專利名稱：縮膽囊素－b/胃泌素受體的免疫原性組合物以及治療腫瘤的方法
背景技術(shù)：
激素胃泌素通過其5′羧基末端的氨基酸與胃泌素/縮膽囊素(CCK)-B受體以高親和力結(jié)合。CCK-B/胃泌素受體是一種細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，它通過G蛋白與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道相連，進(jìn)而再來控制各種基因的表達(dá)。
胃泌素是一種肽激素，其以兩種形式存在，三十四胃泌素(G34)和十七胃泌素(G17)，由位于胃竇處的專一化細(xì)胞G細(xì)胞合成和分泌。激素分泌到循環(huán)血液中并與胃中的特異性細(xì)胞(即間接或直接影響胃酸產(chǎn)生的腸嗜鉻樣(ECL)細(xì)胞和壁細(xì)胞)結(jié)合。在組織學(xué)上，已將胃泌素激素與胃酸分泌的刺激相關(guān)聯(lián)(Edkins，J.S.1905)。(本文引用的全部文獻(xiàn)的全部引證見權(quán)利要求前的參考文獻(xiàn)部分。)在最近幾年，越來越多的證據(jù)表明，胃泌素可能在腸胃道內(nèi)作為一種營養(yǎng)因子(Johnson，L.1997)起作用，且它會促進(jìn)腸胃道癌(Watson等人，1989，Dickinson，C.J.1995)以及非腸胃道癌(包括小細(xì)胞肺瘤)(Rehfeld等人，1989)的生長。在胃泌素的翻譯后加工時，它是“成熟的”羧基酰胺化形式，其通過羧基末端結(jié)合胃泌素/CCK-B受體(Kopin等人，1992)。
已經(jīng)表明，幾種腫瘤(例如結(jié)腸直腸、胃、胰和肝細(xì)胞腺癌)在其質(zhì)膜上具有CCK-B/胃泌素受體，并且以高度細(xì)胞增殖對胃泌素反應(yīng)(Rehfeld，J.F.1972，Upp等人，1989和Watson等人，1993)。另外，更近時期，發(fā)現(xiàn)這些癌細(xì)胞有許多也分泌胃泌素，因此影響了自主增殖通道(Van-Solinge等人，1993，Nemeth等人，1993和Seva等人，1994)。
CCK-B/胃泌素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，對CCK和胃泌素的親和力相同(Soll等人，1984)。該受體命名為CCK-B型受體，因為它主要見于腦中(Wank等人，1992)。隨后發(fā)現(xiàn)該受體與胃壁細(xì)胞和ECL細(xì)胞中的外周CCK/胃泌素受體相同(Nakata等人，1992)。已經(jīng)在許多正常組織(Fourmy等人，1984，Grider等人，1990)和腫瘤組織(Singh等人，1990，Watson等人，1993)中明確鑒定出該受體，并用大鼠胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)R42J作了深入的研究(Scemama等人，1987)。AR42J CCK-B/胃泌素受體的cDNA已經(jīng)被克隆和測序，其與大鼠和人腦中的CCK-B/胃泌素受體的DNA序列同源性大于90％，與犬壁細(xì)胞CCK-B/胃泌素受體cDNA的序列同源性大于84％(Wank，S.A.1995)，這證明即使在物種之間的序列同源性也很高。
肽激素G17和G34結(jié)合正常細(xì)胞細(xì)胞膜上的CCK-B/胃泌素受體。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，G17(不是G34)刺激了胃泌素依賴性癌細(xì)胞的生長。尤其是血清伴隨的G17，它具有以受腫瘤細(xì)胞中CCK-B/胃泌素受體介導(dǎo)的內(nèi)分泌方式(Watson等人，1993)刺激結(jié)腸直腸腫瘤生長的潛在能力。胃泌素-17看來特別涉及刺激結(jié)腸直腸腺癌的生長，這可能是由于它對腫瘤細(xì)胞上的CCK-B/胃泌素受體的親和力高于其它胃泌素激素種類(Rehfeld1972和1993)。發(fā)現(xiàn)CCK-B/胃泌素受體在56.7％的人原代結(jié)腸直腸腫瘤上以高親和力形式表達(dá)(Upp等人，1989)。已經(jīng)假設(shè)由于這些腫瘤內(nèi)源性產(chǎn)生胃泌素前體肽，可能也存在潛在的自分泌環(huán)(Van-Solinge等人，1993和Nemeth等人，1993)。所得G17配體/受體復(fù)合物通過調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的第二信使刺激細(xì)胞生長(Ullrich等人，1990)。G17和CCK-B/胃泌素受體的結(jié)合導(dǎo)致激活磷脂酰肌醇分解、激活蛋白激酶C，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加和通過促分裂素激活蛋白激酶誘導(dǎo)c-fos和c-jun基因(這已經(jīng)涉及細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié))(Tadisco等人，1995)。另外，胃泌素與CCK-B/胃泌素受體的結(jié)合還伴隨了隨后酪氨酸激酶pp125FADK(粘著斑激酶，它在促有絲分裂信號傳遞中也起作用)的磷酸化增加(Tanaguchi等人，1994)。
在許多實驗性腸胃癌中，已經(jīng)從體外和體內(nèi)治療上評價了許多高親和力CCK-B/胃泌素受體拮抗劑。例如，丙谷胺，一種谷氨酸衍生物(Seva等人，190；Harrison等人，1990和Watson等人，1991a)；苯唑普(Benzotript)，一種色氨酸的N酰基衍生物；L-365，260，一種阿斯普西林(Aspercillin)的衍生物(Bock等人，1989)，以及CI-988，一種模擬CCK C端五肽序列的分子(Hughes等人，1990)，這些分子已表明可有效中和外源性胃泌素對體外和體內(nèi)腸胃腫瘤生長的作用(Watson等人和Romani等人，1994)。然而，這些拮抗劑有嚴(yán)重的毒副作用，并缺乏特異性，因為它們封閉正常細(xì)胞中受體(如G34和CCK)的所有潛在配體的作用。最近，還描述了高效選擇性CCKB/胃泌素受體拮抗劑如YM022(Yuki等人，1997)和YF476(Takinami等人，1997)。
丙谷胺和苯唑普已經(jīng)在臨床前研究中作了廣泛評價。這些化合物的主要問題是它們?nèi)狈摿?，代替G17所需的濃度相對較高(Watson等人，1992a；Watson等人，1992b)。盡管如此，丙谷胺和苯唑普還是抑制了許多細(xì)胞系的基礎(chǔ)性增殖和胃泌素刺激的增殖(Seva等人，1990；Watson等人，1991a)。另外，丙谷胺還增加了攜帶胃泌素敏感性小鼠結(jié)腸腫瘤MC26的異種移植小鼠的存活，從對照動物的25天到受治療動物的39天。
由于此類針對胃泌素/CCKB受體的胃泌素拮抗劑的特異性很低，因此，用胃泌素拮抗劑可能不能有效地控制腫瘤生長的抑制。另外，識別并結(jié)合胃泌素的細(xì)胞受體并不結(jié)合所有的測試抑制物(Seva等人，1994)。因此，如果在自分泌生長級聯(lián)反應(yīng)中不能完全抑制胃泌素與受體的結(jié)合，那么胃泌素拮抗劑可能就不能阻斷促進(jìn)腫瘤生長的這一機(jī)制。
發(fā)明概述本發(fā)明提供治療胃泌素依賴性腫瘤的免疫原性組合物和免疫方法。該方法包括用抗CCK-B/胃泌素受體免疫原或抗CCK-B/胃泌素受體抗體主動或被動免疫患者。該免疫原產(chǎn)生的抗體對腫瘤細(xì)胞上的CCK-B/胃泌素受體有特異性，并且阻斷了胃泌素對受體的生長促進(jìn)效應(yīng)。該抗體阻止了肽激素與胃泌素依賴性腫瘤細(xì)胞上的CCK-B/胃泌素受體的結(jié)合；因此，腫瘤生長停滯。另外，令人驚奇的是，對該受體NH2-末端有特異性的抗體在結(jié)合受體時被內(nèi)化并迅速轉(zhuǎn)座到腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞核中。該內(nèi)化作用可發(fā)生于早至細(xì)胞接觸抗體后10秒時?？贵w/受體復(fù)合物的迅速內(nèi)化接著引起受影響的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷凋亡或自殺。
