專利名稱：間接聚合和標(biāo)記的抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過抗體聚合，所得聚合抗體結(jié)合于蛋白質(zhì)形成蛋白復(fù)合物或聚合的抗體結(jié)合物并用花青染料標(biāo)記該結(jié)合物而制成的間接聚合和標(biāo)記的抗體，還涉及其制備方法。
用染料標(biāo)記制成的染料標(biāo)記抗體是肉眼可見的，與樣本溶液中所含的免疫原或抗原有特異性反應(yīng)。因此，這樣的抗體用于例如在免疫傳感器中借助抗原-抗體免疫反應(yīng)檢出樣本溶液中所含的特異性物質(zhì)即抗原，在各種醫(yī)療機(jī)構(gòu)中作為診斷工具具有廣闊的應(yīng)用。
花青染料是標(biāo)記抗體最常用的染料，因?yàn)樗鼈兎磻?yīng)性強(qiáng)、摩爾吸光系數(shù)高(見Bioconjugate Chemistry Vol.4,No.2,pp.105-111,1993)。
這些花青染料具有與抗體上存在的氨基或羧基反應(yīng)形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)。花青染料與抗體的結(jié)合比為每分子抗體20-50個(gè)花青染料分子。
這樣制成的花青染料標(biāo)記抗體被應(yīng)用于如免疫色譜法，因?yàn)槠淇梢姸韧ǔ８撸V泛地用于檢測(cè)小量特異性物質(zhì)，如只在妊娠婦女尿中含有的絨毛膜促性腺素。
正常抗體包括數(shù)百至數(shù)千個(gè)氨基或羧基。但是，通常的解釋是，由于其三維結(jié)構(gòu)，在這么多的氨基或羧基中，只有50個(gè)左右可參與反應(yīng)，這使每分子抗體上花青染料的結(jié)合分子數(shù)限制為50個(gè)分子。
而且，由于抗體與抗原的反應(yīng)部位僅限于每分子2個(gè)，因此抗體與抗原結(jié)合敏感性低。
在免疫傳感器等中使用這樣的標(biāo)記抗體限制了傳感器的敏感性，當(dāng)樣本溶液中被分析物即抗原濃度低時(shí)產(chǎn)生難于檢測(cè)的重大問題。
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的在于提供高度敏感的間接聚合和標(biāo)記抗體，促進(jìn)樣本溶液中低濃度被分析物的檢出。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述間接聚合和標(biāo)記抗體的制備方法。
本發(fā)明提供間接聚合和標(biāo)記的抗體，包含抗體和用于標(biāo)記抗體的染料，該染料為以如下化學(xué)式(1)-(4)之一表示的花青染料
其中，R1和R2表示氫或烷基，X表示鹵素，M表示氫或堿金屬，n表示整數(shù)1-4，其中，抗體經(jīng)多功能試劑聚合并經(jīng)二硫鍵結(jié)合于蛋白質(zhì)形成聚合的抗體結(jié)合物，該抗體結(jié)合物被花青染料標(biāo)記。
通過將抗體聚合制得的聚合抗體是多價(jià)的，具有很多與抗原反應(yīng)部位，因此與其它常見的二價(jià)抗體相比，其結(jié)合敏感性高。
此外，當(dāng)結(jié)合到蛋白質(zhì)上后，所得的聚合抗體結(jié)合物與花青染料結(jié)合的面積增加，還增加了染料與聚合抗體結(jié)合物的結(jié)合分子數(shù)目。結(jié)果，用上述方法得到的間接聚合和標(biāo)記抗體可具有極好的可見度。
本發(fā)明間接聚合和標(biāo)記的抗體用于例如免疫色譜法，促進(jìn)以高敏感性檢出低濃度被分析物即抗原。按照本發(fā)明的間接聚合和標(biāo)記抗體因其高敏感性，還可用于任何類型的生物傳感器。
在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施模式中，間接聚合和標(biāo)記抗體具有的結(jié)構(gòu)是其花青染料骨架經(jīng)花青染料中存在的琥珀酰亞胺的?；寂c聚合抗體結(jié)合物中存在的氨基氮之間的共價(jià)鍵結(jié)合于聚合抗體結(jié)合物。
按照本發(fā)明的間接聚合和標(biāo)記抗體，其合乎需要的抗體聚合度可以在2-50范圍內(nèi)。
