專利名稱：結(jié)合hla分子的分離的九肽和十肽及其應(yīng)用的制作方法
相關(guān)申請本申請是1998年1月13日遞交的系列號09/061,388的部分繼續(xù)申請，09/061,388是引入本文作為參考的1997年6月23日遞交的系列號08/880,963的部分繼續(xù)申請。本發(fā)明人在第一個部分繼續(xù)申請的申請日前的一年之內(nèi)公開了本發(fā)明的一部分。參見Romeo等人，免疫學(xué)雜志，1592366(1997)，引入本文作為參考。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫學(xué)有用的肽。更具體地說，本發(fā)明涉及結(jié)合細(xì)胞表面的HLA分子的肽。當(dāng)它們與它們的配體HLA分子復(fù)合時，至少一些這些肽也誘導(dǎo)溶細(xì)胞T細(xì)胞的活化。同時本發(fā)明的一部分涉及這些肽在鑒定HLA-A2陽性細(xì)胞，刺激T細(xì)胞，確定特定的T細(xì)胞以及溶細(xì)胞T細(xì)胞本身的存在的領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景和現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)在許多不同方向進(jìn)行了宿主生物體識別或不識別癌細(xì)胞的研究。對該領(lǐng)域的了解意味著對免疫學(xué)和癌癥學(xué)的一些理解。
對小鼠腫瘤的早期研究表明這些展示的分子當(dāng)移植進(jìn)入同源的動物中時導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞的排斥。在受體動物中T細(xì)胞“識別”這些分子，并激發(fā)溶細(xì)胞T細(xì)胞應(yīng)答，導(dǎo)致移植細(xì)胞的溶解。利用化學(xué)致癌物如甲基膽蒽體外誘導(dǎo)的腫瘤首先獲得證據(jù)。發(fā)現(xiàn)腫瘤表達(dá)的引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的抗原對于每個腫瘤是不同的。參見，Prehn，等人，自然癌癥研究雜志18769-778(1957)；Klein等人，癌癥研究，201561-1572(1960)；Gross，癌癥研究，3326-333(1940)，Basombrio，癌癥研究，302458-2462(1970)，這些文獻(xiàn)教導(dǎo)了利用化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)腫瘤和細(xì)胞表面抗原的差異。這一類抗原已經(jīng)知道為“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTAs”。在觀察到當(dāng)化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)時呈遞這樣的抗原之后，通過紫外輻射體外誘導(dǎo)腫瘤時獲得同樣的結(jié)果。參見Kripke，自然癌癥研究雜志，53333-1336(1974)。
盡管對于如上所述的腫瘤類型觀察到T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，但是據(jù)信自發(fā)腫瘤一般是非免疫原性的。所以確信這些腫瘤不呈遞引起對腫瘤攜帶個體中的腫瘤的應(yīng)答的抗原。參見Hewitt，等人，英國癌癥雜志，33241-259(1976)。
如引入本文作為參考的，Boon等人，實驗方法雜志，1521184-1193(1980)所述，tum-呈遞抗原細(xì)胞系家族是由小鼠腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系的誘變獲得的免疫原性變異體。為了證明，通過突變在同源小鼠中不產(chǎn)生免疫應(yīng)答并且將形成腫瘤的腫瘤細(xì)胞(即，“tum+”細(xì)胞)可以獲得tum-抗原。當(dāng)誘變這些tum+細(xì)胞時，它們受到同源小鼠的排斥，并且不能形成腫瘤(所以是“tum-”)。參見Boon等人，美國科學(xué)院院刊，74272(1977)，該公開物引入本文作為參考。已經(jīng)顯示許多腫瘤類型展示了這一現(xiàn)象。參見例如，F(xiàn)rost等人，癌癥研究，43125(1983)。
tum-突變體不能形成進(jìn)行性腫瘤似乎是因為它們啟動了免疫排斥過程。有利于這一假說的證據(jù)包括腫瘤的tum-突變體，即那些不能正常形成腫瘤的突變體，在利用亞致死量輻射抑制免疫系統(tǒng)的小鼠中能形成腫瘤，見Van Pel等人，美國科學(xué)院年報，765282-5285(1979)；以及觀察到腹膜內(nèi)注射的肥大細(xì)胞瘤P815的tum-細(xì)胞在12-15天呈指數(shù)倍增，然后在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的流入過程中，在僅僅幾天內(nèi)就消失了(Uyttenhove等人，實驗方法雜志，1175-1183(1980))。其它證據(jù)包括甚至當(dāng)在攻擊細(xì)胞之后給予免疫抑制量的輻射時，觀察到小鼠獲得能抵抗對同樣的tum-變異體的隨后的攻擊的免疫記憶(Boon等人，美國科學(xué)院院刊，74272-275(1977)；VanPel等人，出處同上；Uyttenhove等人，出處同上)。后來的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對自發(fā)腫瘤進(jìn)行誘變時，產(chǎn)生能夠產(chǎn)生應(yīng)答的免疫原性變異體。確實，這些變異體能夠引發(fā)抗原始腫瘤的免疫保護(hù)應(yīng)答。參見Van Pel等人，實驗方法雜志，1571992-2001(1983)。所以，已經(jīng)顯示在同源排斥應(yīng)答的靶的腫瘤中引發(fā)所謂的“腫瘤排斥抗原”的呈遞是可能的。當(dāng)外源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入自發(fā)腫瘤時，已經(jīng)獲得同樣的結(jié)果。關(guān)于這一點參見Fearon等人，癌癥研究，482975-1980(1988)。
已經(jīng)識別了一類抗原，它們存在于腫瘤細(xì)胞的表面，并且被溶細(xì)胞T細(xì)胞識別，導(dǎo)致溶解。這一類抗原下文將稱作“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs能或不能引發(fā)抗體應(yīng)答。這些抗原被研究的內(nèi)容，是借助于體外溶細(xì)胞T細(xì)胞的鑒定研究，即特定的溶細(xì)胞T細(xì)胞(下文的“CTL”)亞組鑒定抗原的研究。在呈遞的腫瘤排斥抗原被識別時亞組增殖，并且呈遞腫瘤排斥抗原的細(xì)胞被溶解。特征研究已經(jīng)鑒定了特異地溶解表達(dá)腫瘤排斥抗原的細(xì)胞的CTL克隆。在Levy等人，癌癥研究進(jìn)展，241-59(1977)；Boon等人，實驗方法雜志，1521184-1193(1980)；Brunner等人，免疫學(xué)雜志，1241627-1634(1980)；Maryanski等人，當(dāng)前免疫學(xué)雜志，1241627-1634(1980)；Maryanski等人，當(dāng)前免疫學(xué)雜志，12406-412(1982)；Palladino等人，癌癥研究，475074-5079(1987)可以發(fā)現(xiàn)這一研究工作的例子。對于CTL識別的抗原的其它類型，包括次要組織相容性抗原，雄性特異H-Y抗原，和本文討論的稱為“tum-”抗原的抗原類別需要這一類型的分析。
上面所述的腫瘤例子已知是P815。參見引入本文作為參考的DePlaen等人，美國科學(xué)院年報，852274-2278(1988)；Szikora等人，EMBO J91041-1050(1990)，和Sibille等人，實驗方法雜志，17235-45(1990)，。P815腫瘤是利用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘導(dǎo)的，并作為體外腫瘤和細(xì)胞系培養(yǎng)的肥大細(xì)胞瘤。P815細(xì)胞系已經(jīng)在誘變之后產(chǎn)生許多tum-變異體，包括稱為P91A(DePlaen，出處同上)，35B(Szikora，出處同上)，和P198(Sibille，出處同上)的變異體。相反于腫瘤排斥抗原，這是關(guān)鍵的區(qū)別，tum-抗原只在腫瘤細(xì)胞誘變后呈遞。沒有誘變時腫瘤排斥抗原存在于給定的腫瘤的細(xì)胞上。所以參考該文獻(xiàn)，細(xì)胞系抗原是“tum+”的如稱為“P1”的細(xì)胞系，并且可以引發(fā)產(chǎn)生tum-的變異體。由于tum-的表型有別于親本細(xì)胞系，與它們的tum+親本細(xì)胞系相比，可以預(yù)期在tum-細(xì)胞系的DNA中存在差別。并且這一差別可以開發(fā)定位tum-細(xì)胞中感興趣的基因。結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)tum-變異體的基因如P91A，35B和P198由于基因的編碼區(qū)中的點突變而區(qū)別于它們正常的等位基因。參見，Szikora和Sibille，出處同上，和Lurquin等人，細(xì)胞58293-303(1989)。已經(jīng)證明本發(fā)明的TRA不是這樣。這些論文也證明H-2dI類分子呈遞來自tum-抗原的肽以被CTL識別。Ld呈遞P91A，Dd呈遞P35，Kd呈遞P198。
