專利名稱：白蛋白和抗體的親和生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一類新的白蛋白親和層析介質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明還涉及用這類新的親和層析介質(zhì)純化生產(chǎn)白蛋白和丙種球蛋白的新方法。
血漿蛋白成份在動(dòng)物體內(nèi)具有重要的生理功用。這些蛋白成份可以分離、加工成適合臨床治療用的各種制劑，分別供臨床上對(duì)癥治療用。目前，國(guó)際上從血漿中制備的蛋白制品有白蛋白(albumin)制劑、免疫球蛋白(immunoglobulin)制劑、凝血因子Ⅷ制劑、凝血因子Ⅸ制劑、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ)、纖維結(jié)合蛋白(fibronectin)、α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin)、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin)等。
通過充分合理的綜合利用血漿中的有效成份和血漿成份，可以達(dá)到全面綜合利用寶貴血漿的目的。既減少了輸用全血造成的不必要的浪費(fèi)，又可以減少血源性疾病的傳播。這些制品大多都應(yīng)用在人的生命受到危險(xiǎn)和遺傳性疾病方面，需要輸入的量大，或持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。因此，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性要求高，市場(chǎng)需求穩(wěn)定。根據(jù)血液制品種類和生產(chǎn)技術(shù)的水平的不同，國(guó)際市場(chǎng)的容量為數(shù)百億美元。
目前，血液制品的生產(chǎn)技術(shù)主要采用低溫乙醇沉淀法。這種工藝已經(jīng)有50年的歷史了。這類傳統(tǒng)方法操作步驟多，產(chǎn)品種類有限，血漿中的很多其他有效物質(zhì)被浪費(fèi)掉了。比如，生產(chǎn)滅毒合格的白蛋白和抗體，需要10步操作。這種工藝生產(chǎn)的白蛋白和抗體，產(chǎn)品純度不夠高，雖然生產(chǎn)過程中使用了病毒滅活步驟，但潛在病毒的遺傳物質(zhì)(DNA和RNA)和組成蛋白并沒有去除干凈，在某些條件下仍然有危險(xiǎn)。
雖然近年來發(fā)展出了以離子交換和凝膠過濾為中心的層析法生產(chǎn)工藝，但是生產(chǎn)滅毒合格的白蛋白和抗體仍需要10步左右的操作。使用這種工藝，產(chǎn)品的純度有所提高，但生產(chǎn)成本并沒有降低，產(chǎn)品種類也沒有增加，血漿中許多其它含量較少的寶貴蛋白質(zhì)仍被浪費(fèi)掉了。
低溫乙醇法的操作相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，適宜工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。低溫乙醇法還有保持蛋白質(zhì)天然性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)乙醇沉淀血漿蛋白在接近血漿溶液冰點(diǎn)溫度下進(jìn)行，能使蛋白質(zhì)變性降至最低限度，保持其天然狀態(tài)。此外，低溫乙醇法分離過程中有抑菌作用。近年來的研究證明，適當(dāng)?shù)牡蜏匾掖脊に?6+9法、Kistler和Nitschmann法)有殺滅和清除艾滋病毒的作用，增強(qiáng)了制品的安全性。乙醇作為主要原材料，價(jià)格低廉，易于獲得。但低溫乙醇法的應(yīng)用，應(yīng)具備低溫冷室及連續(xù)冷凍離心機(jī)等設(shè)備條件，需要相當(dāng)?shù)馁Y金。另外，工作人員需在相對(duì)低溫條件下操作。產(chǎn)品的純度有限，最終產(chǎn)品種難免含有微量的雜質(zhì)和變性產(chǎn)品，易于引起負(fù)反應(yīng)。國(guó)際上除一些發(fā)達(dá)國(guó)家之外的大多數(shù)國(guó)家，目前主要仍然采用傳統(tǒng)的乙醇沉淀及其改進(jìn)工藝生產(chǎn)血液制品。由于工藝的限制，產(chǎn)品只有白蛋白制劑和免疫球蛋白制劑，其余的大部分寶貴成份都成了生產(chǎn)過程的廢料。
近年來，層析法被越來越廣泛地應(yīng)用于生物制劑的純化制備。Curling等人1978年發(fā)表了應(yīng)用離子交換層析(Ion-Exchange chromatography)分離白蛋白的方法。Suomela等人描述了小規(guī)模離子交換層析分離免疫球蛋白。將凝膠過濾(Gelfiltration，又稱分子篩層析)與離子交換及超濾技術(shù)相結(jié)合，用于大量血漿蛋白的分離是可行的。然而，雖然柱層析法制各的產(chǎn)品純度較高，能很好的保持蛋白質(zhì)的天然性質(zhì)而且產(chǎn)品收獲率也較高，但是生產(chǎn)成本偏高，生產(chǎn)效率低。
