專(zhuān)利名稱(chēng)：具有免疫細(xì)胞趨化和造血刺激活性的趨化因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的具有免疫細(xì)胞趨化和造血刺激活性的多肽及其突變體、編碼所說(shuō)的多肽的多核苷酸序列、生產(chǎn)所說(shuō)的多肽的方法以及所說(shuō)的多肽及其核苷酸編碼序列在診斷或治療免疫系統(tǒng)疾病、造血系統(tǒng)疾病及腫瘤中的應(yīng)用。
細(xì)胞因子是指由機(jī)體細(xì)胞合成并分泌的小分子多肽類(lèi)因子，它們調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能和免疫功能，并在參與多種細(xì)胞的增殖和分化的過(guò)程中，發(fā)揮極為重要的生理或病理功能。細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素、集落刺激因子、干擾素、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子等。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)展，對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)、功能、受體、信號(hào)傳導(dǎo)、表達(dá)調(diào)控等有了深入的了解。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑藥物已在臨床得到應(yīng)用，收到良好的療效，開(kāi)辟了細(xì)胞因子新的廣闊應(yīng)用前景。
在細(xì)胞因子中，有一類(lèi)具有細(xì)胞趨化作用的小分子多肽，能吸引免疫細(xì)胞到免疫應(yīng)答局部，并參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。大多數(shù)的這類(lèi)因子是約含100個(gè)氨基酸的多肽類(lèi)分子，現(xiàn)將其命名為趨化因子(chemokine)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)可主要分為4個(gè)趨化因子亞家族CXC、CC、CX3C和C亞家族，其中的C代表半胱氨酸，X代表任一種氨基酸。CXC趨化因子的基因多數(shù)定位于第4對(duì)染色體，其成員包括白細(xì)胞介素-8(IL-8)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IFN-IP-10)、MGSA等，它們?cè)谏矬w內(nèi)主要起活化和趨化中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞作用。CC趨化因子多數(shù)基因定位于第17對(duì)染色體上，其成員包括巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α、β(MIP-1α，β)、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、RANTES等，它們則主要活化和趨化單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜鹼性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等。CX3C亞家族目前只發(fā)現(xiàn)一個(gè)成員，即Fractalkine，其主要功能是活化和趨化T細(xì)胞和單核細(xì)胞。C亞家族目前也只發(fā)現(xiàn)一個(gè)成員，即Lymphotactin(Ltn)，主要趨化淋巴細(xì)胞。趨化因子的受體均屬于G蛋白受體家族，其結(jié)構(gòu)特征是具有7個(gè)穿膜區(qū)。根據(jù)其結(jié)合的趨化因子的亞家族成員不同，分別被命名為CXCR1，2，3，4；CCR1，2，3，4，5，6，7；CX3CR等(參見(jiàn)Marco B et al，Human ChemokinesAn UpdateAnnu.Rev.Immunol.1997.15675-705)。大量的功能研究表明，趨化因子在機(jī)體的免疫防御、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、造血調(diào)節(jié)、血管生成等方面發(fā)揮重要的作用。近年還發(fā)現(xiàn)人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)可利用趨化因子的受體做為其侵入機(jī)體免疫細(xì)胞的受體，證明了趨化因子與HIV的感染和致病有密切的關(guān)聯(lián)，并且提示有可能利用趨化因子做為藥物阻斷HIV侵入免疫細(xì)胞(Cocchi F，et al.Identification of RANTES，MIP-1，and MIP-1 as the Major HIV-Suppressive FactorsProduced by CD8+T Cells。Science，15 December 1995，p.1811)。臨床資料分析表明，在一些感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等病理?xiàng)l件下，趨化因子的體內(nèi)含量可發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)異常性表達(dá)，表現(xiàn)為趨化因子及其受體的缺陷，趨化因子表達(dá)過(guò)度，以及可溶性趨化因子受體水平增加等。因而，檢查趨化因子水平有可能對(duì)一些疾病進(jìn)行輔助診斷、病程觀察、療效判斷及治療監(jiān)測(cè)。在臨床治療應(yīng)用方面，目前已有一些基因工程的趨化因子藥物及其相關(guān)藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)治療，有望成為新一代的生物技術(shù)藥物。例如，髓樣造血祖細(xì)胞抑制因子(MPIF-1)是一種CC趨化因子，該因子在腫瘤大劑量放、化療中有可能被用作為造血保護(hù)劑發(fā)揮治療效用(Marshall A，HGS launches″first″genomicsproduct in clinic.Nat Biotechnol 1998，16129)。
以上表明細(xì)胞因子或趨化因子具有十分重要的研究和臨床應(yīng)用意義，因此進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞因子或趨化因子尤為重要。鑒于人髓樣白血病細(xì)胞系U937在有絲分裂原PHA的刺激下能夠產(chǎn)生多種已知的細(xì)胞因子或趨化因子(Brantschen S，Gauchat JF，de Week AL et al.Differential expression of cytokinemRNAs in human cell lines.Lymphokine Res 1989 8(3)163-72)，而白細(xì)胞介素-10(IL-10)具有抑制多種細(xì)胞因子表達(dá)的功能(Di-Hwei，H et al，Science，1990，250，830)，我們利用了Diatchenko L等人描述的抑制性遞減雜交(SSH)技術(shù)(Diatchenko L，Y FC，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationAmethod for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes andlibraries.Pro Natl Acad Sci USA.1996 936025-30)從IL-10抑制的人髓樣白血病細(xì)胞系U937 cDNA中分離并克隆了新的趨化因子基因。經(jīng)同源性分析顯示，其核苷酸序列與已知基因的核苷酸序列無(wú)明顯的同源性。我們利用已建立的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)深入研究了該多核苷酸的結(jié)構(gòu)特征，并在原核和真核細(xì)胞中成功地表達(dá)了由所說(shuō)的多核苷酸編碼的UCK-1多肽及其同系物和變異體。生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的UCK-1多肽作為一種分泌性的小分子趨化因子多肽，對(duì)多種免疫細(xì)胞具有明顯的趨化活性，并且對(duì)骨髓造血細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和集落形成的作用。同時(shí)，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了UCK-1的至少3種變異體形式，可能為UCK-1 mRNA的不同剪切體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有免疫細(xì)胞趨化和造血刺激活性的多肽，及其具有生物學(xué)活性的變異體、類(lèi)似物、衍生物或其片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸分子，其中包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA及其類(lèi)似物和其具有生物學(xué)活性的片段。