’-端(與反義RNA的3’-端互補(bǔ))為雙鏈的RNA分子并保持不可翻譯性。而且，反義寡核苷酸，例如寡核苷酸AS-1(SEQ IDNO12)可通過(guò)化學(xué)方法容易地合成，并被導(dǎo)入載體中與一種啟動(dòng)子可操縱地連接，以降低體內(nèi)細(xì)胞對(duì)IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)的表達(dá)。
本發(fā)明的載體可以是任何一種合適的通常用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的真核或原核載體，例如，現(xiàn)有技術(shù)中已知的游離型，可復(fù)制，或可整合進(jìn)染色體的載體。用于IR1B1或IR1B4反義RNA表達(dá)的特定的優(yōu)選的載體是含有EB病毒調(diào)節(jié)區(qū)域的游離載體(Deiss和Kimchi，1991)，該調(diào)節(jié)區(qū)充當(dāng)與相對(duì)于該調(diào)節(jié)區(qū)反義方向安排的IR1B1或IR1B4 cDNA可操縱連接的啟動(dòng)子。反義載體和寡核苷酸硫代磷酸酯的應(yīng)用描述于Annals of the New Yorkof ScienceGene Therapy for Neoplastic Disease，eds.B.E.Huber和J.S.Lazo，Vol.716，1994(e.g.Milligan等，第228-241頁(yè))。
按照本發(fā)明，被移植到需要移植的病人身上的組織或器官的存活可通過(guò)降低對(duì)IFN的細(xì)胞響應(yīng)來(lái)延長(zhǎng)。移植組織的排斥是通過(guò)組織相容性抗原介導(dǎo)的，而這些MHC I型抗原的合成依賴于IFN的刺激。因而，對(duì)IFN刺激的細(xì)胞響應(yīng)的降低將延長(zhǎng)移植組織的存活。按照本發(fā)明的延長(zhǎng)移植組織存活的方法包括向待對(duì)病人移植的組織或器官的細(xì)胞中導(dǎo)入一種重組DNA分子，該重組DNA分子含有一種以反義方向與一種啟動(dòng)子可操縱連接的IR1B1或IR1B4 cDNA序列或其片段，從而使這些被轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)反義IR1B1或IR1B4 RNA。該重組DNA分子可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何一種適用于這一目的的方法導(dǎo)入組織或器官的細(xì)胞中。在該重組DNA分子被導(dǎo)入組織或器官的細(xì)胞中之后，該組織或器官可被移植到需要移植的病人的身上。
含有一種重組DNA分子的藥物組合物可被直接注射進(jìn)腫瘤中，例如腦腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)，該重組DNA分子是一種表達(dá)載體并攜帶以有義方向與一種啟動(dòng)子可操縱連接的IR1B1或IR1B4 cDNA，從而使這些腫瘤中的細(xì)胞對(duì)作為癌癥治療的外源性IFN治療的響應(yīng)提高。對(duì)外源性IFN治療的細(xì)胞響應(yīng)的提高將導(dǎo)致惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
對(duì)體內(nèi)或體外的基因轉(zhuǎn)移已有很多報(bào)道，例如，Annals of the New YorkAcademy of SciencesGene Therapy for Neoplastic Diseases，Vol.716，1994；參見例如，“用于理解和治療人類疾病的直接基因轉(zhuǎn)移”G.E.Plautz，第144至153頁(yè)，和”p53腫瘤抑制物的作用機(jī)制和通過(guò)重建p53功能進(jìn)行癌癥基因治療的前景”Roemer等，第265-282頁(yè)。將重組DNA分子插入待移植的組織或器官的細(xì)胞中或腫瘤中的方法包括腺病毒，逆病毒，腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體，以及直接的DNA注射或者寡核苷酸-脂質(zhì)體注射。將逆病毒載體注射進(jìn)腦瘤或者將腺病毒用于感染囊纖維化病人的上呼吸道細(xì)胞的臨床試驗(yàn)是眾所周知的。
含有編碼IR1B1或IR1B4 cDNA或其片段的重組DNA分子的藥物組合物包括其中含有為達(dá)到本發(fā)明目的的有效量的該重組DNA分子的所有組合物，所說(shuō)的IR1B1或IR1B4 cDNA或其片段相對(duì)于可操縱連接的啟動(dòng)子是在有義或反義方向上的。此外，該藥物組合物可含有適當(dāng)?shù)乃幬锟山邮艿妮d體或賦形劑，以穩(wěn)定該重組DNA分子或者便于施用。
本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案是包括特異于IFNAR1-結(jié)合蛋白質(zhì)IR1B1或IR1B4或其片段的抗體的抗原結(jié)合部分的分子在診斷中的應(yīng)用，例如，用于檢測(cè)活組織檢測(cè)中獲得的腫瘤組織中IR1B1或IR1B4蛋白質(zhì)的水平的免疫檢測(cè)方法，或用于蛋白質(zhì)純化的親和層析。
術(shù)語(yǔ)“抗體”包括多克隆抗體，單克隆抗體(mAbs)，嵌合抗體，抗特異型(anti-Id)抗體，單鏈抗體，和聯(lián)合制備的人源化抗體，以及已通過(guò)任何一種已知的技術(shù)，例如，但不限于，酶切，肽合成或重組技術(shù)得到的它們的活性片段。
多克隆抗體是來(lái)自用一種抗原免疫的動(dòng)物的血清的一群異源性抗體分子。單克隆抗體含有特異于抗原的基本上同源的抗體群，該抗體群含有基本上相似的抗原決定基結(jié)合位點(diǎn)。單克隆抗體可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人已知的方法獲得。參見，例如，Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；美國(guó)專利第4376110號(hào)，Ausubel等編，同上文獻(xiàn)，Harlow和Lane抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)；和Colligan等編，當(dāng)代免疫學(xué)方法，Greene Publishing Assoc.和WileyInterscience，N.Y.，(1992，1993)，其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。這些抗體可以屬于任何免疫球蛋白族，包括IgG，IgM，IgE，IgA，GILD和它們的任何一個(gè)亞族。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以培養(yǎng)在體外，原位或體內(nèi)。優(yōu)選使用在體內(nèi)或在原位高滴度生產(chǎn)單克隆抗體的方法。
嵌合抗體是不同的部分來(lái)源于不同種動(dòng)物的分子，例如具有來(lái)自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白的恒定區(qū)的分子。嵌合抗體主要應(yīng)用于降低免疫源性并提高產(chǎn)率的情況下，例如，當(dāng)鼠單克隆抗體在雜交瘤中具有高的產(chǎn)率但在人中具有高的免疫源性的情況下，使用人/鼠嵌合單克隆抗體。嵌合單克隆抗體及其制備方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的(Cabilly等，美國(guó)科學(xué)院院刊813273-3277(1984)；Morrison等，美國(guó)科學(xué)院院刊816851-6855(1984)；Boulianne等，Nature 312643-646(1984)；Cabilly等，歐洲專利申請(qǐng)125023(1985年11月14日公開)；Neuberger等，Nature314268-270(1985)；Taniguchi等，歐洲專利申請(qǐng)171496(1985年2月19日公開)；Morrison等，歐洲專利申請(qǐng)173494(1986年3月5日公開)；Neuberger等，PCT申請(qǐng)WO8601533，(1986年3月13日公開)；Kudo等，歐洲專利申請(qǐng)184187(1986年6月11日公開)；Morrison等，歐洲專利申請(qǐng)173494(1986年3月5日公開)；Sahagan等，免疫學(xué)雜志，1371066-1074(1986)；Robinson等，國(guó)際專利申請(qǐng)，WO9702671(1987年5月7日公開)；Liu等，美國(guó)科學(xué)院院刊843439-3443(1987)；Sun等，美國(guó)科學(xué)院院刊84214-218(1987)；Better等，Science 2401041-1043(1988)；和Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，同上文獻(xiàn)。
抗特異型(anti-Id)抗體是一種識(shí)別通常與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的獨(dú)特的決定基的抗體。Id抗體可通過(guò)用待制備抗-Id的單克隆抗體免疫與該單克隆抗體來(lái)源的動(dòng)物在種類和基因型完全相同的動(dòng)物(例如小鼠品系)來(lái)制備。該被免疫的動(dòng)物通過(guò)產(chǎn)生針對(duì)這些特異型決定基的抗體(抗-Id抗體)來(lái)識(shí)別和應(yīng)答免疫抗體的特異型決定基。參見，例如，美國(guó)專利4699880。
抗-Id抗體也可以被用作免疫源在另外一個(gè)動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生所謂的抗-抗-Id抗體。該抗-抗-Id抗體可能與誘導(dǎo)抗-Id的單克隆抗體具有相同的抗原決定基。因而，通過(guò)使用針對(duì)單克隆抗體的特異型決定基的抗體，可能鑒定其他的表達(dá)同樣的特異性的抗體的克隆。
應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的抗體可以是完整的抗體，例如單克隆抗體，但是正是抗體的抗原決定基結(jié)合位點(diǎn)提供了所需的功能。因而，除了完整的抗體，也可使用其蛋白質(zhì)裂解片段，例如Fab或F(ab’)2片段。Fab和F(ab’)2片段缺乏完整抗體的Fc片段，可從循環(huán)系統(tǒng)中快速地被清除出去，并且與完整的抗體相比具有較小的非特異性組織結(jié)合(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。這種片段通常通過(guò)蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)生，使用例如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)。