近年來，西方國(guó)家采用的瑞典Amershan Pharmacia Biotech和Pharmardule聯(lián)合發(fā)展的血液制品層析生產(chǎn)工藝PharmaFrac。該工藝?yán)昧怂牟綄游?，白蛋白的產(chǎn)率為25g/L血漿，丙種球蛋白的產(chǎn)率為5g/L血漿。這個(gè)工藝雖然可以避免微量組份變性成為廢料，并可通過增加生產(chǎn)線生產(chǎn)其它產(chǎn)品(如九因子)，但這些工藝沒有減少生產(chǎn)步驟，沒有提高產(chǎn)品的產(chǎn)率，也沒有降低生產(chǎn)成本，因而市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力并不強(qiáng)。
其它的方法還有鹽析法(硫酸銨鹽析)、利凡諾(Rivanol)沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、熱乙醇/PEG法等，由于各種因素，沒有在工業(yè)上得到廣泛采用。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效率、低成本、步驟簡(jiǎn)便的大規(guī)模生產(chǎn)生產(chǎn)血液制品的方法和材料，尤其是用于同時(shí)生產(chǎn)白蛋白和丙種球蛋白的方法和材料。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一類新的親和層析介質(zhì)，該親和介質(zhì)可與白蛋白高親和性的結(jié)合，因而用于免疫球蛋白的親和純化。
本發(fā)明的另一目的是提供這類親和層析介質(zhì)的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種低成本、高效率、步驟簡(jiǎn)便的大規(guī)模生產(chǎn)人白蛋白和丙種球蛋白的親和技術(shù)工藝。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種親和層析介質(zhì)，它包括固相載體以及偶聯(lián)在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離純化白蛋白和丙種球蛋白的方法，它包括用親和層析柱對(duì)含白蛋白和丙種球蛋白的原料進(jìn)行親和層析，從而使白蛋白固定于親和層析介質(zhì)，而丙種球蛋白則隨流穿液流過親和層析柱；對(duì)固定于親和層析介質(zhì)上的白蛋白進(jìn)行洗脫，從而獲得純化的白蛋白；以及對(duì)含丙種球蛋白的該流穿液進(jìn)行離子交換層析或疏水層析，從而獲得純化的丙種球蛋白。
較佳地，在親和層析中所用的親和層析介質(zhì)包括固相載體以及偶聯(lián)在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
在一個(gè)優(yōu)選例中，該方法還包括還包括步驟在進(jìn)行親和層析之前，對(duì)含白蛋白和丙種球蛋白的原料進(jìn)行換緩沖液(buffer-exchange)處理。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，對(duì)含丙種球蛋白的該流穿液的進(jìn)一步分離純化是通過離子交換層析進(jìn)行，其中使用含DEAE-或S-基團(tuán)的離子交換樹脂，從而吸附除丙種球蛋白之外的雜質(zhì)。
本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)在于，發(fā)現(xiàn)了一種新穎的高親和力的白蛋白親和層析介質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上首次將白蛋白的親和層析和丙種球蛋白的分離純化結(jié)合在一起，形成了一種新的大規(guī)模生產(chǎn)白蛋白和丙種球蛋白的親和技術(shù)生產(chǎn)工藝。
該工藝的特點(diǎn)是低成本、高效率和步驟簡(jiǎn)便。這種親和技術(shù)工藝，成本和生產(chǎn)效率可以與低溫乙醇法相當(dāng)，產(chǎn)品的純度和質(zhì)量與PharmaFrac層析工藝相當(dāng)，但生產(chǎn)步驟減少一半，產(chǎn)品回收率提高20％以上。此外本發(fā)明的親和純化工藝具有生產(chǎn)快速、工藝穩(wěn)定的特點(diǎn)，可以耐受醫(yī)藥生產(chǎn)中必需的現(xiàn)場(chǎng)在線清洗和消毒，方便地滿足GMP(Good Manufacturing Practice)標(biāo)準(zhǔn)。
親和層析，又稱為生物選擇性吸附層析，已經(jīng)成為純化生物大分子活性物質(zhì)不可缺少的分離技術(shù)。隨著對(duì)生物制品中活性成分的純度和需求量的增加，雜質(zhì)含量的降低，傳統(tǒng)分離技術(shù)如凝膠過濾和離子交換層析技術(shù)再也不能滿足工業(yè)生產(chǎn)和學(xué)術(shù)研究的要求。
與其它方法相比，親和層析方法具有以下幾個(gè)明顯的特點(diǎn)。親和層析介質(zhì)允許對(duì)生物分子選擇地吸附和解離，可以取得很高的純化倍數(shù)，常常為1000多倍。此外，蛋白在純化過程中不僅得到濃縮，當(dāng)結(jié)合到親和配位體上時(shí)，蛋白的性質(zhì)也更加穩(wěn)定；其結(jié)果又提高了目標(biāo)產(chǎn)品的活性回收率。因此，親和分離技術(shù)非常適用于處理體積大，濃度低的生物活性物質(zhì)。