本發(fā)明的免疫原包含從人CCK-B/胃泌素受體衍生獲得的天然的或合成的肽，作為免疫原的免疫模擬(immunomimic)部分。此免疫原還可包含與免疫模擬肽一個末端相連的間隔臂肽序列。免疫原還可與蛋白載體，如白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、牛血清白蛋白等偶聯(lián)。
在一個實例中，針對CCK-B/胃泌素受體的免疫接種方法包括主動免疫，其中用本發(fā)明的免疫原免疫患者。該免疫原刺激產(chǎn)生針對腫瘤細(xì)胞上CCK-B/胃泌素受體的抗體。
抗CCK-B/胃泌素受體免疫原產(chǎn)生的抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的CCK-B/胃泌素受體并有效地阻止肽激素與受體結(jié)合，從而抑制了腫瘤細(xì)胞分裂的自分泌生長刺激通道，并最終抑制了腫瘤的生長。
在本發(fā)明的另一個實例中，治療方法包括被動免疫，其中給予患者足夠濃度的針對CCK-B/胃泌素受體的抗體，以結(jié)合腫瘤細(xì)胞的CCK-B/胃泌素受體，抗體阻斷了肽激素與受體的結(jié)合。激素與其受體結(jié)合的受阻抑制了腫瘤細(xì)胞的生長刺激通道，從而抑制了激素依賴性腫瘤的生長。在本發(fā)明該方面的一個較佳實例中，人治療的抗體可以是用本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生的嵌合的、人源化的或人單克隆抗體。另外，該抗CCK-B/胃泌素受體抗體還可與細(xì)胞毒性分子(如霍亂毒素)、或標(biāo)記了放射性核素(如125I和131I)的放射活性分子偶聯(lián)，以增強殺死腫瘤細(xì)胞的作用。
本發(fā)明還提供了一種診斷胃泌素腫瘤反應(yīng)性的方法，該方法包括用本發(fā)明的抗體通過免疫化學(xué)方法檢測組織活檢中的胃泌素依賴性(含有CCK-B/胃泌素)腫瘤。本發(fā)明的特異性抗CCK-B/胃泌素受體抗體可用于檢測系統(tǒng)，用諸如生物素、辣根過氧化物酶和熒光素等化合物標(biāo)記，通過標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)程序來檢測腫瘤組織中的CCK-B/胃泌素受體。
本發(fā)明還提供了診斷胃泌素依賴性腫瘤的方法，該方法包括用抗CCK-B/胃泌素受體抗體在體內(nèi)檢測胃泌素依賴性(含有CCK-B/胃泌素受體)腫瘤。該方法包括，通過靜脈注射給予患有結(jié)腸直腸腫瘤的患者有效劑量的放射性標(biāo)記的抗CCK-B/胃泌素受體抗體，用標(biāo)準(zhǔn)閃爍掃描方法顯影或檢測細(xì)胞膜結(jié)合有抗CCK-B/胃泌素受體抗體的腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的這一方面，抗CCK-B/胃泌素受體抗體應(yīng)用放射性核素如111銦、90釔和131I標(biāo)記。
附圖簡述

圖1A和1B描述了CCK-B/胃泌素受體及其7個跨膜結(jié)構(gòu)域的示意圖。
圖2顯示了用針對CCK-B/胃泌素受體肽1的免疫原免疫家兔所產(chǎn)生的抗體的ELISA試驗數(shù)據(jù)。
圖3顯示了用針對CCK-B/胃泌素受體肽4的免疫原免疫的家兔所產(chǎn)生的抗體的ELISA試驗數(shù)據(jù)。
圖4顯示了抑制性ELISA試驗獲得的數(shù)據(jù)，該試驗用來評價所產(chǎn)生的針對GRP1-DT免疫原的親和純化抗體的特異性。
圖5的條狀圖顯示了125I-人G17與AR42J細(xì)胞的結(jié)合受肽抑制劑抑制的數(shù)據(jù)。
圖6的條狀圖是免疫金標(biāo)記的AR4-℃J腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)含顆粒分布。
圖7是用針對肽1的抗體對腺癌細(xì)胞核膜的蛋白抽提物進(jìn)行Western印跡分析的照片。
圖8是用針對肽1的抗體對腺癌細(xì)胞的核外和質(zhì)膜蛋白抽提物進(jìn)行Western印跡分析的照片。
圖9的點狀圖描述對照以及抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物的C170HM2腫瘤重量。
圖10的點狀圖描述對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物的C170HM2腫瘤的橫截面積。
圖11的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物的C170HM2腫瘤平均重量。
圖12的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物的C170HM2腫瘤的平均橫截面積。
圖13的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物體內(nèi)C170HM2腫瘤平均數(shù)。
圖14的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物中C170HM2肝轉(zhuǎn)移腫瘤重量的中值。
圖15的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物中C170HM2腫瘤的橫截面積的中值。
圖16的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物中C170HM2腫瘤數(shù)目的中值。
圖17的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物中肝C170HM2腫瘤數(shù)目的平均值和中值。
圖18的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物中肝C170HM2腫瘤重量的平均值和中值。
圖19的條狀圖顯示對照和抗CCK-B/胃泌素受體處理過的動物中C170HM2肝腫瘤轉(zhuǎn)移的橫截面積的平均值和中值。
圖20顯示了對照(正常家兔血清)和抗GRP1處理過的裸鼠C170HM2肝腫瘤異種移植中放射性標(biāo)記125I抗體的濃度。
圖21的條狀圖顯示對照和抗GRP1處理過的裸鼠每個異種移植肝的C170HM2肝腫瘤數(shù)平均值。
圖22的條狀圖顯示了對照和抗GRP1處理過的裸鼠的肝異種移植物的C170HM2肝腫瘤重量的平均值。
圖23顯示了對照和抗GRP1處理過的裸鼠的C170HM2肝腫瘤異種移植蛋白的Western印跡。
圖24是用光學(xué)顯微鏡攝下的組織切片的照片，照片顯示了對照小鼠C170HM2肝異種移植物的蘇木精/伊紅染色的切片。
圖25是光學(xué)顯微鏡攝下的組織切片的照片，照片顯示了經(jīng)家兔抗GRP1抗體處理過的小鼠C170HM2肝異種移植物經(jīng)蘇木精/伊紅染色的切片。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法涉及治療動物(包括人)胃泌素激素依賴性腫瘤，并包括給予患者抗CCK-B/胃泌素受體免疫原，免疫原在受免疫患者體內(nèi)產(chǎn)生抗體與腫瘤細(xì)胞上的CCK-B/胃泌素受體結(jié)合，從而防止激素與受體結(jié)合，以便抑制激素的促進(jìn)生長效應(yīng)。更重要的是，從臨床角度來看，受體/抗GRP1復(fù)合物迅速內(nèi)化，橫穿細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。這表現(xiàn)為觸發(fā)了受影響細(xì)胞的自殺(凋亡)。
免疫原包含人CCK-B/胃泌素受體的天然或合成的肽作為免疫模擬物。特別是，已經(jīng)開發(fā)出兩種合成的肽作為免疫模擬物。這些肽從CCK-B/胃泌素受體的氨基酸序列開發(fā)出來，有免疫原性，能在體內(nèi)和體外與腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性CCK-B/胃泌素受體交叉反應(yīng)。肽1由CCK-B/胃泌素受體序列的氨基酸5-21組成KLNRS VQGTGP GPGASL(肽1，序列表中SEQ ID NO1)。肽1組成了受體的氨基端，其位于細(xì)胞膜的胞外表面上(見圖1)。