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)所說(shuō)的多肽的方法，該方法包括在適于表達(dá)本發(fā)明的多肽的條件下培養(yǎng)含有編碼所說(shuō)多肽之核酸序列的重組體原核或真核宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基和/或溶胞產(chǎn)物中回收所說(shuō)的多肽。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有作為活性成分的上述多肽及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述多肽或編碼這些多肽的多核苷酸，在生產(chǎn)用于診斷或治療免疫功能紊亂相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供與上述多肽發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的多克隆或單克隆抗體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供可用于抑制上述多肽的作用的拮抗劑，以及這些拮抗劑在生產(chǎn)用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫病及病毒感染等的藥物中的應(yīng)用。
下列附圖是舉例顯示本發(fā)明的實(shí)施方案，而不意味著限制本發(fā)明的待批要求的范圍。


圖1顯示本發(fā)明的UCK-1的cDNA序列(SEQ ID NO1)及由之推測(cè)的蛋白質(zhì)UCK-1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。圖2顯示本發(fā)明的多肽的一種變異體UCK-2的cDNA編碼區(qū)序列(SEQ ID NO3)及由之推測(cè)的蛋白質(zhì)UCK-2的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。圖3顯示本發(fā)明的另一種變異體UCK-3的cDNA編碼區(qū)序列(SEQ ID NO5)及由之推測(cè)的蛋白質(zhì)UCK-3的氨基酸序列(SEQ IDNO6)。圖4顯示本發(fā)明的另一種變異體UCK-4的cDNA編碼區(qū)序列(SEQ IDNO7)及由之推測(cè)的蛋白質(zhì)UCK-4的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。由所示氨基酸序列組成的多肽是已鑒定的成熟形式的多肽(減去起始蛋氨酸殘基)，并且其中使用標(biāo)準(zhǔn)的三字母縮寫(xiě)符號(hào)表示各氨基酸，上述序列均已在GenBank登記，UCK-1登記號(hào)為AF096895；UCK-2登記號(hào)為AF 135380；UCK-3登記號(hào)為AF135381；UCK-4登記號(hào)為AF145216。上述序列將于99年10月在GenBank公布。
圖5是對(duì)U937細(xì)胞進(jìn)行白細(xì)胞介素-10抑制表達(dá)研究中所使用的抑制性底物雜交(SSH)的技術(shù)路線示意圖。
圖6顯示用于在真核宿主中表達(dá)本發(fā)明的細(xì)胞趨化蛋白質(zhì)UCK-1的重組表達(dá)載體pcDIUCK-1，2，3，4的構(gòu)建。
圖7顯示本發(fā)明的UCK-1蛋白質(zhì)對(duì)多種細(xì)胞的趨化活性。
圖8顯示本發(fā)明的UCK-1蛋白質(zhì)對(duì)哺乳動(dòng)物造血細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)活性。
圖9顯示本發(fā)明的UCK-1，2，3蛋白質(zhì)對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性。
圖10顯示利用反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)UCK-1及其變異體UCK-2，3，4在腫瘤和正常組織的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供編碼具有圖1(SEQ ID NO2)所示推測(cè)的氨基酸序列之成熟多肽的分離的多核苷酸及其突變序列。生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)顯示所說(shuō)的多肽是具有顯著的CC家族趨化因子的生物學(xué)活性的成熟多肽。
可在人的結(jié)腸、胰腺、腦、心臟和胚胎組織，以及相關(guān)組織來(lái)源的腫瘤中檢測(cè)到編碼UCK-1的多核苷酸。該多核苷酸含有編碼99個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放讀框(從核苷酸152個(gè)到449)。并且可在多種腫瘤組織中包括結(jié)腸癌、肺腺癌、前列腺癌、卵巢癌在內(nèi)的和相應(yīng)胚胎組織中檢測(cè)到UCK-1的變異體UCK-2，UCK-4的多核苷酸。UCK-2多核苷酸編碼序列含有編碼152個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放讀框(ORF)；UCK-3多核苷酸編碼序列含有編碼67個(gè)氨基酸殘基的ORF；UCK-4多核苷酸編碼序列含有編碼120個(gè)氨基酸殘基的ORF。
本發(fā)明的多核苷酸編碼序列可以是RNA形式的或DNA形式的，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。所說(shuō)的DNA可以是雙鏈或單鏈的。如果是單鏈的，其可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。
編碼成熟多肽的編碼序列可以完全相同于SEQ ID NO1所示的或已保藏的重組體大腸桿菌所攜帶的編碼序列，或者由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，其可以是不同于編碼相同成熟多肽及其衍生物的如SEQ ID NO1所示的或已保藏的重組體大腸桿菌中所攜帶的DNA編碼序列。
編碼SEQ ID NO2所示成熟多肽的多核苷酸可以只包括成熟多肽的編碼序列或包括成熟多肽的編碼序列和附加編碼序列、成熟多肽的編碼序列和非編碼序列，例如內(nèi)含子或成熟多肽之編碼序列的5′和/或3′端非編碼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼具有SEQ ID NO2所示推測(cè)的氨基酸序列之多肽或由已保藏的重組體大腸桿菌所攜帶的cDNA編碼之多肽的片段、類(lèi)似物及衍生物的上述多核苷酸的變異體，多核苷酸的變異體可以是該多核苷酸的天然存在的等位基因變異體、mRNA不同剪切變異體或其非天然存在的變異體。這樣的變異體也可以是編碼與具有如SEQ ID NO2所示推測(cè)的氨基酸序列的多肽有相同或相似生物學(xué)活性之多肽的缺失變異體、取代變異體及加入或插入變異體。所說(shuō)的等位變異體是可以帶有核苷酸取代、缺失或加入的，但實(shí)質(zhì)上沒(méi)有改變所編碼之多肽的功能的多核甘酸序列的可替代形式。本發(fā)明的UCK-2編碼序列(SEQ ID NO3，)、UCK-3(SEQ ID NO5)和UCK-4(SEQ ID NO7)即屬于此類(lèi)變異體形式的多核苷酸序列。由這些變異的核苷酸編碼序列編碼的UCK變異體可以在功能上與本發(fā)明的UCK-1相同、相似或不同。
可以使用本發(fā)明全長(zhǎng)基因的小片段作為cDNA文庫(kù)的雜交探針，以從cDNA文庫(kù)分離全長(zhǎng)度基因及其與本發(fā)明的UCK基因有高度序列同源的核苷酸序列。這些探針一般至少有30個(gè)堿基，并且也可含有多達(dá)50個(gè)以上的堿基。可使用這些探針鑒定相當(dāng)于全長(zhǎng)度轉(zhuǎn)錄物和含有完整基因之基因組克隆的cDNA克隆。方法包括根據(jù)已知的DNA序列合成寡核苷酸探針，并在雜交條件下使用含有與本發(fā)明的基因互補(bǔ)之DNA序列的標(biāo)記的寡核苷酸與人cDNA基因組DNA或RNA文庫(kù)雜交，從中分離出文庫(kù)中與探針雜交所需要的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及與上述序列至少有70％，較好90％，最好95％序列相同性的序列雜交的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。所說(shuō)的“嚴(yán)格條件”是指只有當(dāng)序列間至少有95％相同性時(shí)才發(fā)生雜交的雜交條件。與上述多核苷酸雜交的多核苷酸最好是編碼與SEQ ID NO1所示cDNA編碼的成熟多肽有基本上相同生物學(xué)活性之多肽的多核苷酸。
