專利名稱：生長激素和相關(guān)蛋白的衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程構(gòu)建的治療蛋白質(zhì)。具體地說，所述工程蛋白質(zhì)包括生長激素及其相關(guān)蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
下列蛋白質(zhì)由生長激素(GH)超基因家族的基因編碼(Bazan(1990)；Mott和Campbell(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996))生長激素、催乳素、胎盤催乳質(zhì)、紅細胞生成素(EPO)、血栓生成素(TPO)、白介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亞基)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、ω-干擾素、τ-干擾素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和cardiotrophin-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。預(yù)料將來通過基因克隆和測序?qū)㈣b定這一基因家族的其它成員。盡管GH超基因家族的成員通常具有有限的氨基酸或DNA同源性，但它們具有相似的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。所具有的結(jié)構(gòu)特征使該基因家族的新成員得以容易鑒定。
部分患者和醫(yī)療保健人員對長效作用、“用戶喜歡”的治療方法的開發(fā)具有相當(dāng)大的興趣。蛋白質(zhì)不像常規(guī)小分子藥物，其生產(chǎn)花費高，不易被身體吸收。而且，如果口服蛋白質(zhì)會被降解。因此，天然蛋白質(zhì)必須通過注射給藥。注射后，大多數(shù)蛋白質(zhì)迅速從身體中清除，迫使需要頻率通常為每日的注射?；颊卟幌矚g注射，注射導(dǎo)致耐受性降低，并降低藥效。某些蛋白質(zhì)，例如當(dāng)?shù)皖l率給藥(每周使用EPO三次)時，紅細胞生成素(EPO)有效，因為它們被糖基化。然而，糖基化蛋白質(zhì)需要應(yīng)用昂貴的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)制備。
注射蛋白質(zhì)在體內(nèi)的保留時間是有限的，保留時間的長短由例如蛋白質(zhì)大小以及蛋白質(zhì)是否含有共價修飾(例如糖基化)等因素決定。注射蛋白質(zhì)的循環(huán)濃度在24小時內(nèi)不斷以幾個數(shù)量級的幅度改變。蛋白質(zhì)激動劑的濃度快速改變能夠?qū)е略诖碳r和刺激后的其它時間對靶細胞產(chǎn)生巨大變化的下游結(jié)果。類似的問題困擾著蛋白質(zhì)激動劑。這些波動可導(dǎo)致蛋白質(zhì)治療的效能降低，并增加不良副作用的幾率。重組蛋白質(zhì)從身體中快速清除顯著增加了每位患者治療需要的蛋白質(zhì)量，從而顯著增加了治療花費。隨著新的和現(xiàn)有的藥物用于更多的疾病適應(yīng)癥，預(yù)期蛋白質(zhì)藥物的消耗量在未來幾年內(nèi)可能會顯著增加。
因此，需要開發(fā)降低對病人和接受醫(yī)療保健者進行蛋白質(zhì)治療的費用的蛋白質(zhì)給藥技術(shù)。本發(fā)明提供了對這類問題的解決方案，即提供了延長蛋白質(zhì)治療藥物在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，以使蛋白質(zhì)不必頻繁注射的方法。該解決方案也滿足了對”用戶滿意”的蛋白質(zhì)治療的需要和愿望，即不需要頻繁注射的蛋白質(zhì)治療。本發(fā)明通過提供生物活性的、引入半胱氨酸的生長激素超基因家族成員的變異體解決了上述和其它問題。本發(fā)明還提供了用半胱氨酸反應(yīng)聚合物或其它類型的半胱氨酸反應(yīng)基團化學(xué)修飾這些變異體以制備其衍生物，以及如此制備的分子。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了GH超基因家族成員的半胱氨酸變異體。這些變異體包括半胱氨酸殘基取代所述蛋白質(zhì)的非必需氨基酸得到的蛋白質(zhì)。這些變異體優(yōu)選包括半胱氨酸殘基取代所述蛋白質(zhì)的環(huán)區(qū)、α-螺旋末端、第一個兩親螺旋的近側(cè)、最后一個兩親螺旋的遠側(cè)的氨基酸，或者將半胱氨酸殘基加到所述蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端得到的蛋白質(zhì)。取代的優(yōu)選位點是N-或O-連接的糖基化位點。
本發(fā)明還提供了一種半胱氨酸變異體，其中被取代的氨基酸位于GH超基因家族干擾素/干擾素-10樣的A-B環(huán)、B-C環(huán)、C-D環(huán)或D-E環(huán)上。
本發(fā)明還提供了一種GH超基因家族成員的半胱氨酸變異體成員，其中半胱氨酸殘基插入天然蛋白質(zhì)的兩個氨基酸之間。具體地說是半胱氨酸殘基插入環(huán)區(qū)、α-螺旋末端、第一個兩親螺旋的近側(cè)、或最后一個兩親螺旋的遠側(cè)。更具體地說是，半胱氨酸殘基插入N-或O-相連的糖基化位點中的兩個氨基酸之間、或緊鄰N-連接或O-連接的糖基化位點中的一個氨基酸。
本發(fā)明還提供了更具體的半胱氨酸變異體，其中半胱氨酸引入的環(huán)區(qū)是GH超基因家族的干擾素/干擾素-10樣的A-B環(huán)、B-C環(huán)、C-D環(huán)、或D-E環(huán)。
這種半胱氨酸取代或插入突變還可以包括將一種或多種其它氨基酸插入半胱氨酸取代物或插入物的氨基末端或羧基末端。
本發(fā)明還提供了通過將半胱氨酸變異體聚乙二醇化而進一步衍生的半胱氨酸變異體，以及由此制備的衍生化蛋白質(zhì)。
如實施例的描述，還提供了GH超基因家族成員的具體的半胱氨酸變異體，包括例如，GH變異體。GH半胱氨酸變異體可以在A-B環(huán)的N-末端、B-C環(huán)、C-D環(huán)，A、B、C、D螺旋的前三個或后三個氨基酸，以及螺旋A的近側(cè)和螺旋D的遠側(cè)的氨基酸上具有半胱氨酸取代的氨基酸或插入的半胱氨酸。
更具體地說，半胱氨酸可取代下列氨基酸F1、T3、P5、E33、A34、K38、E39、K40、S43、Q46、N47、P48、Q49、T50、S51、S55、T60、A98、N99、S100、G104、A105、S106、E129、D130、G131、S132、P133、T135、G136、Q137、K140、Q141、T142、S144、K145、D147、T148、N149、S150、H151、N152、D153、S184、E186、G187、S188、和G190。
按照本發(fā)明的半胱氨酸變異體的其它例子包括紅細胞生成素變異體。紅細胞生成素變異體包括那些取代的氨基酸位于A-B環(huán)、B-C環(huán)、C-D環(huán)、螺旋A的近側(cè)氨基酸和螺旋D的遠側(cè)氨基酸，以及N-或C-末端氨基酸的變異體。更具體地說，EPO半胱氨酸變異體包括半胱氨酸取代下面指示的氨基酸得到的分子絲氨酸-126、N24、I25、T26、N38、I39、T40、N83、S84、A1、P2、P3、R4、D8、S9、T27、G28、A30、E31、H32、S34、N36、D43、T44、K45、N47、A50、K52、E55、G57、Q58、G77、Q78、A79、Q86、W88、E89、T107、R110、A111、G113、A114、Q115、K116、E117、A118、S120、P121、P122、D123、A124、A125、A127、A128、T132、K154、T157、G158、E159、A160、T163、G164、D165、R166和S85。
GH超基因家族的成員包括生長激素、催乳素、胎盤催乳素、紅細胞生成素、血小板生成素、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12(p35亞基)、白介素-13、白介素-15、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、ω-干擾素、τ-干擾素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、cardiotrophin-1和其它鑒定分類為該家族成員的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可以來源于任何包括人、寵物和家畜在內(nèi)的任何動物品種。
在說明書以及本文闡述的“規(guī)則”基礎(chǔ)上，對本發(fā)明的其它改變和修飾將對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。所有這些均被認為是本發(fā)明的一部分。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及半胱氨酸變異體，尤其是這種蛋白質(zhì)與聚乙二醇(PEG)或其它類似物位點特異性結(jié)合的半胱氨酸變異體衍生物。PEG是一種無抗原性的惰性聚合物，它顯著延長蛋白質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)時間。這使得蛋白質(zhì)在較長時間內(nèi)有效。PEG共價修飾蛋白質(zhì)證明是一種延長蛋白質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)半衰期的有效方法(Abuchowski等，1984；Hershfield，1987；Meyers等，1991)。蛋白質(zhì)共價連接PEG增加了蛋白質(zhì)的有效大小，降低了其從體內(nèi)清除的速率。商業(yè)提供的PEG有幾種分子量大小，這使PEG修飾蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期根據(jù)應(yīng)用不同分子量大小的PEG，而適應(yīng)不同的個體病癥。PEG修飾的其它優(yōu)點包括增加蛋白質(zhì)的溶解性，增加蛋白質(zhì)的體內(nèi)穩(wěn)定性，以及降低蛋白質(zhì)的免疫原性(Katre等，1987；Katre，1990)。
PEG衍生蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法是利用與半胱氨酸反應(yīng)的PEG將PEG與半胱氨酸殘基共價連接。商業(yè)提供了許多具有不同反應(yīng)基團(例如馬來酰亞胺，乙烯基磺酸)和PEG分子量大小不同(2-20 kDa)的高度特異性的與半胱氨酸反應(yīng)的PEG(例如，來自Shearwater，Polymers，Inc.，Huntsville，AL)。在中性pH條件下，這些PEG試劑選擇性連接“游離”半胱氨酸殘基，即不含二硫鍵的半胱氨酸殘基。這些結(jié)合對水解具有穩(wěn)定性。半胱氨酸反應(yīng)性PEG的應(yīng)用使能開發(fā)確定結(jié)構(gòu)的均一PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物。
今年來在確定具有商業(yè)重要性的蛋白質(zhì)治療劑的結(jié)構(gòu)和了解它們?nèi)绾闻c其蛋白質(zhì)靶體(例如細胞表面受體、蛋白酶等)相互作用方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進展。這些結(jié)構(gòu)信息可被用來使用半胱氨酸反應(yīng)PEG設(shè)計PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物。大多數(shù)蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基參與形成二硫鍵，因此不能用于使用半胱氨酸反應(yīng)PEG進行PEG衍生化。然而利用重組DNA技術(shù)在體外誘導(dǎo)突變，可以將其它的半胱氨酸殘基導(dǎo)入蛋白質(zhì)的任何位置。加入的半胱氨酸可以插入蛋白質(zhì)的起始位置、蛋白質(zhì)的末端位置、蛋白質(zhì)序列中的兩個氨基酸之間，或者優(yōu)選取代蛋白質(zhì)序列中的現(xiàn)有氨基酸。新加入的“游離”半胱氨酸可以作為利用半胱氨酸反應(yīng)性PEG進行PEG分子特異性結(jié)合的位點。加入的半胱氨酸必須暴露在蛋白質(zhì)表面，使該方法的PEG衍生化得以順利實現(xiàn)。如果用于插入加入的半胱氨酸的位點在生物活性上是非必須的，那么PGE衍生化蛋白質(zhì)將基本上表現(xiàn)野生型(正常)的體外生物活性。用半胱氨酸反應(yīng)性PEG進行PEG衍生蛋白質(zhì)的主要技術(shù)難題在于鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)中暴露于表面的、非必須區(qū)域，其中可以插入半胱氨酸殘基或用半胱氨酸殘基取代現(xiàn)有氨基酸而不喪失生物活性的。
幾種加入半胱氨酸的人蛋白質(zhì)變異體和這些蛋白質(zhì)的PEG聚合物結(jié)合體已有描述。美國專利5,206,344描述了加入半胱氨酸的IL-2變異體。這些加入的半胱氨酸的變異體位于成熟IL-2多肽鏈氨基末端的前20個氨基酸。優(yōu)選的半胱氨酸變異體位于成熟多肽鏈的第3號位置，在自然發(fā)生的蛋白質(zhì)中對應(yīng)O-糖基化的蘇氨酸殘基。在位置3用半胱氨酸取代蘇氨酸產(chǎn)生能夠用半胱氨酸反應(yīng)PEG進行PEG衍生，并保留全部體外生物活性的IL-2變異體(Goodson和Katre，1990)。相比較而言，用賴氨酸反應(yīng)PEG對天然IL-2進行PEG衍生化顯示降低體外生物活性(Goodson和Katre，1990)。該專利沒有報道在IL-2的其它位置進行半胱氨酸取代的效能。
美國專利5,166,322公開了加入半胱氨酸的IL-3變異體。這些變異定位在成熟蛋白質(zhì)序列N-末端的前14個氨基酸范圍內(nèi)。該專利公開了該蛋白質(zhì)在細菌中的表達以及用半胱氨酸反應(yīng)PEG共價修飾蛋白質(zhì)。其中沒有提供加入半胱氨酸的變異體和IL-3的PEG-結(jié)合物是否具有生物活性的信息。也沒有報道在該多肽鏈的其它位置加入半胱氨酸的變異體。
世界專利申請WO9412219和PCT申請US95/06540公開了胰島素樣生長因子I(IGF-I)的加入半胱氨酸的變異體。IGF-I與GH具有十分不同的結(jié)構(gòu)，它不是GH超基因家族的成員(Mott和Campbell，1995)。描述了IGF-1蛋白中許多位置上的半胱氨酸取代。僅僅一些加入半胱氨酸的變異體具有生物活性。加入半胱氨酸的變異體的優(yōu)選位點是成熟蛋白鏈中的氨基酸位置69?？拷鞍踪|(zhì)N-末端位置(殘基1-3)的半胱氨酸取代產(chǎn)生具有降低生物活性和不適宜二硫鍵的IGF-1變異體。
世界專利申請WO9422466教導(dǎo)了胰島素樣生長因子(IGF)結(jié)合蛋白-1的兩種加入半胱氨酸的變異體，它們具有與GH極不相同的結(jié)構(gòu)，并且不是GH超基因家族的成員。其中公開的兩種加入兩個半胱氨酸的IGF結(jié)合蛋白質(zhì)-I的變異體定位于成熟蛋白質(zhì)鏈的98位和101位，在自然發(fā)生的蛋白質(zhì)中對應(yīng)磷酸化的絲氨酸殘基。
美國專利申請07/822296指出腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白的加入半胱氨酸的變異體，它是一種可溶性的、截短形式的腫瘤壞死因子細胞受體。腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白與GH具有十分不同的結(jié)構(gòu)，它不是GH超基因家族的成員。
IGF-I、IGF結(jié)合蛋白-I和腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)與GH十分不同，這些蛋白質(zhì)不是GH超基因家族的成員。因為如此，很難使用從IGF-I、IGF結(jié)合蛋白-I和腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白的研究中得到的信息來制備GH超基因家族成員的加入半胱氨酸的變異體。關(guān)于IL-2和IL-3的研究開始在已知IL-2和IL-3的結(jié)構(gòu)之前(McKay 1992；Bazan，1992)，以及明確這些蛋白質(zhì)是GH超基因家族的成員之前。以前針對鑒定將半胱氨酸殘基加入IL-2和IL-3的優(yōu)選位點的實驗是大量經(jīng)驗基礎(chǔ)上的實驗，并且這些實驗的進行是在表明GH超基因家族的成員具有相似的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的實驗之前。
基于目前可獲得的GH超基因家族的成員的結(jié)構(gòu)信息，本發(fā)明提供了確定推論的“規(guī)則”，即GH超基因家族成員的那些區(qū)域和氨基酸殘基可以用于插入或取代半胱氨酸殘基而不顯著喪失生物學(xué)活性。與自然發(fā)生的蛋白質(zhì)相反，這些加入半胱氨酸的GH超基因家族成員的變異體將擁有新的特征，例如用能在多肽鏈的明確位點被半胱氨酸反應(yīng)聚合物或其它類型的半胱氨酸反應(yīng)物質(zhì)共價修飾的能力。共價修飾的蛋白質(zhì)具有生物活性。
GH是GH超基因家族研究得最清楚的成員。GH是腦垂體分泌的一種22 kDa的蛋白質(zhì)。GH刺激骨、軟骨和肌肉代謝，它是兒童時期促進身體發(fā)育的人體主要激素。重組人GH(rhGH)用于治療兒童由于GH缺乏和腎衰導(dǎo)致的矮小癥。GH未糖基化，能夠在細菌中以完全活性的形式產(chǎn)生。該蛋白質(zhì)在體內(nèi)具有短的半衰期，必須每日皮下注射給藥以維持最大有效性(MacGillivray等，1996)。最近，重組人GH(rhGH)被批準用于治療AIDS患者的惡病質(zhì)，并處于用于治療與其它疾病有關(guān)的惡病質(zhì)。
業(yè)已熟知人GH的序列(參見，例如被本文引作參考的Martial等，1979；Goeddel等1979；SEQ ID NO1)。GH在序列上與催乳素和胎盤泌乳質(zhì)密切相關(guān)，這三種蛋白質(zhì)在起源上被認為屬于一個小的基因家族。在各動物品種之間GH的一級序列高度保守(Abdel-Meguid等，1987)，與廣泛類型的蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)一致。已經(jīng)通過X-射線晶體學(xué)解決了豬GH的三維折疊結(jié)構(gòu)(Abdel-Meguid等，1987)。該蛋白質(zhì)具有致密的球形結(jié)構(gòu)，包括由環(huán)相連的四個兩親α-螺旋束。人GH具有類似的結(jié)構(gòu)(de Vos等，1992)。四個α-螺旋區(qū)從蛋白質(zhì)的N-末端起依次稱為A-D。環(huán)區(qū)指它們連接的螺旋區(qū)，例如，A-B環(huán)連接螺旋束A和B。A-B和C-D環(huán)較長的，而B-C環(huán)較短。GH含有四個半胱氨酸殘基，它們都參與形成二硫鍵。這些二硫鍵的排列分另是半胱氨酸53與半胱氨酸165相連，半胱氨酸182與半胱氨酸189相連。
與受體結(jié)合的GH的晶體結(jié)構(gòu)顯示，GH具有兩個受體結(jié)合位點，結(jié)合兩個受體分子(Cunningham等，1991；de Vos等，1992)。這兩個受體結(jié)合位點稱作位點I和位點II。位點I包括螺旋D的羧基(C)-末端和部分螺旋A以及A-B環(huán)，而位點II包括螺旋A的氨基(N)-末端區(qū)和部分螺旋C。GH與其受體的結(jié)合是連續(xù)發(fā)生的，位點I總是首先結(jié)合。然后位點II開始結(jié)合第二個GH受體，導(dǎo)致受體產(chǎn)生二聚作用，并激活細胞間的信號傳遞途徑，從而導(dǎo)致細胞對GH發(fā)生反應(yīng)。位點II發(fā)生突變的GH突變蛋白質(zhì)(在120號氨基酸位置由甘氨酸到精氨酸的突變)能夠結(jié)合信號GH受體，但不能使GH受體產(chǎn)生二聚化；這種突變蛋白質(zhì)在體外作為GH的拮抗劑，推測因占據(jù)GH受體位點而不能激活細胞間信號傳遞途徑而起作用(Fuh等，1992)。