而且，編碼抗體的可變區(qū)的DNA可插入其他的抗體中，產(chǎn)生嵌合抗體(參見，例如，美國(guó)專利4816567)，或插入T-細(xì)胞受體中，產(chǎn)生具有同樣寬的特異性的T-細(xì)胞(參見Eshhar，Z.等，Br.J.Cancer Suppl.，1027-9，1990；Gross，G.等，美國(guó)科學(xué)院院刊，8610024-8，1989)。也可產(chǎn)生和使用單鏈抗體。單鏈抗體可以是具有抗原結(jié)合能力并含有一對(duì)與免疫球蛋白的輕和重鏈的可變區(qū)同源或相似的氨基酸序列的單鏈復(fù)合肽(連接的VH-VL或單鏈FV)。VH和VL兩者均可具有天然的單克隆抗體序列，或者這兩種鏈中的一個(gè)或兩個(gè)可含有一種美國(guó)專利5091513所述類型的CDR-FR構(gòu)建體。這些分開的類似于輕和重鏈可變區(qū)的多肽通過(guò)多肽連接子連接在一起。這種單抗體的制備方法，特別是其中DNA編碼VH和VL鏈的多肽結(jié)構(gòu)是已知的，可按照例如美國(guó)專利4946778，5091513和5096815所述的方法來(lái)完成。
因而，術(shù)語(yǔ)“包含抗體的抗原結(jié)合部分的分子”不僅包括由任何一種動(dòng)物細(xì)胞系或微生物產(chǎn)生的任何同種異型的完整的免疫球蛋白分子，也包括它們的反應(yīng)性部分，包括，但不限于，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)(ab’)2片段，它們的重和/或輕鏈的可變部分，含有這種反應(yīng)性部分的嵌合或單鏈抗體，以及任何其它類型的分子或細(xì)胞，其中這種抗體反應(yīng)性部分已被物理地插入，例如嵌合T-細(xì)胞受體或具有這種受體的T-細(xì)胞，或者通過(guò)含有這種反應(yīng)性部分的分子的部分的手段開發(fā)出來(lái)的用于釋放治療半分子的分子。
上文已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了完整的描述，參照下文實(shí)施例可以理解到同樣的內(nèi)容，這些都是為了說(shuō)明的目的，不限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1與IFN受體結(jié)合的兩種人類蛋白質(zhì)，IR1B1和IR1B4將通過(guò)使用BamH1-有義引物(5’ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC(SEQ ID NO5)和EcoRI反義引物(5’tgacgaattcctaTCATACAAAGTC(SEQID NO6)的PCR擴(kuò)增的編碼完整IFNAR1-IC區(qū)域的cDNA片段克隆進(jìn)BlueScript載體(BS-SK+，Stratagene)。將來(lái)自這一BS-IFNAR1-IC的BamHI-SalI片段導(dǎo)入pGBT10載體(CloneTech)中并在該Gal4 DNA結(jié)合區(qū)域(pGBT10-IFNAR1-IC)之后同相融合，用以進(jìn)行雙雜種篩選。雙雜種篩選方法(Fields和Song，1989)是使用Durfee等(1993)的改良方法使用來(lái)自人類EB病毒(EBV)-轉(zhuǎn)化的B-淋巴細(xì)胞的pACT質(zhì)粒cDNA文庫(kù)與pGBT10-IFNAR1-IC共轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株Y153來(lái)進(jìn)行的。酵母Y153菌株具有兩個(gè)在GAL1上游激活序列(UAS)的控制之下的報(bào)告基因，它僅在Gal4轉(zhuǎn)錄因子的活性被重建的情況下才被轉(zhuǎn)錄。這需要有被導(dǎo)如該特定的酵母克隆的pACT質(zhì)粒編碼的融合蛋白質(zhì)與來(lái)自pGBT10質(zhì)粒的IFNAR1-IC區(qū)域具有親和性。報(bào)告基因之一是GAL1 His3，它允許在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；另一個(gè)報(bào)告基因是GAL-LacZ，它提供β-半乳糖苷酶活性。此外，pACT質(zhì)粒具有Leu2基因并且pGBT10質(zhì)粒具有TRP1基因，它們分別允許在缺乏亮氨酸和色氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。菌落的篩選是在合成培養(yǎng)基SC減Trp，Leu，His，在25mM 3-氨基三唑(它進(jìn)一步篩選組氨酸原養(yǎng)型)的存在下進(jìn)行的。然后對(duì)生長(zhǎng)的菌落使用X-gal濾膜測(cè)試(Breeden和Naysmith，1985)檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。
通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌HB101并選擇leu+轉(zhuǎn)化體得到了9個(gè)陽(yáng)性酵母克隆，并回收它們的pACT質(zhì)粒。對(duì)于每一種酵母DNA，分離了兩個(gè)這種大腸桿菌HB101。對(duì)從這些大腸桿菌克隆中得到的pACT質(zhì)粒進(jìn)行部分測(cè)序的結(jié)果顯示它們落入兩組被稱為IR1B1和IR1B4的cDNA序列。將IR1B1和IR1B4組的pACT質(zhì)粒通過(guò)與攜帶核纖層蛋白，cdk2和p53或其它控制插入物(CloneTech)的pAS質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化SFY526酵母報(bào)告菌株(Bartel等，1993)進(jìn)行特異性測(cè)試。對(duì)在SC″Crp，-leu上生長(zhǎng)的菌落檢測(cè)β-半乳糖苷酶的表達(dá)。從這些特異的陽(yáng)性pACT質(zhì)粒用XhoI切除插入物，將其克隆進(jìn)BS-KS(Stratagene)，并使用DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit在一個(gè)373A Sequencer(Applied Biosystems)中從T7和T3啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序。
圖1顯示pACT克隆IR1B1與不同的pAS或pGBT10質(zhì)粒誘餌共轉(zhuǎn)化酵母SFY526的結(jié)果。酵母細(xì)胞生長(zhǎng)在濾膜的條斑1至9中的選擇性SC培養(yǎng)基-trp，-leu中。用X-gal試劑(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)染色僅在條斑2和4中為陽(yáng)性。如圖1所示，條斑4是一種具有活性lacZ基因的對(duì)照酵母。條斑2是IR1B1和IFNAR1-IC融合蛋白質(zhì)的組合。僅用IR1B1(條斑9)，或者任何其它的除了IR1B1和IFNAR1-IC之外的組合不顯示β-半乳糖苷酶活性。因而，IR1B1可特異地與IFNAR1 IFN受體鏈的IC區(qū)域結(jié)合。
同樣，圖2顯示pACT克隆IR1B4與不同的pAS或pGBT10質(zhì)粒誘餌共轉(zhuǎn)化酵母SFY526的結(jié)果。酵母細(xì)胞生長(zhǎng)在濾膜的條斑1至8中的SC培養(yǎng)基-trp，-leu中，并用X-gal試劑染色僅在條斑3和7中為陽(yáng)性。如圖2中的下部方框所示，條斑7是一種具有活性lacZ基因的對(duì)照酵母。條斑3是IR1B4和IFNAR1-IC融合蛋白質(zhì)的組合。與用IR1B1得到的結(jié)果相同，僅用IR1B4(條斑1)，或者任何其它的除了IR1B4和IFNAR1-IC之外的組合不顯示β-半乳糖苷酶活性。因而，IR1B4也可特異地與IFNAR1 IFN受體鏈的IC區(qū)域結(jié)合。實(shí)施例2IR1B1蛋白質(zhì)序列顯示鈣-結(jié)合EF手位點(diǎn)將pACT-IR1B1質(zhì)粒中的cDNA插入物用XhoI切除，將其克隆進(jìn)Bluescript BS-KS(Stratagene)載體，并使用DyeDeoxy Terminator CycleSequencing Kit在一個(gè)373A DNA Sequencer(Applied Biosystems)中從T7和T3啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序。最長(zhǎng)的質(zhì)粒在Gal4活化區(qū)域和pACT質(zhì)粒的連接序列之后具有一個(gè)830核苷酸的序列(圖3)，并且其中發(fā)現(xiàn)一個(gè)191個(gè)氨基酸的開放閱讀框(圖3)。使用BlastP運(yùn)算法則(Altscaul等，1990)以及Bioaccelerator Alignment(Henikoff和Henikoff，1992)進(jìn)行了蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的聯(lián)網(wǎng)檢索。鈣牽蛋白獲得了最高分(CATR-HUMAN，accessionSwiss Protein SW New P41208)，從氨基酸52至173具有62.1％的相似性和32.4％的相同性，鈣調(diào)磷酸酶B(CALB NAERG，accession Swiss ProteinP42322；CALB-HUMAN，accession P06705)從氨基酸50至171具有59.8％的相似性和32.5％的相同性。
圖4顯示IR1B1與人類鈣調(diào)磷酸酶B(CALB)和鈣牽蛋白(CATR)的排列。鈣結(jié)合，螺旋-環(huán)-螺旋EF-手區(qū)域由黑體和下劃線的字母表示。IR1B1具有兩個(gè)EF-手位點(diǎn)，但前兩個(gè)EF-手區(qū)域不是保守的。IR1B1顯示出與鈣調(diào)磷酸被B(由圖4中的垂直線表示)和鈣牽蛋白(由圖4中的帽號(hào)表示)均具有同源性。但是，IR1B1明顯是一種以前還沒有被鑒定的新型的和不同的人類蛋白質(zhì)。實(shí)施例3IR1B1是一種IFN-誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物將人類黑素瘤U266S細(xì)胞(在5ml懸浮培養(yǎng)物中約3×106細(xì)胞)用重組IFN-α8(來(lái)自細(xì)菌2×108IU/mg)或者重組IFN-β(來(lái)自CHO細(xì)胞3×108IU/mg)以750IU/ml處理2小時(shí)或18小時(shí)。用IFN處理之后，收集細(xì)胞，并用一種含有硫氰酸胍鹽和酚的Tri-試劑(Molecular ResearchCenter，Cincinnati，Ohio)抽提。將抽提的RNA進(jìn)行醇沉淀，用甲醛變性，通過(guò)甲醛-瓊脂糖電泳分析(10μg RNA/點(diǎn)樣點(diǎn))，并印跡在GeneScreenPlus(Dupont，New England Nuclear，Billerica，MA)上。將Northern印跡與106cpm的用Rediprime試劑盒(Amersham，UK)使用32P-dCTP和隨機(jī)引發(fā)而標(biāo)記的IR1B1 cDNA反應(yīng)。