另外，與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸可以是至少有10堿基，最好有30個(gè)堿基的連續(xù)序列，并且可以是有或沒(méi)有保留活性的?？墒褂眠@樣的多核苷酸作為回收或探查SEQ ID NO1所示多核苷酸的探針，或作為診斷探針，或作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物。
因此，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2所示多肽的多核苷酸至少有70％，最好有90％相同性的多核苷酸及其至少有10個(gè)堿基，最好有30個(gè)堿基的片段，以及由這樣的多核苷酸編碼的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有免疫細(xì)胞趨化活性和造血細(xì)胞刺激活性的本發(fā)明命名為UCK-1的多肽，該多肽具有如SEQ ID NO1所示的推測(cè)的氨基酸序列或具有由已保藏的重組體大腸桿菌所攜帶的多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，以及這些多肽的具有基本上相同功能或活性的片段、類(lèi)似物和衍生物，并且其中所說(shuō)的衍生物包括提高了或降低了生物學(xué)功能的多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組的多肽，天然多肽或合成的多肽，但最好是重組的多肽。
具有圖SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽或由已保藏的生物學(xué)材料攜帶的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類(lèi)似物可以是其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括有取代基的，或者其中成熟的多肽是與其他化合物，如用于提高該多肽之半壽期的化合物(如聚乙二醇或脂質(zhì))相融合的，或者其中為純化該成熟多肽而在其側(cè)翼融合有附加氨基酸序列的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物。
本發(fā)明的多肽或多核苷酸最好是以分離的形式提供的，并且最好是純化成均質(zhì)材料的。所說(shuō)的“分離的”是指已離開(kāi)了其原有環(huán)境，如離開(kāi)了活的生物體的或已離開(kāi)其部分或全部共存材料的多肽或多核苷酸。這樣的多核苷酸可以是某種載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸可以是某種組合物的一部分，因?yàn)榇藭r(shí)這樣的載體或組合物已不是其天然環(huán)境的一部分，所以所說(shuō)的多肽或多核苷酸仍是被分離的。
本發(fā)明的多肽包括如SEQ ID NO2所示的多肽，以及與之至少有70％同源性，較好有90％同源性，最好有95％同源性或相似性的多肽，并且包括這些多肽的一部分，其中所說(shuō)多肽的一部分一般至少包括20個(gè)氨基酸，較好包括至少40個(gè)氨基酸。如眾所周知，兩個(gè)多肽的“同源性”或“相似性”是通過(guò)將一種多肽的氨基酸序列和其保守的氨基酸取代物與第二種多肽的序列相比較而確定的。
可使用本發(fā)明多肽的片段或其一部分作為中間體，以肽合成法制備相應(yīng)的全長(zhǎng)度多肽，也可使用本發(fā)明多核苷酸的片段或其部分來(lái)合成本發(fā)明的全長(zhǎng)度多核苷酸。
本發(fā)明還涉及攜帶所說(shuō)的多核苷酸的載體、用該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。
可用攜帶本發(fā)明多核苷酸的克隆載體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。所用的載體例如可以是質(zhì)粒、病毒顆?；蚴删w形式的?？稍跒榛罨瘑?dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增所需的UCK-1基因而適當(dāng)修飾的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)中所使用的溫度、pH等培養(yǎng)條件一般都是由所選用的表達(dá)特定蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞決定的，并且這些條件都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
可按重組DNA技術(shù)使用本發(fā)明的多核苷酸生產(chǎn)本發(fā)明具有免疫細(xì)胞趨化活性和造血細(xì)胞刺激活性的多肽。為此，可將所說(shuō)的多核苷酸插入到各種用于表達(dá)該多肽的適當(dāng)表達(dá)載體中。這樣的載體包括染色體、非染色體來(lái)源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、噬菌粒(由質(zhì)粒和噬菌體DNA組合體衍生的載體)、以及病毒(如桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)DNA，條件是這些載體能夠在所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制并存活。
可用各種已知的方法將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入到載體的適當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)中。插入到表達(dá)載體中的DNA序列被可操作地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列即啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這樣的啟動(dòng)子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體λPL啟動(dòng)子及在原核或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的其他啟動(dòng)子。
此外，表達(dá)載體可含有啟動(dòng)翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止子，并含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)志基因，以提供被轉(zhuǎn)化之宿主細(xì)胞的可選擇表型特征，如適用于真核細(xì)胞的新霉素抗性或二氫葉酸還原酶基因，或適用于大腸桿菌中的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性基因。
可用含有上文所述適當(dāng)DNA序列，以及適當(dāng)啟動(dòng)子或其他轉(zhuǎn)錄與翻譯控制序列的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使宿主表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。
可使用任何適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸，可提到的適當(dāng)宿主的例子有細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等；真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅和中國(guó)家蠶細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS和HEK293細(xì)胞；以及人細(xì)胞如TF-1細(xì)胞、U937細(xì)胞和Hela細(xì)胞。
具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及包括上述一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列的重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括在其中以正向或反向插入了本發(fā)明的多核苷酸序列的載體，如質(zhì)粒或病毒載體，并且在所說(shuō)的多核苷酸序列的上游可操作地連接了適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列。
