專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含提供T輔助表位的蛋白或蛋白部分和一種抗原，所述抗原得自人乳頭瘤病毒并發(fā)現(xiàn)在人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的腫瘤的治療或預(yù)防中有實(shí)用性。具體地說，本發(fā)明涉及包含連接至流感嗜血菌B的蛋白D的HPV毒株16或18的E6或E7蛋白。
乳頭瘤病毒是小的裸露的DNA腫瘤病毒(7.9千堿基，雙鏈)，它是高度物種特異性的。已經(jīng)描述了超過70種各種人乳頭瘤(HPV)基因型。乳頭瘤病毒在來源物種(人、牛等)和來自相同物種的其它乳頭瘤病毒的遺傳相關(guān)性程度的基礎(chǔ)上進(jìn)行分類。HPV一般對皮膚或粘膜表面是特異性的，已經(jīng)在異常組織或腫瘤組織中檢測為稀少和常見的基礎(chǔ)上，大致分別分為“低”和“高”風(fēng)險。低風(fēng)險HPV通常引起持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的良性損害(疣或乳頭瘤)。高風(fēng)險HPV與癌癥相關(guān)。HPV病毒和人癌癥之間最強(qiáng)的正相關(guān)性在于，在HPV16和18與宮頸癌之間存在最強(qiáng)的正相關(guān)性。在宮頸癌中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10種以上的其它HPV類型，包括HPV31和HPV33，盡管其頻率較低。
在年輕的性活躍婦女中生殖器HPV感染是常見的，大多數(shù)個體或者清除感染，或者如果損害發(fā)展，這些生殖器將退化。僅一個亞群的受感染個體的損害發(fā)展至高級上皮內(nèi)瘤形成，這些瘤形成的僅一部分進(jìn)一步發(fā)展至侵入性癌。
尚未清楚地確立導(dǎo)致HPV感染的分子事件。缺乏合適的體外系統(tǒng)繁殖人乳頭瘤病毒，這已經(jīng)阻礙了關(guān)于該病毒周期最佳信息的進(jìn)展。
今天，已經(jīng)分離出不同類型的HPV，并借助細(xì)菌中的克隆系統(tǒng)和新近通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行了特征鑒定。在與充分特征鑒定的1型牛乳頭瘤病毒(BPV1)比較的基礎(chǔ)上，已經(jīng)限定了所述HPV基因組的分子結(jié)構(gòu)。
盡管確實(shí)存在微小變異，但描述的所有HPV基因組均具有至少7個早期基因E1-E7和兩個晚期基因L1和L2。另外，上游調(diào)節(jié)區(qū)帶有看來控制所述HPV基因組大多數(shù)轉(zhuǎn)錄事件的調(diào)節(jié)序列。
E1和E2基因分別參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄控制，往往由于病毒整合而被破壞。E6和E7參與病毒轉(zhuǎn)化。E5也涉及該過程。
在諸如HPV16和18的涉及宮頸癌的HPV中，致癌過程在病毒DNA整合后開始。整合導(dǎo)致編碼衣殼蛋白L1和L2的基因失活，E2阻抑物功能的喪失導(dǎo)致使連續(xù)裝配的E6/E7可讀框去調(diào)節(jié)，過量表達(dá)兩種早期蛋白E6和E7，這將導(dǎo)致正常細(xì)胞分化的逐漸喪失并發(fā)生癌。通過分別使成視網(wǎng)膜瘤基因產(chǎn)物的主要腫瘤抑制蛋白p53和pRB失活，E6和E7克服了正常的細(xì)胞周期。
宮頸癌在婦女中是常見的，通過癌前期中間期發(fā)展至通常導(dǎo)致死亡的侵入性癌。該疾病的中間期稱為宮頸上皮內(nèi)瘤形成，根據(jù)增強(qiáng)的嚴(yán)重性分為I-III級(CIN I-III)。
在臨床上，女性肛殖道HPV感染表現(xiàn)為宮頸扁頭濕疣，這是koilocytosis的標(biāo)志，主要影響宮頸扁平上皮的表面細(xì)胞和中間細(xì)胞。
koilocyte為該病毒細(xì)胞病變效應(yīng)的結(jié)果，表現(xiàn)為具有核周透明暈(clear haloe)的多核細(xì)胞。由于導(dǎo)致該損害疣狀外觀的異常角質(zhì)化，上皮變厚。
這種扁頭濕疣當(dāng)為HPV16或18血清型陽性時，是向?qū)m頸上皮內(nèi)瘤形成和原位癌(CIS)進(jìn)化的高風(fēng)險因子，這些本身被認(rèn)為是侵入性宮頸癌的前體損害。
致癌HPV感染的自然史是3個連續(xù)的時期，即(1)潛伏感染期，(2)具有完整病毒體產(chǎn)物的核內(nèi)病毒復(fù)制期，這對應(yīng)于koilocytes的出現(xiàn)。在此期，HPV產(chǎn)生其所有的蛋白，包括E2、E5、E6、E7、L1和L2。
(3)病毒整合入細(xì)胞基因組的時期，這觸發(fā)了惡性轉(zhuǎn)化的開始，對應(yīng)于CIN II和CFNIII/CIS，koilocytes進(jìn)行性消失。在此期，E2的表達(dá)向下調(diào)節(jié)，E6和E7的表達(dá)增強(qiáng)。在CIN II/III和CIN III/宮頸癌之間，病毒DNA由在基層細(xì)胞中游離變?yōu)閮H整合E6和E7基因(腫瘤細(xì)胞)。所有宮頸癌中的85％是最主要與HPV16血清型相關(guān)的扁平細(xì)胞(Squamos cell)癌。10％和5％分別為腺癌和腺扁平細(xì)胞癌，這兩種類型均主要與HPV18血清型相關(guān)。然而，存在其它的致癌HPV。
國際專利申請第WO 96/19496號公開了人乳頭瘤病毒E6和E7蛋白的變異體，特別是在E6和E7蛋白中均有缺失的E6/E7的融合蛋白。這些缺失融合蛋白被認(rèn)為具有抗原性。
本發(fā)明提供組合物，所述組合物包含連接具有T細(xì)胞表位的免疫融合伴侶的或者E6或E7或者E6/E7融合蛋白。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選形式中，所述免疫融合伴侶得自流感嗜血菌B的蛋白D。所述蛋白D衍生物最好包含該蛋白的約前1/3，特別是N末端前100-110個氨基酸。可以將蛋白D脂化(lipidate)(Lipo蛋白D)。其它免疫融合伴侶包括來自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。通常，利用N末端81個氨基酸，盡管可以使用不同的片段，只要它們包括T輔助表位。
在另一實(shí)施方案中，所述免疫融合伴侶是稱為LYTA的蛋白。最好使用該分子C末端部分。Lyta得自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，由N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶LYTA(由lytA基因編碼{Gene，43(1986)第265-272頁})合成，該酶是特異性降解肽聚糖骨架中某些鍵的自溶素。LYTA蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對膽堿或諸如DEAE的某些膽堿類似物的親和性。該特性已經(jīng)用來開發(fā)可用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。已經(jīng)描述了于氨基末端含該C-LYTA片段的雜合蛋白的純化{Biotechnology10，(1992)第795-798頁}。如本文所用的，一個優(yōu)選實(shí)施方案利用在C末端中發(fā)現(xiàn)始于178殘基的Lyta分子的重復(fù)部分。一種特別優(yōu)選的形式摻入殘基188-305。
因此，本發(fā)明在優(yōu)選實(shí)施方案中提供融合蛋白，所述融合蛋白包含蛋白D-HPV16的E6、蛋白D-HPV16的E7、蛋白D-HPV18的E7、蛋白D-HPV18的E6和蛋白D-HPV16和18的E6 E7。所述蛋白D部分最好包含蛋白D的前1/3。人們會認(rèn)識到可以利用來自其它HPV亞型的其它E6和E7蛋白。
本發(fā)明的蛋白最好在大腸桿菌中表達(dá)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)具有包含5-9個、最好6個組氨酸殘基的組氨酸尾的所述蛋白。這些在輔助純化中是有利的。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白E7可以攜帶一個突變，以減少對rb位點(diǎn)(成視網(wǎng)膜瘤基因產(chǎn)物)的結(jié)合，并因此消除任何潛在的轉(zhuǎn)化能力。HPV16 E7的優(yōu)選突變包括用甘氨酸取代Cys24或用谷胺酰胺取代谷氨酸26。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述E7蛋白含有這兩種突變。
HPV 18 E7的優(yōu)選突變包括用甘氨酸取代Cys27和/或用谷胺酰胺取代谷氨酸29。此外，優(yōu)選存在兩種突變。
也可以將單突變或雙突變引入E6的p53區(qū)，以消除任何潛在的轉(zhuǎn)化能力。
在本發(fā)明再一實(shí)施方案中，提供連接至免疫融合伴侶的HPV的E6 E7融合蛋白。優(yōu)選的免疫融合伴侶為蛋白D，更優(yōu)選為蛋白D的前1/3。
本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明蛋白的DNA。這種序列可以插入合適的表達(dá)載體中，并在合適的宿主中表達(dá)。
編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列可以用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)合成，諸如D.M.Roberts等，Biochemistry 1985，24，5090-5098描述的酶連接、化學(xué)合成、體外酶聚合或利用例如熱穩(wěn)定性聚合酶的PCR技術(shù)、或這些技術(shù)的組合。
可以采用諸如DNA聚合酶I(Klenow片段)的DNA聚合酶，在合適的緩沖液中于10-37℃，體外進(jìn)行DNA的酶聚合，所述緩沖液根據(jù)需要含有三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP，反應(yīng)體積一般為50μl或更少。采用諸如T4 DNA連接酶的DNA連接酶，于4℃至室溫的溫度下，一般在50ml或更少的體積的合適緩沖液中，進(jìn)行DMA片段的酶連接，所述緩沖液諸如0.05MTris(pH7.4)、0.01M MgCl2、0.01M二硫蘇糖醇、1mM亞精胺、1mM ATP和0.1mg/ml牛血清白蛋白?？梢圆捎弥T如以下文獻(xiàn)中描述的固相技術(shù)，通過常規(guī)磷酸三酯、亞磷酸酯或亞磷酰胺化學(xué)進(jìn)行DNA聚合物或片段的化學(xué)合成，所述文獻(xiàn)為‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-ALaboratory Manual’(H.G.Gassen和A Lang編輯)，Verlag Chemie，Weinheinm(1982)，或在其它科學(xué)出版物例如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat，和R.C.Titmas，Nucleic Acids Research，1982，10，6243；B.S.Sproat和W.Bannwarth，Tetrahedron Letters，1983，24，5771；M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters，1980，21，719；M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Joumal of the AmericanChemical Society，1981，103，3185；S.P.Adams等，Journal of theAmerican Chemical Society，1983，105，661；N.D.Sinha，J.Biernat，J.McMannus和H.Koester，Nucleic Acids Research，1984，12，4539；和H.W.D.Matthes等，EMBO Journal，1984，3，801。
可以采用諸如Maniatis等，Molecular Cloning-A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor，1982-1989中描述的常規(guī)重組技術(shù)，進(jìn)行本發(fā)明的方法。
特別是，所述方法可以包括以下步驟i)制備復(fù)制型或整合型表達(dá)載體，所述載體能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)其包含的核苷酸序列編碼該蛋白或其免疫原性衍生物的DNA聚合物；ii)用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；iii)在允許表達(dá)所述DNA聚合物的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生所述蛋白；和iv)回收所述蛋白。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”本文用來是指將外源DNA引入宿主細(xì)胞。例如采用Genetic Engineering；S.M.Kingsman和A.J.Kingsman編輯；BlackwellScientific Publications；Oxford，England，1988中描述的常規(guī)技術(shù)，用合適的質(zhì)?；虿《据d體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染，可以達(dá)到這一點(diǎn)。術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)化子”在下文應(yīng)用于所得的含有并表達(dá)目的外源基因的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的重組抗原最好在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)策略包括將E7、E6或E6/E7融合體融合至流感嗜血菌B的蛋白D的1/3-N末端部分，該部分是提供T細(xì)胞輔助表位的免疫融合伴侶。于該融合蛋白的羧基末端工程加入親和多組氨酸尾，便于簡化的純化。這種重組抗原在大腸桿菌中作為不溶性蛋白過量產(chǎn)生。