特定區(qū)域和氨基酸在GH受體結(jié)合和胞間信號傳遞的中的作用還通過以下技術(shù)進行了研究，例如誘變、單克隆抗體和蛋白酶消化。第一個誘變實驗需要用密切相關(guān)蛋白質(zhì)，即催乳素的相似區(qū)域取代GH的全部區(qū)域(Cunningham等，1989)。結(jié)果之一是用催乳素的B-C環(huán)取代GH的B-C環(huán)不影響雜交GH蛋白質(zhì)與可溶性人GH受體的結(jié)合，意味著B-C環(huán)對于受體結(jié)合是非必需的。丙氨酸掃描突變(用丙氨酸取代各氨基酸)鑒定了對GH的生物活性十分關(guān)鍵的14個氨基酸(Cunningham和Wells，1989)。這些氨基酸定位于螺旋A、B、C和D，以及A-B環(huán)上，對應(yīng)結(jié)構(gòu)研究中鑒定的位點I和位點II。確定第41和172位氨基酸位置的兩個賴氨酸殘基，即K41和K172，是位點I受體結(jié)合位點的關(guān)鍵成分，這解釋了當(dāng)K172乙?；笥^察到生物活性降低(Teh和Chapman，1988)。對K168的修飾也顯著降低GH受體結(jié)合和生物活性(de la Llosa等，1985；Martal等，1985；Teh和Chapman，1988)。還利用單克隆抗體研究了結(jié)合GH受體的GH區(qū)域(Cunningham等，1989)。制備了人GH的八個單克隆抗體，分析了它們中和GH活性和防止GH與其重組可溶性受體結(jié)合的能力。后一項研究得以在GH的三維結(jié)構(gòu)中定位各單克隆抗體的假定結(jié)合位點。令人感興趣的是單克隆抗體1和8不能從其結(jié)合受體中取代GH。這兩種單克隆抗體的結(jié)合位點定位在B-C環(huán)(單克隆1)和A-B環(huán)的N-末端(單克隆8)。未研究特異性地與C-D環(huán)結(jié)合的單克隆。單克隆抗體研究意味著B-C環(huán)和A-B環(huán)的N-末端對于受體結(jié)合是非必需的。最后，用胰蛋白酶限制性切割GH被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一種保留全部活性的雙鏈衍生物(Mills等，1980；Li，1982)。酶譜研究指出胰蛋白酶切割和/或刪除對應(yīng)C-D環(huán)的氨基酸134到149位置之間的氨基酸。這些研究表明C-D環(huán)不影響受體結(jié)合或GH生物活性。
已經(jīng)通過X-射線衍射和NMR研究確定了一些細胞因子的結(jié)構(gòu)，包括G-CSF(Hill等，1993)，GM-CSF(Diederichs等，1991；Walter等，1992)，IL-2(Bazan，1992；McKay，1992)，IL-4(Redfield等，1991；Powers等，1992)，和IL-5(Milburn等，1993)，盡管它們的一級序列缺乏顯著的同源性，但顯示與GH結(jié)構(gòu)具有驚人的保守性。EPO經(jīng)模型研究和誘變研究認為是該家族的成員(Boissel等，1993；Wen等，1994)。包括纖毛狀神經(jīng)生長因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、血栓形成因子(TPO)、制瘤素M、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15和α-、β-、ω-、τ-、γ-干擾素在內(nèi)的其它大量細胞因子和生長因子屬于該家族(Mott和Campbell綜述，1995；Silvennoinen和Ihle，1996)。目前認為上面所有細胞因子和生長因子構(gòu)成一個大的基因家族，其中GH是原型。
除了共有相似的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之外，該家族的成員還共有這樣的特性，即它們必須與細胞表面受體寡聚，以激活胞間信號傳遞途徑。某些GH家族成員，例如，GH和EPO，結(jié)合單一類型的受體，并導(dǎo)致它形成均二聚體。其它的家族成員，例如，IL-2、IL-4和IL-6結(jié)合多于一種類型的受體，另導(dǎo)致受體形成雜二聚體或更高級的聚集體(Davis等，1993；Paonessa等，1995；Mott和Campbell，1995)。誘變研究表明，象GH一樣，其它細胞因子和生長因子含有多個受體結(jié)合位點，典型的為兩個，連續(xù)地結(jié)合它們的同源受體(Mott和Campbell，1995；Matthews等，1996)。象GH一樣，其它家族成員的重要受體結(jié)合位點主要在四個α-螺旋和A-B環(huán)上(Mott和Campbell綜述，1995)。在家族成員中參與受體結(jié)合的螺旋束中的特定氨基酸各有不同(Mott和Campbell，1995)。大多數(shù)與GH超基因家族成員相互作用的細胞表面受體是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的，它們構(gòu)成第二大的多基因家族(Bazan，1990；Mott和Campbell，1995；Silvennoinen和Ihle，1996)。
對GH超基因家族多種成員的誘變研究得出的一般性結(jié)論是，連接α-螺旋的環(huán)通常不參與受體結(jié)合。尤其是短的B-C環(huán)，在不是全部也是大多數(shù)的家族成員中，對受體結(jié)合是非必需的。因為這個原因，B-C環(huán)是在GH超基因家族成員中導(dǎo)入半胱氨酸取代的優(yōu)選區(qū)域。A-B環(huán)、B-C環(huán)、C-D環(huán)(以及GH超基因家族的干擾素/IL-10樣成員的D-E環(huán))也是引入半胱氨酸突變的優(yōu)選區(qū)域。螺旋A的近側(cè)和最后一個螺旋的遠側(cè)的氨基酸可能也不涉及受體結(jié)合，因此也是引入半胱氨酸取代的優(yōu)選區(qū)域。某些GH家族成員，例如EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO，IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β-干擾素含有N-連接和O-連接的糖。蛋白質(zhì)中的糖基化位點幾乎全部在環(huán)區(qū)中，而不在α-螺旋束中。因為環(huán)區(qū)通常不涉及受體結(jié)合，也因為它們是糖基共價結(jié)合的位點，因此它們是將半胱氨酸取代引入蛋白質(zhì)的優(yōu)選位點。蛋白質(zhì)中含有N-連接和O-連接的糖基化位點的氨基酸是半胱氨酸取代的優(yōu)選位點，因為這些氨基酸暴露于表面，天然蛋白質(zhì)可以接受空間體積較大的糖基在這些位點上與蛋白質(zhì)相連，并且這些糖基化位點一般定位在遠離受體結(jié)合位點的區(qū)域。
未來將很可能發(fā)現(xiàn)GH基因家族的其它成員。GH超基因家族的新成員可以通過預(yù)測蛋白質(zhì)序列的計算機-輔助二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析鑒定。GH超基因家族的成員將擁有四到五個兩親螺旋，它們由非螺旋氨基酸(環(huán)區(qū))連接。這些蛋白質(zhì)可以在N-末端含有一個疏水信號序列，以促進從細胞中分泌。這些后來發(fā)現(xiàn)的GH超基因家族的成員也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明提供了制備有生物活性的引入半胱氨酸的GH超基因家族成員變異體的“原則”。該“原則”可以應(yīng)用于任何現(xiàn)有的和未來的GH超基因家族的成員。引入半胱氨酸的變異體將擁有與自然發(fā)生的蛋白質(zhì)不同的新特征。其中最重要的是，引入半胱氨酸的變異體將擁有這樣的特征，即可以用半胱氨酸反應(yīng)聚合物或其它類型的半胱氨酸反應(yīng)物質(zhì)共價修飾它們，以制備具有改善的性質(zhì)(例如增加的體內(nèi)半衰期、增加的溶解性、和改善的體內(nèi)效能)的生物活性蛋白質(zhì)。
具體地說，本發(fā)明通過用半胱氨酸殘基取代蛋白質(zhì)中的非必需氨基酸，提供具有生物活性GH超基因家族成員的半胱氨酸變異體。半胱氨酸殘基優(yōu)選取代構(gòu)成蛋白質(zhì)環(huán)區(qū)氨基酸、靠近α-螺旋末端的氨基酸和第一兩親螺旋近側(cè)或最后一個兩親螺旋遠側(cè)的氨基酸。引入半胱氨酸殘基的另一個優(yōu)選位點是在蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端。還可以在多肽鏈的已公開區(qū)域的兩個氨基酸之間引入半胱氨酸。本發(fā)明指出蛋白質(zhì)中N-和O-連接的糖基化位點是引入半胱氨酸取代的優(yōu)選位點，可以取代構(gòu)成該位點的氨基酸，或者在N-連接的位點上，引入半胱氨酸。糖基化位點可以是O-糖基化的絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基，或者是N-糖基化的天冬氨酸殘基。N-連接的糖基化位點具有天冬氨酸-X-絲氨酸或蘇氨酸(N-X-S/T)這樣的一般結(jié)構(gòu)，其中X可以是任何一個氨基酸。N-連接的糖基化位點中的天冬氨酸殘基、X位置上的氨基酸和絲氨酸/蘇氨酸殘基是制備生物活性的引入半胱氨酸的這些蛋白質(zhì)的變異體的優(yōu)選位點。直接圍繞或緊鄰O-連接和N-連接的糖基化位點的氨基酸(糖基化位點兩側(cè)約10個殘基范圍內(nèi))是引入半胱氨酸取代的優(yōu)選位點。
一般性地說，鑒定制備生物活性的引入半胱氨酸的蛋白質(zhì)變異體的優(yōu)選位點的某些“原則”可以應(yīng)用于任何蛋白質(zhì)，不只是屬于GH超基因家族成員的蛋白質(zhì)。具體地說，制備生物活性的蛋白質(zhì)的半胱氨酸變異體(除了IL-2)的優(yōu)選位點是O-連接的糖基化位點。直接圍繞O-連接的糖基化位點的氨基酸(約在糖基化位點兩側(cè)10個殘基內(nèi))也是優(yōu)選位點。N-連接的糖基化位點，以及緊鄰該糖基化位點兩側(cè)(約在N-X-S/T位點兩側(cè)10個殘基內(nèi))的氨基酸殘基也是制備引入半胱氨酸的蛋白質(zhì)變異體的優(yōu)選位點?？梢杂冒腚装彼崛〈幻黠@喪失生物活性的氨基酸也是制備引入半胱氨酸的蛋白質(zhì)變異體的優(yōu)選位點。可以對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行半胱氨酸掃描誘變，然后測定生物活性效果來鑒定所述非必需氨基酸。半胱氨酸掃描誘變需要在多肽鏈中加入半胱氨酸殘基或用半胱氨酸殘基取代多肽鏈中各個氨基酸，然后確定半胱氨酸取代對生物活性的影響。半胱氨酸掃描誘變類似于丙氨酸掃描誘變(Cunningham等，1992)，除了用半胱氨酸殘基而不是丙氨酸殘基單獨取代目標(biāo)氨基酸。
還設(shè)想了應(yīng)用該“原則”制備引入半胱氨酸的變異體和蛋白質(zhì)拮抗劑的結(jié)合物。在某些炎癥狀況，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、過敏癥和傷口結(jié)疤的病理過程中涉及細胞因子和生長因子的過量產(chǎn)生。GH的過量產(chǎn)生被暗示為肢端肥大癥的病因。某些生長因子和細胞因子，例如GH和IL-6可能涉及某些癌癥的增殖。涉及炎癥和癌癥的一些生長因子和細胞因子是GH超基因家族的成員。開發(fā)這些分子的蛋白質(zhì)拮抗劑以治療這些疾病已引起相當(dāng)大的興趣。策略之一是遺傳工程改造這些細胞因子和生長因子，是它們可以與受體結(jié)合，但不能寡聚受體。這已通過誘變處理分子上的第二受體結(jié)合位點(位點II)實現(xiàn)。得到的突變蛋白質(zhì)能夠結(jié)合并占據(jù)受體位點，但不能激活細胞間的信號傳遞途徑。該策略已經(jīng)成功地應(yīng)用于GH以得到GH拮抗劑(Cunningham等，1992)。還在尋求類似策略以研制GH超基因家族其它成員的拮抗劑，例如IL-2(Zurawski等，1990；Zurawski和Zurawski，1992)，IL-4(Kruse等，1992)，IL-5(Tavernier等，1995)，GM-CSF(Hercus等，1994)和EPO(Matthews等，1996)。因為本文描述的在GH超基因家族成員中引入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點暴露在這些蛋白質(zhì)中受體結(jié)合位點的外面，并因此從一些位點中區(qū)別出來用于制備蛋白質(zhì)拮抗劑，所以本文描述的引入半胱氨酸的變異體可以用于生產(chǎn)長效的蛋白質(zhì)拮抗劑。舉例說明，Cunningham等(1992)通過將甘氨酸殘基(氨基酸120)突變?yōu)榫彼嵫兄瞥鲆环N體外GH拮抗劑。該甘氨酸殘基是GH中第二受體結(jié)合位點的關(guān)鍵成分；當(dāng)它被取代為精氨酸后，GH不能與受體二聚。在120位甘氨酸到精氨酸的突變可以導(dǎo)入編碼本文設(shè)想的加入半胱氨酸的GH變異體的DNA序列中以產(chǎn)生能與半胱氨酸反應(yīng)PEG或其它類型的半胱氨酸反應(yīng)物質(zhì)結(jié)合的加入半胱氨酸的GH拮抗劑。同樣，使蛋白質(zhì)從激動劑變成拮抗劑的其它蛋白質(zhì)中的氨基酸改變可以被引入編碼本文所述的加入半胱氨酸的蛋白質(zhì)變異體的DNA序列中。正在花費相當(dāng)大的努力鑒定使蛋白質(zhì)從激動劑變?yōu)檗卓箘┑陌被岣淖?。Hercus等(1994)報道在成熟GM-CSF蛋白的21位用精氨酸或賴氨酸取代谷氨酸，可以使GM-CSF從激動劑變成拮抗劑。Tavernier等(1995)報道在成熟IL-5的13位用谷氨酰氨取代谷氨酸可以產(chǎn)生IL-5拮抗劑。
可以用類似于上述的實驗策略制備來源于各種動物的GH超基因家族成員的引入半胱氨酸的變異體(激動劑和拮抗劑)。這可能因為人和動物的細胞因子和生長因子之間一級氨基酸序列和結(jié)構(gòu)非常保守。因為這個原因，本文公開的制備GH超基因家族成員的引入半胱氨酸的生物活性變異體的“原則”將可以用于制備寵物(例如狗、貓、馬)和商業(yè)動物(例如，牛、羊、豬)的GH超基因家族成員的引入半胱氨酸的生物活性變異體。這些引入半胱氨酸的變異體與半胱氨酸反應(yīng)PEG結(jié)合將產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的長效類型的蛋白質(zhì)，它們將有利于寵物和商業(yè)農(nóng)畜的市場。
Silvennoimem和Ihle(1996)提供了屬于CH超基因家族成員的蛋白質(zhì)(造血細胞因子)。Silvennoimem和Ihle(1996)還提供了關(guān)于這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達的信息。本文描述的蛋白質(zhì)的編碼氨基酸的DNA序列，以及體外和體內(nèi)生物法測定法在Aggarwal和Gutterman(1992；1996)，Aggarwal(1998)，以及Silvennoimem和Ihle(1996)中已有描述。這些蛋白質(zhì)的各供應(yīng)商例如R&DSystems，Inc.和Endogen，Inc.的目錄也提供了這些蛋白質(zhì)的生物分析法。
提供實施例論證如何應(yīng)用這些“原則”制備引入半胱氨酸的GH超基因家族的GH、紅細胞生成素、α-干擾素、β-干擾素、G-CSF、和其它成員的變異體。這些實施例不是限制性的，而僅是本發(fā)明具體實施方式
的實例。
實施例1引入半胱氨酸的GH變異體本實施例公開了GH中某些生物活性非必需以及當(dāng)這些氨基酸突變?yōu)榘腚装彼釟埢螅瑢⒉桓淖兎肿拥恼６蜴I結(jié)合模式和整體構(gòu)型的氨基酸。這些氨基酸定位在成熟蛋白質(zhì)的A-B環(huán)的N-末端(成熟蛋白質(zhì)序列的34-52位的氨基酸；SEQ ID NO1；Martial等1979；Goeddel等1979)，B-C環(huán)(成熟蛋白質(zhì)序列的97-105位的氨基酸)，C-D環(huán)(成熟蛋白質(zhì)序列的130-153位的氨基酸)。還鑒定了引入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點是A、B、C和D螺旋中的前三個或后三個氨基酸，以及螺旋A的近側(cè)和螺旋D的遠側(cè)氨基酸。
可以應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)，從商購的從人腦垂體制備的單鏈cDNA(ClonTech，San Diego，CA)或用重疊的寡聚核苷酸裝配的單鏈cDNA，擴增編碼野生型GH的DNA序列?？梢詰?yīng)用多種方法例如噬菌體技術(shù)(Kunkel等1987)、PCR誘變技術(shù)(Innis等1990；White1993)采用例如Stratagene出售的誘變試劑盒(″快速改變誘變”試劑盒，San Diego，CA)或Promega出售的誘變試劑盒(基因編輯器試劑盒，Madison WI)將特定突變引入GH基因。
半胱氨酸取代可被引入包括B-C環(huán)、C-D環(huán)和A-B環(huán)的N-末端在內(nèi)的任何氨基酸，或者引入臨近這些區(qū)域的α-螺旋區(qū)的前三個氨基酸，或者引入螺旋A近側(cè)或螺旋D遠側(cè)的區(qū)域。引入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點是F1、T3、P5、E33、A34、K38、E39、K40、S43、Q46、N47、P48、Q49、T50、S51、S55、T60、A98、N99、S100、G104、A105、S106、E129、D130、G131、S132、P133、T135、G136、Q137、K140、Q141、T142、S144、K145、D147、T148、N149、S150、H151、N152、D153、S184、E186、G187、S188和G190。半胱氨酸殘基還可以引入成熟蛋白質(zhì)的起始部分，即F1氨基酸的近側(cè)，或者成熟蛋白質(zhì)的最后一個氨基酸之后，即在F191之后。如果需要，可容易地利用克隆的突變基因的體外DNA重組和/或特殊需要的突變的序列構(gòu)建將兩個或多個該突變組合到同一個蛋白質(zhì)中。
1.人生長激素(GH)的基因克隆應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)以及引物BB1和BB2，從人腦垂體單鏈cDNA(商品由CLONTECH，Inc.，Palo Alto，CA提供)擴增人GH基因。BB1的序列是5′-GGGGG TCGAC CATAT GTTCC CAACC ATTCC CTTATCCAG-3′(SEQ ID NO24)。BB2的序列為5′-GGGGG ATCCT CACTAGAAGC CACAG CTGCC CTC-3′(SEQ ID NO25)。引物BB1設(shè)計為編碼成熟GH的第一個氨基酸即苯丙氨酸之前首先編碼啟動子即蛋氨酸，為了克隆的目的還設(shè)計有SalI和NdeI位點。反向引物BB2含有為克隆目的的BamHI位點。100微升PCR反應(yīng)液含每種寡核苷酸引物各20 pmole，1 X PCR緩沖液(含MgCl2的Perkin-Elmer緩沖液)，四種核苷酸dA、dC、dG和dT每種濃度各為200 mM，2 ng單鏈cDNA，2.5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer)，和2.5單位Pfu聚合酶(Stratagene，Inc.)。PCR反應(yīng)條件為96℃3分鐘，循環(huán)(95℃1分鐘；63℃30秒；72℃1分鐘)35次，隨后72℃10分鐘。使用的熱循環(huán)儀是Amplitron II熱循環(huán)儀(Thermolyne)。用SalI和BamHI消化約600 bp的PCR產(chǎn)物，凝膠純化，然后克隆到同樣消化的質(zhì)粒pUC19(商品由New England BioLabs，Beverly，MA提供)中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到E.coli菌株DH5α中，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化體。幾個克隆在LB培養(yǎng)基上連夜生長，用從Qiagen，Inc.(Valencia，CA)購買的小質(zhì)粒DNA分離試劑盒分離質(zhì)粒DNA。確定克隆LB6具有正確的DNA序列。