適用的載體的例子包括用于真核細(xì)胞的pMT-hIL-3(馬大龍，狄春輝，龐健等，(1991)高技術(shù)通訊1126-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；以及適用于真核細(xì)胞的pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。適用的啟動(dòng)子包括lacI、lacII、T7、λPL和trp等細(xì)菌啟動(dòng)子，以及CMV、SV40、HSV胸苷激酶等真核細(xì)胞啟動(dòng)子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人腫瘤細(xì)胞，或者是低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或者是原核細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法如氯化鈣轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法或微粒轟擊法將所說(shuō)的構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。
可按常規(guī)方法使用包含在宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體產(chǎn)生由重組DNA序列編碼的多肽產(chǎn)物?；蛘撸部墒褂贸Ｒ?guī)的肽合成儀化學(xué)合成本發(fā)明的多肽?；蛘?，也可使用衍生于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的mRNA，在無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
必要時(shí)，為了提高編碼本發(fā)明多肽的DNA在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄效率，可在載體中插入增強(qiáng)子序列。增強(qiáng)子一般是約含10-300個(gè)堿基對(duì)并作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)DNA轉(zhuǎn)錄的順式作用元件。另外，必要時(shí)也可在啟動(dòng)子和下游結(jié)構(gòu)序列之間插入一個(gè)能指導(dǎo)翻譯產(chǎn)物向周質(zhì)或細(xì)胞外培養(yǎng)基中分泌的前導(dǎo)序列(分泌信號(hào))?；蛘撸筛鶕?jù)需要導(dǎo)入編碼融合蛋白質(zhì)的異源DNA序列，所說(shuō)的融合蛋白質(zhì)可包括一個(gè)賦予所需特征，如用于穩(wěn)定被表達(dá)之產(chǎn)物的或簡(jiǎn)化其純化步驟的N未端識(shí)別肽。
可適用于原核細(xì)胞的市售表達(dá)載體一般均帶有可選擇標(biāo)志和細(xì)胞復(fù)制原點(diǎn)，以及已知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的其他遺傳元件。這樣的市售載體包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)?？筛鶕?jù)所選用的適當(dāng)啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因序列來(lái)選擇衍生于pBR322的適當(dāng)載體。
在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度變動(dòng)或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo))誘導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培養(yǎng)之。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞。
也可用各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括人腫瘤細(xì)胞系，如Hela、TF-1和U937細(xì)胞系，以及COS、CHO和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可含有復(fù)制原點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)、切接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列，及5′側(cè)翼非編碼序列。可使用衍生于SV40的切接和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列來(lái)提供必要的遺傳元件。
可以用各種已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的UCK-1及其變異體多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過(guò)濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。
本發(fā)明的多肽可以是從天然來(lái)源純化的或化學(xué)合成的，或以重組DNA技術(shù)由原核或真核宿主產(chǎn)生的。根據(jù)重組生產(chǎn)方法中所用宿主的不同，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的，并且可以包括一個(gè)起始蛋氨酸殘基。
利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)UCK-1在不同組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了UCK-1在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，特別令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)在某些細(xì)胞中存在有UCK-1的變異體形式。對(duì)這些變異體基因的克隆化和序列分析，證明它們分別編碼152個(gè)、67個(gè)和120個(gè)氨基酸，分別將其命名為UCK-2、UCK-3和UCK-4蛋白質(zhì)。據(jù)我們推測(cè)，這些變異體很可能是UCK-1基因的不同的剪切形式。特別是發(fā)現(xiàn)UCK-2在多種原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中高表達(dá)，而正常細(xì)胞中的表達(dá)水平則相對(duì)較低。因此，它們的存在對(duì)于腫瘤發(fā)生研究和臨床診斷將具有重要的潛在價(jià)值。
在實(shí)施例中，用一個(gè)已構(gòu)建的攜帶編碼UCK-1多肽之多核苷酸序列的重組表達(dá)載體(pcDI-UCK-1，pcDI-UCK-2，pcDI-UCK-3)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，經(jīng)生物活性分析研究培養(yǎng)物和細(xì)胞裂解物的趨化作用，發(fā)現(xiàn)UCK-1，2，3系分泌性蛋白。上述這些結(jié)果提示該多肽為分泌性的具有趨化活性的趨化因子，在免疫調(diào)節(jié)和造血調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
由于本發(fā)明的多肽具有多種生物學(xué)活性，因而具有多方面的應(yīng)用價(jià)值，例如本發(fā)明的基因工程的重組UCK-1及其變異體由于可具有造血刺激效應(yīng)，有可能利用本發(fā)明在造血系統(tǒng)疾病的治療方面發(fā)揮作用，包括原發(fā)性或繼發(fā)性造血功能障礙等。
本發(fā)明的基因工程的重組UCK-1及其變異體由于可具有免疫細(xì)胞趨化活性，有可能將其應(yīng)用于腫瘤和感染性疾病的治療。
本發(fā)明的UCK-1及其變異體的基因?qū)塍w內(nèi)，特別是導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞作為腫瘤疫苗，有可能作為新的基因治療手段在腫瘤治療發(fā)揮療效。
由于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)UCK-1和UCK-2基因在腫瘤中高表達(dá)，從而為進(jìn)一步了解其在腫瘤發(fā)病的作用，將其用于腫瘤檢測(cè)和腫瘤治療目的提供了必要的基礎(chǔ)。
由于UCK-1及其變異體的可具有炎癥細(xì)胞趨化作用(參見(jiàn)圖4)，有可能將其做為抗炎癥治療的藥物新靶點(diǎn)，通過(guò)抗UCK-1及其變異體抗體或其它封閉劑治療自身免疫性疾病。
由于本發(fā)明的UCK-1及其變異體具有體內(nèi)刺激骨骼肌細(xì)胞增殖的作用(參見(jiàn)實(shí)施例8)，有可能利用其治療各種原因造成肌肉萎縮或其他退行性病變。
由于本發(fā)明的UCK-1及其變異體具有體內(nèi)刺激骨骼肌細(xì)胞增殖的作用(參見(jiàn)實(shí)施例8)，而在DNA疫苗或DNA藥物直接肌肉注射表達(dá)時(shí)，增殖中的骨骼肌更易于接受DNA，因而可將UCK-1及其變異體與DNA疫苗或DNA藥物同時(shí)或先后注射，以促進(jìn)DNA疫苗或DNA藥物的免疫及治療效果。