在大規(guī)模生產(chǎn)的純化工藝中，采用親和層析技術(shù)可以大大減少純化過程的步驟，從而減少了合格產(chǎn)品的生產(chǎn)時(shí)間和成本。當(dāng)下游生產(chǎn)成本占總生產(chǎn)成本的80％時(shí)顯得更加重要。在純化過程的任何環(huán)節(jié)都可以使用親和層析技術(shù)，但采用的越早，獲得的經(jīng)濟(jì)效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology,4,954-958,1986)對(duì)生物制品生產(chǎn)工藝調(diào)查的結(jié)果顯示，在所有被考察的工藝中，一步純化效果最佳的單元操作中，有45％是利用親和步驟獲得的。
親和分離介質(zhì)的關(guān)鍵是親和配位體(也可稱為“親和配位體”)。親和配位體必須能夠選擇性地和可逆地吸附生物大分子。傳統(tǒng)的親和配位體為親和介質(zhì)的成功使用奠定的基礎(chǔ)。然而，在工業(yè)生產(chǎn)中，天然的親和配位體，如抗體、輔酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺點(diǎn)最突出的因素是成本昂貴，生物和化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，生產(chǎn)中難于維持結(jié)合活性，也不能經(jīng)受在線清潔和消毒，因此，還可能被其它物質(zhì)，如病毒和內(nèi)毒素污染。
針對(duì)根據(jù)白蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，本發(fā)明人篩選發(fā)現(xiàn)了一種成本低，親和力高的親和配位體3-氨甲基吡啶。將該化合物固定于層析介質(zhì)上后，不僅能夠提供高效的純化倍數(shù)、重復(fù)性的結(jié)果，而且配位體極少脫落。更適合工業(yè)化、大規(guī)模生產(chǎn)醫(yī)用和試劑用白蛋白。而且，原料在去除了白蛋白之后的殘液，主要含有丙種球蛋白和其他雜質(zhì)。對(duì)丙種球蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化(如離子交換層析或疏水層析)之后，就可獲得高純度的丙種球蛋白。
用于本發(fā)明的親和配位體3-氨甲基吡啶是一種已知的化合物，可用常規(guī)方法合成或購(gòu)得。
可用于本發(fā)明的固相載體可以是親和層析領(lǐng)域中任何具有活性連接基團(tuán)(如羥基、氨基、羧基、環(huán)氧基、鹵素等)的固相載體。本發(fā)明的新穎的親和層析配位體還可通過橋連分子而連接于常用的固相載體上。代表性的固相載體包括(但并不限于)葡聚糖凝膠如Sephadex，交聯(lián)的葡聚糖珠如PDX，烯丙基葡聚糖和N,N’-亞甲基雙(丙烯酰胺)的交聯(lián)共聚物如Sephacryl，瓊脂糖凝膠如Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF，瓊脂糖和葡聚糖的交聯(lián)共聚物如Superdex、高度交聯(lián)的瓊脂糖和葡聚糖如Superose,N-三[羥甲基]甲基丙烯酰胺和羥基化交聯(lián)接頭的共聚物珠如Trisacryl、Trisacryl plus，瓊脂糖珠如Ultrogel A，聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠如Ultrogel AcA，纖維素珠如高孔隙度的再生纖維素珠、涂有聚合物的硅膠，或它們的混合物。
將本發(fā)明的3-氨甲基吡啶偶聯(lián)于或固定于固相載體的方法可選用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，這取決于所用的固相載體種類。例如用環(huán)氧氯丙烷作為交聯(lián)劑或馬來酸酐等進(jìn)行偶聯(lián)。對(duì)固定化技術(shù)的一般綜述，可參見Turkova,J.(1993)“Bioaffinity Chromatography”,Elsevier Science,London,U.K。
在本發(fā)明的新工藝中，可用本發(fā)明方法分離純化的含白蛋白和丙種球蛋白的原料可以是任何含白蛋白和丙種球蛋白的原料，例如人血漿，動(dòng)物血漿、基因工程表達(dá)產(chǎn)物、低溫乙醇生產(chǎn)工藝中含白蛋白和丙種球蛋白的中間產(chǎn)物(例如，上清Ⅰ、上清a、上清b、上清Ⅳ、上清C以及沉淀A(組份Ⅱ+Ⅲ)、沉淀B(組份Ⅲ)、沉淀GG(組份Ⅱ)、沉淀Ⅳ)(見Kistler and Nitschmann法工藝)。
首先將含白蛋白和抗體的原料作適當(dāng)稀釋，例如配成1-12％(較佳地2-10％，最佳地4-8％)的溶液。
為了提高親和層析的效率，可以對(duì)含白蛋白和抗體的原料或其稀釋液進(jìn)行換緩沖液處理。例如經(jīng)過Sephadex G-25凝膠過濾層析柱，將緩沖液交換為結(jié)合緩沖液，如磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)。