圖5顯示雜交在1.1kb RNA上的IR1B1 cDNA。IR1B1 mRNA的量在IFN-β對(duì)U266S細(xì)胞處理之后2小時(shí)顯著提高。但是，在IFN處理之后18小時(shí)，IR1B1 mRNA從細(xì)胞中消失，表明這一誘導(dǎo)是快速的并且是瞬時(shí)的。許多IFN-誘導(dǎo)的mRNA在IFN處理之后的24小時(shí)內(nèi)在細(xì)胞中繼續(xù)聚積(Revel和Chebath，1986)。
已證實(shí)在每一個(gè)泳道中存在相同量的RNA。如圖5的下面部分所示，相同的U266S(富含IFN受體)RNA與一種18S核糖體cDNA探針的雜交表明在每一泳道中具有相同量的18S rRNA(僅顯示出了18S rRNA電泳的印跡的部分)。在另一個(gè)使用1200U/ml的IFN用于誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，用INF-α8在2小時(shí)也觀察到IR1B1 mRNA，但在30分鐘沒有(未示出)。
發(fā)現(xiàn)IR1B1 mRNA在不同的人類細(xì)胞中(U266，Daudi和THP-1細(xì)胞)具有相同的1.1kb大小。應(yīng)當(dāng)注意，這一大小與鈣牽蛋白mRNA的大小接近，但與鈣調(diào)磷酸酶B mRNA的大小不同(2.5kb)。較小的mRNA與IR1B1是一種約20kDa的小的蛋白質(zhì)相一致。實(shí)施例4IR1B4蛋白質(zhì)在體外與IFNAR1結(jié)合通過(guò)使用網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的體外翻譯合成具有蛋白質(zhì)標(biāo)志(旗序列)的IR1B4蛋白質(zhì)并將該蛋白質(zhì)與重組IFNARI-IC融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌中反應(yīng)測(cè)試IR1B4與IFNAR1的IC-區(qū)域的結(jié)合。將實(shí)施例1中的pACT-IR1B4DNA用XhoI切割，用Klenow酶補(bǔ)平，將其克隆進(jìn)用EcoRI切割并補(bǔ)平的PECE-旗表達(dá)載體中(Ellis等，1986)。將含有同框旗-IR1B4融合體的NotI-BamHI片段重新克隆進(jìn)用NotI-BamHI切割的BS-SK中T3啟動(dòng)子的下游。通過(guò)從T3啟動(dòng)子的序列分析證實(shí)旗融合體的序列。用T3聚合酶和1μg的BamHI-線性化的BS-旗-IR1B4 DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(Promega試劑盒)。在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液(Promega試劑盒)中用[35S]甲硫氨酸(Amersham)和5μg RNA轉(zhuǎn)錄物在30℃進(jìn)行體外翻譯1小時(shí)。將產(chǎn)物在使用前用RNase處理。通過(guò)將BamHI-EcoRI，BS-IFNAR1-IC的插入物(參見上文)克隆進(jìn)pGEX2(Pharmacia Biotech)的相同位點(diǎn)制備GST-IFNAR1-IC融合蛋白質(zhì)。GST和GST-IFNAR1-IC是在大腸桿菌中表達(dá)的，并被結(jié)合在谷胱甘肽-瓊脂糖珠(Sigma)而回收。
抗-旗M2瓊脂糖珠得自Kodak Scientific Imaging Systems。針對(duì)IFN受體(IFNAR1)α-組分的單克隆抗體IFNaR3由Dr.O.Comlamonici(Colamonici等，1990)贈(zèng)送，并在1∶100稀釋后使用。制備了針對(duì)IFNAR1-IC(Ab 631)的C-末端肽的兔抗體，并被用于從2×107人黑素瘤U266S和U266R細(xì)胞的含有如前描述的抗蛋白酶(Ambrovich等，1994)的Brij提取物(0.75ml)中進(jìn)行的IFNAR1的免疫沉淀，除了蛋白質(zhì)G珠(Pharmacia)與單克隆抗體IFNaR3 SDS-PAGE一起使用，并且在FujixBAS1000 Phosphor-Imager進(jìn)行的分析與以前相同(Harroch等，1994)。
首次證實(shí)了當(dāng)翻譯產(chǎn)物被抗-旗抗體免疫沉淀時(shí)得到了一種約32kDa的蛋白質(zhì)(圖6A和6B)。在圖6A和6B中，當(dāng)標(biāo)出抗旗抗體的使用時(shí)(用符號(hào)+)，意味著IR1B4-旗融合mRNA(從相應(yīng)的DNA構(gòu)建體的體外轉(zhuǎn)錄)的放射活性翻譯產(chǎn)物與結(jié)合在瓊脂糖珠(Kodak Scientific Imaging Systems產(chǎn)物)上的抗-旗M2抗體反應(yīng)。含有融合于旗氨基酸序列的IR1B4的翻譯的蛋白質(zhì)被結(jié)合在這些抗-旗抗體珠上，在將這些珠離心沉淀后，將該蛋白質(zhì)用SDS緩沖液洗脫并用于SDS-PAGE。這些反應(yīng)被用作表明期望的融合蛋白質(zhì)存在的對(duì)照。
將谷胱甘肽的珠(Sigma)，其上結(jié)合融合于IFNAR1-IC的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，加入網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液翻譯反應(yīng)中。將這些珠離心并洗滌，用十二烷基硫酸鈉(SDS 1％)釋放結(jié)合在GST珠上的蛋白質(zhì)，并通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析。觀察到由35S-甲硫氨酸標(biāo)記的32kDa蛋白質(zhì)結(jié)合在GST-IFNAR1-IC上，而不與單獨(dú)的GST結(jié)合(圖6A)。這表明，IR1B4直接結(jié)合在分離的IFNAR1-IC肽區(qū)域上。
為了證實(shí)IR1B4與存在于人類細(xì)胞膜上的IFNAR1蛋白質(zhì)相互作用，將人骨髓瘤U266細(xì)胞的洗滌劑抽提物與來(lái)自網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的IR1B4的由35S-甲硫氨酸標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物混合。將IFNAR1蛋白質(zhì)用特異于IFNAR1的胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體IFNaR3(得自Colamonici等，1990)進(jìn)行免疫沉淀。通過(guò)SDS-PAGE分析，當(dāng)洗滌劑抽提物來(lái)自U266S(富含IFN受體)時(shí)，顯示32kDa IR1B4-旗的電泳帶的存在(圖6B)，但當(dāng)來(lái)自U266R細(xì)胞——一種來(lái)自IFN受體缺陷型U266的突變的IFN-α，β-抗性衍生細(xì)胞系(Abramovich等，1994)——時(shí)沒有這種電泳帶的存在。當(dāng)將U266S提取物與針對(duì)IFNAR1的C-末端肽的Ab-631反應(yīng)時(shí)同樣觀察到32kDa的電泳帶，并且當(dāng)Cos-7細(xì)胞用旗-IR1B4和人類IFNAR1 cDNA轉(zhuǎn)移時(shí)IFNAR1被抗-旗沉淀。這些結(jié)果證實(shí)IR1B4以特定的方式與來(lái)自人類細(xì)胞的完整的IFNAR1結(jié)合。實(shí)施例5IR1B4 cDNA和蛋白質(zhì)序列IR1B4 cDNA的核苷酸序列具有一個(gè)編碼361氨基酸長(zhǎng)蛋白質(zhì)的開放閱讀框(圖7)。該人類cDNA在各種人類細(xì)胞包括U266骨髓瘤細(xì)胞中識(shí)別一種1.5kb的組成型表達(dá)的poly-A+mRNA。使用BlastP運(yùn)算法則(Altscaul等，1990)以及Bioaccelerator Alignment(Henikoff和Henikoff，1992)進(jìn)行了蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的聯(lián)網(wǎng)檢索，發(fā)現(xiàn)IR1B4是蛋白質(zhì)-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的一個(gè)獨(dú)特的成員。由Lin等描述的大鼠PRMT1 cDNA(1996，Genbanksequence I.D.1390024；Accession U60882)用ALIGN計(jì)算機(jī)程序分析僅有81.4％的同源性。在氨基酸水平(圖8)，人類IR1B4/PRMT在其氨基末端明顯不同于PRMT1，其前19個(gè)氨基酸完全不同。僅對(duì)IR1B4 N-末端測(cè)序?qū)⒉粫?huì)表明IR1B4與PRMT1具有同源性。也發(fā)現(xiàn)另外一種已被描述的人類蛋白質(zhì)，HCP-1(Nikawa等，1996；Genbank accession D66904)，與IR1B4具有同源性。但是，HCP-1在殘基147-175具有不同的氨基酸序列(圖9)。HCP-1起初是基于其在酵母中互補(bǔ)ire15突變體的能力而被鑒定的，其酶學(xué)功能以前沒有被鑒定(Nikawa等，1996)。因而，IR1B4是一種新型的人類蛋白質(zhì)。實(shí)施例6與IFNAR1-IC結(jié)合的IR1B4蛋白質(zhì)具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性用IFNAR1受體可從人類細(xì)胞提取物中共-免疫沉淀甲基轉(zhuǎn)移酶活性。將U266S細(xì)胞的Brij-洗滌劑提取物在4℃與或不與抗-IFNAR1抗體Ab 631(Abramovich等，1994)過(guò)夜反應(yīng)。加入蛋白質(zhì)A珠(40μl 50％的IPA-400fast flow，Repligen)1小時(shí)。將珠洗滌并在0.1ml的25mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，50μM(0.25μCi)14C-(甲基)-S-腺苷-甲硫氨酸(Amersham)，和100μg組蛋白(來(lái)自小牛胸腺的IIA型，Sigma)中在30℃溫育30分鐘。在如Lin等(1996)所述的條件下進(jìn)行組蛋白的體外甲基化。在SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)和在Phospor-imager中曝光后分析組蛋白電泳帶的放射活性。用抗-IFNAR1涂覆的珠觀察到了組蛋白的14C-甲基的標(biāo)記，但在對(duì)照反應(yīng)中沒有觀察到(圖10)。因而，蛋白質(zhì)甲基-轉(zhuǎn)移酶活性是與這些人類細(xì)胞的IFN受體鏈組成型地相聯(lián)系的。當(dāng)IFNAR1在將IFN-β加入U(xiǎn)266S細(xì)胞5分鐘后被免疫沉淀時(shí)發(fā)現(xiàn)了相似的酶活性。實(shí)施例7在IFN的作用中IR1B4/PRMT1的參與用化學(xué)方法合成與IR1B4 cDNA的起始密碼子周圍核苷酸12-33的序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸硫代磷酸酯(AS-1，反義序列5’-GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3’，SEQ ID NO12)(Stein等，1989)。