在另一個實例中，免疫原包括肽4，其由CCK-B/胃泌素受體的下列氨基酸序列組成GPGAH RALSG APISF(肽4，序列表中SEQ ID NO2)。肽4是受體的第4個胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，它也在質(zhì)膜的外側(cè)(見圖1)。
免疫原還可包含延伸肽或間隔臂(spacer)肽以使免疫模擬性肽突出于蛋白載體上并增強其與淋巴細(xì)胞受體結(jié)合的能力。合適的間隔臂肽序列是氨基酸序列SSPPPPC(絲氨酸(Ser)間隔臂，序列表中SEQ ID NO3)。然而，其它間隔臂肽也同樣適用。然后，使免疫模擬性肽(有或沒有間隔臂)通過羧基端的半胱氨酸殘基與蛋白載體(如白喉類毒素)偶聯(lián)。間隔臂肽在免疫學(xué)上與CCK-B/胃泌素受體衍生的肽無關(guān)，且因此應(yīng)能增強而非決定受體衍生肽的特異性免疫原性。
患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的CCK-B/胃泌素受體的存在和密度可通過使標(biāo)記的抗受體抗體與腫瘤活檢樣品獲得的樣品反應(yīng)來測定?？故荏w抗體可用放射活性示蹤物、染料或熒光標(biāo)記物作標(biāo)記。另外，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從患者的腫瘤活檢樣品來體外評價腫瘤細(xì)胞對胃泌素的反應(yīng)性。腫瘤活檢樣品經(jīng)CCK-B/胃泌素受體抗體試驗呈陽性的患者是用本發(fā)明方法治療的典型候選者。
將有效劑量范圍為0.001-2毫克的免疫原性組合物給予患者來治療腸胃癌癥。免疫原性組合物的有效劑量應(yīng)能在免疫后1-3個月在患者體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生針對CCK-B/胃泌素受體的有效水平的抗體滴度。在對患者免疫后，用標(biāo)準(zhǔn)臨床程序(如超聲和磁共振顯象(MRI))監(jiān)控免疫原的有效性，以檢測腫瘤的存在和大小。針對受體的抗體滴度水平還可從取自患者的血樣來監(jiān)測。加強免疫應(yīng)按需給予，以維持有效的抗體滴度。胃泌素依賴性癌癥(如胃、肝、胰癌和結(jié)腸直腸腺癌)根據(jù)此方法的有效治療應(yīng)導(dǎo)致抑制腫瘤生長并使腫瘤體積減小。
本發(fā)明的抗CCK-B/胃泌素受體免疫原引起的抗體可通過三種可能的機(jī)制對胃泌素依賴性腫瘤產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)(i)抑制胃泌素與其受體的結(jié)合，(ii)降解或破壞腫瘤細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道；和(iii)在受體/抗體復(fù)合物內(nèi)化并遷移到細(xì)胞核中時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(細(xì)胞自殺)。
在本發(fā)明的另一個實例中，將抗CCK-B/胃泌素受體抗體給予患有CCK-B/胃泌素受體反應(yīng)性腫瘤的患者。該抗體特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的CCK-B/胃泌素受體?？贵w和受體的結(jié)合阻止了胃泌素與其在細(xì)胞膜中的配體的結(jié)合，因此，抑制了胃泌素依賴性腫瘤細(xì)胞的生長信號，使腫瘤生長停滯。抗體宜為能有效地結(jié)合靶受體的嵌合或人化抗體或其片段，它可用標(biāo)準(zhǔn)方法制得，如美國專利No.5,023,077，5,468,494，5,607,676，5,609,870，5,688,506和5,662,702中所公開的那些。這些外源產(chǎn)生的抗體還利用它們對腫瘤細(xì)胞生長的抑制或?qū)⒍拘晕镔|(zhì)輸送給腫瘤細(xì)胞來殺死質(zhì)膜上攜帶CCK-B/胃泌素受體的腫瘤細(xì)胞。較佳的治療用抗CCK-B/胃泌素抗體是與受體蛋白胞外結(jié)構(gòu)域1和4(圖1中分別顯示成GRP-1和GRP-4)反應(yīng)的那些抗體。特別佳的是特異性識別并結(jié)合對應(yīng)于肽1和4的受體蛋白氨基酸序列的抗體。這種免疫接種方法中的腫瘤生長抑制還通過超聲顯影和MRI來監(jiān)測，并根據(jù)患者的需要給予重復(fù)免疫。
抗體抑制腫瘤細(xì)胞生長并殺死腫瘤細(xì)胞的效果可通過將細(xì)胞毒性分子與抗CCK-B/胃泌素抗體偶聯(lián)來增強。細(xì)胞毒性分子可以是毒素，例如是霍亂毒素、蓖麻毒素、α-鵝膏覃堿或標(biāo)記的放射活性分子(例如用125I或131I)、或化療劑(例如胞嘧啶阿拉伯糖苷或5-氟尿嘧啶)。
抗體除了可用125I和131I作放射性標(biāo)記外，抗CCK-B/胃泌素受體抗體還可用放射性核素如111銦和90釔標(biāo)記。在本發(fā)明的這一方面，抗體可用來體內(nèi)檢測和診斷具有CCK-B/胃泌素受體的腫瘤，方法是將這些抗體給予患者，并檢測含有CCK-B/胃泌素受體的腫瘤細(xì)胞上結(jié)合的抗體。在注射后約1-2小時放射標(biāo)記的抗CCK-B/胃泌素抗體達(dá)到腫瘤，用以前公開的標(biāo)準(zhǔn)閃爍方法(Harrison′s Principles ofInternal Medicine，Isselbacher等人編輯，第13版，1994)使放射活性“熱點”顯影。
給予患者治療胃泌素依賴性腫瘤的免疫原組合物可以是各種形式。這些形式包括(例如)固體、半固體和液體劑型，例如粉末、液體溶液、懸液、栓劑以及可注射和可灌輸溶液。較佳的形式取決于打算采用的給藥方式以及治療用途。組合物包含本發(fā)明的免疫原以及合適的藥學(xué)上可接受的組分，并且可能包括其它藥物制劑、載體、佐劑、賦形劑等。合適的佐劑可包括去甲胞壁酰二肽(nor-MDP，Peninsula Labs.，CA)，和油如Montanide ISA 703(Seppic，Inc.，Paris，F(xiàn)rance)，它們可用標(biāo)準(zhǔn)方法混合。較佳的是，組合物是單位劑量形式。一次或在一段時間內(nèi)給予活性化合物用于免疫或作為藥劑的量將取決于受治療對象、給藥方式和形式、和治療醫(yī)師的判斷。
用于被動免疫的本發(fā)明抗CCK-B/胃泌素受體抗體宜用藥學(xué)上可接受的載體(如鹽溶液例如磷酸緩沖鹽溶液)靜脈給予患者。
實施例1GRP1-DT和GRP4-DT偶聯(lián)物的制備用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方法制得CCK-B/胃泌素受體肽。為使免疫原能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，合成羧基端各有間隔臂序列SSPPPPC(序列表中SEQ ID NO3)的肽1和肽4。隨后，用一端為琥珀酰亞胺酯而另一端為馬來酰亞胺的異雙功能連接劑，利用下述方法A或方法B，通過間隔臂序列末端肽氨基酸殘基半胱氨酸使這些肽與載體(白喉類毒素(DT))上的氨基偶聯(lián)。
方法A如以前在美國專利No.5,023,077中所述的，將肽1或4連接在載體上通過如下方式實現(xiàn)。將干的肽溶解在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)和30倍摩爾過量的二硫蘇糖醇(DTT)中。在水飽和的氮氣氣氛下攪拌溶液4小時。通過在G10 Sephadex柱(用0.2M乙酸平衡)層析，將含還原半胱氨酸的肽與其它組分分離。將肽凍干并真空保藏至使用。用異雙功能連接劑如ε-馬來酰亞氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)處理激活載體，此連接劑的比例足以在每105分子量載體中激活約25個游離的氨基。在白喉類毒素的具體例子中，用量為每20毫克白喉類毒素中加入6.18毫克EMCS(純度為75％)。
