專利名稱：用抗ErbB2抗體治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療以ErbB2過(guò)度表達(dá)為特征的疾病的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用抗ErbB2抗體和化療劑的組合而不是蒽環(huán)類抗生素(anthracycline如阿霉素或表柔比星)來(lái)治療易患或診斷患有過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌癥患者。
背景技術(shù)：
已經(jīng)確定編碼生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子受體的原癌基因在各種人惡性腫瘤(包括乳房癌)致病機(jī)理中起著重要作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，人ErbB2基因(erbB2，也稱為her2或c-erbB-2)，在約25-30％的人乳房癌患者中是過(guò)度表達(dá)的，該基因編碼了與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)相關(guān)的185kd的跨膜糖蛋白受體(p185HER2)(Slamon等，Science，235177-182；Slamon等，Science，244707-712)。
幾條證據(jù)證實(shí)了ErbB2在ErbB2過(guò)度表達(dá)腫瘤的致病機(jī)理和臨床侵襲性中起直接的作用。已表明，將ErbB2引入非腫瘤細(xì)胞會(huì)引起它們發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(Hudziak等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 847159-7163；DiFiore等人，Science 23778-182)。發(fā)現(xiàn)表達(dá)HER2的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)育產(chǎn)生了乳房腫瘤(Guy等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8910578-10582)。
針對(duì)erbB2基因的大鼠等價(jià)物(neu)編碼的人erbB2蛋白產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的抗體己有描述。Drebin等人，Cell 41695-706(1985)報(bào)道了針對(duì)大鼠neu基因產(chǎn)物的IgG2a單克隆抗體。該抗體稱為7．16．4，它使B104-101細(xì)胞(經(jīng)neu原癌基因轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞)上的細(xì)胞表面p185表達(dá)下調(diào)，并抑制這些細(xì)胞形成集落。在Drebin等人，PNAS(USA)839129-9133(1986)中，7．16．4抗體顯示出能抑制植入裸鼠體內(nèi)的neu轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞以及大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(從該細(xì)胞中最先分離得到neu癌基因)的致瘤性生長(zhǎng)。Drebin等在Oncogene 2387-394(1988)中討論了抗大鼠neu基因產(chǎn)物的一組抗體的生產(chǎn)方法。發(fā)現(xiàn)所有這些抗體對(duì)懸浮在軟瓊脂中的neu轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)均有細(xì)胞靜止作用。IgM，IgG2a和IgG2b同種型抗體能在補(bǔ)體存在下明顯介導(dǎo)neu轉(zhuǎn)化細(xì)胞的體外裂解，但是沒(méi)有一種抗體能介導(dǎo)neu轉(zhuǎn)化細(xì)胞的高水平的依賴于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。Drebin等Oncogene 2273-277(1988)報(bào)道了與p185分子上的兩個(gè)不同區(qū)域起反應(yīng)的抗體混合物，對(duì)植入裸鼠中的neu轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞有協(xié)同抗腫瘤作用。Myers等在Meth．Enzym．198277-290(1991)中綜述了抗neu抗體的生物效應(yīng)。另可參見(jiàn)WO94／22478，1994年10月13日公開(kāi)。
Hudziak等，Mol．Cell．Biol．9(3)1165-1172(1989)描述了一組抗ErbB2抗體的產(chǎn)生，該抗體用人乳房腫瘤細(xì)胞系SKBR3來(lái)作性質(zhì)鑒定。SKBR3細(xì)胞在接觸抗體后的細(xì)胞相對(duì)增殖可通過(guò)72小時(shí)后細(xì)胞單層的結(jié)晶紫染色來(lái)測(cè)定。通過(guò)該試驗(yàn)，測(cè)得抗體4D5有最大的抑制效果，它可抑制56％的細(xì)胞增殖。該組中的其它抗體(包括7C2和7F3)在該試驗(yàn)中降低細(xì)胞增殖的程度較低。Hudziak等的結(jié)論是，4D5抗體對(duì)SKBR3細(xì)胞的作用是細(xì)胞靜止作用而非細(xì)胞毒性，因?yàn)樵趶呐囵B(yǎng)基中除去抗體后SKBR3細(xì)胞恢復(fù)成接近正常的生長(zhǎng)速度。另發(fā)現(xiàn)，抗體4D5使得p185erbB2過(guò)度表達(dá)的乳房腫瘤細(xì)胞系對(duì)于TNF-α胞毒效應(yīng)敏感。另見(jiàn)WO89／06692，1989年7月27日公開(kāi)。Hudziak等的文獻(xiàn)中所討論的抗ErbB2抗體在以下各文獻(xiàn)中也有所表述Fendly等，CancerResearch 501550-1558(1990)；Kotts等，In Vitro 26(3)59A(1990)；Sarup等，GrowthRegulation 172-82(1991)；Shepard等，J．Clin．Immunol．11(3)∶117-127(1991)；Kumar等，Mol．Cell．Biol．11(2)979-986(1991)；Lewis等，Cancer Immunol．Immunother．37255-263(1993)；Pietras等，Oncogene 91829-1838(1994)；Vitetta等，Cancer Research545301-5309(1994)；Sliwkowski等，J．Biol．Chem．269(20)14661-14665(1994)；Scott等，J．Biol．Chem．26614300-5(1991)；和D’souza等，Proc．Natl．Acad．Sci．917202-7206(1994)。
Tagliabue等，Int．J．Cancer47933-937(1991)描述了兩種抗體，它們是根據(jù)對(duì)過(guò)度表達(dá)ErbB2的肺腺癌細(xì)胞系(Calu-3)的反應(yīng)性選出的。發(fā)現(xiàn)其中一種抗體(稱為MGR3)可內(nèi)化、誘導(dǎo)ErbB2的磷酸化并在體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
McKenzie等Oncogene 4543-548(1989)制得了一組有不同表位特異性的抗ErbB2抗體，其中包括命名為T(mén)A1的抗體。發(fā)現(xiàn)該TA1抗體能引起ErbB2胞吞作用的加速(參見(jiàn)Maier等，Cancer Res．515361-5369(1991))。Bacus等MolecularCarcinogenesis 3350-362(1990)報(bào)道了TA1抗體誘導(dǎo)乳房癌細(xì)胞系A(chǔ)U-565(過(guò)度表達(dá)erbB2基因的細(xì)胞系)和MCF-7(不過(guò)度表達(dá)erbB2基因的細(xì)胞系)的成熟。發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)和獲得成熟表型受到抑制，與細(xì)胞表面ErbB2受體水平的減少和細(xì)胞質(zhì)中受體水平暫時(shí)升高有關(guān)。
Stancovski等PNAS(USA)888691-8695(1991)獲得了一組抗ErbB2的抗體，將這些抗體腹膜內(nèi)注射入裸鼠中，評(píng)價(jià)了其對(duì)erbB2基因過(guò)度表達(dá)所轉(zhuǎn)化的小鼠成纖維細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)的作用。對(duì)于四種抗體檢測(cè)到有不同的腫瘤抑制水平，但是一種抗體(N28)卻持續(xù)地刺激腫瘤生長(zhǎng)。單克隆抗體N28明顯誘導(dǎo)ErbB2受體磷酸化，而其它四種抗體通常表現(xiàn)出低的或不表現(xiàn)出磷酸化誘導(dǎo)活性。對(duì)于抗ErbB2抗體對(duì)SKBR3細(xì)胞增殖的作用也作了評(píng)價(jià)。在該SKBR3細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，與對(duì)照相比，有兩種抗體(N12和N29)降低了細(xì)胞增殖。評(píng)價(jià)了各種抗體通過(guò)依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)和依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)體外誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的能力，該篇論文的作者的結(jié)論是抗體的抑制功能顯然并不是由CDC或ADCC所致。
Bacus等在Cancer Research 522580-2589(1992)中進(jìn)一步對(duì)前文Bacus等(1990)和Srancovski等所述的抗體進(jìn)行了性質(zhì)鑒定。該鑒定延伸了Stancovski等的研究，評(píng)價(jià)了給攜帶有過(guò)度表達(dá)人ErbB2的小鼠成纖維細(xì)胞的裸鼠靜脈注射這些抗體后的作用。在他們的早期研工作中發(fā)現(xiàn)，N28加速了腫瘤生長(zhǎng)，而N12和N29則明顯抑制表達(dá)ErbB2的細(xì)胞的生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)N24抗體也有部分腫瘤抑制作用。Bacus等還測(cè)試了這些抗體促進(jìn)人乳房癌細(xì)胞系A(chǔ)U565和MDA-MB453(過(guò)度表達(dá)ErbB2)以及MCF-7(含有低水平的此受體)中成熟表型的能力。Bacus等發(fā)現(xiàn)，腫瘤的體內(nèi)抑制與細(xì)胞分化相關(guān)；腫瘤刺激性抗體N28對(duì)分化沒(méi)有作用；N12、N29和N24抗體的腫瘤抑制作用與它們誘導(dǎo)的分化程度相關(guān)。
Xu等Int．J．Cancer 53401-408(1993)評(píng)價(jià)了一組抗ErbB2抗體的表位結(jié)合特異性，及其抑制不依賴于貼壁和依賴于貼壁的SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)(通過(guò)單個(gè)抗體和組合)、調(diào)節(jié)細(xì)胞表面ErbB2、以及抑制配體刺激的不依賴于貼壁生長(zhǎng)的能力。另見(jiàn)WO94／00136，1994年1月6日公開(kāi)，和Kasprzyk等，Cancer Research 522771-2776(1992)關(guān)于抗ErbB2抗體的組合物。另外，在Hancock等Cancer Res．514575-4580(1991)；Shawver等，Cancer Res．541367-1373(1994)；Arteaga等Cancer Res．543758-3765(1994)和Harwerth等J．Biol．Chem．26715160-15167(1992)中討論了其它抗ErbB2抗體。
一種重組的人化抗ErbB2單克隆抗體(鼠抗ErbB2抗體4D5的人化版本，稱為rhuMAb HER2或HERCEPTIN)在患ErbB2過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳房癌、已經(jīng)接受廣泛的抗癌治療的患者中表現(xiàn)出有臨床活性(Baselga等人，J．Clin．Oncol．14737-744)。
ErbB2過(guò)度表達(dá)通常被認(rèn)為是預(yù)后不良(尤其是在患有涉及腋淋巴結(jié)的原發(fā)性疾病的患者中)的預(yù)報(bào)(Slamon等人，和，同上；Ravdin和Chamness，Gene15919-27；以及Hynes和Stern，Biochim Biophys Acta 1198165-184)，并且與對(duì)激素治療和化療劑(包括CMF(環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶)以及蒽環(huán)類抗生素)的敏感性和／或抗性有關(guān)(Baselga等人，Oncology 11(3 Suppl 1)43-48)。然而，盡管ErbB2過(guò)度表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，HER2-陽(yáng)性患者對(duì)taxans治療有臨床反應(yīng)的可能性比HER2-陰性患者好3倍(Ibid)。rhuMab HER2表現(xiàn)出能增強(qiáng)帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)和阿霉素抗裸鼠中乳房癌異體移植物的活性，該裸鼠中注射了表達(dá)高水平HER2的人乳房腺癌細(xì)胞(Baselga等人，Breast Cancer，Proceedings ofASCO，13卷，摘要53)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療以ErbB2過(guò)度表達(dá)為特征的疾病，其基于這樣一個(gè)認(rèn)識(shí)，盡管用抗ErbB2抗體治療能明顯增強(qiáng)常用化療劑的臨床效果，但是給予抗ErbB2抗體會(huì)加重己被視為是蒽環(huán)類抗生素衍生物副作用的心肌功能紊亂綜合征。
因此，本發(fā)明涉及一種治療易患或經(jīng)診斷患有特征為ErbB2受體過(guò)度表達(dá)的疾病患者的方法，該方法包括在蒽環(huán)類抗生素衍生物不存在下，給予患者治療有效量的抗ErbB2抗體與化療劑的組合物，該化療劑不是蒽環(huán)類抗生素衍生物(如阿霉素或表柔比星)。
所治疾病宜為以ErbB2受體過(guò)度表達(dá)為特征的良性或惡性腫瘤，例如癌癥如乳房癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞性肺癌、非小細(xì)胞性肺癌、腸胃癌、胰癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌和各類頭部和頸部癌?；焺┮藶樗怂鞯?taxoid)，如TAXOL(帕利他塞)或TAXOL衍生物。
盡管抗ErbB2抗體在較佳實(shí)施方案中的抗增生效應(yīng)是足夠的，但是抗ErbB2抗體能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或凋亡。較佳的抗ErbB2抗體結(jié)合ErbB2受體的胞外結(jié)構(gòu)域，較佳的是結(jié)合ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域序列中的表位4D5或3H4。更佳的，抗體是抗體4D5，最佳的是人化形式。
本發(fā)明的方法特別適合治療以ErbB2受體過(guò)度表達(dá)為特征的乳房或卵巢癌。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種制品，它包含一個(gè)容器，容器中的成分包含抗ErbB2抗體，任選地容器上還有或附有說(shuō)明該組合物可用來(lái)治療ErbB2受體過(guò)度表達(dá)為特征的病癥的標(biāo)簽，以及包裝插頁(yè)，該插頁(yè)有避免采用蒽環(huán)類抗生素化療劑與本組合物組合的說(shuō)明。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域的表位圖譜，它通過(guò)截短突變體分析和定點(diǎn)誘變(Nakamura等，J．of Virology 67(10)6179-6191(1993年10月)；Renz等，J．Cell．biol．125(6)1395-1406(1994年6月))而測(cè)得?？乖鲋车膯慰寺】贵w4D5和3H4卻結(jié)合于跨膜結(jié)構(gòu)域附近。用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)從cDNA制得各種ErbB2-ECD截短物或點(diǎn)突變。ErbB2突變體在哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒中被表達(dá)成gD融合蛋白。該表達(dá)質(zhì)粒采用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子／增強(qiáng)子以及位于插入cDNA下游的SV40終止子和聚腺苷酸化信號(hào)。將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入293S細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染1天后，使細(xì)胞在不含甲硫氨酸和半胱氨酸、含有1％透析過(guò)的胎牛血清和各25μCi35S甲硫氨酸和35S半胱氨酸的低葡萄糖DMEM中通過(guò)新陳代謝進(jìn)行標(biāo)記過(guò)夜。收集上清，在上清液中加入ErbB2單克隆抗體或?qū)φ湛贵w，4℃培育2-4小時(shí)后收集上清液。使復(fù)合物沉淀，施加到10-20％Tricine SDS梯度凝膠上，在100V下電泳。將凝膠電泳印跡到膜上并通過(guò)放射自顯影來(lái)分析。SEQID NO8和9分別顯示了3H4和4D5表位。