為了在E.coli中表達，用NdeI和EcoRI消化克隆LB6，消化成為約600bp的凝膠純化片段，克隆到已經(jīng)用同樣的酶消化和磷酸酶化的質(zhì)粒pCYB1(商品來源于New England BioLabs，Beverly，MA)上。連接混合物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，在LB氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化體。從幾種轉(zhuǎn)化體中分離并通過NdeI和EcoRI消化篩選質(zhì)粒DNA。鑒定了一種正確的克隆，命名為pCYB1wtGH(pBBT120)。這種質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到E.coli菌株JM109或W3110中(可從New England BilLabs和美國典型培養(yǎng)物收藏中心獲得)。
2.STII-GH的構(gòu)建野生型GH克隆LB6(pUC19野生型GH)用作構(gòu)建含E. coli STII信號序列(Picken等1983)的GH克隆的模版。由于其長度，在兩個連續(xù)的PCR反應(yīng)中加入STII序列。第一個反應(yīng)使用正向引物BB12和反向引物BB10。BB10的序列為5′-CGCGG ATCCG ATTAG AATCC ACAGC TCCCC TC-3′(SEQ ID NO28)。BB12的序列為5′-ATCTA TGTTC GTTTT CTCTATCGC T ACCAA CCTTA CGCAT TCCCA ACCAT TCCCT TATCC AG-3′(SEQ ID NO30)。
如擴增野生型GH所述的方法進行PCR反應(yīng)，除了使用約4 ng的質(zhì)粒LB6作為模版，而不是單鏈cDNA作模版，PCR條件為96℃3分鐘，循環(huán)(95℃1分鐘；63℃30秒；72℃1分鐘)30次，隨后72℃10分鐘。使用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen，Inc.)對約630 bp的PCR產(chǎn)物進行凝膠純化，用水稀釋50倍，取2微升作為第二次PCR反應(yīng)的模版。第二次PCR反應(yīng)使用反向引物BB10和正向引物BB11。BB11的序列為5′-CCCCCTCTAG ACATA TGAAG AAGAA CATCG CATTC CTGCT GGCAT CTATGTTCGT TTTCT CTATC G-3′(SEQ ID NO29)。
引物BB11含有用于克隆的XbaI和NdeI位點。PCR條件如第一次反應(yīng)所述。用XbaI和BamHI消化約660 bp的PCR產(chǎn)物，凝膠純化，然后克隆到同樣酶切的質(zhì)粒pCDNA3.1(+)(Invitrogen，Inc.Carlsbad，CA)中。確定克隆pCDNA3.1(+)∷stII-GH(5C)或“5C”具有正確的DNA序列。
用NdeI和BamHI酶切克隆“5C”，然后克隆到同樣酶切的pBBT108(pUC19的衍生物，它缺失一個Pst I位點，該質(zhì)粒下文將描述)中。用上述酶消化后鑒定具有正確插入體的克隆。這種克隆，命名為pBBT111，用NdeI和SalI消化，對含stII-GH融合基因的660 bp片段進行凝膠純化，然后克隆到用同樣酶消化和磷酸化的質(zhì)粒表達載體pCYB1(New EnglandBioLabs)中。通過限制性核酸內(nèi)切酶消化鑒定含stII-GH插入體的重組質(zhì)粒。選擇這樣的一個分離體進行進一步研究，它被命名為pBBT114。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli菌株JM109或W3110中(可從New England BilLabs和美國典型培養(yǎng)物收藏中心獲得)。
3.ompA-GH的構(gòu)建使用野生型GH克隆LB6(pUC19野生型GH)作為構(gòu)建含E.coli ompA信號序列的GH克隆的模版(Movva等1980)。由于其長度，將ompA序列加入兩個連續(xù)的PCR反應(yīng)。第一個反應(yīng)使用正向引物BB75′-GCAGTGGCAC TGGCT GGTTT CGCTA CCGTA GCGCA GGCCT TCCCA ACCATTCCCT TATCC AG-3′(SEQ ID NO31)，和反向引物BB105′-CGCGGATCCG ATTAG AATCC ACAGC TCCCC TC-3′(SEQ ID NO28)。
PCR反應(yīng)如擴增野生型GH所述的那樣，除了使用約4 ng的質(zhì)粒LB6作為模版而不是單鏈cDNA，PCR條件為96℃3分鐘，循環(huán)(95℃1分鐘；63℃30秒；72℃1分鐘)30次，隨后72℃10分鐘。使用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen，Inc.)對約630 bp的PCR產(chǎn)物進行凝膠純化，用水稀釋50倍，取2微升用作第二次PCR反應(yīng)的模版。第二次PCR反應(yīng)使用反向引物BB10和正向引物BB65′-CCCCG TCGAC ACATA TGAAG AAGACAGCTA TCGCG ATTGC AGTGG CACTG GCTGG TTTC-3′(SEQ IDNO32)。
PCR條件如第一次反應(yīng)所述的條件。凝膠純化約660 bp的PCR產(chǎn)物，用SalI和Bam H1消化，然后克隆到用SalI和Bam H1酶切過的pUC19(NewEngland BilLabs)中或用Xho I和Bam H1(單鏈Sal I和Xho I產(chǎn)物相容)酶切過的pCDNA3.1(+)(Invitrogen)中。對幾種克隆測序后，發(fā)現(xiàn)所有pUC19克隆(8/8)在ompA序列區(qū)都含有錯誤。僅對一個pCDNA3.1(+)克隆測序后，發(fā)現(xiàn)它含有一個在ompA區(qū)模糊的序列。為了制備正確的ompA-GH融合基因，使兩個測序后發(fā)現(xiàn)含有不同錯誤的、由方便的限制性酶位點分開的片段重組，并克隆到缺失PstI位點的pUC19衍生物(參見pBBT108，下文詳述)中。得到的質(zhì)粒，命名為pBBT112，攜帶ompA-GH融合基因，作為Nde I-BamH1片段被克隆到pBBT108的同樣位點上。該質(zhì)粒被命名為pBBT112，用于如下述的以PCR為基礎(chǔ)的、GH的位點特異性誘變。
4.Pst-pUC19的構(gòu)建為了促進用于構(gòu)建選擇性半胱氨酸取代突變體和插入突變體的克隆GH基因的誘變，如下述構(gòu)建了缺失一個Pst I位點的質(zhì)粒pUC19(New EnglandBioLabs)衍生物。用Pst I消化pUC19質(zhì)粒DNA，然后在75℃用PFU DNA聚合酶(Stratagene)處理，其中使用賣方提供的反應(yīng)緩沖液，并加入200 uMdNTP。在該條件下，聚合酶將消化由Pst I消化形成的3′單鏈懸掛區(qū)，而不消化雙鏈區(qū)。最終結(jié)果是構(gòu)成Pst I識別位點中間四個堿基的4個單鏈堿基的缺失。得到的分子是雙鏈，即“平頭”末端。在這些酶反應(yīng)后，用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen，Inc.)凝膠純化線狀單體。純化后的DNA用T4 DNA連接酶(New England BioLabs)按照供應(yīng)商提供的方案處理，用Pst I消化，然后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。篩選轉(zhuǎn)化體，通過Pst I和Bam H1限制性消化進行分析。篩選出一種沒有被Pst I酶切，但在Bam H1位點附近被酶切的轉(zhuǎn)化體，并被命名為pBBT108。
5.GH突變蛋白質(zhì)的構(gòu)建通常利用PCR草案當(dāng)前方法和應(yīng)用(B.A.White編1993，HumanaPress，Inc.，Totowa，NJ)和PCR草案方法和應(yīng)用指南(Innis，M.A.等編，1990，Academic Press Inc San Diego，CA)中描述的定點PCR誘變構(gòu)建GH突變蛋白質(zhì)。典型的PCR引物寡核苷酸設(shè)計為參與GH編碼序列的核苷酸改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)某一特定位置的氨基酸由半胱氨酸殘基取代。這種誘導(dǎo)突變的寡核苷酸引物還可以設(shè)計為在GH編碼序列的羧基末端或氨基末端插入一個半胱氨酸殘基。在后一種情況下，如果有必要還可以將一種或多種附加氨基酸殘基插入引入的半胱氨酸殘基的氨基末端和/或羧基末端。而且，如果需要，可以將寡核苷酸設(shè)計成為在GH編碼序列的特定位置上插入半胱氨酸殘基的插入突變。同樣，可以將一種或多種附加氨基酸與半胱氨酸殘基一起插入，這些氨基酸可以定位在半胱氨酸殘基的氨基末端和/或羧基末端。
半胱氨酸取代突變體T135C如下構(gòu)建。誘導(dǎo)突變的反向寡核苷酸BB28(5′-CTGCT TGAAG ATCTG CCCAC ACCGG GGGCT GCCAT C-3′(SEQ ID NO33))設(shè)計為將編碼135位氨基酸殘基的蘇氨酸密碼子ACT改變?yōu)榫幋a半胱氨酸的密碼子TGT，并設(shè)計跨越BglII位點附近。該寡核苷酸在PCR中用正向引物BB34(5′-GTAGC GCAGG CCTTC CCAAC CATT-3′(SEQID NO34))一起使用，該引物退火成為ompA-GH融合基因的連接區(qū)，不誘導(dǎo)突變。在50μl反應(yīng)液中進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)液含1 X PCR緩沖液(Perkin-Elmer緩沖液，含1.5 mM MgCl2)，四種核苷酸dA、dC、dG和dT每種濃度各為200 mM，每種寡核苷酸引物各0.5μM，5 pg pBBT112(上述的)作為模版，以及1.25單位Amplitac DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和0.125單位PFU DNA聚合酶(Stratagene)。在Robocycler Gradient 96熱循環(huán)儀(Stratagene)中進行反應(yīng)。應(yīng)用的程序為95℃3分鐘，循環(huán)(95℃1分鐘；45℃或50℃或55℃75秒；72℃1分鐘)25次，隨后6℃維持。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)，確定得到期望大小(即約430 bp)的有意義產(chǎn)物的退火溫度。通過應(yīng)用QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen)和采用Bgl II和Pst I消化，將45℃的反應(yīng)清除掉。得到的278 bp的BglII-Pst I片段，含有推測的T135C突變，經(jīng)凝膠純化，連接到已經(jīng)用Bgl II和Pst I消化并經(jīng)凝膠純化的pBBT111(攜帶stII-GH融合基因的pUC19衍生物，同上述)中。先用Bgl II和Pst I消化篩選源于這種結(jié)合的轉(zhuǎn)化體，隨后對一個克隆測序，確定存在T135C突變，并且不存在任何其它可能由于PCR反應(yīng)或由于寡核苷酸的合成潛在引入的突變。該測序后的克隆被發(fā)現(xiàn)具有正確的序列。
用上述T135C所述的方案構(gòu)建取代突變體S132C，不同之處在于使用誘導(dǎo)突變的反向寡核苷酸BB29 5′-CTGCT TGAAG ATCTG CCCAGTCCGG GGGCA GCCAT CTTC-3′(SEQ ID NO35)，而不是BB28，用于克隆的PCR反應(yīng)的退火溫度為50℃。測序的兩個克隆之一發(fā)現(xiàn)具有正確序列。
應(yīng)用類似方案但使用不同的克隆方法構(gòu)建取代突變體T148C。PCR中使用誘導(dǎo)突變的正向寡核苷酸BB30 5′GGGCA GATCT TCAAG CAGACCTACA GCAAG TTCGA CTGCA ACTCA CACAA C3′(SEQ ID NO36)和不誘導(dǎo)突變的反向引物BB33 5′CGCGG TACCC CGGGA TCCGA TTAGAATCCA CAGCT3′(SEQ ID NO37)，引物BB33退火成為大多數(shù)GH編碼序列的3′末端，并跨越緊鄰下游的Bam H1位點。如上述進行PCR反應(yīng)，除了使用的退火溫度為46℃、51℃和56℃。進行PCR和如上述的凝膠分析后，將46℃和51℃的反應(yīng)物合并用于克隆。用Bam H1和Bgl II對它們進行消化，凝膠純化，然后克隆到已經(jīng)用Bam H1和Bgl II消化并按照供應(yīng)商的方案用小牛腸道堿式磷酸酶(Promega)處理過的pBBT111中。通過Bam H1和Bgl II消化分析源于這種結(jié)合的轉(zhuǎn)化體，鑒定188 bp的Bam H1-Bgl II突變PCR片段以適當(dāng)方向克隆的克隆。因為Bam H1和Bgl II產(chǎn)生兼容性末端，這一步的克隆步驟不具備方向特異性。實驗了六個克隆，其中五個顯示取向正確。對其中之一測序，顯示含有所需的T148C突變。該序列中除188 bp BamH1-Bgl II突變PCR片段之外的其余序列也被確定是正確的。
除了下列區(qū)別，取代突變體S144C的構(gòu)建與T148C的構(gòu)建是完全相同的。使用誘導(dǎo)突變的正向寡核苷酸BB31 5′GGGCA GATCT TCAAG CAGACCTACT GCAAG TTCGA C3′(SEQ ID NO38)，而不是BB30。六個實驗克隆中兩個顯示取向正確。對其中之一測序，顯示含有所需的S144C突變。該克隆中除188 bp Bam H1-Bgl II突變PCR片段之外的其余序列也被確定是正確的。
還構(gòu)建了在GH的天然羧基末端加上一個半胱氨酸殘基的突變體。這樣構(gòu)建的突變體，命名為stp192C，其構(gòu)建類似于T148C，但使用了不同的寡核苷酸引物。使用誘導(dǎo)突變的反向寡核苷酸BB32 5′CGCGG TACCG GATCCTTAGC AGAAG CCACA GCTGC CCTCC AC3′(SEQ ID NO39)，其中在GH羧基末端苯丙氨酸殘基的密碼子和翻譯終止密碼子TAA之間插入半胱氨酸的密碼子TGC，并且該引物跨越Bam H1位點附近，還使用了上述的BB345′GTAGC GCAGG CCTTC CCAAC CATT3′(SEQ ID NO40)。如上述進行PCR和凝膠分析后，選擇46℃反應(yīng)用于克隆。實驗的六個克隆中三個顯示取向正確。對其中之一測序顯示含有所需的stp192C突變。該克隆中除188 bpBam H1-Bgl II突變PCR片段之外的其余序列也被確定是正確的。
可以使用類似的PCR誘變方法生產(chǎn)其它半胱氨酸突變體。誘導(dǎo)突變的寡核苷酸序列的選擇根據(jù)取代所需半胱氨酸殘基的位置和是否靠近有用的限制性核酸內(nèi)切酶位點來決定。通常，需要將突變即錯配片段放置于寡核苷酸中部附近，以增強寡核苷酸與模版的退火?？梢詰{經(jīng)驗確定寡核苷酸的適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?。誘導(dǎo)突變的寡核苷酸最好跨越一個獨特的限制性酶切位點，以便PCR產(chǎn)物可以被酶切產(chǎn)生一個能夠方便地克隆到適當(dāng)載體中的片段，所述的適當(dāng)載體，例如，可以是用于表達突變蛋白質(zhì)或提供用于切割突變基因并方便地將它克隆到該表達載體中的方便的限制性酶切位點的載體。有時突變位點和限制性酶切位點相隔大于合成人工寡核苷酸所需的長度通常希望該寡核苷酸的長度最好小于80個堿基，長度為30-40個堿基更為優(yōu)選。
在不適當(dāng)?shù)膶嵗校梢詫τ糜谡T導(dǎo)突變的目的基因進行再次基因操作或再次合成，以插入適當(dāng)位置的限制性位點。或者，也可以使用上面應(yīng)用的PCR誘變方案的改變方案，例如稱為“巨引物法”(“MegaprimerMethod”)(Barik，S.，分子生物學(xué)方法，pp.277-286，15卷PCR草案現(xiàn)代方法和應(yīng)用，B.A.White編，1993，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ)或“經(jīng)重疊延伸的基因剪接”(Horton，R.M.，分子生物學(xué)方法，pp.251-261，15卷PCR草案現(xiàn)代方法和應(yīng)用，B.A.White編，1993，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ)方案，來構(gòu)建這些突變體。
6.GH在pCYB1中的表達為了使GH在E.coli中表達，將pBBT120(不帶有克隆到tac表達載體pCYB1中的引導(dǎo)序列的GH基因)和pBBT114(帶有克隆到tac表達載體pCYB1中的stII引導(dǎo)序列的GH基因)轉(zhuǎn)化E.coli菌株JM109和W3110。還用母載體pCYB1轉(zhuǎn)化JM109和W3110。