按照本發(fā)明的間接聚合和標(biāo)記抗體的制備方法包括以下步驟在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖液中，用多功能試劑將抗體聚合，形成聚合抗體；在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖液中，將蛋白質(zhì)還原形成還原蛋白，使聚合抗體與還原蛋白反應(yīng)，形成聚合抗體結(jié)合物，將該聚合抗體結(jié)合物與染料反應(yīng)，從而用染料標(biāo)記聚合抗體結(jié)合物，染料為化學(xué)式(1)-(4)之一表示的花青染料。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施模式中，該方法可包括如下步驟
在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖液中，用多功能試劑將抗體聚合，形成聚合抗體；在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖液中，將蛋白質(zhì)還原形成還原蛋白，使還原蛋白與染料反應(yīng)，形成標(biāo)記蛋白，將聚合抗體與標(biāo)記蛋白反應(yīng)，染料為化學(xué)式(1)-(4)之一表示的花青染料。
在任何一個(gè)方法中，磷酸鹽緩沖液的較佳pH值在7.0-8.0范圍內(nèi)。
可用于本發(fā)明的較佳聚合和標(biāo)記抗體的抗體不限于特定的抗體，任何抗體無論其來源和亞型均可使用?？捎玫目贵w的例子為各種免疫球蛋白(Ig)，如小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠IgA、小鼠IgE、大鼠IgG、大鼠IgM、大鼠IgA、大鼠IgE、家兔IgG、家兔IgM、家兔IgA、家兔IgE、山羊IgG、山羊IgM、山羊IgE、山羊IgA、綿羊IgG、綿羊IgM、綿羊IgA、綿羊IgE等。這些抗體可從商業(yè)途徑購(gòu)得或可從受關(guān)注的動(dòng)物身上得到。
多功能試劑可列舉在同一個(gè)分子上有兩個(gè)或兩個(gè)以上能結(jié)合于抗體的官能團(tuán)如琥珀酰亞胺基、吡啶基二硫基等的試劑。這些試劑的例子可以是化學(xué)式(5)所示丙酸二硫基磺基琥珀酰亞胺酯、化學(xué)式(6)所示辛二酸二(磺基琥珀酰亞胺)酯、化學(xué)式(7)所示酒石酸二琥珀酰亞胺酯、化學(xué)式(8)所示二(琥珀酰亞胺基琥珀酸乙二醇酯、化學(xué)式(9)所示N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸等。
結(jié)合于聚合抗體上的蛋白質(zhì)可以是不起抗體作用的任何蛋白質(zhì)。較好的是高水溶性蛋白。例如，血清白蛋白較佳，因?yàn)樗鼘?duì)抗原-抗體反應(yīng)無抑制作用，并極易溶于水。
化學(xué)式(1)或(2)所示花青染料是有利于宏觀確認(rèn)的紅色染料。
化學(xué)式(1)所示染料共價(jià)碳原子數(shù)目少，具有高度水溶性，而化學(xué)式(2)所示染料具有很深的紅色，最易于宏觀確認(rèn)。
如果用儀器如傳感器確認(rèn)花青染料的呈色反應(yīng)，染料的顏色不限于紅色，化學(xué)式(3)或(4)所示藍(lán)色染料同樣也可使用。
化學(xué)式(3)或(4)所示染料不太可能受樣本溶液中雜質(zhì)的不良影響，因?yàn)樗鼈兊奈兆V僅存在于長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)域。
在化學(xué)式(1)-(4)中，X表示的鹵素可列舉氟、氯、溴或碘，M表示的金屬可列舉鋰、鈉、鉀等。
本發(fā)明的新特征在所附的權(quán)利要求中特別加以闡述，本發(fā)明無論其組成和內(nèi)容，以及其它目的和特征，均可結(jié)合附圖從下面的詳細(xì)描述中得到更好的理解和認(rèn)識(shí)。


圖1是闡明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所用的免疫色譜法的斜視圖。
首先，描述式(2)所示花青染料的合成途徑的一個(gè)實(shí)施例。