圖2示出了ErbB2結(jié)構(gòu)域1的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。粗體氨基酸表示經(jīng)缺失作圖測(cè)得的單抗7C2和7F3識(shí)別的表位位置，即“7C2／7F3表位”(SEQ ID NO2)。
較佳實(shí)施方案詳述Ⅰ．定義術(shù)語(yǔ)“HER2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”可互換使用。除非另有所述，本文所用的術(shù)語(yǔ)“ErbB2”、“c-Erb-B2”和“HER2”指人蛋白，“her2”、“erbB2”和“c-erb-B2”指人基因。人erbB2基因和ErbB2蛋白在例如Semba等PNAS(USA)826497-6501(1985)和Yamamoto等Nature319230-234(1986)(Genebank登錄號(hào)X03363)中有所描述。ErbB2包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1-4)。
“表位4D5”是ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域中與抗體4D5(ATCC CRL 10463)結(jié)合的區(qū)域。該表位毗鄰ErbB2的跨膜區(qū)。為篩選與4D5表位結(jié)合的抗體，可采用如《抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)所述的常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)?；蛘?，可作表位圖(見(jiàn)圖1)，以評(píng)價(jià)該抗體是否與ErbB2的4D5表位(即大約殘基529左右，如殘基561至625區(qū)域內(nèi)的任何一個(gè)或多個(gè)殘基)結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“表位3H4”指ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域中與抗體3H4結(jié)合的區(qū)域。該表位顯示在圖1中，其包括ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域之氨基酸序列中約541至599的殘基。
術(shù)語(yǔ)“表位7C2／7F3”是ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域N端與7C2和／或7F3抗體(兩者均保藏于ATCC，見(jiàn)下文)結(jié)合的區(qū)域。為了篩選與7C2／7F3表位結(jié)合的抗體，可采用如《抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)所述的常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)?；蛘?，可用表位作圖來(lái)確定該抗體是否與ErbB2上的7C2／7F3表位(即ErbB2中大約殘基22至53區(qū)域(SEQ ID NO2)中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基)結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”或“能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”指抗體使活細(xì)胞變成不能存活之細(xì)胞的能力。這里的“細(xì)胞”是表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞，尤其是過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞。與同組織類型的非癌細(xì)胞相比，過(guò)度表達(dá)ErbB2的細(xì)胞具有明顯高出正常的ErbB2水平。較佳的，該細(xì)胞是癌細(xì)胞，如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰或膀胱的癌細(xì)胞。在體外，細(xì)胞可以是SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞。細(xì)胞的體外死亡可在沒(méi)有補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞存在下測(cè)知，以區(qū)別依賴于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)或依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。這樣，可用熱滅活血清(即沒(méi)有補(bǔ)體)和沒(méi)有免疫效應(yīng)細(xì)胞存在下，來(lái)測(cè)試細(xì)胞死亡。為了確定抗體是否能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，通過(guò)碘化丙錠(PI)、臺(tái)盼藍(lán)(參見(jiàn)，Moore等，Cytotechnology 171-11(1995))或7AAD的吸收相對(duì)于未經(jīng)處理細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)膜完整性的喪失程度。較佳的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體是在“BT474細(xì)胞的PI吸收試驗(yàn)”中誘導(dǎo)PI吸收的那些抗體。
術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡”或“能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡”指抗體誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的能力，它通過(guò)與膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合、DNA片段化、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞裂解和／或形成膜泡囊(稱為凋亡小體(apoptotic body))來(lái)確定。細(xì)胞是過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞?！凹?xì)胞”宜為腫瘤細(xì)胞，如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰或膀胱的癌細(xì)胞。在體外，細(xì)胞可以是SKBR3、BT474、Calu3細(xì)胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞?？梢杂酶鞣N方法來(lái)評(píng)價(jià)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)。例如，可通過(guò)膜聯(lián)蛋白結(jié)合來(lái)測(cè)定磷脂酰絲氨酸(PS)的轉(zhuǎn)運(yùn)；可通過(guò)DNA梯來(lái)評(píng)價(jià)DNA片段化，如本文實(shí)施例所述；可通過(guò)亞二倍體細(xì)胞的增長(zhǎng)評(píng)價(jià)胞核／染色質(zhì)凝聚以及DNA片段化。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗體最好是，在“采用BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗(yàn)”(見(jiàn)下文)中，與未經(jīng)處理細(xì)胞相比，能誘導(dǎo)出約2至50倍(較佳的為5至50倍，最佳的約10-50倍)的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體。
有時(shí)，促細(xì)胞凋亡性抗體是阻斷HRG結(jié)合／激活ErbB2／ErbB3復(fù)合物的抗體(如7F3抗體)。在其它場(chǎng)合，該抗體是不明顯阻斷HRG激活ErbB2／ErbB3受體復(fù)合物的抗體(如7C2)。另外，抗體可以象7C2那樣，在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)，不會(huì)大大減少S期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(如只使這些細(xì)胞百分?jǐn)?shù)相對(duì)于對(duì)照減少約0-10％的抗體)。
感興趣的抗體可以象7C2那樣，與人ErbB2特異性結(jié)合，且不與其它蛋白(如erbB1、erbB3和／或erbB4基因編碼的蛋白)發(fā)生顯著的交叉反應(yīng)。有時(shí)，此抗體可能不與大鼠neu蛋白(如Schecter等，Nature 312513(1984)和Drebin等，Nature312545-548(1984)中所述的)發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)。在該種實(shí)施方案中，此抗體與這些蛋白結(jié)合(如細(xì)胞表面與內(nèi)源性受體結(jié)合)的程度將低于10％(經(jīng)熒光素激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)測(cè)得)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“遺傳調(diào)節(jié)蛋白(heregulin，HRG)”指激活ErbB2-ErbB3和ErbB2-ErbB4蛋白復(fù)合物(即在結(jié)合到其上時(shí)誘導(dǎo)復(fù)合物中酪氨酸殘基磷酸化)的多肽。該術(shù)語(yǔ)中包括的各種遺傳調(diào)節(jié)蛋白多肽公開(kāi)在(例如)Holmes等Science，2561205-1210(1992)；WO 92／20798；Wen等，Mol．Cell．Biol．，14(3)1990-1919(1994)；和Marchionni等，Nature，362312-318(1993)中。該術(shù)語(yǔ)包括天然存在的HRG多肽的生物活性片段和／或變體，如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(如HRGβ1177-244)。
術(shù)語(yǔ)“ErbB2-ErbB3蛋白復(fù)合物”和“ErbB2-ErbB4蛋白復(fù)合物”是ErbB2受體分別與ErbB3受體或ErbB4受體非共價(jià)關(guān)聯(lián)的寡聚物。當(dāng)表達(dá)這兩種受體的細(xì)胞接觸HRG時(shí)形成了該復(fù)合物，它可通過(guò)免疫沉淀來(lái)分離獲得，可用SDS-PAGE(如Sliwkowski等，J．Biol Chem．，269(20)14661-14665(1994)所述)來(lái)分析。
“抗體(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。抗體對(duì)特異抗原表現(xiàn)出結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺少抗原特異性的抗體樣分子。例如，淋巴系統(tǒng)可產(chǎn)生低水平的后一類多肽，而骨髓瘤可產(chǎn)生水平提高的該類多肽。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與一條重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有一個(gè)可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有一個(gè)可變區(qū)(VL)，另一端有一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。據(jù)信特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語(yǔ)“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，應(yīng)用于各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在抗體的整個(gè)可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè)FR區(qū)，它們大致上呈β-折疊構(gòu)型，由三個(gè)CDR相連，這些CDR形成環(huán)來(lái)連接β折疊結(jié)構(gòu)，在某些情況下可形成β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的CDR通過(guò)FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見(jiàn)Kabat等，NIH Publ．No．91-3242，Vol．I，647-669頁(yè)(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如抗體在依賴于抗體的細(xì)胞毒性中的參與作用。
木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生了兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，每個(gè)片段有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))以及一個(gè)殘余的“Fc”片段(該名稱反映了其容易結(jié)晶的能力)。用胃蛋白酶處理產(chǎn)生了一個(gè)F(abb＇)2片段，該片段有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并仍能交聯(lián)抗原。
“Fv”是最小抗體片段，它含有完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)緊密非共價(jià)關(guān)聯(lián)的二聚物組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個(gè)CDR相互作用，在VH-VL二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)CDR共同地賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或Fv的一半，只包含對(duì)抗原有特異性的三個(gè)CDR)也能識(shí)別并結(jié)合抗原，雖然其親和力比整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)低。
Fab片段還含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab′片段與Fab片段不同，其重鏈CH1區(qū)的羧基端加入了幾個(gè)殘基，其中包括來(lái)自鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab′-SH在這里被命名為Fab′，其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基帶有一個(gè)游離的巰基。F(ab′)2抗體片段最初是以Fab′片段對(duì)的形式產(chǎn)生的，在其間有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)方式也是己知的。
脊椎動(dòng)物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。
根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
術(shù)語(yǔ)“抗體”具有最廣泛的含義，其具體包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)，以及具有所需生物活性的抗體片段。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，較佳的是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；二抗體(diabody)；線性抗體(Zapata等，Protein Eng．8(10)1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；和抗體片段形成的多特異性抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從一類基本均一抗體獲得的抗體，即該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體是高特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)(多克隆)抗體制劑(通常是包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或可用重組DNA方法(例如參見(jiàn)美國(guó)專利No．4，816，567)制得?！皢慰寺】贵w”也可用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J．Mol．Biol．，222581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離獲得。