轉(zhuǎn)讓給本申請相同的受讓人的1992年5月22日遞交的PCT申請PCT/US92/04354，涉及人腫瘤排斥抗原前體編碼基因的家族，稱為MAGE家族。在van der Bruggen等人，科學(xué)2541643(1991)也討論了幾個這些基因。現(xiàn)在已經(jīng)清楚在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)MAGE家族的各種基因，并且可以作為這樣的腫瘤的診斷以及本文討論的其它目的的標(biāo)記。也參見Traversari等人，免疫遺傳學(xué)，35145(1992)；van derBruggen等人，科學(xué)，2541643(1991)和DePlaen等人，免疫遺傳學(xué)，40360(1994)。蛋白質(zhì)加工和呈遞于細(xì)胞表面的機(jī)制現(xiàn)在已經(jīng)相當(dāng)好的記錄了。在Barinaga，“得到一些′骨架′MHC怎樣結(jié)合肽”，科學(xué)257880(1992)；同樣參見Fremont等人，科學(xué)257919(1992)；Matsumura等人，科學(xué)，257927(1992)；Engelhard，免疫學(xué)年評，12181-207(1994)；Madden等人，細(xì)胞，75693-708(1993)；Ramensee等人，免疫學(xué)年評，11213-244(1993)；Germain，細(xì)胞76287-299(1994)可以發(fā)現(xiàn)該領(lǐng)域的開發(fā)的綜述。這些論文通常指出結(jié)合MHC/HLA分子的肽需九個氨基酸長(“九肽”)，并且指出了九肽的第二個和第九個殘基的重要性。對于H-2Kb，固定殘基是八聚體的位置5和8，對于H-2Db，它們是九肽的位置5和9，而對于HLA-A1的固定殘基是九聚體的位置3和9。通常，對于HLA分子，位置2和9是固定的。
對基因的MAGE家族的研究已經(jīng)表明特定的九肽事實上呈遞在一些腫瘤細(xì)胞的表面，并且九肽的呈遞需要呈遞分子是HLA-A1。MAGE-1腫瘤排斥抗原(“TRA”或“九肽”)的復(fù)合物導(dǎo)致溶細(xì)胞T細(xì)胞(″CTL″)溶解呈遞它的細(xì)胞。
在1992年8月31日申請的美國專利號5,405,940和美國專利號5,571,711中提供的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)將各種MAGE基因的同源區(qū)和編碼相關(guān)的九肽的MAGE-1基因的區(qū)域比較時，存在大量的同源性。確實，這些觀察導(dǎo)致這些專利所公開的發(fā)明的一個方面和權(quán)利要求，它是九肽的一個家族，所有都具有同樣的N末端和C末端氨基酸。這些九肽被描述為可用于各種目的，包括它們用作免疫原，單獨或與載體肽偶聯(lián)。九肽大小足夠構(gòu)成抗原表位，并且其中產(chǎn)生的抗體被描述為可用于鑒定單獨存在或作為更大的多肽的一部分的九肽。
相關(guān)文獻(xiàn)的前面的概括顯示了各種肽，通常八個，九個，或十個氨基酸長，與MHC分子復(fù)合，并呈遞由溶細(xì)胞T細(xì)胞識別的靶。對黑素瘤已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，現(xiàn)在將溶細(xì)胞T細(xì)胞識別的黑素瘤抗原分成3大類。第一類包括許多上面討論的抗原(例如MAGE)，在一些黑素瘤以及其它腫瘤類型和正常的睪丸和胎盤中表達(dá)，這些抗原是在正常組織中通常是沉默的正常基因的表達(dá)產(chǎn)物。
黑素瘤抗原的第二個家族包括起源于正常蛋白質(zhì)的突變形式的抗原。這一家族的例子是MUM-1(Coulie等人，美國科學(xué)院院刊，927976-7980(1995))；CDK4(Wolfel，等人，科學(xué)2691281-1284(1955))；Bcatenin(Robbins，等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1831185-1192(1996))；和HLA-A2(Brandel，等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1832501-2508(1996))。同樣上面討論的第三類包括黑素瘤和黑素細(xì)胞表達(dá)的分化抗原。例子是酪氨酸酶，gp100，gp75，和Melan A/Mart-1。關(guān)于Melan-A參見引入本文作為參考的美國專利號5,620,886，關(guān)于酪氨酸酶參見Wolfel，等人，當(dāng)前免疫學(xué)雜志，24759(1994)和Brichard，等人，當(dāng)前免疫學(xué)雜志，26224(1996)；關(guān)于gp100參見Kang等人，免疫學(xué)雜志，1551343(1995)；Cox等人，科學(xué)264716(1994)；Kawakami等人，免疫學(xué)雜志，1543961(1995)；關(guān)于gp75參見Wang等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1831131(1996)。
在HLA-A*0201陽性的黑素瘤病人的外周血淋巴細(xì)胞，和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中鑒定了溶細(xì)胞T細(xì)胞(下文中稱為“CTLs”)。參見Kawakami，等人，美國科學(xué)院院刊913515(1994)；Coulie等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，18035(1994)。當(dāng)測試來源于不同病人的十個HLA-A*0201限制的Melan-A特異的CTL時，發(fā)現(xiàn)它們中的九個識別肽Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO2)并與之反應(yīng)，該肽由Melan-A的氨基酸27-35組成。(Kawakami，等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，180347-352(1994))。Rivoltini等人，免疫學(xué)雜志，1542257(1995)，顯示了利用SEQ ID NO2刺激來自HLA-A*0201陽性正常供體和黑素瘤病人的PBL可以誘導(dǎo)Melan-A特異的CTL。這一應(yīng)答的強(qiáng)度已經(jīng)導(dǎo)致建議SEQ ID NO2作為疫苗開發(fā)的靶。但是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)十肽，即Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO1)實際上是比SEQ ID NO2更好的靶。這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致前面闡述的工作，這些工作是本發(fā)明的一部分。
已經(jīng)鑒定與HLA-A*0201結(jié)合的大多數(shù)肽是9個或10個氨基酸長，并且特征在于具有兩個固定殘基。第一個是位置2的Leu或Met，第二個是位置9的Leu或Val。參見Falk等人自然351290(1991)。Ruppert等人在細(xì)胞74929(1993)中示出在九肽或十肽內(nèi)的其它位置的氨基酸也可能在肽-HLA-A*0201相互作用中起作用。他們顯示例如位置1的帶負(fù)電殘基或脯氨酸與弱的HLA-A*0201結(jié)合相關(guān)。
這一工作的令人感興趣之處在于SEQ ID NO1和2代表的兩個肽在位置2不具有主要的固定殘基，并且強(qiáng)結(jié)合物SEQ ID NOl在位置1具有帶負(fù)電的殘基。
強(qiáng)結(jié)合物不是必須是穩(wěn)定結(jié)合物，意味著在肽和HLA分子之間的相互作用可能是并且是簡要的。當(dāng)需要誘導(dǎo)CTL，鑒定CTL，或進(jìn)行其它類型的實驗時，具有以高親和力結(jié)合MHC類I分子并且形成穩(wěn)定的復(fù)合物的能力的肽是如人所愿的。參見Van der Burg等人，免疫學(xué)雜志，1563308(1996)。