對這些菌株給出下列命名BOB119JM109(pCYB1)BOB130W3110(pCYB1)BOB129JM109(pBBT120)BOB133W3110(pBBT120)BOB121JM109(pBBT114)BOB132W3110(pBBT114)菌株在含100μg/ml安芐青霉素的Luria Broth(LB)(Sambrook，等1989)中在37℃生長過夜，以便表達。用含100μg/ml安芐青霉素的LB稀釋這些飽和的過夜培養(yǎng)物，至A600處的OD值約為0.03，然后在旋轉(zhuǎn)搖床上的搖瓶中于37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速一般為250-300 rpm。監(jiān)測OD值，當(dāng)培養(yǎng)物的OD值達到約0.25-0.5，典型地在0.3-0.4之間時，加入IPTG至終濃度為0.5 mM。通常在誘導(dǎo)后1、3、5和約16小時時對培養(yǎng)物取樣?！凹s16小時”的時間點表示對培養(yǎng)物培養(yǎng)過夜，準確時間可以從約15-20小時之間變化。離心沉淀誘導(dǎo)培養(yǎng)物和未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的樣品，重新懸浮于1X樣品緩沖液(50 mMTris-HCl(pH 6.8)，2％十二烷基硫酸鈉，10％甘油，0.1％溴酚蘭)，如果需要可以加入1％的β-巰基乙醇。樣品煮沸約10分鐘或加熱到95℃約10分鐘。樣品冷卻至室溫，然后裝載到SDS聚丙烯酰胺凝膠上，或者如果不立即跑凝膠，可以-20℃儲藏。樣品按照供應(yīng)商的方案，應(yīng)用快速凝膠池(Ready Gel Cell)電泳裝置(Bio-Rad)在預(yù)制的15％聚丙烯酰胺“快速凝膠”(“ReadyGels”)(Bio-Rad，Hercules CA)上對樣品進行電泳分離。通常樣品在200伏特跑電泳約35-45分鐘。用考馬斯亮藍對凝膠染色，或電印跡后用Western印跡分析。來自菌株BOB129、BOB133、BOB121和BOB132的全細胞水解產(chǎn)物的考馬斯亮藍染色顯示了一條與購自研究診斷學(xué)公司(Flanders，NJ)的純化重組人GH標(biāo)準品共遷移的約22 kD的色帶。該色帶是連夜誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)培養(yǎng)物中最重要的組分。然而，在上述同樣菌株的的未誘導(dǎo)培養(yǎng)物中也觀察到一條同樣分子量的色帶，在攜帶缺乏GH基因的表達載體pCYB1的BOB119和BOB130對照菌株的誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)物中也能觀察到該色帶。為了解釋該觀察結(jié)果，對菌株BOB119、BOB130、BOB129、BOB133、BOB121、和BOB132的誘導(dǎo)培養(yǎng)物的全細胞水解產(chǎn)物進行Western印跡分析。用購自美國生物學(xué)；目錄#G9000-11(Swampscott，MA)的多克隆兔抗人GH抗血清進行Western印跡。初級抗體以1∶5000的稀釋度稀釋使用，用購自Pierce(Rockford，IL)的結(jié)合了堿式磷酸酶(產(chǎn)品號31341)的山羊抗-兔IgGFc檢測初級抗體的結(jié)合。次級抗體以1∶10,0000的稀釋度稀釋使用。用ImmunoPureFast Red TR/AS-MX底物試劑盒(Pierce，Rockford IL)按照供應(yīng)商的方案檢測堿式磷酸酶的活性。Western印跡清楚地證明了GH在BOB129、BOB133、BOB121、和BOB132的誘導(dǎo)后3小時和16小時的誘導(dǎo)培養(yǎng)物的水解產(chǎn)物中存在。在對照菌株，BOB119和BOB130的誘導(dǎo)培養(yǎng)物中，Western印跡沒有在誘導(dǎo)后3或16小時的時間點檢測到GH。
在這些初步試驗中，從BOB132 W3110(pBBT114)中得到GH的產(chǎn)量最高，其中GH基因融合在stII分泌信號序列的下游。進一步檢測該菌株是否如期望分泌GH蛋白到周質(zhì)中。如上述制備BOB132的誘導(dǎo)培養(yǎng)物，然后按照Koshland和Botstein(Cell 20(1980)pp.749-760)的方法對上述培養(yǎng)物進行滲透壓刺激。該方法使外膜破裂，使周質(zhì)的成分釋放到周圍培養(yǎng)基中。隨后從細胞相關(guān)成分的殘留物中離心分離存在于上清液中的周質(zhì)成分。在該試驗中，發(fā)現(xiàn)通過BOB132合成的大部分GH定位在周質(zhì)中。該結(jié)果與大部分總GH跟純化的GH標(biāo)準品在大小上也不能分辨的結(jié)果相一致，這表明stII信號序列已經(jīng)被除去。這是分泌型的指標(biāo)。還對大規(guī)模(500 ml)BOB132培養(yǎng)物進行了誘導(dǎo)，連夜培養(yǎng)，并按照Hsiung等，1986(Bio/Technology 4，pp.991-995)描述的方法進行滲透壓刺激。凝膠分析再次證明生產(chǎn)的大部分GH是可溶的、定位在周質(zhì)的、與GH標(biāo)準品分子量大小無差別的。該材料還可以應(yīng)用與Becker和Hsiung，1986(FEBS論文集204，pp.145-150)在重組人GH中應(yīng)用的類似條件定量結(jié)合于Q-瓊脂糖柱并從其上洗脫。
7.人GH受體的克隆應(yīng)用正向引物BB3和反向引物BB4通過PCR克隆人GH受體。BB3的序列為5’-CCCCG GATCC GCCAC CATGG ATCTC TGGCA GCTGCTGTT-3’(SEQ ID NO26)。BB4的序列為5’-CCCCG TCGAC TCTAGAGCTA TTAAA TACGT AGCTC TTGGG-3’(SEQ ID NO27)。模版為由人肝制備的單鏈cDNA(由CLONTECH試驗室商業(yè)提供)。引物BB3和BB4分別含有用于克隆目的的BamHI和SalI限制性位點。100μl PCR反應(yīng)物含有2.5 ng單鏈cDNA和1 X PCR緩沖液(含MgCl2的Perkin-Elmer緩沖液)中20微微摩爾的各引物，四種核苷酸dA、dC、dG和dT各200摩爾濃度，2.5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer)和2.5單位Pfu聚合酶(Stratagene，Inc.)。PCR反應(yīng)條件為96℃3分鐘，循環(huán)(95℃1分鐘；58℃30秒；72℃2分鐘)35次，隨后72℃10分鐘。使用的熱循環(huán)儀為Amplitron II ThermalCycler(Thermolyne)。用BamHI和SalI消化約1.9 kb的PCR產(chǎn)物，然后用同樣酶切的質(zhì)粒pUC19(New England BioLabs)連接。然而，從含有1.9 kb PCR片段的連接反應(yīng)物中沒有得到轉(zhuǎn)化體。Leung等(Nature，1987，330，pp.537-543)也沒有在pUC19中得到人GH受體的全長cDNA克隆。接著，將該PCR片段克隆到低拷貝數(shù)的載體pACYC184(New England BioLabs)的BamHI和SalI位點上。以適當(dāng)?shù)念l率得到該克隆，但攜帶克隆PCR片段的E.coli菌株在用于篩選pACYC184維持生長的氯霉素存在下生長很差，形成較小的、外觀類型不同的克隆。
同時將該PCR片段克隆到pCDNA3.1(+)(Invitrogen)中。用BamHI和SalI消化約1.9 kb的PCR產(chǎn)物，然后連接到pCDNA3.1(+)的BamHI和XhoI克隆位點。僅來自該連接的罕見轉(zhuǎn)化體含有克隆GH受體的cDNA，所有這些轉(zhuǎn)化體都含有刪除的受體編碼序列片段。對這些克隆之一測序，發(fā)現(xiàn)在GH受體編碼序列中含有135 bp的刪除該基因的其余序列與Leung等(1987)報道的一致。
8.兔GH受體的克隆用正向引物BB3(如上述)和反向引物BB36通過PCR克隆兔GH受體。BB36序列為5’-CCCCG TCGAC TCTAG AGCCA TTAGA TACAAAGCTC TTGGG-3’(SEQ ID NO41)，其含有用于克隆目的的XbaI和SalI限制性位點。兔肝多聚(A)+mRNA購自CLONTECH，Inc.，它被用作單鏈cDNA第一條鏈合成中的底物，用來制備PCR擴增的模版。利用來自BoehringerMannheim Corp(Indianapolis，IN)的用于RT-PCR(AMV)試劑盒的第一條鏈cDNA合成試劑盒，按照供應(yīng)商的方案實現(xiàn)了單鏈cDNA第一條鏈的合成。利用任意六聚物或BB36作為引物合成平行第一條鏈cDNA。接著用第一條鏈合成產(chǎn)物作為模版，用引物BB3和BB36作為引物，按照用于RT-PCR(AMV)試劑盒的第一條鏈cDNA合成試劑盒上的方案，并用2.5單位的Amplitac DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和0.625單位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為96℃保溫3分鐘，循環(huán)(95℃1分鐘；58℃30秒；72℃2分鐘)35次，隨后72℃保溫10分鐘。使用的熱循環(huán)儀為Amplitron II Thermal Cycler(Thermolyne)。利用任意六聚物引導(dǎo)或BB36引導(dǎo)的cDNA作為模版的PCR反應(yīng)液中觀察到期望的約1.9 kb的PCR產(chǎn)物。在隨后的克隆試驗中使用任意六聚物引導(dǎo)的cDNA。用Bam H1和XbaI消化，然后在1.2％的瓊脂糖凝膠上跑凝膠。該消化產(chǎn)生兩個片段(約365 bp和約1600 bp)，因為兔GH受體基因含有一個內(nèi)部Bam H1位點。對這兩個片段進行凝膠純化。先洗脫出來的約1600bp的BamH1-XbaI片段克隆到已經(jīng)用同樣這兩種酶消化過的pCDNA3.1(+)中。在適度的頻率可以方便的得到這些克隆，經(jīng)限制性酶消化以及隨后測序確定這些克隆沒有缺失的跡象。為了制備全長克隆，將一個含約1600 bp的Bam H1-Xba I片段(pCDNA3.1(+)∷rab-ghr-2A)的質(zhì)粒用Bam H1消化，并用小牛腸道堿式磷酸酶(Promega)按照供應(yīng)商提供的方案處理，凝膠純化，然后與凝膠純化的含兔GH受體基因5’部分的約365 bp的Bam H1片段連接。篩選源于這種連接的轉(zhuǎn)化體，并用限制性酶消化和PCR分析，以確定約365 bp片段的存在和它相對于兔GH受體基因遠側(cè)片段的取向。經(jīng)分析四個克隆中三個發(fā)現(xiàn)含有約365 bp的片段，該片段以重建兔GH受體基因的正確方向被克隆。相對于人基因在E.coli中的克隆，兔基因在E.coli中的克隆并不復(fù)雜，這與Leung等(1987)的結(jié)果一致，他們也輕易地從E.coli中得到兔GH受體基因的全長cDNA克隆，而不能從E.coli中得到人基因的全長cDNA克隆。在分析中可以使用人GH作為配體的兔GH受體，因為報道人GH與兔受體的結(jié)合具有高度親合力(Leung等1987)。應(yīng)該在應(yīng)用前對含有克隆兔GH受體的質(zhì)粒測序，以便鑒定兔GH受體cDNA具有正確的序列。
9.人/兔嵌合GH受體基因的構(gòu)建作為兔受體的另一種方式，可以構(gòu)建混合了跨膜人受體的胞外區(qū)和兔受體胞質(zhì)區(qū)的嵌合受體?？梢酝ㄟ^在人基因和兔基因中共有的唯一Nco I位點重組人和兔基因來構(gòu)建該嵌合受體(Leung等1987)。該重組體，含有定位于5’端或Nco I位點“上游”的人基因片段和定位于3’端或Nco I位點“下游”的兔基因片段，將編碼準確地編碼所需類型的嵌合嵌合受體，其具有跨膜人受體的胞外區(qū)和兔受體的胞質(zhì)區(qū)。這將能夠分析具有天然受體結(jié)合位點的GH、GH突變蛋白、和PEG衍生化的GH突變蛋白的相互作用，而不必在E.coli中克隆全長人GH受體。
GH突變蛋白可以在很多表達系統(tǒng)例如細菌、酵母或昆蟲細胞中表達。用于將GH突變蛋白表達到這些系統(tǒng)中的載體可以從大量供應(yīng)商處購買，例如Novagen，Inc.(在E.coli中表達的pET15b)，New England Biolabs(在E.coli中表達的pC4B1)，Invitrogen(利用桿狀病毒在昆蟲細胞中表達的pVL1392、pVL1393和pMELBAC，在酵母細胞中表達的Pichia載體，以及在哺乳動物細胞中表達的pCDAN3)。已經(jīng)成功地在E.coli中制備了GH，它為胞質(zhì)蛋白，并且為利用E.coli的OmpA或STII信號序列促進該蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)空間的分泌型的周質(zhì)蛋白質(zhì)(Chang等，1987；Hsiung等，1986)。最好GH突變蛋白以分泌蛋白質(zhì)的形式表達，以致于它們不含天然人蛋白質(zhì)中不存在的N-末端蛋氨酸殘基。為了在E.coli中表達，可以將編碼GH或GH突變蛋白的DNA序列克隆到E.coli表達載體中，例如使用強效T7啟動子的pET15b或者使用TAC啟動子的pCYB1。將IPTG(異丙基硫代吡喃半乳糖，購自Sigma Chemical Company)加入生長培養(yǎng)基，可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。重組GH將從釋放的位置分泌到周質(zhì)空間，接著純化，然后用滲透壓刺激(Becker和Hsiung，1986)。可以用其它色譜方法例如離子交換色譜、疏水作用色譜和反向色譜進一步純化該蛋白質(zhì)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)(例如，參見Becker和Hsiung，1986)。可以應(yīng)用商業(yè)提供的蛋白質(zhì)分析試劑盒(例如BioRad Laboratories，Richmond，CA出售的試劑盒)測定蛋白質(zhì)濃度。如果在E.coli中表達的GH蛋白是不溶解的，那么可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法使它們再折疊(參見Cox等，1994和世界專利申請WO9422466和WO9412219)。
或者，可以在昆蟲細胞中以分泌蛋白質(zhì)的形式表達該蛋白質(zhì)?？梢哉{(diào)整表達質(zhì)粒，以使它含有促進蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中的GH信號序列?？梢詫DNA克隆到商業(yè)提供的載體中，例如來自invitrogen，Inc.的pVL1392，然后感染昆蟲細胞?？梢詰?yīng)用常規(guī)色譜方法從條件介質(zhì)中純化GH和GH突變蛋白?？梢允褂每箁hGH的抗體結(jié)合Western印跡，確定色譜中含GH蛋白的組分?；蛘?，可以應(yīng)用ELISA分析法鑒定含GH蛋白的組分。
也可以在真核細胞例如酵母或哺乳動物細胞中以胞外或分泌型蛋白質(zhì)的形式表達引入半胱氨酸的GH變異體。各商業(yè)供應(yīng)公司例如Invitrogen，Inc。Stratagene，Inc.和Clon Tech，Inc.的目錄中描述了表達蛋白質(zhì)的載體和該實驗的操作方法?？梢詰?yīng)用常規(guī)色譜方法純化GH和GH突變蛋白。
可以應(yīng)用增殖受GH影響的細胞系測定GH突變蛋白的生物活性。Fuh等(1992)通過用鼠G-CSF受體與兔GH受體胞外區(qū)融合的嵌合受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化骨髓性白血病細胞系——FDC-P1，制備了一種GH-響應(yīng)細胞系。該細胞系的增殖受GH影響，半數(shù)最大有效濃度(EC50)為20微微摩爾?？梢詰?yīng)用這些受體的公開序列和標(biāo)準分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建類似細胞系(Fuh等1992)。或者，應(yīng)用這些受體的公開序列和標(biāo)準分子生物學(xué)技術(shù)將人GH受體的胞外區(qū)與鼠G-CSF受體融合。可以通過應(yīng)用標(biāo)記GH的流動細胞記數(shù)，或者通過轉(zhuǎn)化細胞與放射性標(biāo)記的GH結(jié)合的能力，或者通過轉(zhuǎn)化細胞對加入GH響應(yīng)的增殖，來鑒定表達嵌合受體的轉(zhuǎn)化細胞。在細胞增殖分析中可以應(yīng)用表達嵌合受體的細胞對純化GH和GH突變蛋白進行測試，以測定這些蛋白質(zhì)的特異活性。可以將細胞在含有各種濃度的GH或GH突變蛋白的96孔平皿上鋪板。18小時后，用3H-胸苷處理細胞4小時，然后收獲測定合并到其中的放射活性?？梢詼y定各突變蛋白質(zhì)的EC50。每種突變蛋白質(zhì)在每個數(shù)據(jù)點均使用三個孔，使每種分析至少重復(fù)三次。與野生型GH相比顯示具有類似的或更好的最佳刺激水平和EC50值的GH突變蛋白是優(yōu)選的。
可以利用購買自Shearwater，Inc.的半胱氨酸反應(yīng)性8 kDa PEG-馬來酰亞胺(或PEG-乙烯砜)對保留體外活性的GH突變蛋白進行PEG衍生化。一般地，用這些試劑對蛋白質(zhì)進行PEG衍生化的方法類似于世界專利申請WO9412219和WO9422466以及PCT申請US95/06540中描述的方法，僅略微改動。必須用二硫蘇糖醇(DTT)部分還原重組蛋白質(zhì)，以便實現(xiàn)游離半胱氨酸的最佳PEG衍生化。雖然游離半胱氨酸不形成二硫鍵，但除非進行上述部分還原步驟，否則它仍然與半胱氨酸反應(yīng)PEG相對不發(fā)生反應(yīng)。部分還原各突變蛋白質(zhì)所需的DTT的量可以憑經(jīng)驗確定，使用一定濃度范圍內(nèi)的DTT。通常過量5-10倍(摩爾)的DTT室溫處理30分鐘即可?？梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)在反相柱上洗脫曲線的輕微移動探測這種部分還原。需要注意不能過度還原蛋白質(zhì)，使其它的半胱氨酸殘基暴露。可以通過反相-HPLC(蛋白質(zhì)將具有與完全還原型和變性蛋白質(zhì)相近的保留時間)和含兩個PEG的GH分子的出現(xiàn)(通過SDS-PAGE上的分子量的改變探測)探測過度還原。野生型GH可以用作對照，因為在同樣條件下它不應(yīng)該被PEG衍生化?？梢詰?yīng)用尺寸排阻色譜用旋轉(zhuǎn)柱除去過量的DTT。部分還原的蛋白質(zhì)可以與多種濃度的PEG-馬來酰亞胺(PEG蛋白質(zhì)的摩爾比為1∶1；5∶1；10∶1和50∶1)反應(yīng)，用來確定兩種物質(zhì)的優(yōu)選比率。可以通過應(yīng)用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得到的分子量移動監(jiān)測蛋白質(zhì)的PEG衍生化。認為能夠提供大量單-PEG衍生物而不是雙-PEG衍生物的最小量的PEG是優(yōu)選的(認為80％轉(zhuǎn)化成為單-PEG衍生物是較好的)。通?？梢酝ㄟ^尺寸排阻色譜或離子交換色譜將單-PEG衍生蛋白質(zhì)從未被PEG衍生的蛋白質(zhì)和未反應(yīng)的PEG中純化出來。純化的PEG衍生蛋白質(zhì)可以進行上述細胞增殖分析測試，用來確定它的特異活性。
上述實驗可以鑒定GH中能夠改變成為半胱氨酸殘基，進行PEG衍生化，并保留體外生物活性的B-C環(huán)、C-D環(huán)、或A-B環(huán)的N-末端的氨基酸?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的動物疾病模型測試這些突變蛋白質(zhì)。
可以通過實驗確定PEG分子在適當(dāng)?shù)奈稽c與蛋白質(zhì)結(jié)合。所述實驗可以如下進行用蛋白水解酶消化蛋白質(zhì)，利用尺寸排阻、離子交換或反相色譜純化PEG多肽(它將具有較大的分子量)，最后進行氨基酸測序或質(zhì)譜分析。偶聯(lián)PEG的氨基酸將作為氨基酸測序中的空白。
PEG-GH蛋白的藥物動力學(xué)性質(zhì)可以如下確定，或者如世界專利申請WO9422466中描述的那樣確定。可以對成對大鼠或小鼠靜脈快速濃注實驗蛋白質(zhì)。在所需的時間點對動物取少量血樣監(jiān)測24小時的蛋白質(zhì)體內(nèi)循環(huán)水平。可以用ELISA分析法對實驗蛋白質(zhì)的循環(huán)水平定量。還可以進行應(yīng)用皮下途徑給用蛋白質(zhì)的其它實驗。應(yīng)該用無PEG衍生化的蛋白質(zhì)作為對照進行同樣的實驗。這些實驗將揭示是否PEG試劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合改變了蛋白質(zhì)的藥動學(xué)性質(zhì)。相對于未經(jīng)PEG衍生的蛋白質(zhì)，用PEG對蛋白質(zhì)的共價修飾將增加蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期。較大的PEG分子和/或結(jié)合較多的PEG分子應(yīng)該比小分子PEG更長地延長循環(huán)半衰期。