本文的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)(其中重鏈和／或輕鏈的一部分與衍生自該特定種類或?qū)儆谔囟ǖ目贵w類或亞類的抗體序列相同或同源，而鏈的其余部分與衍生自另一種類或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體對(duì)應(yīng)序列同源)以及該抗體的片段，只要該片段顯示有所需的生物活性即可(美國(guó)專利No．4，816，567；Morrison等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，816851-6855(1984))。
“人化”形式的非人(如小鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合序列)，它們含有非人免疫球蛋白的最小序列。對(duì)于大多數(shù)情況，人化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)中的受者互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被非人源(供者抗體)(例如有所需特異性、親和力和活性的小鼠、大鼠或家兔)抗體的CDR殘基代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)被對(duì)應(yīng)的非人殘基代替。另外，人化的抗體可包括既不存在于受者抗體、又不存在于導(dǎo)入的CDR或構(gòu)架序列中的殘基。作這些修飾能進(jìn)一步提高和最大化抗體的性能。通常，人化抗體包含了基本上(至少一個(gè)、通常兩個(gè))的所有的可變區(qū)，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人化抗體最好還包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的Fc部分。更詳細(xì)的情況可參見(jiàn)Jones等，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr．Op．Struct．Biol．，2593-596(1992)。人化抗體包括PRIMATIZEDTM抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)可從通過(guò)用感興趣抗原免疫接種獼猴制得的抗體衍生獲得。
“單鏈Fv”或"sFv"抗體片段包括抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)存在于一條多肽鏈中。較佳的，F(xiàn)v多肽還包括VH和VL區(qū)間的多肽接頭，該接頭可使sFv形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv綜述可見(jiàn)Pluckthun，《單克隆抗體的藥物學(xué)》，113卷，Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag，New York，269-315頁(yè)(1994)。
術(shù)語(yǔ)“二抗體”指有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包括的一個(gè)重鏈可變區(qū)(VH)與一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VL)相連于同一條多肽鏈(VH-VL)中。采用一個(gè)短得無(wú)法使同一鏈上兩個(gè)區(qū)之間產(chǎn)生配對(duì)的接頭，迫使該區(qū)域與另一鏈中的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)，而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。二抗體在例如EP404，096；WO93／11161；和Hollinger等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，906444-6448(1993)中有更詳細(xì)的描述。
“分離”的抗體是已被鑒定并從其天然環(huán)境成分中分離和／或回收獲得的抗體。其天然環(huán)境中的污染成分是會(huì)干擾該抗體診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，它可能包括酶、激素和其它蛋白類或非蛋白類溶解物。在較佳的實(shí)施方案中，抗體將被純化至(1)含有超過(guò)95％(重量)的抗體(經(jīng)Lowery方法測(cè)得)，最佳的為大于99％(重量)；(2)足以獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基(用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀測(cè)得)；或(3)在還原或非還原的條件下、經(jīng)SDS-PAGE以考馬斯亮藍(lán)或更佳的銀染法測(cè)定是均一的。分離的抗體包括重組細(xì)胞中的原位抗體，因?yàn)樵摽贵w天然環(huán)境中的至少一種成分不存在。然而，分離的抗體通?？捎弥辽僖环N純化步驟制得。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)Fc區(qū)的一個(gè)表位，它負(fù)責(zé)提高IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。
“治療”指治療和預(yù)防措施。那些需要治療的對(duì)象是那些已經(jīng)患有疾病以及有待預(yù)防疾病的對(duì)象。
需要治療的“哺乳動(dòng)物”指分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)、動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)動(dòng)物，或?qū)櫸铮绻?、馬、貓、奶牛等。較佳的哺乳動(dòng)物是人。
“疾病”是受益于抗ErbB2抗體治療的任何疾病。這包括慢性和急性疾病或失調(diào)，包括使哺乳動(dòng)物易患所述疾病的那些病理性狀態(tài)。本文待治療的非限制性疾病例子包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴惡性腫瘤；神經(jīng)、膠質(zhì)、星形膠質(zhì)、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞性、上皮性、基質(zhì)和囊胚腔疾?。缓脱装Y、血管生成性和免疫性疾病。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指具有抗增殖效果的任何用量。較佳的，該治療有效量具有凋亡活性，或能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，該細(xì)胞宜為良性或惡性腫瘤細(xì)胞，具體是癌細(xì)胞。效果可用常規(guī)方式檢測(cè)，這取決于待治療的疾病。對(duì)于癌癥治療，例如可通過(guò)評(píng)價(jià)疾病進(jìn)展的時(shí)間或測(cè)定反應(yīng)速率(RR)(見(jiàn)下文實(shí)施例)來(lái)測(cè)定效果。
術(shù)語(yǔ)“癌”和“癌的”指哺乳動(dòng)物中通常以細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)調(diào)控為特征的生理性狀態(tài)。癌的例子包括(但不局限于)癌瘤、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞性肺癌、非小細(xì)胞性肺癌、腸胃癌、胰癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳房癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌瘤和各類頭部和頸部癌。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性試劑”指能抑制或阻止細(xì)胞功能和／或破壞細(xì)胞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)包括放射性同位素(如I131、I125、Y90和Re186)、化療劑和毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物的酶活性毒素或其片段。
“化療劑”是用于治療癌癥的化學(xué)物質(zhì)?；焺┑睦影ò⒚顾?、表柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷酰胺(CYTOXANTTM)、硫替哌、白清安、塔克索德(例如，帕利他塞(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(Taxotere，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance))、氨甲碟呤、順鉑、長(zhǎng)春堿、博來(lái)霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、鹽酸米托蒽醌(Mitoxantrone)、長(zhǎng)春花新堿、維諾瑞賓(Vinorelbine)、卡鉑(Carboplatin)、表鬼臼毒素噻吩糖苷、道諾霉素、洋紅霉素、氨基碟呤、更生霉素、絲裂霉素、埃斯波霉素(見(jiàn)美國(guó)專利No．4，675，187)、苯丙氨酸氮芥和其它相關(guān)的氮芥子類。本定義中還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制作用于腫瘤的激素的激素制劑，如他莫昔芬和奧那普斯通(onapristone)。
化療劑的其它例子包括磺酸烷酯，如英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替哌；氮雜環(huán)丙烷和甲蜜胺類，包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、和三甲基蜜胺；氮芥如，苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺、雌莫司汀、二氯甲二乙胺、氧氮芥鹽酸鹽、諾凡比星(novembichin)、膽甾醇對(duì)苯乙酸氮芥、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，如亞硝基脲氮芥、氯唑星(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司?。豢股?，如阿克拉霉素、放線菌素、胺茴霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸、放線菌素C、刺孢霉素、卡拉星(carabicin)、嗜癌菌素、色霉素、6-重氮-5氧代-L-正亮氨酸、道諾霉素、菌酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、潑非洛霉素(potfiromycin)、嘌羅霉素、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司它丁、佐柔比星、慶大霉素；葉酸類似物，如德諾蝶呤(denopterin)、碟羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、噻密普啉(thiamiprine)、硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類似物，如環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、多西氟啶(doxifluridine)、依諾他濱和氟尿苷；雄激素，如二甲睪酮、屈他雄酮丙酮酸、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺，如氨基格魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，如frolinic acid；醋葡醛內(nèi)酯、磷酰胺醛糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生群；艾德噻(edatraxate)；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；福尼星(elfomithine)；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；硝基胺；噴司它?。槐郊{米特(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲苯肼；PSK；雷佐生；西唑喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2′-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；苯丁酸氮芥；加西它賓(gemcitabine)；6-硫代鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；鉑；新霉酰胺；諾維通(novantrone)；噻洛達(dá)(xeloda)；依邦洛內(nèi)(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；視黃酸；卡普它賓(capecitabine)、以及上述物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
調(diào)節(jié)或抑制作用于腫瘤的激素的激素試劑的其它例子包括其它抗雌激素類，如雷洛昔吩(Evista)、芳族酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基三苯氧胺、曲沃西芬、凱西酚(keoxifene)以及LY 117018；以及抗雄激素類，如氟他胺和尼魯米特；以及上述物質(zhì)藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)抑制劑”指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞(尤其是過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞)生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此該生長(zhǎng)抑制劑可明顯減少S期中過(guò)度表達(dá)ErbB2的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。生長(zhǎng)抑制劑例子包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展(S期以外處)的試劑，如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的試劑。典型的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春花堿類(長(zhǎng)春花新堿和長(zhǎng)春花堿)、TAXOL、和拓?fù)洧蛐鸵种苿┤绨⒚顾?、表柔比星、道諾紅霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和博來(lái)霉素。使G1停滯的那些試劑也將溢出(spill over)到S期停滯，例如DNA烷基化試劑如三苯氧胺、強(qiáng)的松、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲碟呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。進(jìn)一步的信息可在《癌的分子基礎(chǔ)》，Mendelsohn和Israel編輯，Chapter 1，名稱為“細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、癌基因和抗腫瘤藥物”，Murakami等，(WB SaundersPhiladelphia，1995)，尤其是第13頁(yè)。4D5抗體(及其功能等價(jià)物)也可用于此目的。