將該寡核苷酸在第0天加入接種在96-孔微培養(yǎng)板上的U266S細(xì)胞中(8000細(xì)胞/孔/0.2ml RPMI，10％FCS)，使最終濃度為10μM，并在第二天以5μM重新加入。在第0天，以64或25IU/ml加入IFN-β。在培養(yǎng)3天后，將20μl AlamarBlue，一種基于氧化還原反應(yīng)的細(xì)胞密度比色指示劑(BioSource，Camarillo，CA)，加入每一個(gè)孔中，并繼續(xù)溫育6-7小時(shí)。在一個(gè)微量板ELISA讀數(shù)器(測(cè)試濾光片530nm，參照濾光片630nm)對(duì)雙孔進(jìn)行多次讀數(shù)。校正活細(xì)胞數(shù)和OD值與生長(zhǎng)曲線之間的關(guān)系。為測(cè)量甲基轉(zhuǎn)移酶，將來(lái)自合并孔的細(xì)胞通過(guò)冷凍-解凍在25μl/孔的25mM Tris-HCl，pH7.4，1mMEDTA，1mM EGTA，40μg/ml亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽，20μg/ml胃蛋白酶抑制劑，1μM苯基甲基磺酰氯(PMSF)中裂解。反應(yīng)是在50μl的體積中在30℃進(jìn)行30分鐘，其中含有25μl細(xì)胞提取物，100μM肽R1(Najbauer等，1993；得自Genosys，Cambridge，UK)，3μCi[3H](甲基)S-腺苷甲硫氨酸(Amersham，73Ci/mmol)。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠(16％)電泳之后，在50％甲醇，10％乙酸中固定，并用Amplify(R)(Amersham)處理，進(jìn)行8天的放射自顯影。該AS-1反義DNA能夠大幅度降低U266S細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性，這是通過(guò)在R1肽底物中氚化的甲基的摻入測(cè)定的(圖11)，并被用于研究該酶在IFN功能中可能發(fā)揮的作用。選用IFN的生長(zhǎng)抑制活性，這是因?yàn)樗稍诩?xì)胞上最直接地定量，也因?yàn)橐呀?jīng)觀察到大鼠PRMT1與生長(zhǎng)-相關(guān)基因的相互作用(Lin等，1996)。反義-1寡核苷酸AS-1的加入，它與IR1B4/PRMT cDNA的起始密碼子周圍的序列互補(bǔ)，降低了IFN-β對(duì)人類骨髓瘤U266S細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)(圖12)。這意味著，在反義AS-1的存在下，IFN處理的細(xì)胞顯示出較高的生長(zhǎng)(不包括硫代磷酸酯的毒性效應(yīng))。在IFN不存在下的生長(zhǎng)沒有受到顯著影響。相應(yīng)于同樣的cDNA區(qū)域的有義寡核苷酸S-3與反義-1相比僅具有很小的影響(S-3，圖12)。有義S-3對(duì)酶活性水平也僅有很小的抑制效應(yīng)(圖11)。另一個(gè)反義硫代磷酸酯寡核苷酸AS-2(SEQ ID NO13)相應(yīng)于該cDNA的中間部分并與SEQ ID NO7的核苷酸572-592互補(bǔ)，幾乎沒有影響(圖12)。IFN-β對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的高達(dá)5倍的降低——反義-1寡核苷酸使其PRMT活性部分缺失——表明IR1B4/PRMT酶與IFNAR1受體的IC區(qū)域的結(jié)合對(duì)于IFN在細(xì)胞上的作用在功能上是顯著的。
這些實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了IR1B4蛋白質(zhì)甲基化酶的PRMT類的肽底物，例如R1肽Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO11；Najbauer等，1993)，它被用于圖11所示的實(shí)驗(yàn)中。蛋白質(zhì)在緊接甘氨酸殘基的精氨酸殘基上的甲基化(例如在上述的肽中)可能是一種象磷酸化那樣的蛋白質(zhì)修飾，其作用是向細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)。hnRNP組的蛋白質(zhì)是一種PRMT酶的靶物，并且由于這些蛋白質(zhì)影響mRNA的加工，剪切，運(yùn)輸和穩(wěn)定性(Liu和Dreyfuss，1995)，它們的甲基化可能對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后控制起作用。由于與IFN受體的鏈的結(jié)合而被發(fā)現(xiàn)的IR1B4/PRMT蛋白質(zhì)可介導(dǎo)在對(duì)IFN的響應(yīng)中在基因表達(dá)中的變化。其它的蛋白質(zhì)底物可通過(guò)IFN受體而被甲基化，包括IFN受體復(fù)合體的其它成分和轉(zhuǎn)錄因子。Lin等(1996)已觀察到大鼠PRMT1與生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的結(jié)合激活了PRMT1并改變其底物特異性，可能是通過(guò)除去一些細(xì)胞的胞質(zhì)中與PRMT1相關(guān)的抑制蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行的。可期望結(jié)合在IFN受體的IFNAR1鏈上的IR1B4的相似的激活。結(jié)論本文描述了一種新型蛋白質(zhì)IR1B1，它與I型干擾素受體的IFNAR1鏈的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域相互作用。在人細(xì)胞用IFN處理后該蛋白質(zhì)被快速和瞬間誘導(dǎo)。IR1B1的特征在于螺旋-環(huán)-螺旋EF-把手位點(diǎn)的存在，它是鈣-結(jié)合蛋白質(zhì)的標(biāo)志。鈣離子流參與IFN作用的機(jī)制中，特別是用于起始細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞形態(tài)變化以及細(xì)胞骨架的組織(Tamm等，1987)。鈣離子激活的酶在響應(yīng)IFN時(shí)可產(chǎn)生第二信號(hào)，例如二?；?甘油。而且，鈣調(diào)素類蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)一些蛋白質(zhì)激酶，并且已觀察到這些途徑在IFN處理的細(xì)胞中具有功能(Tamm等，1987)。很有可能IFN受體結(jié)合蛋白質(zhì)IR1B1參與這種鈣離子依賴性的IFN對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)。
用于與IFNAR1-IC區(qū)域相互作用的蛋白質(zhì)的雙-雜種篩選也鑒定出另外一種蛋白質(zhì)IR1B4，它被證明是一種酶的蛋白質(zhì)-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的一個(gè)成員(PRMT1；Lin等，1996)。已知該酶使一些RNA和DNA結(jié)合蛋白質(zhì)甲基化，特別是異源性核的核糖核蛋白(hnRNP)。該hnRNP參與mRNA從核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，前-mRNA的旁路剪接，以及轉(zhuǎn)錄后控制(Liu和Dreyfuss，1995)。錨定在IFNAR1-IC區(qū)域上的IR1B1和IR1B4/PRMT1蛋白質(zhì)揭示了除了由Darnell等(1994)描述的已知的Jak-Stat途徑外存在的IFN的新型信號(hào)機(jī)制。
現(xiàn)已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了完整的描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)看到在等同的參數(shù)、濃度和條件的很寬的范圍內(nèi)可以進(jìn)行相同的發(fā)明而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，也不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)依照特定實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述時(shí)，可以看到可以進(jìn)行進(jìn)一步修改。按照本發(fā)明的總的原則，這一修改應(yīng)包括任一種變化、應(yīng)用或調(diào)整，并包括屬于本領(lǐng)域內(nèi)已知和習(xí)慣作法的對(duì)本發(fā)明的修改，這些修改按照權(quán)利要求書所述范圍可以應(yīng)用于上文所述的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)。
所有本文引用的參考文獻(xiàn)，包括期刊文章或摘要，公開的或相應(yīng)的美國(guó)或外國(guó)專利申請(qǐng)，頒發(fā)的美國(guó)或外國(guó)專利或任一種其它參考文獻(xiàn)全部引入本文作為參考，包括所引用文獻(xiàn)中的全部的數(shù)據(jù)、表、圖和正文。此外，本文引用文獻(xiàn)中所引用的全部文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均全部引入本文作為參考。
對(duì)已知的方法步驟、常規(guī)的方法步驟、已知的方法，常規(guī)的方法的參考并不意味著我們承認(rèn)本發(fā)明任一一個(gè)方面、描述或?qū)嵤┓桨敢言谙嚓P(guān)的文獻(xiàn)中被公開、教導(dǎo)或提示。
上文中對(duì)特定實(shí)施方案的描述完全公開了本發(fā)明總體性質(zhì)，其他人根據(jù)本領(lǐng)域公知的知識(shí)(包括本文引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)可容易將這些特定的實(shí)施方案進(jìn)行修改和/或調(diào)整，以用于各種用途，而不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，都不偏離本發(fā)明的總的構(gòu)思。因而，基于本文的教導(dǎo)和引導(dǎo)，這種調(diào)整和修改屬于本文公開的實(shí)施方案的等同方式和范圍之內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，本文所用術(shù)語(yǔ)只是為了說(shuō)明而不是為了限制的目的，因而本文所用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)由普通技術(shù)人員按照本文的教導(dǎo)和指引結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)來(lái)解釋。