將每20毫克等份白喉類毒素溶解在1毫升0.2M磷酸鈉緩沖液(pH6.45)中，從而激活白喉類毒素。將等份6.18毫克EMCS溶解在0.2毫升二甲基甲酰胺(DMF)中。在暗處將50微升EMCS滴加入DT同時攪拌。在暗處培育2小時后，使混合物在G50 Sephadex柱(用含有0.1mM EDTA的0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡)上層析。
在暗處，將含有EMCS激活的白喉類毒素的組分在PM10超濾膜上濃縮。用Lowry法或Bradford法測定濃縮物的蛋白含量。載體的EMCS含量這樣來測定使激活的載體與半胱氨酸-HCl一起培育，然后和10mM Ellman′s試劑5，5′-二硫代-雙(2-硝基苯甲酸)10mM反應(yīng)。用5-硫代-2-硝基苯甲酸于412nm的摩爾消光系數(shù)為13.6×103，將含半胱氨酸-HCl的空白管和含半胱氨酸-HCl以及載體的樣品管之間的光密度差轉(zhuǎn)換成EMCS基團(tuán)含量。
另用Ellman′s試劑測定該肽的還原半胱氨酸含量(-SH)。將約1毫克肽溶解在1毫升氮氣飽和的水中，使該溶液的0.1毫升等份與Ellman′s試劑反應(yīng)。用5-硫代-2-硝基苯甲酸的摩爾消光系數(shù)(13.6×103)計算游離的半胱氨酸-SH。將含有的游離-SH足以與載體上25個EMCS激活的各個氨基反應(yīng)的肽量溶解在含有0.1mMEDTA的0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中，于暗處滴加入EMCS激活的載體中。在所有肽溶液加入載體中后，使混合物于暗處在水飽和氮氣氣氛下培育過夜。
在G50 Sephadex柱上(用0.2M碳酸氫銨平衡)層析，將通過EMCS與載體連接的肽偶聯(lián)物與混合物的其它組分分離。將空柱體積中洗脫的偶聯(lián)物凍干，20℃干燥貯藏至使用。
對所得偶聯(lián)物可作肽含量特征分析，肽含量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法(包括重量增加、氨基酸分析等)來測定。用該方法制得帶間隔臂序列的肽1和4與白喉類毒素的偶聯(lián)物經(jīng)測定具有有效的肽/載體比值(每100KD MW載體有5-35摩爾肽)，并且認(rèn)為均適于用作免疫原來免疫受測試動物。較佳的是，每100KDMW的DT有10-30摩爾范圍的肽產(chǎn)生了有效的免疫應(yīng)答。
方法B在一個較佳的方法中，含有GRP1偶聯(lián)于DT以及GRP4偶聯(lián)于DT的偶聯(lián)物可在室溫下用下列方法制備。將純化的DT(400毫克)溶解在氮氣飽和的20毫升0.5M磷酸鹽緩沖液(pH6.6)中，形成20毫克/毫升的DT溶液。將DT溶液置于60毫升棕色玻璃瓶(作為反應(yīng)容器和過濾貯器)中。將EMCS偶聯(lián)劑(123.6毫克)溶解在2.0毫升二甲基甲酰胺中。在15分鐘內(nèi)將EMCS溶液滴加入DT溶液中同時連續(xù)攪拌。給瓶加蓋，在室溫下再攪拌混合物1小時45分鐘，形成活化的DT(M-DT)。然后用Amicon Model TFC10細(xì)通道超濾系統(tǒng)借助操作手冊I-113G和XM50滲流超濾膜對M-DT進(jìn)行滲濾純化。用420毫升磷酸鹽緩沖液洗M-DT兩次，每次濃縮至20毫升，然后用420毫升含有0.1M EDTA的0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH＝6.0)洗一次，將溶液濃縮至20毫升。
為了制備GRP1-DT偶聯(lián)物，將2.02毫升M-DT溶液(含有22.3毫克M-DT)置于10毫升棕色玻璃管中，然后將13毫克GRP1肽溶解在檸檬酸鹽緩沖液中，獲得40毫克/毫升肽，滴加入M-DT溶液同時攪拌。為了制備GRP4-DT偶聯(lián)物，將2.21毫升M-DT溶液(含有24.4毫克M-DT)置于10毫升棕色玻璃管中，然后將13毫克GRP4肽溶解在檸檬酸鹽緩沖液中，獲得40毫克/毫升肽，并滴加入M-DT溶液中同時攪拌。
使反應(yīng)在暗處進(jìn)行過夜。從反應(yīng)容器中取出每個偶聯(lián)物，并分別在12000-14000MW截留透析管中用500毫升0.1M碳酸氫銨溶液換液5次透析。將每個偶聯(lián)物凍干。然后用氨基酸分析法分析偶聯(lián)物，測得GRP1-DT的肽與DT替代比值為每105MW DT有21.8個肽，GRP4-DT的肽與DT替代比為每105MW DT有21.1個肽。
用該方法制得的帶間隔臂的肽1和4與DT的偶聯(lián)物具有有效的肽/載體比(每100KD MW載體有5-35摩爾肽)，這些偶聯(lián)物均被認(rèn)為適于用作免疫原。產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答的較佳比例范圍為每100KD MW的DT有10-25摩爾肽。
免疫原的制備用上述含有肽1或肽4以間隔臂偶聯(lián)于DT的本發(fā)明的免疫原來免疫家兔。免疫原的制備如下將偶聯(lián)物溶解在0.15M磷酸鈉緩沖鹽溶液(pH7.3)中至濃度為3.79毫克/毫升。將偶聯(lián)物溶液加入Montanide ISA(703)佐劑(Seppic，Inc.)中，偶聯(lián)物溶液與Montanide ISA 703之比為30∶70(重量∶重量)，然后用Silverson勻化器8000RPM勻化混合物3分鐘，形成含有1毫克/毫升偶聯(lián)物的乳液。
免疫和樣品收集用由0.1毫克GRP1-DT或GRP4-DT偶聯(lián)物組成的0.1毫升免疫原肌內(nèi)注射家兔。每只家兔于0至4周注射免疫原。在實驗的6和8周，收集每只家兔的血液。從每一血樣制備血清并-20℃保藏至用于測定抗CCK-B/胃泌素受體抗體存在的試驗。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)用固相ELISA篩選每一免疫家兔針對肽1和肽4產(chǎn)生的抗血清的反應(yīng)或交叉反應(yīng)。ELISA如下進(jìn)行用25微升/孔10微克/毫升連接牛血清白蛋白(BSA)的肽1(GRP1-BSA)、或連接BSA的肽4(GRP4-BSA)抗原(0.1M甘氨酸-HCl，pH9.5緩沖液配)包被聚苯乙烯96孔板(IMMULON II Dynatech)。將這些孔板4℃培育過夜，隨后用緩沖液洗滌。
用1％BSA-FTA凝血緩沖液(pH7.2)將從免疫家兔獲得的抗血清連續(xù)作10-1至10-8范圍的稀釋。每孔25微升測試抗血清與各測試肽室溫培育1小時。培育后，用緩沖液充分洗滌平板，除去所有未結(jié)合的抗體。每個孔用25微升生物素化的山羊抗家兔IgG(H+L)(在1％BSA-FTA稀釋緩沖液中以1∶1000稀釋)室溫下處理1小時。在洗滌平板除去未結(jié)合的抗家兔試劑后，使每個孔和25微升親和素-堿性磷酸酶偶聯(lián)物(1％BSA-FTA緩沖液中1∶1000稀釋)室溫培育1小時。充分洗板除去未結(jié)合的親和素-堿性磷酸酶試劑，并和25微升1毫克/毫升p-硝基苯磷酸鹽(PNPP)(用含有0.01％MgCl2·6H2O的10％二乙醇胺緩沖液(pH9.8)配)一起培育。使平板顯色脂質(zhì)反應(yīng)物在490納米波長下的吸光值達(dá)到光密度為0.8-1.5。為了測試家兔產(chǎn)生的抗血清的特異性，也用DT免疫家兔，對于ELISA測試，用DT作為抗原包板以測定產(chǎn)生的抗載體抗血清的反應(yīng)性。
圖2顯示用肽1/GRP1作為抗原的ELISA結(jié)果，圖3顯示了用肽4/GRP4作為抗原的ELISA結(jié)果。從圖2可以看出，ELISA結(jié)果顯示經(jīng)肽1-間隔臂-DT偶聯(lián)物免疫的家兔產(chǎn)生了特異性結(jié)合肽1的高滴度抗體，即使抗血清在高稀釋度(1∶100,000)下抗體仍能結(jié)合肽1。同樣，圖3表明經(jīng)肽4-間隔臂-DT偶聯(lián)物免疫的家兔產(chǎn)生了高滴度的抗肽4抗體。從圖2和3看出，經(jīng)各個肽免疫的家兔產(chǎn)生的抗體在低抗血清濃度下能與各肽特異性結(jié)合。數(shù)據(jù)表明，抗肽1和抗肽4抗體結(jié)合CCK-B/胃泌素受體的肽1和4的能力很強。數(shù)據(jù)還表明，用本發(fā)明的偶聯(lián)物免疫家兔引發(fā)了分別針對肽1和肽4的強免疫應(yīng)答反應(yīng)。另外，經(jīng)肽1或肽4偶聯(lián)物免疫的家兔看來是正常的，在實驗期間沒有表現(xiàn)出任何疾病或病理性癥狀。