“阿霉素”是一種蒽環(huán)類抗生素。阿霉素的化學(xué)全名為(8S-順式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來(lái)蘇糖-己糖吡喃糖基)氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥乙?；?-1-甲氧基-5，12-萘二酮。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是由一類細(xì)胞釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的遺傳術(shù)語(yǔ)。這些細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫酰基人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素(如促卵泡激素(FSH)；促甲狀腺素(TSH)和促黃體素(LH))；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤(pán)催乳素；腫瘤壞死因子α和β；米勒抑制物；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(如NGF-β)；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)；胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ和Ⅱ；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactor)；干擾素(如干擾素α；β和γ)；集落刺激因子(CSF)(如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF))；白細(xì)胞介素(IL)(如IL-1；IL-1α；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-8；IL-9；IL-11；IL-12)；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子(包括LIF和盒配體(KL，kit ligand))。本文所用的術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然的或重組細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等價(jià)物。
本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)“前體藥物”指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，它對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性比親代藥物低，并能受酶激活成為或轉(zhuǎn)變?yōu)槌筛呋钚缘挠H代形式。例如參見(jiàn)，Wilman，″癌癥化療中的前體藥物″biochemical Society Transactions，14，pp．375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，″前體藥物一種定向輸送藥物的化學(xué)方法″，Directed Drug Delivery，Borchardt等，(編輯)，pp．247-267，HumanaPress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括(但不局限于)含磷酸酯的前體藥物、含硫代磷酸酯的前體藥物、含硫酸酯的前體藥物、含肽的前體藥物、D-氨基酸修飾的前體藥物、糖基化的前體藥物、含β-內(nèi)酰胺的前體藥物、含有任選取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或含有任選取代的苯基乙酰胺的前體藥物、能轉(zhuǎn)變成更具細(xì)胞毒性游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可衍生成前體藥物形式用于本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物例子包括(但不局限于)上述那些化療劑。
“固相”指本發(fā)明抗體可以粘附的非水性基質(zhì)。本文中固相例子包括部分或全部由玻璃(如孔徑控制的玻璃)、多糖(如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些例子中，根據(jù)上下文，固相可包括測(cè)試板的孔；在其它的例子中，它可以是純化柱(如親和層析柱)。該術(shù)語(yǔ)也包括如美國(guó)專利No．4，275，149中公開(kāi)的分散顆粒的不連續(xù)固相。
“脂質(zhì)體”是由各類脂質(zhì)、磷脂和／或表面活性劑組成的用來(lái)將藥物(如本文公開(kāi)的抗ErbB2抗體，以及任選的化療劑)傳遞給哺乳動(dòng)物的小囊泡。脂質(zhì)體的組分通常以雙層形式排列，這與生物膜的脂類排列方式類似。
術(shù)語(yǔ)“包裝插頁(yè)”用來(lái)指按照慣例包括在治療產(chǎn)品市售包裝內(nèi)的說(shuō)明書(shū)，它含有的信息是關(guān)于適應(yīng)癥、用途、劑量、給藥方式、禁忌癥和／或關(guān)于使用這些治療產(chǎn)品的警告。
Ⅱ．抗ErbB2抗體的產(chǎn)生下面將描述用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明抗體的典型技術(shù)方案。用來(lái)生產(chǎn)抗體的ErbB2抗原可以是，例如，可溶形式的ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域或含有所需表位的其一部分。或者，可用在細(xì)胞表面表達(dá)ErbB2的細(xì)胞(如被轉(zhuǎn)化能過(guò)度表達(dá)ErbB2的NIH-3T3細(xì)胞；或癌細(xì)胞系，如SKBR3細(xì)胞，見(jiàn)Stancovski等，PNAS(USA)888691-8695(1991))來(lái)生產(chǎn)抗體?？捎脕?lái)生產(chǎn)抗體的其它形式的ErbB2是本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可知的。
(ⅰ)多克隆抗體最好是通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)的抗原和佐劑，在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗體。利用雙功能或衍生化試劑(例如磺基琥珀酰亞胺馬來(lái)酰亞胺苯甲氧酯(通過(guò)半胱氨酸殘基來(lái)偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR(其中R和R1是不同的烷基))，可以將相關(guān)的抗原與在待免疫接種動(dòng)物中有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑)偶聯(lián)起來(lái)。
用抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物對(duì)動(dòng)物免疫接種，方法是混合例如100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對(duì)兔或小鼠)和3體積的Freund完全佐劑，將此溶液注射入皮內(nèi)多處部位。1個(gè)月后，以Freund完全佐劑中的肽或偶聯(lián)物原先量的1／5至1／10加強(qiáng)注射入皮下多處部位。7至14天后，對(duì)動(dòng)物取血，測(cè)定血清的抗體滴度。繼續(xù)加強(qiáng)接種動(dòng)物直至滴度升高至平臺(tái)。動(dòng)物最好是用同一抗原、但與不同蛋白和／或通過(guò)不同交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)接種。偶聯(lián)物也可在重組細(xì)胞培養(yǎng)中制成融合蛋白。另外，凝聚劑(如明礬)也適用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
(ⅱ)單克隆抗體單克隆抗體可從一類基本均一的抗體獲得，即群體中包含的各個(gè)抗體是相同的，除了可能存在的極少量天然發(fā)生的突變外。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”表示了抗體的特征，它不是無(wú)聯(lián)系抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國(guó)專利No．4，816，567)制得。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫接種小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物(如倉(cāng)鼠)，以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞，而淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫接種用蛋白的抗體?；蛘撸馨图?xì)胞可在體外受免疫。然后用合適的融合劑(如聚乙二醇)來(lái)融合淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp．59-103(Academic Press，1986))。
將這樣制得的雜交瘤細(xì)胞接種到合適的培養(yǎng)基中，使其生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基中最好含有一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤培養(yǎng)基中通常加入次黃嘌呤、氨基碟呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)抑制了HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
較佳的骨髓瘤細(xì)胞是能有效融合、能支持所選擇的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定而高水平產(chǎn)生抗體、且對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基之類的培養(yǎng)基敏感的那些細(xì)胞。其中較佳的骨髓瘤細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，如從MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤(購(gòu)自Salk InstituteCell Distribution Center，San Diego，California USA)衍生的細(xì)胞系和SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞(購(gòu)自American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA)。另外，用來(lái)生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系也已有所描述(Kozbor，J．Immunol．，1333001(1984)；Brodeur等，Monoclonal antibody Production Techniques andApplications，pp51-63(Marcel Dekker，Inc．，New York，1987))。
測(cè)定雜交瘤生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中有無(wú)針對(duì)抗原的單克隆抗體產(chǎn)生。雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性宜通過(guò)免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)(如放射性免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA))來(lái)測(cè)定。
單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等，Anal．Biochem．，107220(1980)的Scatchard分析來(lái)測(cè)定。
在鑒定了能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和／或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，通過(guò)有限稀釋步驟來(lái)亞克隆該克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding，《單克隆抗體理論和實(shí)踐》，59-103頁(yè)(Academic Press，1986))使該亞克隆生長(zhǎng)。用于該目的的合適的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞還可以腹水瘤形式在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。
用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟(如蛋白A-Sepharose，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)，將亞克隆細(xì)胞分泌的單克隆抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)液、腹水或血清中分離出來(lái)。
很容易分離獲得編碼單克隆抗體的DNA并用常規(guī)步驟對(duì)其測(cè)序(例如，用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是此類DNA的較佳來(lái)源。一旦分離出后，可將DNA置入表達(dá)載體中，然后將該載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞(如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞)中，在重組宿主細(xì)胞中合成獲得單克隆抗體。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述文獻(xiàn)包括Skerra等，Curr Opinion in Immunol．，5256-262(1993)和Pluckthum，Immunol．Res．，130151-188(1992)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從采用McCafferty等，Nature，348552-554(1990)所述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)中分離獲得抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J．Mol．Biol．，222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫(kù)來(lái)分離鼠和人抗體。以后的出版物描述了通過(guò)鏈改組(Marks等，Bio／Technology，10779-783(1992))、以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse等，Nuc．Acids．Res．，212265-2266(1993))，來(lái)產(chǎn)生高親和力(nM范圍)的人抗體。因此，這些方法是傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)分離單克隆抗體的可行的變化方案。
也可對(duì)DNA進(jìn)行修飾，例如通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列來(lái)代替同源的小鼠序列(美國(guó)專利No．4，816，567；Morrison等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，816851(1984))，或使非免疫球蛋白多肽的編碼序列的部分或全部與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)連接。
通常，用這些非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒定區(qū)，或者用它們?nèi)〈贵w中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，產(chǎn)生了一個(gè)嵌合的二價(jià)抗體，該抗體包含了對(duì)一個(gè)抗原有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)不同抗原有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
(ⅲ)人化抗體以及人抗體人化非人抗體的方法是本領(lǐng)域中熟知的。人化的抗體中宜導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)非人源氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“導(dǎo)入”殘基，它們通常取自“導(dǎo)入”可變區(qū)。人化可基本上依據(jù)Winter及其合作者(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)所述的方法進(jìn)行，用嚙齒類CDR或CDR序列來(lái)取代人抗體的對(duì)應(yīng)序列。因此，這些“人化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利No．4，816，567)，其中基本上不到一個(gè)完整的人可變區(qū)被非人動(dòng)物的對(duì)應(yīng)序列取代。在實(shí)踐中，人化抗體通常是人抗體中一些CDR殘基以及可能還有一些FR殘基被嚙齒類抗體中類似部位的殘基取代。