由于本發(fā)明的UCK-1及其變異體具有體內(nèi)刺激毛囊細(xì)胞增殖的作用，有可能利用其促進(jìn)毛囊增生，治療脫發(fā)癥。
可使用本發(fā)明的多肽，其片段或類(lèi)似物或衍生物，或攜帶其編碼序列并表達(dá)這些多肽的細(xì)胞作為免疫原，以生產(chǎn)該多肽的抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體，并且包括嵌合的、單鏈的和人源化的抗體及其Fab片段?？捎酶鞣N已知的方法生產(chǎn)這些抗體和其片段。以常規(guī)方法得到的抗體可與多肽本身結(jié)合。一般說(shuō)來(lái)，使用只編碼本發(fā)明的多肽之一部分的序列產(chǎn)生的抗體也能夠與整個(gè)天然多肽結(jié)合。然后可用這樣的抗體從表達(dá)本發(fā)明多肽的組織材料中分離所需的多肽。
可用雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，Nature 256495-497，1975)或人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，Immunology Today 472，1983)生產(chǎn)人單克隆抗體。另外，可用轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)表達(dá)抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
另外，可用反義技術(shù)制備反義構(gòu)建體，通過(guò)三股螺旋形成反義DNA或RNA來(lái)控制基因表達(dá)。例如，可使用編碼本發(fā)明多肽之多核苷酸序列的5′編碼部分設(shè)計(jì)10-30bp長(zhǎng)度的反義RNA寡核苷酸。也可設(shè)計(jì)與基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域互補(bǔ)的DNA寡核苷酸，從而借以阻止表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生(參見(jiàn)Cooney et al.，Science241456，1988；Dervan et al.，Science 2511360，1991)。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交并阻斷mRNA分子的翻譯。
可使用本發(fā)明的多肽或其拮抗劑作為基本活性成分，與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑混合，制成藥物組合物。根據(jù)治療目的和給藥途徑，以及使用方法的不同，可使用不同的載體或賦形劑將本發(fā)明的藥物組合物制成多種不同的劑型。例如可制成適于各種給藥途徑，特別是胃腸道外途徑給藥的溶液劑、脂質(zhì)體包裹劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑。使用的載體或賦形劑包括但不只限于生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇和其組合?？筛鶕?jù)需要，在本發(fā)明的組合物中加入一種或多種其他輔助成分，例如有與本發(fā)明的UCK-1有協(xié)同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物，以及選自人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸(如甘氨酸或賴(lài)氨酸)和金屬陽(yáng)離子(如Zn2+，Mn2+，Mg2+和Ca2+)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑；選自聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑；以及適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?。在粘膜或皮膚局部給藥的情況下，所說(shuō)的組合物可含有例如選自二甲基亞砜和月桂氮卓酮的皮膚滲透劑，以及適當(dāng)?shù)淖杂苫宄齽?br> 為了使用上的方便和便于維持組合物各成分特別基本活性成分的生物學(xué)活性，可將本發(fā)明的藥物組合物制作成藥盒的包裝形式，這樣的藥盒可包括一個(gè)或多個(gè)裝有本發(fā)明藥物組合物之一種或多種成分的容器，并在每個(gè)容器上按政府制藥管理機(jī)構(gòu)指定的形式注明有關(guān)藥物的使用或銷(xiāo)售的批號(hào)及相關(guān)信息。
可通過(guò)常規(guī)途徑，特別是胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物，例如通過(guò)靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或粘膜內(nèi)途徑給藥。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾微克到幾毫克/公斤體重/天，但針對(duì)每個(gè)特定病人的具體用藥劑量應(yīng)根據(jù)待治療疾病或病理狀態(tài)的性質(zhì)及嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重、一般健康狀況及給藥方式等因素由臨床醫(yī)生來(lái)確定。
也可以根據(jù)本發(fā)明在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的多肽，即以所謂的“基因治療”方法使用這些多肽。例如，可以用編碼本發(fā)明。多肽的多核苷酸于體外基因工程化處理病人的細(xì)胞，然后再將工程化改造的細(xì)胞導(dǎo)入欲用所說(shuō)的多肽治療的病人體內(nèi)。例如可使用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒來(lái)轉(zhuǎn)染并工程化改造所說(shuō)的在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞?？砂匆阎椒▽a(chǎn)生含有編碼本發(fā)明多肽之反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞投用于病人體內(nèi)，以在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程化改造并在體內(nèi)表達(dá)所說(shuō)的多肽。
上述這些方法以及用于這些方法的反轉(zhuǎn)錄病毒、包含在載體內(nèi)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、包括啟動(dòng)子和處于適當(dāng)啟動(dòng)子控制下之多核苷酸編碼序列的載體、用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體，以及適當(dāng)?shù)目杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞都是基因治療領(lǐng)域中已知的。
可借助各種已知的方法用攜帶本發(fā)明多肽之核酸編碼序列的載體體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞或靶細(xì)胞。這些方法包括但不只限于電穿孔、微粒轟擊(例如使用Biolistic裝置)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，以及磷酸鈣沉淀法或這些方法的聯(lián)合使用。另外，也可以將反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裹在脂質(zhì)體中，或者偶聯(lián)到脂質(zhì)體上，然后再運(yùn)送到宿主體的適當(dāng)靶細(xì)胞內(nèi)。
總之，可由生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生包含本發(fā)明多肽之核酸編碼序列的感染性反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，然后使用這樣的載體顆粒于體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所說(shuō)多肽的核酸序列。可被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不只限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞和成人癌細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞及表皮細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的多核苷酸作為診斷試劑，檢測(cè)突變形式的基因以診斷因體內(nèi)UCK-1表達(dá)不足或表達(dá)過(guò)量所導(dǎo)致的疾病或病理狀態(tài)。