實施例2進(jìn)行下列實驗以在家兔內(nèi)建立針對實施例1中用方法B制得的含Ser間隔臂的GRP1-DT肽的抗體特異性。進(jìn)行一系列測試以評價GRP1-DT免疫誘導(dǎo)出的并用GRP1-Ser Sepharose柱免疫吸附親和純化的家兔抗體的特異性。
用抑制性ELISA評價親和純化抗體的GRP1-Ser肽特異性。實驗的進(jìn)行如下使50微升2微克/毫升偶聯(lián)物溶液(甘氨酸緩沖液配，0.1M，pH＝9.5)4℃培育過夜，以將GRP1-Ser-BSA偶聯(lián)物包被于96孔板(Immulon U bottom)上。使親和純化的抗GRP1抗體(最終濃度為10ng/ml)與不同抑制劑(連續(xù)1∶10稀釋)結(jié)合并在室溫下培育1小時。抑制劑包括GRP1-Ser、GRP1 EPT、Ser、人胃泌素17(1-9)-Ser間隔臂(hG17(9)-Ser)、GRP1 EPT+Ser、和緩沖液(沒有抑制劑)。培育緩沖液由PBS+0.5％BSA+0.05％吐溫20+0.02％NaN3組成。隨后的步驟采用相同的緩沖液，只是沒有BSA。洗滌96孔板去除未結(jié)合的GRP1-Ser-BSA，加入抗體+抑制劑的混合物(50微升/孔)。1小時后，洗滌平板，加入山羊抗家兔Ig(H+L)堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Zymed)(1∶2000稀釋)。培育1小時后，洗滌平板除去未結(jié)合的試劑，加入50微升/孔pNPP底物(Sigma)溶液(1毫克/毫升以底物緩沖液(PBS+0.1毫克/毫升MgCl2+10％二乙醇胺+0.02％NaN3配)。培育60分鐘后，在MRX讀數(shù)計(Dynatech Laboratories)上測定吸收值。對每一濃度樣品作一式兩份測定并計算平均值。從所有數(shù)值中減去背景結(jié)合值(用親和純化的家兔抗GnRH抗體建立)，對于測試的每種抑制劑計算相對于未加入抑制劑(抗GPR1抗體+緩沖液)的抑制％抑制％＝(100)(1-((A未抑制-A抑制)/A未抑制)，其中A為吸收值。結(jié)果顯示在圖4中。
圖4表示抗體結(jié)合的抑制百分?jǐn)?shù)是抑制劑濃度的函數(shù)。從該圖中可以看出，GRP1-Ser肽完全抑制了抗體與GRP1-Ser-BSA的結(jié)合。用不含Ser間隔臂序列的GRP1 EPT肽(GRP1 EPT加Ser間隔臂等摩爾混合物)獲得了約60％的抑制。這些肽不能產(chǎn)生完全的抑制表明，抗體的比例對于包含GRP1和Ser間隔臂序列兩種元件的表位是特異性的。而Ser間隔臂序列本身或攜帶Ser間隔臂的不相關(guān)肽(hG17(9)-Ser，(由hG17氨基末端9個殘基以及Ser間隔臂組成)沒有獲得抑制。這些ELISA結(jié)果證明，親和純化抗體制備物對GRP1-Ser肽有特異性，且60％的結(jié)合活性針對肽的胃泌素受體表位組分。
實施例3AR42J腫瘤細(xì)胞(歐洲動物細(xì)胞保藏中心，Porton Down，UK)系從大鼠胰腺癌獲得，已明確知道有CCK-B/胃泌素受體。因此，測試了AR42J以確認(rèn)CCK-B/胃泌素受體的表達(dá)以及放射性配體抑制的hG17受體的特異性。AR42J細(xì)胞在完全RPMI1640(Sigma)中7％CO2下37℃培育，RPMI中添加了10％FCS(GeminiBioproducts)、2mM谷氨酰胺(JRH Biosciences)、1mM丙酮酸鈉(JRH B.)和50微克/毫升慶大霉素(Gemini Bioproducts)。用含0.25％EDTA的PBS從175cm2T形瓶收獲細(xì)胞，然后用PBS(沒有EDTA)洗兩次，離心(400Xg10分鐘)。所有操作均維持細(xì)胞于0-4℃。用緩沖液制備單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106細(xì)胞/毫升。將1毫升細(xì)胞懸液等份加入12×75毫米培養(yǎng)管中，然后離心細(xì)胞并棄去上清液。將細(xì)胞重懸于含有人G17(hG17)、促性腺激素釋放激素(GnRH)或沒有肽的PBS(0.1毫升/管)中。肽濃度為1.0ng/ml、100ng/ml和10μg/ml。每管中加入含有約26300CPM(比活，2200Ci/毫摩爾)的0.1毫升125I-hG17(NEN)等份。振蕩試管，然后培育15分鐘。用PBS洗細(xì)胞兩次，然后在γ計數(shù)器(Wallac)中計數(shù)。樣品作一式兩份測定。減去背景計數(shù)，然后用下列公式計算每種抑制劑抑制125I-hG17結(jié)合的百分?jǐn)?shù)抑制％＝(100)(1-((CPM未抑制-CPM抑制)/CPM未抑制)。
放射性配體結(jié)合抑制測試的結(jié)果顯示在圖5中，其表明了單個值的平均值(±SE)。從圖中可以看出，125I-hG17與AR42J細(xì)胞的結(jié)合被G17抑制。抑制的程度隨加入抑制劑的量而增加，至每管1微克hG17(測試肽最高濃度)為32％抑制。相反，GnRH在兩個測試最高濃度(100pg GnRH獲得6％的抑制被認(rèn)為系非特異性)下沒有產(chǎn)生抑制，這表明hG17的抑制對胃泌素有特異性。這些結(jié)果確認(rèn)了AR42J腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)有胃泌素受體。
實施例4用免疫熒光法評價GRP1-Ser特異性抗體與AR42J細(xì)胞的結(jié)合。如前述實施例那樣培養(yǎng)生長AR42J細(xì)胞，用細(xì)胞刮器從175cm2T形瓶收獲細(xì)胞，用緩沖液(有0.02％NaN3的PBS)洗兩次，然后離心(400Xg7分鐘)。所有操作均維持細(xì)胞在0-4℃。以緩沖液制備單個細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106個細(xì)胞/毫升。將細(xì)胞懸液加入1.5毫升微量離心管(1毫升/管)中。離心使細(xì)胞沉淀，抽吸上清液。將細(xì)胞重懸于含有肽抑制劑(1.0毫克/毫升)的緩沖液(0.1毫升/管)中。抑制劑包括GRP1-Ser、GnRH、hG17(9)-Ser和緩沖液(沒有抑制劑)?？贵w包括家兔抗GRP1-Ser(100微克/毫升)、親和純化的家兔抗DT(陰性對照，100微克/毫升)、小鼠抗AR42J抗血清(陽性對照，1∶100稀釋，熱滅活)或正常小鼠血清，將抗體加入合適的試管中并混合。培育細(xì)胞1小時并不時攪拌。然后用緩沖液洗細(xì)胞三次，每管中加入0.1毫升熒光素標(biāo)記的山羊抗家兔IgG(Antibodies Incorporated)(1∶50稀釋)。經(jīng)小鼠血清處理的細(xì)胞用熒光素抗小鼠IgG試劑(Zymed)顯色。振蕩細(xì)胞使其重懸，然后培育1小時。再洗細(xì)胞三次，然后重懸于甘油∶PBS(1∶1，v∶v)中(50微升/管)。用每管所含物質(zhì)制備濕標(biāo)本(wet mount)，用Laborlux 12熒光顯微鏡(Leitz)檢測細(xì)胞。熒光按0至4級評分，0表示背景熒光(用正常小鼠血清獲得)，4表示最大熒光(用小鼠抗AR42J陽性對照抗血清獲得)。
免疫熒光測試的結(jié)果顯示在表1中。從表中可以看出，在沒有肽抑制劑存在下用抗GRP1-Ser抗體處理的AR42J細(xì)胞有很強的熒光，這表明抗體與細(xì)胞結(jié)合。家兔抗-DT抗體沒有產(chǎn)生熒光染色，這表明抗GRP1-Ser抗體所觀察到的染色不是家兔免疫球蛋白的非特異性細(xì)胞表面結(jié)合的結(jié)果。另外，顯示出結(jié)合對GRP1-Ser肽有特異性。GRP1-Ser的加入完全抑制了結(jié)合，而不相關(guān)的肽(包括hG17(9)-Ser和GnHR)卻不能抑制。由于GRP1表位包含胃泌素受體的殘基5-21，結(jié)論是抗GRP1-Ser抗體對AR42J細(xì)胞表達(dá)的胃泌素受體有特異性。