本發(fā)明的蛋白最好與反式硫氧還蛋白(TIT)共同表達(dá)。最好是反式對順式硫氧還蛋白的共同表達(dá)，以保持抗原無硫氧還蛋白，而不需要蛋白酶。硫氧還蛋白的共同表達(dá)使本發(fā)明蛋白易于溶解。硫氧還蛋白的共同表達(dá)也對在蛋白純化得率、純化蛋白的溶解性和質(zhì)量有顯著影響。
所述表達(dá)載體是新的，也構(gòu)成本發(fā)明的部分。
可以按照本發(fā)明制備所述復(fù)制型表達(dá)載體，即切割與所述宿主細(xì)胞相匹配的載體，提供具有完整復(fù)制子的線性DNA區(qū)段；并在連接條件下將所述線性區(qū)段與一種或多種DNA分子混合，所述DNA分子與所述線性區(qū)段一起編碼所需產(chǎn)物，諸如編碼本發(fā)明蛋白的DNA聚合物或其衍生物。
因此，根據(jù)需要，可以預(yù)形成或在構(gòu)建載體期間形成所述DNA聚合物。
載體的選擇將部分由宿主細(xì)胞決定，所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，但最好是大腸桿菌。合適的載體包括質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和重組病毒。
采用例如以上引用的Maniatis等描述的方法，用合適的限制性酶、所述DNA的聚合和連接，常規(guī)進(jìn)行所述復(fù)制型表達(dá)載體的制備。
按照本發(fā)明，通過在轉(zhuǎn)化條件下用本發(fā)明的復(fù)制型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，制備重組宿主細(xì)胞。合適的轉(zhuǎn)化條件是常規(guī)的轉(zhuǎn)化條件，描述于例如以上引用的Maniatis等的文獻(xiàn)或“DNA Cloning”第II卷，D.M.Glover編輯，IRL Press Ltd，1985。
根據(jù)宿主細(xì)胞，決定轉(zhuǎn)化條件的選擇。因此，諸如大腸桿菌的細(xì)菌宿主可以用CaCl2溶液(Cohen等，Proc.Nat.Acad.Sci.，1973，69，2110)或包含RbCl、MnCl2、乙酸鉀和甘油的混合物的溶液、然后用3-[N-嗎啉基]-丙磺酸、RbCl和甘油處理。培養(yǎng)中的哺乳動物細(xì)胞可以通過將載體DNA鈣共沉淀至所述細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明也擴(kuò)展至用本發(fā)明的復(fù)制型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
如按照例如以上引用的Maniatis等的文獻(xiàn)或“DNA Cloning”所述，在允許表達(dá)所述DNA聚合物的條件下常規(guī)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。因此，最好提供營養(yǎng)給細(xì)胞，并在50℃以下的溫度培養(yǎng)。
根據(jù)宿主細(xì)胞，采用常規(guī)方法回收產(chǎn)物。因此，當(dāng)宿主為諸如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞時，可以進(jìn)行物理、化學(xué)或酶裂解細(xì)胞，從所得的裂解液中分離所述蛋白產(chǎn)物。當(dāng)所述宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞時，一般可以從營養(yǎng)培養(yǎng)基或從無細(xì)胞提取物中分離所述產(chǎn)物。常規(guī)的蛋白分離技術(shù)包括選擇性沉淀、吸附層析和親和層析，包括單克隆抗體親和柱。
當(dāng)本發(fā)明的蛋白與組氨酸尾(His標(biāo)志)一起表達(dá)時，利用離子金屬親和層析柱(IMAC)柱，可以容易地通過親和層析純化所述蛋白。
在IMAC柱產(chǎn)生高度純化的蛋白之前或之后，可以利用第二個層析步驟，諸如Q-sepharose。如果所述免疫融合伴侶為C-LYTA，則可能利用CLYTA對膽堿和/或DEAE的親和性來純化該產(chǎn)物。在包括差別親和層析的兩步驟方法中，可以容易并有效地純化含C-LYTA和his標(biāo)志的產(chǎn)物。一個步驟涉及His標(biāo)志對IMAC柱的親和性，另一步驟涉及LYTA的C末端結(jié)構(gòu)域?qū)δ憠A或DEAE的親和性。
包含C-LYTA和組氨酸標(biāo)志的蛋白是新蛋白，因此構(gòu)成本發(fā)明的一個方面。采用簡單的兩步驟差別親和方法，可以將這些蛋白純化至高水平(高于80％，最好高于90％)。
提供的本發(fā)明蛋白的純度最好通過SDS PAGE顯示至少為80％，更優(yōu)選90％。當(dāng)通過SDS PAGE在還原條件下分析時，該蛋白為一條主要的單條帶，而蛋白質(zhì)印跡分析顯示低于5％的宿主細(xì)胞蛋白污染。
本發(fā)明也提供在藥學(xué)上可接受的賦形劑中包含本發(fā)明蛋白的藥用組合物。優(yōu)選的疫苗組合物包含至少蛋白D-HPV16的E6或其衍生物與蛋白D-PHV16的R7?；蛘撸鯡6和E7可以以單分子存在，最好為蛋白DE6/E7融合蛋白。這種疫苗可以可任選地含有HPV18的E6和E7蛋白之一或兩者，優(yōu)選形式為蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白DE6/E7融合蛋白。本發(fā)明的疫苗可以含有HPV16或18的其它HPV抗原。特別是，所述疫苗可以含有L1或L2抗原單體?；蛘撸@種L1或L2抗原可以作為病毒樣顆粒一起存在，或僅所述L1蛋白作為病毒樣顆粒或殼粒結(jié)構(gòu)存在。這種抗原、病毒樣顆粒和殼粒本身是已知的。參見例如WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。可以包括另外的早期蛋白，諸如E2或最好是例如E5。本發(fā)明的疫苗可以還包含來自其它HPV毒株的抗原，最好來自毒株HPV611、HPV31或33。
疫苗的制備一般描述于Vaccin Design-The subunit and adjuvantapproach(Powell和Newman編輯)Pharmaceutical Biotechnology第6卷Plenum Press 1995。Fullerton的美國專利4,235,877描述了在脂質(zhì)體內(nèi)包衣殼。
本發(fā)明的蛋白最好在本發(fā)明的疫苗制劑中加上佐劑。合適的佐劑包括鋁鹽，諸如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，但也可以為鈣、鐵或鋅鹽，或可以為酰化酪氨酸或?；?、多糖的陽離子或陰離子衍生物或聚磷腈的不溶性懸浮液。
在本發(fā)明的制劑中，最好是所述佐劑組合物誘導(dǎo)優(yōu)先的TH1應(yīng)答。合適的佐劑系統(tǒng)包括例如單磷脂酰脂質(zhì)A(最好為3-脫-O-?；瘑瘟字Ｖ|(zhì)A(3D-MPL))與鋁鹽的組合物。
增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷脂酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合物，特別是WO94/00153中公開的SQ21和3D-MPL的組合物，或WO96/33739中公開的其中QS21用膽固醇猝滅的反應(yīng)原性較低的組合物。
在WO95/17120中描述了一種特別有效的在水包油乳液中包括QS21、3D-MPL和生育酚的佐劑制劑。
因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供用單磷脂酰脂質(zhì)A或其衍生物作為佐劑、包含蛋白D(或其衍生物)-E6或蛋白D(或其衍生物)-E7的疫苗。
所述疫苗最好還包含皂苷，最好是QS21。
所述制劑最好還包含水包油乳液和生育酚。本發(fā)明也提供生產(chǎn)疫苗制劑的方法，包括將本發(fā)明的蛋白與藥學(xué)上可接受的賦形劑(諸如3D-MPL)一起混合。
本發(fā)明將參考以下實(shí)施例進(jìn)一步描述實(shí)施例I構(gòu)建表達(dá)融合蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的大腸桿菌菌株1)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)-質(zhì)粒pMG MCS prot D1/3(＝pRIT14589)為pMG81(描述于以WO97/01640公開的英國專利申請n°951 3261.9)的衍生物，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection and Immunity，Jan.第119-125頁)殘基Ser20→Thr127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)。該質(zhì)粒用來表達(dá)融合蛋白D1/3-E7-His。
b)-HPV16型的HPV基因組E6和E7序列(參見Dorf等，Virology 1985，145，第181-185頁)從的pBR322中克隆的HPV16全長基因組(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Refernzzentrumfür人病原體乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg)進(jìn)行擴(kuò)增，并將其亞克隆入pUC19，得到TCA301(＝pRIT14462)。表達(dá)融合蛋白-D1/3-E7-His的質(zhì)粒TCA308(＝pRIT14501)的構(gòu)建從pRIT14462擴(kuò)增對應(yīng)于E7蛋白氨基酸1→98的核苷酸序列。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，于所述E7序列的5’端和3’端產(chǎn)生NcoI和SpeI限制性位點(diǎn)，允許插入質(zhì)粒pMGMCS prot D1/3的相同位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒TCA308(＝pRIT14501)。對插入片段進(jìn)行測序，以證實(shí)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間沒有產(chǎn)生修飾。融合蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的序列描述于

圖1。2)-AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14501引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl。Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3)-細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E7-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14501轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白D1/3-E7-His的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。實(shí)施例II融合蛋白D1/3-E7-His(HPV16)的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16.000g離心30分鐘。
將以上提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。通過考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約33kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗蛋白D和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾?？捡R斯染色SDS-聚丙烯酰胺凝膠顯示，表達(dá)水平代表約5％的總蛋白。實(shí)施例III蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的純化將1升表達(dá)蛋白-D1/3-E7-His的細(xì)菌培養(yǎng)物于4℃以11,300g離心30分鐘，將細(xì)胞沉淀于-80℃保持，直至進(jìn)一步處理。在75ml PBS緩沖液中再懸浮后，大腸桿菌細(xì)胞在弗氏壓碎器(SLM Aminco)中以20,000psi破碎。以17,000g離心30分鐘沉淀裂解的細(xì)胞。含有蛋白D1/3-E7-His的沉淀在30ml 2M NaCl、50mM磷酸鹽pH7.5中洗滌1次，然后在30ml 50mM磷酸鹽pH7.5中洗滌2次。于室溫下將沉淀在30ml 8M尿素、50mM磷酸鹽pH7.5中溫育2小時后，蛋白溶解。于4℃以17,000g離心15分鐘去除細(xì)胞碎片。于室溫下進(jìn)行蛋白純化，將15ml溶解的蛋白上樣至5ml Ni2+NTA(Qiagen)樹脂(Pharmacia柱XK16/20)，該柱在8M尿素、50mM磷酸鹽pH7.5中以0.2ml/min的流速預(yù)平衡。該柱在相同的緩沖液洗滌，直至280nm下的吸光度達(dá)到基線。用8M尿素、50mM磷酸鹽pH7.5中的0-600mM咪唑梯度洗脫該蛋白。最后兩個步驟的流速達(dá)到1ml/min。洗脫的流分經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝較電泳和蛋白質(zhì)印跡分析。用多克隆抗蛋白D或單克隆抗E7抗體經(jīng)考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)的ProtD1/3-E7-His，作為約32kDa的主要單條帶出現(xiàn)，估計(jì)為純度為95％的蛋白。用多克隆抗大腸桿菌蛋白抗體示蹤，沒有觀察到大腸桿菌污染。