可用各種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)攜帶UCK-1基因突變的個(gè)體。可從病人的體液中，如血液、尿液、唾液或活體或尸檢材料中得到用于診斷試驗(yàn)的核酸?？梢允褂没駾NA或RNA直接進(jìn)行檢測(cè)，也可以使用PCR方法(Saiki et al.，Nature 324163-166，1986)擴(kuò)增DNA后再進(jìn)行檢測(cè)。例如，可使用與編碼本發(fā)明多肽的核酸互補(bǔ)的PCR引物鑒定和分析待檢材料中相應(yīng)基因的突變，如可與正?；蛐拖啾容^并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小改變來(lái)確定待檢基因的缺失或插入?？蓪U(kuò)增的DNA與放射標(biāo)記的UCK-1及其變異體RNA或反義DNA序列雜交，以鑒定點(diǎn)突變。
可用直接DNA測(cè)序法分析參考基因和突變基因之間的序列差異。另外，也可利用克隆的DNA片段作為探針并結(jié)合PCR方法，以高敏感性和特異性來(lái)檢測(cè)特定的DNA片段，例如可聯(lián)合使用測(cè)序引物和由擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的單鏈PCR產(chǎn)物或單鏈模板分子。
可以在含有或不含變性劑的凝膠，特別是高分辨率凝膠中檢測(cè)DNA的電泳遷移率來(lái)完成基于DNA序列差異的遺傳學(xué)試驗(yàn)。可在變性甲酰胺梯度凝膠上區(qū)分不同序列的DNA片段(如參見(jiàn)Myers et al.，Science 2301242，1985)。另外，也可用核酸酶保護(hù)檢測(cè)法或化學(xué)裂解法(如參見(jiàn)Cotton et al.，PNAS，USA，854397-4401，1985)揭示特定部位的序列改變。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)各種組織中UCK-1及其變異體蛋白質(zhì)水平改變的診斷試驗(yàn)法。用于檢測(cè)得自宿主體內(nèi)之樣品中的UCK-1及其變異體蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并包括放射免疫法、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合法、Western印跡分析法及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。其中優(yōu)選的方法是ELISA法。
本發(fā)明的多核苷酸序列對(duì)于染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列可特異地定位于個(gè)別人染色體的特定位置并可與之雜交。按照本發(fā)明，對(duì)本發(fā)明的DNA進(jìn)行染色體作圖是將這些序列與疾病相關(guān)基因聯(lián)系起來(lái)的第一個(gè)重要步驟。
可從cDNA制備PCR引物以進(jìn)行序列的染色體作圖。對(duì)基因的3′非翻譯區(qū)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，以迅速選擇出跨越基因組DNA中一個(gè)以上外顯子并從而加入擴(kuò)增過(guò)程中的引物。然后使用這些引物以PCR法篩選含有個(gè)別人染色體的體細(xì)胞雜種。只有那些含有對(duì)應(yīng)于引物之人類(lèi)基因的雜種才產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。對(duì)體細(xì)胞雜種進(jìn)行PCR作圖是一種指定特定DNA在特定染色體上的位置的便利方法。在按照本發(fā)明使用同樣的寡核苷酸引物的情況下，可用一組得自特定染色體的片段或大的基因組克隆群體按相似方法完成亞定位。然后再用螢光原位雜交法(FISH)對(duì)cDNA克隆進(jìn)行精確的染色體定位(參見(jiàn)Verma et al.，HumanchromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NY(1988))。
一旦完成了序列的精確染色體定位作圖，即可將該序列的物理位置與遺傳圖數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(lái)。然后通過(guò)連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)來(lái)鑒定作圖定位于同一染色體區(qū)域上的基因與疾病之間的關(guān)系。然后，可確定受損或未受損個(gè)體間的cDNA或基因組DNA的差異。如果在某些或全部受損個(gè)體中觀察到突變，而正常個(gè)體中沒(méi)有觀察到這種突變，則該突變便很可能是致病因素。
以下借助實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，但應(yīng)明確的是，這些實(shí)施例并不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍的限制。
實(shí)施例1從U937細(xì)胞cDNA中分離IL-10抑制的相關(guān)基因根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IL-10是一種細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)，可對(duì)多種來(lái)源的細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF等產(chǎn)生抑制效應(yīng)，(Di-Hwei，H et al，Science，1990，250，830)。推斷IL-10抑制的基因中，必然有目前尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子或趨化因子，因而采用文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的抑制性遞減雜交(SSH)技術(shù)(參見(jiàn)Diatchenko L，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationA methodfor generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Pro Natl Acad Sci USA.1996 936025-30)從U937細(xì)胞中分離IL-10抑制的細(xì)胞因子候選基因。
以10μg/mlPHA刺激8小時(shí)的U937細(xì)胞為試驗(yàn)者cDNA(Tester cDNA)來(lái)源，以同樣濃度PHA刺激并同時(shí)加100ng/ml IL-10抑制的U937細(xì)胞為驅(qū)動(dòng)者cDNA(Driver cDNA)來(lái)源。計(jì)數(shù)并調(diào)整兩種cDNA來(lái)源細(xì)胞數(shù)一致，達(dá)到1×107個(gè)/ml。
細(xì)胞總RNA的提取是利用GIBCO-BRL公司的TRIzolTM試劑；mRNA的提取是利用Pharmacia公司的Quick Prep Micro mRNA purification kit，詳細(xì)操作過(guò)程均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA復(fù)溶于無(wú)RNase的水中，分光光度計(jì)(Backman640)定量后，用于Northern blot雜交和文庫(kù)構(gòu)建。
采用Clontech PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit提供的寡核苷酸、試劑和酶，分別以上述Driver和Tester mRNA為模板，進(jìn)行單鏈及雙鏈cDNA的合成。
SSH差示雜交詳細(xì)操作過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用glassmilk將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即差異cDNA片段回收并克隆到PGEM-T easy載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL1-Blue菌，挑陽(yáng)性克隆，用PEG沉淀方法純化質(zhì)粒DNA，然后利用自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行序列分析。將測(cè)序所得到的序列通過(guò)國(guó)際互連網(wǎng)在GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行同源性比較，與數(shù)據(jù)庫(kù)同源性低于90％的序列為新基因，通過(guò)GenBank中的BankIt功能進(jìn)行新基因登記。其中一個(gè)可能有某些重要功能的基因定名為UCK-1(該基因在GenBank的登記號(hào)為AF096895)。