參考文獻(xiàn)Abramovich，C.，Shulman，L.M，Ratovitski，E.，Harroch，S.，Tovey，M，Eid，P. and Revel，M.(1994)Differentialtyrosine phosphorylation of the IFNAR chain of the typeI Interferon receptor and of an associated surfaceprotein in response to IFN-α and IFN-β.EMBO J.，135871-5877.Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.andLipman，D.J.(1990)Basic local alignment researchtool. J.Mol. Biol.，215403-410.Barter，P.L.，Chien，C.T.，Sternglanz，R.and Fields，S.
(1993)Elimination of false positives thatarise inusing the two-hybrid system.BioTechnigues，14920-924.Boldin，M.P.Varfolomeev，E.E.Pancer，Z.Mett，I.L.CamonisJ.H.and Wallach D.(1995)A novel protein thatinteracts with the death domain of Fas/APOl contains asequence motif related to the death domain.J BiolChem，2707795 7798.Breeden，L. and Naysmith，K.，(1995)Regulation of the yeastHO gene.Cold Spring Harbor Svmp.Ouant.Biol.，50643-650.Colamonici，O.R.，D′Allessandro，F(xiàn).，Diaz，M.O.，Gregory，S.a.，Necker，L.M. and Nordan，R.(1990)Characterization of three monoclonal antibodies thatrecognize the Interferon-α2 receptor.Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 87，7230-7234.Darnell，J.E.，Kerr，I.M.and Stark，G.R.(1994)Jak-Statpathways and transcriptional activation in response toIFNs and other extracellular signaling proteins.
Science，2641415-1421.David，M.，Chen，H.E.，Goelz，S.，Larner，A.C.and Neel，B.G.(1995a)Differential regulation of the alpha/betaInterferon-stimulated Jak/Stat pathway by the SH2domain-containing tyrosine phosphatase SHPTP1.Mol.
Cell.Biol.，157050-7058.David，M.，Petricoin，E.III，Benjamin，C.，Pine，R.，Weber，M.J. and Larner，A.C.(1995b)Requirement for MAPkinase(ERK2)activity in Interferon α- and Interferonβ-stimulated gene expression through Stat proteins.
Science，2691721-1723.David，M.，Petricoin，E.III.And Larner，A.C.(1996)Activation of Protein kinase A inhibits Interferoninduction of the Jak/Stat pathway in U266 cells. J.
Biol.Chem.，2714585-4588.Deiss，L.P. and Kimchi，A.(199)A genetic tool used toidentify thiroredoxin as a mediator of a growthinhibitory signal.Science 252，117-20.Domanski，P.，Witte，M.，Kellum，M.，Rubinstein，M.，Hackett，R.，Pitha，P.And Colamonici，O.R.(1995)Cloning and expression of a long form of the betasubunit of the Interferon alpha beta receptor that isrequired for signaling.J.Biol.Chem.，27021606-21611.Durfee，T.，Becherer，K，Chen，P.-L.，Yeh，S-H，Yang，Y.，Kilburn，A.E.，Lee，W.-H.and Elledge，S.(1993).Theretinoblastoma protein associates with the proteinphosphatase type 1 catalytic subunit.Genes & Devpt.，7555-569.Ellis，L.，Clauser，E.，Morgan，D.O.，Edery，M.，Roth，R.A.
and Rutter，W.J.(1986)Replacement of insulin receptortyrosine residues 1162 and 1163 compromises insulin-stimulated kinase activity and uptake of 2-deoxyglucose. Cell，45，721-731.Fields，S.and Song，O.(1989).A novel genetic system todetect protein-protein interactions.Nature，340245-246.Guerini，D.et al(1989).DNA 8675-682.Harroch，S.，Revel，M.and Chebath，J.(1994).Interleukin-6 signaling via four transcription factors bindingpalindromic enhancers of different genes.J.Biol.
Chem.，26926191-26195.Henikoff，S.and Henikoff，J.G.(1992).Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，8910915-10919.Kagan，R.M.and Clarke，S.(1994) Widespread occurrence ofthree sequence motifs in diverse S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases suggests acommon structure for these enzymes.Arch.Biochem.
Biophys.，310，417-427.Lee，V.D.and Huang，B.(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011039-11043.Leung，S.，Qureshi，S.A.，Kerr，I.M.，Darnell，J.E.andStark，G.R.(1995).Role of Stat2 in the alphaInterferon signaling pathway.Mol.Cell.Biol.，151312-1317.Lin，W.-J.，Gary，J.D.，Yang，M.C.，Clarke，S.andHerschman，H.R.(1996).The mammalian immediate-earlyTIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 proteininteract with a Protein-arginine Methyltransferase，J.
Biol Chem.，27115034-15044.Liu，Q.And Dreyfuss，G.(1995).In vivo and in vitroarginine methylation of RNA-binding proteins.
Mol.Cell.Biol.，152800-2808.Najbauer，J.，Johnson，B.A.，Young，A.L.and Asward，D.W.
(1993)Peptides with sequences similar to glycinearginine rich motifs in proteins interacting with RNAare efficiently recognized by methyltransferasesmodifying arginine in numerous proteins.J.Biol.
Chem.，268，10501-10509.Nikawa，J.-I.，Nakano，H.and Ohi，N.(1996)Structural andfunctional conservation of human yeast HCPI genes whichcan suppress the growth defect of the Saccharomycescerevisiae ire15 mutant.Gene，171，107-111.Revel，M.(1984).The Interferon system in mannature ofthe Interferon molecules and mode of action. In Becker，I.(ed.)，Antiviral Drugs and Interferon.The molecularbasis of their activity.Martinus Nijhoff Publ.，Boston，pp 357-433.Revel，M.and Chebath，J.(1986)Interferon-activated genes.
Trends Biochem. Sci.，11166-170.Stein，C.A.，Subasinghi，C.，Shinozuka，K.and Cohen，J.S.
(1989)Physicochemical properties of phosphorothionateoligodeoxynucleotides.Nucleic Acids Res.，16，3209-3221.Tamm，I.，Lin，S.L.，Pfeffer，L.M.and Sehgal，P.B.(1987).
Interferons α and β as cellular regulatory molecules.
In Gresser，I.(ed.)，Interferon 9，Acad.Press，London，pp 14-74.Uze，G.，Lutfalla，G.and Gresser，I.(1990).Genetictransfer of a functional human Interferon α receptorinto mouse cellscloning and expression of its cDNA.