可以在生長激素缺陷(Cox等，1994)和惡病質(zhì)(Tomas等，1992；Read等，1992)的嚙齒動物模型中實驗PEG-GH蛋白，以確定優(yōu)選給藥方案并驗證效能。這些研究中可以考察不同大小例如8和20 kDa的PEG分子和給藥方案，以確定優(yōu)選的PEG大小和給藥方案。預(yù)期較大的PEG分子比較小的PEG分子延長循環(huán)半衰期，因此將減少給藥頻率。然而，較大蛋白質(zhì)可能潛在地降低體內(nèi)分布體積；因此，一個20 kDa PEG與GH的結(jié)合可能將限制生物利用度，從而降低效能。嚙齒動物模型將能夠確定是否存在這種情況。一旦確定了優(yōu)選給藥方案和PEG大小后，可以在動物模型中比較PEG-GH與GH的效能。雖然所有含有GH活性的PEG-GH蛋白質(zhì)都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，促進生長的能力等于或優(yōu)于GH，而能夠降低給藥頻率的PEG-GH蛋白質(zhì)是優(yōu)選蛋白質(zhì)。如果PEG-GH和GH都使用較少頻率的給藥方案，那么PEG-GH應(yīng)該比GH更有效。
可以使用的一個GH缺陷模型是垂體切除大鼠。在該模型中GH可以刺激體重增長以及骨和軟骨的生長(Cox等1994)。可以從Charles River購買垂體切除大鼠。對大鼠注射GH、PEG-GH或安慰劑，每日測定體重的增加，連續(xù)10-14天。處死時，測定脛骨骨端的寬度作為骨生長的參數(shù)。進行這些研究的實驗方法在Cox等(1994)中有描述。
可以用類似方法測試PEG-GH對嚙齒動物惡病質(zhì)模型的效果。每日經(jīng)滲透泵或皮下注射給用地塞米松，可以促使體重減輕(Tomas等，1992；Read等1992；PCT專利申請/US95/06540)。
實施例2引入半胱氨酸的紅細胞生成素變異體該實施例涉及引入半胱氨酸的紅細胞生成素(EPO)變異體。EPO是促進紅細胞生成的主要激素。EPO作用于成熟的紅細胞前體，刺激它們進一步增殖和分化成為成熟的紅細胞。Amgen，Inc.提供其市售藥品。人EPO是由成人腎分泌的一種35-39 kDa的糖蛋白。成熟的人蛋白質(zhì)含有166個氨基酸，并高度糖基化。Lin等(1985)和Jacobs等(1985)公開了人EPO的序列(SEQ IDNO2)，它們作為參考引入本文。EPO的一級序列種間高度保守(等同性超過80％；Wen等1994)。糖基團超過蛋白質(zhì)質(zhì)量的40％。人EPO含有三個N-連接的糖基化位點和一個O-連接的糖基化位點。N-連接的糖基化位點在不同種之間是保守的，而O-連接的糖基化位點不是。EPO的大量糖基化導(dǎo)致該蛋白質(zhì)不能結(jié)晶，因此該蛋白質(zhì)的X-射線結(jié)構(gòu)還不清楚。人EPO含有四個半胱氨酸殘基。二硫鍵的分配為Cys7到Cys161和Cys29到Cys33。在小鼠EPO中Cys33不是保守的，意味著Cys29到Cys33的二硫鍵對小鼠EPO的結(jié)構(gòu)或功能不是關(guān)鍵的。該結(jié)論可能也適用于人EPO(Boissel等1993)。
EPO的氨基酸序列與GH超基因家族成員的蛋白質(zhì)一致，突變研究也支持該EPO結(jié)構(gòu)的觀點(Boissel等1993；Wen等1994)。推測了模擬GH結(jié)構(gòu)得出的EPO三維結(jié)構(gòu)模型(Boissel等1993；Wen等1994)。已經(jīng)通過誘變實驗鑒定了EPO中對受體結(jié)合起重要作用的氨基酸，初步認定它們定位在推測的螺旋A的N-端部分和推測的螺旋D的C-端部分(Boissel等1993；Wen等1994；Matthews等1996)。僅鑒定了一個EPO的細胞表面受體(D’Andrea等1989)。據(jù)信EPO與其受體的二聚化基本上與GH與其受體的二聚化相同(Matthews等1996)。
人EPO含有三個通過N-連接的糖基化位點(天冬氨酸-24、-38和-83)和一個通過O-連接的糖基化位點(絲氨酸-126)。N-連接的糖基化位點定位在A-B環(huán)和B-C環(huán)，O-連接的糖基化位點定位在C-D環(huán)。N-連接的糖基化位點在種間是保守的，而O-連接的糖基化位點在嚙齒動物EPO中缺乏(Wen等1993)。曾描述過一種126位含有蛋氨酸的非O-連接的糖基化人變異體(美國專利4703008)。N-連接的糖基團高度分枝，并含有末端唾液酸殘基(Sasaki等1987；Takeuchi等1988)。N-38和N-83含有分枝程度最高的低聚糖(Sasaki等1988)。
EPO上的末端唾液酸殘基對蛋白質(zhì)的體內(nèi)功能是關(guān)鍵的，因為消化除去這些殘基也就喪失了體內(nèi)活性(Fukada等1989；Spivak和Hogans，1989)?；钚詥适c無唾液酸的蛋白質(zhì)從體內(nèi)快速清除有關(guān)。無唾液酸的蛋白質(zhì)在大鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期少于10分鐘，相比較而言，有唾液酸的蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期約為2小時(Fukada等1989；Spivak和Hogans，1989)。因此，EPO的體內(nèi)活性與其循環(huán)半衰期直接相關(guān)。
通過單獨地或組合地使三個含有N-連接的糖基化位點的天冬氨酸殘基突變，已經(jīng)清楚地鑒定了N-連接的糖基團在EPO生物活性中的作用。從哺乳動物細胞中分泌出來的、僅一個N-連接的糖基化位點發(fā)生突變的EPO突變蛋白質(zhì)即N24Q、N38Q和N83Q與野生型EPO同樣有效，這表明并不是三個位點上的N-連接的糖基化對蛋白質(zhì)分泌都是必需的(N24Q指示24位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝滨０?。相比較而言，從哺乳動物中分泌出的、兩個或更多N-連接的糖基化位點發(fā)生突變的EPO突變蛋白質(zhì)比野生型EPO生物活性低(Yamaguchi等1991；Delorme等1992)。突變研究發(fā)現(xiàn)任何一個單一N-連接的糖基化位點發(fā)生突變的蛋白質(zhì)體外生物活性均等于或大于野生型EPO。因此，得出結(jié)論N-連接的糖基化位點對EPO的分泌或體外生物活性不是必需的。事實上，除去一個糖基化位點可能改善生物活性(Yamaguchi等1991)。
分成兩組研究N-連接的糖基化突變蛋白質(zhì)的體內(nèi)生物活性。Yamaguchi等(1991)論證N24Q和N83Q突變蛋白質(zhì)的體內(nèi)活性大于野生型EPO，這與它們體外活性的增加有關(guān)。這些作者發(fā)現(xiàn)N38Q突變蛋白質(zhì)的體內(nèi)活性比野生型EPO降低約60％。N38是N-連接的糖基化位點中分枝程度最高的位點(Sasaki等1988)。Delorme等(1992)報道任何N-連接的糖基化位點的突變都會降低體內(nèi)生物活性約50％。兩項研究中，兩個或更多糖基化位點發(fā)生突變的突變蛋白質(zhì)的體內(nèi)活性均降低。
上述研究表明某些N-連接的糖基化對EPO的體外和體內(nèi)活性是必需的。然而，不是三個糖基化位點對于活性都是絕對關(guān)鍵的。N-連接的糖基團增加了EPO的表觀分子量，延長了其與生物活性有關(guān)的循環(huán)半衰期。天然EPO和哺乳動物細胞中生產(chǎn)的EPO具有復(fù)雜的N-連接的糖基團，它們含有半乳糖和末端唾液酸殘基。半乳糖殘基被肝細胞特異性受體識別，促進EPO從體內(nèi)快速清除，除非半乳糖殘基被末端唾液酸掩蓋。
誘變研究證明O-連接的糖基化對于EPO的體內(nèi)或體外功能不是必需的(Delorme等1992)。這與觀察到嚙齒動物沒有O-糖基化一致，也與存在絲氨酸-126取代為蛋氨酸的自然發(fā)生的人EPO變異體相應(yīng)地缺乏O-糖基化一致。絲氨酸-126的誘變揭示該位點上某種氨基酸的改變(改變?yōu)轭R氨酸、組氨酸或谷氨酸)產(chǎn)生生物活性類似與野生型EPO的EPO突變蛋白質(zhì)，而其它氨基酸的改變(改變?yōu)楸彼峄蚋拾彼?產(chǎn)生活性嚴重降低的EPO分子(Delorme等1992)。絲氨酸-126改變?yōu)榘腚装彼岬男Ч丛芯俊０l(fā)現(xiàn)S126V EPO的體內(nèi)生物活性與野生型EPO相近(Delorme等1992)。
復(fù)雜的、N-連接的、含有末端唾液酸殘基的碳水化合物對EPO的體內(nèi)生物活性的重要性使該蛋白質(zhì)的商業(yè)生產(chǎn)限于哺乳動物細胞。含有唾液酸的N-連接的糖基團的重要作用在于防止蛋白質(zhì)聚合、增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，并延長蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期。末端唾液酸殘基掩蓋了其下的半乳糖殘基(它由肝細胞的特異性受體識別，并促進無唾液酸的蛋白質(zhì)清除)，從而延長了EPO的循環(huán)半衰期?？梢栽诶ハx細胞中制備EPO，它是N-糖基化的，并具有全部體外活性；它的體內(nèi)活性未見報道(Wojchowski等1987)。
該實施例提供了引入半胱氨酸的EPO變異體的設(shè)計方案，以及它們在利用半胱氨酸反應(yīng)性PEG和其它半胱氨酸反應(yīng)性試劑制備結(jié)合物中的應(yīng)用。EPO中的某些氨基酸對于生物活性是非必需的，可以突變成為半胱氨酸殘基而不會改變正常的二硫鍵結(jié)合模式和分子的整體構(gòu)型。這些氨基酸定位在A-B環(huán)(成熟蛋白質(zhì)序列的23-58位氨基酸)、B-C環(huán)(成熟蛋白質(zhì)序列的77-89位氨基酸)、C-D環(huán)(成熟蛋白質(zhì)序列的108-131位氨基酸)、螺旋A的近側(cè)(1-8位氨基酸)和螺旋D的遠側(cè)(成熟蛋白質(zhì)序列的153-166位氨基酸)。還推測引入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點可以是蛋白質(zhì)序列的N-末端或C-末端。半胱氨酸取代的優(yōu)選位點是O-連接的糖基化位點(絲氨酸-126)和含有三個N-連接的糖基化位點的氨基酸(N24、I25、T26、N38、I39、T40、N83、S84、S85)。糖基化位點是引入半胱氨酸取代和使PEG分子結(jié)合于EPO的有吸引力的位點，因為()這些位點暴露于表面；(2)天然蛋白質(zhì)可以允許這些位置存在大體積的糖基團；(3)糖基化位點位于推測的環(huán)區(qū)，遠離受體結(jié)合位點(Wen等1994)；和(4)誘變研究表明這些位點(至少單獨地)不是體外或體內(nèi)活性的關(guān)鍵位點(Yamaguchi等1991；Delorme等1992)。如上面的討論，包括O-糖基化位點區(qū)的區(qū)域的局部構(gòu)型可能對生物活性是很重要的。但還沒有研究在126位的半胱氨酸取代是否會影響生物活性。半胱氨酸-29到半胱氨酸-33的二硫鍵對EPO的生物活性是非必需的，因為將這兩個殘基同時改變?yōu)槔野彼崛匀划a(chǎn)生生物活性EPO蛋白質(zhì)(Boissel等1993；Wen等1994)?？梢詫腚装彼?29或半胱氨酸-33之一改變成為其它氨基酸制備“游離”半胱氨酸。優(yōu)選的氨基酸改變應(yīng)該是改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸。保留的“游離”半胱氨酸(半胱氨酸-29或半胱氨酸-33)應(yīng)該是用半胱氨酸反應(yīng)性試劑共價修飾蛋白質(zhì)的優(yōu)選位點。
Bill等(1995)用半胱氨酸單獨取代N24、N38和N83，報道突變蛋白質(zhì)的體外生物活性大幅度降低(低于野生型活性的20％)。Bill等(1995)在細菌中表達了融合蛋白質(zhì)形式的EPO變異體(與谷胱甘肽-硫-轉(zhuǎn)移酶融合)。本發(fā)明一方面提供了表達系統(tǒng)，其中N24C、N38C、和N83C EPO變異體將具有與野生型EPO十分相近的體外生物活性。
美國專利4703008構(gòu)思了EPO的自然發(fā)生變異體以及出現(xiàn)在哺乳動物EPO蛋白質(zhì)中的氨基酸取代。綿羊EPO在多肽鏈的第88位含有半胱氨酸殘基。本發(fā)明人沒有發(fā)現(xiàn)任何其它自然發(fā)生的人或動物EPO的半胱氨酸變異體，其中半胱氨酸殘基位于本文公開的用于制備引入半胱氨酸的EPO變異體的多肽區(qū)。專利4703008具體指示遠遠不同于引入半胱氨酸的EPO變異體，其中建議可以通過刪除半胱氨酸殘基或用絲氨酸或組氨酸殘基取代自然發(fā)生的半胱氨酸殘基促進EPO的表達。
EPO的成熟蛋白質(zhì)形式含有165或166個氨基酸，因為翻譯后除去了C-末端的精氨酸。天冬氨酸-165是165個氨基酸構(gòu)型的C-末端，而精氨酸-166是166個氨基酸構(gòu)型的C-末端氨基酸。本文描述的半胱氨酸取代和插入突變可以包括成熟EPO的165氨基酸構(gòu)型和166氨基酸構(gòu)型。
可以通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)從人HepG2或Hep3B細胞系(它們是已知的缺氧或氯化鈷處理下表達EPO的細胞系(Wen等1993)，購自美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC))克隆編碼EPO的cDNA。可以通過標(biāo)準噬菌體、質(zhì)?；蛉鏕H中所述的PCR誘變方法將半胱氨酸突變引入cDNA。如上所述，引入半胱氨酸取代突變的優(yōu)選位點在A-B環(huán)、B-C環(huán)、C-D環(huán)和螺旋A的近側(cè)區(qū)和螺旋D的遠側(cè)區(qū)。這些區(qū)域中的最優(yōu)選位點是N-和O-連接的糖基化位點S126-C；N24C；I25C；T26C；N38C；I39C；T40C；N83C；S84C和S85C。半胱氨酸取代突變的其它優(yōu)選位點在A-B環(huán)、B-C環(huán)和C-D環(huán)，圍繞糖基化位點的氨基酸以及蛋白質(zhì)螺旋A的近側(cè)區(qū)和螺旋D的遠側(cè)區(qū)(Boissel等1993；Wen等1994)。這些區(qū)域中用于半胱氨酸取代的其它優(yōu)選位點為A1、P2、P3、R4、D8、S9、T27、G28、A30、E31、H32、S34、N36、D43、T44、K45、N47、A50、K52、E55、G57、Q58、G77、Q78、A79、Q86、W88、E89、T107、R110、A111、G113、A114、Q115、K116、E117、A118、S120、P121、P122、D123、A124、A125、A127、A128、T132、K154、T157、G158、E159、A160、T163、G164、D165、和R166。還可以在成熟蛋白質(zhì)第一個氨基酸的近側(cè)，即A1之前，或者在成熟蛋白質(zhì)中最后一個氨基酸的遠側(cè)即D165或R166之后引入半胱氨酸殘基。還提供了半胱氨酸-29或半胱氨酸-33被其它氨基酸，優(yōu)選絲氨酸或丙氨酸取代的其它變異體。
可以利用昆蟲細胞表達野生型EPO和EPO突變蛋白，用來確定引入半胱氨酸的突變蛋白質(zhì)是否具有生物活性?？梢詫⒕幋aEPO/EPO突變蛋白的DNA克隆到桿狀病毒表達載體pVL1392中(購自Invitrogen，Inc.和SifmaCororation(St.Louis，MO))，用于感染昆蟲細胞?？梢允褂枚嗫寺】谷薊PO抗血清(購自R&D Systems)通過感染昆蟲細胞條件介質(zhì)的Western印跡鑒定生產(chǎn)EPO的重組桿狀病毒?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)色譜方法純化分泌的EPO突變蛋白?？梢允褂蒙虡I(yè)提供的蛋白質(zhì)分析試劑盒或ELISA分析試劑盒(購自R&D Systems和Bio-Rad Laboratories)測定蛋白質(zhì)濃度。
可以用細胞增殖分析法使用受EPO影響的細胞系例如UT7-epo(Wen等1994)或TF1(購自ATCC)測試純化EPO和EPO突變蛋白，用來確定蛋白質(zhì)的特異性活性。細胞可以在含有多種濃度的EPO的96孔微滴平板中鋪板。測試進行三次。培養(yǎng)1-3天后，可以如GH中所述，通過3H-胸苷的插入測定細胞增殖?？梢源_定每種突變蛋白質(zhì)的實現(xiàn)半數(shù)-最大刺激的蛋白質(zhì)濃度(EC50)。每種突變蛋白質(zhì)至少應(yīng)該在每個數(shù)據(jù)點設(shè)定三個孔進行三次實驗。EC50值可以用來比較突變蛋白質(zhì)的相對活力?；蛘?，可以利用MTT染料排除分析法分析受EPO突變蛋白影響的細胞增殖(Komatsu等1991)。優(yōu)選顯示與野生型EPO類似的或更好的最佳刺激水平和EC50值的蛋白質(zhì)。
上述研究明確了EPO中能夠改變成為半胱氨酸殘基同時保留生物活性的氨基酸殘基的定位。可以用如前述用于GH突變蛋白的半胱氨酸反應(yīng)性8kDa PEG-馬來酰亞胺對保留活性的突變蛋白質(zhì)進行PEG衍生化。應(yīng)該使用野生型PEG作為對照，因為它不應(yīng)該在同樣的部分還原條件下與半胱氨酸反應(yīng)性PEG反應(yīng)。能夠得到大量單-PEG衍生產(chǎn)物而不是雙-PEG衍生蛋白質(zhì)的最小量PEG應(yīng)該優(yōu)先考慮?？梢杂贸叽缗抛杌螂x子交換色譜將單-PEG衍生蛋白質(zhì)從沒有被PEG衍生的蛋白質(zhì)和沒有反應(yīng)的PEG中分離出來。應(yīng)當(dāng)在上述的細胞增殖實驗中測試經(jīng)純化的PEG衍生蛋白質(zhì)以確定它們的生物活性。
選擇保留體外生物活性的一種或多種PEG衍生蛋白質(zhì)用于在動物疾病模型中測試。可以如GH中所述，確定蛋白質(zhì)衍生化的適當(dāng)氨基酸。
對利用昆蟲細胞表達的PEG衍生化EPO突變蛋白質(zhì)的體內(nèi)測試可能需要對它們進行再次基因工程操作，以便在哺乳動物中表達，從而確保適當(dāng)?shù)奶腔?。利用昆蟲細胞生產(chǎn)的PEG-EPO供選擇物可以在下述動物模型中測試，以便確定是否它們具有體內(nèi)活性和是否它們與利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)的PEG-EPO具有相同的活性。為了在哺乳動物細胞中表達，可以將EPO突變蛋白亞克隆到商業(yè)提供的真核細胞表達載體中，然后穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(由ATCC提供)。可以利用ELISA分析法篩選表達EPO的亞細胞系?？梢灾苽渥銐蛄康睦ハx細胞生產(chǎn)的EPO突變蛋白和哺乳動物細胞生產(chǎn)的EPO突變蛋白，用來比較它們在動物缺氧模型中的生物活性。
可以利用人工紅細胞增多癥或饑餓的嚙齒動物模型實驗EPO突變蛋白的體內(nèi)生物活性(Cotes和Bangham，1961；Goldwasser和Gross.，1975)。在饑餓的嚙齒動物模型中，在第一天對大鼠斷食，在第二天和第三天用實驗樣品處理大鼠。在第四天，給大鼠注射放射性鐵-59。約18小時后，麻醉大鼠，取血樣。然后測定標(biāo)記鐵轉(zhuǎn)化到紅細胞中的轉(zhuǎn)化百分率。在人工紅細胞增多癥模型中，將小鼠關(guān)在密封罐中，使它連續(xù)幾天接觸低比重大氣。然后將動物帶到正常氣壓下。紅細胞的形成連續(xù)幾天受到抑制。返回到正常氣壓后的第四天或第六天，給小數(shù)注射紅細胞生成素或生理鹽水。每天給小鼠注射一次，連續(xù)一到兩天。一天后給動物靜脈注射標(biāo)記的鐵-59。令小鼠情緒平穩(wěn)后20小時，測定標(biāo)記鐵插入紅細胞的量。在兩個模型中可以考察不同的劑量組和不同的注射時間，以確定是否PEG-EPO具有生物活性和/或更有效，并產(chǎn)生比天然EPO更長的作用效果。