之后，對(duì)于經(jīng)過換緩沖液處理之后的樣品，進(jìn)行親和層析，從而獲得純化的白蛋白。具體地，白蛋白的親和層析可以包括上樣(吸附)、洗滌和洗脫步驟。此外，對(duì)于親和層析后的白蛋白洗脫液，還可陰離子交換、陽離子交換和凝膠過濾層析以及超濾等方法對(duì)白蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化。
在白蛋白的親和層析步驟中，一種結(jié)合條件是使用如下結(jié)合緩沖液緩沖液的鹽濃度為0.005-0.03M,pH5.0-9.0；更佳地，0.01-0.02M,pH5.5-7.0；最佳地，是5mM磷酸緩沖液(pH6.0)。
一種洗脫條件是使用如下的洗脫緩沖液緩沖液的鹽濃度為0.005-2.0M,pH2.0-5.0或9.5-11.0；較佳地，鹽濃度為0.01-0.50M,pH3.5-4.8；最佳地是15mM醋酸緩沖液(pH4.6)(如果需對(duì)白蛋白進(jìn)行再純化，這樣就不必再換緩沖液)。
在親和層析同時(shí)，可收集上樣和洗滌過程中含丙種球蛋白和其他雜質(zhì)的緩沖液，以用于丙種球蛋白的分離純化。
對(duì)于丙種球蛋白的分離純化，可選用離子交換層析、疏水層析和其他本領(lǐng)域常用于丙種球蛋白分離的方法。較佳地，選用離子交換層析，尤其是用含DEAE-或S-基團(tuán)的離子交換樹脂(如DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose和S-Sepharose FF。)直接吸附除丙種球蛋白之外的雜質(zhì)，從而直接從流穿液獲得純化的丙種球蛋白。在一種優(yōu)選例中，是用DEAE-Sepharose FF進(jìn)行離子交換層析，其中條件為pH為5.0-6.8，鹽濃度為1mM-50mM。
在本發(fā)明的一個(gè)具體優(yōu)選例中，將原料用裝有層析介質(zhì)AT23的親和層析柱，在磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)的條件下吸附白蛋白。用足夠量的磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗去未吸附的雜質(zhì)后，再用醋酸溶液(15mM,pH4.6)專一洗脫白蛋白。從AT23的親和層析柱流穿的原料液，直接上到用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF離子交換柱上。原料液中的雜質(zhì)被吸附，抗體直接流穿。這個(gè)工藝制備的白蛋白和抗體的半成品的純度為98％左右。高于中國(guó)藥典和美國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)。產(chǎn)品回收率在80％以上。
在說明書附圖中，

圖1顯示了化合物3-氨甲基吡啶的結(jié)構(gòu)式。
圖2是用12％SDS-PAGE檢測(cè)親和層析后白蛋白的電泳圖。
圖3是用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定白蛋白的流出峰結(jié)果。
圖4用10％SDS-PAGE檢測(cè)離子交換層析后丙種球蛋白的電泳圖。
圖5是用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定丙種球蛋白的流出峰結(jié)果。
圖6是不同鹽濃度下AT23親和層析介質(zhì)與白蛋白之間結(jié)合曲線圖。
圖7是不同pH下AT23親和層析介質(zhì)與白蛋白之間結(jié)合曲線圖。
圖8是不同鹽濃度下從AT23親和層析介質(zhì)上洗脫白蛋白的曲線圖。
圖9是不同鹽濃度下從AT23親和層析介質(zhì)上洗脫白蛋白的曲線圖。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1制備親和層析介質(zhì)AT23取化合物3-氨甲基吡啶(15g)，溶解于50ml Na2CO3(0.5M，pH11.0)，加入到盛環(huán)氧基Sepharose 6B(1000ml)的可密封瓶中，60℃搖振過夜。在停止之前，加入2ml的乙醇胺，保溫振蕩2小時(shí)。最后取出反應(yīng)瓶中Sepharose 6B，經(jīng)0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸餾水(1000ml×5)分別洗滌后，得到親和層析介質(zhì)，命名為AT23，加入20％乙醇儲(chǔ)存待用。
實(shí)施例2制備親和層析介質(zhì)AT24化合物3-氨甲基吡啶(20g)，溶解于50-400ml Na2CO3(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛環(huán)氧基珠狀纖維素(又稱為纖維素珠)(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃搖振過夜。在停止之前，加入1-10ml的乙醇胺，保溫振蕩2小時(shí)。最后取出反應(yīng)瓶中珠狀纖維素，經(jīng)0.5M醋酸(1000ml),0.1MNaOH(1000ml)和蒸餾水(1000ml×5)分別洗滌后，得到所需的纖維素基質(zhì)的親和層析介質(zhì)AT24，加入用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