表1<
>實施例5將傳代16-18代的AR42J細(xì)胞培育在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞在濕度100％、5％CO2的空氣下維持于37℃，在T75瓶(Falcon，London，UK)中生長至80％鋪滿，在0.02％EDTA處理以將粘附細(xì)胞變?yōu)閼腋『筮M(jìn)行傳代。使細(xì)胞和實施例1所述的抗CCK-B/胃泌素受體抗體(aGR)一起培育10秒、30秒、30分鐘和1小時，該抗體用本發(fā)明的CCK-B/胃泌素肽1受體免疫原在家兔內(nèi)產(chǎn)生，并已在肽1制備的柱中經(jīng)親和層析純化。
將細(xì)胞固定在1％戊二醛中1小時，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備細(xì)胞用于免疫電子顯微鏡(ImmunoEM)研究。2000rpm離心細(xì)胞懸液2次2分鐘，然后將細(xì)胞沉淀重懸于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。用LR白塑料樹脂過濾細(xì)胞沉淀。切成厚度為70-90nm的超薄切片置于Pioloform涂布的鎳柵格上。將柵格置于正常山羊血清(Dako，HighWycome，UK)(0.1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，Poole，Dorset)配)中并室溫培育30分鐘。用PBS清洗柵格，然后和第二抗體生物素偶聯(lián)的山羊抗家兔抗體(金標(biāo)記)(1∶50稀釋在1％BSA中)一起室溫培育1小時。進(jìn)行沒有第二抗體的對照實驗。在最后PBS洗滌后，在飽和的水性醋酸雙氧鈾和Reynold′s檸檬酸鉛中復(fù)染色柵格各3分鐘。計數(shù)在細(xì)胞膜上、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、細(xì)胞核膜上以及細(xì)胞核內(nèi)的金顆粒。由獨立觀察者計數(shù)每柵格中的25個細(xì)胞。對于對照，使AR42J與抗體接觸至少1秒，采用沒有CCK-B/胃泌素受體的肝細(xì)胞。另用接觸正常IgG的AR42J細(xì)胞作為對照來測定抗CCK-B/胃泌素受體抗體的非特異性結(jié)合。這些試驗的結(jié)果顯示在表2和圖6中。
表2AR42J細(xì)胞中CCK-B/胃泌素受體免疫金顆粒的分布
(25個細(xì)胞的平均值±SEM，重復(fù)5次)表2和圖6表明，與CCK-B/胃泌素受體相連的免疫抗體金顆粒位于腺癌細(xì)胞的質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜和核質(zhì)上，這進(jìn)一步證明抗體/受體復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)化。
從表2看出，采用針對CCK-B/胃泌素受體氨基末端的抗血清所作的免疫電子顯微鏡研究表明，在培育1小時后，免疫金標(biāo)記的CCK-B/胃泌素受體抗體的分布迅速內(nèi)化，12％的抗體受體復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合，36.6％在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，7.9％在核膜中，非常令人驚奇的是，43.5％在細(xì)胞核內(nèi)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)CCK-B/胃泌素受體免疫反應(yīng)性強的區(qū)域在染色質(zhì)上，這提示特異性結(jié)合位點起著調(diào)節(jié)DNA的作用。
用偶聯(lián)于金珠的抗免疫球蛋白(免疫金珠)的這些電子顯微鏡研究揭示抗受體/受體復(fù)合物在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生極為迅速的翻轉(zhuǎn)(turnover)；早在接觸抗體10秒時就可在細(xì)胞核內(nèi)檢測到復(fù)合物(如圖6所示)。
實施例6使腺癌細(xì)胞系，即AR42J、HCT116、C170HM2、Lovo、ST16和MGLVA1在體外生長，并如實施例3所述那樣進(jìn)行收獲。將30x T-75瓶的細(xì)胞懸浮在5毫升勻化緩沖液(1mM碳酸氫鈉、2mM氯化鎂、1nM苯甲磺酰氯、40mM氯化鈉、10微升亮抑酶肽、1μM抑胃酶肽5μM EDIA)中。在勻化器中沖擊5次(每次5秒)，進(jìn)行勻化。對于核外膜，4℃500g離心7分鐘使組織碎片沉淀。棄去沉淀，使上清液4℃500g離心，以進(jìn)一步除去碎片。使上清液4℃48000g再離心1小時。將含有核外膜制備物的沉淀懸于Tris/NP-40溶液(0.1M TRIZMA、0.5％NONIDET P40[Sigma Chemical])中。
對于核膜制備物，在第二勻化緩沖液(25mM Tris-HCl，pH7.4，0.1％TRITON100，0.32M蔗糖，3mM MgCl2，2mM EGTA，0.1mM精胺四鹽酸，2mM PMSF，10mM苯并亞胺(bezomidine)鹽酸鹽，3mM EGTA氨基乙腈鹽酸鹽[Sigma])中勻化后，通過4℃400g離心10分鐘使組織碎片沉淀。將沉淀重懸于55％(0.2M)蔗糖(HPLC水配)中。4℃60000g離心該混合物1小時。用0.4％NONIDET P40(用不含TRITON100的勻化緩沖液配)洗滌沉淀。4℃700g離心沉淀15分鐘，重懸于不含TRITON100的勻化緩沖液中。
用Lowey法(用Pierce的試劑盒)測定蛋白含量。將含有10-15微克的樣品上樣于8-16％Tris/甘氨酸梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE(Novex R和D系統(tǒng)在Tris/甘氨酸緩沖液中，并在125伏恒壓、36mA下跑90分鐘。將凝膠固定在10％冰醋酸中1小時，將樣品點樣在硝酸纖維素膜上。使膜在1％BSA中培育1小時，然后和GRP1抗血清(有和沒有預(yù)吸收)一起培育1小時。用親和素生物素-過氧化物酶復(fù)合物方法以二氨基-聯(lián)苯胺(bezidene)為底物檢測抗體結(jié)合。用針對肽1產(chǎn)生的家兔抗血清(家兔抗GRP1抗血清)作的Western印染結(jié)果分析顯示在圖7和8中。
如圖7所示，蛋白分子量標(biāo)記的范圍從116、66、45到29kDa。印跡顯示，在所有被研究的腺癌細(xì)胞中(即HCT116、C170HM2、LoVo、ST16和MGLVA1(除AP5LV外))均在大約43kDa處顯示了顯著的抗肽1免疫活性條帶。該蛋白對應(yīng)于截短形式的CCK-B/胃泌素受體。一些細(xì)胞系(HCT116和C170HM2)顯示出分子量在60-100KDa范圍內(nèi)的至少其它3條條帶。數(shù)據(jù)表明，抗CCK-B/胃泌素受體抗體能識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞中CCK-B/胃泌素受體的不同同種型。
圖8顯示了C170HM2和HCT160腺癌細(xì)胞核外(ENM)和質(zhì)膜的Western印跡結(jié)果。如圖8所示，測試腺癌細(xì)胞系的ENM CCK-B/胃泌素受體證明存在兩條強烈染色的條帶一條約為43kDa，另一條大約66KDa。當(dāng)只對質(zhì)膜組分染色時，出現(xiàn)了在大約66KDa處的單個條帶。因此，Western印跡研究確認(rèn)了免疫電子顯微鏡研究的結(jié)果，即CCK-B/胃泌素受體存在于腺癌腫瘤細(xì)胞中，但是免疫電子顯微鏡研究沒有區(qū)分CCK-B/胃泌素受體的同種型。數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的免疫原引發(fā)了能識別和結(jié)合受體不同同種型的抗CCK-B/胃泌素受體抗體，這對于治療這些腫瘤是有利的。