為了去除尿素，于室溫下將9ml 1.33mg/ml的純化抗原(Bradford)對3升PBS緩沖液透析過夜，然后對新鮮的PBS緩沖液透析4小時?；厥兆鳛榭扇苄缘鞍椎?0％的無尿素蛋白。為了去除污染性內(nèi)毒素，在溫和攪拌下，將6ml透析的蛋白與1ml Affiprep polymixin凝膠(Biorad)于4℃溫育3小時。與500μl Affiprep polymixin樹脂進(jìn)行第二次溫育，將內(nèi)毒素水平減少至8.8EU/μg蛋白。在0.22μm過濾裝置(Milex 0.22GV，Millipore)上除菌過濾后，以0.665mg/ml分析prot-D1/3-E7-His蛋白的穩(wěn)定性。SDS PAGE分析顯示，在于-20℃、4℃、室溫或37℃下溫育7天后，沒有放出該蛋白。實(shí)施例IV表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV16的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)-質(zhì)粒pMG MCSprotD1/3(＝pRIT14589)為pMG81(描述于WO97/01640)的衍生物，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection and Immunity，Jan.第119-125頁)殘基Ser20→Thr127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)。該質(zhì)粒用來表達(dá)融合蛋白D1/3-E7-His。
b)-HPV16型的HPV基因組E6和E7序列(參見Dorf等，Virology1985，145，第181-185頁)從在pBR322中克隆的HPV16全長基因組(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Refernzzentrum fr人病原體乳頭瘤病毒-D69120-Heidelberg)進(jìn)行擴(kuò)增，并將其亞克隆入pUC19，得到TCA301(＝pRIT14462)。表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV16的質(zhì)粒TCA307(＝pRIT14497)的構(gòu)建從pRIT14462擴(kuò)增對應(yīng)于E6蛋白氨基酸1→151的核苷酸序列。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，于所述E6序列的5’端和3’端產(chǎn)生NcoI和SpeI限制性位點(diǎn)，允許插入質(zhì)粒pMGMCS Prot D1/3的相同位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒TCA307(＝pRIT14497)(參見圖2)。對插入片段進(jìn)行測序，以證實(shí)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間沒有產(chǎn)生修飾。融合蛋白-D1/3-E6-His的編碼序列描述于圖3。2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14497引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14497轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白D1/3-E6-his的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E6-his(HPV16)的特征鑒定提取物的制備將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16.000g離心30分鐘?？捡R斯染色SDS-聚丙烯酰胺凝膠與蛋白質(zhì)印跡的分析將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約32kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗蛋白D和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約5％的總蛋白。5.與硫氧還蛋白共同表達(dá)以類似于pro D1/3E7His(HPV18)表達(dá)(實(shí)施例XIII)的方式，用編碼硫氧還蛋白和蛋白D1/3E7His(HPV16)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株AR58。實(shí)施例V蛋白D1/3 E6 His(HPV 16)的純化在大腸桿菌(AR58)中表達(dá)HPV-16 ProtD1/3 E6重組抗原。表達(dá)策略包括將E6融合至流感嗜血菌蛋白D的1/3-N末端部分，該部分為提供T細(xì)胞輔助表位的免疫融合伴侶。將親和性多組氨酸尾工程改造在所述融合蛋白的羧基末端。該重組抗原在大腸桿菌中以不溶性蛋白過量表達(dá)。
該抗原的溶解需要變性劑。在缺乏變性劑的情況下，ProtD1/3-E6-His于中性pH下沉淀，為了避開溶解性問題，將這些蛋白與一種折疊伴侶反式硫氧還蛋白(TIT)共同表達(dá)。
當(dāng)共同表達(dá)硫氧還蛋白時，在存在0.05mg/ml卡那霉素的情況下，于30℃在補(bǔ)充0.2mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞光密度(OD600nm)達(dá)到0.4時，通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至42℃，熱誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。蛋白表達(dá)維持4小時。按照以下方案進(jìn)行純化。細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀60 OD6001 mM pefabloc，2M NaCl，PBS pH 7.4(緩沖液A)弗氏壓碎器通過3次20,000psi離心 17,000g 30 min，4℃沉淀洗滌液2MNaCl，PBS pH 7.4(緩沖液B)x1PBS pH 7.4(緩沖液C)x2離心 17,000g 30 min，4℃沉淀溶解 6M鹽酸胍，20mM PO4，pH 7.0(緩沖液D)于4℃過夜離心 17,000g 30 min，4℃上清液上樣至 平衡IMAC 6M鹽酸胍，20mM PO4，pH7.0(緩沖液D)
洗脫8M尿素，20mM PO4，pH7.0中的咪唑階梯(0.025M，01M，0.5M)Affiprep Polymyxin 8M尿素，20mM PO4，pH7.0(緩沖液E)2h室溫透析 4M尿素，0.5M精氨酸，150mM NaCl，10mMPO4，pH6.8(緩沖液I)2M尿素，0.5M精氨酸，150mM NaCl，10mMPO4，pH6.8(緩沖液J)0M尿素，0.5M精氨酸，150mM NaCl，10mMPO4，pH6.8(緩沖液K)通過采用弗氏細(xì)胞壓碎裝置進(jìn)行高壓勻漿，有效地破碎細(xì)胞。用高濃度蛋白變性劑提取抗原。這第一步打開細(xì)菌細(xì)胞壁，從細(xì)菌不溶性部分提取抗原。在4升培養(yǎng)物上進(jìn)行以下純化。
A. PBS/2 M NaCl/1 mM PefablocB. PBS/2M NaClC. PBS137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM NaH2PO4，1.47mMKH2PO4 pH7.4。
D. 6M鹽酸胍，20mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)pH7.0原料為10個燒瓶，每個燒瓶400ml培養(yǎng)物。
在使細(xì)胞通過弗氏壓碎器(20,000psi)三次進(jìn)行細(xì)胞裂解之前，將細(xì)胞糊狀物在緩沖液A(在這種情況下為240ml緩沖液A)中懸浮于60OD600。于4℃將裂解細(xì)胞以15,000g沉淀30分鐘。在240ml緩沖液B中將含所述重組蛋白的細(xì)菌細(xì)胞沉淀洗滌1次，然后在240ml緩沖液C中洗滌2次。
在搖床(rotating wheel)上，用240ml緩沖液D將Prot D E6-His(TIT)溶解過夜。于4℃以15,000g將細(xì)胞碎片沉淀30分鐘。上清液(230ml)于-20℃貯存。然后將該材料經(jīng)IMAC層析。
將螯合配體NTA(次氮基-三-乙酸)連接至瓊脂糖支持體(Qiagen)。用鎳金屬離子使NTA配體帶電荷，鎳金屬離子通過鎳的6個配位點(diǎn)中的4個配位點(diǎn)與其相互作用。鎳的其余兩個配位點(diǎn)與6xHis-標(biāo)記蛋白的組氨酸殘基強(qiáng)烈地相互作用。通過用結(jié)合至N-NTA的咪唑競爭并取代標(biāo)記的抗原，完成洗脫。
使用Ni-NTA瓊脂糖Qiagen(分類目錄號30 250)。溶液D:6M鹽酸胍，20MPO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH7.0E:8M尿素，20mMPO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH 7.0F:E+0.025M咪唑G:E+0.1M咪唑H:E+0.5M咪唑0.5MNaOH去離子水0.02％NaN3純化a) 填充樹脂(15ml樹脂/230ml樣品)，并在10倍柱體積(C.V.)緩沖液D中以15cm h-1平衡。b) 將得自溶解部分的上清液以15cm h-1注射到柱上。c) 柱子用緩沖液D以15cm h-1洗滌，直至OD 280mm回至基線。d) 柱子用2CV緩沖液E以15cm h-1洗滌?；厥障礈觳糠帧) 柱子首先用5CV緩沖液F洗脫。消除25kD主要污染物。f) 柱子然后用2CV緩沖液G洗脫。g) 柱子最后用3CV緩沖液H洗脫。洗脫所述抗原。合并抗原陽性流分(30ml)通過affiprep層析去除內(nèi)毒素。Affi-PrepPolymyxin支持體包括偶聯(lián)至Affi-PrepMatrix的USP級Polymyxin B。由于它對內(nèi)毒素脂質(zhì)A部分具有高度親和性，polymixinB以高容量和選擇性結(jié)合內(nèi)毒素分子。溶液E:8M尿素，20mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH 7.0(無熱原)。0.5 MNaOH去離子無熱原水步驟1)將Affi-PrepPolymyxin樹脂在10倍體積的0.1M NaOH中洗滌，然后在10倍體積的無熱原水中洗滌。2)樹脂在10倍體積的緩沖液E中平衡。3)15ml(半個庫)IMAC洗脫的樣品與3ml Affi-PrepPolymyxin樹脂以分批模式一起溫育。4)溫育在搖床上于室溫進(jìn)行4小時或于4℃O/N。5)樣品以2000g(Beckman GS-6R)離心10分鐘。6)收集含該抗原的上清液，進(jìn)行內(nèi)毒素和蛋白分析。7)棄去樹脂。
小分子通過半透膜擴(kuò)散，而保留大分子。由于膜兩邊溶質(zhì)濃度的差異而驅(qū)動透析過程。引入新的緩沖液，直至每邊的緩沖液組分相同。緩沖液I:4M尿素，0.5M精氨酸，15M NaCl，10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH6.8J:2M尿素，0.5M精氨酸，0.15M NaCl，10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH6.8K 0M尿素，0.5M精氨酸，0.15M NaCl，10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH6.81)將樣品(15ml)引入透析管(直徑20.4mm，高度6cm)2)于4℃攪拌下，將透析管置于含緩沖液I的2升量筒中2小時。3)于4℃將透析管置于含緩沖液J的2升量筒(在攪拌下)中2小時。4)于4℃將透析管置于含緩沖液K的2升量筒(在攪拌下)中O/N。更換緩沖液，于4℃透析2小時以上。
Millipore無菌Millex-GV 0.22μ，13mm。分類目錄號SLGV0130S。
所有步驟均在室溫(RT≈22℃)進(jìn)行，該抗原似乎穩(wěn)定。
使抗原溶液通過0.2μm濾器過濾，以防止任何細(xì)菌生長。將抗原于-20℃保持在Nunc管制瓶中。特征鑒定蛋白D1/3 E6 His特征鑒定如下蛋白D1/3-E6-His為長273個氨基酸的肽，112個氨基酸來自蛋白D部分。蛋白D1/3-E6-His的理論分子量為32kD，在SDS-PAGE上遷移為33kD蛋白。蛋白D1/3-E6-His的理論等電點(diǎn)為8.17。
病毒蛋白E6為含14個半胱氨酸殘基的堿性蛋白，其中8個(Cys30、33、63、66和Cys 103、106、136、139)參與兩個C-末端鋅結(jié)合基元。
蛋白D1/3-E6-His作為不溶性蛋白在大腸桿菌-AR58菌株中與折疊伴侶反式硫氧還蛋白一起表達(dá)。在400ml燒瓶中產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。
每升培養(yǎng)物獲得5.4mg 95％純蛋白。實(shí)施例VI表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6E7-his/HPV16的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)質(zhì)粒pMG MCS protD1/3(＝pRIT14589)為pMG81(上文描述的)的衍生物，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection andImmunity，Jan.第119-125)殘基Ser 20→Thr 127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)。該質(zhì)粒用來表達(dá)融合蛋白D1/3-E6E7-hs。
b)HPV16型的HPV基因組E6和E7序列(參見Dorf等，Virology1985，145，第181-185頁)從在pBR322中克隆的HPV16全長基因組(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Refernzzentrum für人病原體乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg)進(jìn)行擴(kuò)增，并將其亞克隆入pUC19，得到TCA 301(＝pRIT14462)。
