專利名稱：分離和純化促卵泡激素和黃體生成激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從粗制的人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)，特別地從絕經(jīng)或絕經(jīng)后婦女的尿提取物起始分離和純化促卵泡激素(FSH)和黃體生成激素(LH)的特別簡單和經(jīng)濟(jì)的新方法。
通常認(rèn)為FSH和LH是促性腺激素或人可育性激素。這些原始生理學(xué)效應(yīng)是促進(jìn)在這樣的生物過程中涉及的配子發(fā)生和/或類固醇合成的化合物，可從天然來源垂體、人和動(dòng)物血漿以及絕經(jīng)或絕經(jīng)后婦女的尿中充裕地得到。FSH和LH以混合物的形式從這些天然來源提取，通常稱為人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)，HMG也可以作為粗提物從市場上得到；該混合物由約1∶1比例的FSH和LH結(jié)合其它尿蛋白組成。然而這些提取物的純度水平低，這主要是由于其它蛋白的污染，所以不適合用于治療目的在人體中施用。
在本領(lǐng)域內(nèi)已開發(fā)了幾種基本上基于離心、沉淀、層析和過濾技術(shù)從天然來源的產(chǎn)品起始純化FSH和LH的方法，其目的是減少上述的蛋白污染。
美國專利號(hào)3,674,865描述了從尿提取物中純化FSH；這一方法總共包括21個(gè)不同步驟，仍得到FSH和LH的混合物，F(xiàn)SH和LH比例在3∶1-6∶1之間變動(dòng)。
美國專利號(hào)3,973,004(Derwent提取物)描述了通過用硫酸銨選擇性沉淀從垂體中分離FSH，同時(shí)在美國專利4,115,375(權(quán)利要求書，美國專利摘要)中描述了用聚乙二醇作為沉淀劑。
然而，上述方法的缺點(diǎn)是最終得到的產(chǎn)品的特異活性和純度不能令人滿意。尤其是，蛋白污染的存在誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，因此上述激素只能通過特定的施用途經(jīng)，如肌肉注射攝入，在應(yīng)用中涉及相當(dāng)多的困難。
最近，已建立一些使用免疫親和層析和特異的單克隆抗體(歐洲專利EP 0 322 438；歐洲專利申請(qǐng)EPA 0 328 248，Derwent提取物)或重組DNA技術(shù)(國際專利申請(qǐng)WO 85/01958)的純化方法。盡管這些方法可以得到具高特異活性的產(chǎn)品，但是這些方法由于可能的污染而有嚴(yán)重問題，可能的污染來自病毒及宿主細(xì)胞中的異源蛋白和DNA殘留物；因此來自這些方法的產(chǎn)品不得不得到認(rèn)真純化并在使用它們治療之前得到測試以排除可能污染的存在。
因此，很明顯需要一種方法，這種方法能得到高純度和高特異活性的產(chǎn)品，并且沒有上述的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是從粗制的HMG起始分離和純化FSH和LH的方法，這種方法能夠得到具高純度和高特異活性的這兩種激素。上述方法包括以下步驟選擇性地，在80-90％(體積/體積)乙醇水溶液中清除所述粗制HMG的所含病毒；將在步驟(1)中得到的產(chǎn)物上樣到含DEAE型弱堿性陰離子樹脂的離子交換層析柱上，用含5-15％(體積/體積)乙醇和離子強(qiáng)度逐漸增加的0-70mM NaCl的10-50mM磷酸緩沖液(pH 7.0-8.0)選擇性地洗脫LH和FSH；將在步驟(2)中得到的含LH或FSH的洗脫物上樣到在惰性支持物上有由antraquinone衍生物組成的配體的親和層析柱上，用堿性pH溶液(含有從0-3M KCl得到的逐漸增加的離子強(qiáng)度)選擇性地洗脫污染蛋白和FSH或LH；選擇性地，將在步驟(3)中得到的FSH激素上樣到含季銨基團(tuán)的強(qiáng)堿性陰離子樹脂離子交換層析柱上，在堿性PH下用具有逐漸增加的離子強(qiáng)度的0-400mM NaCl溶液選擇性地洗脫污染蛋白和FSH。
另外，在上述步驟(3)和(4)中得到FSH和LH激素可以被去除熱源并凍干或冷凍。
根據(jù)本發(fā)明的方法的特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下詳細(xì)描述中更好的報(bào)告。