實(shí)施例2UCK-1 mRNA表達(dá)的Northern blot檢測(cè)使用TriZ0LTM試劑盒(GIBCO-BRI Co.)提取各大約1×107個(gè)PHA刺激培養(yǎng)8小時(shí)后的U937細(xì)胞及相同數(shù)目PHA刺激培養(yǎng)，并加100ng/ml IL-10抑制的U937細(xì)胞的總RNA。提取的總RNA經(jīng)分光光度計(jì)(Beckman 640)定量后，按文獻(xiàn)(Sambrook J.Fritsch EF，Maniatic T(1989)″Molecular cloning-a Laboratorymanual″2ndedition，pp343-374，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA)所述方法并使用隨機(jī)引物熒光素標(biāo)記試劑盒(Dupont NEN NEL803)進(jìn)行Northern雜交。結(jié)果顯示UCK-1在PHA培養(yǎng)8小時(shí)后的U937細(xì)胞中高表達(dá)，IL-10能夠抑制其表達(dá)，其分子量大小為約500bp。
實(shí)施例3UCK-1全長(zhǎng)cDNA的序列和結(jié)構(gòu)特征通過(guò)SSH得到了得到UCK-1全長(zhǎng)cDNA序列，大小與上述Northern雜交結(jié)果相吻合。以PHA刺激8小時(shí)和PHA刺激同時(shí)IL-10抑制8小時(shí)的U937細(xì)胞文庫(kù)為模板，利用UCK-1特異引物，擴(kuò)增UCK-1全長(zhǎng)DNA，得到預(yù)期的全長(zhǎng)，所獲序列是正確的，且該基因的表達(dá)可被IL-10所抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因在PHA刺激的U937細(xì)胞中至少有三種不同的剪切形式。
獲得的UCK-1的cDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，UCK-1全長(zhǎng)cDNA為534bp，包括Poly A序列及“ATTAAA”加尾信號(hào)(圖1，上行)。根據(jù)序列分析，UCK-1從第152個(gè)堿基開(kāi)始編碼99個(gè)aa的開(kāi)放讀碼框架(圖1)。利用Prosite計(jì)算機(jī)軟件分析推測(cè)的氨基酸序列，未發(fā)現(xiàn)穿膜區(qū)序列、DNA結(jié)合位點(diǎn)及N-糖基化位點(diǎn)，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，但真核細(xì)胞表達(dá)上清液的活性分析證明UCK-1蛋白可以分泌到細(xì)胞外，屬于分泌性蛋白(參見(jiàn)實(shí)施實(shí)例4)。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)UCK-1的35-79位氨基酸與線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)的amino acidpermease蛋白有46％的同源性，與其它的基因和蛋白無(wú)同源性，表明UCK-1為新的基因。在UCK-1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)連續(xù)的半胱氨酸(CC)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這種結(jié)構(gòu)往往出現(xiàn)于CC家族的趨化因子中，提示UCK-1可能為一種的趨化因子，但UCK-1與目前已知的任何趨化因子均無(wú)明顯的同源性，因而需進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)方能進(jìn)一步確定UCK-1是否屬于CC型趨化因子。
實(shí)施例4UCK-1，2，3，4蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞表達(dá)利用PCR技術(shù)從PHA刺激的U937細(xì)胞cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增得到UCK-1，2，3，4基因的完整開(kāi)放讀碼框架序列，并將其克隆到pGEM-T easy載體中。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI將插入片段釋放出來(lái)，克隆到真核表達(dá)載體pcDI的EcoRI位點(diǎn)中，篩選正向插入克隆，經(jīng)內(nèi)切酶鑒定正確，命名為pcDI-UCK1，2，3，4。使用Qiagen公司的質(zhì)粒純化系統(tǒng)純化質(zhì)粒，應(yīng)用Qiagen公司的高效轉(zhuǎn)染試劑Superfect瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染上清，用作活性分析。用于擴(kuò)增UCK-1，2，3，4編碼區(qū)的引物序列如下5 ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA AT 3
5 CCG CTC GAG TTA CAA AAC TTC TTT TTT TTC 3實(shí)施例5UCK-1蛋白質(zhì)的趨化實(shí)驗(yàn)利用Ficoll-hypaque(1.077)分層液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，用NH4CL.Tris溶解紅細(xì)胞，U937細(xì)胞，K562細(xì)胞，HL-60細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，用1.3％的DMSO刺激HL-60細(xì)胞4天，得到向嗜中性粒細(xì)胞系分化的HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，備作趨化實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染上清作倍比稀釋?zhuān)拥节吇∈蚁聦涌字?，把?zhǔn)備好的細(xì)胞加到趨化小室上層孔中，按要求裝好趨化小室，嗜中性粒細(xì)胞孵育1小時(shí)，其余細(xì)胞孵育3小時(shí)，取膜，刮去非特異細(xì)胞，甲醇固定，Giemsa染色，40倍鏡下，隨機(jī)選5個(gè)視野記數(shù)，取平均值，將UCK-1上清組趨化的細(xì)胞數(shù)與轉(zhuǎn)染pcDI載體組上清組趨化的細(xì)胞數(shù)相比，即得到趨化指數(shù)。結(jié)果如圖7所示，UCK-1對(duì)中性粒細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、U937細(xì)胞、K562細(xì)胞及DMSO刺激的HL-60細(xì)胞均有明顯趨化作用。
實(shí)施例6UCK-1對(duì)正常人低密度骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)的影響利用Ficoll-hypaque(1.077)分離正常人低密度骨髓細(xì)胞，用無(wú)血清1640洗2次，稀釋為2×106/ml，取90μl加到96空培養(yǎng)板中，各作3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加10μl 1640，GM-CSF組加入10μl 20ng/ml GM-CSF，UCK-1和pcDI組各加相應(yīng)的轉(zhuǎn)染上清，培養(yǎng)5天，加入MTT，測(cè)OD570，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCK-1能促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖，其作用強(qiáng)度類(lèi)似于20ng/ml GM-CSF(圖8)。
實(shí)施例7UCK-1，2，3對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)的影響無(wú)菌取Balb/c小鼠骨髓細(xì)胞，用Tris.NH4Cl pH7.2溶解紅細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106/ml。對(duì)照組加10μl正常COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽(yáng)性對(duì)照組加小鼠IL-3和SCF，其它各組加10μl pcDI，UCK-1，UCK-2和UCK-3轉(zhuǎn)染上清，培養(yǎng)90小時(shí)，加入MTT，測(cè)OD570，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCK-1，UCK-2能明顯促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞的增殖，UCK-3作用不明顯(圖9)。