本發(fā)明特別涉及是非常好的HLA結(jié)合物和CTL刺激物的新九聚體和十聚體的開發(fā)，這些分子及其應(yīng)用是下面的公開物中闡述的本發(fā)明的特征。
附圖的簡要描述

圖1顯示了確定腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞群是否溶解在其表面呈遞HLA-A*0201和各種肽的復(fù)合物的細(xì)胞的實驗的結(jié)果。
圖2a-2d顯示了比較各種肽的穩(wěn)定性研究。
圖3顯示了當(dāng)用TILN測試時，各種肽的抗原活性。
圖4平行于圖3，但利用的是用各種肽刺激而從PBL產(chǎn)生的CTL。
圖5a-5r顯示了在用各種肽刺激PBMC后流式細(xì)胞計數(shù)研究的結(jié)果。
圖6a-6e描述了在已經(jīng)利用各種肽刺激的PBMC上溶解活性的測試的結(jié)果。
圖7a-7e提供了用其它肽刺激后含有SEQ ID NO1的四聚體陽性的熒光分揀淋巴細(xì)胞的Melan-A特異溶解活性的數(shù)據(jù)。
圖8顯示了Melan-A單特異性CTL細(xì)胞系的肽依賴溶解活性的定量評估。
優(yōu)選的實施方案的詳細(xì)描述實施例1在這些實驗中，從HLA-A*0201陽性的病人的腫瘤入侵淋巴結(jié)產(chǎn)生腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(下文“TILs”)。設(shè)計實驗以便避免體外抗原特異選擇，現(xiàn)在闡述方法。
溶解腫瘤浸潤淋巴結(jié)(下文中“TILNs”)的活體組織成單細(xì)胞懸浮液，然后在24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)。在2毫升用Asn(0.24毫摩爾/升)，Arg(0.55毫摩爾/升)，和Gln(1.5毫摩爾/升)，和10％混合人A+血清(從A型血液供體獲得的血清)，以及重組的人IL-2(100單位/毫升)和IL-7(10納克/毫升)補(bǔ)充的Iscove′s Dulbecco培養(yǎng)基中加入總共3×106個細(xì)胞。僅使用這些細(xì)胞因子用于培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液以避免體外抗原特異選擇。培養(yǎng)懸浮液2-3星期，然后鑒定細(xì)胞的細(xì)胞表面表現(xiàn)型。僅使用大于75％CD8+T細(xì)胞，以及所需的溶細(xì)胞的活性的細(xì)胞群體。將TILN群體與自體細(xì)胞，以前鑒定為HLA-A*0201陽性的黑素瘤細(xì)胞系(Me290)，已知是HLA-A*0201陰性的黑素瘤細(xì)胞系(Me260)或不加工抗原的細(xì)胞系T2，以及SEQ ID NO1的肽合并在一起確定上述第二種特性。以1微摩爾/升將肽，以及變化比例的效應(yīng)器(TILN)細(xì)胞和靶細(xì)胞一起加入。圖1所示的結(jié)果顯示利用LAU132和LAU203，通過這一方法鑒定兩個TILN群體，獲得的結(jié)果。在圖1中，“M10”是SEQ ID NO1，并且其它簡寫如上所述。測試是在不存在或存在外源加入肽時的4小時51Cr釋放測試。在圖1中，空心的標(biāo)記代表不存在肽，實心的標(biāo)記代表肽的存在。在這一測試中，在37℃利用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞1小時，然后洗滌兩次。在存在或不存在50微升抗原肽(1微克/毫升)時，在50微升效應(yīng)器細(xì)胞的樣品中(變化量，如本文指出)加入標(biāo)記的細(xì)胞(在50微升中的1000個細(xì)胞)。在它們加入之前，為了消除由于效應(yīng)器群體中存在NK類效應(yīng)器的任何非特異溶解，在存在未標(biāo)記天然殺傷(NK)細(xì)胞的靶(50,000細(xì)胞每孔)條件下，在37℃最少溫育效應(yīng)器細(xì)胞20分鐘。在37℃溫育4小時后測量51Cr釋放，并且如下計算特異性溶解百分?jǐn)?shù)
如圖1所示，不管是否加入肽，兩個TILN群體同樣溶解HLA-A*0201陽性細(xì)胞系。在每種情況下均不溶解HLA-A*0201陰性系Me260，并且只有當(dāng)加入肽時，不加工抗原的T2才被溶解。這些結(jié)果顯示當(dāng)與HLA-A*0201陽性細(xì)胞復(fù)合時，下文中利用的兩個TILN群體識別SEQ ID NO1限定的表位。
實施例2對如上所述的實驗進(jìn)行了一些修飾以便確定是否TILN識別其它肽好于SEQ ID NO1。在這些實驗中，利用已知的方法合成下面的肽Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO2)Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile(SEQ ID No3)Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu(SEQ ID NO4)這些肽分別對應(yīng)于Melan-A的氨基酸27-35，27-36，和32-40。
以效應(yīng)器∶靶比例30∶1，將T2細(xì)胞(靶)與TILN(效應(yīng)器)溫育以便確定TILN識別。利用了變化濃度的肽SEQ ID NO1，2，3或4。使用上面討論的51Cr釋放測試。下面的表闡述了這些實驗的結(jié)果，其中肽濃度是給出50％最大活性時的濃度。相對活性通過與SEQ IDNO2的比較，即[nM]50％[SEQ ID NO2]/[nM]50％[測試肽]獲得的。
表1TILN LAU 203TILN LAU 132肽序列 肽2[nM]50％相對活性b肽[nM]50％相對活性AAGIGILTV27-3540 1151EAAGIGILTV26-351.5 27 1 15AAGIGILTVI27-36600 0.06 300 0.05ILTVILGV32-40＞104＜4×10-3＞104＜1.5×10-3
可以看到SEQ ID NO1具有明顯高于測試的其它肽的活性。
實施例3為了嘗試確定與HLA-A*0201分子具有增強(qiáng)的結(jié)合性的肽，合成了一系列肽。合成的肽據(jù)認(rèn)為是SEQ ID NO2(即，Ala Ala Gly IleGly Ile Leu Thr Val)的衍生物，并且是Ala Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO5)Ala Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO6)Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO7)和Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO8)對于SEQ ID NO1，即Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val，衍生物是Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO9)Glu Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO10)Glu Ala Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO11)Glu Ala Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO12)Tyr Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO13)Phe Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO14)Ala Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO15)Ala Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO16)使用了三個其它對照肽，即Glu Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu(SEQ ID NO17)Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO18)和Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val(SEQ ID NO19)SEQ ID NOS17和18對應(yīng)于流感A基質(zhì)蛋白質(zhì)(“FLUMA”)的氨基酸58-66，和MAGE-3 TRAP的氨基酸168-176。