通過在離子交換和親和樹脂上簡單的提取和容易的純化步驟，本發(fā)明的方法能得到具高特異活性和高純度的FSH和LH，這樣不需要進(jìn)一步純化處理，它們就能用于治療施用給人體。這種方法特別簡單經(jīng)濟(jì)，而且因?yàn)樗饕谒M(jìn)行，所以它也具有使用的有機(jī)溶劑數(shù)量非常有限的優(yōu)點(diǎn)。
起始的粗制HMG優(yōu)選地是從絕經(jīng)或絕經(jīng)后婦女的尿中得到的尿濃縮物；根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的起始HMG具有低于10I.U./mg，更優(yōu)選地在2到10 I.U./mg之間變動(dòng)的FSH特異活性和0.5-5I.U./mg的LH特異活性。
在本發(fā)明的方法的步驟(1)中，優(yōu)選地在-20℃和5℃之間溫度下，將粗制HMG懸浮于80-90％(體積/體積)乙醇水溶液中，放置1-4小時(shí)。
進(jìn)行這種處理是為了清除粗制HMG的病毒水平，這對(duì)于純化后在藥學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用是必須的。
在本發(fā)明的方法的步驟(2)中，在0℃-8℃，優(yōu)選地0℃-6℃下，將在步驟(1)中已選擇性地清除了病毒水平的固體殘留物溶于在5-50mM磷酸緩沖液中的5-15％(體積/體積)乙醇水溶液中，磷酸緩沖液優(yōu)選地含有10-30mM磷酸鈉，pH范圍為7.3-7.6。
在優(yōu)選地0℃-8℃溫度范圍將這樣得到的溶液上樣到含DEAE型弱堿性陰離子樹脂的離子交換層析柱上，優(yōu)選地使用含5-50mM磷酸緩沖液(優(yōu)選地含10-30mM磷酸鈉，pH為7.3-7.6)的5-15％(體積/體積)乙醇水溶液作為條件緩沖液。上述陰離子樹脂優(yōu)選地在纖維素基質(zhì)上含叔胺基團(tuán)，選擇性地含季銨基團(tuán)，更優(yōu)選地是DEAE纖維素(例如DE52 Whatman)。
當(dāng)柱直徑/長度比為0.3-0.6，蛋白總上樣量為每毫升樹脂20-50mg時(shí)，優(yōu)選的流速范圍是10-30ml/cm2·小時(shí)。
吸附在樹脂上的LH激素優(yōu)選地用在10-50mM磷酸鹽緩沖液(優(yōu)選地含10-30mM磷酸鈉，pH 7.3-7.6)中的5-15％(體積/體積)乙醇水溶液洗脫。上述導(dǎo)致只有LH得到回收的洗脫優(yōu)選地在0-8℃溫度下進(jìn)行。
吸附在樹脂上的FSH激素隨后用在10-50mM磷酸緩沖液(優(yōu)選地含10-30mM磷酸鈉，pH 7.3-7.6，含30-50mM NaCl)中的5-15％(體積/體積)乙醇水溶液洗脫。上述洗脫優(yōu)選地在0-8℃溫度下進(jìn)行。在這一步驟中，乙醇在洗脫緩沖溶液中的存在起決定作用，因?yàn)樗苁筁H和FSH更好地分離，并使兩種激素的回收產(chǎn)率更高。
在本發(fā)明的方法的步驟(3)中，通過含antraquinone衍生物，優(yōu)選地Cibacron Blue(與惰性支持物，優(yōu)選地瓊脂糖共價(jià)連接)作為配體的親和層析，優(yōu)選地使用含Agarose Blue的親和層析柱，對(duì)從步驟(2)得到的含LH和FSH的洗脫物分別進(jìn)行進(jìn)一步的純化程序。
優(yōu)選地將上述洗脫物酸化至pH 5.5和7.5，并于0℃-8℃溫度范圍上樣到上述柱子上，柱子事先在10-30mM醋酸緩沖液(優(yōu)選地含醋酸鈉，pH5.5-7.5)中平衡。
當(dāng)柱直徑/長度比為0.5-0.9，蛋白總上樣量為每ml樹脂5-15mg時(shí)，優(yōu)選的流速范圍為7-14ml/cm2·小時(shí)。
然后用一種或多種40-60mM甘氨酸-NaOH緩沖液(選擇性地含0-3M濃度范圍的KCl，具有逐漸增加的離子強(qiáng)度，將pH改變到8.5-10)選擇性地洗脫吸附在柱子上的FSH或LH激素，從而與污染蛋白分開。
然后可以用本領(lǐng)域已知的方法對(duì)這樣得到的激素進(jìn)行濃縮并脫鹽，用于隨后的冷凍或凍干。
根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，用本領(lǐng)域已知的方法將去鹽的LH激素凍干并且隨后可以去除熱源。