實(shí)施例8UCK-1在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及其變異體UCK-2、UCK-3、UCK-4的發(fā)現(xiàn)為分析UCK-1在各種胚胎組織，成人組織及腫瘤組織的表達(dá)水平和剪切形式，以Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels試劑盒提供的單鏈cDNA文庫(kù)作模板，利用UCK-1編碼區(qū)特異性引物(同構(gòu)建pcDI載體的引物)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)UCK-1在多種胚胎組織和腫瘤組織高表達(dá)，且存在多種不同的變異體，而在正常成人組織中表達(dá)水平低或不表達(dá)(圖10)。說(shuō)明該基因可能與胚胎發(fā)育及腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。
實(shí)施例9UCK-1基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)及生物活性的研究選擇4～6周齡的BABLb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。利用Qiagen公司的質(zhì)粒純化系統(tǒng)純化真核表達(dá)質(zhì)粒pcDI-UCK1，應(yīng)用基因直接注射的方法將pcDI-UCK1注射至小鼠肌肉組織及皮下組織(100μg/只)。注射后第10天、第30天分別采取注射局部的小鼠肌肉組織及皮下組織，通過(guò)組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、酶學(xué)等方法觀察pcDI-UCK1表達(dá)產(chǎn)物在注射組織局部的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDI-UCK1表達(dá)產(chǎn)物具有①趨化炎癥細(xì)胞至注射局部組織的作用；②促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞增殖及分化的作用；③促進(jìn)毛囊角質(zhì)細(xì)胞增殖及分化的作用。
序列表(1)、一般信息(i)申請(qǐng)人北京醫(yī)科大學(xué)、北京北醫(yī)聯(lián)合生物工程公司(ii)發(fā)明名稱(chēng)具有免疫細(xì)胞趨化作用和造血刺激作用的新趨化因子(iii)序列數(shù)6(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人馬大龍(B)街道海淀區(qū)學(xué)院路38號(hào)(C)城市北京(D)國(guó)家中華人民共和國(guó)(E)郵編100083(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介體類(lèi)型3.5英寸軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)奔騰166MMX(C)操作系統(tǒng)WINDOWS95(D)軟件WORD97(vi)電訊信息(A)電話86-10-62091149(B)電傳86-10-62091149
權(quán)利要求
1.編碼如SEQ ID NO2中所示多肽之氨基酸1至99的分離的多核苷酸，或其片段或等位基因變異體，或與之雜交的核苷酸片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸編碼具有由保藏登記號(hào)為CGMCC No.0392的生物學(xué)樣品所包含的DNA表達(dá)之氨基酸序列的成熟多肽。
3.編碼如SEQ ID NO4中所示多肽之氨基酸1至152的分離的多核苷酸，或其片段或等位基因變異體，或與之雜交的核苷酸片段；編碼如SEQ IDNO6中所示多肽之氨基酸1至67的分離的多核苷酸，或其片段或等位基因變異體，或與之雜交的核苷酸片段；編碼如SEQ ID NO8中所示多肽之氨基酸1至120的分離的多核苷酸，或其片段或等位基因變異體，或與之雜交的核苷酸片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是cDNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是RNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是基因組DNA。
7.含有權(quán)利要求1或2或3所述之DNA的載體。
8.用權(quán)利要求7的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
9.具有如SEQ ID No2中所示的氨基酸序列的或由保藏物CGMCC No.0392所含的cDNA編碼的多肽，及其具有功能等同的片段、類(lèi)似物或衍生物。
10.可與權(quán)利要求9的多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體或抑制所說(shuō)多肽的作用的拮抗劑。
11.生產(chǎn)權(quán)利要求8的多肽的方法，包括在適于表達(dá)所說(shuō)的多肽的條件下培養(yǎng)含有編碼如權(quán)利要求9限定的多肽之核酸序列的宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基和/或細(xì)胞裂解物中回收所說(shuō)的多肽。
12.含有作為活性成分的權(quán)利要求9的多肽及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑藥物組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的多肽或根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸在生產(chǎn)用于體外和/或體內(nèi)診斷或治療由于先天或后天引起的造血功能障礙相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所說(shuō)的藥物包括用于體外和/或體內(nèi)診斷或治療肌肉萎縮、肌肉病變、脫發(fā)等疾病的制劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所說(shuō)的藥物包括抗腫瘤劑、抗病毒劑和胚胎發(fā)育及組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定控制劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的多肽或根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸及由之編碼的多肽在生產(chǎn)用于增強(qiáng)DNA疫苗或DNA藥物效力的佐劑中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或拮抗劑在生產(chǎn)用于體內(nèi)和/或體外診斷或治療心臟梗塞、肝壞死、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及自身免疫病的藥物中的應(yīng)用。
18.診斷與權(quán)利要求的多肽表達(dá)不是相關(guān)的疾病的方法，該方法包括體外檢測(cè)編碼所說(shuō)多肽的核酸序列中的突變。
19.一種體外診斷方法，該方法包括分析權(quán)利要求9的多肽在得自宿主體內(nèi)的樣品中的存在。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了人類(lèi)細(xì)胞來(lái)源的一種新的具有免疫細(xì)胞趨化活性和造血細(xì)胞刺激作用的趨化因子類(lèi)多肽及編碼該多肽的核酸序列及其變異體形式。以重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽及其變異體的方法和抗該多肽的抗體和拮抗劑。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有該多肽或其DNA編碼序列及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物,以及所說(shuō)的多肽或編碼所說(shuō)的多肽的核酸在生產(chǎn)用于體外和/或體內(nèi)診斷或治療免疫細(xì)胞功能異常疾病和/或腫瘤放化療導(dǎo)致造血功能低下等疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/52GK1244584SQ9910728
公開(kāi)日2000年2月16日 申請(qǐng)日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月14日
發(fā)明者馬大龍, 韓文玲, 張潁妹, 宋泉聲, 狄春輝, 黃家強(qiáng), 湯建, 陳光慧 申請(qǐng)人:北京醫(yī)科大學(xué), 北京北醫(yī)聯(lián)合生物工程公司