實施例3α干擾素可以通過真核細胞制備α干擾素，它具有抗病毒、抗腫瘤核免疫調(diào)節(jié)作用。存在至少20個不同的編碼具有70％或更多相同氨基酸的蛋白質(zhì)的α干擾素基因。Blatt等(1996)中公開了已知的α干擾素種類的氨基酸序列。曾描述過一種將最普遍的氨基酸整合到單一多肽鏈中的“共有”干擾素(Blatt等1996)。可以通過將α干擾素蛋白質(zhì)的不同部分連接成為一個蛋白質(zhì)制備雜交α干擾素蛋白質(zhì)(Horisberger和Di Marco，1995)。某些α干擾素在螺旋A的近側(cè)區(qū)和B-C環(huán)附近含有N-連接的糖基化位點(Blatt等1966)。α2干擾素蛋白質(zhì)(SEQ ID NO3)含有四個半胱氨酸殘基，它們構(gòu)成兩個二硫鍵。半胱氨酸1-半胱氨酸98的二硫鍵(某些α干擾素中為半胱氨酸1-半胱氨酸99，例如α1干擾素SEQ ID NO4)不是活性必需的。α2干擾素蛋白質(zhì)不含有任何N-連接的糖基化位點。已經(jīng)確定了α干擾素的晶體結(jié)構(gòu)(Radhakrishnan等1996)。
該實施例提供了在螺旋A的近側(cè)區(qū)、螺旋E的遠側(cè)區(qū)、在A-B環(huán)中、在B-C環(huán)中、在C-D環(huán)中和D-E環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。在α干擾素-2的這些區(qū)域引入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點為D2、L3、P4、Q5、T6、S8、Q20、R22、K23、S25、F27、S28、K31、D32、R33、D35、G37、F38、Q40、E41、E42、F43、G44、N45、Q46、F47、Q48、K49、A50、N65、S68，T69，K70，D71，S72，S73，A74，A75，D77，E78，T79，Y89，Q90，Q91，N93，D94，E96，A97，Q101，G102，G104，T106，E107，T108，P109，K112，E113，D114，S115，K131，E132，K133，K134，Y135，S136，A139，S152，S154，T155，N156，L157，Q158，E159，S160，L161，R162，S163，K164，E165。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸之前即C1之前，或者成熟蛋白質(zhì)的最后一個氨基酸之后，即E165之后的變異體。還提供了半胱氨酸-1或半胱氨酸-98(在某些α干擾素中為半胱氨酸-99)被其它氨基酸取代，優(yōu)選被絲氨酸或丙氨酸取代的其它變異體。還提供了半胱氨酸-1被刪除(半胱氨酸-1缺陷型)的其他變異體。半胱氨酸變異體可以包括任何自然發(fā)生的或非天然的α干擾素序列，例如共有干擾素或干擾素蛋白質(zhì)雜交體。某些自然發(fā)生的α干擾素(例如α干擾素-1)含有一個自然形成的“游離”半胱氨酸。在該干擾素中，自然發(fā)生的游離半胱氨酸可以改變成為其它氨基酸，優(yōu)選改變成為絲氨酸或丙氨酸。
該實施例還提供了包括共有干擾素在內(nèi)的其它α干擾素的半胱氨酸變異體，半胱氨酸突變發(fā)生在這些蛋白質(zhì)的相同位點。Blatt等(1966)報道了α干擾素-2與其它已知α干擾素和共有干擾素的并列比較。Rhadhakrishnan等(1996)確定了α干擾素-2的晶體結(jié)構(gòu)。Lydon等(1985)發(fā)現(xiàn)α干擾素N-末端前四個氨基酸的缺失不會影響生物活性。Valenzuela等(1985)發(fā)現(xiàn)α干擾素-2中用半胱氨酸、酪氨酸或絲氨酸取代苯丙氨酸-47，不會該百年該蛋白質(zhì)的生物活性。半胱氨酸-1和半胱氨酸-98分別單獨改變?yōu)楦拾彼岷徒z氨酸，而不改變該蛋白質(zhì)的生物活性(DeChiara等1986)。
可以從人基因組DNA擴增編碼α干擾素-2的DNA序列，因為α干擾素基因不含內(nèi)含子(Pestka等，1987)。Goeddel等(1980)公開了α干擾素-2的DNA序列?；蛘?，可以從已知自然表達或接觸病毒后表達α干擾素的人淋巴母細胞的細胞系中分離α干擾素-2的cDNA(Goeddel等1980；Pickering等1980)。其它這類細胞系可以從美國典型培養(yǎng)物收藏中心(Rockvill，MD)獲得?？梢詰?yīng)用基于質(zhì)粒的定點誘變試劑盒(例如，快速改變誘變試劑盒(Quick-Change Mutagenesis Kit)，Stratagene，Inc.)，噬菌體誘變方法，或使用如GH中所述的PCR誘變將特異性突變引入α干擾素序列。
已經(jīng)成功地在E.coli中生產(chǎn)出胞間蛋白質(zhì)形式的α干擾素(Tarnowski等1986；Thatcher和Panayotatos，1986)。可以使用類似方法表達α干擾素突變蛋白?？梢詫⒕幋aα干擾素或α干擾素突變蛋白質(zhì)的質(zhì)?？寺〉紼.coli表達載體中，例如使用強效T7啟動子的pET15b(Novagene，Inc.)或使用TAC啟動子的pCYB1(New England BioLabs，Beverly，MA)?？梢酝ㄟ^將IPTG加入生長培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達。
在E.coli中表達的重組α干擾素有時可溶，有時不溶(Tarnowski等1986；Thatcher和Panayotatos，1986)。不溶性可能與蛋白質(zhì)的過表達程度有關(guān)。不溶性α干擾素蛋白質(zhì)可以以包涵體的形式提取，按照標(biāo)準氧化再折疊方案恢復(fù)其完全活性的構(gòu)型(Thatcher和Panayotatos，1986；Cox等1994)?？梢杂闷渌V方法例如離子交換、疏水作用、尺寸排阻和反相樹脂進一步純化α干擾素蛋白質(zhì)(Thatcher和Panayotatos，1986)。可以利用商業(yè)提供的蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad Laboratories)。
如果α干擾素突變蛋白不能成功地在E.coli中表達，可以如用于GH所述在昆蟲細胞中以分泌蛋白的形式表達該蛋白質(zhì)?？梢詫υ摰鞍踪|(zhì)進行修飾使其含有天然α干擾素的信號序列(Goeddell等1980)或者蜜蜂蜂毒肽(mellitin)信號蛋白序列(Invitrogen，Inc.)，以促進蛋白質(zhì)的分泌?？梢詰?yīng)用常規(guī)色譜程序從條件培養(yǎng)基中純化α干擾素和α干擾素突變蛋白?？梢詫ⅵ粮蓴_素抗體與Western印跡結(jié)合，以定位色譜過程中含有α干擾素蛋白的組分?；蛘撸梢杂肊LISA鑒定含α干擾素蛋白的組分。
可以應(yīng)用體外病毒噬斑減少分析法測定α干擾素和α干擾素突變蛋白的生物活性(Ozes等1992；Lewis，1995)?？梢詫⑷薍eLa細胞在96孔平板上鋪板，在37℃生長到接近鋪滿。然后沖洗細胞，并用不同濃度的各種α干擾素制品處理24小時。應(yīng)該包括沒有α干擾素的對照和野生型α干擾素(購自Endogen，Inc.，Woburn，MA)。在平板中加入一種病毒，例如水泡性口膜炎病毒(VSV)和腦心肌炎病毒(EMCV)，將平板在37℃進一步培養(yǎng)24-48小時。還應(yīng)該包括沒有病毒的樣品作為對照。當(dāng)病毒處理后的、無α干擾素的對照孔中有90％或更多的細胞被殺死時(通過觀察孔中的病毒決定)，用結(jié)晶紫對細胞單層染色，用微平板讀數(shù)儀記錄各孔的吸收度。或者，用染料MTT對細胞單層染色(Lewis，1995)。應(yīng)該對樣品分析兩到三次?？梢杂肊C50值(50％抑制病毒的致細胞病變作用所需的蛋白質(zhì)的量)比較蛋白質(zhì)的相對潛能。野生型α干擾素保護細胞免受VSV和EMCV的致細胞病變作用，在該分析中其特異性活性約為2X108單位/mg(Ozes等1992)。顯示EC50值與野生型α干擾素相當(dāng)?shù)摩粮蓴_素突變蛋白是優(yōu)選的。
可以應(yīng)用類似于GH中所述的方法對保留活性的α干擾素突變蛋白進行PEG衍生。野生型α干擾素-2可以作為對照，因為在類似條件下它不會被PEG衍生化。得到大量單-PEG衍生蛋白質(zhì)而不是雙-PEG衍生產(chǎn)物的最小量PEG應(yīng)該優(yōu)先考慮?？梢酝ㄟ^尺寸排阻或離子交換色譜將單-PEG衍生蛋白質(zhì)從無-PEG衍生的蛋白質(zhì)和未反應(yīng)的PEG中純化出來?？梢岳蒙鲜霾《臼砂邷p少的生物測定實驗PEG衍生蛋白質(zhì)，以便確定它們的生物活性。優(yōu)選生物活性與野生型α干擾素相當(dāng)?shù)腜EG衍生化α干擾素蛋白?？梢詫EG衍生化蛋白應(yīng)用如用于GH時所述的PEG結(jié)合位點的酶譜分析和藥動學(xué)數(shù)據(jù)的測定。
可以應(yīng)用裸鼠的腫瘤異種移植模型和病毒感染模型測試PEG-α干擾素突變蛋白的體內(nèi)生物活性(Balkwill，1986；Fish等1986)。因為PEG-α干擾素的生物活性可能是種間特異的，因此在體外病毒噬斑減少分析中應(yīng)該使用類似于前面所述的適當(dāng)?shù)膭游锛毎祦泶_定PEG衍生蛋白質(zhì)的活性。接著，應(yīng)該考察不同劑量給藥和不同注射時間的影響，以便確定如何使PEG-α干擾素更有效，并因此制備比無PEG衍生的α干擾素作用時間更長的PEG-α干擾素。
可以設(shè)計新α干擾素來源0的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例4β干擾素β干擾素由成纖維細胞制備，它表現(xiàn)抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。單拷貝β干擾素基因編碼一種前蛋白質(zhì)，它經(jīng)分裂產(chǎn)生一種166個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)(Taniguchi等1980；SEQ ID NO5)。該蛋白00質(zhì)含有三個半胱氨酸，其中半胱氨酸-17是“游離的”，即它不參與形成二硫鍵。該蛋白質(zhì)含有一個N-連接的糖基化位點。還未確定該蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)(Karpusas等1997)。
本實施例提供了在任意三個含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體(即N80C、E81C、或T82C)。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)、螺旋E的遠側(cè)、A-B環(huán)中、B-C環(huán)中、C-D環(huán)中和D-E環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。在這些區(qū)域中引入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點是M1、S2、Y3、N4、L5、Q23、N25、G26、R27、E29、Y30、K33、D34、R35、N37、D39、E42、E43、K45、Q46、L47、Q48、Q49、Q51、K52、E53、A68、F70、R71、Q72、D73、S74、S75、S76、T77、G78、E107、K108、E109、D110、F111、T112、R113、G114、K115、L116、A135、K136、E137、K138、S139、I157、N158、R159、L160、T161、G162、Y163、L164、R165和N166。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)第一個氨基酸近側(cè)，即M1之前，或者成熟蛋白質(zhì)最后一個氨基酸遠側(cè)，即N166遠側(cè)的變異體。
在天然蛋白質(zhì)序列或自然發(fā)生的“游離”半胱氨酸殘基(半胱氨酸-17)改變?yōu)槠渌被?，?yōu)選改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上制備這些變異體。
可以設(shè)計新的來源于β干擾素的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例5粒細胞集落刺激因子(G-CSF)G-CSF是一種多能性細胞因子，它促進粒細胞增殖、分化和發(fā)揮作用。該蛋白質(zhì)由激活的單核細胞和巨噬細胞制備。Souza等(1986)，Nagata等(1986a，b)和美國專利4810643報道了G-CSF的氨基酸序列(SEQ ID NO6)，它們作為參考插入本文。合成的人蛋白質(zhì)為204或207個氨基酸的前蛋白質(zhì)，它經(jīng)分裂形成174或177個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。較大構(gòu)型比較小構(gòu)型的蛋白質(zhì)特異性低。該蛋白質(zhì)含有五個半胱氨酸，其中四個參與形成二硫鍵。半胱氨酸-17不形成二硫鍵。用絲氨酸取代半胱氨酸-17產(chǎn)生具備全部活性的突變G-CSF蛋白(美國專利4810643)。該蛋白質(zhì)在成熟蛋白質(zhì)的蘇氨酸-133位有O-糖基化。
本實施例提供了一種在蘇氨酸-133位引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A近側(cè)、螺旋D遠側(cè)、A-B環(huán)中、B-C環(huán)中和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的其它變異體。在這些區(qū)域引入半胱氨酸取代的優(yōu)選位點是T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，T38，K40，S53，G55，W58，A59，P60，S62，S63，P65，S66，Q67，A68，Q70，A72，Q90，A91，E93，G94，S96，E98，G100，G125，M126，A127，A129，Q131，T133，Q134，G135，A136，A139，A141，S142，A143，Q145，Q173和P174。本實施例還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)第一個氨基酸近側(cè)即T1之前，或成熟蛋白質(zhì)最后一個氨基酸遠側(cè)即P174之后的變異體。還提供了在天然蛋白質(zhì)序列或自然發(fā)生的“游離”半胱氨酸殘基(半胱氨酸-17)改變?yōu)槠渌被幔瑑?yōu)選改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的上述變異體。
可以從R&D Systems(Minneapolis，MN)購買編碼人G-CSF的cDNA或應(yīng)用從人腫瘤細胞系(例如已知固有地表達G-CSF的5637和U87-MG)分離出的mRNA進行PCR擴增編碼人G-CSF的cDNA(Park等1989；Negata，1994)。上述細胞系由美國典型培養(yǎng)物收藏中心(Rockville，MD)提供?？梢岳没谫|(zhì)粒的定點誘變試劑盒(例如，快速改變誘變試劑盒，Stratagene，Inc.)，噬菌體誘變法、或應(yīng)用如用于GH時描述的PCR誘變將特定突變引入G-CSF序列。
已經(jīng)成功地在E.coli中制備出胞間蛋白質(zhì)形式的G-CSF(Souza等1986)。可以使用類似方法表達G-CSF和G-CSF突變蛋白。可以將編碼G-CSF或G-CSF突變蛋白的質(zhì)?？寺〉紼.coli表達載體中，例如使用強效啟動子T7的pET15b(由Novagen，Inc.，Madison，WI提供)或使用強效啟動子TAC的pCYB1(由New England BioLabs，Beverly，MA提供)。可以將IPTG加入生長培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。在E.coli中表達的G-CSF是不溶的，可以以包涵體的形式提取?？梢园凑諛?biāo)準氧化再折疊方案恢復(fù)蛋白質(zhì)的完全活性構(gòu)型(Souza等1986；Lu等1992；Cox等1994)?？梢允褂妙愃品椒ㄔ僬郫B半胱氨酸突變蛋白質(zhì)?？梢杂闷渌V法例如離子交換、疏水作用、尺寸排阻和反相樹脂進一步純化蛋白質(zhì)(Souza等1986；Kuga等1989；Lu等1992)?？梢允褂蒙虡I(yè)提供的蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad Laboratories)測定蛋白質(zhì)濃度。
如果G-CSF或G-CSF突變蛋白不能在E.coli中表達，可以如用于GH時所述將G-CSF或G-CSF突變蛋白以分泌蛋白的形式表達到昆蟲細胞中?？梢孕揎椀鞍踪|(zhì)使其含有天然G-CSF的信號序列(Souza等1986；Nagata等1986a；Nagata等，1986b)或者蜜蜂mellitin信號序列(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)，用來促進蛋白質(zhì)的分泌?？梢允箚压δ艹Ｒ?guī)色譜程序從條件介質(zhì)中純化G-CSF和G-CSF突變蛋白?？梢詫-CSF抗體與Western印跡結(jié)合，以確定色譜中含有G-CSF蛋白質(zhì)的組分?；蛘撸肊LISA鑒定含G-CSF蛋白質(zhì)的組分。
還可以如用于紅細胞生成素的實施例2所述在哺乳動物細胞G-CSF突變蛋白。
可以使用體外細胞增殖分析法測定G-CSF和G-CSF突變蛋白的生物活性。可以用鼠NFS-60細胞系和人AML-193細胞系測定G-CSF的生物活性(Tsuchiya等1986；Lange等1987；Shirafuji等1989)。這兩種細胞系的增殖都受人G-CSF的影響。優(yōu)選AML-193細胞系，因為它來源與人，因此消除了由于種間差異導(dǎo)致的假結(jié)果的可能性。G-CSF影響NFS60細胞系增殖的半數(shù)最大有效濃度(EC50)為10-20微微摩爾。在細胞增殖分析中可以使用這些細胞系用公開的方法(Tsuchiya等1986；Lange等1987；Shiraguji等1989)測試G-CSF突變蛋白，以確定蛋白質(zhì)的特異活性?？梢詫⒓毎诩佑胁煌瑵舛菺-CSF或G-CSF突變蛋白的96孔組織培養(yǎng)皿上鋪板。在潮濕的組織培養(yǎng)保溫箱中于37℃培養(yǎng)1-3天后，如用于GH時所述通過3H-胸苷的插入測定細胞增殖。每種突變蛋白質(zhì)應(yīng)該在各數(shù)據(jù)點設(shè)置三個孔，至少分析三次?？梢杂肊C50值比較突變蛋白質(zhì)的相對潛能。與野生型G-CSF表現(xiàn)類似最佳刺激水平和EC50值的G-CSF突變蛋白是優(yōu)選的。
可以利用類似用于GH時所述的方法對G-CSF突變蛋白進行PEG衍生化。野生型G-CSF和絲氨酸-17G-CSF可以用作對照，因為在同樣條件下它不應(yīng)該被PEG衍生化。認為得到大量單-PEG衍生化產(chǎn)物而不是雙-PEG衍生化產(chǎn)物的最小量PGE是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^尺寸排阻色譜或離子交換色譜將單-PEG衍生蛋白質(zhì)從未被PEG衍生的蛋白質(zhì)和未反應(yīng)的PEG中純化出來。可以如上述用細胞增殖分析法測試純化的PEG衍生蛋白質(zhì)，以確定它們的特異活性。
可以利用類似用于GH所述的方法酶譜分析蛋白質(zhì)的PEG位點。可以利用用于GH的類似方法獲取PEG衍生蛋白質(zhì)的藥動學(xué)數(shù)據(jù)。
可以用正常的Sprague-Dawley大鼠(購自Charles River)進行論證PEG-G-CSF體內(nèi)效能的初步研究。給各組大鼠單次皮下或靜脈注射多種劑量的G-CSF、PEG-G-CSF或安慰劑。每日處死部分動物，直到一周，用來測定外周血中的嗜中性粒細胞和總白細胞數(shù)。可以測定其它類型的血細胞(血小板和紅細胞)，以證實細胞特異性。