根據(jù)步驟(4)，在步驟(3)中得到的FSH激素一旦去鹽可得到進(jìn)一步的純化，純化步驟通過在強(qiáng)堿性陰離子樹脂上離子交換層析進(jìn)行；這樣的強(qiáng)堿性陰離子樹脂在纖維素基質(zhì)上含季銨基團(tuán)，并選擇性地與叔胺基團(tuán)結(jié)合；纖維素基質(zhì)優(yōu)選的是DE53 Whatman。
FSH優(yōu)選地通過在10-50mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0-9.5)中透析平衡，并上樣到利用同樣緩沖液平衡的柱子上。
當(dāng)柱直徑/長度比為0.08-0.3，蛋白總上樣量在每ml樹脂0.5-10mg范圍內(nèi)時(shí)，優(yōu)選的流速范圍是20-40ml/cm2·小時(shí)。
最初用10-50mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0-9.5，含一定濃度，優(yōu)選地40-80mM NaCl)洗脫柱子，由此得到污染蛋白的洗脫。
隨后用線性NaCl濃度梯度洗脫結(jié)合在樹脂上的FSH激素，NaCl濃度梯度優(yōu)選地在10-50mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0-9.5)中含70-100mM至140-400mM NaCl。
這樣得到的純化FSH激素用本領(lǐng)域已知的方法超濾去鹽，冷凍干燥并去除熱源。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，在步驟(3)或(4)中得到的FSH和LH的去熱源過程如下進(jìn)行純化激素的凍干粉末在-15℃和0℃之間的溫度下溶于含5-15％(重量/體積)乙酸銨的30-50％(體積/體積)乙醇水溶液中。
然后向此溶液加入3-8mM磷酸鈉(tribasic sodium phosphate)和3-8mM乙酸鈣；然后用氫氧化鈉將pH值提高到8-10。離心后，在-20℃和0℃之間的溫度下向得到的上清中加入1.5-2.5倍于每個(gè)上清體積的純乙醇。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，再一次離心后，重新將所得沉淀溶于水并透析。
最后，含純化LH或FSH的溶液可以以溶液形式冷凍或根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法凍干，這樣可以保持激素活性不變以便于長期貯存。
用本發(fā)明的方法能夠得到非常高純度的FSH和LH，分別地，F(xiàn)SH具有超過6,000 I.U./mg的特異活性，并且無LH活性；而LH具有超過500 I.U./mg的特異活性。
以下報(bào)告的本發(fā)明的實(shí)施例是作為例證而不是為限制性目的。實(shí)施例1從粗制尿HMG純化FSH在含水乙醇中清除粗制HMG的病毒水平除非有不同的說明，所有此后提及的操作都在0℃-6℃溫度范圍下進(jìn)行。
在-10℃溫度下，將200g從絕經(jīng)或絕經(jīng)后婦女的尿中得到的粗制HMG懸浮于10升乙醇/水混合物(85∶15，體積/體積)中。將這樣得到的懸浮液保持在-10℃溫度下，持續(xù)攪拌3小時(shí)，然后使用GS3Sorvall轉(zhuǎn)子于7,000 rpm離心20分鐘；去除上清后，回收沉淀。在DE52上的離子交換層析將步驟1.1中得到的沉淀溶于2升含20mM磷酸鈉的10％乙醇溶液(pH7.3)中。使用GS3 Sorvall轉(zhuǎn)子將這樣得到的溶液于7,000 rpm離心30分鐘，并將得到的上清上樣到DE52 Whatman離子交換柱(1995目錄號(hào)4057910)上。所用的DE52 Whatman離子交換柱以二乙氨乙基纖維素為基礎(chǔ)，直徑為14cm，長為36cm，并已在含10％(體積/體積)乙醇的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)中平衡。在層析過程中，以3升/小時(shí)的速率洗脫柱子，以約700ml的級(jí)分收集洗脫物。
上樣后，按以下順序洗脫柱子10升含20mM磷酸鈉的10％(體積/體積)乙醇(pH＝7.3)；40升含20mM磷酸鈉和40mM氯化鈉的10％(體積/體積)乙醇(pH＝7.3)；層析后，測定每個(gè)洗脫物組分于280nm的光密度(OD 280)，以及LH和FSH活性。