第一步，將肼基苯磺酸(10)和異丙基甲基酮溶于酸溶劑，加熱生成磺酸假吲哚鎓(11)。在磺酸假吲哚鎓(11)的醇溶液中加入金屬氫氧化物的飽和醇溶液，生成磺酸假吲哚鎓的金屬鹽(12)。
第二步，將鹵代烷酸加到金屬鹽(12)的有機(jī)溶液中，加熱生成磺酸羧基烷基假吲哚鎓的另一個(gè)金屬鹽(13)。此處，考慮到鹵代烷酸的水溶性問題，以具有1-4個(gè)碳原子為佳。
最后一步，將金屬鹽(13)和原甲酸乙酯溶于堿性有機(jī)溶劑，加熱生成羧酸衍生物(14)。然后，將羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳化二亞胺，后者作為縮合劑，加到羧酸衍生物(14)的有機(jī)溶劑中，將混合物攪拌，最終生成化學(xué)式(2)所示花青染料，用作標(biāo)記染料。
在化學(xué)式(1)所示花青染料的合成中，用N-羧基乙基-3,3-二甲基假吲哚代替上述原甲酸乙酯。同樣地，在化學(xué)式(3)或(4)所示花青染料的合成中，分別用四甲氧基丙烷或戊烯二醛四甲基縮醛代替上述原甲酸乙酯。
化學(xué)式(1)-(4),(13)和(14)所示化合物中所含的鹵素可列舉氟、氯、溴或碘。化學(xué)式(1)-(4)和(12)-(14)所示化合物中所含的金屬可列舉鋰、鈉、鉀等。
下面將描述用多功能試劑進(jìn)行抗體聚合反應(yīng)的機(jī)制。
起始反應(yīng)如式(15)所示，當(dāng)多功能試劑，具有兩個(gè)或兩個(gè)以上琥珀酰亞胺基的二硫二(丙酸磺基琥珀酰亞胺酯)，加到抗體中時(shí)，如式(16)所示，抗體的一個(gè)氨基接近多功能試劑的琥珀酰亞胺基的一個(gè)酯鍵。
接著，如式(17)所示，氨基和酯基之間發(fā)生反應(yīng)，氨基失去一個(gè)氫原子。然后，從氨基釋放的游離氫原子結(jié)合到琥珀酰亞胺基的琥珀酰亞胺上，將琥珀酰亞胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基琥珀酰亞胺，導(dǎo)致羥基琥珀酰亞胺從琥珀酰亞胺基釋出。當(dāng)上述反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，琥珀酰亞胺基的剩余部分和失去一個(gè)氫原子的氨基互相結(jié)合，形成酰胺鍵，該酰胺鍵起到將多功能試劑分子結(jié)合于抗體分子的作用。
如式(18)所示，同樣地反應(yīng)也出現(xiàn)在多功能試劑的其余琥珀酰亞胺基上，形成另一個(gè)酰胺鍵，將其它多功能試劑分子結(jié)合于其它抗體分子。該反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，形成聚合抗體。
具有琥珀酰亞胺基的花青染料和具有氨基的抗體之間的結(jié)合機(jī)制與上述相同。
下面，借助具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更具體的描述。
(Ⅰ)聚合抗體的合成將10mg小鼠IgG(相當(dāng)于6.667×10-5mmol)溶于1ml磷酸鹽緩沖液(以下簡(jiǎn)稱“PBS”)。然后將一滴(0.1ml)含丙酸二硫磺基琥珀酰亞胺酯(以下簡(jiǎn)稱“DTSSP”)的PBS加到小鼠IgGPBS中，于35℃攪拌。此處所用的DTSSP的PBS溶液含DTSSP 4.057mg(相當(dāng)于0.006667mmol,100當(dāng)量)。
然后，于35℃攪拌30分鐘，將混合物用瓊脂糖凝膠(商品名Sephadex G25M柱)作凝膠過濾，得到約6ml IgG凝聚物的PBS液(IgGagg.)。IgG凝聚物(IgGagg.)中IgG分子的濃度計(jì)算如下將這樣合成的溶液(0.5ml)于280nm處測(cè)定吸光度，吸光度值為2.69。由于考慮到280nm處觀察的吸光度來自IgG，因此，IgG凝聚物(IgGagg.)的濃度計(jì)算如下IgGagg.=2.69/2.099×105=1.282×10-5(M)計(jì)算時(shí)，將IgG在280nm處的摩爾吸光系數(shù)限定為2.099×105。
(Ⅱ)聚合抗體結(jié)合物的合成將牛血清白蛋白(下文簡(jiǎn)稱“BSA”)(110mg，相應(yīng)于0.001667mmol；25當(dāng)量IgG)溶于5ml PBS，所得的混合物中再加入二硫蘇糖醇(77mg)，室溫?cái)嚢?0分鐘以還原BSA。然后將溶液用Sephadex G25M柱(2.5×30cm)進(jìn)行凝膠過濾，得到BSA的28ml PBS溶液(SH活性)。