選擇人輕鏈和重鏈可變區(qū)來(lái)制備人化抗體對(duì)于降低抗原性來(lái)說(shuō)是非常重要的。根據(jù)所謂的“最佳配合”方法，用已知人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)來(lái)篩選嚙齒類抗體的可變區(qū)序列。然后，采用最接近嚙齒類序列的人序列作為人化抗體的人構(gòu)架區(qū)(FR)(Sims等，J．Immunol．，1512296(1993)；Chothia等，J．Mol．Biol．，196901(1987))。另一種方法采用得自所有人抗體輕鏈或重鏈特定亞組共有序列的特定構(gòu)架區(qū)。同一構(gòu)架區(qū)可用于幾個(gè)不同的人化抗體(Carter等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，894285(1992)；Presta等，J．Immnol．，1512623(1993))。
更重要的是，抗體的人化應(yīng)保留對(duì)抗原的高親和力以及其它有利的生物性能。為達(dá)到這一目的，制備人化抗體的一個(gè)較佳的方法是，利用親代序列和人化序列的三維模型分析親代序列和各種概念上(conceptual)的人化抗體。免疫球蛋白的三維模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常能獲得的和熟知的?？傻玫侥苊枋龊惋@示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。觀察這些顯示結(jié)果，就能分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能起到的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的殘基。這樣，就能從供者抗體和導(dǎo)入序列中選出FR殘基并將其組合，從而獲得所需的抗體特性(如對(duì)靶抗原的親和力提高)。通常，CDR殘基直接影響和最實(shí)質(zhì)上影響抗原結(jié)合。
或者，現(xiàn)在可以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它能經(jīng)免疫接種在沒(méi)有內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生人抗體的全部組成成份。例如，已經(jīng)描述了嵌合種系突變型小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失會(huì)完全抑制內(nèi)源性抗體產(chǎn)生。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這些種系突變型小鼠中能使其在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體。例如參見(jiàn)，Jakobovits等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno．，733(1993)。人抗體也可從噬菌體展示文庫(kù)中獲得(Hoogenboom等，J．Mol．Biol．，227381(1991)；Marks等，J．Mol．Biol．，222581-597(1991))。
(ⅳ)抗體片段制備抗體片段的各種技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來(lái)。在傳統(tǒng)上，這些片段是通過(guò)完整抗體的蛋白消化來(lái)獲得的(例如參見(jiàn)，Morimoto等，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24107-117(1992)和Brennan等，Science，22981(1985))。然而，現(xiàn)在這些片段可用重組宿主細(xì)胞來(lái)直接生產(chǎn)。例如，如上所述，抗體片段可從抗體噬菌體文庫(kù)中分離獲得?；蛘?，可從大腸桿菌中直接回收得到Fab′-SH片段，并使其化學(xué)交聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio／Technology 10163-167(1992))。根據(jù)另一種方法，F(xiàn)(ab′)2片段可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離獲得。制備抗體片段的其它方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見(jiàn)WO 93／16185。
(ⅴ)雙特異性抗體雙特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同表位有結(jié)合特異性的抗體。典型的雙特異性抗體可以與ErbB2蛋白的兩個(gè)不同的表位結(jié)合。例如，一個(gè)臂可以與ErbB2結(jié)構(gòu)域1中的表位(如7C2／7F3表位)結(jié)合，另一個(gè)可以與不同的ErbB2表位(如4D5表位)結(jié)合。其它此類抗體可以將ErbB2結(jié)合位點(diǎn)與EGFR、ErbB3和／或ErbB4結(jié)合位點(diǎn)組合起來(lái)。或者，抗ErbB2臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上觸發(fā)分子(如T細(xì)胞受體分子CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcγR)(如FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡ(CD32)和FcγRⅢ(CD16))的臂組合，以使細(xì)胞防御機(jī)制聚集于表達(dá)ErbB2的細(xì)胞上。雙特異性抗體也可用來(lái)使細(xì)胞毒性制劑定位于表達(dá)ErbB2的細(xì)胞。這些抗體具有ErbB2結(jié)合臂和細(xì)胞毒性制劑(如皂素、抗干擾素α、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻蛋白A鏈、氨甲碟呤或放射活性同位素半抗原)結(jié)合臂。雙特異性抗體可制成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是該領(lǐng)域中已知的。制備全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)方法是以兩個(gè)具有不同特異性的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)共同表達(dá)為基礎(chǔ)(Millstein等，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四雜交物)可能產(chǎn)生有10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。要純化該正確分子(通常采用親和層析方法)是相當(dāng)費(fèi)力的，且產(chǎn)量低。WO93／08829以及Traunecker等，EMBO J．103655-3659(1991)公開(kāi)了類似的方法。
根據(jù)不同的方法，使具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗體結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。最好與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合，至少包括部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。最好是至少在一個(gè)融合物中有含輕鏈結(jié)合所必需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及免疫球蛋白輕鏈(如果需要)的DNA插入分離的表達(dá)載體中，并且共同轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體中。在構(gòu)建時(shí)采用不相等比例的三種多肽鏈來(lái)提供最優(yōu)得率的實(shí)施方案中，這為調(diào)節(jié)三個(gè)多肽片段相互比例提供了更大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩個(gè)多肽鏈以相等比率表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)率，或比例無(wú)關(guān)緊要時(shí)，可以將兩個(gè)或所有三個(gè)多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體中。
在該方法的一個(gè)較佳實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂中具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈和另一臂中的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)有利于將所需的雙特異性抗體從不需要的免疫球蛋白鏈組合物中分離出來(lái)，因?yàn)槊庖咔虻鞍纵p鏈只存在于雙特異性分子的一半中，因此很容易分離。該方法公開(kāi)在WO94／04690中。制備雙特異性抗體的更詳細(xì)的情況例如可參見(jiàn)Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。根據(jù)WO96／27011中描述的另一種方法，一對(duì)抗體分子間的界面可被工程改造成使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中回收獲得的異二聚物達(dá)到最大的百分?jǐn)?shù)。較佳的界面至少包含抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的一部分。在該方法中，第一抗體分子界面上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸小側(cè)鏈被較大的側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)代替。通過(guò)用較小的側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)來(lái)代替大的氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上形成與(第一抗體中的)大側(cè)鏈大小相同或相似的補(bǔ)償性“空穴”。這就提供了一種機(jī)制使得異二聚物的產(chǎn)量高于其它不需要的最終產(chǎn)物(如均二聚物)。
雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異偶聯(lián)”的抗體。例如，異偶聯(lián)物中的一個(gè)抗體可以與親和素偶聯(lián)，另一個(gè)可以與生物素偶聯(lián)。例如，已有建議用這種抗體來(lái)使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利No．4，676，980)以及用來(lái)治療HIV感染(WO91／00360、WO92／200373和EP03089)。異偶聯(lián)抗體可用任何方便的交聯(lián)方法來(lái)制得。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域中已知的，美國(guó)專利No．4，676，980中公開(kāi)了這些交聯(lián)劑以及許多交聯(lián)技術(shù)。
從抗體片段來(lái)制備雙特異性抗體的方法在文獻(xiàn)中也已有所描述。例如，可通過(guò)化學(xué)鍵來(lái)制備雙特異性抗體。Brennan等，Science，22981(1985)描述了這樣一種方法，該方法是將完整的抗體蛋白水解斷裂成F(ab＇)2片段。在二巰基復(fù)合試劑亞申酸鈉存在下還原這些片段，使連位二巰基穩(wěn)定，從而防止分子間形成二硫鍵。然后將產(chǎn)生的Fab′片段轉(zhuǎn)變成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通過(guò)巰基乙胺還原將一個(gè)Fab＇-TNB衍生物重新轉(zhuǎn)變成Fab′-巰基。再與等摩爾量的另一個(gè)Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。制得的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。
最近的進(jìn)展實(shí)現(xiàn)了從大腸桿菌中直接回收獲得可化學(xué)交聯(lián)形成雙特異性抗體的Fab′-SH片段。Shalaby等，J．Exp．Med．，175217-225(1992)描述了全人化雙特異性抗體F(ab′)2分子的制備過(guò)程。使各Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來(lái)，然后在體外進(jìn)行定向化學(xué)交聯(lián)，形成雙特異性抗體。這樣形成的雙特異性抗體能結(jié)合過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞，并觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)人乳房腫瘤靶的裂解活性。
關(guān)于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)制備和分離雙特異性抗體片段的各種方法已有描述。例如，利用亮氨酸拉鏈可制得雙特異性抗體。Kostelny等，J．Immunol．，148(5)1547-1553(1992)。通過(guò)基因融合，使Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩個(gè)不同抗體的Fab′部分連接。還原抗體均二聚物的鉸鏈區(qū)，形成單體，然后重新氧化形成抗體異二聚物。該方法也可用來(lái)制備抗體均二聚物。Hollinger等Proc．Natl．Acad．Sci．USA，906444-6448(1993)中描述的“二抗體”技術(shù)為制備雙特異性抗體片段提供了另一種機(jī)理。這些片段包括了通過(guò)一個(gè)接頭將重鏈可變區(qū)(VH)連接到輕鏈可變區(qū)(VL)，該接頭非常短，使得同一鏈上的兩個(gè)功能域之間不能發(fā)生配對(duì)。因此，一個(gè)片段上的VH和VL功能域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH功能域配對(duì)，從而形成了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。采用單鏈Fv(scFv)二聚物來(lái)制備雙特異性抗體片段的另一種策略也已有報(bào)道。見(jiàn)Grubber等，J．Immunol．，152∶5368(1994)。
也可考慮采用有超過(guò)兩價(jià)的抗體。例如，可制得三特異性抗體。Tutt等，J．Immunol．14760(1991)。
(ⅵ)篩選所需性能的抗體上面描述了制備抗體的方法?，F(xiàn)在挑選具有本文所述性能的那些抗體。
為了選擇能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，例如相對(duì)于對(duì)照通過(guò)PI、臺(tái)盼藍(lán)或7AAD吸收的評(píng)價(jià)來(lái)表明膜完整性的喪失。較佳的測(cè)試方法是“采用BT474細(xì)胞的PI吸收試驗(yàn)”。根據(jù)該試驗(yàn)，將BT474細(xì)胞(可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rochville，MD)獲得)培育在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)Ham′s F-12(50∶50)中(添加了10％熱滅活FBS(Hyclone)和2mM L谷氨酰胺)。(這樣，該試驗(yàn)在沒(méi)有補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞存在下進(jìn)行)。將BT474細(xì)胞以每碟3×106個(gè)的密度接種到100×20mm碟中，使其粘附過(guò)夜。然后除去培養(yǎng)基，代之以單獨(dú)的新鮮培養(yǎng)基或含有10μg／ml合適單克隆抗體的培養(yǎng)基。培育細(xì)胞3天。在每次處理后，用PBS洗滌單層并用胰蛋白酶消化脫粘附。然后，4℃、1200rpm離心細(xì)胞5分鐘，將沉淀物重懸在3ml冰Ca2+結(jié)合緩沖液(10mM Hepes，pH7．4，140mM NaCl，2．5mM CaCl2)中，等分裝入35mm蓋有濾網(wǎng)的12×75試管中(每管1ml，3管為一處理組)以去除細(xì)胞凝聚塊。然后在試管中加入PI(10μg／ml)。用FACSCANTM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。選擇能誘導(dǎo)有統(tǒng)計(jì)意義水平的細(xì)胞死亡(經(jīng)PI吸收確定)的那些抗體。