實(shí)施例3制備親和層析介質(zhì)AT25將化合物3-氨甲基吡啶(18g)，溶解于50-400ml Na2CO3(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛環(huán)氧基Trisacryl(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃搖振過夜。在停止之前，加入1-10ml的乙醇胺，保溫振蕩2小時(shí)。最后取出反應(yīng)瓶中Trisacryl，經(jīng)0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸餾水(1000ml×5)分別洗滌后，得到所需的Trisacryl基質(zhì)的親和層析介質(zhì)AT25，加入用20％乙醇儲(chǔ)存待用。
實(shí)施例4(1)換緩沖液處理取500ml的冰凍的人血漿，于4℃融化，過濾除去沉淀。上樣到已經(jīng)用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，繼續(xù)用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗脫。收集280nm的吸收峰，得到980ml樣品。放置約30分鐘以上，如該樣品有沉淀，則棄去沉淀。
(2)親和層析將實(shí)施例1制備的親和層析介質(zhì)AT23(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡后，把已換為結(jié)合緩沖液的900ml人血漿樣品加到柱上。同時(shí)開始收集流穿液(含丙種球蛋白和其他雜質(zhì))。再用3000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)洗滌，去除未吸附的物質(zhì)。同時(shí)繼續(xù)收集流穿液，直至用核酸蛋白檢測(cè)儀在280納米處檢測(cè)沒有蛋白流出為止，收集到流穿液共1500ml。
之后，用1500ml洗脫緩沖液(15mM醋酸緩沖液，pH4.6)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)品(圖2)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產(chǎn)品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)得(圖3)白蛋白的純度為98％以上。白蛋白的總回收率為(88％)。
(3)分離純化丙種球蛋白對(duì)應(yīng)上述收集的親和柱AT23的流穿液(1500ml)，全部上到已經(jīng)用磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集全部流穿液(含丙種球蛋白)。用10％的還原性SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)品(圖4)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品大小和含量與血漿中的抗體相同。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定(圖5)，得到抗體的純度為99％以上?？贵w的總回收率為(90％)實(shí)施例5(1)換緩沖液處理將30g低溫乙醇工藝生產(chǎn)的中間產(chǎn)品(組份Ⅱ+Ⅲ)，于4℃溶解于500ml磷酸緩沖液(20mM,pH7.0)，過濾除去沉淀。上樣到已經(jīng)用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，繼續(xù)用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗脫。收集280nm的吸收峰，得到1000ml樣品。
(2)親和層析親和層析介質(zhì)AT23(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡后，把950ml經(jīng)過Sephadex G-25柱的樣品加到柱上。用3000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)洗脫，去除未吸附的物質(zhì)后，再用1500ml醋酸溶液(15mM,pH4.6)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產(chǎn)品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定，白蛋白的純度為98％以上。白蛋白的回收率為(80％)。
在親和層析過程中，如實(shí)施例4一樣收集含丙種球蛋白和其他雜質(zhì)的流穿液。