c)TCA301(＝pRIT14462)中的E6和E7編碼序列用合成的寡核苷酸連接物(在AflIII和NsiI位點(diǎn)之間插入)修飾，引入E6和E7基因之間5個核苷酸的缺失，以去除E6終止密碼子，并在質(zhì)粒TCA309(＝pRIT14556)中產(chǎn)生融合的E6和E7編碼序列，參見圖4。表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6E6-His/HPV16的質(zhì)粒TCA 311(＝pRIT14512)的構(gòu)建從pRIT14556擴(kuò)增對應(yīng)于融合E6E7蛋白氨基酸1→249的核苷酸序列。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，于E6E7融合序列的5’端和3’端產(chǎn)生NcoI和SpeI限制性位點(diǎn)，允許插入質(zhì)粒pMGMCS ProtD1/3的相同位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒TCA311(＝pRIT14512)(參見圖5)。對插入片段進(jìn)行測序，以證實(shí)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間沒有產(chǎn)生修飾。融合蛋白-D1/3-His的編碼序列描述于圖6。2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14512引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6E7-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14512轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白D1/3-E6E7-his的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E6-his的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16.000g離心30分鐘。
將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約48kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗蛋白D和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約1％的總蛋白。實(shí)施例VIb以類似方式，在存在硫氧還蛋白的情況下在大腸桿菌中表達(dá)LipoD 1/3和得自HPV16的E6-E7的融合蛋白。含MDF殘基的前蛋白(388aa)的N末端后接16個氨基酸的脂蛋白D(來自流感嗜血菌)的信號肽，該信號肽在體內(nèi)切割，產(chǎn)生成熟蛋白(370aa)。脂蛋白部分(aa 1-127)后接融合的蛋白E6和E7。該蛋白的C末端用TSGHHHHHH延長。
通過以下方案純化該蛋白實(shí)施例VII脂蛋白D1/3-E6-D7-His(TIT)的純化A)溶解在使細(xì)胞通過弗氏壓碎器(20,000psi)3次進(jìn)行細(xì)胞裂解之前，在作為蛋白酶抑制劑的1 mM Pefabloc存在下，將細(xì)胞糊狀物在2MNaCl，20mM磷酸鹽(NaH2PO4/K2HPO4)pH7.5中懸浮至60OD600。將裂解的細(xì)胞以15,000g于4℃沉淀30分鐘。為了降低內(nèi)毒素水平，將含該重組蛋白的細(xì)菌細(xì)胞沉淀在4M尿素，2M NaCl，20mM磷酸鹽pH7.5中洗滌2次，在2％Empigen BB，20mM磷酸鹽pH7.5中洗滌1次，最后在20mM磷酸緩沖液pH7.0中洗滌2次，以去除痕量的去污劑(每次洗滌均以用于細(xì)胞懸浮的相同體積中進(jìn)行)。于4℃LipoProtD1/3-E6-E7-His(TIT)用8M尿素的0.2M β巰基乙醇(＝βMeOH)，20mM PO4 pH12溶液中溶解過夜，然后于室溫下用相同的緩沖液溫育2小時。細(xì)胞碎片以15,000g于4℃沉淀30分鐘。上清液于-20℃保持。B)純化1)在Q-Sepharose快流柱上進(jìn)行陰離子交換層析將225ml冷凍樣品于室溫在冷水浴中復(fù)蘇，上樣至Q-Sepharose快流柱(Pharmacia，XK 26/20)，該柱以45cm/h在8M尿素，0.2MβMEOH，20mM PO4 pH 12(30ml樹脂/225ml上清液)中預(yù)平衡。柱子用8 M尿素，0.2M βMEOH，20mM PO4 pH 12洗滌，直至OD 280mm達(dá)到基線，然后在8M尿素，20mM磷酸鹽pH12(在2倍柱體積中)進(jìn)行第二次洗滌。通過在8M尿素，20mM磷酸鹽pH12中經(jīng)NaCl分步(0.1M、0.25M、0.5M NaCl，每個步驟在2倍柱體積中進(jìn)行)進(jìn)行洗脫，合并0.5MNaCl洗脫的流分。2)離子金屬親和層析(IMAC)合并得自Q Sepharose步驟的0.5M NaCl洗脫的流分，將其對0.2M NaCl，8M尿素，20mM磷酸鹽pH10透析，然后上樣至在8M尿素，20mM磷酸鹽pH12(30ml樹脂/61ml樣品)中以5.6cm/h預(yù)平衡的Ni2+-NTA(Qiagen)柱(XK 26/20，Pharmacia)。柱子在8M尿素，20mM磷酸鹽pH12中洗滌直至達(dá)到基線，然后用8M尿素，20mM磷酸鹽pH10洗滌。在8M尿素，20mM磷酸鹽pH10中以45cm/h經(jīng)咪唑分步洗脫該抗原。合并0.5M咪唑洗脫的流分。C)濃縮在得自AMICON的攪拌槽中于室溫下，將Imac樣品在5kDaFiltron Omega膜上濃縮約5倍(至0.407mg/ml)。D)透析于室溫下，將濃縮樣品對尿素濃度降低(4M、2M尿素)的0.5M精氨酸、150mM NaCl、10mM PO4 pH6.8分步透析。于4℃對0.5M精氨酸、150mM NaCl、10mM PO4 pH6.8進(jìn)行最后透析。結(jié)果IMAC步驟能夠于0.025 M咪唑下去除32kD污染物，它也洗脫出某些抗原。經(jīng)SDS-PAGE考馬斯藍(lán)染色，估計(jì)0.05M咪唑洗脫的抗原的純度為90％。在這兩個純化步驟之后，樣品無大腸桿菌污染物。采用特異性抗原-N和/或C末端抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析，顯示比全長蛋白分子量大和小的異源條帶模式。該模式提示存在與全長蛋白共同純化的聚集物和不完全加工的蛋白和/或降解的蛋白。實(shí)施例VIII表達(dá)融合ProtD1/3-突變E7(cys24-＞gly，glu26-＞gln)HPV16型的大腸桿菌菌株B1002的構(gòu)建1)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原材料a)質(zhì)粒pRIT 14501(＝TCA 308)，編碼融合ProtDl/3-E7-His
b)質(zhì)粒LITMUS 28(New England Biolabs cat n°306-38)，pUC衍生的克隆載體c)質(zhì)粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589)，pMG81的衍生物(上文描述的)，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection and Immunity，Jan.第119-125頁)殘基Ser 20→Thr 127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)。表達(dá)具有His尾的融合蛋白-D1/3-突變E7(cys24-＞gly，glu26-＞gln)的質(zhì)粒pRIT 14733(＝TCA347)的構(gòu)建將帶有HPV16的E7基因編碼序列、得自pRIT 14501(＝TCA308)、用His尾延長的NcoI-XbaI片段，亞克隆入可用于誘變的中間載體Litmus 28中，產(chǎn)生pRI 14909(＝TCA337)。選擇雙突變cys24--＞gly(Edmonds and Vousden，J.Virology 632650(1989))和glu26--＞gln(Phelps等，J.Virology 662418-27(1992)，以削弱與成視網(wǎng)膜瘤基因(pRB)抗癌基因產(chǎn)物的結(jié)合。用試劑盒“快速改變定點(diǎn)誘變”(Stratagenecat n°200518)實(shí)現(xiàn)在E7基因中引入突變，產(chǎn)生質(zhì)粒pRIT 14681(＝TCA343)。經(jīng)測序證實(shí)存在突變且完整的E7基因的完整性后，將突變E7基因引入載體pRIT 14589(＝pMG MCS ProtD1/3)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pRIT 14733(＝TCA347)(圖7)。
圖8描述了融合蛋白-D1/3-突變E7(cys24-＞gly，glu26-＞gln)-His的序列。2)表達(dá)ProtD1/3-突變E7(cys24--＞gly，glu26--＞gln)-His/HPV16的菌株B1002的構(gòu)建將質(zhì)粒pRIT 14733引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，AR58為含λpL啟動子的熱敏感性阻抑物的缺陷型λ溶原菌，經(jīng)選擇抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子，得到菌株B1002。3)-細(xì)菌菌株B1002的生長和誘導(dǎo)-Prot D1/3-突變E7(cys24--＞gly，glu26--＞gln)-His/HPV16的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100 mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT 14733轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞(B1002)。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白D1/3-突變E7-His/HPV16的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4)-融合Prot D1/3-突變E7(cys24-＞gly，glu26-＞gln)-His HPV16型的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中。在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20 000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16000g離心30分鐘。
將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約33kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆22 J 70抗蛋白D、Zymed的單克隆抗E7/HPV16和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約3-5％的總蛋白。
從培養(yǎng)物肉湯中離心分離B1002細(xì)胞。將濃縮的B1002細(xì)胞于-65℃貯存。
實(shí)施例IXPR0TD1/3 E7(突變的(Dmutant))HPV16的純化
a)細(xì)胞懸浮液的制備將冷凍的濃縮B1002細(xì)胞復(fù)蘇，于4℃再懸浮于細(xì)胞破碎緩沖液中(參見表1)，至最終的光密度OD650為60(相當(dāng)于約25g DCW L-1的細(xì)胞濃度)。b)細(xì)胞破碎通過使細(xì)胞于1000巴下通過高壓勻漿器(Rannie)2次破碎細(xì)胞。破碎的細(xì)胞懸浮液收集于燒瓶中，于4℃維持。細(xì)胞破碎緩沖液Na2HPO4(0.02N)，NaCl(2M)pH用HCl 3N(Merck)調(diào)至7.5純化2a)動態(tài)膜過濾(MDF-PALL FILTRON)將2升破碎的細(xì)胞懸浮液(OD 60)上樣至得自PALL、裝有0.2μm截留膜的動態(tài)過濾系統(tǒng)DMF。
從2升濃縮至1升，得到樣品PCC1用3倍體積(3L)empigen-EDTA緩沖液(濃度EDTA 1.86g，Empigen(30％)3.33ml，PO43-0.5M 40.00ml 40.00ml)以恒定體積洗滌，得到樣品PD1從1L濃縮至300ml，得到樣品PCC2用10倍體積(3L)empigen緩沖液(每升的濃度Empigen 30％，3.33ml，PO43-0.5M 40ml)pH7.5以恒定體積洗滌，得到樣品通過加入相同體積(300ml)鹽酸胍8M緩沖液(每升的濃度Gu.HCl764g；Empigen 30％3.33ml，PO43-0.5M 40ml)pH7.5，將蛋白溶解蛋白的回收在濃縮至初始體積(300ml)期間收集滲透液-樣品P3，和用3倍體積鹽酸胍4M緩沖液(每升的濃度GuHCl 328.12g；
Empigen(30％)3.33ml，PO43-0.5M 40.00ml)pH7.5滲濾所有這些步驟均在冷房(2-8℃)中進(jìn)行，用0.5M PO43-調(diào)節(jié)pH。
將P3部分于-20℃貯存，等待用于下一步的純化步驟。2b)Zn螯合sepharose層析將P3部分解凍，注射到填充并平衡的Zn螯合sepharose FF中。
此后，該柱用約3倍體積的鹽酸胍4M緩沖液(參見上文)洗滌-樣品Zn-FT用約5倍體積的尿素4M緩沖液(每升濃度尿素240.24g，Empigen3.33ml PO43-0.5M 40.00ml))洗滌-樣品Zn-W用約3倍體積的尿素4M-咪唑20mM緩沖液(每升濃度尿素240.24g，Empigen(30％)3.33ml咪唑(1.36g)PO43-0.5M 40.00ml，pH7.5)、如上的緩沖液但咪唑的每升濃度為34.04g洗脫-樣品Zn-20用尿素4M-咪唑500mM洗脫至所述UV峰結(jié)束-樣品Zn-500該柱用EDTA 50mM和NaOH 0.5M洗滌，在下一個純化步驟之前，將Zn螯合sepharose洗出液(Zn-500)貯存于2-8℃，于室溫下進(jìn)行Zn螯合sepharose層析操作。2c)Q-sepharose層析將Zn-500流分注射到填充并平衡的Q-sepharose FF。