可以用大鼠嗜中性白細胞減少癥模型測試PEG-G-CSF的效能?？梢酝ㄟ^環(huán)磷酰胺處理誘導(dǎo)嗜中性白細胞減少癥，環(huán)磷酰胺是普遍使用的髓性抑制的化療藥。G-CSF促進環(huán)磷酰胺處理動物體內(nèi)正常嗜中性粒細胞水平的恢復(fù)(Kubota等1990)。在0天給大鼠注射環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)嗜中性白細胞減少癥。然后將動物分成不同的組，分別給各組皮下注射G-CSF，PEG-G-CSF或安慰劑。每日測定外周血中的嗜中性粒細胞和總白細胞數(shù)，直到上述值返回正常水平。首先，應(yīng)該確定每日注射G-CSF促進嗜中性粒細胞的恢復(fù)。接著，應(yīng)該考察不同劑量給藥和不同注射時間的影響，以確定是否PEG-G-CSF更有效，并制備比無PEG衍生的G-CSF作用時間更長的PEG-G-CSF。
可以設(shè)計新的G-CSF來源的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例6血小板生成素(TPO)血小板生成素刺激血小板巨核細胞前體的形成。Bartley等(1994)，F(xiàn)oster等(1994)，de Sauvage等(1994)公開了TPO的氨基酸序列(SEQ IDNO7)，它們作為參考插入本文。
合成的蛋白質(zhì)為含353個氨基酸的前體蛋白質(zhì)，它經(jīng)分裂形成332個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。N-末端的154個氨基酸與EPO和其它GH超基因家族的成員具有同源性。C-末端的199個氨基酸不與任何其它已知蛋白享有同源性。C-末端區(qū)含有六個N-連接的糖基化位點和多個O-連接的糖基化位點(Hoffman等1996)。還在螺旋A的近側(cè)、A-B環(huán)中、和螺旋C的C-末端發(fā)現(xiàn)O-連接的糖基化位點(Hoffman等1996)。一種僅含成熟蛋白質(zhì)殘基1-195的截短的TPO蛋白具有全部體外活性(Bartley等1994)。
本實施例提供了將任何含有N-連接的糖基化位點和O-連接的糖基化位點的氨基酸改變成半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A近側(cè)、螺旋D遠側(cè)、A-B環(huán)中、B-C環(huán)中和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。
引入半胱氨酸殘基的優(yōu)選位點是S1，P2，A3，P4，P5，A6，T37，A43，D45，S47，G49，E50，K52，T53，Q54，E56，E57，T58，A76，A77，R78，G79，Q80，G82，T84，S87，S88，G109，T110，Q111，P113，P114，Q115，G116，R117，T118，T119，A120，H121，K122，G146，G147，S148，T149，A155，T158，T159，A160，S163，T165，S166，T170，N176，R177，T178，S179，G180，E183，T184，N185，F(xiàn)186，T187，A188，S189，A190，T192，T193，G194，S195，N213，Q214，T215，S216，S218，N234，G235，T236，S244，T247，S254，S255，T257，S258，T260，S262，S272，S274，T276，T280，T291，T294，S307，T310，T312，T314，S315，N319，T320，S321，T323，S325，Q326，N327，L328，S329，Q330，E331和G332。本發(fā)明提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)第一個氨基酸近側(cè)即S1之前，或引入成熟蛋白質(zhì)最后一個氨基酸遠側(cè)即G332之后的變異體。提供了在天然人蛋白質(zhì)或從天然蛋白質(zhì)第147位氨基酸到C-末端(即G332)被截掉的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的引入半胱氨酸的變異體。提供了從氨基酸147到332被截掉的TPO蛋白的最后一個氨基酸遠側(cè)加上半胱氨酸殘基的變異體。
可以設(shè)計新的TPO來源的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例7粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)GM-CSF刺激各種造血細胞的增殖和分化，所述造血細胞包括嗜中性粒細胞，單核細胞，嗜曙紅細胞，類紅細胞，和巨核細胞等細胞族。Cantrell等(1985)和Lee等(1985)報道了人GM-CSF的氨基酸序列(SEQ ID NO8)，它們作為參考插入本文。
制備的GM-CSF位144個氨基酸的前蛋白，它經(jīng)裂解形成127個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。該成熟蛋白質(zhì)具有兩個N-連接的糖基化位點。其中一個定位在螺旋A的C-末端；另一個定位在A-B環(huán)上。
本實施例提供在所有含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體，即N27C，L28C，S29C，N37C，E38C和T39C。本實施例還提供了在螺旋A近側(cè)，螺旋D遠側(cè)，A-B環(huán)中，B-C環(huán)中，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。在這些區(qū)域引入半胱氨酸取代的優(yōu)選位點是A1，P2，A3，R4，S5，P6，S7，P8，S9，T10，Q11，R30，D31，T32，A33，A34，E35，E41，S44，E45，D48，Q50，E51，Y53，Q64，G65，R67，G68，S69，L70，T71，K72，K74，G75，T91，E93，T94，S95，A97，T98，T102，I117，D120，E123，V125，Q126和E127。提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)第一個氨基酸近側(cè)即A1近側(cè)，或者引入成熟蛋白質(zhì)最后一個氨基酸遠側(cè)即E127遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于GM-CSF的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例8IL-2IL-2是由活化的T細胞合成的T細胞生長因子。該蛋白質(zhì)促進活化T細胞的克隆發(fā)展。合成的人IL-2是153個氨基酸的前體，它經(jīng)分裂形成133個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)(Tadatsugu等1983；Devos等1983；SEQ ID NO9)。
Tadatsugu等(1983)和Devos等(1983)闡述了IL-2的氨基酸序列。成熟蛋白質(zhì)含有三個半胱氨酸殘基，其中兩個形成二硫鍵。成熟蛋白質(zhì)的半胱氨酸-125不參與二硫鍵。用絲氨酸取代半胱氨酸-125產(chǎn)生完全生物活性的IL-2突變蛋白(Wang等，1984)。該蛋白質(zhì)在成熟蛋白質(zhì)鏈的蘇氨酸-3含有O-連接的糖基化。
本實施例提供了在螺旋D的最后四個位置，螺旋D的遠側(cè)區(qū)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。提供了在天然蛋白質(zhì)序列或自然發(fā)生的“游離”半胱氨酸殘基(半胱氨酸-125)改變?yōu)槠渌被?，?yōu)選改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的上述變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)即A1之前，或最后一個氨基酸遠側(cè)即T133之后的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-2的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例9IL-3IL-2是由活化的T細胞合成的，刺激多能造血干細胞增殖和分化。Yang等(1986)；Dorssers等(1987)和Otsuka等(1988)報道了人IL-3的氨基酸序列(SEQ ID NO10)，它們作為參考插入本文。該蛋白質(zhì)含有兩個半胱氨酸殘基和兩個N-連接的糖基化位點。曾報道過兩個等位基因，產(chǎn)生第8位氨基酸位置為絲氨酸或脯氨酸的異構(gòu)體或者成熟蛋白質(zhì)。
本實施例提供了在任何含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-3的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例10IL-4
IL-4是促進單核細胞、T細胞和B細胞增殖和分化的多效性細胞因子。IL-4參與B細胞分泌IgE的過程，據(jù)信IgE在哮喘和遺傳過敏癥中發(fā)揮作用。IL-4的生物活性是種間特異性的。合成的IL-4是153個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)分裂形成129個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。Yokota等(1986)報道了人IL-4的氨基酸序列(SEQ ID NO11)，它作為參考插入本文。該蛋白質(zhì)含有六個半胱氨酸殘基和兩個N--連接的糖基化位點。糖基化位點定位在A-B環(huán)和C-D環(huán)。
本實施例提供了在任何含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)即H1之前或最后一個氨基酸遠側(cè)即S129之后的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-4的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例11IL-5IL-5是嗜酸性粒細胞的分化和激活因子。Yokota等(1987)報道了人IL-5的氨基酸序列(SEQ ID NO12)，它作為參考插入本文。該成熟蛋白質(zhì)含有115個氨基酸，它以溶解狀態(tài)、二硫鍵連接的均二聚體的形式存在。該蛋白質(zhì)含有O-連接和N-連接的糖基化位點。
本實施例提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-5的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例12IL-6
IL-6促進許多細胞類型的增殖和分化。Hirano等(1986)報道了人IL-6的氨基酸序列(SEQ ID NO13)，它作為參考插入本文。合成的IL-6是212個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)分裂形成184個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。成熟蛋白質(zhì)在T137，T138，T142或T143含有兩個N-連接的糖基化位點和一個O-連接的糖基化位點。
本實施例提供了在任何含有N-連接的糖基化位點和O-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-6的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例13IL-7IL-7促進不成熟B細胞增殖，并作用于成熟T細胞。Goodwin等(1989)報道了IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO14)，它作為參考插入本文。合成的該蛋白質(zhì)是177個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)分裂形成152個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)，它含有三個N-連接的糖基化位點。
本實施例提供了在任何含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-4的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
實施例14IL-9IL-9是作用于多種類淋巴細胞的多效性細胞因子。IL-9促進活化T細胞和細胞毒性T淋巴細胞增殖，促進肥大細胞前體的增殖，于紅細胞生成素協(xié)同激活免疫紅細胞前體。Yang等(1989)報道了人IL-9的氨基酸序列(SEQID NO15)，它作為參考插入本文。合成的IL-9是含有144個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)分裂形成126個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)含有四個潛在的N-連接的糖基化位點。
本實施例提供了在任何含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-9的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例15IL-10Vieira等(1991)報道了人IL-10的氨基酸序列(SEQ ID NO16)，它作為參考插入本文。合成的IL-10是含有178個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)分裂形成160個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。IL-10的功能在于激活或抑制免疫系統(tǒng)。該蛋白質(zhì)與干擾素具有結(jié)構(gòu)同源性，即它含有五個兩親螺旋。該蛋白質(zhì)含有一個N-連接的糖基化位點。
本實施例提供了在任何含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-10的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例16IL-11IL-11是激活造血作用、淋巴細胞增殖作用和急性相反應(yīng)的多效細胞因子。IL-11與IL-6的生物活性部分相同。Kawashima等(1991)和Paul等(1990)報道了人IL-11的氨基酸序列(SEQ ID NO17)，二者作為參考插入本文。合成的IL-11是含有199個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)分裂形成178個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)不含N-連接的糖基化位點。
本實施例提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-11的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例17IL-12 p35IL-12促進NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞增殖和分化。IL-12為p35亞基和p40亞基形成的雜二聚體。p35亞基是GH超基因家族的成員。Gubler等(1991)和Wolf等(1991)報道了p35亞基的氨基酸序列(SEQ ID NO18)，二者作為參考插入本文。合成的p35亞基是含有197個氨基酸的前體蛋白，經(jīng)分裂形成175個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)含有7個半胱氨酸殘基和三個潛在的N-連接的糖基化位點。
本實施例提供了在任意三個含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。提供了在天然蛋白質(zhì)序列或自然發(fā)生的“游離”半胱氨酸殘基改變?yōu)槠渌被?，?yōu)選改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的上述變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-12 p35的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例18IL-13
IL-13與IL-4的生物學(xué)性質(zhì)部分相同。McKenzie等(1993)和Minty等(1993)報道了人IL-13的氨基酸序列(SEQ ID NO19)，二者作為參考插入本文。合成的該蛋白質(zhì)是含有132個氨基酸的前體蛋白，經(jīng)分裂形成112個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。成熟蛋白質(zhì)含有五個半胱氨酸殘基和多個N-連接的糖基化位點。McKenzie等(1993)描述了由于mRNA的交替剪接刪除了78位谷氨酰胺的變異體。
本實施例提供了在任意三個含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，螺旋D的遠側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，和C-D環(huán)中引入半胱氨酸的變異體。提供了在天然蛋白質(zhì)序列或預(yù)先存在的“游離”半胱氨酸殘基改變?yōu)槠渌被?，?yōu)選改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的上述變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-14的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
實施例19IL-15IL-15促進T細胞，NK細胞，LAK細胞和腫瘤滲透淋巴細胞(TumorInfiltrating Lymphocyte)增殖和分化。IL-15可以用于治療癌癥和病毒感染。Anderson等(1995)報道了IL-15的氨基酸序列(SEQ ID NO20)，它作為參考插入本文。IL-15含有兩個N-連接的糖基化位點，它們定位在C-D環(huán)中和D螺旋的C-末端。IL-15編碼162個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)裂解形成114個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。
本實施例提供了在任意三個在C-D環(huán)中或D螺旋的C-末端含有N-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。本實施例還提供了在螺旋A的近側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)或螺旋D的遠側(cè)引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于IL-15的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例20巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)M-CSF調(diào)節(jié)單核細胞生長，分化和發(fā)揮作用。該蛋白質(zhì)是二硫鍵連接的均二聚體。曾報道由于mRNA的剪接不同導(dǎo)致多種分子量的M-CSF。Kawasaki等(1985)，Wong等(1987)和Cerretti等(1988)報道了人M-CSF及其多種加工形式的氨基酸序列，它們作為參考插入本文?？梢宰裱搼?yīng)用的一般教導(dǎo)并按照本文描述的實施例制備引入半胱氨酸的變異體。