為了選擇能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗體，可采用“利用BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗(yàn)”。如前段中所述的那樣，培養(yǎng)BT474細(xì)胞并接種到碟中。然后除去培養(yǎng)基，代之以單獨(dú)的新鮮培養(yǎng)基或含10μg／ml單克隆抗體的培養(yǎng)基。培育3天后，用PBS洗滌單層并用胰蛋白酶消化脫粘附。然后離心細(xì)胞，重懸于Ca2+結(jié)合緩沖液中，并如上所述等分裝入試管中進(jìn)行細(xì)胞死亡試驗(yàn)。然后在試管中加入經(jīng)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(1μg／ml)。用FACSCANTM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。選擇能誘導(dǎo)出膜聯(lián)蛋白結(jié)合有統(tǒng)計(jì)意義水平(與對(duì)照相比)的那些抗體作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗體。
除了膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗(yàn)外，還可用“利用BT474細(xì)胞的DNA染色試驗(yàn)”。為了進(jìn)行該試驗(yàn)，將前兩段中所述經(jīng)感興趣抗體處理的BT474細(xì)胞在9μg／ml HOECHST33342TM中37℃培養(yǎng)2小時(shí)，然后用MODFIT LTTM軟件(Verity Software House)在EPICS ELITETM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Coulter Corporation)上分析。誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)變化(比未處理細(xì)胞(高達(dá)100％細(xì)胞凋亡)高2倍或更高(較佳的為3倍或更高))的抗體可被選作采用該試驗(yàn)的促細(xì)胞凋亡性抗體。
為了篩選與感興趣抗體結(jié)合的ErbB2表位結(jié)合的抗體，可采用如《抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)所述的常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)。或者，可用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表位作圖。
為了鑒定在細(xì)胞培養(yǎng)中能抑制50-100％SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)的抗ErbB2抗體，進(jìn)行WO89／06692中所述的SKBR3試驗(yàn)。根據(jù)該試驗(yàn)，使SKBR3細(xì)胞在F12和DMEM培養(yǎng)基混合物(1∶1)(其中添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素鏈霉素)中生長(zhǎng)。在35mm細(xì)胞培養(yǎng)碟中接種20，000個(gè)SKBR3細(xì)胞(2ml／35mm碟)。每個(gè)碟中加入了2．5μg／ml抗ErbB2抗體。6天后，用COULTERTM電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目與未處理細(xì)胞比較。選擇抑制50-100％SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)的那些抗體，并按需與細(xì)胞凋亡性抗體組合使用。
(ⅶ)效應(yīng)器功能的工程改造在效應(yīng)器功能方面可能希望改進(jìn)本發(fā)明的抗體，以增強(qiáng)抗體在治療(例如)癌時(shí)的效果。例如，可在Fc區(qū)域中引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。這樣制得的均二聚抗體可能有改進(jìn)的內(nèi)化能力和／或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞殺傷能力和依賴于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron等，J．Exp Med．1761191-1195(1992)和Shopes，B．J．Immunol．1482918-2922(1992)。也可如Wolff等Cancer Research532560-2565(1993)描述的那樣，用異二功能性交聯(lián)劑來(lái)制備抗腫瘤活性增強(qiáng)的均二聚抗體?；蛘撸蓪⒖贵w工程改造成具有雙Fc區(qū)，從而可能增強(qiáng)補(bǔ)體裂解和ADCC能力。見(jiàn)Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
(ⅷ)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及包含與細(xì)胞毒性制劑偶聯(lián)的本文所述抗體的免疫偶聯(lián)物，該細(xì)胞毒性制劑例如有化療劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素，或其片段)、或放射活性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
用來(lái)制備此類免疫偶聯(lián)物的化療劑在上文已有描述?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自綠濃桿菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、α-八疊球菌、Aleurites fordii蛋白、代辛(diathin)蛋白、美洲商陸蛋白(PAPⅠ、PAPⅡ和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻楓樹(shù)毒素、巴豆毒素、皂苷草抑制劑、芥洛尼(gelonin)、分裂素原(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊諾霉素和三科西星(tricothecenes)。各種放射性核素可用來(lái)制備放射性偶聯(lián)的抗ErbB2抗體。例子包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
抗體與細(xì)胞毒性制劑的偶聯(lián)物可用各種雙功能蛋白偶聯(lián)劑制得，偶聯(lián)劑例如有N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、二疊氮化合物(如二(對(duì)-疊氮苯甲酰基)己二胺)、二重氮衍生物(如二(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可根據(jù)Vitetta等Science 2381098(1987)所述制備蓖麻毒蛋白的免疫毒素。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用來(lái)偶聯(lián)放射性核苷酸與抗體的典型的螯合劑。見(jiàn)WO94／11026。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以與“受體”(如鏈霉親和素)偶聯(lián)，以用來(lái)預(yù)先靶向腫瘤，其中將抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，然后用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予與細(xì)胞毒性制劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(如親和素)。
(ⅸ)免疫脂質(zhì)體本文公開(kāi)的抗ErbB2抗體也可制成免疫脂質(zhì)體。含有該抗體的脂質(zhì)體的制備方法是本領(lǐng)域中已知的，如Epstein等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，823688(1985)；Hwang等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77∶4030(1980)；和美國(guó)專利No．4，485，045和4，544，545中有所描述。美國(guó)專利No．5，013，556中公開(kāi)了循環(huán)時(shí)間增加的脂質(zhì)體。
特別有用的脂質(zhì)體可通過(guò)反向蒸發(fā)方法從包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物制得。將脂質(zhì)體擠壓通過(guò)限定孔徑的濾膜，獲得所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明的抗體Fab′片段可如Martin等，J．Biol．Chem．257286-288(1982)中所述的那樣通過(guò)二硫鍵互換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。脂質(zhì)體中可以任選地含有化療劑。見(jiàn)Gabizon等，J．National CancerInst．81(19)1484(1989)。
(ⅹ)依賴于抗體的酶介導(dǎo)的前體藥物治療(ADEPT)通過(guò)將抗體與激活前體藥物的酶(能將前體藥物(如肽基化療劑，見(jiàn)WO81／01145)轉(zhuǎn)變成有活性的抗癌藥)偶聯(lián)，本發(fā)明的抗體還可用于ADEPT。例如參見(jiàn)WO88／07378和美國(guó)專利No．4，975，278。
用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶成分包括可作用于前體藥物將其轉(zhuǎn)變成更具活性和細(xì)胞毒性形式的任何酶。
用于本發(fā)明方法的酶包括(但不局限于)用于將含磷酸酯的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含硫酸酯的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的芳基硫酸酯酶；用于將無(wú)毒性5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成抗癌藥物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫酰胺酶；用于將含肽前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的蛋白酶，如鋸齒(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)；用于轉(zhuǎn)變含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；用于將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的糖類斷裂酶，如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；用于將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；以及用于將經(jīng)苯氧乙?；虮揭阴；苌陌坊謩e轉(zhuǎn)變成游離藥物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘撸捎镁哂忻富钚缘目贵w(也稱為抗體酶(abzyme))將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離的、有活性的藥物(例如參見(jiàn)，Massey，Nature 328:457-458(1987))?？贵w-抗體酶偶聯(lián)物可如本文所述的那樣來(lái)制備，以將抗體酶遞送至腫瘤細(xì)胞群。
利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(如用上述的異雙功能交聯(lián)劑)使本發(fā)明的酶與抗ErbB2抗體共價(jià)結(jié)合?；蛘?，利用本領(lǐng)域中熟知的重組DNA技術(shù)(例如參見(jiàn)Neuberger等，Nature，312604-608(1984))，可以構(gòu)建出融合蛋白，它包含本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)和與之相連的本發(fā)明酶的至少一個(gè)功能活性部分。
(ⅹⅰ)抗體補(bǔ)救性受體結(jié)合表位的融合在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，希望采用抗體片段而不是完整的抗體，例如來(lái)提高腫瘤穿透性。在這種情況下，希望對(duì)抗體片段進(jìn)行修飾，以提高其血清半衰期。例如，這可通過(guò)在抗體片段中摻入補(bǔ)救受體結(jié)合表位(例如，通過(guò)抗體片段中合適區(qū)域內(nèi)的突變，或在肽尾端中摻入表位，然后通過(guò)DNA或肽合成融合入抗體片段末端或中部)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
制備體內(nèi)半衰期提高的這種抗體變體的系統(tǒng)性方法包括以下幾步。首先是鑒定IgG分子Fc區(qū)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位的序列和構(gòu)型。一旦確定了該表位，就可修飾感興趣抗體的序列，使其包括經(jīng)鑒定的結(jié)合表位的序列及構(gòu)型。在該序列發(fā)生突變后，測(cè)試抗體變體，看其體內(nèi)半衰期是否比原來(lái)的抗體長(zhǎng)。如果在測(cè)試時(shí)抗體變體沒(méi)有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，則再一次將其序列改變使其包括經(jīng)鑒定結(jié)合表位的序列和構(gòu)型。測(cè)試變化后的抗體是否有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，繼續(xù)該過(guò)程直至獲得表現(xiàn)出較長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的分子。
這樣被摻入到感興趣抗體中的補(bǔ)救受體結(jié)合表位是上述任何合適的表位，其特征取決于(例如)被修飾的抗體類型。該轉(zhuǎn)移應(yīng)使感興趣的抗體仍然具有本文所述的生物活性。
較佳的，該表位構(gòu)成一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域中來(lái)自Fc區(qū)的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的類似位置上。更佳的是，F(xiàn)c區(qū)中一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的三個(gè)或多個(gè)殘基被轉(zhuǎn)移。還要佳的是，該表位取自(例如IgG的)Fc區(qū)中CH2區(qū)，并被轉(zhuǎn)移到抗體CH1、CH3或VH區(qū)、或一個(gè)以上的此類區(qū)域中?；蛘撸摫砦蝗∽訤c區(qū)的CH2區(qū)，并被轉(zhuǎn)移到抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)或這兩者中。
在一個(gè)最佳的實(shí)施方案中，補(bǔ)救受體結(jié)合表位包含序列(5′到3′)PKNSSMISNTP(SEQ ID NO3)，還任選地包括選自HQSLGTQ(SEQ ID NO4)、HQNLSDGK(SEQ IDNO5)、HQNISDGK(SEQ ID NO6)或VISSHLGQ(SEQ ID NO7)的序列，尤其當(dāng)抗體片段是Fab或(Fab′)2時(shí)。在另一個(gè)最佳實(shí)施方案中，補(bǔ)救受體結(jié)合表位是含有下述序列(5′到3′)的多肽HQNLSDGK(SEQ ID NO5)、HQNISDGK(SEQ ID NO6)或VISSHLGQ(SEQ ID NO7)和序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO8)。
(ⅹⅱ)抗ErbB2抗體的純化當(dāng)采用重組技術(shù)時(shí)，抗體可產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)(周質(zhì)間隙內(nèi))或被直接分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，則第一步是(例如)通過(guò)離心或超離心來(lái)除去宿主細(xì)胞或裂解片段的顆粒碎片。Carter等，Bio／Technology 10163-167(1992)描述了分泌入大腸桿菌周質(zhì)間隙的抗體的一種分離方法。簡(jiǎn)言之，在乙酸鈉(pH3．5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下融化細(xì)胞漿狀物約30分鐘。離心除去細(xì)胞碎片。若抗體被分泌到培養(yǎng)基中，則最好首先用商業(yè)上購(gòu)得的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或MilliporePellicon的超濾裝置)濃縮該表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在前述任何步驟中均可加入抑制蛋白水解的蛋白酶抑制劑(如PMSF)，還可加入抗生素以防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)。