此后，該柱用約7倍體積的尿素4M緩沖液(參見上文)洗滌-樣品QS-FT用約10倍體積的無empigen尿素4M緩沖液(每升濃度尿素240.24g，PO43-0.5M 40.00ml))洗滌-樣品QS-W1用約10倍體積的無empigen尿素6M緩沖液(尿素360.36g/L)洗滌-樣品QS-W2用約5倍體積的尿素6M-NaCl 200mM緩沖液(每升濃度尿素360.35g，NaCl 11.69g，40.00ml PO43-洗脫。
用約3倍體積的尿素6M-NaCl 500mM緩沖液(如上所述，但NaCl29.22g/L)洗脫。由所述UV峰終止確定所述流分的提取終止-樣品QS-500用4倍體積尿素4M-NaCl1M緩沖液(每升濃度尿素360.36，NaCl58.44g 40.00ml PO43-(0.5)洗脫-樣品QS-1M然后該柱用NaOH0.5M洗滌在下一個純化步驟之前，QS-sepharose洗出液(QS-500)貯存于2-8℃。
于室溫下進(jìn)行Q-sepharose層析操作。2d)超濾然后，在10kD超濾裝置(Ultraette-Pall Filtron)上處理QS-500流分。
將該產(chǎn)物首先濃縮至約1mg/ml蛋白，然后對10倍體積的磷酸緩沖液滲濾。
棄去滲濾液(UF-P部分)，將存留物(retentate)(UF-R部分)貯存于2-8℃，等待最后的過濾。
于2-8℃下進(jìn)行超濾操作。2e)最后的過濾最后的大批料(UF-R部分)在層流和無菌100級房間(aseptic class100room)中通過0.22μm無菌濾器(Millipak-Millipore)過濾。終濃度為0.5-1.0μg/ml。
將該無菌大批料貯存于-20℃。實(shí)施例X表達(dá)融合clyta-E6-his(HPV16)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)-質(zhì)粒pRIT14497(＝TCA307)，編碼融合ProtD1/3-E6-His/HPV16
b)-質(zhì)粒pRIT14661(＝DVA2)，一種中間載體，含肺炎鏈球菌LytA的117個C末端密碼子的編碼序列。Lyta衍生自肺炎鏈球菌，合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶LYTA(由lytA基因編碼，{Gene，43(1986)第265-272頁})，這是一種特異性降解肽聚糖骨架中某些鍵的自溶素。
LYTA蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對膽堿的親和性，或?qū)χT如DEAE的某些膽堿類似物的親和性。1.b表達(dá)融合clyta-E6-His/HPV16的質(zhì)粒pRIT14634(＝TCA332)的構(gòu)建a)第一步為從質(zhì)粒pRIT14497中純化大的NcoI-AflII限制性片段和從pRIT14661中純化小的AflII-AflIII限制性片段。
b)第二步為將clyta序列連接至E7-His序列(NcoI和AflIII為匹配的限制性位點(diǎn))，產(chǎn)生質(zhì)粒pRIT 14634(＝TCA332)，它編碼在pL啟動子控制下的融合蛋白clyta-E6-His。(參見圖9)融合蛋白clya-E6-His的編碼序列描述于圖10。AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14634引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)，AR58為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-clyta-E6-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT 14634轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白clyta-E6-his的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4.融合clyta-E6-his的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中。在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16000g離心30分鐘。將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約33kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗clyta抗體和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約3％的總蛋白。實(shí)施例XI表達(dá)融合clyta-E6-his(HPV16)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.a原材料a)-質(zhì)粒pRIT14501(＝TCA308)，編碼融合ProtD1/3-E7-His/HPV16b)-質(zhì)粒pRIT14661(＝DVA2)，一種中間載體，含肺炎鏈球菌LytA的117個C末端密碼子的編碼序列。1.b表達(dá)融合clyta-E7-his/HPV16的質(zhì)粒pRIT14626(＝TCA330)的構(gòu)建a)第一步為從質(zhì)粒pRIT14501中純化大的NcoI-AflII限制性片段和從pRIT14661中純化小的AflII-AflIII限制性片段。
b)第二步為將clyta序列連接至E7-His序列(NcoI和AflIII為匹配的限制性位點(diǎn))，產(chǎn)生質(zhì)粒pRIT 14626(＝TCA330)，它編碼在pL啟動子控制下的融合蛋白clyta-E7-His。(圖11)融合蛋白clyta-E7-His的編碼序列描述于圖12。2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14626引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-clyta-E7-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14626轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白clyta-E7-his的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4.融合clyta-E7-his的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16.000g離心30分鐘。將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約35kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗clyta抗體和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約5％的總蛋白。實(shí)施例XII表達(dá)融合clyta-E6E7-his(HPV16)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.a原材料a)-質(zhì)粒pRIT14512(＝TCA311)，編碼融合ProtD1/3-E6E7-His/HPV16b)-質(zhì)粒pRIT14661(＝DVA2)，一種中間載體，含肺炎鏈球菌LytA的117個C末端密碼子的編碼序列。1.b表達(dá)融合clyta-E6E7-His/HPV16的質(zhì)粒pRIT14629(＝TCA331)的構(gòu)建
a)第一步為從質(zhì)粒pRIT14512中純化大的NcoI-AflII限制性片段和從pRIT14661中純化小的AflII-AflIII限制性片段。
b)第二步為將clyta序列連接至E7-His序列(NcoI和AflIII為匹配的限制性位點(diǎn))，產(chǎn)生質(zhì)粒pRIT 14629(＝TCA331)，它編碼在pL啟動子控制下的融合蛋白clyta-E6E7-His。(參見圖13)融合蛋白clyta-E6E7-His的編碼序列描述于圖14。2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14629引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-clyta-E6E7-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14629轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白clyta-E6E7-his的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4.融合clyta-E6E7-his的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。
將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約48kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗clyta抗體和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約1％的總蛋白。實(shí)施例XIIIProt D1/3 E7 his(HPV 18)(大腸桿菌B1011)、與反式硫氧還蛋白一起表達(dá)的蛋白D1/3 E7 his HPV(大腸桿菌B1012)1)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
1).a.表達(dá)融合蛋白-D1/3-E7-His/HPV18的質(zhì)粒TCA316(＝pRIT 14532)的構(gòu)建原材料a)質(zhì)粒pMG MCS_prot D1/3(＝pRIT14589)為pMG81(描述于以WO97/01640公開的英國專利申請n°951 3261.9)的衍生物，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection and Immunity，Jan.第119-125頁)殘基Ser 20→Thr127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)(參見圖15)。該質(zhì)粒用來表達(dá)融合蛋白D1/3-E7-His。
b)原型HPV 18的HPV基因組E6和E7序列(Cole等，J.Mol.Biol.(1987)193，599-608)從在pBR322中克隆的HPV 16全長基因組(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Refernzzentrum fr人病原體乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg)進(jìn)行擴(kuò)增，并將其亞克隆入pUC19，得到TCA 302(＝pRIT14467)。質(zhì)粒TCA 316(＝pRIT14532)的構(gòu)建從pRIT14467擴(kuò)增對應(yīng)于E7蛋白的氨基酸1→105的核苷酸序列。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，于E7序列的5’端和3’端產(chǎn)生NcoI和SpeI限制性位點(diǎn)，允許插入質(zhì)粒pMGMCS prot D1/3的相同位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒TCA316(＝pRIT14532)。對插入片段進(jìn)行測序，在E7基因中鑒定出一個對E7/HPV18原型序列的修飾(核苷酸128G-＞A)，導(dǎo)致甘氨酸被谷氨酸取代(E7中的aa 43，在融合蛋白中為156位)。融合蛋白-D1/3-E7-His/HPV18的編碼序列描述于圖16。
1).b.表達(dá)硫氧還蛋白的質(zhì)粒TCA313(＝pRIT14523)的構(gòu)建原材料a)-質(zhì)粒pBBR1MCS4(Antoine R.和C.Locht，Mol.Microbiol.1992，6，1785-1799；M.E.Kovach等，Biotechniques 16，(5)，800-802)，它與含ColE1或P15a復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒相匹配。
b)-質(zhì)粒pMG42(描述于WO93/04175)，含λ噬菌體啟動子pL的序列。
c)-質(zhì)粒pTRX(Invitrogen，試劑盒Thiofusion K350-01)，帶有硫氧還蛋白的編碼序列后接AspA轉(zhuǎn)錄終止子。質(zhì)粒TCA 313(＝pRIT14523)的構(gòu)建純化得自pMG42的EcoRI-NdeI片段，它帶有pL啟動子和pTRX的NdeI-HidIII片段、帶有硫氧還蛋白的編碼序列后接AspA終止子，將其連接到質(zhì)粒載體pBBR1MCS4的EcoRI和HindIII位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒TCA313(＝pRIT14523)(參見圖17)。
硫氧還蛋白的序列描述于圖18中。2)-AR58菌株的轉(zhuǎn)化2).a.為獲得表達(dá)ProtD1/3-E7-His/HPV18的菌株1011將質(zhì)粒pRIT14523引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌，選擇抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子。