(3)分離純化丙種球蛋白收集親和柱AT23的流穿液共1400ml，全部上到已經(jīng)用磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集流穿液。用10％的還原性SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品大小和含量與血漿中的抗體相同。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定得抗體的純度為98.5％以上?？贵w的總回收率為(85％)實(shí)施例6(1)換緩沖液處理500ml的冰凍狗血漿，于4℃融化，過濾除去沉淀。上樣到已經(jīng)用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，繼續(xù)用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗脫。收集280nm的吸收峰，得到900ml樣品。
(2)親和層析親和層析介質(zhì)AT23(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡后，把900ml經(jīng)過Sephadex G-25柱的狗血漿加到柱上。用3000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)洗脫，去除未吸附的物質(zhì)后，再用1500ml醋酸溶液(0.1M AcH,pH4.6)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用10％的SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產(chǎn)品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定可以看出產(chǎn)品的流出峰是比較完美的正態(tài)分布。對(duì)峰面積積分可以算出，白蛋白的純度為97％以上。白蛋白的總回收率為(87％)。
在親和層析過程中，如實(shí)施例4一樣收集含丙種球蛋白和其他雜質(zhì)的流穿液。
(3)分離純化丙種球蛋白收集親和柱AT23的流穿液共1300ml，全部上到已經(jīng)用磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集流穿液。用10％的還原性SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品大小和含量與血漿中的抗體相同。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定算抗體的純度為96％以上?？贵w的總回收率為(90％)實(shí)施例7將親和層析介質(zhì)AT24(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000mlTris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)平衡后，把人血漿(500ml，已經(jīng)將緩沖液換為Tris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)加到柱上。用3000ml Tris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，再用1500ml醋酸溶液(15-200mM,pH2.4-5.0)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測(cè)產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產(chǎn)品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測(cè)定表明，產(chǎn)品的流出峰是比較完美的正態(tài)分布。對(duì)峰面積積分可以算出，白蛋白的純度為99％以上(表1)。白蛋白的總回收率為(88％)。
表1
對(duì)于含丙種球蛋白和其他雜質(zhì)的流穿液，按實(shí)施例6所述的方法處理。
實(shí)施例8在該實(shí)施例中，將實(shí)施例4中的獲得白蛋白洗脫液調(diào)節(jié)pH至pH4.8、離子強(qiáng)度0.05。再上到Q-Sepharose柱(5×20cm)，收集流穿液，白蛋白的回收率＞81％，純度為99.99％。
實(shí)施例9對(duì)親和層析中結(jié)合條件和洗脫條件的優(yōu)化在該實(shí)施例中，分別對(duì)親和層析中結(jié)合條件和洗脫條件(鹽濃度和pH值)進(jìn)行優(yōu)化。選用實(shí)施例1制備AT23親和層析介質(zhì)，在中性條件下進(jìn)行結(jié)合條件的鹽濃度優(yōu)化→在緩沖液電導(dǎo)率不變情況下進(jìn)行結(jié)合酸堿度條件優(yōu)化→在緩沖液電導(dǎo)率不變情況下進(jìn)行洗脫酸堿度條件優(yōu)化→在緩沖液電導(dǎo)率不變情況下進(jìn)行洗脫鹽濃度條件優(yōu)化。
結(jié)果如圖7-9所示，在白蛋白的結(jié)合的鹽濃度為0.005-0.03M，更佳地0.01-0.02M(圖6)，pH條件為pH5.0-9.0更佳地pH5.5-7.0(圖7)。