例如，可用羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來(lái)純化從細(xì)胞中制得的抗體組合物，其中親和層析是較佳的純化方法。蛋白A作為親和配體的合適程度取決于抗體中任何免疫球蛋白Fc區(qū)的動(dòng)物種類和同種型。蛋白A可用來(lái)純化以人γ1、γ2或γ4重鏈為基礎(chǔ)的抗體(Lindmark等，J．Immunol．Meth．621-13(1983))。對(duì)于所有小鼠同種型和人γ3，建議采用蛋白G(Guss等，EMBO J．515671575(1986))。用作親和配體附著的基質(zhì)通常是瓊脂糖，但是也可采用其它基質(zhì)。機(jī)械上穩(wěn)定的基質(zhì)(如孔徑控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)能達(dá)到比瓊脂糖更快的流速，操作時(shí)間更短。當(dāng)抗體包含CH3區(qū)時(shí)，可用Bakerbond ABXTM樹(shù)脂(J．T．Baker，Phillipsburg，NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收抗體的不同，還可采用其它蛋白純化方法，如在離子交換柱上分級(jí)、乙醇沉淀、反向HPLC、硅膠層析、陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(如聚天冬氨酸柱)上的肝素SEPHAROSETM層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何初步純化后，可對(duì)包含感興趣抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水作用層析，采用pH約2．5-4．5的洗脫緩沖液，最好是在低鹽濃度(如約0-0．25M鹽)下進(jìn)行。
C．藥物制劑將有所需純度的抗體與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制成凍干制劑或水性溶液形式的用于本發(fā)明的抗體治療劑并保藏(Remington′sPharmaceutical Sciences，16版，Osol，A．編輯(1980))?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下應(yīng)對(duì)受者沒(méi)有毒性，它們包括緩沖液，如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲季胺、苯扎氯胺、芐索氯胺、苯酚、丁基或芐基醇；對(duì)羥苯甲酸烷酯如對(duì)羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戈醇；和間-甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽平衡離子，如鈉；金屬配合物(如Zn-蛋白配合物)；和／或非離子表面活性劑，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文的制劑還可含有待治療的具體適應(yīng)征所需的一種或多種活性化合物，尤其是具有互補(bǔ)活性且相互間沒(méi)有不利影響的那些化合物。例如，在一個(gè)制劑中，還希望提供與EGFR、ErbB2(如與ErbB2上不同表位結(jié)合的抗體)、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合的抗體。或者，另外此組合物還可包含細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)抑制劑，只要該細(xì)胞毒性劑不是蒽環(huán)類抗生素衍生物(例如阿霉素或表柔比星)。這些分子應(yīng)以實(shí)現(xiàn)目的的有效劑量組合。
活性組分還可包裹在(例如)通過(guò)團(tuán)聚技術(shù)或界面聚合法制得的微膠囊中，例如分別在羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，在膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微珠、微乳劑(microemulsion)、納米級(jí)顆粒和納米級(jí)膠囊)或巨乳劑(macroemulsion)中。這些技術(shù)公開(kāi)在Remington′s Pharmaceutical Sciences 16版，編者Osol，A．(1980)中。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須無(wú)菌。這很容易通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。
可以制得緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水聚合物半滲透基質(zhì)，其中該基質(zhì)是成形制品形式，如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利No．3，773，919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不能降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯組成的可注射的微珠)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管諸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸的聚合物能持續(xù)釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間卻較短。當(dāng)膠囊化的抗體長(zhǎng)時(shí)間停留在體內(nèi)時(shí)，它們會(huì)由于暴露在37℃水分下而變性或凝聚，從而導(dǎo)致生物活性喪失，且免疫原性可能會(huì)改變?？梢愿鶕?jù)涉及的機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機(jī)理是通過(guò)硫代-二硫鍵互換而形成了分子間S-S鍵，則可通過(guò)修飾巰基殘基、自酸性溶液中凍干、控制濕度程度、采用合適的添加劑和開(kāi)發(fā)特殊的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)達(dá)到穩(wěn)定化。
Ⅳ．抗ErbB2抗體的治療本發(fā)明認(rèn)為抗ErbB2抗體可用來(lái)治療各種以ErbB2受體過(guò)度表達(dá)和／或激活為特征的各種病癥。典型的病情或疾病的例子包括良性或惡性腫瘤(如腎、肝、腎、膀胱、乳房、胃、卵巢、結(jié)直腸、前列腺、胰、肺、外陰、甲狀腺、肝細(xì)胞癌；肉瘤；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和各種頭部和頸部腫瘤)；白血病和淋巴惡性腫瘤；其它疾病，如神經(jīng)、膠質(zhì)、星形膠質(zhì)、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞性、上皮性、基質(zhì)和囊胚腔疾??；以及炎癥、血管生成和免疫疾病。
可根據(jù)已知的方法將本發(fā)明的抗體給予人患者，這些方法例如有作為藥團(tuán)的靜脈內(nèi)給藥、或通過(guò)肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑持續(xù)灌輸一定時(shí)間。靜脈給予抗體的方式是較佳的。
本發(fā)明的治療方法涉及抗ErbB2抗體與非蒽環(huán)類抗生素衍生物的化療劑的聯(lián)合給藥。聯(lián)合給藥包括共同給藥，采用分開(kāi)的制劑或一種藥物制劑，以及以任何次序的連續(xù)給藥，其中較佳的是在兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物活性時(shí)有一段時(shí)間。這些化療劑的制劑和劑量方案可根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)來(lái)使用，或可根據(jù)專業(yè)醫(yī)師的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。這些化學(xué)治療的制劑和劑量方案還公開(kāi)在ChemotherapyService Ed．，M．C．Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，MD(1992)中?；焺┛稍诮o予抗體前后或同時(shí)給予?？贵w可以與抗雌激素化合物(如三苯氧胺)或抗黃體酮化合物(如onapristone)(見(jiàn)EP616812)組合，這些分子的劑量是本領(lǐng)域中已知的。
還希望給予抗其它腫瘤相關(guān)抗原的抗體，如與EGFR、ErbB3、ErbB4、或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合的抗體?；蛘吡硗?，可以將兩種或多種抗ErbB2抗體給予患者。有時(shí)，還可將一種或多種細(xì)胞因子給予患者也許有好處。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，抗ErbB2抗體與生長(zhǎng)抑制劑一同給藥。例如，可以首先給予生長(zhǎng)抑制劑，然后再給予ErbB2抗體。然而，也可考慮同時(shí)給藥，或首先給予ErbB2抗體。生長(zhǎng)抑制劑的合適劑量是目前采用的那些劑量，而且由于生長(zhǎng)抑制劑與抗ErbB2抗體的組合作用(協(xié)同作用)，該劑量還可降低。
為預(yù)防或治療疾病，抗體的合適劑量將取決于上述待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和病程(無(wú)論給予抗體是用來(lái)預(yù)防還是治療目的)、以前的治療、患者病史以及對(duì)抗體的反應(yīng)、主治醫(yī)師的判斷?？贵w可以適當(dāng)?shù)匾淮涡曰蛟谝幌盗兄委熤薪o予患者。
根據(jù)疾病嚴(yán)重程度和類型，給予患者的最初候選抗體劑量約為1μg／kg至15mg／kg(如0．1-20mg／kg)，無(wú)論是通過(guò)一次或多次給藥還是連續(xù)灌輸。根據(jù)上述因素，典型的每日劑量大約為1μg／kg至100mg／kg或更高。對(duì)于反復(fù)給藥幾天或更長(zhǎng)時(shí)間，須取決于病征，治療持續(xù)直至病征受到所希望的抑制。然而，也可采用其它劑量方案。這種治療的進(jìn)展情況很容易通過(guò)常規(guī)技術(shù)和試驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)。
關(guān)于合適劑量的進(jìn)一步信息提供在下文實(shí)施例中。
G．產(chǎn)品的生產(chǎn)在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種含有用于治療上述疾病的物質(zhì)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包括一個(gè)容器、一個(gè)標(biāo)簽和一張包裝插頁(yè)。合適的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可用諸如玻璃或塑料之類的各種物質(zhì)制成。容器中盛放了可有效治療病征的組合物，還可以有一個(gè)無(wú)菌入口(例如，容器可以是盛靜脈用溶液的袋或有可用皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的至少一種活性劑是抗ErbB2抗體。容器上的或附帶的標(biāo)簽說(shuō)明了該組合物可用來(lái)治療所列出的病征。產(chǎn)品還可包含第二個(gè)容器，該容器中含有藥學(xué)上可接受的緩沖液，如磷酸緩沖鹽溶液、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。它還可包括商業(yè)和應(yīng)用上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭和注射器。另外，產(chǎn)品包含一張有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)，插頁(yè)包括了該組合物不能和蒽環(huán)類抗生素化療劑(如阿霉素或表柔比星)組合使用的警告。
H．材料的保藏下列雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，USA(ATCC))中抗體命名ATCC編號(hào) 保藏日期7C2 ATCC HB-122151996年10月17日7F3 ATCC HB-122161996年10月17日4D5 ATCC CRL 10463 1990年5月24日下文的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明的細(xì)節(jié)。
實(shí)施例材料和方法抗ErbB2單克隆抗體。按Fendly等Cancer Res．501550-1558(1990)和WO89／06692所述，產(chǎn)生了對(duì)ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域有特異性的抗ErbB2的IgG1κ鼠單克隆抗體4D5。簡(jiǎn)而言之，如Hudziak等，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)847159(1987)所述產(chǎn)生NIH3T3／HER2-3400細(xì)胞(每個(gè)細(xì)胞表達(dá)約1×105ErbB2個(gè)分子)，用含25mM EDTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)收獲細(xì)胞，用于免疫接種BALB／c小鼠。在第0、2、5、7周給小鼠腹膜內(nèi)注射含107細(xì)胞的0．5毫升PBS。在第9周和第13周，對(duì)抗血清能免疫沉淀32p標(biāo)記的ErbB2的小鼠腹膜內(nèi)注射經(jīng)麥芽凝集素-Sepharose(WGA)純化的ErbB2膜提取物。然后，靜脈內(nèi)注射一次0．1ml的ErbB2制劑，取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系X63-Ag8．653融合。通過(guò)ELISA和放射性免疫沉淀法篩選雜交瘤上清液的ErbB2結(jié)合能力。MOPC-21(IgGl)(Cappell，Durham，NC)，被用作同種異型匹配對(duì)照。
治療用鼠4D5抗體的人化版本(HERCEPTIN)進(jìn)行。對(duì)該人化抗體進(jìn)行工程改造，將鼠4D5抗體的互補(bǔ)決定區(qū)插入人免疫球蛋白IgG1共有序列的構(gòu)架區(qū)(IgG1)中(Carter等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 894285-4289)。所得人化抗ErbB2單克隆抗體對(duì)p185HER2有很高的親和力(Dillohiation常數(shù)[Kd]0．1 nmol／L)，在體外和人異體移植物中明顯抑制了含有高水平p185HER2的乳房癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)出依賴于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)作用，而且發(fā)現(xiàn)作為單一治療劑，對(duì)接受過(guò)廣泛先期治療的ErbB2過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳房癌患者有臨床活性。HERCEPTIN由經(jīng)基因工程改造的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系產(chǎn)生，該細(xì)胞系大規(guī)模生長(zhǎng)，并將抗體分泌到培養(yǎng)基中。用標(biāo)準(zhǔn)的層析和過(guò)濾方法從CHO培養(yǎng)基中純化獲得該抗體。對(duì)用于本研究的每批抗體進(jìn)行檢驗(yàn)，以確認(rèn)它的性質(zhì)、純度和效力，并符合“食品藥物管理局”對(duì)無(wú)菌性和安全性的要求。
合格標(biāo)準(zhǔn) 患者必須符合下列研究許可的合格標(biāo)準(zhǔn)-轉(zhuǎn)移性乳房癌-ErbB2(HER2)癌基因有過(guò)度表達(dá)(經(jīng)免疫組織化學(xué)或熒光原位雜交(FISH)測(cè)定為2+至3+)。[ErbB2的腫瘤表達(dá)可如以前所述(Slamon等人，和)的那樣，通過(guò)免疫組織化學(xué)分析從石蠟保存的患者腫瘤塊制得的一系列薄切片來(lái)測(cè)定。所用的第一檢測(cè)抗體是4D5單克隆抗體，它具有和用于治療的人化抗體相同的CDR。如果至少25％的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出特征性的p185HER2膜染色，則認(rèn)為腫瘤過(guò)度表達(dá)ErbB2]。
-通過(guò)放射照相手段、物理檢查或照片表現(xiàn)出二維可測(cè)定的疾病(包括溶解性骨病損)可測(cè)定的疾病定義為，在兩個(gè)垂直直徑中可通過(guò)物理檢查、X-射線(平片)、計(jì)算機(jī)化的X線斷層攝影術(shù)(CT)、磁共振顯影(MRI)、超聲或照片可重復(fù)測(cè)出的塊物。