Cell.60225-234.Wickstrom，E.(1991).InProspects for Antisense NucleicAcid Therapy of Cancer and AIDS，pp.7-24，Wiley-Liss，New York.Yang，C.H.，Shi，W，Basu，L.，Murti，A.，Constantinescu，S.N.，Blatt，L.，Croze，E.，Mullersman，J.E.andPfeffer，L.M.(1996).Direct association of Stat3 withthe TFNAR-1 chain of the human type I Interferonreceptor.J.Biol.Chem.，2718057-8061.
序列表(1)總信息(i)申請(qǐng)人REVEL，MichaelCHEBATH，JudithABRAMOVICH，Carolina(ii)發(fā)明名稱新型IFN受體1結(jié)合蛋白質(zhì)，編碼它們的DNA，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)干擾素的反應(yīng)的方法(iii)序列數(shù)目13(iv)通信地址(A)收信人BROWDY AND NEIMARK(B)街道419 Seventh Street，N.W.，Suite 300(C)城市Washington(D)州D.C.
(E)國(guó)家USA(F)郵編20004(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(Vi)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)申請(qǐng)日(Vi)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S60/035636(B)申請(qǐng)日1997年1月15日(viii)律師/代理人信息(A)姓名BROWDY，Roger L.
(B)登記號(hào)25618(C)案號(hào)REVEL＝14 PCT(ix)通訊號(hào)碼(A)電話202-628-5197(B)傳真202-737-3528(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度830堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)43..615(xi)序列描述SEQ ID NO1CGTCTCGAGG CGAGTTGGCG GAGCTGTGCG CGCGGCGGGG CG ATG GGG GGC TCG 54Met Gly Gly Ser1GGC AGT CGC CTG TCC AAG GAG CTG CTG GCC GAG TAC CAG GAC TTG ACG 102Gly Ser Arg Leu Ser Lys Glu Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Asp Leu Thr5 10 15 20TTC CTG ACG AAG CAG GAG ATC CTC CTA GCC CAC AGG CGG TTT TGT GAG 150Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile Leu Leu Ala His Arg Arg Phe Cys Glu25 30 35CTG CTT CCC CAG GAG CAG CGG AGC GTG GAG TCG TCA CTT CGG GCA CAA 198Leu Leu Pro Gln Glu Gln Arg Ser Val Glu Ser Ser Leu Arg Ala Gln40 45 50GTG CCC TTC GAG CAG ATT CTC AGC CTT CCA GAG CTC AAG GCC AAC CCC 246Val Pro Phe Glu Gln Ile Leu Ser Leu Pro Glu Leu Lys Ala Asn Pro55 60 65TTC AAG GAG CGA ATC TGC AGG GTC TTC TCC ACA TCC CCA GCC AAA GAC 294Phe Lys Glu Arg Ile Cys Arg Val Phe Ser Thr Ser Pro Ala Lys Asp70 75 80AGC CTT AGC TTT GAG GAC TTC CTG GAT CTC CTC AGT GTG TTC AGT GAC 342Ser Leu Ser Phe Glu Asp Phe Leu Asp Leu Leu Ser Val Phe Ser Asp85 90 95 100ACA GCC ACG CCA GAC ATC AAG TCC CAT TAT GCC TTC CGC ATC TTT GAC 390Thr Ala Thr Pro Asp Ile Lys Ser His Tyr Ala Phe Arg Ile Phe Asp105 110 115TTT GAT GAT GAC GGA ACC TTG AAC AGA GAA GAC CTG AGC CGG CTG GTG 438Phe Asp Asp Asp Gly Thr Leu Asn Arg Glu Asp Leu Ser Arg Leu Val120 125 130AAC TGC CTC ACG GGA GAG GGC GAG GAC ACA CGG CTT AGT GCG TCT GAG 486Asn Cys Leu Thr Gly Glu Gly Glu Asp Thr Arg Leu Ser Ala Ser Glu135 140 145ATG AAG CAG CTC ATC GAC TAC ATC CTG GAA GAG TCT GAC ATT GAC AGG 534Met Lys Gln Leu Ile Asp Tyr Ile Leu Glu Glu Ser Asp Ile Asp Arg150 155 160GAT GGA ACC ATC AAC CTC TCT GAG TTC CAG CAC GTC ATC TCC CGT TCT 582Asp Gly Thr Ile Asn Leu Ser Glu Phe Gln His Val Ile Ser Arg Ser165 170 175 180CCA GAC TTT GCC AGC TCC TTT AAG ATT GTC CTG TGACAGCAGC CCCAGCGTGT 635Pro Asp Phe Ala Ser Ser Phe Lys Ile Val Leu185 190GTCCTGGCAC CCTGTCCAAG AACCTTTCTA CTGCTGAGCT GTGGCCAAGG TCAAGCCTGT 695GTTGCCAGTG CGGGCCAAGC TGGCCCAGCC TGGAGCTGGC GCTGTGCAGC CTCACCCCGG 755GCAGGGGCGG CCCTCGTTGT CAGGGCCTCT CCTCACTGCT GTTGTCATTG CTCCGTTTGT 815GGGCCTTCGT GGCCA 830(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度191氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gly Gly Ser Gly Ser Arg Leu Ser Lys Glu Leu Leu Ala Glu Tyr1 5 10 15Gln Asp Leu Thr Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile Leu Leu Ala His Arg20 25 30Arg Phe Cys Glu Leu Leu Pro Gln Glu Gln Arg Ser Val Glu Ser Ser35 40 45Leu Arg Ala Gln Val Pro Phe Glu Gln Ile Leu Ser Leu Pro Glu Leu50 55 60Lys Ala Asn Pro Phe Lys Glu Arg Ile Cys Arg Val Phe Ser Thr Ser65 70 75 80Pro Ala Lys Asp Ser Leu Ser Phe Glu Asp Phe Leu Asp Leu Leu Ser85 90 95Val Phe Ser Asp Thr Ala Thr Pro Asp Ile Lys Ser His Tyr Ala Phe100 105 110Arg Ile Phe Asp Phe Asp Asp Asp Gly Thr Leu Asn Arg Glu Asp Leu115 120 125Ser Arg Leu Val Asn Cys Leu Thr Gly Glu Gly Glu Asp Thr Arg Leu130 135 140Ser Ala Ser Glu Met Lys Gln Leu Ile Asp Tyr Ile Leu Glu Glu Ser145 150 155 160Asp Ile Asp Arg Asp Gly Thr Ile Asn Leu Ser Glu Phe Gln His Val165 170 175Ile Ser Arg Ser Pro Asp Phe Ala Ser Ser Phe Lys Ile Val Leu180 185 190(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度170氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp1 5 10 15Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu20 25 30Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu35 40 45Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr50 55 60Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser65 70 75 80Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe85 90 95Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu100 105 110Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln115 120 125Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly130 135 140Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu145 150 155 160Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val165 170(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度172氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Ala Ser Asn Phe Lys Lys Ala Asn Met Ala Ser Ser Ser Gln Arg1 5 10 15Lys Arg Met Ser Pro Lys Pro Glu Leu Thr Glu Glu Gln Lys Gln Glu20 25 30Ile Arg Glu Ala Phe Asp Leu Phe Asp Ala Asp Gly Thr Gly Thr Ile35 40 45Asp Val Lys Glu Leu Lys Val Ala Met Arg Ala Leu Gly Phe Glu Pro50 55 60Lys Lys Glu Glu Ile Lys Lys Met Ile Ser Glu Ile Asp Lys Glu Gly65 70 75 80Thr Gly Lys Met Asn Phe Gly Asp Phe Leu Thr Val Met Thr Gln Lys85 90 95Met Ser Glu Lys Asp Thr Lys Glu Glu Ile Leu Lys Ala Phe Lys Leu100 105 110Phe Asp Asp Asp Glu Thr Gly Lys Ile Ser Phe Lys Asn Leu Lys Arg115 120 125Val Ala Lys Glu Leu Gly Glu Asn Leu Thr Asp Glu Glu Leu Gln Glu130 135 140Met Ile Asp Glu Ala Asp Arg Asp Gly Asp Gly Glu Val Ser Glu Gln145 150 155 160Glu Phe Leu Arg Ile Met Lys Lys Thr Ser Leu Tyr165 170(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CTGAGGATCC AAAGTCTTCT TGAGATGCAT C 31(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TGACGAATTC CTATCATACA