在這些實驗中，利用了已知結(jié)合HLA-A*0201的肽，即MAGE-3 TRAP的氨基酸271-279(SEQ ID NO19)，在抑制測試中，一起利用了識別SEQ ID NO19和HLA-A*0201的溶細(xì)胞T細(xì)胞系198NS(Valmori等人，癌癥研究，57735(1997)。在這些測試中，將變化濃度的測試肽(1μM到100μM)與51Cr標(biāo)記的T2細(xì)胞(1000個細(xì)胞/孔)在室溫下一起溫育15分鐘。然后加入亞最適劑量的SEQ IDNO19(lnM)以及足以產(chǎn)生5/1效應(yīng)器/靶比例的量的CTL198NS。然后根據(jù)上面所述的方法，進(jìn)行51Cr釋放測試。計算抑制CTL識別復(fù)合物的測試肽的量，然后利用下述通式計算相對于SEQ ID NO2的每個肽的結(jié)合親和力
如果R大于1，則測試肽結(jié)合HLA-A*0201的親和力大于SEQ IDNO2。值小于1表明親和力較低。下面闡述了結(jié)果表II肽 序列 競爭劑a競爭劑相對[μM]50％活性bMelan-A27-35AAGIGILTV60 1ALGIGILTV1.5 40AMGIGILTV230LAGIGILTV65 1MAGIGILTV55 1Melan-A26-35EAAGIGILTV 15 4ELAGIGILTV 6.5 9EMAGIGILTV 20 3EALGIGILTV 100 0.6EAMGIGILTV 100 0.6YAAGIGILTV 415FAAGIGILTV 230流感A基質(zhì)58-66GILGFVFTL160MAGE-3168-176EVDPIGHLY＞100＜0.6SEQ ID NO1，5，6，9，10，13和14都顯示比SEQ ID NO2更高的親和力。
實施例4在開發(fā)MHC結(jié)合肽中的一個考慮是產(chǎn)生的MHC分子和肽的復(fù)合物是穩(wěn)定的，優(yōu)選地比最初發(fā)現(xiàn)與MHC分子復(fù)合的肽更加穩(wěn)定。
為了測試新合成的肽的穩(wěn)定性，在室溫下，在含有飽和量的肽(10微摩爾/升)，和3微克/毫升(微球蛋白的無血清培養(yǎng)基中過夜溫育T2細(xì)胞，以便有利于需要的MHC分子的組裝。然后，除去肽，加入10-4摩爾/升ementine(抑制蛋白質(zhì)合成)。然后在37℃溫育細(xì)胞不同時間。在各個溫育時間點，利用標(biāo)記的HLA-A2特異性mAb染色細(xì)胞的等分試樣以便測量HLA-A2表達(dá)。
通過與包括SEQ ID NO17的復(fù)合物的比較確定穩(wěn)定性，這一復(fù)合物在6小時期間內(nèi)是穩(wěn)定的。圖2A-D表示了結(jié)果。圖2A顯示了每個肽的平均熒光強(qiáng)度?！癗C”指在缺乏外源肽時，由T2細(xì)胞呈遞的HLA-A*0201，而“FLUMA”是SEQ ID NO17，并且是“流感基質(zhì)抗原”的縮寫。在圖2A中，肽是SEQ ID NO2，1和9。在圖2B中，肽是SEQ ID NOS2，7，8，5，6和17(“FLUMA”)。在圖2C中，肽是SEQ ID NOS1，12，11，9，10和17。在圖2D中，肽是SEQ ID NOS1，13，14和17。分解圖僅是為便于理解。圖2B-2D顯示了相對的復(fù)合物穩(wěn)定性，其中相對于用SEQ ID NO17時觀察到的穩(wěn)定性，測試肽的熒光強(qiáng)度被標(biāo)準(zhǔn)化。SEQ ID NO1和2形成不穩(wěn)定的復(fù)合物，在一小時內(nèi)裂解。這也在SEQ ID NO7和8中發(fā)現(xiàn)。
在另一方面，SEQ ID NO9，10，13和14形成在6小時內(nèi)穩(wěn)定的復(fù)合物，其中SEQ ID NO5，6，11和12形成中等程度穩(wěn)定的復(fù)合物。
實施例5利用TILN和CTL，在上面討論的51Cr測試類型中測試當(dāng)肽結(jié)合HLA-A*0201時每種肽的抗原活性。對每個肽進(jìn)行劑量應(yīng)答分析，并且計算相對于SEQ ID NO2的抗原活性。在下面的表III和表IV及圖3中分別表示了來自TILN(表III和圖3)和CTL(表IV)的數(shù)據(jù)。
利用Leu或Met取代SEQ ID NO2的N末端氨基酸增強(qiáng)了活性7.5到20倍，而在第二個位置上的取代幾乎使活性消失，盡管增強(qiáng)了與HLA-A*0201的結(jié)合(表III和圖3)。
SEQ ID NO1比SEQ ID NO2更好識別，并且在SEQ ID NO1中第二位的Ala的取代分別增強(qiáng)了識別30和600倍。在位置3的這樣的取代如所預(yù)期的降低了活性。在位置1的取代導(dǎo)致了識別的增強(qiáng)。
表IIITILN LAU 203 TILN LAU 132肽序列 [nM]相對活性[nM]相對活性AAGIGILTV 601 30 1ALGIGILTV ＞1000＜0.6 ＞1000 ＜0.03AMGIGILTV ＞1000＜0.6 ＞1000 ＜0.03LAGIGILTV 6 101.520MAGIGILTV 8 7.5 2.512EAAGIGILTV 125 3 10ELAGIGILTV 2 300.05 600EMAGIGILTV 2 300.05 600EALGIGILTV ＞1000＜0.06＞1000 ＜0.03EAMGIGILTV ＞1000＜0.06＞1000 ＜0.03YAAGIGILTV 5 20 1 30FAAGIGILTV 1 60 0.05 600本文示出了利用CTL獲得的結(jié)果。具體地，利用了5個獨立的HLA-A*0201限制的Melan-A特異CTL克隆，已知其中每一個克隆均溶解黑素瘤靶細(xì)胞。
CTL以不同效率識別SEQ ID NO2。當(dāng)用Leu取代位置1的Ala，5個克隆中的4個增強(qiáng)了識別，而位置2的同樣的取代導(dǎo)致了活性的喪失。5個克隆的3個識別SEQ ID NO1比SEQ ID NO2更加有效，但所有克隆都非常有效地識別SEQ ID NO9，而識別SEQID NO10導(dǎo)致不同程度減弱了的識別，SEQ ID NO11的識別導(dǎo)致5個克隆中的4個降低了識別。當(dāng)測試SEQ ID NO12時，令人驚奇地識別提高了，因為TIL識別降低。關(guān)于SEQ ID NO13和14，CTL的識別減弱。
由此可以結(jié)論，SEQ ID NO7和9比測試的其它肽更好地被識別。而其它肽被不同程度地識別。
如圖4和表III所述測定Melan-A衍生的肽相對活性圖3描述了其它實驗，顯示了TILN LAU203和TILN LAUl32對T2細(xì)胞呈遞的各種Melan-A肽類似物的識別。在淋巴細(xì)胞與靶比例301時進(jìn)行4小時的51Cr測試。
圖3的第一組(頂部和底部)比較了SEQ ID NO2，7，8，5和6。
第二組(項部和底部)比較了SEQ ID NO1，9，10，11和12。
第三組(頂部和底部)比較了SEQ ID NO1，13，14和4。
但是，本文獲得的最重要的結(jié)果是當(dāng)利用SEQ ID NO9時，SEQID NO9誘導(dǎo)的CTL識別和溶解呈遞內(nèi)源肽的細(xì)胞。
實施例6根據(jù)前面的數(shù)據(jù)，利用SEQ ID NO9的肽進(jìn)行CTL誘導(dǎo)研究。
根據(jù)Valmori等人，出處同上，離心純化來自HLA-A*0201陽性黑素瘤病人的外周血淋巴細(xì)胞，并且富集CD3+細(xì)胞。然后選擇這一富集亞群的CD8+細(xì)胞。得到的亞群常規(guī)地含有90％以上的CD8+細(xì)胞，并且將這些亞群用于進(jìn)一步的實驗。
以1-2×106細(xì)胞/孔涂布純化的CD8+T細(xì)胞，以及2×106個刺激細(xì)胞，下面將討論它的制備。在總共2毫升Iscove′培養(yǎng)基中合并效應(yīng)器和刺激細(xì)胞，該培養(yǎng)基已經(jīng)補(bǔ)充了10％人血清，L-精氨酸(0.55毫摩爾/升)，L-天冬酰胺(0.24毫摩爾/升)，和L-谷氨酰胺(1.5毫摩爾/升)，以及重組的人IL-7(10納克/毫升)和重組的人IL-2(10單位/毫升)。
為了制備刺激細(xì)胞，在37℃，在無血清培養(yǎng)基中，溫育2×106個自體PBL以及20微克/毫升每種肽和3微克/毫升(2微球蛋白2小時。然后洗滌，輻射(300rads)PBL，然后在加入到CD8+細(xì)胞群體中之前，調(diào)節(jié)到適當(dāng)體積。在第7天，用在補(bǔ)充10納克/毫升重組人IL-7和10U/ml重組人IL-2的完全培養(yǎng)基中的肽脈沖的自體PBL再刺激細(xì)胞。用肽脈沖的并輻射的PBL進(jìn)行每周再刺激。在第二輪(MC-2)后第一次測試CTL活性。
下表和圖4中示出了結(jié)果。在圖4中，所用的CD8+細(xì)胞來源是LAU203。在第二次(MC-2)再刺激后7天分析CTL活性。用SEQID NOS1和2獲得了結(jié)果。用這些結(jié)果與SEQ ID NO9比較。