洗脫條件是洗脫緩沖液的鹽濃度為0.005-2.0M，較佳地，鹽濃度為0.01-0.50M(圖8)。pH條件為pH2.0-5.0或pH9.5-11.0(圖9)，較佳地，pH3.5-4.8。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1．一種親和層析介質(zhì)，其特征在于，它包括固相載體以及偶聯(lián)在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
2．如權(quán)利要求1所述的親和層析介質(zhì)，其特征在于，所述的固相載體選自葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N,N’-亞甲基雙(丙烯酰胺)的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖和葡聚糖的交聯(lián)共聚物、高度交聯(lián)的瓊脂糖和葡聚糖、N-三[羥甲基]甲基丙烯酰胺和羥基化交聯(lián)接頭的共聚物珠、瓊脂糖珠、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠、和涂有聚合物的硅膠。
3．如權(quán)利要求1所述的親和層析介質(zhì)，其特征在于，所述的固相載體選自Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisacryl、Trisacryl plus、Ultrogel A、UltrogelAcA、高孔隙度的再生纖維素珠。
4．一種分離純化白蛋白和丙種球蛋白的方法，其特征在于，它包括用親和層析柱對(duì)含白蛋白和丙種球蛋白的原料進(jìn)行親和層析，從而使白蛋白固定于親和層析介質(zhì)，而丙種球蛋白則隨流穿液流過親和層析柱；對(duì)固定于親和層析介質(zhì)上的白蛋白進(jìn)行洗脫，從而獲得純化的白蛋白；以及對(duì)含丙種球蛋白的該流穿液進(jìn)行離子交換層析或疏水層析，從而獲得純化的丙種球蛋白。
5．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，親和層析中所用的親和層析介質(zhì)包括固相載體以及偶聯(lián)在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
6．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括步驟在進(jìn)行親和層析之前，對(duì)含白蛋白和丙種球蛋白的原料進(jìn)行換緩沖液處理，從而使緩沖液的鹽濃度為0.005-0.03M且pH為5.0-9.0。
7．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，對(duì)含丙種球蛋白的該流穿液進(jìn)行離子交換層析，使用含DEAE-或S-基團(tuán)的離子交換樹脂，從而吸附除丙種球蛋白之外的雜質(zhì)。
8．如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的離子交換樹脂選自下組DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose和S-Sepharose FF。
9．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的含白蛋白和丙種球蛋白的原料選自下組人血漿、動(dòng)物血漿、低溫乙醇生產(chǎn)工藝的含白蛋白和丙種球蛋白的中間產(chǎn)物。
10．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，親和層析中所用的親和層析介質(zhì)包括固相載體以及偶聯(lián)在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體；而且在進(jìn)行親和層析之前，對(duì)含白蛋白和丙種球蛋白的原料進(jìn)行換緩沖液處理，從而使緩沖液的鹽濃度為0.005-0.03M且pH為5.0-9.0；而且對(duì)結(jié)合的白蛋白進(jìn)行洗脫時(shí)，所用的條件是0.005-2.0M的鹽，pH2.0-5.0或9.5-11.0的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)生產(chǎn)白蛋白和抗體(丙種球蛋白)的生產(chǎn)工藝,包括將原料先用親和技術(shù)分離出白蛋白,然后用離子交換層析或疏水層析精制出抗體(丙種球蛋白),即可得到高純度的白蛋白和丙種球蛋白的試劑級(jí)和醫(yī)用級(jí)產(chǎn)品。本發(fā)明還公開了用于此工藝的新穎的親和層析介質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1296951SQ9912406
公開日2001年5月30日 申請(qǐng)日期1999年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月22日
發(fā)明者李榮秀, 王繼武, 肖齊世, 陳冬星 申請(qǐng)人:上海中路生物工程有限公司