AAGTC25(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1308堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)16..1098(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCGCGAACT GCATC ATG GAG AAT TTT GTA GCC ACC TTG GCT AAT GGG ATG 51Met Glu Asn Phe Val Ala Thr Leu Ala Asn Gly Met195 200AGC CTC CAG CCG CCT CTT GAA GAA GTG TCC TGT GGC CAG GCG GAA AGC99Ser Leu Gln Pro Pro Leu Glu Glu Val Ser Cys Gly Gln Ala Glu Ser205 210 215AGT GAG AAG CCC AAC GCT GAG GAC ATG ACA TCC AAA GAT TAC TAC TTT 147Ser Glu Lys Pro Asn Ala Glu Asp Met Thr Ser Lys Asp Tyr Tyr Phe220 225 230 235GAC TCC TAC GCA CAC TTT GGC ATC CAC GAG GAG ATG CTG AAG GAC GAG 195Asp Ser Tyr Ala His Phe Gly Ile His Glu Glu Met Leu Lys Asp Glu240 245 250GTG CGC ACC CTC ACT TAC CGC AAC TCC ATG TTT CAT AAC CGG CAC CTC 243Val Arg Thr Leu Thr Tyr Arg Asn Ser Met Phe His Asn Arg His Leu255 260 265TTC AAG GAC AAG GTG GTG CTG GAC GTC GGC TCG GGC ACC GGC ATC CTC 291Phe Lys Asp Lys Val Val Leu Asp Val Gly Ser Gly Thr Gly Ile Leu270 275 280TGC ATG TTT GCT GCC AAG GCC GGG GCC CGC AAG GTC ATC GGG ATC GAG 339Cys Met Phe Ala Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lys Val Ile Gly Ile Glu285 290 295TGT TCC AGT ATC TCT GAT TAT GCG GTG AAG ATC GTC AAA GCC AAC AAG 387Cys Ser Ser Ile Ser Asp Tyr Ala Val Lys Ile Val Lys Ala Asn Lys300 305 310 315TTA GAC CAC GTG GTG ACC ATC ATC AAG GGG AAG GTG GAG GAG GTG GAG 435Leu Asp His Val Val Thr Ile Ile Lys Gly Lys Val Glu Glu Val Glu320 325 330CTC CCA GTG GAG AAG GTG GAC ATC ATC ATC AGC GAG TGG ATG GGC TAC 483Leu Pro Val Glu Lys Val Asp Ile Ile Ile Ser Glu Trp Met Gly Tyr335 340 345TGC CTC TTC TAC GAG TCC ATG CTC AAC ACC GTG CTC TAT GCC CGG GAC 531Cys Leu Phe Tyr Glu Ser Met Leu Asn Thr Val Leu Tyr Ala Arg Asp350 355 360AAG TGG CTG GCG CCC GAT GGC CTC ATC TTC CCA GAC CGG GCC ACG CTG 579Lys Trp Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Phe Pro Asp Arg Ala Thr Leu365 370 375TAT GTG ACG GCC ATC GAG GAC CGC CAG TAC AAA GAC TAC AAG ATC CAC 627Tyr Val Thr Ala Ile Glu Asp Arg Gln Tyr Lys Asp Tyr Lys Ile His380 385 390 395TGG TGG GAG AAC GTG TAT GGC TTC GAC ATG TCT TGC ATC AAA GAT GTG 675Trp Trp Glu Asn Val Tyr Gly Phe Asp Met Ser Cys Ile Lys Asp Val400 405 410GCC ATT AAG GAG CCC CTA GTG GAT GTC GTG GAC CCC AAA CAG CTG GTC 723Ala Ile Lys Glu Pro Leu Val Asp Val Val Asp Pro Lys Gln Leu Val415 420 425ACC AAC GCC TGC CTC ATA AAG GAG GTG GAC ATC TAT ACC GTC AAG GTG 771Thr Asn Ala Cys Leu Ile Lys Glu Val Asp Ile Tyr Thr Val Lys Val430 435 440GAA GAC CTG ACC TTC ACC TCC CCG TTC TGC CTG CAA GTG AAG CGG AAT 819Glu Asp Leu Thr Phe Thr Ser Pro Phe Cys Leu Gln Val Lys Arg Asn445 450 455GAC TAC GTG CAC GCC CTG GTG GCC TAC TTC AAC ATC GAG TTC ACA CGC 867Asp Tyr Val His Ala Leu Val Ala Tyr Phe Asn Ile Glu Phe Thr Arg460 465 470 475TGC CAC AAG AGG ACC GGC TTC TCC ACC AGC CCC GAG TCC CCG TAC ACG 915Cys His Lys Arg Thr Gly Phe Ser Thr Ser Pro Glu Ser Pro Tyr Thr480 485 490CAC TGG AAG CAG ACG GTG TTC TAC ATG GAG GAC TAC CTG ACC GTG AAG 963His Trp Lys Gln Thr Val Phe Tyr Met Glu Asp Tyr Leu Thr Val Lys495 500 505ACG GGC GAG GAG ATC TTC GGC ACC ATC GGC ATG CGG CCC AAC GCC AAG 1011Thr Gly Glu Glu Ile Phe Gly Thr Ile Gly Met Arg Pro Asn Ala Lys510 515 520AAC AAC CGG GAC CTG GAC TTC ACC ATC GAC CTG GAC TTC AAG GGC CAG 1059Asn Asn Arg Asp Leu Asp Phe Thr Ile Asp Leu Asp Phe Lys Gly Gln525 530 535CTG TGC GAG CTG TCC TGC TCC ACC GAC TAC CGG ATG CGC TGAGGCCCGG 1108Leu Cys Glu Leu Ser Cys Ser Thr Asp Tyr Arg Met Arg540 545 550CTCTCCCGCC CTGCACGAGC CCAGGGGCTG AGCGTTCCTA GGCGGTTTCG GGGCTCCCCC1168TTCCTCTCCC TCCCTCCCGC AGAAGGGGGT TTTAGGGGCC TGGGCTGGGG GGATGGGGAG1228GGCACATTGG GACTGTGTTT TTCATAAATT ATGTTTTTAT ATGGTTGCAT TTAATGCCAA1288TAAATCCTCA GCTGGGGAAA1308(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度361氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Glu Asn Phe Val Ala Thr Leu Ala Asn Gly Met Ser Leu Gln Pro1 5 10 15Pro Leu Glu Glu Val Ser Cys Gly Gln Ala Glu Ser Ser Glu Lys Pro20 25 30Asn Ala Glu Asp Met Thr Ser Lys Asp Tyr Tyr Phe Asp Ser Tyr Ala35 40 45His Phe Gly Ile His Glu Glu Met Leu Lys Asp Glu Val Arg Thr Leu50 55 60Thr Tyr Arg Asn Ser Met Phe His Asn Arg His Leu Phe Lys Asp Lys65 70 75 80Val Val Leu Asp Val Gly Ser Gly Thr Gly Ile Leu Cys Met Phe Ala85 90 95Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lys Val Ile Gly Ile Glu Cys Ser Ser Ile100 105 110Ser Asp Tyr Ala Val Lys Ile Val Lys Ala Asn Lys Leu Asp His Val115 120 125Val Thr Ile Ile Lys Gly Lys Val Glu Glu Val Glu Leu Pro Val Glu130 135 140Lys Val Asp Ile Ile Ile Ser Glu Trp Met Gly Tyr Cys Leu Phe Tyr145 150 155 160Glu Ser Met Leu Asn Thr Val Leu Tyr Ala Arg Asp Lys Trp Leu Ala165 170 175Pro Asp Gly Leu Ile Phe Pro Asp Arg Ala Thr Leu Tyr Val Thr Ala180 185 190Ile Glu Asp Arg Gln Tyr Lys Asp Tyr Lys Ile His Trp Trp Glu Asn195 200 205Val Tyr Gly Phe Asp Met Ser Cys Ile Lys Asp Val Ala Ile Lys Glu210 215 220Pro Leu Val Asp Val Val Asp Pro Lys Gln Leu Val Thr Asn Ala Cys225 230 235 240Leu Ile Lys Glu Val Asp Ile Tyr Thr Val Lys Val Glu Asp Leu Thr245 250 255Phe Thr Ser Pro Phe Cys Leu Gln Val Lys Arg Asn Asp Tyr Val His260 265 270Ala Leu Val Ala Tyr Phe Asn Ile Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Arg275 280 285Thr Gly Phe Ser Thr Ser Pro Glu Ser Pro Tyr Thr His Trp Lys Gln290 295 300Thr Val Phe Tyr Met Glu Asp Tyr Leu Thr Val Lys Thr Gly Glu Glu305 310 315 320Ile Phe Gly Thr Ile Gly Met Arg Pro Asn Ala Lys Asn Asn Arg Asp325 330 335Leu Asp Phe Thr Ile Asp Leu Asp Phe Lys Gly Gln Leu Cys Glu Leu340 345 350Ser Cys Ser Thr Asp Tyr Arg Met Arg355 360(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度353氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Ala Ala Ala Glu Ala Ala Asn Cys Ile Met Glu Val Ser Cys Gly1 5 10 15Gln Ala Glu Ser Ser Glu Lys Pro Asn Ala Glu Asp Met Thr Ser Lys20 25 30Asp Tyr Tyr Phe Asp Ser Tyr Ala His Phe Gly Ile His Glu Glu Met35 40 45Leu Lys Asp Glu Val Arg Thr Leu Thr Tyr Arg Asn Ser Met Phe His50 55 60Asn Arg His Leu Phe Lys Asp Lys Val Val Leu Asp Val Gly Ser Gly65 70 75 80Thr Gly Ile Leu Cys Met Phe Ala Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lys Val85 90 95Ile Gly Ile Glu Cys Ser Ser Ile Ser Asp Tyr Ala Val Lys Ile Val100 105 110Lys Ala Asn Lys Leu Asp