注意對于樣品LAU203親本肽幾乎沒有活性，而SEQ ID NO9引發(fā)強(qiáng)CTL應(yīng)答，這一活性也與SEQ ID NO1交叉反應(yīng)。
下表中的結(jié)果描述了用同樣的肽和用來自8個不同HLA-A2陽性黑素瘤病人，即LAU203，LAU132，LAU145，LAU86，LAU50，LAU148，LAU161，和LAU119的PBL的實驗。
a)在第三次再刺激后7天測試溶解活性。b)每次測試進(jìn)行淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例的滴定。c)數(shù)字代表了每個靶獲得的特異溶解百分?jǐn)?shù)。Me290是從病人LAU203獲得的Melan-A和HLA-A*0201陽性黑素瘤細(xì)胞系。Me260是從病人LAU149獲得的HLA-A*0201陰性黑素瘤細(xì)胞系。每個數(shù)字代表重復(fù)培養(yǎng)物的幾何平均數(shù)。黑體字表示明顯特異的CTL。當(dāng)在存在或缺乏Melan-A26-35(1微摩爾/升)或Me290和Me260時在T2細(xì)胞上獲得的特異溶解的差異等于或高于10％時。當(dāng)在至少一個培養(yǎng)物中檢測到明顯特異的溶解時，認(rèn)為病人是應(yīng)答者。
d)克隆6是來源于TILN289的Melan-A特異CTL克隆。
實施例7
正如上面指出的，SEQ ID NO1的十肽比SEQ ID NO2的九肽具有更高的識別效率。進(jìn)行實驗以便確定這是否是肽SEQ ID NO1與HLA-A*0201分子的更好的結(jié)合的結(jié)果。這些實驗包括功能肽競爭測試。引入本文作為參考的Gaugler等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，174921(1994)描述了這一類型的測試，本文再加描述。在這一測試中，利用51Cr標(biāo)記表達(dá)HLA-A*0201的靶細(xì)胞(T2細(xì)胞)，然后與不同濃度的肽溫育15分鐘。加入突變的Ras5-14肽的亞最適濃度。這一肽具有的氨基酸序列為Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val(SEQ ID NO20)在15分鐘后，加入CTL克隆7RAS的樣品。從已經(jīng)注射了SEQ IDNO20肽的HLA-A*0201人/β-微球蛋白雙轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴結(jié)獲得這一CTL克隆。以5淋巴細(xì)胞(10,000細(xì)胞/孔)1靶細(xì)胞的比例加入CTL。在37℃溫育細(xì)胞4小時，然后終止測試。除了SEQ ID NO1的肽之外，還測試了SEQ ID NO2，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQID NO21)。SEQ ID NO21是已知的肽，起源于MAGE-1，已知它結(jié)合HLA-A1分子并且刺激溶解。參見引入本文作為參考的美國專利號，5,405,940，SEQ ID NO12。
當(dāng)單獨利用SEQ ID NO20時，溶解百分?jǐn)?shù)是80％。沒有肽的對照溶解百分?jǐn)?shù)是4％。
結(jié)果表明SEQ ID NO1顯示比SEQ ID NO2高5倍的有效結(jié)合。SEQ ID NO3和4均以對于SEQ ID NO2可比的活性結(jié)合，而對照(SEQ ID NO21)顯示沒有結(jié)合。與SEQ ID NO2相比，SEQ IDNO13和14顯示明顯提高的結(jié)合。當(dāng)利用特異于HLA-A*0201和一種不同的肽的復(fù)合物的人CTL克隆時，獲得了同樣的結(jié)果。下表示出了相對競爭劑活性，其是以抑制對照溶解50％所需的SEQ IDNO2的濃度除以待測試的肽濃度來表示以保證同樣的結(jié)果
表VI相對競爭劑活性肽實驗1實驗2實驗3SEQ ID NO21 1 1SEQ ID NO14 4 5SEQ ID NO14 1217 20SEQ ID NO13 8 10 10SEQ ID NO3未做 未做2SEQ ID NO4未做 未做2實施例8在基于流式細(xì)胞計數(shù)測試的另一個測試中確定相對的HLA-A*0201肽結(jié)合活性。在這些實驗中，在23℃，在存在2微克/毫升人β2微球蛋白時，用不同濃度的肽SEQ ID NO1，2，13，14或4溫育2×105個T2細(xì)胞16小時。在4℃洗滌細(xì)胞，然后利用FITC標(biāo)記的單克隆抗體BB7.2染色。這一mAb特異于HLA-A2分子上的構(gòu)象依賴的表位。然后，利用通式(樣品的平均熒光一背景的平均熒光)/(背景的平均熒光)計算熒光指數(shù)。參見Nijman等人，當(dāng)前免疫學(xué)雜志，231215(1993)。再次，SEQ ID NO1顯示比SEQ ID NO2更高的結(jié)合效率(約10倍)。SEQ ID NO4顯示與SEQ ID NO2同樣的相對結(jié)合活性，而SEQ ID NO13和14具有與SEQ ID NO1相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合活性。
實施例9在這些實驗中，利用13個CTL克隆評估肽識別的效率，所有這些克隆均是特異于HLA-A*0201和SEQ ID NO2的復(fù)合物的。
進(jìn)行了如上所述的實施例3中描述的同樣類型的51Cr釋放測試。具體地，如Gaugler等人，出處同上，所述，在2毫克/毫升小牛血清白蛋白和1∶40稀釋的W6/32腹水補(bǔ)充的Tris-Dulbecco緩沖液中，用51Cr(用鈉鹽)標(biāo)記T2細(xì)胞，這穩(wěn)定了MHC分子。在不同濃度的肽中加入不同量的標(biāo)記細(xì)胞以產(chǎn)生不同的效應(yīng)器靶比例。測試的13個CTL的10個識別SEQ ID NO1十肽比SEQ ID NO2九肽更有效，獲得半最大溶解需要的濃度比九肽低20到1000倍。另外三個CTL產(chǎn)生類似的滴定曲線。沒有一個CTL識別SEQ ID NO3和HLA-A2的復(fù)合物。在另外的實驗中，在IL-2釋放測試中測試一個CTL克隆，再次證實用SEQ ID NO1提供了比SEQ ID NO2高10倍的效率。
實施例10如上所述，利用SEQ ID NO1，13，和14“分解”CTL組。利用這些肽進(jìn)行如上實施例7中描述的識別測試。4個CTL識別SEQ IDNO1，13和14同樣好。第5個CTL識別SEQ ID NO1和13，但不識別SEQ ID NO14。兩個其它的CTL識別SEQ ID NO1和14但不識別SEQ ID NO13。一個CTL只識別SEQ ID NO1。
實施例11然后進(jìn)行一套實驗以研究本文所述的T細(xì)胞的受體(下文″TCRs″)，因為已知在TCR所有組成成分中有不同的成分組合，結(jié)果形成不同的TCR。
為此，根據(jù)Chomczynski等人，生物化學(xué)年評162156(1987)提取了所測試的每個CTL的106細(xì)胞的總RNA。然后，根據(jù)商購產(chǎn)品說明書，用聚(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。之后，根據(jù)引入本文作為參考的Genevee等人，當(dāng)前免疫學(xué)雜志，221261(1992)，利用Vα和Vβ探針組，和Cα/Cβ特異性寡核苷酸經(jīng)PCR擴(kuò)增樣品等分試樣。發(fā)現(xiàn)了六個不同的Vα區(qū)段，即Vα2，4，6，7，14和21。一個克隆實際上呈遞兩個框內(nèi)Vα轉(zhuǎn)錄物。發(fā)現(xiàn)了7個不同的Vβ區(qū)段(兩個克隆表達(dá)Vβ13，兩個克隆表達(dá)Vβ14，兩個克隆表達(dá)Vβ16。Vβ2，Vβ3，Vβ7.2和Vβ8.2每個均由一個克隆表達(dá))。
實施例12通過測試單Ala取代的衍生物，研究確定單氨基酸側(cè)鏈在SEQ IDNO1和HLA-A*0201分子之間的相互作用中的貢獻(xiàn)。即制備的衍生物與SEQ ID NO1相同，但位置1，4，5，6，7，8，9或10改變成Ala。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的合成方法制備肽。然后，根據(jù)它們抑制已知的HLA-A*0201結(jié)合肽即來源于酪氨酸酶的Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val(SEQ ID NO22)，與HLA-A*0201限制的CTL克隆LAU132/2的結(jié)合的能力在一功能競爭測試中測試它們。簡要地說，在單克隆抗體W6/32存在下，用51Cr標(biāo)記T2細(xì)胞。細(xì)胞和單克隆抗體如上所述。在室溫下，將不同濃度的競爭肽(50微升體積)與50微升51Cr標(biāo)記的T2細(xì)胞(這一量給出了1000細(xì)胞/孔)一起溫育15分鐘。然后，每孔(體積50微升)加入亞最適劑量的1納摩爾/升SEQ ID NO22肽以及5000CTL。在37℃溫育4小時后測量51Cr釋放。確定了抑制50％51Cr釋放所需的每個競爭肽的濃度。將抑制50％需要的SEQ ID NO1的濃度除以測試肽的50％抑制值，計算相對競爭劑活性簡化了比較。