圖1表示得到的層析譜，其中報(bào)告了洗脫物組分的LH和FSH特異活性(I.U./ml)和光密度。
這樣的層析譜清楚地表明LH由緩沖溶液(a)洗脫，而FSH由含40mM NaCl的緩沖溶液(b)洗脫。特別地，如實(shí)施例2中所述收集含LH的組分6-20并進(jìn)一步純化；如下述收集含F(xiàn)SH的組分28-41并純化。通過在Agarose Blue上親和層析純化FSH
使用Agarose Blue 3 GA親和樹脂(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，Mo，1995年目錄號(hào)C1410)；在裝入層析柱之前，用下列試劑洗該樹脂10升在0.5％Na2CO3中的2.5M KCl溶液，1小時(shí)；10升0.5％Na2CO3溶液，30分鐘；10升6M尿素溶液，2小時(shí)；10升水，30分鐘；10升0.5％Na2CO3溶液，30分鐘；10升水，30分鐘；10升50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.5)，30分鐘；10升20mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.5)，30分鐘；將在20mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.5)中平衡的樹脂裝入層析柱中得到直徑11cm、高16cm的樹脂基質(zhì)。
將在步驟1.2中得到的含F(xiàn)SH的樣品用1.7M乙酸調(diào)節(jié)pH到6.5，并上樣到柱子中。
于1升/小時(shí)流速進(jìn)行樣品的上樣和其進(jìn)一步的洗脫。在向柱子上樣期間回收的洗脫物被收集在單一組分中，而隨后再收集約700ml的級(jí)份。
上樣后，首先按以下順序洗脫柱子1升20mM醋酸鈉緩沖液，pH＝6.5；5升50mM甘氨酸-NaOH緩沖液，pH＝10；3升50mM甘氨酸-NaOH，0.2M KCl緩沖液，pH＝9；然后用如下制備的在甘氨酸-NaOH緩沖液中的KCl線性梯度洗脫容器1) 9升在50mM甘氨酸-NaOH緩沖液中的0.3M KCl，pH＝9；容器2) 9升在50mM甘氨酸-NaOH緩沖液中的2.5M KCl，pH＝9；層析后，測定每個(gè)洗脫物組分在280nm的光密度值(OD280)和FSH特異活性(I.U./ml)。圖2表示所得的層析譜。
在上樣期間，F(xiàn)SH保留在柱子中而大部分污染蛋白在洗脫物中發(fā)現(xiàn)(未在圖中表示)。仍然滯留在樹脂上的一些污染蛋白首先用含0.3MKCl的緩沖液洗，在這些條件下沒有觀察到FSH的洗脫。
隨后用KCl梯度洗脫(從組分14開始)，首先得到其它污染蛋白的清除(大約從組分15到組分20)；FSH的洗脫在更高的KCl濃度下出現(xiàn)，表現(xiàn)為對(duì)稱峰(從組分22到組分29)。
之后，將組分23-28收集在一起；用1.7M乙酸將所得產(chǎn)物的pH調(diào)到7.5；然后產(chǎn)物本身可通過超濾濃縮和去鹽，超濾時(shí)使用帶AmiconPM10膜的Amicon過濾器。在DE53上的離子交換層析已事先如步驟1.3中所述得到濃縮并去鹽的FSH樣品逆著5升25mM Tris-HCl緩沖液(pH9.3)透析18小時(shí)；之后將樣品上樣到DE 53Whatman離子交換層析柱(1995目錄號(hào)4058910)上；所用層析柱直徑2cm，高18cm，并已用25mM Tris-HCl緩沖液(pH＝9.3)平衡。以100ml/小時(shí)的流速洗脫柱子，以約18ml的級(jí)分收集洗脫物。
上樣后，首先用450ml含80mM NaCl的25mM Tris-HCl緩沖液(pH9.3)洗脫柱子，然后用如下制備的NaCl線性梯度洗脫容器1)600ml在25mM Tris-HCl緩沖液中的90mM NaCl，pH＝9.3；容器2) 600ml在25mM Tris-HCl緩沖液中的160mM NaCl，pH＝9.3；圖3表示了所得的層析譜，其中表示了每個(gè)洗脫物組分于280nm時(shí)的光密度(OD 280)及FSH特異活性(I.U./ml)。