向這樣得到的BSA的PBS溶液中加入按上述(Ⅰ)制得的聚合抗體的PBS溶液6ml，于4℃攪拌過夜，然后用Sepharose凝膠(商品名Sephacryl S300HR柱)，進(jìn)行凝膠過濾，得到聚合抗體結(jié)合物的PBS溶液50ml。
(Ⅲ)間接聚合和標(biāo)記抗體的制備將化學(xué)式(2)表示的稱作“SLIC3”的染料350.2mg(相當(dāng)于0.34mmol，總蛋白含量的200當(dāng)量)溶于0.2ml PBS中。將所得的溶液輕輕地滴加到按上述(Ⅱ)制得的聚合抗體結(jié)合物的PBS溶液50ml中。此處所用的染料中，式(2)中，X為碘，M為鉀，n為2。
于4℃攪拌20小時(shí)后，將溶液用Sephadex G25M柱(2.5×30cm,2.5×150cm)進(jìn)行凝膠過濾，得到間接聚合和標(biāo)記抗體的PBS溶液64ml。這樣得到的間接聚合和標(biāo)記抗體，其每分子IgG的SLIC3數(shù)目測(cè)定如下按前面描述的同樣的方式，在550nm處測(cè)定溶液的吸光度，其值為24.7。因?yàn)榫酆峡贵w結(jié)合物在550nm處不被吸收，因此認(rèn)為觀察到的吸收源自結(jié)合于聚合抗體結(jié)合物的SLIC3分子。因此，SLIC3的濃度〔SLIC3〕可測(cè)定如下〔SLIC3〕=24.7/8.55×104=2.889×10-4(M)計(jì)算時(shí)，550nm處SLIC3的摩爾吸光系數(shù)定為8.55×104。
因此，結(jié)合于間接聚合和標(biāo)記抗體的一個(gè)IgG分子上的SLIC3分子的數(shù)目可測(cè)定如下〔SLIC3〕/〔IgGagg.〕=2.889×10-4/1.042×10-6=277.3分子經(jīng)計(jì)算，結(jié)合于蛋白質(zhì)上的一分子IgG的濃度(即〔IgGagg.〕)定為10mg/64ml(1.042×10-6M)。
(Ⅳ)間接聚合和標(biāo)記抗體的評(píng)價(jià)將上述(Ⅲ)中制得的間接聚合和標(biāo)記抗體引入免疫色譜傳感器(immunochromatosensor)。測(cè)定550nm處吸光度來評(píng)估該抗體的敏感性。
圖1是此處所用的免疫色譜傳感器結(jié)構(gòu)的斜視圖。將第一玻璃濾片2、硝基纖維素制的抗體固定膜5和第二玻璃濾片6依次放置在聚氯乙烯之類塑料制的支持板1上。將第一玻璃濾片2一端浸漬(Ⅲ)中制得的間接聚合和標(biāo)記抗體，該端與抗體固定膜5接觸，形成浸漬了標(biāo)記抗體的區(qū)域3。將能與間接聚合和標(biāo)記抗體的同樣抗原反應(yīng)的另一種抗體吸收固定于抗體固定膜5的預(yù)定部位，形成抗體固定區(qū)域4。
用具有上述結(jié)構(gòu)的免疫色譜傳感器測(cè)定本發(fā)明的間接聚合和標(biāo)記抗體的吸光度。一種測(cè)定方法如下按照色譜法的原理，當(dāng)樣本液滴加到不與抗體固定膜5接觸的第一玻璃濾片2的另一端時(shí)，樣本溶液開始從第一玻璃濾片2經(jīng)標(biāo)記抗體浸漬部位3向第二玻璃濾片6移動(dòng)。這時(shí)，標(biāo)記抗體浸漬區(qū)域3上的間接聚合和標(biāo)記抗體與樣本溶液中所含的抗原結(jié)合。然后，結(jié)合于宿主抗原的含間接聚合和標(biāo)記抗體的樣本溶液向抗體固定區(qū)域4移動(dòng)，宿主抗原與抗體固定區(qū)域4上的固定抗體發(fā)生結(jié)合，將抗原固定在抗體固定區(qū)域4。剩余的樣本溶液經(jīng)抗體固定膜5繼續(xù)向第二玻璃濾片6移動(dòng)，最后吸附在第二玻璃濾片6上。
將波長(zhǎng)550nm的L1光輻照抗體固定區(qū)域4，測(cè)定反射光L2，從而測(cè)得吸光度。
然后，除了用化學(xué)式(1)、(3)和(4)代替化學(xué)式(2)所示花青染料外，按上述同樣的方法制備其它間接聚合和標(biāo)記抗體。將這樣制得的抗體施加于免疫色譜傳感器，分別于430、640和720nm處測(cè)定它們的吸光度。此處所用的染料中，化學(xué)式(1)、(3)和(4)中X為碘，M為鉀，n為2。