成骨細(xì)胞性轉(zhuǎn)移灶、胸膜腔積液或腹水不認(rèn)為是可測(cè)定的?？蓽y(cè)定的病損最大尺寸至少為1厘米。轉(zhuǎn)移性疾病的可評(píng)價(jià)部位的敘述以及可評(píng)價(jià)部位(如肺)中的病損數(shù)目必須記錄在合適的病例報(bào)告表格(CRF)中。如果有大量肺或肝病損，則跟蹤每個(gè)部位最大的6個(gè)病損。
-能理解并愿意簽署書(shū)面表示同意的表格-婦女應(yīng)滿18周歲-通過(guò)對(duì)血液、腎、肝和代謝功能的篩選性實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)證明，候選人適合接受伴隨的細(xì)胞毒化學(xué)治療。
排除的標(biāo)準(zhǔn) 具有下列任一情況的患者應(yīng)被排除在研究之外-以前接受過(guò)轉(zhuǎn)移性乳房癌的細(xì)胞毒化學(xué)治療患者可能在以前曾接受過(guò)轉(zhuǎn)移性疾病的激素治療(如三苯氧胺)或佐劑環(huán)境中的細(xì)胞毒性治療。
-伴有的惡性腫瘤未被有效治愈-Kamofsky評(píng)分上性能狀況低于60％-懷孕的或正受護(hù)理的婦女；有可能分娩的婦女，除非經(jīng)研究者確定已有效避孕-兩側(cè)有乳房癌(原發(fā)性腫瘤必須有2+到3+的HER2過(guò)度表達(dá)，或轉(zhuǎn)移部位必須有2+到3+的HER2過(guò)度表達(dá))-在研究前30天內(nèi)使用了調(diào)查性或未經(jīng)許可的制劑-臨床上不穩(wěn)定的或有不能治療的轉(zhuǎn)移到腦部的轉(zhuǎn)移灶(例如需要放射治療)根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，選擇469位患者參加本研究。隨機(jī)地使半數(shù)患者(通過(guò)化學(xué)治療分層)另外接受HERCEPTIN抗體(見(jiàn)下文)。
給藥和劑量抗ErbB2抗體在第0天，在90分鐘期間靜脈內(nèi)給予4毫克／千克人化抗ErbB2抗體(HERCEPTIN，H)。從第7天起，患者每周在90分鐘期間靜脈內(nèi)接受2毫克／千克抗體。
化學(xué)治療患者接受過(guò)下列兩種化學(xué)治療方案之一最少6個(gè)周期，只要患者的疾病沒(méi)有進(jìn)展a)環(huán)磷酰胺和阿霉素或表柔比星(AC)，如果患者沒(méi)有在佐劑背景中接受過(guò)蒽環(huán)類抗生素治療，或b)帕利他塞(T，TAXOL)，如果患者在佐劑背景中接受過(guò)蒽環(huán)類抗生素治療。HERCEPTIN抗體的最初給藥在任一化療方案第一個(gè)周期前24小時(shí)。隨后在化療給藥馬上開(kāi)始前給予抗體，如果抗體的最初給藥被很好地耐受的話。如果抗體的第一次給予未被很好地耐受的話，則在化療給藥前24小時(shí)繼續(xù)隨后的灌輸。使患者繼續(xù)接受化療超過(guò)6個(gè)周期，如果在治療醫(yī)師看來(lái)患者繼續(xù)治療有利的話。
環(huán)磷酰胺(600毫克／平方米)的給予可以在最短3分鐘期間靜脈內(nèi)推入或在最長(zhǎng)2小時(shí)內(nèi)灌注輸入。
阿霉素(60毫克／平方米)或表柔比星(75毫克／平方米)可根據(jù)制度規(guī)定的程序在最短3-5分鐘期間靜脈內(nèi)緩慢推入或在最長(zhǎng)2小時(shí)內(nèi)灌注輸入。
帕利他塞(TAXOL)給予的劑量是在3小時(shí)內(nèi)靜脈內(nèi)給予175毫克／平方厘米。接受帕利他塞的所有患者預(yù)先在給予帕利他塞之前12至6小時(shí)口服地塞米松(或其等價(jià)物)20毫克×2劑；在帕利他塞之前30分鐘靜脈內(nèi)給予50毫克苯海拉明(或其等價(jià)物)，和在帕利他塞之前30分鐘給予二甲茚啶(dimetidine)(或另一H2阻斷劑)。
反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展性疾病任何可測(cè)定的病損有25％或更多增加的客觀證據(jù)。進(jìn)展性疾病反應(yīng)還包括出現(xiàn)新病損的那些情況。對(duì)于骨病損，進(jìn)展定義為平片、CT、MRI客觀測(cè)得增加25％；并非由骨折引起的有癥狀的新?lián)p傷；或需要緩和的放射治療。
完全反應(yīng) 所有放射照片和／或肉眼能看到的腫瘤在最短4周內(nèi)消失。皮膚和胸壁完全反應(yīng)必須通過(guò)活檢來(lái)確認(rèn)。
部分反應(yīng) 所有可測(cè)定的病損的垂直直徑總和在最短4周內(nèi)減少至少50％。沒(méi)有出現(xiàn)新的病損，所有病損的大小也沒(méi)有進(jìn)展。
最小反應(yīng) 所有可測(cè)定的病損的垂直直徑總和減少25％至49％。沒(méi)有出現(xiàn)新的病損，所有病損的大小也沒(méi)有進(jìn)展。
穩(wěn)定的疾病 可測(cè)定的病損的大小變化不超過(guò)25％。沒(méi)有出現(xiàn)病損。
從治療開(kāi)始到進(jìn)展計(jì)算至腫瘤進(jìn)展的時(shí)間(TTP)。用針對(duì)單一部分的確切方法計(jì)算反應(yīng)速度的置信限。(Fleiss，JL，Statistical Methods for Rates and Proportions(第2版)，New York，NY，Wiley，1981，13-17頁(yè))。
結(jié)果在10．5個(gè)月的中期隨訪中，疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP，月為單位)以及反應(yīng)比例(RR)的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，HERCEPTIN明顯增加了化療劑的效果，且整體的嚴(yán)重副作用(AE)沒(méi)有增加參與者TTP(月) RR(％) AE(％)CRx 2345．5 36．2 66CRx+H 2358．6*62．00**69AC1456．5 42．1 71AC+H 1469．0 64．9 68T 89 4．2 25．0 59T+H 89 7．1 57．3 70*對(duì)數(shù)秩次檢驗(yàn)的p＜0．001**X2檢驗(yàn)p＜0．01CRx化療
AC蒽環(huán)類抗生素／環(huán)磷酰胺治療HHERCEPTINTTAXOL據(jù)報(bào)道，AC+H(18％級(jí)3／4)的組合治療比單用AC(3％)、T(0％)或T+H(2％)更經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)類似于用蒽環(huán)類抗生素時(shí)所觀察到的心肌功能紊亂綜合征。
這些數(shù)據(jù)表明抗ErbB2抗體的治療與化療劑聯(lián)合能增加臨床效果(從反應(yīng)比例和疾病進(jìn)展的評(píng)價(jià)結(jié)果而確定)。但是，由于阿霉素或表柔比星增加了心肌副作用，因此蒽環(huán)類抗生素與抗ErbB2抗體治療的組合使用是禁忌的。從風(fēng)險(xiǎn)和效益考慮，該結(jié)果表明HERCEPTIN和帕利他塞(TAXOL)的組合治療是有利的。
說(shuō)明書(shū)中的所有引用文獻(xiàn)均表述性地納入本文作為參考。
序列表&#60110&#62 Genentech，Inc．&#60120&#62 用抗ErbB2抗體治療&#60130&#62 P1256R2PCT&#60150&#62 US 60／069，346&#60151&#62 1997-12-12&#60160&#62 9&#60210&#62 1&#60211&#62 166&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 1Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu1 5 10 15Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val20 25 30Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser35 40 45Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu50 55 60Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg65 70 75Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala80 85 90Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr95 100 105Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu110 115 120Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln125 130 135Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys140 145 150Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg155 160 165Ala&#60210&#62 2&#60211&#62 32&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 2Ser Thr Gin Val Cys Thr G1y Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro1 5 10 15Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln20 25 30Gly Cys&#60210&#62 3&#60211&#62 11&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 3Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro1 5 10&#60210&#62 4&#60211&#62 7&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 4His Gln Ser Leu Gly Thr Gln1 5&#60210&#62 5&#60211&#62 8&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 5His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys1 5&#60210&#62 6&#60211&#62 8&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 6His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys1 5&#60210&#62 7&#60211&#62 8&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 7Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln1 5&#60210&#62 8&#60211&#62 59&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 8Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val1 5 10 15Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln20 25 30Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val35 40 45Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg50 55&#60210&#62 9&#60211&#62 65&#60212&#62 PRT&#60213&#62 智人&#60400&#62 9Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr1 5 10 15Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr20 25 30Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys35 40 45Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu50 55 60Gly Ala Cys Gln Pro6權(quán)利要求
1．一種治療易患或經(jīng)診斷患有以ErbB2受體過(guò)度表達(dá)為特征的疾病的人患者的方法，該方法包括在蒽環(huán)類抗生素衍生物不存在下，給予人患者有效量的抗ErbB2抗體與非蒽環(huán)類抗生素衍生物的化療劑的組合。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疾病是良性或惡性腫瘤。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疾病是癌。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述癌癥選自乳房癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞性肺癌、非小細(xì)胞性肺癌、腸胃癌、胰癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各類頭部和頸部癌。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述癌癥是乳房癌。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性乳房癌。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體與ErbB2受體的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體與ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域序列中的表位4D5結(jié)合。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抗體是人化的4D5抗ErbB2抗體。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化療劑是塔克索德。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述塔克索德是帕利他塞或多西他塞。
12．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)以單劑形式給予個(gè)體時(shí)，所述組合的有效量低于所述抗ErbB2抗體與所述化療劑的有效量之總和。
13．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)測(cè)定疾病進(jìn)展時(shí)間或反應(yīng)比例來(lái)測(cè)定效率。
14．一種生產(chǎn)的制品，它包含一個(gè)容器，容器內(nèi)包含抗ErbB2抗體的組合物，以及包裝插頁(yè)，該包裝插頁(yè)上有避免使用蒽環(huán)類抗生素類化療劑與所述組合物組合使用的說(shuō)明。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的生產(chǎn)制品，它還包含容器上的標(biāo)簽或容器附帶的標(biāo)簽，該標(biāo)簽表明了所述組合物可用來(lái)治療以ErbB2受體過(guò)度表達(dá)為特征的疾病。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的生產(chǎn)制品，其中所述標(biāo)簽表明所述組合物可用來(lái)治療乳房癌。
17．根據(jù)權(quán)利要求15所述的生產(chǎn)制品，其中所述抗ErbB2抗體與受體的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的生產(chǎn)制品，其中所述抗ErbB2抗體與ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域序列中的表位4D5結(jié)合。
19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的生產(chǎn)制品，其中所述抗體是人化4D5抗ErbB2抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療以ErbB2過(guò)度表達(dá)為特征的疾病的方法。更具體地說(shuō),本發(fā)明涉及用抗ErbB2抗體和化療劑的組合而不是蒽環(huán)類抗生素(如阿霉素或表柔比星)來(lái)治療易患或診斷患有過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌癥患者。
文檔編號(hào)C07K16/32GK1281468SQ98812097
公開(kāi)日2001年1月24日 申請(qǐng)日期1998年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月12日
發(fā)明者S·謝克, V·E·佩頓 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司