層析譜清楚地表明用含80mM NaCl的起始洗脫溶液洗導(dǎo)致一些污染蛋白的清除，而FSH仍保留在柱子上。相反，從組分30開始，用NaCl梯度可選擇性地從污染蛋白中洗脫FSH。將組分31-40收集在一起，通過使用裝有Amicon PM10膜的Amicon過濾器濃縮去鹽，并最終得到冷凍干燥。FSH的去熱源作用將109g在前述步驟中得到的冷凍干燥的FSH溶解于55ml含40％(體積/體積)乙醇和10％(重量/體積)乙酸銨的冷溶液中。通過冰鹽浴，將溶液溫度保持在約-10℃并持續(xù)進(jìn)行磁力攪拌，同時(shí)向溶液中加入下列成分1.2ml 7.6％十二水合磷酸鈉(tribasic sodium phosphate)水溶液；1.4ml 4.9％乙酸鈣水溶液。
用20％(重量/體積)NaOH將pH提高到約8.5，繼續(xù)在約-10℃溫度下持續(xù)攪拌溶液30分鐘，然后在Sorvall SS34轉(zhuǎn)子中于8,000rpm離心30分鐘。去除沉淀，在冰鹽浴中將收集的上清(57ml)冷卻至約-10℃并進(jìn)行攪拌。
加入114ml預(yù)冷至-20℃的95％(體積/體積)乙醇，然后將溶液于-20℃溫度下持續(xù)攪拌約30分鐘并放置12小時(shí)。
在0-4℃低溫離心機(jī)中于8,000 rpm離心30分鐘，然后去除上清并將沉淀重新溶于80ml無熱源的水中。將這樣得到的溶液逆著10升無熱源水透析，然后冷凍干燥。
圖4表示含1.1mg/ml根據(jù)上述方法純化的FSH的溶液的吸收光譜。用放射免疫方法，使用Serono FSH Maiclone試劑盒(目錄號(hào)13101)測定這樣純化的FSH的活性，相當(dāng)于6,870 I.U./mg蛋白。根據(jù)含1mg/ml FSH的水溶液在277nm得到光密度0.62(在1cm光徑的石英比色杯中)，計(jì)算純化的FSH中的蛋白濃度。此折算率在制備過程中根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，即于277nm測定含有稱重的事先凍干的無鹽激素的溶液的吸光度。已證明在具4,000-10,000 I.U./mg FSH特異活性的純化激素樣品中，此折算率比其它蛋白測定方法更可靠。低純度組分(例如在步驟1.2中得到的那些)的蛋白濃度使用BCA Protein AssevyPierce(Pierce目錄號(hào)23223和23224)，用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。
關(guān)于FSH純化(如在步驟1.1-1.5中描述的進(jìn)行純化)的資料在表1中表示。<
<p>表2表示在根據(jù)實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行的進(jìn)一步FSH純化實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果<
實(shí)施例2從粗制尿HMG純化LH關(guān)于在含水乙醇中清除粗制HMG的病毒水平和在DE 52上進(jìn)行離子交換層析的步驟2.1和2.2，對(duì)于FSH和LH是相同的，如實(shí)施例1的1.1和1.2項(xiàng)中所述的進(jìn)行。通過在Agarose Blue上親和層析純化FSHAgarose Blue 3 GA親和樹脂如1.3項(xiàng)中所述的得到制備。
然后將樹脂在20mM乙酸鈉緩沖液(pH＝6.5)中平衡，并裝入層析柱中以得到直徑11cm、高16cm的樹脂基質(zhì)。
將如1.2項(xiàng)中所述得到的含LH的樣品用1.7M乙酸調(diào)節(jié)pH到6.5，并按1升/小時(shí)的流速上樣到柱子上。將向柱子上樣期間得到的洗脫物收集在單一組分中，隨后再收集約600ml的級(jí)分。
上樣后，首先按以下順序洗脫柱子1升20mM乙酸鈉緩沖液，pH＝6.5；5升50mM甘氨酸-NaOH緩沖液，pH＝10；2升50mM甘氨酸-NaOH，0.15M KCl緩沖液，pH＝9；然后用如下制備的在甘氨酸-NaOH緩沖液中的KCl線性梯度洗脫容器1)8升在50mM甘氨酸-NaOH緩沖液中的0.15M KCl，pH＝10；2)8升在50mM甘氨酸-NaOH緩沖液中的1.7M KCl，pH＝10。
層析后，測定每個(gè)組分在280nm的光密度值(OD 280)和LH特異活性(I.U./ml)。