2).b.構(gòu)建表達(dá)ProtD1/3-E7-His/HPV18和硫氧還蛋白的菌株1012將質(zhì)粒pRIT14532和pRIT14523引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌，經(jīng)雙選擇選擇抗卡那霉素和氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化子。3)-細(xì)菌菌株B1011和B1012的生長和誘導(dǎo)-具有或不具有反式硫氧還蛋白的Prot-D1/3-E7-His/HPV18的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素(對于B1011而言)以及補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨芐青霉素(對于B1012而言)的100ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14523轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞(B1011菌株)和用質(zhì)粒pRIT14523轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞(菌株B1012)。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白D1/3-E7-his/HPV18和硫氧還蛋白的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。融合蛋白D1/3-E7-His/HPV18的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16.000g離心30分鐘?？捡R斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
在菌株B1011的沉淀部分中考馬斯染色凝膠顯示融合protD1/3-E7-His(約31kDa)，部分位于(30％)菌株B1012的上清液部分，在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗蛋白D和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾?？捡R斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠顯示，表達(dá)水平代表約1-3％的總蛋白。
對于菌株B1012的提取物而言，在上清液中考馬斯染色凝膠顯示硫氧還蛋白(約12kDa)，并用單克隆抗硫氧還蛋白(Invitrogen R920-25)在蛋白質(zhì)印跡中得到鑒定。Prot D1/3 E7-his/HPV18的純化在大腸桿菌(如上所述)AR58菌株中表達(dá)重組HPV 18-ProtD 1/3-E7-His。所有步驟均在室溫(RT≈22℃)下進(jìn)行。通過監(jiān)測OD280nm監(jiān)測蛋白。在各步驟之間，抗原陽性部分于-20℃保持。
純化的抗原于-20℃和4℃穩(wěn)定1周(不降解)，但于37℃溫育后看來對氧化更為敏感。d)-溶解性蛋白的溶解性為pH依賴性的(參見下文)，pH＜7.4時溶解性降低
PBS pH 7.4686μg/ml100％PBS pH 7.2560μg/ml81％PBS pH 7.0498μg/ml72％PBS pH 6.8327μg/ml48％e)-HPV18 Prot D1/3 E7蛋白由227個氨基酸組成。其理論分子量為25.9kDa，理論等電點(diǎn)為5.83。在還原SDS PAGE中它以約31.5kDa遷移。實(shí)施例XIVHPV 18蛋白D1/3 E7的純化a)-溶解在使細(xì)胞通過Rannie破碎器2次進(jìn)行細(xì)胞裂解之前，將細(xì)胞糊狀物在2M NaCl，20mM磷酸鹽(NaH2PO4/K2HPO4)pH7.6中懸浮至60OD600。將裂解的細(xì)胞在JA 10轉(zhuǎn)子中以9,000rpm于4℃沉淀30分鐘。為了降低內(nèi)毒素水平，將含該重組蛋白的細(xì)菌細(xì)胞沉淀在5mMEDTA，2M NaCl，PBS pH7.4中洗滌1次，在4M尿素，20mM磷酸鹽pH7.4中洗滌1次，最后在PBSpH7.4中洗滌1次，以去除痕量的EDTA(每次洗滌均以用于細(xì)胞懸浮的2倍體積中進(jìn)行)。于4℃HPV18-Prot D1/3-E7-His(對于反式硫氧還蛋白為TIT)用6M鹽酸胍，50mMPO4 pH7.6溶液中溶解(在用于細(xì)胞懸浮的相同體積中)過夜。細(xì)胞碎片在JA 10轉(zhuǎn)子中以9,000rpm于4℃沉淀30分鐘。給上清液補(bǔ)充0.5％Empigen BB，并于室溫溫育。b)純化1).a.固定化金屬親和層析將125ml樣品上樣至Zn2+螯合Sepharose FF柱(XK 26/20，Pharmacia；50ml凝膠/125ml溶解)，該柱以4ml/min在0.5％EmpigenBB，6M鹽酸胍，50mM PO4 pH7.6中預(yù)平衡。柱子用鹽酸胍6M，PO450mM pH7.6洗滌，直至達(dá)到基線，然后用鹽酸胍6M，0.5MNaCl，PO450mM pH7.6洗滌。用0.25M咪唑的6M尿素，0.5M NaCl，PO4 50mMpH7.6溶液以2ml/min洗脫抗原(圖1B)。將IMAC洗脫的樣品于4℃對PBS pH7.4透析。1).b.Affi-PrepPolymixin(Bio-Rad)為了降低內(nèi)毒素水平，將28mg(37ml)抗原以分批模式與2mlAffiprep Polymyxin樹脂一起溫育，該樹脂在PBS pH7.4中于室溫下預(yù)平衡過夜。蛋白得率估計(jì)為60％，內(nèi)毒素含量降低6.5倍。1).c.分析在還原SDS-PAGE上分析的純化抗原在考馬斯藍(lán)染色和銀染后，顯示30kDa的一條主帶和55kDa的第二條帶。在非還原性SDS-PAGE中，HPV-18-ProtD1/3-E7-His主要看來是分子量≥175kDa的成片條帶。然而，通過加入5mM β-巰基乙醇可以逆轉(zhuǎn)這種氧化。該帶型被抗ProtD或抗His蛋白質(zhì)印跡分析所證實(shí)。c)-穩(wěn)定性純化的抗原于-20℃和4℃下穩(wěn)定1周(不降解)，但于37℃溫育后看來對氧化更敏感。d)溶解性蛋白的溶解性為pH依賴性的(參見下文)，pH＜7.4時溶解性降低PBS pH 7.4686μg/ml100％PBS pH 7.2560μg/ml81％PBS pH 7.0498μg/ml72％PBS pH 6.8327μg/ml48％HPV18-Prot D1/3-E7-His蛋白由227個氨基酸組成。其理論分子量為25.9kDa。在還原SDS PAGE中它以約31.5kDa遷移，理論等電點(diǎn)為5.83。實(shí)施例XV表達(dá)融合ProtD1/3-突變E7(cys27-＞gly，glu29-＞g/n)HPV18型的大腸桿菌菌株B1098的構(gòu)建1)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原材料a)-質(zhì)粒pRIT 14532(＝TCA 316)，編碼融合ProtD1/3-E7-Hisb)-質(zhì)粒LITMUS 28(New Enland Biolabs cat n°306-38)，pUC衍生的克隆載體c)-質(zhì)粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589)，pMG81的衍生物(上文描述的)，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection andImmunity，Jan.第119-125頁)殘基Ser 20→Thr 127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)。表達(dá)具有His尾的融合蛋白-D1/3-突變E7(cys27-＞gly，glu29-＞gln)的質(zhì)粒pRIT 14831(＝TCA355)的構(gòu)建將帶有HPV18的E7基因編碼序列、用His尾延長的pRIT 14532(＝TCA 316)的NcoI-XbaI片段，亞克隆入可用于誘變的中間載體Litmus28中，產(chǎn)生pRIT 14910(＝TCA348)。與E7/HPV16誘變相似，選擇雙突變cys27--＞gly和glu29--＞gln，以削弱與成視網(wǎng)膜瘤基因(pRB)抗癌基因產(chǎn)物的結(jié)合。
用試劑盒“快速改變定點(diǎn)誘變”(Stratagene cat n°200518)實(shí)現(xiàn)在E7基因中引入突變。對pRIT14532的測序指出，在E7的43位存在谷氨酸，而非HPV18原型序列中的甘氨酸，實(shí)現(xiàn)第二個誘變循環(huán)，將甘氨酸引入43位。我們獲得了質(zhì)粒pRIT 14829 (＝TCA353)。經(jīng)測序證實(shí)存在突變且完整的E7基因的完整性后，將突變E7基因引入載體pRIT14589(＝pMG MCS ProtD1/3)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pRIT 14831(＝TCA355)(參見圖17)。
圖18描述了融合蛋白-D1/3-突變E7(cys27-＞gly，glu29-＞gln)-His的序列。2)表達(dá)ProtD1/3-突變E7(cys27--＞gly，glu29--＞gln)-His/HPV18的菌株B1098的構(gòu)建將質(zhì)粒pRIT 14831引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，AR58為含λpL啟動子的熱敏感性阻抑物的缺陷型λ溶原菌，經(jīng)選擇抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化子，得到菌株B1098。3)-細(xì)菌菌株B1098的生長和誘導(dǎo)-ProtD1/3-突變E7(cys27--＞gly，glu29--＞gln)-His/HPV18的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100mlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT 14831轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞(B1098菌株)。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動ProtD1/3-突變E7-His/HPV18的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4)-融合ProtD1/3-突變E7(cys27-＞gly，glu29-＞gln)-His HPV16型的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中。在弗氏壓碎器SLMAminco中以20000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。提取物于4℃以16000g離心30分鐘?？捡R斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡法分析將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀?？捡R斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的約31kDa的一條主帶，并在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆22 J 70抗蛋白D和檢測可及的組氨酸尾的單克隆Penta-His(Qiagen cat.n°34660)進(jìn)行了鑒定。表達(dá)水平代表約3-5％的總蛋白。實(shí)施例XVI表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-his/HPV 18的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)質(zhì)粒pMG MCS_prot D1/3(＝pRIT14589)為pMG81(描述于以WO97/01640公開的英國專利申請n°951 3261.9)的衍生物，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection and Immunity，Jan.第119-125頁)殘基Ser 20→Thr127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)。該質(zhì)粒用來表達(dá)融合蛋白D1/3-E6-His。
HPV 18型的HPV基因組E6和E7序列(Cole等，J.Mol.Biol.1987，193，第599-608頁)從在pBR322中克隆的HPV18全長基因組(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Refernzzentrum für人病原體乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg)進(jìn)行擴(kuò)增，并將其亞克隆入pUC19，得到TCA 302(＝pRIT14467)。表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV18的質(zhì)粒TCA 314(＝pRIT14526)的構(gòu)建從pRIT14467擴(kuò)增對應(yīng)于E6蛋白的氨基酸1→158的核苷酸序列。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，于E6序列的5’端和3’端產(chǎn)生NcoI和SpeI限制性位點(diǎn)，以允許插入質(zhì)粒pMGMCS Prot D1/3的相同位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒TCA314(＝pRIT14526)(參見圖21)。對插入片段進(jìn)行測序，證實(shí)在所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間沒有產(chǎn)生修飾。所述融合蛋白-D1/3-E6-His的編碼序列描述于圖22。AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14526引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/rl卡那霉素的100mlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14526轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白D1/3-E6-his的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E7-his的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。將提取物以16.000g于4℃離心30分鐘。將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的一條約32kDa的主帶，在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗蛋白D和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約3-5％的總蛋白。實(shí)施例XVII表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6E7-his/HPV 18的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)質(zhì)粒pMG MCS prot D1/3(＝pRIT14589)為pMG81(描述于以WO97/01640公開的英國專利申請n°951 3261.9)的衍生物，其中流感的NS1編碼區(qū)的密碼子4-81被對應(yīng)于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等，1991，Infection and Immunity，Jan.第119-125頁)殘基Ser 20→Thr127的密碼子取代。Prot-D1/3的序列后接一個多克隆位點(diǎn)(11個殘基)和一個C末端組氨酸尾(6His)的編碼區(qū)。該質(zhì)粒用來表達(dá)融合蛋白D1/3-E6E7-his。