發(fā)現(xiàn)在位置1(SEQ ID NO15)利用Ala取代Glu導(dǎo)致競爭劑活性增加5倍。Ala取代位置4或6的Glu導(dǎo)致20和10倍的活性的下降，位置7和10的取代也是如此(約25倍，每次)。在位置8或9變化即，Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Ala Thr Val(SEQ ID NO23)和Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Ala Val(SEQ ID NO24)未導(dǎo)致活性的明顯變化。實施例13然后研究如上所述討論的SEQ ID NO1的單Ala取代與HLA-A*0201形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性。簡要地說，利用飽和濃度的類似物(10微摩爾/升)加載T2細(xì)胞，并且在室溫下與肽和β2微球蛋白(3微克/毫升)在無血清的培養(yǎng)基中過夜溫育。除去過量的肽，加入emetine(10-4摩爾/升)以阻斷蛋白質(zhì)合成。然后，溫育細(xì)胞不同時間，用熒光素標(biāo)記的抗HLA-A2單克隆抗體(BB7.2)染色等分試樣以確定表面上的分子的量。因為已知SEQ ID NO17的肽與HLA-A*0201形成穩(wěn)定的復(fù)合物(van der Burg，免疫學(xué)雜志，1563308(1996))，利用這一肽作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。通過計算類似物的平均熒光減去背景熒光，并且除以用SEQ ID NO17獲得的同樣值確定復(fù)合物的穩(wěn)定性。背景熒光是不加肽同樣處理T2細(xì)胞獲得的值。
發(fā)現(xiàn)在1-6小時內(nèi)，復(fù)合物SEQ ID NO1/HLA-A*0201是不穩(wěn)定的，并且在1小時之內(nèi)分解。在同樣的6小時內(nèi)SEQ ID NO15形成穩(wěn)定的復(fù)合物。所有測試的其它衍生物形成低穩(wěn)定性的復(fù)合物。
實施例14然后，測試如上所述的衍生物的相對抗原活性。在這些實驗中，測試了如上所述制備的TILN LAU132和TILN LAU203兩個TILN群和10個不同的溶細(xì)胞T細(xì)胞系。在10個CTL中，5個起源于浸潤的淋巴細(xì)胞或腫瘤浸潤的淋巴結(jié)，5個來自正常供體的外周血淋巴細(xì)胞。已知所有的CTL均特異于HLA-A*0201和SEQ ID NO2的復(fù)合物；但是，給出了如上所述的結(jié)果，顯示了SEQ ID NO1的優(yōu)勢，這一十肽用于進(jìn)行比較。
在51Cr釋放測試中評估抗原識別。在37℃用51Cr標(biāo)記靶T2細(xì)胞1小時，然后洗滌兩次。然后在加入效應(yīng)器細(xì)胞(50微升)之前，用不同濃度的肽(50微升體積)，在室溫溫育標(biāo)記的靶細(xì)胞(在50微升中的1000細(xì)胞樣品)15分鐘。當(dāng)TILN是效應(yīng)器細(xì)胞時，這些細(xì)胞已經(jīng)與未標(biāo)記的K562細(xì)胞(50,000細(xì)胞/孔)至少預(yù)溫育20分鐘，以去除由于NK類效應(yīng)器的非特異溶解。測量了在37℃溫育4小時后的上清液中的51Cr。通過從測試的51Cr釋放中減去自發(fā)釋放的51Cr，除以總51Cr減去自發(fā)釋放，得到的數(shù)據(jù)乘以100確定溶解百分?jǐn)?shù)。在濃度范圍10-5M到10-13M進(jìn)行滴定。為了定量比較，確定50％最大活性需要的濃度，對SEQ ID NO2的參考值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
與其它測試的變異體相反，發(fā)現(xiàn)兩個TILN群體識別SEQ ID NO15比SEQ ID NO1的親本十肽好20-60倍。關(guān)于CTL，所測試的10個CTL中的8個識別該肽比它們識別SEQ ID NO1或2好。
關(guān)于CTL特異性觀察到了其它差異。10個測試的CTL中的5個識別SEQ ID NO1好于SEQ ID NO2。這5個CTL中的1個識別SEQ ID NO1很有效，識別SEQ ID NO2較差。剩余的5個克隆的3個識別SEQ ID NO1和2同樣有效，2個識別SEQ ID NO2好于SEQ ID NO1。
這顯示了在腫瘤反應(yīng)性CTL的良好特異性中具有強(qiáng)烈的趨異性。
實施例15然后進(jìn)行進(jìn)一步的實驗確定CTL克隆所展示的抗原特異性的趨異性是否是T細(xì)胞所有組成成分對抗原SEQ ID NO1的一個共有特征，或是由于用于產(chǎn)生CTL的不同方法所致。為了測試這一點，特異的T細(xì)胞的來源是沒有進(jìn)行來自肽的體外刺激的抗原驅(qū)動的選擇。利用了出處同上的TILN群LAU203。正如前面的實施例顯示的，該群展示了相當(dāng)高的抗Melan-A HLA-A*0201陽性黑素瘤細(xì)胞的CTL活性。通過限制稀釋培養(yǎng)物，在輻射的異源的PBMC，Epstein Barr病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞，植物凝集素，和重組IL-2存在下，從這一群中衍生CTL克隆。利用標(biāo)準(zhǔn)幾率模型，從克隆率高于90％的培養(yǎng)物衍生克隆。然后，通過在微滴平板上，每3-4星期涂布5×103個細(xì)胞以及輻射飼養(yǎng)細(xì)胞(5×104異源PBMC，和2×104EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞)，以及PHA和重組IL-2擴(kuò)展它們。
進(jìn)行了兩個獨立的實驗，得到130個生長的克隆，當(dāng)在如上所述類型的51Cr釋放測試中測試這些克隆時，發(fā)現(xiàn)11個至少識別SEQ IDNO1和2中的一個。
為了確定細(xì)微的特異性，用SEQ ID NO1，2和15進(jìn)行了如上所述類型的抗原識別測試。發(fā)現(xiàn)4個克隆識別SEQ ID NO1好于SEQID NO2(即相對抗原活性至少高10倍)，6個克隆識別2個肽同樣好，一個識別SEQ ID NO2好于SEQ ID NO1。9個CTL識別SEQID NO15好于SEQ ID NO1和2，與肽SEQ ID NO1和SEQ IDNO2的微摩爾識別濃度相反，其中一個克隆識別納摩爾濃度的SEQID NO15。
實施例16確定本發(fā)明的肽的體外免疫原性。為此，通過在含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入1微摩爾/升肽刺激來自LAU203的PBMC(1.0×107細(xì)胞每個測試)。測試的肽是SEQ ID NO1，29，15和16。將SEQ ID NO17的肽用作陰性對照。
在加入肽之后，用已經(jīng)利用上面列出的一個肽在37℃脈沖1小時的自體PBMC每星期刺激培養(yǎng)物。即，用SEQ ID NO1脈沖PBMC再刺激用SEQ ID NO1處理的培養(yǎng)物。充分洗滌再刺激培養(yǎng)物，并且在它們使用之前輻射。
在刺激后7天，檢測培養(yǎng)物以確定與HLA-A2和SEQ ID NO9四聚體反應(yīng)的CD8+的存在。在3星期中重復(fù)這一步驟總共3次。為了制備四聚體，首先需要制備編碼修飾的HLA-A*0201分子的構(gòu)建體。為此，從HLA-A*0201陽性細(xì)胞中提取總RNA，然后利用特異于該分子的引物，和逆轉(zhuǎn)錄鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)克隆HLA-A*0201。按照引入本文作為參考的Altman等人，科學(xué)，27494-96(1996年10月4日)進(jìn)行。同時利用RT-PCR，改變氨基末端核苷酸序列以便最佳化所用的載體中的蛋白質(zhì)表達(dá)。參見引入本文作為參考的Garboczi等人，美國科學(xué)院院刊，893429(1992)。之后，再次利用特異的引物擴(kuò)增分子的細(xì)胞外編碼部分。將得到的構(gòu)建體再克隆進(jìn)入在HLA-A*0201重鏈的3′末端的產(chǎn)生框架內(nèi)BirA生物素化識別位點的載體。在獨立的大腸桿菌培養(yǎng)物過量表達(dá)修飾的HLA-A*0201和β2微球蛋白。純化得到的內(nèi)含體，并且在脲中溶解HLA和β2微球蛋白重組蛋白，然后在4℃的再折疊溶液中再折疊形成復(fù)合物。(再折疊溶液含有100毫摩爾/升Tris，pH8.0，L-精氨酸，400毫摩爾/升，EDTA，2毫摩爾/升，還原型谷胱甘肽5毫摩爾/升，氧化型谷胱甘肽，0.5毫摩爾/升，PMSF 0.1毫摩爾/升，HLA重鏈和β2微球蛋白1微摩爾/升，和10微摩爾/升需要的肽)。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將再折疊溶液濃縮到7.5毫升。然后，利用BirA反應(yīng)緩沖液交換再折疊緩沖液(Tris100毫摩爾/升，pH7.5，NaCl 200毫摩爾/升，MgCl25毫摩爾/升，PMSF 100微摩爾/升，亮抑酶肽1微摩爾/升，和抑胃酶肽1微摩爾/升)，最后3種是在使用之前加入。