圖5表示如上所述得到的洗脫層析譜。在向柱子上樣期間，LH保留在柱子中而大部分污染蛋白在洗脫物中發(fā)現(xiàn)(未在圖中表示)。在梯度洗脫之前通過用pH＝10的兩種緩沖液進(jìn)行沖洗將仍然滯留在樹脂上的一些污染蛋白洗脫出來。
用KCl梯度洗脫LH低KCl濃度導(dǎo)致其它污染蛋白的洗脫，而在高離子濃度時(shí)出現(xiàn)LH的洗脫。
然后將組分17-25收集在一起，用1.7M乙酸將pH值調(diào)節(jié)到7.5。然后通過在Amicon PM10膜上的超濾將溶液濃縮并去鹽，并且最后冷凍干燥。LH的去熱源作用將205g在前述步驟中得到的冷凍干燥的LH溶解于102ml含40％(體積/體積)乙醇和10％(重量/體積)乙酸銨的溶液中。通過冰鹽浴，將溶液溫度保持在約-10℃并持續(xù)進(jìn)行磁力攪拌，同時(shí)向溶液中加入下列成分2.25ml 7.6％十二水合磷酸鈉(tribasic sodium phosphate)水溶液；2.7ml 7.6乙酸鈣水溶液。
在用20％(重量/體積)NaOH將pH提高到約8.5之后，繼續(xù)在約-10℃溫度下持續(xù)攪拌溶液30分鐘，然后在Sorvall SS34轉(zhuǎn)子中于8,000rpm離心30分鐘。去除沉淀，在冰鹽浴中將收集的上清(107ml)保持在約-10℃溫度下并進(jìn)行攪拌。
加入214ml預(yù)冷至-20℃的95％(體積/體積)乙醇，并將溶液于-20℃溫度下持續(xù)攪拌約30分鐘并放置12小時(shí)。
在0-4℃低溫離心機(jī)中于8,000 rpm離心30分鐘，然后去除上清并將沉淀重新溶解于125ml無熱源的水中。將這樣得到的溶液逆著10升無熱源水透析，然后冷凍干燥。
圖6表示含2.8mg/ml根據(jù)上述方法純化的LH的水溶液的紫外光譜。用放射免疫方法，使用Serono LH Maiclone試劑盒(目錄號(hào)13201)測定純化的LH的特異活性，相當(dāng)于521 I.U./mg蛋白。用BCA ProteinAssay Pierce(Pierce目錄號(hào)23223和23224)，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)測定蛋白濃度。關(guān)于根據(jù)上述步驟進(jìn)行的LH純化的資料在表3中表示。
<p>表4表示在用實(shí)施例2中所述的方法進(jìn)行的進(jìn)一步LH純化實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種從粗制HMG起始分離和純化FSH和LH的方法，包括以下步驟1)選擇性地，在80-90％(體積/體積)乙醇水溶液中清除所述粗制HMG的病毒；2)將在步驟(1)中得到的產(chǎn)物上樣到含DEAE型弱堿性陰離子樹脂的離子交換層析柱上，用含5-15％(體積/體積)乙醇和離子強(qiáng)度逐漸增加的0-70mM NaCl的10-50mM磷酸緩沖液(pH7.0-8.0)選擇性地洗脫LH和FSH；3)將在步驟(2)中得到的含LH或FSH的洗脫物上樣到含antraquinone衍生物作為配體的親和層析柱上，用具有從0-3M KCl得來的逐漸增加的離子強(qiáng)度的堿性pH溶液選擇性地洗脫污染蛋白和FSH或LH；4)選擇性地，將在步驟(3)中得到的FSH上樣到含強(qiáng)堿性陰離子樹脂的離了交換層析柱上，并用具有逐漸增加的離子強(qiáng)度的0-400mM NaCl溶液在堿性pH下選擇性地洗脫污染蛋白和FSH。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述粗制HMG來自絕經(jīng)或絕經(jīng)后婦女的尿液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1中，用所述乙醇水溶液在-20℃-5℃溫度下處理所述粗制HMG 1-4小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述弱堿性陰離子樹脂是DEAE纖維素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的離子交換層析柱事先用在5-50mM磷酸緩沖液中的5-15％(體積/體積)乙醇水溶液(pH7.3-7.6)在0℃-8℃溫度下平衡。