實施例7將C170HM2腺癌細(xì)胞腹膜內(nèi)注射入裸鼠中，使腫瘤在肝中生長。對照小鼠接受磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的灌輸，試驗小鼠接受一種抗CCK-B/胃泌素受體抗體的灌輸。在組1中，每只小鼠每天灌輸0.5毫克針對肽1產(chǎn)生的家兔抗CCK-B/胃泌素受體抗體(家兔抗肽1，Rbt@GRP1)。在組2中，每只小鼠每天接受0.5毫克針對肽4產(chǎn)生的家兔抗CCK-B/胃泌素受體抗體(家兔抗肽4，Rbt@GRP1)。灌輸抗體后40天期間研究小鼠，處死并取出腫瘤進(jìn)行研究。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評價腫瘤的重量、大小和橫截面積。結(jié)果顯示在圖9和10中。
如圖9和10所示，在小鼠中植入結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞系C170HM2而不加處理導(dǎo)致大腫瘤塊迅速生長(經(jīng)腫瘤重量或腫瘤大小以及腫瘤的腫瘤橫截面積測得)。然而，用家兔抗肽1或家兔抗肽4抗體灌輸動物導(dǎo)致有可檢測腫瘤的動物數(shù)量顯著降低，并使患腫瘤動物的腫瘤重量和大小明顯比對照低。在計算腫瘤平均重量、腫瘤平均體積、或腫瘤平均數(shù)時，可以看到相同的效果。這些數(shù)據(jù)顯示在圖11、12和13中。
通過計算腫瘤數(shù)、重量和大小的中值(median)，進(jìn)一步了解其在群體內(nèi)的分布。結(jié)果顯示在圖14、15和16中。從這些圖可以看出，家兔抗肽1免疫原在抑制腫瘤生長方面始終比家兔抗肽4更有效。然而，與對照處理相比，家兔抗肽1和家兔抗肽4均表現(xiàn)出了很強的腫瘤抑制活性。
實施例8用結(jié)腸癌細(xì)胞系C170HM2通過實施例7所述的方法(只是初始細(xì)胞接種量更高)在裸鼠內(nèi)產(chǎn)生更大的腫瘤負(fù)荷。C170HM2是肝侵襲性異種移植模型。對照和試驗小鼠也用實施例7描述的方法處理。
灌輸抗體40天后，處死小鼠，取出肝腫瘤并進(jìn)行研究。圖17、18和19顯示了這些試驗的結(jié)果。圖17顯示了對照以及抗CCK-B/胃泌素受體抗體治療動物的肝腫瘤數(shù)的平均值和中值。數(shù)據(jù)表明，家兔抗CCK-B/胃泌素受體抗體(家兔@GRP)有效地抑制了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。在與對照比較時，用家兔抗肽1，小鼠肝內(nèi)肝腫瘤平均數(shù)在數(shù)值上明顯降低(斯徒登特T試驗)p＝0.0084，肝腫瘤數(shù)中值p＝0.0016(Mann Whitney)。用抗肽4抗體處理的小鼠也顯示出肝腫瘤數(shù)平均值減少；然而，該動物中的肝腫瘤平均數(shù)與對照相比沒有差別。
圖18表明抗肽1和抗肽4抗體還能減少肝轉(zhuǎn)移腫瘤重量的平均值和中值(與對照動物相比)。圖19中的數(shù)據(jù)表明，抗CCK-B/胃泌素受體處理過的小鼠肝腫瘤橫截面積的平均值和中值與對照動物相比也顯著降低。
數(shù)據(jù)表明，抗CCK-B/胃泌素受體抗體有效地控制了胃泌素依賴性結(jié)腸癌在肝(這種癌轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散的主要部位)內(nèi)的擴(kuò)散和生長。
實施例9我們進(jìn)行這些研究來確認(rèn)GRP1對C170HM2細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。研究的目的是為了評價針對GRP1產(chǎn)生的抗血清的腫瘤定位作用，并測定其對裸鼠肝內(nèi)C170HM2細(xì)胞生長的治療效果。如上述實施例7所述，將C170HM2細(xì)胞腹膜內(nèi)注射入裸鼠內(nèi)。在家兔內(nèi)產(chǎn)生GRP1抗血清。抗血清用125I作放射性標(biāo)記，并給予已通過尾靜脈注射建立起C170HM2異種移植的裸鼠。對照小鼠接受125I放射性標(biāo)記的正常家兔血清。在注射單劑125I抗體后漸增的時間點處死小鼠。根據(jù)每分鐘每克組織(CPM/g)的計數(shù)測定放射活性，并計算肝/肝腫瘤比。
圖20顯示了結(jié)合于肝腫瘤的放射性標(biāo)記的家兔抗GRP1抗體(與對照相比)。從圖中看出，與肝腫瘤組織結(jié)合的家兔抗GRP1抗體多于對照。圖20還表明，對于放射性標(biāo)記的正常家兔血清和GRP1抗血清，y軸的肝腫瘤/肝比值隨著x軸時間的增加而增加。正常家兔血清在第1天的比值為1并保持不變至第5天。這表明肝腫瘤和正常肝內(nèi)的放射性標(biāo)記水平是相同的。GRP1抗血清比值呈指數(shù)型累積，在第5天達(dá)到2。這表明放射性標(biāo)記的GRP1抗血清特異性地定位于C170HM2肝腫瘤內(nèi)。
實施例10GRP1抗血清對C170HM2異種移植的治療性效果C170HM2腫瘤異種移植通過腹膜內(nèi)注射細(xì)胞來引起。用三種不同的細(xì)胞接種物來產(chǎn)生3種水平的腫瘤負(fù)荷。從第0天起，通過每天尾靜脈注射被動給予GRP1抗血清。治療在第40天終止。
GRP1抗血清對腫瘤“攝取率(take rate)”的影響評價的最初參數(shù)是肝內(nèi)腫瘤平均數(shù)，其顯示在圖21中。將正常家兔抗血清處理的對照編在增加細(xì)胞接種物的組中。如圖21所示，對照組中，每個肝的腫瘤平均數(shù)在1至3之間。GRP1抗血清處理組中，對所有三次細(xì)胞接種物，每個肝的腫瘤平均數(shù)均低于1，所有3個試驗均是有意義的(一次接種，n＝18，p＝0.003；2次接種，n＝12，p＝0.0001和3次接種，n＝20，p＝0.0068，Mann Whitney分析)。
GRP1抗血清對建立的腫瘤重量影響圖22顯示了正常家兔血清處理過的對照(左圖)對于3次增加細(xì)胞接種的腫瘤重量平均值。圖中還顯示了GRP1抗血清處理后的裸鼠腫瘤重量平均值，所有3次細(xì)胞接種使肝重量平均值減少60％，所有3個試驗均是有意義的(一次接種，p＝0.0016；2次接種，p＝0.0084，和3次接種，p＝0.0001，Mann Whitney分析)。
Western印跡測定C170HM2異種移植中的GRP1免疫反應(yīng)性從3個試驗中2個的C170HM2異種移植制備核外膜蛋白。通過Western印跡用GRP1抗血清來分析它們。圖23是Western印跡的照片，表明正常家兔血清處理的異種移植物中有2個免疫反應(yīng)性條帶在74和50kDa，前一條帶表現(xiàn)出最強的免疫反應(yīng)性。在GRP1抗血清處理過的異種移植物中，有兩條免疫活性條帶以及在對照異種移植或體外生長的細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)的中間條帶。該50kDa條帶顯示出最強的免疫反應(yīng)性。這表明在GRP1抗血清處理的異種移植中，較大比例的CCKB/胃泌素受體可能作為內(nèi)化形式存在。
C170HM2異種移植物的組織學(xué)分析圖24顯示了C170HM2異種移植物侵入裸鼠肝的顯微圖片。腫瘤通常由壞死中心以及在侵入肝時擠壓肝細(xì)胞的活的前移邊緣組成。用Tunel法測定C170HM2腫瘤的活的前移邊緣中的凋亡程度，陽性細(xì)胞用原位雜交顯影。圖25顯示了凋亡細(xì)胞存在于GRP1抗血清處理的異種移植物中的活腫瘤細(xì)胞中，但不存在于正常家兔血清處理的腫瘤中。
數(shù)據(jù)表明，針對CCKB/胃泌素受體氨基端表位產(chǎn)生的抗血清選擇性地定位于肝侵入性C170HM2腫瘤內(nèi)。GRP1表位的中和誘導(dǎo)出對腫瘤“攝取率”和已建立腫瘤的總瘤荷有明顯影響。這種腫瘤抑制性效應(yīng)可能是由于(a)封閉CCKB/胃泌素受體而誘導(dǎo)了總的細(xì)胞靜止效應(yīng)和/或(b)抗體靶向細(xì)胞核而可能導(dǎo)致凋亡的間接效應(yīng)。