然后通過合并含有HLA-A2復(fù)合物的再折疊混合物與50微摩爾/升酶，在200毫摩爾/升的Tris中的100毫摩爾/升生物素，和100毫摩爾/升腺苷三磷酸，利用生物素全酶合成酶(BirA酶)生物素化復(fù)合物。在室溫下過夜溫育混合物。然后純化生物素化的復(fù)合物，與藻紅素標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合，以產(chǎn)生四聚體結(jié)構(gòu)。分離這些物質(zhì)，在小體積中重配，濃度為1毫克/毫升。
加入SEQ ID NO9的肽以結(jié)合四聚體。確定相對于每個樣品中的CD8+細(xì)胞總數(shù)的四聚體陽性的T細(xì)胞的總數(shù)。圖5顯示了這些結(jié)果。發(fā)現(xiàn)這些類似物都誘導(dǎo)特異于SEQ ID NO9的CD8+細(xì)胞。
實施例17在第三次刺激循環(huán)后7天，在51Cr釋放測試中測試培養(yǎng)物以確定在存在或缺乏SEQ ID NO1時它們是否溶解T2細(xì)胞。基本如實施例14所述進(jìn)行這些測試。在圖6中表示了結(jié)果。發(fā)現(xiàn)用類似物刺激比用SEQ ID NO1或SEQ ID NO2刺激導(dǎo)致了與上述的四聚體反應(yīng)的CD8+細(xì)胞更強(qiáng)烈的擴(kuò)增。另外，Melan-A特異溶解直接與也是四聚體特異的CD8+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)相關(guān)，提示相當(dāng)?shù)娜芙饽芰Α?br> 實施例18進(jìn)行另外的實驗系列以便研究CD8+，四聚體陽性細(xì)胞的抗原特異性。為此，利用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞分揀方法，從每個培養(yǎng)物中純化CD8+四聚體陽性細(xì)胞。然后利用標(biāo)準(zhǔn)有絲分裂原刺激技術(shù)，體外擴(kuò)展細(xì)胞。然后，根據(jù)前面實施例的方法，在存在或缺乏在上述體外刺激中所用的肽或SEQ ID NO1時，對T2細(xì)胞測試它們的溶解活性。
圖7的結(jié)果顯示每個培養(yǎng)物展示高水平的針對用測試肽和用SEQID NO1脈沖的靶細(xì)胞的特異溶解。
通過評估抗自體Melan-A+黑素瘤細(xì)胞系Me290的能力圖7同樣記錄了不同培養(yǎng)物的殺腫瘤能力。參見實施例1，觀察到了高的殺腫瘤活性，對SEQ ID NO2，在效應(yīng)器/靶比例3∶1時，對SEQ ID NO1在效應(yīng)器/靶比例7∶1時，對SEQ ID NO15在效應(yīng)器/靶比例4∶1時，對SEQ ID NO9在效應(yīng)器/靶比例5∶1時，對SEQ ID NO16在效應(yīng)器/靶比例15∶1時觀察到了50％最大的殺腫瘤活性。
實施例19利用標(biāo)準(zhǔn)CTL測試以及實施例3的測試細(xì)胞系，定量抗原識別的親和力和不同細(xì)胞群體的相對抗原活性。利用各種范圍的肽濃度開發(fā)滴定曲線，圖8顯示了其中一個。表VII概括了這些數(shù)據(jù)
表VIII在四聚體指導(dǎo)的熒光細(xì)胞流動分揀之后，Melan-A單特異性CTL系的相對潛力利用下列SEQ ID NO刺激培養(yǎng)物(A) 2 1 15 9 16肽[nM]50％2252025 355011 2.5 33 1515 0.04 0.04 0.15 0.08 0.1590.001 0.15 0.03 0.03 0.316 0.001 0.015 0.01 0.003 0.03(B)相對抗原活性21 1 11 11258 812315 625 500 166 437 333925×103133 833 1666 16616 25×1031333 2500 16×1031666(這些值是50％最大活性所需的肽濃度)不同的細(xì)胞系對親本肽的親和力是非常相似的，除了用SEQ IDNO16體外刺激后獲得的細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)這一細(xì)胞系識別HLA-A2/SEQ ID NO1復(fù)合物的效率低約2倍，識別HLA-A2/SEQ IDNO1比其它細(xì)胞系低約5-15倍。
關(guān)于表VIII的第二部分，必須注意，不管用于刺激擴(kuò)增的肽是何種，所有細(xì)胞系識別含有SEQ ID NO1的復(fù)合物都比識別含有SEQID NO2的復(fù)合物更好。所有細(xì)胞系識別肽類似物均比親本序列更有效，盡管不同細(xì)胞系的相對抗原性不同。細(xì)胞系對類似物的優(yōu)選不總是與用于產(chǎn)生細(xì)胞系的類似物相關(guān)。
正如將要看到的，前面的實施例描述了本發(fā)明的各種特征。這些特征包括結(jié)合HLA分子如HLA-A2分子的肽，舉例的分子是可以引發(fā)溶細(xì)胞T細(xì)胞增殖的HLA-A*0201。正如從本文的數(shù)據(jù)可以看到，這些肽是九肽或十肽。所有的肽，第一個氨基酸均指氨基末端，并且最后一個氨基酸指羧基末端。本發(fā)明的肽可以是十肽，在C端或羧基末端是Val。當(dāng)?shù)诙€氨基酸是Ala時，它們可以在氨基末端具有Tyr或Phe。在另一個實施方案中，氨基末端是Glu，接著第二個，第三個位置是Ala，Leu或Met，末端是Val，其中如果位置2是Ala，位置3必須是Met或Leu，反過來也是一樣。具有在SEQ ID NO5和8-14所示的氨基酸序列的肽是舉例性的。
同樣是本發(fā)明的一部分的是分離的溶細(xì)胞T細(xì)胞系，它們特異于這些肽和它們的MHC結(jié)合配體即HLA分子如HLA-A2分子，優(yōu)選地是HLA-A*0201的復(fù)合物。
這些肽結(jié)合HLA分子的能力使它們可用作通過確定肽是否結(jié)合樣品中的細(xì)胞來確定HLA-A2陽性細(xì)胞如HLA-A*0201陽性細(xì)胞的存在的試劑。“配體/受體”反應(yīng)類型是本領(lǐng)域已知的，各種方法可用于確定它。
本發(fā)明的另一方面是攜帶指導(dǎo)細(xì)胞合成修飾的十肽必須的信息的“小基因”，在所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了小基因?？梢栽O(shè)計編碼一個或多個抗原肽的小基因，并且利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或通過克隆進(jìn)疫苗或腺病毒轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞基因組。參見引入本文作為參考的，例如Zajac，等人，癌癥雜志研究，71496(1997)。
可以將肽與來自其它腫瘤排斥抗原的肽結(jié)合以便形成“polytopes”。舉例的肽包括引入本文作為參考的美國專利申請系列號，08/672,351，08/718,964，現(xiàn)在美國專利號____，08/487,135現(xiàn)在美國專利號_____，08/530,569和08/880,963列出的那些。
可以利用的另外的肽是下面的參考文獻(xiàn)中描述的那些，所有均引入本文作為參考美國專利號5,405,940；5,487,974；5,519,117；5,530,096；5,554,506；5,554,724；5,558,995；5,585,461；5,589,334；5,648,226；和5,683,886；PCT國際公開號92/20356，94/14459；96/10577；96/21673；97/10837；97/26535；和97/31017以及在審的美國申請系列號08/713,354。
polytopes是兩個或多個潛在的免疫原性或免疫刺激肽的組合，它們可以各種方式結(jié)合，以確定是否這一類型的分子將刺激和/或引起免疫應(yīng)答。