可以設(shè)計新的來源于M-CSF的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例21制瘤素M制瘤素M是影響某些細胞型生長和分化的多功能細胞因子。Malik等(1989)報道了人制瘤素M的氨基酸序列(SEQ ID NO21)，它作為參考插入本文。制瘤素M由活化的單核細胞和T淋巴細胞合成。合成的制瘤素M是含有252個氨基酸的前體蛋白，它經(jīng)連續(xù)分裂形成一個含227個氨基酸的蛋白質(zhì)，然后形成一個含196個氨基酸的蛋白質(zhì)(Linsley等1990)。成熟蛋白質(zhì)含有O-連接的糖基化位點和兩個N-連接的糖基化位點。該蛋白質(zhì)在T160，T162和S165存在O-糖基化。成熟蛋白質(zhì)含有五個半胱氨酸殘基。
本實施例提供了在三個含有N-連接的糖基化位點或O-連接的糖基化位點的氨基酸的任意一個上引入半胱氨酸的變異體。本實施例提供了在螺旋A的近側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)或螺旋D的遠側(cè)引入半胱氨酸的變異體。提供了在天然蛋白質(zhì)序列或預(yù)先存在的“游離”半胱氨酸殘基改變?yōu)槠渌被?，?yōu)選改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的上述變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于制瘤素M的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例22睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)Lam等(1991)報道了人CNTF的氨基酸序列(SEQ ID NO22)，它作為參考插入本文。CNTF是含有200個氨基酸的蛋白質(zhì)，它們不含糖基化位點或用于分泌的信號序列。該蛋白質(zhì)含有一個半胱氨酸殘基。CNTF的功能是神經(jīng)細胞的存活因子。
本實施例提供了在螺旋A的近側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)或螺旋D的遠側(cè)引入半胱氨酸的變異體。提供了在天然蛋白質(zhì)序列或預(yù)先存在的“游離”半胱氨酸殘基改變?yōu)槠渌被?，?yōu)選改變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸的變異蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的上述變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于CNTF的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
實施例23白血病抑制因子(LIF)Moreau等(1988)和Gough等(1988)報道了LIF的氨基酸序列(SEQ IDNO23)，二者作為參考插入本文。人LIF基因編碼含202個氨基酸的前體，它裂解產(chǎn)生含180個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)含有六個半胱氨酸殘基，其均參與形成二硫鍵。該蛋白質(zhì)含有多個O-連接和N-連接的糖基化位點。Robinson等(1994)確定了該蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。該蛋白質(zhì)影響許多細胞型的生長和分化。
本實施例提供了在任意三個含有N-連接的糖基化位點或O-連接的糖基化位點的氨基酸上引入半胱氨酸的變異體。還提供了在螺旋A的近側(cè)，A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)或螺旋D的遠側(cè)引入半胱氨酸的變異體。還提供了半胱氨酸殘基引入成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸近側(cè)或最后一個氨基酸遠側(cè)的變異體。
可以設(shè)計新的來源于LIF的本實施例分子，并基本上如實施例1和2中所述測試其活性，然而需要替換涉及本實施例特異蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的適當(dāng)測定法和其它考慮因素。
本文引用的所有文件均作為參考插入其中。
本文公開的蛋白質(zhì)類似物可以本領(lǐng)域公知的基本上相同的劑型和劑量用于具有天然蛋白質(zhì)的已知治療用途中。
雖然本文具體地描述了本發(fā)明的作為例子的優(yōu)選實施方式，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠認識到除了這些具體描述之外的改變，修改，添加和應(yīng)用，并可以不偏離本發(fā)明的本質(zhì)修改優(yōu)選實施例和方法。
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Leu Gly Ile Pro Ser Asp Asn Cys50 55 60Thr Arg Pro Cys Phe Ser Glu Arg Leu Ser Gln Met Thr Asn Thr Thr65 70 75 80Met Gln Thr Arg Tyr Pro Leu Ile Phe Ser Arg Val Lys Lys Ser Val85 90 95Glu Val Leu Lys Asn Asn Lys Cys Pro Tyr Phe Ser Cys Glu Gln Pro100 105 110Cys Asn Gln Thr Thr Ala Gly Asn Ala Leu Thr Phe Leu Lys Ser Leu115 120 125Leu Glu Ile Phe Gln Lys Glu Lys Met Arg Gly Met Arg Gly Lys Ile130 135 140<210>16<211>178<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>16Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val1 5 10 15Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His20 25 30Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe35 40 45Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu50 55 60Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys65 70 75 80Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro85 90 95Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu100 105 110Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg 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Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr165 170 175Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys180 185 190Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr195 200 205Ile Asp Arg Val Thr Ser Tyr Leu Asn Ala Ser210 215<210>19<211>132<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>19Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly1 5 10 15Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu20 25 30Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys35 40 45Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys50 55 60Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu65 70 75 80Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala85 90 95Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala100 105 110Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu115 120 125Gly Arg Phe Asn130<210>20<211>114<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>20Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1 5 10 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Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr65 70 75 80Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val85 90 95His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu100 105 110Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile115 120 125Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile130 135 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys145 150 155 160Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu165 170 175Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His180 185 190Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met195 200<210>23<211>181<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>23Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala Thr Cys Ala Ile Arg His1 5 10 15Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln20 25 30Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln35 40 45Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val50 55 60Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Ala Lys Leu65 70 75 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gggatccgat tagaatccac agct<210>38<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；PCR引物<400>38gggcagatct tcaagcagac ctactgcaag ttcgac<210>39<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；PCR引物<400>42CGCGG TACCG GATCC TTAGC AGAAG CCACA GCTGC CCTCCAC<210>40<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；PCR引物<400>24GTAGC GCAGG CCTTC CCAAC CATT<210>41<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；PCR引物<400>40CCCCG TCGAC TCTAG AGCCA TTAGA TACAA AGCTC TTGGG
權(quán)利要求
1.GH超基因家族成員的半胱氨酸變異體，包括一個取代選自環(huán)區(qū)氨基酸、α螺旋末端附近的氨基酸、第一個兩親螺旋近側(cè)的氨基酸、最后一個兩親螺旋遠側(cè)的氨基酸中的一個氨基酸的半胱氨酸殘基或半胱氨酸殘基加到蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端。
2.GH超基因家族成員的半胱氨酸變異體，包括引入環(huán)區(qū)中的兩個氨基酸之間、α螺旋末端區(qū)、第一個兩親螺旋近側(cè)、或最后一個兩親螺旋遠側(cè)的半胱氨酸殘基。
3.按照權(quán)利要求1的半胱氨酸變異體，其中被取代的氨基酸是N-或O-連接的糖基化位點的一部分。
4.按照權(quán)利要求2的半胱氨酸變異體，其中半胱氨酸殘基導(dǎo)入N-連接的糖基化位點中的兩個氨基酸之間或靠近N-連接或O-連接的糖基化位點中的一個氨基酸。
5.按照權(quán)利要求1-4的半胱氨酸變異體，其中GH超基因家族的成員選自生長激素、催乳素、胎盤催乳素、紅細胞生成素、血小板生成素、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12(p35亞基)、白介素-13、白介素-15、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、α干擾素、β干擾素、γ干擾素、ω干擾素、τ干擾素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、cardiotrophin-1和巨噬細胞集落刺激因子。
6.按照權(quán)利要求1的半胱氨酸變異體，其中被取代的氨基酸位于GH超基因家族干擾素/類干擾素-10樣成員的A-B環(huán)、B-C環(huán)、C-D環(huán)或D-E環(huán)中。
7.按照權(quán)利要求2的半胱氨酸變異體，其中環(huán)區(qū)是GH超基因家族干擾素/類干擾素-10樣成員的A-B環(huán)、B-C環(huán)、C-D環(huán)或D-E環(huán)。
8.按照權(quán)利要求1-7的半胱氨酸變異體，其中引入的半胱氨酸被聚乙二醇化。
9.按照權(quán)利要求1的半胱氨酸變異體，其中GH超基因家族的成員是生長激素。
10.按照權(quán)利要求9的半胱氨酸變異體，其中被取代的氨基酸選自位于A-B環(huán)的N-末端，B-C環(huán)，C-D環(huán)的氨基酸，A、B、C和D螺旋中的前三個或最后三個氨基酸，以及螺旋A近側(cè)和螺旋D遠側(cè)的氨基酸。
11.按照權(quán)利要求10的半胱氨酸變異體，其中被取代的氨基酸選自F1、T3、P5、E33、A34、K38、E39、Q40、S43、Q46、N47、P48、Q49、T50、S51、S55、T60、A98、N99、S100、G104、A105、S106、E129、D130、G131、S132、P133、T135、G136、Q137、K140、Q141、T142、S144、K145、D147、T148、N149、S150、H151、N152、D153、S184、E186、G187、S188、和G190。
12.按照權(quán)利要求1的半胱氨酸變異體，其中GH超基因家族的成員是紅細胞生成素。
13.按照權(quán)利要求12的半胱氨酸變異體，其中被取代的氨基酸選自位于A-B環(huán)，B-C環(huán)，C-D環(huán)的氨基酸，螺旋A近側(cè)和螺旋B遠側(cè)和N或C末端的氨基酸。
14.按照權(quán)利要求13的半胱氨酸變異體，其中被取代的氨基酸選自絲氨酸-126、N24、I25、T26、N38、I39、T40、N83、S84、A1、P2、P3、R4、D8、S9、T27、G28、A30、E31、H32、S34、N36、D43、T44、K45、N47、A50、K52、E55、G57、Q58、G77、Q78、A79、Q86、W88、E89、T107、R110、A111、G113、A114、Q115、K116、E117、A118、S120、P121、P122、D123、A124、A125、A127、A128、T132、K154、T157、G158、E159、A160、T163、G164、D165、R166和S85。
15.按照權(quán)利要求2的半胱氨酸變異體，其中GH超基因家族的成員是生長激素。
16.按照權(quán)利要求15的半胱氨酸變異體，其中半胱氨酸引入選自A-B環(huán)的N-末端，B-C環(huán)，C-D環(huán)的氨基酸，A、B、C和D螺旋中的前三個或最后三個氨基酸，以及螺旋A近側(cè)和螺旋B遠側(cè)的氨基酸區(qū)域。
17.按照權(quán)利要求2的半胱氨酸變異體，其中GH超基因家族的成員是紅細胞生成素。
18.按照權(quán)利要求17的半胱氨酸變異體，其中半胱氨酸引入選自A-B環(huán)的N-末端，B-C環(huán)，C-D環(huán)，A、B、C和D螺旋中的前三個或最后三個氨基酸，以及螺旋A近側(cè)和螺旋D遠側(cè)的區(qū)域。
19.按照權(quán)利要求2的半胱氨酸變異體，其中GH超基因家族的成員是α干擾素。
20.按照權(quán)利要求19的半胱氨酸變異體，其中半胱氨酸引入選自A-B環(huán)的N-末端，B-C環(huán)，C-D環(huán)，A、B、C和D螺旋中的前三個或最后三個氨基酸區(qū)域，以及螺旋A近側(cè)和螺旋D遠側(cè)區(qū)域。
21.按照權(quán)利要求2的半胱氨酸變異體，其中GH超基因家族的成員是粒細胞集落刺激因子。
22.按照權(quán)利要求21的半胱氨酸變異體，其中半胱氨酸引入選自A-B環(huán)的N-末端，B-C環(huán)，C-D環(huán)，A、B、C和D螺旋中的前三個或最后三個氨基酸區(qū)域，以及螺旋A近側(cè)和螺旋D遠側(cè)區(qū)域。
23.按照權(quán)利要求8-22的半胱氨酸變異體，其中引入的半胱氨酸被聚乙二醇化。
全文摘要
生長激素超基因家族包括超過20個結(jié)構(gòu)相關(guān)的細胞因子和生長因子。本發(fā)明提供了制備這些蛋白質(zhì)的位點特異性、生物活性結(jié)合物的一般方法。本方法涉及通過定點誘變將半胱氨酸殘基引入蛋白質(zhì)中的非必需區(qū)域或用半胱氨酸殘基取代蛋白質(zhì)中的非必需氨基酸,然后經(jīng)引入的半胱氨酸殘基將半胱氨酸反應(yīng)性聚合物或其它類型的半胱氨酸反應(yīng)性基團共價結(jié)合到蛋白質(zhì)上。本文公開了在蛋白質(zhì)中引入半胱氨酸殘基或引入半胱氨酸取代的優(yōu)選位點,以及由此制備的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物。
文檔編號C07K14/57GK1269805SQ98808995
公開日2000年10月11日 申請日期1998年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月14日
發(fā)明者喬治·N·考克斯第三 申請人:博爾德生物技術(shù)公司