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Watson，Susan A.
Grimes，Stephen(ii)發(fā)明名稱縮膽囊素-B/胃泌素受體的免疫原性組合物以及治療腫瘤的方法(iii)序列數(shù)目3(iv)通信地址(A)收件人Dimitrios T.Drivas，White &amp; Case(B)街道1155 Avenue of the Americas(C)城市紐約(D)州NY(E)國家USA(F)郵編10036-2787(v)計算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Drivas，Dimitrios T..
(B)登記號32，218(C)參考/案卷號1102865-0032(ix)通訊信息(A)電話(212)819-8200(B)電傳(212)354-8113(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假想無(iv)反義無(v)片段類型N端(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Leu Asn Arg Ser Val Gln Gly Thr Gly Pro Gly Pro Gly Ala Ser Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假想無
(iv)反義無(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQ ID NO2Gly Pro Gly Ala His Arg Ala Leu Ser Gly Ala Pro Ile Ser Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys1 權(quán)利要求
1.一種免疫原，它包含與免疫原性載體偶聯(lián)的來自CCK-B/胃泌素受體的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原，其中肽的氨基酸序列為KLNR SVQGTGPGP GASL，即序列表中SEQ ID NO1，或GPGA HRAL SGAPI SF，即序列表中SEQ ID NO2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原，它還包含一個間隔臂肽序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫原，其中間隔臂肽序列是SSPPPPC，即序列表中SEQ ID NO3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原，其中免疫原性載體選自白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素和牛血清白蛋白。
6.一種治療由胃泌素依賴性惡性細(xì)胞生長引起的惡性疾病的方法，該方法包括給予需要這種治療的動物有效量的抗CCK-B/胃泌素受體免疫原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中免疫原包含CCK-B/胃泌素受體的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中肽的氨基酸序列為KLNR SVQGT GPGPGASL，即序列表中SEQ ID NO1，或GPGAHRAL SGAPISF，即序列表中SEQID NO2。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中免疫原還包含一個間隔臂肽序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中間隔臂肽序列是SSPPPPC，即序列表中SEQ ID NO3。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，該方法還包含選自白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素和牛血清白蛋白的免疫原性載體。
12.一種治療胃泌素依賴性腫瘤的方法，該方法包括給予需要這種治療的動物有效量的抗CCK-B/胃泌素抗體，該抗體識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞中的CCK-B/胃泌素受體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中抗體選自嵌合的、單克隆的和人源化的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中抗CCK-B/胃泌素受體抗體識別并結(jié)合受體的氨基酸序列KLNR SVQGT GPGP GASL，即序列表中SEQ ID NO1，或GPGA HRAL SGAPI SF，即序列表中SEQ ID NO2。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或14所述的方法，其中抗體還與細(xì)胞毒性分子偶聯(lián)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中細(xì)胞毒性分子是毒素或放射活性分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中毒素是霍亂毒素。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中放射活性分子用125I或131I標(biāo)記。
19.一種檢測含有CCK-B/胃泌素受體的胃泌素反應(yīng)性腫瘤的方法，該方法包括使抗胃泌素受體抗體與腫瘤活檢樣品中分離出的細(xì)胞接觸，并檢測樣品中的CCK-B/胃泌素受體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中抗胃泌素受體抗體對CCK-B/胃泌素受體的氨基端肽有特異性。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中肽在CCK-B/胃泌素受體的氨基端區(qū)域中，包含氨基酸殘基5-21。
22.一種免疫原性組合物，該組合物包含抗CCK-B/胃泌素受體免疫原。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中免疫原包含來自CCK-B/胃泌素受體的肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中免疫原包含針對CCK-B/胃泌素受體的抗體。
25.一種診斷胃泌素依賴性腫瘤的方法，該方法包括給予患有結(jié)腸直腸腫瘤的患者放射標(biāo)記的抗CCK-B/胃泌素受體抗體，并用閃爍掃描法使腫瘤顯影。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中抗CCK-B/胃泌素受體抗體用111銦或90釔作放射性標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療胃泌素依賴性腫瘤的免疫原、免疫原性組合物以及方法。免疫原包含與間隔臂以及免疫原性載體偶聯(lián)的來自CCK－B/胃泌素受體的肽。免疫原能在體內(nèi)誘導(dǎo)出抗體,該抗體與腫瘤細(xì)胞中的CCK－B/胃泌素受體結(jié)合,從而阻止刺激生長的肽激素與受體結(jié)合,并抑制了腫瘤細(xì)胞生長。免疫原還包含用于被動免疫的針對CCK－B/胃泌素受體的抗體。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明抗體來檢測在體內(nèi)或來自組織活檢的胃泌素依賴性腫瘤的診斷方法。
文檔編號C07K14/72GK1255860SQ98805055
公開日2000年6月7日 申請日期1998年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月12日
發(fā)明者D·米凱利, M·卡普林, S·A·沃森, S·格蘭姆斯 申請人:埃弗頓有限公司