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，4和/或5中所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，用含10-30mM磷酸鈉的5-15％(體積/體積)乙醇水溶液(pH7.3-7.6)在0℃-8℃溫度下從柱子上洗脫LH。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，4和/或5中所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，用含10-30mM磷酸鈉和30-50mM氯化鈉的5-15％(體積/體積)乙醇水溶液(pH7.3-7.6)在0℃-8℃溫度下從柱子上洗脫FSH。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述antraquinonoe衍生物是Cibacron Blue。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和8所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述親和層析柱由Agarose Blue構(gòu)成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1，8和/或9所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述親和層析柱事先用10-30mM乙酸緩沖液(pH5.5-7.5)平衡。
11.根據(jù)權(quán)利要求1，8，9和/或10所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，用一種或多種含0-3M KCl的40-60mM甘氨酸-NaOH緩沖液(從8.5-11改變pH值)選擇性地洗脫LH或FSH。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述強(qiáng)堿性陰離子樹脂在纖維素基質(zhì)上包含季銨基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或12所述的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述的離子交換層析柱事先用10-50mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0-9.5)平衡。
14.根據(jù)權(quán)利要求1，12和/或13所述的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述污染蛋白用含40-80mM NaCl的10-50mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0-9.5)洗脫，所述FSH用在10-50mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0-9.5)中的濃度范圍從70到40mM的NaCl梯度選擇性地洗脫。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14的任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，隨后將在步驟(3)或(4)中得到的FSH或LH冷凍干燥或冷凍，并去除熱源。
全文摘要
一種從粗制HMG,優(yōu)選地從尿提取物起始分離和純化FSH和LH的特別簡單和經(jīng)濟(jì)的新方法,包括以下步驟:選擇性地在含水乙醇中去除粗制HMG所含的病毒;在DEAE型弱堿性陰離子樹脂上離子交換層析;在含antraquinone衍生物作為配體的樹脂上親和層析;選擇性地,在強(qiáng)堿性陰離子樹脂上離子交換層析;由此得到的特別純的并具有高特異活性的激素可以隨后進(jìn)行去除熱源的步驟。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1262278SQ9910137
公開日2000年8月9日 申請(qǐng)日期1999年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月26日
發(fā)明者P·魯爾迪, E·多納蒂, I·拉帕潑特 申請(qǐng)人:Ibsa生物化學(xué)研究股份有限公司