b)HPV 18型的HPV基因組E6和E7序列(Cole等，J.Mol.Biol.1987，193，599-608)從在pBR322中克隆的HPV 18全長基因組(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)，Refernzzentrum für人病原體乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg)進(jìn)行擴(kuò)增，并將其亞克隆入pUC19，得到TCA 302(＝pRIT1 4467)。
c)TCA302(＝pRIT 14467)中的E6和E7的編碼序列用合成寡核苷酸連接物(插入Hga I和NsiI位點(diǎn)之間)修飾，引入E6和E7基因之間的11個核苷酸缺失，去除了E6的終止密碼子，并在質(zhì)粒TCA320(＝pRIT 14628)中產(chǎn)生融合的E6和E7編碼序列，參見圖23。表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6E7-His/HPV18的質(zhì)粒TCA 328(＝pRIT14567)的構(gòu)建從pRIT14618擴(kuò)增對應(yīng)于融合的E6E7蛋白的氨基酸1→263的核苷酸序列。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，于E6E7融合序列的5’端和3’端產(chǎn)生NcoI和SpeI限制性位點(diǎn)，以允許插入質(zhì)粒pMGMCS Prot D1/3的相同位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒TCA328(＝pRIT14567)(參見圖24)。對插入片段進(jìn)行測序，證實(shí)在所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間沒有產(chǎn)生修飾。所述融合蛋白-D1/3-E6E7-His的編碼序列描述于圖25。2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pRIT14567引入大腸桿菌AR58(Mott等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，8288)中，該菌株為含λpL啟動子的熱敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6E7-His的表達(dá)于30℃在補(bǔ)充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)用質(zhì)粒pRIT14512轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞。在對數(shù)生長期中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至39℃，以失活λ阻抑物，并啟動蛋白D1/3-E6E7-his的合成。于39℃的溫育持續(xù)4小時。沉淀細(xì)菌并貯存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E6E7-his的特征鑒定將冷凍細(xì)胞復(fù)蘇，再懸浮于10ml PBS緩沖液中，在弗氏壓碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎細(xì)胞(通過3次)。將提取物以16.000g于4℃離心30分鐘。
將上述提取物離心后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析等份的上清液和沉淀。
考馬斯染色凝膠顯示位于沉淀部分的一條約48kDa的主帶，在蛋白質(zhì)印跡中，用兔多克隆抗蛋白D和偶聯(lián)至牛小腸堿性磷酸酶的Ni-NTA綴合物(Qiagen cat.n°34510)進(jìn)行了鑒定，所述綴合物檢測可及的組氨酸尾。表達(dá)水平代表約1％的總蛋白。實(shí)施例XVIII疫苗制劑用得自以上實(shí)施例、在大腸桿菌菌株AR58中表達(dá)的蛋白和作為佐劑的制劑配制疫苗，所述作為佐劑的制劑包含油/水乳液中的3脫-O-?；瘑瘟字Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)和氫氧化鋁或3D-MPL和/或可任選的QS21的組合物，所述疫苗可任選地用膽固醇配制。
3D-MPL為革蘭氏陰性菌明尼蘇達(dá)沙門氏菌(Salmonellaminnesota)的化學(xué)解毒形式的脂多糖(LPS)。在Smith Kline BeechamBiologicals進(jìn)行試驗(yàn)已經(jīng)表明，與各種載體結(jié)合的3D-MPL強(qiáng)烈增強(qiáng)體液免疫，也強(qiáng)烈增強(qiáng)TH1型細(xì)胞免疫。
QS21為從皂樹Saponaria Molina樹皮粗提取物中純化的一種皂苷，它具有強(qiáng)佐劑活性它不僅激活抗原特異性淋巴組織增生，而且激活對幾種抗原的CTL。
含本發(fā)明抗原、含3D-MPL和明礬的疫苗，按WO93/19780或92/16231中描述的類似方式進(jìn)行制備。
在Smith Kline Beecham Biologicals進(jìn)行試驗(yàn)已經(jīng)證明了3D-MPL和QS21的組合物在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和TH1型細(xì)胞免疫應(yīng)答中均有明顯的協(xié)同效應(yīng)。在US 5750110中描述了含這種抗原的疫苗。
油/水乳液由2種油(生育酚和角鯊烯)和含作為乳化劑的Tween 80的PBS組成。該乳液包含5％角鯊烯、5％生育酚、0.4％Tween 80，其平均粒度為180nm，被稱為SB62(參見WO 95/17210)。
在Smith Kline Beecham Biologicals進(jìn)行試驗(yàn)已經(jīng)證明，將這種O/W乳液附加至MPL/QS21進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫刺激劑的性質(zhì)。乳液SB62(2倍濃縮物)的制備將Tween80溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)中，得到2％的PBS溶液。為了提供100ml 2倍濃縮乳液，將5g DL α生育酚和5ml角鯊烯充分渦旋混合。加入90ml PBS/Tween溶液，并充分混合。然后使所得的乳液通過注射器，最后用M110S微流化儀微流化。所得油滴的大小約為180nm。Prot.D1/3 E7 QS21/3D MPL水包油制劑的制備將ProtD1/3-E7(5μg)在10倍濃縮的PBS pH 6.8和水中稀釋，然后以5分鐘的間隔連續(xù)加入SB62、3 D MPL(5μg)、QS21(5μg)和50μg/ml作為防腐劑的破柳汞。乳液體積等于總體積的50％(對于100μl的劑量為50μl)。所有溫育均于室溫、攪拌下進(jìn)行。用PBS取代所述蛋白，制備無抗原的佐劑對照。用Prot D E7進(jìn)行的腫瘤退化試驗(yàn)(HPV16)疫苗抗原融合蛋白ProtD E7蛋白D是一種暴露于革蘭氏陰性菌流感嗜血菌表面的脂蛋白。摻入包括蛋白D前109個殘基作為融合伴侶，為疫苗抗原提供旁觀者輔助特性(bystander help properties)。如上所述，用QS21 3D-MPL和SB62配制抗原。實(shí)施例XIX體內(nèi)腫瘤退化試驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞系TC1用HPV 16 E6和E7將得自C57BL.6小鼠的原代肺上皮細(xì)胞無限增殖化，然后用活化的ras癌基因轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生表達(dá)E6和E7的致癌細(xì)胞系(Lin KY等，1996)。通過用小鼠抗HPV 16 E7 Mab(Triton Corp.Alameda，CA)對固定的透化TC1細(xì)胞進(jìn)行FACS分析已經(jīng)證實(shí)了E7的表達(dá)。腫瘤生長用胰蛋白酶消化體外培養(yǎng)生長的TC1細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中洗滌2次，皮下注射到小鼠的右脅腹。為了評價所建立腫瘤的治療，注射3×10e4細(xì)胞/小鼠劑量的TC1細(xì)胞。注射腫瘤細(xì)胞后1周和2周，用5μg 100μl protD 1/3 E7 His爪墊內(nèi)(50μl爪墊)的PBS溶液或3D-MPL、QS21和SB62溶液，或用PBS或單獨(dú)的佐劑，對小鼠進(jìn)行疫苗接種。每組使用5只C57BL/6小鼠(Iffa Credo)。1周2次監(jiān)測小鼠腫瘤的生長。平均腫瘤質(zhì)量/組示于圖26，用proD 1/3 E7 His的PBS溶液或用PBS或用單獨(dú)的佐劑疫苗接種的小鼠進(jìn)行性發(fā)展生長的腫瘤(0-1只無腫瘤小鼠/組)。相反，用佐劑中的proD1/3 E7 His疫苗接種的5只小鼠中的4只沒有發(fā)生腫瘤，1只動物在第40天時出現(xiàn)非常小的穩(wěn)定的腫瘤。該結(jié)果表明，得自HPV16、在佐劑中配制的蛋白protD1/3 E7His能夠誘導(dǎo)表達(dá)該抗原的小的建立腫瘤的退化。免疫學(xué)讀出(read out)增殖測定對于體外測定，通過于第69天將接種疫苗的小鼠的脾或腘淋巴結(jié)壓碎，制備淋巴細(xì)胞。將1等份2×10e5細(xì)胞以一式三份接種到包被有濃度降低的(10、1、0.1μg/ml)protD 1/3 E7His的96孔板中，或接種到膠乳微珠(Sigma)，以在體外再刺激所述細(xì)胞(72小時)。通過3H胸苷摻入測定T細(xì)胞的增殖。
圖27和28比較了protD E7刺激脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞增殖的能力，所述脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞在體內(nèi)用PBS、3D-MPL、QS21 SB62、ProtD1/3 E7 His和ProtD1/3 E7 His+3D-MPL、QS21、SB62佐劑之一引發(fā)，表明與其它組相比，僅在用佐劑中的protD1/3 E7 His免疫的小鼠中檢測到在脾臟中的高增殖應(yīng)答。抗體應(yīng)答在取器官的同時取個體的血清，進(jìn)行間接ELISA。
將5μg/ml純化E7蛋白用作包被抗原。在PBS+1％新生小牛血清中于37℃飽和1小時后，在所述飽和緩沖液中連續(xù)稀釋血清(以1/100開始)，并于4℃溫育過夜(O/N)或于37℃溫育90分鐘。在0.1％PBSTween 20中洗滌后，將生物素化山羊抗小鼠Ig(1/1000)或山羊抗小鼠Ig亞類(總IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b)抗血清(1/5000)用作第二抗體，在于37℃溫育90分鐘后，加入偶聯(lián)至過氧化物酶的鏈霉抗生物素蛋白，用TMB(四甲基-聯(lián)苯胺/過氧化物)用作底物，10分鐘后，用0.5M硫酸終止反應(yīng)，測定O.D.450。
與血清的相對平均中點(diǎn)稀釋度相比，通過在不同組小鼠中接種疫苗引發(fā)的亞類特異性抗E7的效價示于圖29。
這些結(jié)果表明，以2次注射單獨(dú)ProtD 1/3 E7 HOV 16觸發(fā)弱抗體應(yīng)答。
當(dāng)在存在佐劑SB62、QS21+3D-MPL的情況下注射ProtD1/3 E7時，產(chǎn)生的抗E7抗體多得到。
在任何血清樣品中，甚至在接受佐劑SB62、QS2 1+3D-MPL中的ProtD 1/3 E7的小鼠血清中(數(shù)據(jù)未顯示)，既沒有檢測到IgA，也沒有檢測到IgM。相反，通過用單獨(dú)的ProtD 1/3 E7疫苗接種，略微增強(qiáng)了總的IgG水平，通過將佐劑SB62、QS21+3D-MPL加至該蛋白，大大增加了總IgG水平。對不同IgG亞類濃度的分析表明，與接受單獨(dú)的該抗原或單獨(dú)的佐劑的小鼠血清中觀察到的濃度相比，當(dāng)在接受含佐劑抗原的小鼠的血清中分析的所有類型IgG亞類(IgG1、IgG2a和IgG2b)的濃度提高時，已經(jīng)誘導(dǎo)出混合抗體應(yīng)答。所發(fā)現(xiàn)的主要同種型為IgG2b，它占總IgG的80％以上)，該同種型一般認(rèn)為與TH1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)有關(guān)。實(shí)施例XX體內(nèi)腫瘤保護(hù)試驗(yàn)以14天的間隔，用或者PBS、實(shí)施例1的佐劑、5μg protD1/3 E7His或者實(shí)施例1佐劑中的5μg protD1/3 E7 His，以100μl的體積(50μl/爪墊)爪墊內(nèi)免疫小鼠2次。腫瘤的生長最后一次疫苗接種后4周，用2X10e5 TC1細(xì)胞/小鼠在脅腹中皮下攻擊小鼠。用胰蛋白酶消化體外培養(yǎng)生長的TC1細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中洗滌2次，并注射。1周2次監(jiān)測每組中所用的5只小鼠的腫瘤生長。