His Val Val Thr Ile Ile Lys Gly Lys Val115 120 125Glu Glu Val Glu Leu Pro Val Glu Lys Val Asp Ile Ile Ile Ser Glu130 135 140Trp Met Gly Tyr Cys Leu Phe Tyr Glu Ser Met Leu Asn Thr Val Leu145 150 155 160His Ala Arg Asp Lys Trp Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Phe Pro Asp165 170 175Arg Ala Thr Leu Tyr Val Thr Ala Ile Glu Asp Arg Gln Tyr Lys Asp180 185 190Tyr Lys Ile His Trp Trp Glu Asn Val Tyr Gly Phe Asp Met Ser Cys195 200 205Ile Lys Asp Val Ala Ile Lys Glu Pro Leu Val Asp Val Val Asp Pro210 215 220Lys Gln Leu Val Thr Asn Ala Cys Leu Ile Lys Glu Val Asp Ile Tyr225 230 235 240Thr Val Lys Val Glu Asp Leu Thr Phe Thr Ser Pro Phe Cys Leu Gln245 250 255Val Lys Arg Asn Asp Tyr Val His Ala Leu Val Ala Tyr Phe Asn Ile260 265 270Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Arg Thr Gly Phe Ser Thr Ser Pro Glu275 280 285Ser Pro Tyr Thr His Trp Lys Gln Thr Val Phe Tyr Met Glu Asp Tyr290 295 300Leu Thr Val Lys Thr Gly Glu Glu Ile Phe Gly Thr Ile Gly Met Arg305 310 315 320Pro Asn Ala Lys Asn Asn Arg Asp Leu Asp Phe Thr Ile Asp Leu Asp325 330 335Phe Lys Gly Gln Leu Cys Glu Leu Ser Cys Ser Thr Asp Tyr Arg Met340 345 350Arg(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度360氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Glu Asn Phe Val Ala Thr Leu Ala Asn Gly Met Ser Leu Gln Pro1 5 10 15Pro Leu Glu Glu Val Ser Cys Gly Gln Ala Glu Ser Ser Glu Lys Pro20 25 30Asn Ala Glu Asp Met Thr Ser Lys Asp Tyr Tyr Phe Asp Ser Tyr Ala35 40 45His Phe Gly Ile His Glu Glu Met Leu Lys Asp Glu Val Arg Thr Leu50 55 60Thr Tyr Arg Asn Ser Met Phe His Asn Arg His Leu Phe Lys Asp Lys65 70 75 80Val Val Leu Asp Val Gly Ser Gly Thr Gly Ile Leu Cys Met Phe Ala85 90 95Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lys Val Ile Gly Ile Val Cys Ser Ser Ile100 105 110Ser Asp Tyr Ala Val Lys Ile Val Lys Ala Asn Lys Leu Asp His Val115 120 125Val Thr Ile Ile Lys Gly Lys Val Glu Glu Val Glu Leu Pro Val Glu130 135 140Lys Val Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gly Trp Ala Thr Ala Ser Ser Thr145 150 155 160Ser Pro Cys Ser Thr Pro Cys Ser Met Pro Gly Thr Ser Val Ala Pro165 170 175Asp Gly Leu Ile Phe Pro Asp Arg Ala Thr Leu Tyr Val Thr Ala Ile180 185 190Glu Asp Arg Gln Tyr Lys Asp Tyr Lys Ile His Trp Trp Glu Asn Val195 200 205Tyr Gly Phe Asp Met Ser Cys Ile Lys Asp Val Ala Ile Lys Glu Pro210 215 220Leu Val Asp Val Val Asp Pro Lys Gln Leu Val Thr Asn Ala Cys Leu225 230 235 240Ile Lys Glu Val Asp Ile Tyr Thr Val Lys Val Glu Asp Leu Thr Phe245 250 255Thr Ser Pro Phe Cys Leu Gln Val Lys Arg Asn Asp Tyr Val His Ala260 265 270Leu Val Ala Tyr Phe Asn Ile Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Arg Thr275 280 285Gly Phe Ser Thr Ser Pro Glu Ser Pro Tyr Thr His Trp Lys Gln Thr290 295 300Val Phe Tyr Met Glu Asp Tyr Leu Thr Val Lys Thr Gly Glu Glu Ile305 310 315 320Phe Gly Thr Ile Gly Met Arg Pro Asn Ala Lys Asn Asn Arg Asp Leu325 330 335Asp Phe Thr Ile Asp Leu Asp Phe Lys Gly Gln Leu Cys Glu Leu Ser340 345 350Cys Ser Thr Asp Tyr Arg Met Arg355 360(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO11Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly1 5 10(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GGCTACAAAA TTCTCCATGA TG22(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13TGGCCGTCAC ATACAGCGTG G 2權(quán)利要求
1.一種重組DNA分子，它含有一種核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種能夠被IFN-α或IFN-β誘導(dǎo)并具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO8所示氨基酸序列的IFNAR1受體結(jié)合蛋白質(zhì)。
2.按照權(quán)利要求1所述的重組DNA分子，還含有一種與所述的編碼IFNAR1受體結(jié)合蛋白質(zhì)的序列以有義方向可操縱連接的啟動(dòng)子，從而當(dāng)該重組DNA分子位于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中時(shí)，所說(shuō)的啟動(dòng)子能夠表達(dá)所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
3.按照權(quán)利要求2所述的重組DNA分子，其中，所說(shuō)的啟動(dòng)子在人類細(xì)胞中是一種強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子。
4.按照權(quán)利要求1所述的重組DNA分子，其中，所說(shuō)的核苷酸序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO7。
5.一種重組DNA或RNA分子，它包括一種DNA分子，該DNA分子含有在有義或反義方向上的SEQ ID NO1或SEQ ID NO7或它們的片段，它們能夠與編碼可由干擾素誘導(dǎo)的IFNAR1受體結(jié)合蛋白質(zhì)的mRNA雜交，從而阻止其表達(dá)；或者一種RNA分子，其序列與所說(shuō)的DNA的序列相對(duì)應(yīng)。
6.按照權(quán)利要求5所述的重組DNA或RNA分子，它含有一種RNA分子。
7.按照權(quán)利要求5所述的重組DNA或RNA分子，其中所說(shuō)的序列是在有義方向上的。
8.按照權(quán)利要求5所述的重組DNA或RNA分子，其中所說(shuō)的序列是在反義方向上的。
9.按照權(quán)利要求8所述的重組DNA或RNA分子，含有一種重組DNA分子，該重組DNA分子還含有一種與所說(shuō)的序列以反義方向可操縱連接的啟動(dòng)子，從而使所說(shuō)的啟動(dòng)子能夠表達(dá)一種反義RNA，該反義RNA與編碼可由干擾素誘導(dǎo)的IFNAR1受體結(jié)合蛋白質(zhì)的有義RNA的全部或者其一部分互補(bǔ)。
10.按照權(quán)利要求9所述的重組DNA分子，其中所說(shuō)的核苷酸序列是一種來(lái)自SEQ ID NO1或SEQ ID NO7的5’-末端的片斷。
11.按照權(quán)利要求2，9和10中任何一項(xiàng)所述的重組DNA分子，其中所說(shuō)的啟動(dòng)子是一種干擾素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
12.按照權(quán)利要求1-5和7-10中任何一項(xiàng)所述的重組DNA分子，它是一種表達(dá)載體。
13.一種宿主細(xì)胞，它能夠表達(dá)與編碼可干擾素誘導(dǎo)的IFNAR1受體結(jié)合蛋白質(zhì)的有義RNA互補(bǔ)的反義RNA，該細(xì)胞含有一種權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
14.一種延長(zhǎng)移植組織存活性的方法，包括如下步驟將一種待向需要移植的病人中移植的組織或器官的細(xì)胞中導(dǎo)入含有權(quán)利要求8-10中任何一項(xiàng)所述的重組DNA分子的表達(dá)載體；以及將該組織或器官移植給病人。
15.一種在癌癥治療中增強(qiáng)對(duì)外源干擾素治療的響應(yīng)的方法，包括如下步驟將含有一種含有權(quán)利要求3或4所述的重組DNA分子的表達(dá)載體，和藥物可接受載體的藥物組合物直接施用在腫瘤上；以及隨后施用外源干擾素治療。
16.一種IFNAR1結(jié)合蛋白質(zhì)，它具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO8的序列。
17.一種分子，它含有特異于權(quán)利要求16的IFNAR1結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體的抗原結(jié)合部分。
18.按照權(quán)利要求17所述的分子，它由一種單克隆抗體組成。
19.一種用于提供IFNAR1受體結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，包括，將按照權(quán)利要求1所述的DNA置于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中，其置入方式應(yīng)使在所說(shuō)的宿主培養(yǎng)之后可得到所說(shuō)蛋白質(zhì)的表達(dá)，和培養(yǎng)所說(shuō)的宿主，以得到所說(shuō)蛋白質(zhì)的表達(dá)。
全文摘要
分離出了新型蛋白質(zhì)IR1B1和IR1B4,它們與I型IFN受體IFNAR1結(jié)合并在對(duì)IFN的細(xì)胞響應(yīng)中發(fā)揮作用?？梢允┯迷谟辛x或反義方向上編碼這種蛋白質(zhì)的DNA,以增強(qiáng)或抑制對(duì)IFN的細(xì)胞響應(yīng)。針對(duì)這些蛋白質(zhì)的抗體可被用于分離這些新型蛋白質(zhì)或用于免疫檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07K14/715GK1243544SQ98801808
公開日2000年2月2日 申請(qǐng)日期1998年1月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月15日
發(fā)明者米歇爾·雷維爾, 卡羅萊娜·阿布拉莫維奇, 朱迪斯·E·舍巴特 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司