為作對(duì)比，除了用非聚合抗體代替聚合抗體結(jié)合物外，按所示同樣的方法制備其它標(biāo)記抗體，同樣地施加于免疫色譜傳感器并測(cè)定其吸光度。
結(jié)果顯示，按本發(fā)明的間接聚合標(biāo)記抗體實(shí)施例(各包含聚合抗體結(jié)合物)，其吸光度約為0.8，而只包含非聚合抗體的對(duì)比實(shí)施例的標(biāo)記抗體其吸光度約為0.08。結(jié)果表明，本發(fā)明的間接聚合和標(biāo)記抗體的敏感性約10倍于對(duì)比實(shí)施例的敏感性。
如上所述，本發(fā)明的間接聚合和標(biāo)記抗體具有很多與抗原反應(yīng)的位點(diǎn)，也富含與一分子抗體結(jié)合的染料分子的數(shù)目，因此，促進(jìn)高靈敏度的免疫檢測(cè)。本發(fā)明的間接聚合和標(biāo)記抗體在例如免疫色譜法上的使用使高靈敏度傳感器的產(chǎn)生成為可能。
雖然用目前最佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解的是，這樣的揭示不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。在閱讀上述公開內(nèi)容后，各種變動(dòng)和修改對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說無疑將會(huì)不解自明。因此，所附的權(quán)利要求旨在解釋為覆蓋落在本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍內(nèi)的所有變動(dòng)和修改。
權(quán)利要求
1．間接聚合和標(biāo)記的抗體，包含抗體和用于標(biāo)記所述抗體的染料，所述染料為以如下化學(xué)式(1)-(4)之一表示的花青染料
其中，R1和R2表示氫或烷基，X表示鹵素，M表示氫或堿金屬，n表示整數(shù)1-4，其中，所述抗體經(jīng)多功能試劑聚合并經(jīng)二硫鍵結(jié)合于蛋白質(zhì)形成聚合的抗體結(jié)合物，所述聚合的抗體結(jié)合物被花青染料標(biāo)記。
2．如權(quán)利要求1所述的間接聚合和標(biāo)記抗體，其中所述花青染料骨架經(jīng)所述花青染料中存在的琥珀酰亞胺的?；寂c所述聚合抗體結(jié)合物中存在的氨基氮之間的共價(jià)鍵結(jié)合于所述聚合抗體結(jié)合物。
3．權(quán)利要求1所述的間接聚合和標(biāo)記抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖液中，用多功能試劑將抗體聚合，形成聚合抗體，在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖液中，將蛋白質(zhì)還原形成還原蛋白，將所述聚合抗體與所述還原蛋白反應(yīng)，形成聚合抗體結(jié)合物，及將所述聚合抗體結(jié)合物與染料反應(yīng)，從而用所述花青染料標(biāo)記所述聚合抗體結(jié)合物，所述染料為化學(xué)式(1)-(4)之一表示的花青染料
其中，R1和R2表示氫或烷基，X表示鹵素，M表示氫或堿金屬，n表示整數(shù)1-4。
全文摘要
高靈敏度間接聚合和標(biāo)記的抗體,該抗體促進(jìn)樣本溶液中低濃度抗原的檢測(cè)。其制備方法為用多功能試劑聚合抗體,將聚合抗體經(jīng)抗體的二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合形成聚合抗體結(jié)合物,用上式所示花青染料標(biāo)記結(jié)合物:其中,R
文檔編號(hào)C07D403/00GK1235165SQ99106379
公開日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1999年5月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月7日
發(fā)明者重藤修行, 宮崎仁誠(chéng) 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社