圖30表明，用SB62 QS21，3D-MPL佐劑中的E7蛋白接種，保護(hù)所有其它組小鼠抵抗腫瘤的發(fā)生(每5只動物中僅1只具有非常小而穩(wěn)定的腫瘤)，在接受無佐劑的E7蛋白或單獨(dú)的佐劑的組中，發(fā)生生長的腫瘤。免疫學(xué)讀出最后一次疫苗接種后3周，在腫瘤攻擊之前，處死每組的5只小鼠用于免疫學(xué)讀出。增殖測定對于體外測定，如上所述，由脾或腘淋巴結(jié)制備淋巴細(xì)胞。將1等份2×10e5細(xì)胞一式三份接種到包被有濃度降低的(10、1、0.1μg/ml)protD 1/3 E7 His的96孔板中，或接種到膠乳微珠(Sigma)，以在體外再刺激所述細(xì)胞(72小時)。通過3H胸苷摻入測定T細(xì)胞的增殖。
圖31和32分別表明，用脾細(xì)胞和腘淋巴結(jié)細(xì)胞，如在治療環(huán)境中觀察到的，接受SB62 QS21，3D-MPL佐劑中的E7蛋白的小鼠獲得的較好的淋巴組織增殖活性，抗體應(yīng)答。
圖33表明，如在治療環(huán)境中一樣，在用于3D-MPL、QS21 O/W佐劑中配制的ProtD1/3 E7蛋白疫苗接種的小鼠的血清中，觀察到較好的抗體應(yīng)答。觸發(fā)了混合抗體應(yīng)答，在這種情況下，作為所有測試的IgG亞類(IgG 2a、IgG2b、IgG1)，IgG2b是發(fā)現(xiàn)的主要同種型，占總IgG的75％。實(shí)施例XXI用Prot D1/3 E7(HPV 18)進(jìn)行疫苗接種試驗(yàn)以2周間隔，用100μl 5μg protD 1/3 18 E7 His爪墊內(nèi)(50μl/爪墊)的PBS溶液或QS21、3D-MPL和WO96/33739中所述的SB62，DQ MPL溶液或WO98/15827中所述的DQ明礬MPL溶液，對小鼠進(jìn)行2次疫苗接種。每組使用8只6-8周齡的Balb/c小鼠(Iffa Credo)。第II次后14天，取脾臟和淋巴結(jié)用于免疫學(xué)讀出，取血液樣品作血清學(xué)分析?！衩庖邔W(xué)讀出增殖測定對于體外測定，通過于第28天將接種疫苗的小鼠的脾或腘淋巴結(jié)壓碎，制備淋巴細(xì)胞。
將1等份2×10e5細(xì)胞一式三份接種到包被有濃度降低的(10、1、0.1、0.01μg/ml)protD 1/3 18 E7 His的96孔板中，以在體外再刺激所述細(xì)胞(72小時)。通過3H胸苷摻入測定T細(xì)胞的增殖。結(jié)果以刺激指數(shù)(cpm樣品/cpm基線)表示。
圖34和35比較了protD 1/3 18 E7刺激脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞增殖的能力，所述脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞在體內(nèi)或者用ProtD1/3 18 E7 His或者用ProtD1/3 18 E7 His+佐劑引發(fā)，表明在接受單獨(dú)的蛋白的小鼠中僅觀察到基本的淋巴組織增殖，而在用佐劑中的protD1/3 18 E7 His免疫的小鼠中檢測到脾臟中高的增殖應(yīng)答和淋巴結(jié)中非常高的應(yīng)答。細(xì)胞因子的產(chǎn)生● 用培養(yǎng)基或ProtD1/3 18E7(1或3μg/ml)體外再刺激脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞96小時后，如所述通過ELISA測定培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的細(xì)胞因子(IL-5和IFNg)● IFNg(Genzyme)用Genzyme的試劑，通過Elisa進(jìn)行IFNγ的定量。每孔用50μl樣品和抗體溶液溶液。96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麥)于4℃用50μl倉鼠抗小鼠IFNg包被過夜，其中倉鼠抗小鼠IFNg以1.5μg/ml在碳酸鹽緩沖液pH9.5中稀釋。然后將板于37℃與100μl含1％牛血清白蛋白和0.1％Tween 20的PBS(飽和緩沖液)溫育1小時。將得自體外刺激(于1/2開始)在飽和緩沖液中2倍稀釋的上清液，加至抗IFNg包被板中，于37℃溫育1小時30分鐘(1 hr 30)。板用PBSTween 0.1％(洗滌緩沖液)洗滌4次，將在飽和緩沖液中稀釋的終濃度為0.5μg/ml的生物素綴合的山羊抗小鼠IFNg加入每孔，于37℃溫育1小時。洗滌步驟后，于37℃加入于飽和緩沖液中稀釋1/10000的AMDEX綴合物(Amersham)30分鐘。將板如上所述洗滌，并與50μlTMB(Biorad)一起溫育15分鐘。用0.4N硫酸終止反應(yīng)，于450nm讀數(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)曲線(小鼠IFNγ標(biāo)準(zhǔn)品)，通過SofrmaxPro(四參數(shù)公式)計(jì)算濃度，并以pg/ml表示?！馡L-5(Pharmingen)用Pharmingen的試劑，通過Elisa進(jìn)行IL5的定量。每孔用50μl樣品和抗體溶液溶液。96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麥)于4℃用50μl大鼠抗小鼠IL5包被過夜，其中大鼠抗小鼠IL5以1μg/ml在碳酸鹽緩沖液pH9.5中稀釋。然后將板于37℃與100μl含1％牛血清白蛋白和0.1％Tween 20的PBS(飽和緩沖液)溫育1小時。將得自體外刺激(于1/2開始)在飽和緩沖液中2倍稀釋的上清液，加至抗IFNg包被板中，于37℃溫育1小時30分鐘(1 hr 30)。板用PBS Tween0.1％(洗滌緩沖液)洗滌4次，將在飽和緩沖液中稀釋的終濃度為1μg/ml的生物素綴合的大鼠抗小鼠IL5加入每孔，于37℃溫育1小時。洗滌步驟后，于37℃加入于飽和緩沖液中稀釋1/10000的AMDEX綴合物(Amersham)30分鐘。將板如上所述洗滌，并與50μl TMB(Biorad)一起溫育15分鐘。用0.4N硫酸終止反應(yīng)，于450nm讀數(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)曲線(重組小鼠IL5)，通過SofrmaxPro(四參數(shù)公式)計(jì)算濃度，并以pg/ml表示。
用脾細(xì)胞開始，無論測試哪個組，均不能檢測到IL-5，相反，在所有組中均觀察到非常高的IFNg產(chǎn)生，而與其它組相比，在接受以SBASlc作為佐劑的蛋白的小鼠組中僅觀察到略微增強(qiáng)。這提示TH1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
關(guān)于淋巴結(jié)細(xì)胞，在僅接受該蛋白的小鼠組中獲得非常弱的IFNg產(chǎn)生，而在接受含佐劑的蛋白的小鼠組中觀察到5-10倍的增強(qiáng)。只能在接受SBAS2佐劑化蛋白的小鼠組中檢測到IL5。
圖36和37比較了在體外分別再刺激脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞后，ProtD1/3 18 E7 His刺激細(xì)胞因子IFNg和IL5產(chǎn)生的能力?？贵w應(yīng)答在取器官的同時取個體的血清，進(jìn)行間接ELISA。
將2.5μg/ml純化protD1/3 18E7蛋白HPV18用作包被抗原。在PBS+1％新生小牛血清中于37℃飽和1小時后，在所述飽和緩沖液中連續(xù)稀釋血清(以1/100開始)，并于4℃溫育過夜(O/N)或于37℃溫育90分鐘。在0.1％PBS Tween 20中洗滌后，將生物素化山羊抗小鼠Ig(1/1000)或山羊抗小鼠Ig亞類(總IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b)抗血清(1/5000)用作第二抗體，在于37℃溫育90分鐘后，加入偶聯(lián)至過氧化物酶的鏈霉抗生物素蛋白，用TMB(四甲基-聯(lián)苯胺/過氧化物)用作底物，10分鐘后，用0.5M硫酸終止反應(yīng)，測定O.D.450。
注射2次單獨(dú)的ProtD 1/3 18 E7，觸發(fā)非常弱的抗體應(yīng)答。通過將佐劑加入該蛋白疫苗，大大提高了總IgG水平。
對不同IgG亞類濃度的分析表明，當(dāng)在存在佐劑DQS21 3D-MPL或SB62，QS21/3D-MPL的情況下注射該蛋白，獲得略微增加的IgG2a亞型百分比分別為28％IgG1、48％IgG2a和43％IgG1、44％IgG2a，相比之下，無佐劑蛋白為46％IgG1、32％IgG2a。用在DQ明礬配制的該蛋白獲得最強(qiáng)的抗體應(yīng)答，所述同種型濃度有明顯變化(80％IgG1、8％IgG2a)。由于Balb/c小鼠中的IgG2a同種型一般被認(rèn)為與TH1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)有關(guān)，因此這些結(jié)果提示DQS21，3D-MPL和SB62 QS21/3D-MPL佐劑傾向于增加體液應(yīng)答的TH1型分布型，而SBAS5誘導(dǎo)明顯的TH2型應(yīng)答。
圖38.顯示了血清中點(diǎn)稀釋度和通過在不同小鼠組中接種疫苗引發(fā)的不同同種型的相對百分比的比較。結(jié)論我們已經(jīng)證明，1/3 Prot D和HPV 16早期蛋白E7融合蛋白誘導(dǎo)有效的系統(tǒng)抗腫瘤免疫，ProtD1/3和HPV18的E7融合蛋白也已經(jīng)證明在用prot D1/3 E7 HPV16融合蛋白疫苗接種的小鼠中具免疫原性，保護(hù)小鼠抵抗表達(dá)E7的腫瘤細(xì)胞的腫瘤攻擊，并消除距疫苗接種位點(diǎn)遠(yuǎn)位點(diǎn)注射而預(yù)建立的表達(dá)HPV16 E7的小腫瘤。
我們已經(jīng)證明，佐劑中的ProtD1/3 E7 HPV16蛋白能夠增強(qiáng)輔助T細(xì)胞增殖，提示用該疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答至少部分與CD4+T細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)。
我們也已經(jīng)證明，通過在含3D-MPL佐劑存在下用Prot D1/3 E7疫苗接種，觸發(fā)了較好的抗體應(yīng)答。在C57BL/6小鼠血清中發(fā)現(xiàn)的主要同種型為IgG2b，提示產(chǎn)生了TH1型免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.得自HPV、連接至免疫融合伴侶的E6或E7或E6/E7融合蛋白。
2.權(quán)利要求1要求保護(hù)的蛋白，其中所述融合伴侶選自流感嗜血菌B的蛋白D或其片段、流感嗜血菌B的脂蛋白D或其片段、流感病毒的NS1或其片段和肺炎鏈球菌的LYTA或其片段。
3.權(quán)利要求1或2要求保護(hù)的蛋白，其中所述E6或E7蛋白得自HPV16或HPV18。
4.權(quán)利要求1、2或3要求保護(hù)的蛋白，其中使所述E7蛋白突變。
5.權(quán)利要求1、2或3要求保護(hù)的蛋白，其中使所述E6蛋白突變。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)要求保護(hù)的蛋白，還包含至少4個組氨酸殘基的組氨酸標(biāo)記。
7.包含異源蛋白、組氨酸標(biāo)記和C-LYTA標(biāo)記的融合蛋白。
8.編碼本文要求保護(hù)的蛋白的DNA序列。
9.疫苗，含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)中要求保護(hù)的蛋白和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或賦形劑。
10.權(quán)利要求9要求保護(hù)的疫苗，還包含佐劑。
11.權(quán)利要求9或10要求保護(hù)的疫苗，其中所述蛋白存在于水包油乳液載體中。
12.權(quán)利要求10或11要求保護(hù)的疫苗，其中所述佐劑包括3D-MPL或QS21或這兩者。
13.本文要求保護(hù)的疫苗，包含另一種HPV抗原。
14.本文要求保護(hù)的用于藥物的疫苗。
15.本文要求保護(hù)的蛋白的用途，用于生產(chǎn)免疫治療性治療患有HPV誘導(dǎo)的腫瘤損害(良性或惡性)的患者的疫苗。
16.本文要求保護(hù)的蛋白的用途，用于生產(chǎn)預(yù)防HPV病毒感染的疫苗。
17.含權(quán)利要求8的DNA序列的載體。
18.含權(quán)利要求8要求保護(hù)的DNA序列和編碼硫氧還蛋白的DNA序列的載體。
19.用權(quán)利要求8的DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主。
20.用權(quán)利要求17或18的載體轉(zhuǎn)化的宿主。
21.權(quán)利要求19要求保護(hù)的宿主，還用編碼硫氧還蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)化。
22.本文要求保護(hù)的蛋白的生產(chǎn)方法，包括用權(quán)利要求6的DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)所述序列并分離所需產(chǎn)物。
23.本文要求保護(hù)的疫苗的生產(chǎn)方法，包括將本文要求保護(hù)的蛋白與合適的佐劑、稀釋劑或其它藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
全文摘要
本發(fā)明提供連接至免疫融合伴侶的人乳頭瘤病毒(HPV)融合蛋白,所述免疫融合伴侶提供對HPV抗原的T輔助表位。提供可用于治療或預(yù)防HPV誘導(dǎo)的損害的疫苗制劑。
文檔編號C07K19/00GK1276833SQ98810251
公開日2000年12月13日 申請日期1998年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月22日
發(fā)明者C·布魯克, T·卡貝松斯?fàn)柾? A·M·E·F·德利瑟, C·M·G·格拉德, A·隆巴爾多－本謝克 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司