這些肽可以直接或通過側(cè)接序列連接在一起。參見Thompson等人，美國科學(xué)院院刊，92(13)5845-5849(1995)，教導(dǎo)了相關(guān)表位序列的直接連接。利用polytopes作為疫苗是已知的。參見例如，Gilbert等人，自然生物技術(shù)，15(12)1280-1284(1997)；Thomson等人，出處同上；Thomson等人，免疫學(xué)雜志，157(2)822-826(1996)；Tam等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，171(1)299-306(1990)，所有這些引入本文作為參考。特定地Tam參考文獻(xiàn)顯示，當(dāng)用于小鼠模型時，polytopes可用于產(chǎn)生抗體和保護(hù)免疫。另外，參考文獻(xiàn)顯示當(dāng)消化時，polytopes產(chǎn)生可以并被MHC呈遞的肽。Tam通過示出CTL識別polytpoe′串′加工的各個表位顯示這一情況。這一途徑例如可以用于確定多少表位可連接在polytope中并且仍引發(fā)識別，也可確定不同的表位的結(jié)合的效率。不同的結(jié)合可以是對表達(dá)特定腫瘤排斥抗原亞組的病人量身定做的。這些polytopes可以作為多肽結(jié)構(gòu)或通過利用核酸遞送系統(tǒng)導(dǎo)入。例如，本領(lǐng)域有許多不同方法可以導(dǎo)入編碼單個表位或如上討論的polytope的DNA。參見例如引入本文作為參考的Allsopp等人，歐洲免疫學(xué)雜志，26(8)；1951-1959(1996)?？梢岳孟俨《?，痘病毒，Ty病毒狀顆粒，質(zhì)粒，細(xì)菌等等。在小鼠模型中可以測試這些系統(tǒng)以確定哪個系統(tǒng)是最適于人的給定的平行情況。它們也可以在人臨床試驗中測試。
同樣，本發(fā)明的一個特征是利用這些肽確定樣品中溶細(xì)胞T細(xì)胞的存在。如上所示樣品中的CTL將與肽/MHC復(fù)合物反應(yīng)。所以，如果知道CTL在樣品中，加入本發(fā)明的肽到HLA-A2陽性細(xì)胞如HLA-A*0201陽性細(xì)胞中可以“溶解”HLA-A2陽性細(xì)胞，然后確定例如放射活性鉻釋放，TNF生產(chǎn)，等等，或通過其它方法確定T細(xì)胞活性。同樣，在樣品中加入HLA-A2陽性細(xì)胞和要求保護(hù)的肽，可以確定樣品中是否存在特異的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(″TILs″)，并且通過例如51Cr釋放，TNF存在等確定HLA-A2陽性細(xì)胞的溶解。另外，通過ELISPOT分析可以檢測CTL。參見例如Schmittel等人(1997)，免疫學(xué)方法雜志，210167-174和Lalvani等人(1997)，實驗醫(yī)學(xué)雜志，126859或通過熒光四聚體MHC I類/肽復(fù)合物的分析(Dunbar等人(1998)當(dāng)前生物學(xué)8413-416。所有文章引入本文作為參考。
當(dāng)然，該肽可以用于引發(fā)CTL的生產(chǎn)。如上所示，當(dāng)與適當(dāng)?shù)膹?fù)合物相遇時，CTL前體發(fā)展成CTL。通過引起這樣的“相遇”，可以產(chǎn)生CTL。這可用于在體內(nèi)以及來自體內(nèi)地生產(chǎn)這樣的CTL。
本發(fā)明的其它特征對技術(shù)人員是明了的。并且不需要本文重復(fù)。
利用的術(shù)語和表達(dá)是用作描述的術(shù)語而非限制性的，不排除利用除了本文顯示和描述的特征或其部分的任何等當(dāng)物以外的術(shù)語和表達(dá)，應(yīng)該認(rèn)識到在本發(fā)明的范圍內(nèi)各種修飾時可能的。
權(quán)利要求
1.結(jié)合HLA-A2分子的分離的肽，所述的肽由10個氨基酸組成，其中羧基末端氨基酸是Val，氨基末端氨基酸是Ala，Tyr或Phe，并且第二個氨基酸是Ala。
2.結(jié)合HLA-A2分子的由10個氨基酸組成的分離的肽，所述的肽在它的羧基末端具有Val，在它的氨基末端為Glu，N末端的第二個和第三個氨基酸是Ala，Leu或Met，條件是當(dāng)?shù)诙€氨基酸是Ala時，第三個氨基酸必須是Leu或Met，并且當(dāng)?shù)谌齻€氨基酸是Ala時，第二個氨基酸必須是Leu或Met。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的肽，具有選自SEQ ID NO13，SEQ ID NO14和SEQ ID NO15的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的肽，具有選自SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的氨基酸序列。
5.特異地識別權(quán)利要求1的分離的肽和HLA-A2分子的復(fù)合物的分離的溶細(xì)胞T細(xì)胞系。
6.特異地識別權(quán)利要求2的分離的肽和HLA-A2分子的復(fù)合物的分離的溶細(xì)胞T細(xì)胞系。
7.用于引發(fā)溶細(xì)胞T細(xì)胞增殖的方法，包括將含有溶細(xì)胞T細(xì)胞前體的樣品與權(quán)利要求1的分離的肽和HLA-A2分子的復(fù)合物接觸以引發(fā)任何特異于所述的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞前體增殖成溶細(xì)胞T細(xì)胞。
8.用于引發(fā)溶細(xì)胞T細(xì)胞增殖的方法，包括將含有溶細(xì)胞T細(xì)胞前體的樣品與權(quán)利要求2的分離的肽與HLA-A2分子的復(fù)合物接觸以引發(fā)任何特異于所述的復(fù)合物的溶細(xì)胞T細(xì)胞前體增殖成溶細(xì)胞T細(xì)胞。
9.由選自SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQID NO7和SEQ ID NO8的氨基酸序列組成的分離的九肽。
10.確定腫瘤樣品中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的存在的方法，包括將所述的腫瘤樣品與HLA-A2陽性細(xì)胞樣品以及權(quán)利要求1的分離的肽混和，并且確定所述的HLA-A2陽性細(xì)胞的溶解作為TIL在所述的樣品中存在的指征。
11.確定腫瘤樣品中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的存在的方法，包括將所述的腫瘤樣品與HLA-A2陽性細(xì)胞樣品以及權(quán)利要求2的分離的肽混和，并且確定所述的HLA-A2陽性細(xì)胞的溶解作為TIL在所述的樣品中存在的指征。
12.確定腫瘤樣品中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的存在的方法，包括混合所述的腫瘤樣品與HLA-A2陽性細(xì)胞樣品和權(quán)利要求9的分離的肽混和，并且確定所述的HLA-A2陽性細(xì)胞的溶解作為TIL在所述的樣品中存在的指征。
13.由SEQ ID NO3，SEQ ID NO23，或SEQ ID NO24所示的氨基酸序列組成的分離的十肽。
14.具有選自SEQ ID NO13，SEQ ID NO14和SEQ ID NO16的氨基酸序列的分離的十肽。
15.引發(fā)與在細(xì)胞表面存在HLA-A2分子和與所述的HLA-A2分子形成非共價復(fù)合物的肽的復(fù)合物的細(xì)胞反應(yīng)的溶細(xì)胞T淋巴細(xì)胞的增殖的方法，包括將含有所述的溶細(xì)胞T淋巴細(xì)胞的樣品與HLA-A2分子和九聚體或十聚體的復(fù)合物接觸，其中所述的九聚體或十聚體的羧基末端氨基酸是Val，所述的九聚體或十聚體的氨基末端氨基酸是Ala，Glu，Tyr或Phe，所述的九聚體或十聚體的第二個氨基酸是Ala或Leu，以刺激與HLA-A2和所述的九聚體或十聚體的復(fù)合物以及至少一個其它的HLA-A2和第二種不同的九聚體或十聚體的復(fù)合物反應(yīng)的溶細(xì)胞T細(xì)胞的增殖。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的九聚體或十聚體具有Ala或Glu作為它的N末端氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的單體是具有SEQ IDNO2的氨基酸序列的九聚體。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的十聚體是具有SEQID NO1，9，15或16的氨基酸序列的十聚體。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)合HLA分子并且引起溶細(xì)胞性T細(xì)胞增殖的九肽和十肽。十肽以纈氨酸結(jié)束,并且他們開始的3個氨基酸位置有限制,也公開了其它有用的九肽。
文檔編號C07K7/06GK1261374SQ9880653
公開日2000年7月26日 申請日期1998年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月23日
發(fā)明者達(dá)尼拉·瓦爾莫里, 讓－查爾斯·切羅蒂尼, 佩德羅·羅梅羅 申請人:路德維格癌癥研究所